ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ НЕЙРОХИРУРГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА Н.Н. БУРДЕНКО»
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ НЕЙРОХИРУРГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА Н.Н. БУРДЕНКО» На правах рукописи РЫЖОВА Марина Владимировна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГЛИОБЛАСТОМ ДЕТСКОГО ВОЗРАСТА И ИХ КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ 14.01.18 – нейрохирургия 14.03.02 – патологическая анатомия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Горелышев Сергей Кириллович доктор медицинских наук, профессор Талалаев Александр Гаврилович Москва – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………………...10 ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………....................................15 Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ АБЕРРАЦИЙ В ГЛИОБЛАСТОМАХ У ДЕТЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)………………………………………………....23 1.1. Глиобластомы у детей. Общие положения………………………...23 1.2. Глиосаркомы у детей………………………………………………..25 1.3. Глиобластомы у детей младше 3 лет……………………………….26 1.4. Цитогенетические аберрации в глиобластомах……..…………….27 1.5. Мутации в глиобластомах………...………………………………...27 1.6. Эпигенетические события в глиобластомах…...……………..…...29 1.6.1. Модификации гистонов и ремоделирование хроматина в глиобластомах………………………………………………….32 1.7. Глиобластомы больших полушарий………………………………...35 1.7.1. Цитогенетические аберрации………………………………...35 1.7.2. Мутации…………………………………………………….....35 1.8. Глиобластомы зрительного бугра…………………………………...36 1.9. Глиобластомы ствола головного мозга……………………………..36 3 1.9.1. Цитогенетические аберрации……………………………39 1.9.2. Мутации……………………………………………………....39 1.10. Глиобластомы мозжечка…………………………………………...39 1.11. Глиобластомы спинного мозга…………………………………….40 1.12. Заключение………………………………………………………….40 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………42 2.1. Общая характеристика клинического материала………………….42 2.1.1. Характеристика нейрохирургических методов лечения…...44 2.1.2. Глиобластомы больших полушарий головного мозга……..46 2.1.2.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ…46 2.1.2.2. Показания к операции……………………………....48 2.1.2.3. Особенности операции и интраоперационная морфология………………………………………….48 2.1.3. Глиобластомы подкорковых узлов …………………………...49 2.1.3.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ…49 2.1.3.2. Показания к операции……………………………....51 2.1.3.3. Особенности операции и интраоперационная морфология……………………………...………….51 2.1.4. Глиобластомы ствола головного мозга…………………...…..52 4 2.1.4.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ……52 2.1.4.2. Показания к хирургическому лечению……………...52 2.1.4.3. Особенности операции и интраоперационная морфология…………………………………………....54 2.1.5. Глиобластомы задней черепной ямки…………….………………..54 2.1.5.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ…...54 2.1.5.2. Показания к операции………………………..……….54 2.1.5.3. Особенности операции и интраоперационная морфология……………………..……………………..55 2.1.6. Глиобластомы спинного мозга ……………..…………………..…..57 2.1.6.1. Характеристика опухолей по данным КТи МРТ…….57 2.1.6.2. Показания к операции…………………………………57 2.1.6.3. Особенности операции и интраоперационная морфология………...…………………………………..57 2.2. Характеристика методов адъювантного лечения нейрохирургических больных с глиобластомами…………………………………..……..…59 2.3. Формирование групп для исследования биологии глиобластом у нейрохирургических больных………………………………………...61 2.4. Катамнестические данные у нейрохирургических больных с глиобластомами……………………………………………………….66 5 2.5. Методы исследования биологии глиобластом у нейрохирургических больных………………………………………………………………...67 2.5.1. Морфологическое исследование глиобластом…………..........67 2.5.2. Иммуногистохимическое исследование глиобластом……….68 2.5.2.1. Методика иммуногистохимического исследования.69 2.5.3. Флуоресцентная гибридизация in situ в глиобластомах……70 2.5.3.1. Методика флуоресцентной гибридизации in situ….71 2.5.4. Сравнительная геномная гибридизация глиобластом……...73 2.5.4.1. Методика сравнительной геномной гибридизации..74 2.5.4.2. Анализ результатов сравнительной геномной гибридизации…………………………………………76 2.5.5. Полное экзомное секвенирование глиобластом…………....77 2.5.5.1. Методика полного экзомного секвенирования…….78 2.5.5.2. Анализ результатов полного экзомного секвенирования……………………………………….81 2.5.6. Метиляционное профилирование ДНК в глиобластомах.....81 2.5.6.1. Основные методы бисульфитного секвенирования..82 2.5.6.2. Методика метиляционного профилирования ДНК с использованием Illumina HumanMethylation450 BeadChip………………………………………………83 6 2.5.6.3. Анализ данных метиляционного профилирования..84 2.5.6.4. Оценка статуса метилирования гена MGMT в глиобластомах...………………………………….….85 2.5.7. Полимеразная цепная реакция в исследовании глиобластом…………………………………………………...86 2.5.8. Прямое секвенирование глиобластом………………….……88 2.5.9. Статистический анализ выживаемости у нейрохирургических больных с глиобластомами ….……...89 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИИ ГЛИОБЛАСТОМ У НЕЙРОХИРУРГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ……………………..…………90 3.1. Морфологическая и молекулярная дифференциальная диагностика низкодифференцированных злокачественных опухолей головного мозга у детей…………………………………………………………90 3.2. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методами Illumina HumanMethylation450 BeadChip, сравнительной геномной гибридизации (array-based comparative genomic hybridization a-CGH) и флуоресцентной гибридизации in situ (Fluorescence in situ hybridization FISH)………………………….118 3.2.1. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методом Illumina HumanMethylation450 BeadChip………..118 7 3.2.2. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методом сравнительной геномной гибридизации………..126 3.2.3. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методом флуоресцентной гибридизации in situ………….133 3.2.4. Связь выявленных в глиобластомах цитогенетических аберраций с гистологической картиной опухоли……….136 3.3. Выявление в глиобластомах мутаций генов методами полного экзомного секвенирования (Whole exome sequencing WES) и прямого секвенирования (Direct sequencing), выявление мутантных протеинов методом иммуногистохимического исследования, выявление эпигенетических нарушений в методом метиляционного анализа ДНК (DNA methylation profiling) ….…137 3.3.1. Анализ мутаций генов в глиобластомах методом полного экзомного секвенирования………………………………….137 3.3.2. Анализ мутаций генов H3F3A, IDH1 и BRAF в глиобластомах методом прямого секвенирования…....................................137 3.3.3. Иммуногистохимическое выявление мутантных протеинов K27M, IDH1 и BRAF в глиобластомах……………….…..144 3.3.4. Выявление эпигенетических нарушений методом метиляционного анализа ДНК……………………….……146 8 3.3.5. Кластерный анализ результатов, полученных при изучении эпигенома детских глиобластом……………………………154 3.3.6. Статистический анализ выживаемости нейрохирургических больных с глиобластомами…………………………………156 3.3.6.1. Регрессивная модель Кокса………………………...161 3.3.7. Клинико-молекулярная стратификация глиобластом…….162 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ…………………..165 4.1. Клинико-морфологическое сопоставление полученных аберраций и их прогностическое значение в глиобластомах у нейрохирургических больных ……………………………………165 4.2. Биологическое значение выявленных в глиобластомах генетических аберраций и мутаций генов и их роль для таргетной терапии опухолей у нейрохирургических больных ..............……175 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………...197 ВЫВОДЫ………………………………………………………………………….210 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………….………213 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………….……..215 ПРИЛОЖЕНИЕ…………………………………………………………………...257 ПРИЛОЖЕНИЕ 1………………………………………...........257 Протокол ведения больных c глиобластомами в до- и 9 послеоперационном периодах…………………………..257 ПРИЛОЖЕНИЕ 2……………………………………………...259 Список пациентов от 4 месяцев до 18 лет, оперированных в ФГБНУ «НИИ НХ» в период с 1998 по 2013 годы (исследуемая подгруппа)………………………….259 Список пациентов от 19 до 62 лет, оперированных в ФГБНУ «НИИ НХ» в период с 1999 по 2011 годы (контрольная группа)…………..…..263 ПРИЛОЖЕНИЕ 3……………………………………………...265 Буквенные обозначения аминокислот…………………265 10 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТРО атипическая тератоидно-рабдоидная опухоль ВОЗ Всемирная организация здравоохранения ГБМ глиобластома ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота ИГХ иммуногистохимическое исследование КТ компьютерная томография МикроРНК класс некодирующих РНК, которые представляют собой эндогенные малые молекулы РНК, имеющие приблизительно 20-30 пар нуклеотидов МРТ магнитно-резонансная томография НДЗО низкодифференцированная злокачественная опухоль ПНЭО ЦНС примитивная нейроэктодермальная опухоль центральной нервной системы ПНЭО ЦНС NOS «not otherwise specified» – «не указано иное», синоним супратенториальной ПНЭО ЦНС ПЭТ позитронно-эмиссионная томография РНК рибонуклеиновая кислота СОД суммарная очаговая доза ЦНС центральная нервная система 11 Экзон участок ДНК, несущий генетическую информацию, кодирующую синтез белка AT/RT Atypical teratoid/rhabdoid tumour aCGH Array-based Comparative Genomic Hybridization (сравнительная геномная гибридизация) BRAF ген BRAF, официальное название V-RAF murine sarcoma viral oncogene homolog B1, локализация 7q34 CCND1 ген CCND1, официальное название cyclin D1, локализация 11q13.3 CCND2 ген CCND2, официальное название cyclin D2, локализация 12p13.32 CD Cluster of differentiation, кластер дифференцировки CD45 (LCA) Leucocyte Common Antigen (общий лейкоцитарный антиген) CDK4 ген CDK4, официальное название cyclin-dependent kinase 4, локализация 12q14.1 CDK6 ген CDK6, официальное название cyclin-dependent kinase 6, локализация 7q21.2 CDKN2A ген CDKN2A, официальное название cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, синонимы - p16(INK4), p16(INK4A), локализация 9p21.3 CNS central nervous system CpG Cytosine—phosphate—Guanine (цитозин-фосфат-гуанин) ddNTP дидеоксинуклеотиды (dideoxynucleotides) – ингибиторы ДНК-полимеразы, используются при секвенировании ДНК 12 DIPG Diffuse intrinsic pontine glioma, диффузная глиома ствола головного мозга EGFR ген EGFR, официальное название epidermal growth factor receptor, локализация 7p12 ЕМА Epithelial Membrane Antigen (эпителиальный мембранный антиген) ETANTR embryonal tumor with abundant neuropil and true rosettes (эмбриональная опухоль с обилием нейропиля и истинными розетками) ETMR еmbryonal tumor with multilayered rosettes (эмбриональная опухоль с многорядными розетками) FISH Fluorescence in situ hybridization (флуоресцентная гибридизация in situ) FLAIR fluid-attenuated inversion recovery – режим МРТ, который минимизирует влияние сигналов цереброспинальной жидкости G34R/V вариант мутации гена H3F3A GBM Glioblastoma, глиобластома G-CIMP Glioma-CpG-Island Methylator Phenotype G-CHOP Glioma-CpG Hypomethylator Phenotype GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein (глиофибриллярный кислый белок) H3F3A ген H3F3A, официальное название H3 histone, family 3A, локализация 1q42.12 HGH High-grade glioma, глиома высокой степени злокачественности 13 IDH1 ген IDH1, официальное название isocitrate dehydrogenase 1, синонимы - isocitrate dehydrogenase, NADP(+)-specific, solubleperoxisomal isocitrate dehydrogenase; PICDisocitrate dehydrogenase, NADP(+)-dependent, cytosolic; IDPC; ICDC, локализация 2q34 INI1 ген SMARCB1, официальное название SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily b, member 1, синонимы - INI1; SNF5; BAF47, локализация 22q11.23 IRS2 ген IRS2, официальное название insulin receptor substrate 2, локализация 13q34 K27M вариант мутации гена H3F3A LGG Low-grade glioma, глиома низкой степени злокачественности LIN28A ген LIN28A, официальное название lin-28 homolog A (C. elegans), локализация 1p36.11 MGMT ген MGMT, официальное название methylguanine-DNA methyltransferase, локализация 10q26.3 mTOR mammalian target of rapamycin MYC ген MYC, официальное название v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog, локализация 8q24.21 MYCN ген MYCN, официальное название v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog, локализация 2p24.3 ТP53 ген-супрессор ТР53, официальное название tumor protein 14 p53, синоним transformation-related protein 53 TRP53, локализация 17р13.1 PDGFRA ген PDGFRA, официальное название platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide, локализация 4q12 PTEN ген PTEN, официальное название phosphatase and tensin homolog, локализация 10q23.31 PXA Pleomorphic xanthoastrocytoma, плеоморфная ксантоастроцитома RTK receptor tyrosine kinase WES whole exome sequencing (полное экзомное секвенирование) WHO World Health Organization Wt wild type, дикий тип, отсутствие мутации гена 15 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы В настоящее время детская нейрохирургия, зарождение которой связано с именем А.А. Арендта, учитывающая тонкие анатомо-физиологические особенности строения головного и спинного мозга у детей из узкой хирургической специальности превратилась в важную составляющую детской нейроонкологической службы, в которой главенствует принцип междисциплинарного подхода к диагностике и лечению опухолей головного и спинного мозга. Для обеспечения мультидисциплинарного и мультицентрового подхода созданы и успешно функционируют «Московская группа по детской нейроонкологии» и «Совет по нейроонкологии», включающие специалистов (нейрохирургов, химиотерапевтов, нейрорентгенологов, неврологов, нейропатоморфологов, лучевых терапевтов, нейроэндокринологов, нейроофтальмологов и нейропсихологов) из разных научно-клинических центров Москвы и России. Именно на стыке наук – нейрохирургии, нейроморфологии, нейробиологии, нейрогенетики и нейроонкологии – появляются новые данные, позволяющие переосмысливать наши подходы к лечению злокачественных опухолей центральной нервной системы. Глиобластома - наиболее часто встречающаяся злокачественная опухоль головного мозга (заболеваемость глиобластомой составляет 12-15% от всех интракраниальных опухолей и 60-75% от всех астроцитарных опухолей), характеризующаяся низкими показателями общей выживаемости [50, 51, 187]. До настоящего момента важной проблемой остается гистологическая верификация глиобластом, особенно изоморфноклеточного варианта, требующего проведения дифференциальной диагностики с другими злокачественными мелко кругло клеточными опухолями [119, 228]. Глиобластомы у детей и взрослых имеют идентичную гистологическую картину и одинаково неблагоприятный прогноз, поэтому долгое время 16 рассматривались совместно. Основное различие заключается в патогенезе этих опухолей: структура выявляемых цитогенетических аберраций, таких как амплификации онкогенов EGFR, PDGRFA, MYC и MYCN, гомозиготная делеция гена CDKN2A и делеция гена PTEN существенно отличается в глиобластомах у данных возрастных групп, что говорит о вовлечении различных молекулярных путей в развитие этих опухолей у детей и взрослых [53, 190, 218, 246, 287]. Определенную роль в развитии глиобластом играют эпигенетические события: метилирование (присоединение метильной группы) ДНК, посттрансляционная (трансляция – процесс синтеза белка на рибосомах) модификация гистонов и посттранскрипционная (транскрипция – процесс синтеза РНК на матрице ДНК) регуляция генной экспрессии микроРНК [59, 87]. Поворотным моментом в исследовании генома глиобластом и создании молекулярной классификации явилось открытие мутаций генов IDH1 [222] и H3F3A [267]. Изоцитрат дегидрогеназа (isocitrate dehydrogenase IDH) – это фермент, катализирующий окислительное декарбоксилирование изоцитрата, в результате реакции образуются α-кетоглутарат (оксоглутарат) и диоксид углерода СО2. Ген IDH1 расположен на длинном плече хромосомы 2q33.3 и кодирует внутриклеточную НАДФ+ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) зависимую изоцитрат дегидрогеназу. Точковые мутации гена IDH1 в кодоне 132, возникающие в глиобластомах, являются гетерозиготными и соматическими и характеризуются заменой пары оснований гуанина на аденин в результате замены аминокислоты аргинина в позиции 132 на гистидин (R132H см. Приложение 3) [29]. Глиобластомы с мутацией гена IDH1 имеют более благоприятные показатели общей выживаемости [15, 84, 128]. Гетерозиготные мутации гена H3F3A впервые в мире описаны в детских глиобластомах с нашим участием [267] в двух вариантах: замена лизина на метионин (K27M) и глицина на аргинин или валин (G34R/V). Обе мутации возникают в позиции, близкой к концевой N-терминали, которая подвергается 17 важным посттрансляционным изменениям, связанным либо с подавлением (K27) либо с активацией (K36) процесса транскрипции. Мутации гена H3F3A патогномоничны для глиобластом и по данным Je et al. [145], исследовавшим 1351 опухоль, не встречаются более ни в какой другой опухоли, включая злокачественные менингиомы, саркомы и карциномы различной локализации. Глиобластомы у детей представляют собой гетерогенную группу, среди которой, несмотря на низкие показатели 5-летней общей выживаемости, встречаются отдельные ―долгожители‖. Исследование мутации гена Н3F3A на большой группе детских глиобластом позволит сравнить варианты мутации гена Н3F3A (K27M и G34R/V) с локализацией опухоли и определить прогностическое значение каждого типа мутации. Это будет способствовать более дифференцированному подходу к лечению глиобластом у детей и возможной таргетной терапии в будущем. Выявление наиболее прогностически неблагоприятного варианта К27М мутации гена Н3F3A позволит использовать высокодозную химиотерапию с аутологичной поддержкой стволовыми клетками для лечения, не опасаясь выраженных осложнений данной терапии [194, 196]. Степень разработанности темы На сегодняшний момент мало известно о молекулярно-генетических аберрациях, мутациях и эпигенетических событиях в детских глиобластомах, данная работа является пионерской в области генетики детских глиобластом, особенно на столь крупной серии опухолей. Цель исследования Оптимизировать подходы к комплексному лечению глиобластом и улучшить прогнозирование исходов лечения нейрохирургических больных на основе исследования генетических и эпигенетических нарушений в глиобластомах у детей в возрасте младше 18 лет, сравнить выявленные нарушения в геноме с контрольной группой уже исследованных глиобластом 18 взрослых, разработать основанную на молекулярных маркерах схему прогноза и определить возможные гены-мишени для таргетной терапии. Задачи исследования 1. Оценить нейрохирургическую тактику в зависимости от нарушений в геноме детских глиобластом. 2. Разработать алгоритм дифференциальной диагностики низкодифференцированных злокачественных опухолей головного мозга у детей, основанный на молекулярных методах. 3. Исследовать молекулярно-генетические аберрации в геноме детских глиобластом методами Illumina HumanMethylation450 BeadChip, сравнительной геномной гибридизации (Array-based Comparative Genomic Hybridization a-CGH) и флуоресцентной гибридизации in situ (Fluorescence in situ hybridization FISH). 4. Исследовать мутации и эпигенетические события в глиобластомах методами полного экзомного секвенирования (Whole exome sequencing WES), прямого секвенирования (Direct sequencing) и метиляционного анализа ДНК (DNA methylation profiling), а также выявить мутантные протеины методом иммуногистохимического исследования. 5. Сравнить молекулярно-генетические нарушения в геноме глиобластом у детей и взрослых с целью разработки «возрастной» молекулярной стратификации. 6. Собрать катамнестические данные у нейрохирургических больных и оценить прогностическую значимость выявленных молекулярно- генетических нарушений в глиобластомах. 7. Оценить биологическую роль выявленных аберраций и определить возможные гены-мишени для таргетной терапии глиобластом. 19 Научная новизна Подробно изучены нарушения в геноме и эпигенетические события в детских глиобластомах благодаря исследования, таких как использованию новейших методов полное экзомное секвенирование (whole exome sequencing WES), метиляционный анализ ДНК (DNA methylation profiling) и прямое секвенирование (direct sequencing). При сравнении генетических аберраций и эпигенетических событий в глиобластомах у детей и взрослых выявлены различия в биологии опухоли у разных возрастных групп, определены прогностические маркеры для детских (амплификации онкогенов, вариант К27М мутации гена H3F3A и метилированый ген MGMT) и взрослых глиобластом (мутация гена IDH1), что позволяет рассматривать эпигенетические события в качестве мишени для будущей таргетной терапии. В рамках международного проекта ―Детские глиобластомы‖, в котором автор данной диссертационной работы принимала непосредственное участие, впервые в мире в глиобластомах у детей была выявлена и описана мутация гена H3F3A, кодирующего гистон Н3.3 [267], что вошло в пятерку наиболее важных событий в нейроонкологии [263]. Теоретическая и практическая значимость Полученные данные позволили сформулировать концепцию о молекулярногенетической гетерогенности глиобластом разных возрастных групп. Результаты работы позволили оптимизировать тактику нейрохирургического пособия при глиобластомах различной локализации у детей; объяснено благоприятное прогностическое значение возраста младше 2 лет у детей с опухолями, имеющими гистологические признаки глиобластом, но молекулярно демонстрирующими профиль глиом низкой степени злокачественности; объяснен феномен длительной выживаемости гистологические признаки глиобластом, у детей с опухолями, имеющими но молекулярно демонстрирующими 20 профиль злокачественной плеоморфной ксантоастроцитомы; определены прогностически значимые цитогенетические аберрации, эпигенетические события и мутации у больных детского возраста с глиобластомами. Негативное влияние на прогноз при детских глиобластомах оказывают следующие факторы: наличие мутации гена H3F3A вариант K27M, наличие амплификации любого из перечисленных (EGFR, PDGFRA, MYC/MYCN, CDK/CCND) онкогенов, а также срединная и глубинная локализация опухоли (в таламусе, стволе головного мозга и спинном мозге), в то время метилированный ген MGMT позитивно влияет на прогноз заболевания. Разработан и внедрен в практику патолого-анатомического отделения ФГБНУ «НИИ НХ» алгоритм диагностики низкодифференцированных злокачественных опухолей, а также исследование глиобластом методом флуоресцентной situ гибридизации in для выявления возможных цитогенетических аберраций. Материалы работы планируется использовать для дальнейшего развития и совершенствования детской нейроонкологической службы. Основные положения, выносимые на защиту 1. Глиобластомы у детей представляют собой гетерогенную группу опухолей, относительно однородную по клинической картине и гистологии, но демонстрирующей четкие различия по молекулярному профилю и, как следствие, прогнозу и таргетной терапии заболевания. Детские глиобластомы отличаются от взрослых опухолей по цитогенетическому профилю и наличию ключевой повторяющейся мутации гена H3F3A, возникающей в 50% детских опухолей. 2. Согласно метиляционному профилированию генов детские глиобластомы могут быть разделены на четыре кластера: K27M, G34R/V, IDH1 и wt GBM. Кластерирование взрослых глиобластом имеет иную структуру: у них отсутствуют кластеры K27M и G34R/V. 3. Детские глиобластомы формируют три основные группы (K27M, G34R/V и с отсутствием мутации гена H3F3A) с клиническими, биологическими и 21 прогностическими особенностями (группа IDH1 у детей с глиобластомами малочисленна). Взрослые глиобластомы подразделяются на две прогностически различные группы в зависимости от наличия или отсутствия мутации гена IDH1. 4. Метилирование гена MGMT гораздо чаще встречается во взрослых глиобластомах и сочетается с мутацией гена IDH1 в обеих возрастных группах и с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V в детских опухолях. Степень достоверности Теория построена на известных проверенных фактах и согласуется с современными представлениями и опубликованными экспериментальными данными по теме диссертации; использованы сравнения авторских данных с литературными данными, полученными ранее по рассматриваемой тематике; установлено количественное и качественное совпадение авторских результатов с данными, представленными в независимых источниках по данной тематике; использованы современные методы сбора и обработки исходной информации. Апробация работы Официальная апробация состоялась 5 декабря 2014 г. на расширенном совместном заседании проблемных комиссий «Детская нейрохирургия» и «Биология и комплексное лечение внутримозговых опухолей» в ФГБНУ «НИИ НХ». Результаты работы были обсуждены 21 августа 2014 г. и 19 февраля 2015 г. на семинарах отделения педиатрической нейроонкологии German Cancer Research Center in the Helmholtz Association (DKFZ), Heidelberg, Germany. Публикации По теме работы опубликовано 50 печатных работ, включая 27 статей в научных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для докторских диссертаций (из них 9 статей опубликовано в отечественных журналах и 18 22 статей в зарубежных журналах). 21 работа опубликована в виде статей и тезисов на профильных отечественных и зарубежных конференциях и конгрессах (из них 15 тезисов в англоязычных сборниках, 4 тезиса в отечественных сборниках и 2 статьи в отечественных медицинских журналах). Две работы опубликованы в виде клинических рекомендаций: «Ассоциация нейрохирургов России. Стандарты, опции и рекомендации в лечении первичных опухолей ЦНС (2012-2013)» и «Клинические рекомендации. Неврология и нейрохирургия / под ред. Е.И. Гусева, А.Н. Коновалова». Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Текст изложен на 265 страницах, содержит 46 рисунков и 8 таблиц. Список литературы содержит ссылки на 18 отечественных и 312 зарубежных источников. 23 Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ АБЕРРАЦИЙ В ГЛИОБЛАСТОМАХ У ДЕТЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Глиобластомы у детей. Общие положения Глиобластома – злокачественная опухоль головного и спинного мозга, возникающая из клеток радиальной глии и единственная из всех глиом имеющая самую высокую четвертую степень злокачественности [122, 127, 172, 182, 183, 187, 252, 288]. У детей глиобластомы чаще поражают срединные структуры головного мозга: зрительный бугор и ствол головного мозга, в отличие от полушарных глиобластом взрослых [6, 187]. Протокол радикальное лечения безопасное химиотерапию. Для глиобластомы у хирургическое обеспечения детей удаление максимально включает опухоли, возможной максимально лучевую и радикальности удаления и предотвращения послеоперационного неврологического дефицита применяются пробуждением, ультразвук, рамочные функциональное навигационные картирование, системы и операции с интраоперационная нейровизуализация. В зависимости от локализации опухоли установлены подходы к лечению: опухоли глубинной локализации не могут быть удалены хирургически, для таламических глиом хирургическое удаление только ухудшает прогноз, в таких случаях предпочтение отдается диагностической стереотаксической биопсии (или в случае интравентрикулярной опухоли – нейроэндоскопической биопсии) с последующей лучевой терапией [6, 117, 140, 325]. 24 Лучевая терапия для лечения глиобластом у детей старше трех лет применяется в дозе 50-60 Грей со стандартным ежедневным фракционированием 1,8-2,0 Грей. Химиотерапия используется совместно с лучевой терапией глиобластом, применяются Lomustine (1-[2-chloro-ethyl]-3-cyclohexyl-1-nitrosourea, CCNU) и Vincristine в комбинации с Procarbazine (PCV). Исследования показали, что Temozolomide менее эффективен у детей с глиобластомами, чем у взрослых [3, 4, 5, 141, 152, 176, 281]. Глиобластомы – злокачественные опухоли, склонные к быстрому прогрессированию за счет локального рецидивирования или метастазирования, несмотря на удаление опухоли и химиолучевую терапию. От истинной прогрессии опухоли следует отличать так называемую «псевдопрогрессию», когда на МРТ появляются участки накопления контрастного вещества, связанные с воспалением на фоне терапии, постхирургическими изменениями, ишемией и отеком. Клинически бессимптомно. псевдопрогрессия Дифференциальный опухоли диагноз как правило между протекает прогрессией и псевдопрогрессий опухоли можно провести при помощи перфузионной МРТ и диффузионно-взвешенной МРТ с последующим анализом коэффициента диффузии [73, 324]. Метастазирование в глиобластомах связывают с повышенной экспрессией маркера стволовых клеток CD133 (ген Prominin 1) [261]. Метастазирование на момент диагноза (так называемое первичное метастазирование) развивается приблизительно у 3% детей с глиобластомами любой локализации, в то время как вторичное метастазирование развивается у 13% глиобластом ствола и 22% нестволовых глиобластом через 7-8 месяцев после постановки диагноза «глиобластома». Выживаемость после вторичного метастазирования не превышает 4 месяцев, вторичное метастазирование является неблагоприятным прогностическим фактором [36, 307]. 25 Для лечения рецидивных опухолей используется повторное хирургическое удаление опухоли, позволяющее не только резецировать объем патологической ткани, но и получить материал для изготовления дендритной вакцины [116, 240]. За хирургическим удалением следуют повторная лучевая терапия (хорошо зарекомендовала себя в лечении рецидивных глиобластом у детей гипофракционированная стереотаксическая лучевая терапия) и химиотерапия с Bevacizumab (Avastin) в качестве монотерапии или в сочетании с Irinotecan [94, 109, 327]. Основными факторами благоприятного прогноза для глиобластом детского возраста на сегодняшний день принято считать возраст младше 3 лет [10] и тотальное удаление опухоли, возможное только в случае поверхностной полушарной локализации [80, 117, 227, 323]. 1.2. Глиосаркомы у детей Глиосаркома – вариант глиобластомы с наличием саркоматозного компонента, появляющегося в результате метаплазии глиальных клеток, а не пролиферирующих сосудов, как считалось ранее. На сегодняшний день моноклональный источник глиального и мезенхимального компонента глиосаркомы доказан на молекулярном уровне [154, 187, 243]. Частота заболеваемости глиосаркомами у детей не превышает 2% от всех глиобластом детского возраста. Отмечено 2 пика заболеваемости – у детей младше 1 года и в возрасте 10-11 лет. Локализуются глиосаркомы преимущественно супратенториально чаще всего в лобной доле, но описаны единичные случаи глиосарком таламуса [154, 211, 239]. Выделяют три группы глиосарком у детей. Первая группа возникает у младенцев в возрасте 1-4 месяцев, имеет хороший прогноз и может быть лечена с использованием хирургического удаления и химиотерапии. Возможно, данные глиобластомы являются врожденными и представляют собой опухоль по биологическим характеристикам сильно отличающуюся от обыкновенной 26 глиосаркомы [132, 190, 221, 256]. Вторая группа развивается у детей более старшего возраста после полученной ранее краниальной лучевой терапии по поводу глиом низкой степени злокачественности, медуллобластом, острого лимфобластого лейкоза, ангиом, менингиом и гигантоклеточных глиобластом. У детей со вторичными глиосаркомами прогноз плохой в отличие от взрослых с индуцированными лучевой терапией глиосаркомами [83, 139, 154, 192, 256]. Третья группа глиосарком развивается у детей старше 3 лет de novo, прогноз у данной категории пациентов неблагоприятный [154, 256]. У взрослых больных и мезенхимальный и глиальный компоненты глиосаркомы имеют цитогенетические и молекулярные аберрации сходные с аберрациями, выявляемыми в первичных глиобластомах: за исключением более низкой частоты амплификации гена EGFR. Делеции генов CDKN2A, PTEN и мутации гена ТР53 встречаются в 20-40% глиосарком у взрослых [243]. Цитогенетические и молекулярные аберрации, а также мутации генов в детских глиосаркомах не изучены и в литературе не описаны. 1.3. Глиобластомы у детей младше 3 лет Возраст младше 3 лет является благоприятным прогностическим фактором. В этом возрасте для лечения глиобластом используются хирургическое удаление опухоли с последующей химиотерапией. Применение лучевой терапии ограничено из-за когнитивных и нейроэндокринных осложнений, но может быть использовано для лечения рецидивных опухолей и лечения первичной опухоли после достижения ребенком трехлетнего возраста [43, 89, 138, 257]. Химиотерапию следует начинать через месяц после удаления опухоли. Лечение включает три альтернативных режима: Карбоплатин, Прокарбазин или Этопозид, Цисплатин или Винкристин, Циклофосфамид – 7 циклов с 3недельными интервалами под контролем гематологических показателей. Химиотерапия может осложниться нейротоксичностью или гематотоксичностью, хотя маленькие дети обычно хорошо переносят лечение [89, 245, 279]. 27 Глиобластома у маленьких детей представляет собой отдельную уникальную группу с относительно благоприятным прогнозом, возможно, из-за отсутствия гиперэкспрессии и мутации гена ТР53, выявляемой только в 9% опухолей и связанной с неблагоприятным результатом в глиобластомах данной возрастной группы [257]. Генетические исследования глиобластом у маленьких детей выявили лишь небольшое количество генов, экспрессия которых отличается у маленьких детей, детей старшей возрастной группы и взрослых больных с глиобластомами. Также при исследовании глиобластом у маленьких детей не было выявлено ни амплификаций генов EGFR и PDGFRA, ни гомозиготной делеции гена CDKN2A, ни мутации гена H3F3A, лишь в небольшом проценте опухолей определялась делеция гена PTEN [45, 190]. 1.4. Цитогенетические аберрации в глиобластомах Наиболее распространенной цитогенетической аберрацией в детских глиобластомах является добавка длинного плеча хромосомы 1q, возникающая более чем в половине опухолей, в то время как основными аберрациями в глиобластомах взрослых являются добавка хромосомы 7 и потеря хромосомы 10q [30, 34, 246]. Также относительно часто в детских глиобластомах встречаются добавки хромосом 2q, 3q (38%), 17q (23%) и потери хромосом 6q, 8q, 10q, 13q и 17p (31%). Сравнение с глиобластомами взрослых выявило преобладание аберраций на хросомах 1p, 2q, 6q, 11q, 16q и 21q в детских опухолях [79, 166, 246]. В глиобластомах у детей и взрослых возникают идентичные аберрации: амплификации онкогенов EGFR и PDGRFA, гомозиготная делеция гена CDKN2A и делеция гена PTEN. Но вышеописанные количественные изменения копий генов различаются по частоте - в глиобластомах взрослых в большем проценте случаев выявляются амплификация онкогена EGFR, гомозиготная делеция гена CDKN2A и делеция гена PTEN, в то время как в детских опухолях чаще встречается амплификация гена PDGRFA, что говорит о вовлечении различных молекулярных путей в развитие этих опухолей у детей и взрослых [53, 166, 232, 235, 291]. 28 1.5. Мутации в глиобластомах Мутации гена-супрессора ТP53 (tumor protein p53) хорошо изучены во многих типах опухолей и возникают в любом экзоне (экзон – участок гена, кодирующий белок, интрон – участок гена, кодирующий участок РНК, не содержит информации о последовательности аминокислот белка), но с преобладанием в экзонах 4-9, которые кодируют ДНК-связывающий домен белка [229, 247]. Ген ТР53 принимает участие в контроле клеточного цикла, задерживая клетки в первой фазе митоза G1, тем самым предотвращая репликацию поврежденной ДНК, также ген ТР53 вовлечен в процессы репарации ДНК и индукцию апоптоза [18]. В патогенезе глиобластом мутация гена ТР53 является ранним событием, более характерна для вторичных глиобластом, развивающихся путем постепенной малигнизации глиом низкой степени злокачественности [219, 220, 273]. В опухолевом геноме взаимодействует множество факторов, генетические и эпигенетические события тесно связаны в патогенезе опухолей: например, мутация гена ТР53 влияет на метилирование ДНК путем участия в регуляции О6 метилгуанин-ДНК-метилтрансферразы, повышая устойчивость клеток глиобластомы к Temozolomide, мутации гена H3F3A связаны с модификациями гистонов, ген ATRX взаимодействует с гистоном Н3.3, а мутация гена ATRX влияет на изменение длины теломер и теломерный гетерохроматин [210, 309, 321]. Гетерозиготные мутации гена H3F3A (H3 histone, family 3A) патогномоничны для детских глиобластом и описаны в двух вариантах: замена лизина на метионин (K27M) и глицина на аргинин или валин (G34R/V). Обе мутации возникают в позиции, близкой к концевой N-терминали, которая подвергается важным посттрансляционным изменениям, связанным либо с подавлением (K27) либо с активацией (K36) процесса транскрипции [65, 66, 108, 145, 184, 267, 285, 322]. 29 Мутация гена IDH1 (isocitrate dehydrogenase в 1) детских глиобластомах выявляется в редких случаях, ее прогностическая значимость в данной возрастной группе не ясна [25]. Мутация гена ATRX (alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked) чаще возникает в глиобластомах взрослых, сочетается с мутациями генов IDH1, ТР53 и удлинением теломер - концевых участков хромосом, которые, связываясь со специфическими белками, образуют нуклеопротеиновый комплекс – теломерный гетерохроматин. Удлинение теломер приводит к генетической нестабильности и увеличению жизненного цикла опухолевых клеток [147, 177, 184]. 1.6. Эпигенетические события в глиобластомах Эпигенетические события заключаются в изменении экспрессии генов или фенотипа клетки, вызванных механизмами, не затрагивающими последовательности ДНК. К таким механизмам относятся метилирование ДНК, модификации гистонов, ремоделирование хроматина и микроРНК, и любой из этих механизмов теоретически может стать мишенью для терапии [44, 74, 111, 181, 312]. Молчание или активация онкогенов и генов-супрессоров могут быть обусловлены гипер- или гипометилированием ДНК. Модификация ДНК наиболее часто происходит за счет метилирования цитозина (рисунок 1) в участках с большим количеством CpG островков, большинство из которых в норме являются метилированными и сочетаются в геноме с неметилированными участками с малым количеством CpG островков (CpG – это аббревиатура, расшифровывающаяся следующим образом: ―Cytosine—phosphate—Guanine‖ – ―цитозин-фосфат-гуанин‖). Реакция метилирования цитозина в CpG островках катализируется ферментом ДНК-метилтрансферазой, метильной группы выступает S-аденозил метионин. в качестве донора 30 -NH3 Рисунок 1. Строение молекулы ДНК. Согласно Уотсону и Крику (1953 г.), ДНК состоит из двух антипараллельных направленных в разные стороны полинуклеотидных цепей, образующих двойную спираль. Каждая цепь состоит из сахарофосфатного остова (дезоксирибоза плюс фосфат), вдоль которого перпендикулярно длинной оси двойной спирали располагаются комплементарные друг другу основания ( A-T аденин - тимин, G-C гуанин - цитозин), соединенные водородными связями. Водородная связь – особый вид нековалентной связи, в ее образовании принимают участие в качестве доноров аминогруппы (аденина, цитозина и гуанина), акцепторами являются карбонильные группы (тимина, цитозина и гуанина). Метилирование ДНК – присоединение метильной группы NH3 к цитозину, при этом происходит модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности ДНК, поэтому метилирование ДНК относится к эпигенетической составляющей генома. Рисунок и текст - Кольман Я., Рѐм К.-Г. [8] и Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. [16]. 31 Гиперметилирование CpG островков приводит к молчанию генов, в глиобластомах описано гиперметилирование следующих генов: геновсупрессоров (retinoblastoma - RB1, epithelial membrane protein 3 - EMP3, RAS association domain family protein 1 - RASSF1A и zinc finger mynd domain-containing protein 10 - ZMYND10), генов, регулирующих клеточный цикл (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A - CDKN2A и cyclin-dependent kinase inhibitor 2B - CDKN2B), генов, участвующих в инвазии и запрограммированной гибели клеток (апоптозе) (death-associated protein kinase 1 - DAPK, tissue inhibitor of metalloproteinase 3 TIMP3 и cadherin 1 - CDH1), а также имеющих наибольшее клиническое значение генов, отвечающих за репарацию ДНК (methylguanine-DNA methyltransferase MGMT, mutL, E. COLI, homolog of, 1 - MLH1) [21, 112, 130, 133, 209, 210]. В опухолевом геноме глиобластом гиперметилирование гена MGMT приводит к его молчанию и потере функции по восстановлению ДНК, что позволяет более эффективно действовать алкилирующим агентам (Temozolomide) на опухолевые клетки, аналогично функционирует и ген MLH1, гиперметилирование этого гена говорит о чувствительности опухолевых клеток к препаратам нитрозомочевины (Nitrosourea) [41, 100, 206, 210, 226, 328]. Гиперметилирование гена MGMT происходит в глиобластомах взрослых, многочисленные исследования не выявили гиперметилирования гена MGMT в глиобластомах у детей [141, 152, 176, 260, 281]. На уровне целого генома глиобластомы у детей и взрослых имеют различную структуру метилирования: взрослые глиобластомы имеют либо гиперметилированный генотип (так называемый G-CIMP-positive ―glioma-CpG island methylator phenotype‖, часто сочетающийся с мутацией гена IDH1) либо нормометилированный (контролем является нормальная мозговая ткань) генотип, в то время как глиобластомы у детей отличаются гипометилированным генотипом, таким образом, чувствительными к лечению Temozolomide оказывается только группа взрослых глиобластом с гиперметилированным генотипом и мутацией гена IDH1 [15, 126, 285, 300, 329]. Гипометилирование определенных участков генома в свою очередь запускает определенных онкогенов в глиобластомах у детей и взрослых [54]. активацию 32 Метилирование также может происходить и в обычно неметилированных участках (участках не-цитозин-гуанин): такое не CG–метилирование описано в эмбриональных стволовых клетках, где составляет 25% от всех метилированных участков [179, 180]. 1.6.1. Модификации гистонов и ремоделирование хроматина в глиобластомах У эукариотических клеток основной структурой ядра является хроматин – комплекс ДНК и гистоновых белков, формирующих нуклеосому. Нуклеосома представляет собой октамер из четырех гистонов H3, H4, H2A, H2B, вокруг которых намотано 147 пар оснований ДНК. Структура гистонов представлена шаровидной формы сердцевиной и концевой N-терминалью (рисунок 2). 33 Рисунок 2. Структура хроматина. В ядре эукариот ДНК связана с белками и образует хроматин. Морфологически различают эухроматин (соответствует участкам хромосом с активной транскрипцией, в которых происходит синтез ДНК на матрице РНК) и гетерохроматин (более конденсирован). Белки хроматина подразделяют на гистоновые и негистоновые (структурные ядерные белки, ферменты и факторы транскрипции). Гистоны – небольшие белки, из-за высокого содержания лизина и аргинина обладающие свойствами сильных оснований, связанные с ДНК, участвуют в структурной организации хроматина, обеспечивают плотную упаковку ДНК в ядре. По две молекулы каждого из гистонов – Н2А, Н2В, Н3 и Н4, составляют октамер, обвитый сегментом ДНК, фомируя нуклеосому. Гистоны в октамере имеют подвижный N-концевой фрагмент из 20 аминокислот, выступающий из нуклеосомы и служащий для поддержания структуры хроматина и контроля за генной экспрессией. Участок ДНК, не связанный с октамером, взаимодействует с гистоном Н1 и формирует суперспиральную структуру (соленоид). Рисунок и текст - Кольман Я., Рѐм К.-Г. [8] и Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. [16]. 34 Существуют два вида хроматина – активный эухроматин, каждый из них молчащий связан гетерохроматин с определенным и типом модификаций. Геторохроматин обеспечивает защиту концевых отделов теломер (N-терминалей) и разделение хромосом во время митоза и связан с низким уровнем ацетилирования и высоким уровнем метилирования гистонов H3K9, H3K27 и H4K20. Эухроматин представляет собой наибольшую часть генома, для него характерно ацетилирование и метилирование гистонов H3K4, H3K36 и H3K79. Гистоны модифицируются посттрансляционно, в этом случае может повреждаться их взаимодействие с ДНК и протеинами ядра. Модификации гистонов составляют так называемый ―гистоновый код‖, который и определяет статус структуры хроматина, а также регулирует виртуально все процессы, действующие или зависящие от ДНК, включая репликацию и репарацию, регуляцию экспрессии генов и сохранность центромер и теломер. Модификации гистонов чаще затрагивают область N-терминали и включают помимо ацетилирования и метилирования лизина и аргинина, также форфорилирование, убиквитинацию (распад белков в протеасомах), аденозиндифосат АДФ рибозилирование, деаминацию и изомеризацию пролина [59, 169, 267, 265]. МикроРНК - класс некодирующих РНК, которые представляют собой эндогенные малые молекулы РНК, имеющие приблизительно 20-30 пар нуклеотидов. МикроРНК влияют на регуляцию путем подавления трансляции (процесса синтеза белка из аминокислот на матрице информационной (матричной) РНК, осуществляемый на рибосомах) и деградации мРНК. Также микроРНК служат регуляторами активности генов, соединяются с комплементарной мРНК и обеспечивают молчание определенных генов. Экспрессия микроРНК повышена в опухолях, особенно глиального ряда. МикроРНК влияют на рост, пролиферацию, миграцию и выживаемость опухолевых клеток. Использование микроРНК в комплексном лечении глиобластом может повысить эффективность лучевой и химиотерапии [167, 295]. 35 1.7. Глиобластомы больших полушарий Супратенториальная локализация глиобластом выявляется в подавляющем большинстве случаев у взрослых пациентов, у детей супратенториальные опухоли составляют около трети от всех детских глиобластом и развиваются чаще в возрасте 15-18 лет. Тотальное или близко к тотальному (~90%) удаление опухоли считается благоприятным прогностическим фактором [48, 80, 227]. 1.7.1. Цитогенетические аберрации Наиболее распространенными количественными изменениями копийности генов в детских полушарных глиобластомах являются добавка хромосомы 1q (встречающаяся в 20% детских глиобластом и только в 9% глиобластом взрослых), потеря хромосомы 16q (18% и 7% соответственно) и потеря хромосомы 4q (15% и 2%). Для детских глиобластом характерна амплификация гена PDGFRA, выявляемая в 14% опухолей, в то время как в глиобластомах взрослых амплификация локуса 4q12 встречается несколько реже – в 10% опухолей. Аберрации взрослых глиобластом - добавка хромосомы 7 (74% взрослых глиобластом) и потеря хромосомы 10q (80% взрослых глиобластом) встречаются в детских полушарных глиобластомах значительно реже: в 12% и 27% соответственно. Также менее распространена в детских глиобластомах и амплификация гена EGFR (10% детских опухолей и более 40% глиобластом взрослых) [34, 150, 166, 224, 236, 320]. 1.7.2. Мутации Мутация гена ТР53 выявляется в 40% полушарных глиобластом у детей, что сходно с частотой мутации во взрослых глиобластомах. В полушарных глиобластомах у детей мутация гена H3F3A выявляется в меньшем проценте случаев, чем в глиобластомах ствола головного мозга. В супратенториальных опухолях мутация гена H3F3A происходит в виде замены 36 глицина на аргинин или валин (вариант G34R/V), варианта K27M не описано [285, 322]. 1.8. Глиобластомы зрительного бугра Глубинные глиобластомы зрительного бугра у детей составляют от 30 до 50% от всех злокачественных глиом ЦНС [93, 170]. При нейрофиброматозе первого типа риск заболеть глиобластомой таламуса увеличен в первые два десятилетия жизни [76]. Выделяют также диффузные двусторонние глиобластомы таламуса, которые следует дифференцировать с синдромом Leigh – подострой некротизирующей энцефаломиелопатией заболеванием, развивающимся у детей - редким нейрометаболическим при мутациях в митохондриальной и ядерной ДНК [201]. Цитогенетические аберрации в таламических глиобластомах отдельно в литературе не представлены, мутация гена H3F3A происходит в варианте K27M [285, 322]. 1.9. Глиобластомы ствола головного мозга Диффузные злокачественные понтинные глиомы развиваются чаще в возрасте 6-7 лет, прогноз при данной патологии крайне неблагоприятный: более 90% детей умирают в течение 2 лет после диагноза из-за бурного роста глиобластом [105, 124, 156]. Хирургическое удаление не рекомендовано для таких опухолей из-за локализации и инфильтративного характера роста, обычно диагноз ставится на основании быстрого развития симптомов МРТ-картины, также помочь в диагностике могут томография, протонная магнитно-резонансная и характерной позитронно-эмиссионная спектроскопия и SWI (susceptibility-weighted imaging - «восприимчиво взвешенные изображения»), а позволяющие добиться высокой степени детализации методики воксельной спектроскопии способны предсказывать показатели выживаемости по степени вовлечения Варолиева моста головного мозга и соотношению холина и Nацетиласпартата [17, 24, 48, 121, 125, 129, 131, 138, 159, 185, 186, 268, 280, 283, 37 284, 308]. Долгое время вопрос о стереотаксической биопсии диффузных понтинных злокачественных глиом обсуждался в литературе, чередуя периоды необходимости и ненужности данной манипуляции. На сегодняшний день в некоторых клиниках рекомендуется проведение стереотаксической биопсии диффузной понтинной опухоли с целью морфологической верификации процесса и исключения примитивной нейроэктодермальной опухоли ствола головного мозга. Для рассчета мишени для стереотаксической биопсии может помочь количественная диффузионно-взвешенная МР-перфузия [55, 123, 185, 189, 280, 286, 308]. В то же время большинство нейрохирургов отрицательно относятся к данной процедуре, так как существующие на данный момент методы лечения (локальная лучевая терапия) не зависят от патоморфологических находок. Стандартным лечением для диффузных глиобластом ствола является лучевая терапия в суммарной очаговой дозе 55-60 Грей, обычная и гипофракционированная терапия не оказывают значительного влияния на показатели выживаемости у детей с диффузными глиобластомами ствола головного мозга [48, 115, 144, 212]. На сегодняшний день роль химиотерапии в лечении диффузных глиобластом ствола не определена, большинство авторов [47, 67, 75, 142, 275] не выявили какого-либо улучшения в выживаемости пациентов данной группы при лечении химиопрепаратами, данный вид терапии лишь усугублял за счет гематологической токсичности и без того невысокое качество жизни детей с понтинными глибластомами [67]. Несколько лет назад Институт нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко принимал участие в международном мультицентровом исследовании препарата ―Тералок‖ (Nimotuzumab), результаты этой работы также не выявили улучшения показателей общей выживаемости у детей с глиобластомами ствола при назначении химиотерапии препаратами, мишенью для которых является ген EGFR. Для диффузных глиобластом ствола характерен быстрый продолженный рост, для лечения рецидивов опухоли некоторыми авторами предлагается 38 повторное облучение [95, 319], хотя при этом возрастает риск неврологических нарушений. В очень редких случаях развивается вторичное метастазирование, поэтому для контроля заболевания рекомендуется проводить МРТ головного и спинного мозга, а при выявлении лептоменингеальной диссеминации (как первичной так и вторичной) – краниоспинальное облучение с одновременной химиотерапией Temozolomide или Nimotuzumab [207, 269]. Также отслеживать и контролировать заболевание помогает и воксельная спектроскопия, с помощью которой возможно оценивать эффективность лучевой терапии и отличить продолженный рост опухоли от постлучевых изменений [175]. Для диффузных глиобластом ствола головного мозга разрабатываются новые, основанные на явлении конвекции, способы доставки лекарственных химиотерапевтических препаратов (Topotecan и Carboplatin) непосредственно в ткань опухоли с помощью робототехники [23, 33]. Изучение генетических аберраций и мутаций в таком потенциально летальном заболевании как диффузные понтинные глиобластомы лимитировано отсутствием опухолевого материала. Поэтому в последнее время в литературе обсуждается вопрос о проведении аутопсий в сроки от 2 до 4 часов с момента биологической смерти с целью получения опухолевого материала для изучения генетических аберраций, мутаций и создания преклинических моделей, позволяющих изучать принципы опухолевого развития, роста и прогрессии, а также механизм действия тех или иных терапевтических агентов, механизмы устойчивости опухоли к лечению в культуре клеток и на животных моделях [60, 62, 306]. Благодаря созданию специального комитета родственники умерших пациентов получают поддержку и после проведения соответствующих разъяснительных бесед, понимают и принимают проведение аутопсии как необходимой меры, направленной на изучение опухолевой природы и будущую возможность и надежду помочь другим детям с диффузными глиобластомами [24, 26, 32, 61, 143]. 39 1.9.1. Цитогенетические аберрации Количественные изменения копий генов в диффузных глиобластомах ствола показывают сходство с аберрациями в полушарных глиобластомах, некоторые особенности понтинных опухолей состоят в более высоком проценте несбалансированности генома и частых добавках хромосом 2, 8q и 9q. Потери хромосом 16q, 17p и 20p происходят в глиобластомах ствола у детей реже, чем в глиобластомах взрослых. Добавка хромосомы 1q выявляется в большем проценте (47%) диффузных глиобластом ствола, чем наблюдается в полушарных детских глиобластомах (20%). Амплификация гена PDGFRA также как и в полушарных глиобластомах является наиболее распространенной из всех амплификаций [34, 150, 223, 234, 310, 326]. 1.9.2. Мутации Мутация гена ТР53 выявляется в диффузных понтинных глиобластомах гораздо чаще (70%), чем в полушарных детских опухолях (40%). Мутация гена H3F3A происходит в варианте K27M и возникает чаще по сравнению с полушарным вариантом G34R/V [150, 285, 322]. 1.10. Глиобластомы мозжечка Глиобластомы мозжечка являются редкой патологией и имеют худший прогноз по сравнению с глиобластомами больших полушарий, даже несмотря на тотальное удаление опухоли [153, 155, 241, 255, 258]. По данным Karremann et al. в глиобластомах мозжечка у детей мутация гена ТР53 выявляется более чем в половине случаев при полном отсутствии мутации гена Н3F3A [155]. 40 1.11. Глиобластомы спинного мозга Первичные спинальные глиобластомы у детей составляют менее 1% от всех опухолей ЦНС и характеризуются повышенным риском метастазирования опухоли в ЦНС и за ее пределами [174, 217, 237, 259]. Прогностически благоприятным фактором является возраст младше 7 лет [174]. Рекомендуется стандартное лечение – максимально возможное удаление опухоли, лучевая терапия СОД 50 Грей (для детей старше 3 лет) и химиотерапия препаратами Lomustine и Vincristine [9, 77, 118, 168, 217, 292, 296]. Для лечения спинальных глиобластом у детей младше трех лет может применяться Sorafenib и вальпроевая кислота [251]. По данным Wolff et al. можно выделить 2 группы спинальных злокачественных глиом: распространенные опухоли у детей более младшего возраста с умеренным потенциалом роста и небольшие по размеру опухоли склонные к быстрому росту у детей более старшего возраста [318]. Немногочисленные исследования, посвященные цитогенетическим аберрациям показывают, что спинальные глиобластомы чаще имеют стабильный кариотип [270], мутация гена H3F3A происходит в варианте K27M [285, 322]. 1.12. Заключение Глиобластомы у детей представляют собой гетерогенную группу заболеваний, состоящую как минимум из двух генетически разнородных подгрупп, напрямую связанных с локализацией опухоли: глиобластомы срединных и глубинных структур и поверхностные полушарные глиобластомы. Опухоли, локализующиеся в зрительном бугре, стволе головного мозга и спинном мозге в большинстве случаев показывают мутацию гена H3F3A вариант K27M, в то время как полушарные глиобластомы имеют другую разновидность мутации того же гена вариант G34R/V и могут быть удалены тотально, а следовательно, 41 являются прогностически более благоприятной подгруппой. Возраст младше 3 лет также считается прогностически благоприятным признаком для глиобластом. Генетические аберрации подробно изучены только во взрослых глиобластомах, что касается детских глиобластом - на сегодняшний момент в мировой литературе почти нет данных, касающихся генетики детских глиобластом на больших сериях, что и послужило основной целью данной работы – изучить цитогенетические аберрации и эпигенетические события на большой группе детких глиобластом, сравнить их со взрослыми опухолями и оценить прогностическое значение выявленных нарушений в геноме и эпигеноме. 42 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Дизайн исследования: ретроспективное 2.1. Общая характеристика клинического материала В исследование были включены только те пациенты c первичнодиагностированными глиобластомами в возрасте до 18 лет, у которых диагноз «глиобластома» был подтвержден на основании генетического исследования с помощью Illumina HumanMethylation450 BeadChip и были известны катамнестические данные. Таким образом, в исследование было включено 136 пациентов, оперированных в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко» в период с 1998 по 2013 годы. Среди этих пациентов было 69 мальчиков и 67 девочек в возрасте от 4 месяцев до 18 лет, средний возраст составил 10 лет (и для мальчиков и для девочек). Распределение пациентов по полу и возрасту представлено на рисунок 3. Для распределения детей по возрастным группам использована следующая общепринятая в педиатрии шкала: возраст до 6 месяцев, до 1 года, до 3 лет, от 4 лет до 7 лет, от 8 лет до 15 лет, от 16 лет до 18 лет. 43 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Возраст до 6 месяцев Возраст от 6 месяцев до 1 года Возраст старше 1 года до 3 лет Возраст от 4 до 7 лет Мальчики (n-69) 1 0 Возраст старше 1 года до 3 лет 2 Девочки (n-67) 0 0 3 Возраст от Возраст до 6 месяцев 6 месяцев до 1 года Возраст от 8 до 15 лет Возраст от 16 до 18 лет Возраст от Возраст от 4 до 7 лет 8 до 15 лет Возраст от 16 до 18 лет 18 38 10 18 31 15 Рисунок 3. Распределение больных с глиобластомами по возрасту и полу (ось y – количество больных, ось x – возраст). 44 Все пациенты были обследованы согласно принятой в ФГБНУ «НИИ НХ» схеме, включающей МРТ головного или спинного мозга с контрастированием, оценку общего функционального статуса по шкалам Лански и Карновского и неврологической симптоматики, оценку степени внутричерепной гипертензии по клиническим признакам и офтальмоскопической картине глазного дна, электроэнцефалографию, общий и биохимический анализы крови (Приложение 1). 2.1.1. Характеристика нейрохирургических методов лечения Все пациенты подверглись оперативному лечению по поводу полушарных глиобластом, глиобластом таламуса и ствола головного мозга, глиобластом мозжечка и опухолей спинальной локализации. Стереотаксическая биопсия проводилась после рассчетов с использованием стереотаксического оборудования при диффузно растущих опухолях таламуса и ствола головного мозга, операции микрохирургического удаления внутримозговых глиобластом выполнялись с использованием операционного микроскопа и микрохирургической техники, нейронавигации и электрофизиологического мониторинга, использовались принятые в ФГБНУ «НИИ НХ» техники стандартных кожных разрезов и доступов в проекции расположения опухоли. Оценка степени удаления опухоли на сегодняшний день является дискутабельной, по данным одних авторов [170] – тотальное удаление опухоли (gross-total resection (GTR)) подразумевает, что хирургу удалось удалить всю видимую опухоль, и послеоперационная нейровизуализация не выявила остатков опухоли, то есть речь идет о 100% макроскопическом удалении опухоли. Хотя по данным «Стандартов, опций и рекомендаций в лечении первичных опухолей ЦНС (2012-2013) под тотальной резекцией понимается удаление более чем 90% опухоли [1]. Субтотальным согласно Kramm et al. [170] считается удаление более 90% опухоли, частичным – менее 90% опухоли, целью стереотаксической и открытой биопсии является получение маленького фрагмента опухоли для гистологической верификации диагноза, эти манипуляции выполняются без 45 опухолевой циторедукции. В нашей работе при оценке радикальности мы придерживались рекомендаций Kramm et al. [170] и использовали следующие критерии: I степень радикальности – практически полное (или тотальное) удаление опухоли: интраоперационно нейрохирург отмечает отсутствие опухоли, МРТ, проведенная на 2-3 сутки, не выявляет остатков опухоли. II степень радикальности – субтотальное удаление опухоли: интраоперационно нейрохирург отмечает небольшие остатки опухоли, по данным МРТ отмечается удаление более 90% опухоли. III степень радикальности - частичное удаление опухоли: интраоперационно нейрохирург отмечает остатки опухоли, по данным МРТ, удалено менее 90% опухоли. Биопсия - получение небольшого фрагмента опухоли для гистологической верификации диагноза. Биопсия опухоли проводилась в 15 случаях, частичное удаление опухоли (по данным протоколов операций и послеоперационных КТ или МРТ без и с контрастным усилением, проведенных в течение 24-72 часов после операции) проведено в 16 случаях, субтотальное удаление опухоли (по данным протоколов операций и послеоперационных КТ или МРТ без и с контрастным усилением, проведенных в течение 24-72 часов после операции) в 41 случаях, тотально (по данным протоколов операций и послеоперационных КТ или МРТ без и с контрастным усилением, проведенных в течение 24-72 часов после операции) опухоль была удалена у 64 пациентов. Подробные данные о радикальности удаления представлены в таблице 1. 46 Таблица 1 Степень радикальности в зависимости от локализации опухоли Тотальное удаление (n=64, 47%) 56 (87%) Полушария (n=70, 51%) Таламус 0 (n=34, 25%) Ствол 0 (n=18, 13%) Мозжечок 1 (2%) (n=2, 2%) Спинной мозг 7 (11%) (n=12, 9%) Субтотальное удаление (n=41, 30%) 9 (22%) Частичное удаление (n=16, 12%) 3 (19%) Биопсия (n=15, 11%) 26 (64%) 5 (31%) 3 (20%) 1 (2%) 7 (44%) 10 (67%) 1 (2%) 0 0 4 (10%) 1 (6%) 0 2 (13%) 2.1.2. Глиобластомы больших полушарий головного мозга 2.1.2.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ Глиобластомы у 70 больных не имели четкой границы между опухолью, отеком и мозговым веществом. Наиболее часто опухоль располагалась в глубинных отделах белого вещества лобной (40%), височной (30%) и теменной долей (25%) головного мозга, а также в мозолистом теле с распространением на оба полушария (имея при этом характерную картину в виде «бабочки»). По данным КТ выявлялась гетерогенная плотность, а также центральная зона низкой плотности (90% случаев), представляющая зону некроза. Часто выявлялись кровоизлияния различной давности. Опухоль была обычно окружена широкой зоной перифокального отека (100%), распространяющегося в белом веществе больших полушарий. После введения контраста появлялся характерный вид кольца с неровным внутренним контуром. Данные МРТ подтверждали гетерогенную структуру опухоли с распространным отеком белого вещества. 47 Рисунок 4. Глиобластома правой лобной области. МРТ в аксиальной проекции в режиме Т1 (А), Т2 (Б), с контрастом (В). Диффузно растущая опухоль имеет гипоинтенсивный в Т1 и гиперинтенсивный сигнал в Т2 режиме. В пределах опухоли выявляется полость (некроз, кровоизлияние). Опухоль гетерогенно накапливает контрастное вещество в виде кольца с неровными контурами. 48 2.1.2.2. Показания к операции Удаление опухоли производилось во всех случаях подозрения на глиобластому больших полушарий головного мозга. Задачей операции являлось удаление основной массы опухоли и создание тем самым благоприятных условий для лучевой и химиотерапии. Ставилась задача максимально полного удаления опухоли. 2.1.2.3. Особенности операции и интраоперационная морфология По интраоперационным данным опухоль обычно представляла собой гетерогенную ткань, в периферической зоне крайне кровоточивую, розоватого цвета, врастающую полосами и узлами в белое вещество, а в центральной зоне – рыхлую желтовато-белую массу с запустевшими сосудами. Удаление периферической зоны продолжалось до явной границы с белым веществом, после чего кровотечение останавливалось. Определение границы крайне затруднялось распространенным отеком белого вещества. Для удаления использовался УЗаспиратор и коагуляция. Удаление центральной части производилось обычным широким отсосом. При расположении небольшой опухоли в глубинных отделах полушарий для ее локализации использовалась безрамная навигация, а также функционально-значимых зонах интраоперационное УЗИ. При расположении использовалась опухоли предоперационная в функциональная МРТ, а также интраоперационная идентификация моторных центров. При различные больших методики интенсивно кровоснабженных кровосбережения: опухолях дооперационная применялись эндоваскулярная эмболизация питающих артерий, индивидуальный подбор гематологических компонентов, тщательный интраоперационный мониторинг параметров 49 гемодинамики, опережающее введение свежезамороженной использование препарата NovoSeven, плазмы, интраоперационная реинфузия аутоэритроцитов, использование помповых инфузионных систем. 2.1.3. Глиобластомы подкорковых узлов 2.1.3.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ По принятой в ФГБУ «НИИ НХ» классификации [6] узловые опухоли таламуса представлены пилоидными астроцитомами, а диффузные – астроцитомы, анапластические астроцитомы и глиобластомы. Для глиобластом таламуса (в нашей серии 34 пациента) характерны некроз и сосудистая пролиферация, что и определяет типичные нейрорентгенологические признаки. Гетерогенность по данным КТ и МРТ объясняется наличием участков солидного компонента опухоли, зон некроза, кровоизлияний и перифокального отека. Контрастное вещество обычно накапливалось в виде широкого кольца с неровными контурами. У ряда больных выявлялись псевдоузловые опухоли, где зона повышенной плостности с достаточно четкими контурами представляла собой участок кровоизлияния. 50 Рисунок 5. Глиобластома задних отделов левого зрительного бугра. МРТ в аксиальной проекции в режиме Т1(А), Т2(Б) и с контрастным усилением (В). Опухоль имеет диффузный характер роста, деформирует задние отделы третьего желудочка и треугольник бокового желудочка, вызывает окклюзионную гидроцефалию. Опухоль гетерогенно накапливает контрастное вещество в виде неровного кольца. 51 2.1.3.2. Показания к операции Хирургическое удаление опухолей зрительного бугра считается обоснованным при опухолях с узловым характером роста, который наиболее характерен для пилоидных астроцитом и при инфильтративно-растущих опухолях, в пределах которых были компактные, хорошо отграниченные участки, зоны некроза и перенесенных кровоизлияний (псевдоузловой тип), наиболее характерный для глиобластом. Целью операции являлась декомпрессия данной области мозга, частичное удаление опухоли, без затрагивания периферической зоны, взятие биопсии и в случае рецидивной опухоли получение материала для изготовления дендритных вакцин. При инфильтративных диффузных опухолях таламуса, имевших нечеткие границы на МРТ и инфильтрировавших структуры мозга без их деформации и смещения, хирургическое лечение считалось противопоказанным. В этих случаях проводилась стереотаксическая биопсия для уточнения гистологического диагноза и выбора тактики комбинированной терапии [6]. 2.1.3.3. Особенности операции и интраоперационная морфология Хирургические доступы к опухолям зрительного бугра определялись топографическим вариантом роста опухоли и включали транскаллезный, затылочный межполушарный, реже – транскортикальный, птериональный и супрацеребеллярный. При глиобластомах превалировало субтотальное и частичное удаление. Наибольшая радикальность удаления отмечалась при опухолях передних отделов зрительного бугра с дорзальным распространением и опухолях центральномедиального распространения. Наименее радикально удалялись опухоли переднебазального и центрально-латерального распространения, что было связано с 52 риском повреждения внутренней капсулы, ствола мозга и перфорирующих артерий на основании мозга. 2.1.4. Глиобластомы ствола головного мозга 2.1.4.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ По существующей классификации [17] узловые опухоли ствола по данным МРТ и КТ представлены астроцитомами, диффузно-растущие опухоли – анапластическими астроцитомами и глиобластомами, и псевдоузловые опухоли – ПНЭО. При глиобластомах ствола (18 больных) на КТ выявлялся округлый очаг низкой плотности, накапливающий по периферии контрастное вещество. Центральная зона низкой плотности представляла собой зоны некроза, аналогичная картина выявлялась и по данным МРТ Т1. Обычно опухоль поражала как минимум 2 отдела ствола мозга. 2.1.4.2. Показания к хирургическому лечению Стереотаксическая биопсия опухолей ствола в нашем материале не проводилась в связи с информативностью КТ/МРТ, позволяющей в большинстве случаев отличить узловую опухоль от диффузно-растущей. Уточнение гистологической природы диффузно-растущей опухоли практически не влияло на выбор тактики лечения, к тому же глиобластомы имели достаточно патогномоничный вид по данным нейровизуализации. Показания к удалению глиобластом ствола были крайне узкими и ограничивались наличием большой опухоли с некротическим компонентом. В этих наблюдениях задачей хирургии было опорожнение кисты и удаление центральных некротических масс с целью декомпрессии ствола. Удаление периферической плотной части считалось крайне опасным, так как в этой области опухоль имела диффузный характер роста. 53 Рисунок 6. Глиобластома моста. МРТ в аксиальной и фронтальной проекции в режиме Т1 (А), Т2 (Б), с контрастным усилением (В,Г). Диффузная опухоль имеет гипоинтенсивный в Т1 и гиперинтенсивный в Т2 сигнал. Отмечается очаговое гетерогенное накопление контрастного вещества. Опухоль деформирует дно четвертого желудочка. 54 2.1.4.3. Особенности операции и интраоперационная морфология Хирургические доступы к опухолям ствола определялись их локализацией и включали срединный доступ, ретросигмовидный, односторонний супрацеребеллярный, подвисочный с рассечением намета мозжечка, затылочный транстенториальный и пресигмовидный. Если опухоль выходила на поверхность дна IV желудочка, то доступ осуществлялся именно в этом месте. При расположении опухоли в толще ствола использовались электрофизиологические методики стимуляции моторных ядерных структур III, VI, VII, IX, X пар черепно-мозговых нервов. Для удаления опухоли использовался ультразвуковой отсос с узким длинным наконечником, либо же биполярная коагуляция опухоли с аспирацией коагулированных фрагментов обычным тонким отсосом. В тот момент, когда граница между опухолью и мозгом становилась сомнительной, дальнейшее удаление тут же прекращалось. По своим морфологическим характеристикам глиобластомы ствола напоминали таковые при опухолях больших полушарий. 2.1.5. Глиобластомы задней черепной ямки 2.1.5.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ У двух наших больных опухоль была представлены крупным очагом гетерогенной плотности по данным МРТ с наличием большой внутриопухолевой кисты (зоны некроза) в области гемисферы мозжечка. 2.1.5.2. Показания к операции Операция показана всем больным с подозрением на любую опухоль мозжечка и IV желудочка. Опухоль обычно располагалась в гемисфере мозжечка, в одном наблюдении проникая в IV желудочек, но не инфильтрируя его дно. 55 Целью операции было максимально радикальное удаление опухоли с захватом перитуморальной зоны белого вещества мозжечка. 2.1.5.3. Особенности операции и интраоперационная морфология Глиобластомы мозжечка представляли собой достаточно большие опухоли с малососудистой зоной некроза, заполненной ксантохромной жидкостью, а также розового цвета обильно кровоснабженной периферией, многочисленными «выростами», проникавшая в белое вещество мозжечка. 56 Рисунок 7. Глиобластома левой гемисферы мозжечка. Рецидив опухоли. Опухоль гипоинтенсивна в режиме Т1 (А,Б), не имеет четкой границы с прилежащим мозгом. Строма опухоли гетерогенно накапливает контрастное вещество. Деформация прилежащего мозга незначительна. 57 2.1.6. Глиобластомы спинного мозга 2.1.6.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ С хирургической точки зрения все многообразие интрамедуллярных опухолей можно разделить на 2 группы: отграниченные (эпендимомы, гемангиобластомы, пилоидные астроцитомы) и диффузные (астроцитомы, анапластические астроцитомы, глиобластомы). При глиобластомах спинного мозга (12 больных) по данным МРТ наиболее часто отмечается гетерогенная плотность, а также гетерогенное накопление контраста. Типичное для глиобластом другой локализации кольцевое накопление контраста встречается у этих больных крайне редко и не является патогномоничным. 2.1.6.2. Показания к операции Если целью хирургического вмешательства для отграниченных опухолей является тотальное удаление вдоль плоскости диссекции, то для глиобластом – максимальное удаление опухолевого объема в пределах «переходной зоны» с минимальным риском развития неврологических нарушений [9]. 2.1.6.3. Особенности операции и интраоперационная морфология Характерным отличием глиобластом является отсутствие плоскости диссекции, что определяется наличием широкой «пограничной зоны», где клетки опухоли располагаются между нервными волокнами. В этих случаях очень важным было использование вызванных двигательных потенциалов. Опухоль обычно удалялась послойно, до достижения визуальной переходной зоны, либо до появления снижения амплитуды и устойчивости вызванных двигательных потенциалов. 58 Рисунок 8. Глиобластома шейного отдела спинного мозга и продолговатого мозга. МРТ в сагиттальной проекции в режиме Т1 (А), Т2 (Б), с контрастным усилением (В). Опухоль локализуется на уровне С1-С7 позвонков и в каудальном отделе ствола мозга, не имеет четкой границы с прилежащим мозгом, гетерогенно накапливает контрастное вещество. 59 2.2. Характеристика методов адъювантного лечения нейрохирургических больных с глиобластомами После верификации опухоли и получения гистологического диагноза пациенты в возрасте от 3 до 18 лет получили химиолучевое лечение на базах Федерального государственного бюджетного учреждения "Российский научный центр рентгенорадиологии Минздрава РФ" (ФГБУ РНЦРР), Федерального государственного бюджетного учреждения ―Российская детская клиническая больница‖ (ФГБУ ―РДКБ‖ Минздрава России), Государственного бюджетного учреждения здравоохранения города Москвы ―Морозовская детская городская клиническая больница‖ Департамента здравоохранения города Москвы, Федерального государственного бюджетного учреждения ―Федеральный научноклинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева (ФГБУ ―ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева‖ Минздрава России), ФГБНУ «НИИ НХ» или, после консультации онколога, по месту жительства с использованием протокола HIT-HGG-2007 или его предыдущей версии HIT-HGG-2000. Согласно протоколу HIT-HGG-2007 детям от 3 до 18 лет после максимально безопасного радикального удаления опухоли и стадирования процесса при М0 стадии проводилась локальная лучевая терапия: в СОД до 54 Гр для детей от 3 до 5 лет, до 59,4 Гр для детей старше 6 лет, доза при опухолях ствола головного мозга не превышала 54 Гр. Дети с локализацией опухоли в спинном мозге получали локально 50,4 Гр - 54 Гр. Параллельно с лучевой терапией проводилась монохимиотерапия препаратом Темозоломид в дозе 75 мг/м2/сутки ежедневно. Через 4 недели после лучевой терапии проводилась консолидирующая монохимиотерапия двенадцатью пятидневными циклами Темозоломида каждые 28 дней в дозе 150-200 мг/м2/сутки. Контроль ответа на терапию (МРТ головного мозга) проводился перед началом монохимиотерапии и после каждого четного цикла Темозоломида. 60 Семь пациентов были лечены с использованием протокола ―Бевацизумаб в комбинации с Темозоломидом и лучевой терапией у пациентов с первично-диагностированной анапластической астроцитомой, глиобластомой и глиосаркомой‖. Согласно данному протоколу лучевая терапия проводилась на гамма-аппарате или линейном ускорителе, проведение лучевой терапии начиналось не позднее 2-3 недель после операции. Локальная лучевая терапия проводилась на ложе удаленной опухоли с захватом здоровой ткани, отступая на 2-3 см от краев поражения в СОД 55-56 Гр. Лучевая терапия проводилась 5 дней в неделю, продолжительность лучевого лечения составляла шесть – шесть с половиной недель. Ежедневная очаговая доза составляла 1,8 Гр. Одновременно с лучевой терапией в первую неделю облучения начиналась химиотерапия Темозоломидом - 75 мг/м2/сутки в капсулах ежедневно в течение всего периода облучения и Бевацизумабом (Авастином), который начинали вводить спустя 4 недели после операции, одновременно с лучевой терапией. Авастин вводили внутривенно, капельно в дозе 5-7,5 мг/кг веса, разведенного в 400 мл физиологического раствора. После завершения лучевой терапии перерыв лечения составлял 4 недели. Далее проводилась поддерживающая комбинированная химиотерапия Темозоломидом и Бевацизумабом (Авастином), во время которой у шести из семи пациетов возникла прогрессия заболевания. Одна пациентка получила шесть циклов поддерживающей комбинированной химиотерапии, в данный момент получает поддерживающую монотерапию Бевацизумабом (Авастином). У детей младше 3-х лет после операции на первом этапе проводился протокол Baby POG [88]. Основная цель этой методики – назначение пролонгированной послеоперационной полихимиотерапии и откладывание назначения токсичной лучевой терапии у детей младше 3-х лет. Протокол BABY POG включает чередующиеся блоки ААВ с интервалом 28 дней, каждый из которых состоит из 3-х циклов: Цикл А – Винкристин 0,065 мг/кг 1 и 8 дни, Циклофосфан 65 мг/кг в/в 1 день; Цикл В – Цисплатин 4 мг/кг 1 день, Вепезид 6,5 61 мг/кг 3, 4 дни. Рекомендованная длительность терапии у детей младше 2-х лет 24 месяца, у пациентов старше 2 лет - 12 месяцев. После завершения полихимиотерапии проводилась локальная лучевая терапия на ложе удаленной опухоли. При отсутствии остаточной опухоли СОД составляла 50 Гр, при наличии остаточной опухоли – обсуждался вопрос о повторной операции, после чего проводилась локальная лучевая терапия в СОД 55 Гр. При возникновении локального рецидива опухоли обсуждался вопрос о повторном хирургическом удалении, которому в ФГБНУ «НИИ НХ» подверглись 34 человека, далее проводилась полихимиотерапия второй линии препаратами Ломустин, Цисплатин и Винкристин в режиме поддерживающей полихимиотерапии протокола HIT-HGG-2000/07 либо назначались Авастин 400 мг внутривенно капельно и Иринотекан 200 мг внутривенно капельно каждые 2 недели при условии удовлетворительных показателей крови. 2.3. Формирование групп для исследования биологии глиобластом у нейрохирургических больных Для изучения и сравнения нарушений в геноме глиобластом у детей и взрослых были сформированы две группы: исследуемая детская и контрольная взрослая. Список пациентов обеих групп приведен в Приложении 2. Обе группы имели одинаковый гистологический диагноз, набраны в одном лечебном учреждении, оперированы одним коллективом нейрохирургов, при этом радикальность удаления опухоли зависела от топографии глиобластомы, все пациенты получили одинаковое лечение согласно протоколам. В исследуемую группу было включено 136 пациентов: 69 мальчиков и 67 девочек в возрасте от 4 месяцев до 18 лет, средний возраст составил 10 лет (и для мальчиков и для девочек). Все 136 пациентов имели первичные глиобластомы de novo; пациенты озлокачествления с глиобластомами, глиом низкой возникшими степени после злокачественности, постепенного а также с вторичными опухолями, развивающимися после предшествующего лечения по 62 поводу лейкозов и медуллобластом, в исследование не включены. Данные об аберрациях рецидивных глиобластом, возникших у пациентов исследуемой группы, также не включены. Критериями для включения в исследуемую группу были: возраст от 4 месяцев до 18 лет, наличие достаточного количества замороженного и залитого в парафин опухолевого материала, подтверждение диагноза «глиобластома» на основании генетического исследования с помощью Illumina HumanMethylation450 BeadChip и уникального классификатора опухолей, разработанного в отделении педиатрической онкологии DKFZ, а также наличие катамнестических данных, собранных путем вызова пациента и его родственников в ФГБНУ «НИИ НХ» на обследование и консультацию либо письма или звонка пациенту и его родственникам. Контрольную группу составили 77 взрослых глиобластом – 46 мужчин и 31 женщина в возрасте от 19 до 62 лет (средний возраст 40 лет), оперированных в ФГБНУ «НИИ НХ» в период с 1999 по 2011 годы. Все пациенты контрольной группы, так же как и пациенты исследуемой группы были обследованы согласно принятой в ФГБНУ «НИИ НХ» схеме, включающей МРТ головного мозга с контрастированием, оценку общего функционального симптоматики, статуса оценку по шкале степени Карновского внутричерепной и неврологической гипертензии по офтальмоскопической картине глазного дна, электроэнцефалографию, общий и биохимический анализы крови (Приложение 1). В подавляющем локализовались в большинстве больших случаев полушариях глиобластомы головного мозга у взрослых с редкими таламическими или мозжечковыми глиобластомами. Все пациенты контрольной группы подверглись оперативному лечению: стереотаксическая биопсия проводилась при диффузно растущих опухолях в двух случаях, частичное удаление опухоли (по данным протоколов операций и 63 послеоперационных КТ или МРТ без и с контрастным усилением, проведенных в течение 24-72 часов после операции) в 12 случаях, субтотальное удаление опухоли (по данным протоколов операций и послеоперационных КТ или МРТ без и с контрастным усилением, проведенных в течение 24-72 часов после операции) в 25 случаях, тотально (по данным протоколов операций и послеоперационных КТ или МРТ без и с контрастным усилением, проведенных в течение 24-72 часов после операции) опухоль была удалена у 38 пациентов. После гистологической верификации опухоли пациенты были консультированы в отделении радиологии и группе химиотерапии и получили химиолучевое лечение в ФГБНУ «НИИ НХ» или по месту жительства. Пациенты получали лучевую терапию на ложе удаленной опухоли до СОД 60 Гр с одновременным приемом Темодала 75 мг/м2 – 100 мг ежедневно на весь период лучевой терапии. Далее проводилась терапия Темодалом 200 мг/м² - 300 мг внутрь с 1 по 5 дни курса. Проводилось 6 курсов. При продолженном росте опухоли мультидисциплинарно обсуждался вопрос о повторном хирургическом вмешательстве, системной химиотерапии, повторном облучении, радиохирургии и паллиативной терапии. 20 пациентов были повторно прооперированы в в ФГБНУ «НИИ НХ». После рецидива опухоли режим химиотерапии изменялся следующим образом: Ломустин – 160 мг, Винкристин 1,5 мг внутривенно струйно на 20 мл. физиологического раствора, после чего вена промывалась путем введения еще 20 мл чистого физиологического раствора – вводили в 1 и 8 дни курса и Прокарбазин (Натулан) 50 мг (1 таблетка по 50 мг) внутрь с 1 по 14 дни курса. Либо назначался другой режим химиотерапии: Авастин 400 мг внутривенно капельно и Иринотекан 200 мг внутривенно капельно каждые 2 недели при условии удовлетворительных показателей крови и контрольных МРТ головного мозга с контрастированием, без контраста, в режимах FLAIR и T2-взвешенном режиме. 64 Таблица 2 Клиническая характеристика исследуемой и контрольной групп Клинические характеристики и Возраст гистологические Исследуемая больных) группа (n-136 Контрольная группа (n-77 больных) Р χ2 CHISQ.TEST 4 месяца - 18 лет (средний возраст 19 лет - 62 года (средний возраст 10 лет) 40 лет) Пол Мужской 69 (51%) 46 (60%) Женский 67 (49%) 31 (40%) Локализация Супратенториальная <0,000001 104 (76%) 75 (97%) Таламус 34 (25%) 2 (3%) Полушария 70 (51%) 73 (94%) Инфратенториальная 20 (15%) 2 (3%) Ствол 18 (13%) 0 Мозжечок 2 (2%) 2 (3%) 12 (9%) 0 Спинальная 0,06 65 Таблица 2 Окончание Степень резекции по данным протоколов операции и послеоперационных КТ или 0, 00005 МРТ Тотальное удаление 64 (47%) 38 (49%) Субтотальное удаление 41 (30%) 25 (32%) Частичное удаление 16 (12%) 12 (16%) Биопсия 15 (11%) 2 (3%) 107 (79%) 41 (53%) Локальный рецидив 85 (79%) 38 (93%) Метастазирование 20 (19%) 2 (5%) Прогрессия заболевания Локальный рецидив и 2 (2%) 0,00002 1 (2%) метастазирование Смерть 76 (56%) 23 (30%) <0,00000001 66 2.4. Катамнестические данные у нейрохирургических больных с глиобластомами Катамнестические данные были известны у всех пациентов исследуемой и контрольной групп. Глубина катамнеза составила от 1 года до семи с половиной лет. От основного заболевания скончалось 76 детей (37 мальчиков и 39 девочек) и 23 взрослых (13 мужчин и 10 женщин); прогрессия заболевания в виде продолженного роста опухоли в месте операции наблюдалась у 85 детей и 38 взрослых, из них 34 ребенка и 20 взрослых больных с глиобластомами подверглись повторному оперативному вмешательству. На момент окончания сбора катамнестических данных (1 июня 2014 или дата последнего контакта с пациентом) из повторно оперированных по поводу рецидива опухоли были живы 10 детей и 15 взрослых. Метастазирование процесса по оболочкам головного и спинного мозга возникло у 20 детей и у 2 взрослых. На момент окончания сбора катамнестических данных трое детей с метастазированием были живы. У 2 детей и одного взрослого возникли последовательное рецидивирование и метастазирование опухоли в большие полушария головного мозга. На момент окончания сбора катамнестических данных были живы 1 ребенок и взрослый с последовательным рецидивированием и метастазированием опухоли. На момент окончания сбора катамнестических данных (1 июня 2014 или дата последнего контакта с пациентом) 60 детей и 54 взрослых были живы, у 31 ребенка и 25 взрослых имелась прогрессия заболевания. 67 2.5. Методы исследования биологии глиобластом у нейрохирургических больных Для более всестороннего и полного изучения биологии глиобластом мы использовали все доступные нам методы исследования от самых новейших и дорогих до использующихся в рутинной практике любого патолого- анатомического отделения. 2.5.1. Морфологическое исследование глиобластом Опухолевый микрохирургического материал, удаления, полученный характеризовался во время гетерогенной операции картиной сероватой резиновой консистенции опухолевой ткани или серой мягкой полупрозрачной опухолью с участками распада, некрозами бело-желтого цвета, патологическими тромбированными сосудами, участками кровоизлияний бурого цвета, что соответствовало интраоперационному диагнозу «глиобластома». Количество материала, доставленного из операционного блока, сильно варьировало в зависимости от локализации опухолей – достаточный объем присланной на исследование опухоли при полушарных глиобластомах и малое количество материала при опухолях ствола. Небольшие фрагменты опухолей (при достаточном количестве материала) на этапе микрохирургического удаления замороживались (временной интервал между получением фрагмента опухоли и замораживанием в жидком азоте не превышал 30 минут) и после хранились при -800С. Остальной опухолевый материал фиксировался в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 часов, после чего обезвоживался в спиртах восходящей концентрации и заливался в парафиновые блоки, с которых были изготовлены срезы толщиной 5 мкм и окрашены гематоксилином и эозином для рутинного микроскопического исследования опухоли. При визуальной оценке 68 срезов отбирались участки для последующего иммуногистохимического исследования и флуоресцентной гибридизации in situ. 2.5.2. Иммуногистохимическое исследование глиобластом Иммуногистохимическое исследование проведено 136 детским опухолям и 77 глиобластомам взрослых. Иммуногистохимическое исследование - метод микроскопического исследования ткани опухоли, обеспечивающий наиболее специфическое выявление в ней экспрессии определенных маркеров. Метод заключается в обработке срезов маркированными специфическими антителами к выявляемому веществу, которое в данной ситуации служит антигеном. В настоящее время используется более чувствительный непрямой иммуногистохимический метод, основанный на том, что немаркированные первичные антитела связываются с искомым антигеном, далее их выявляют при помощи вторичных меченных антител (биотина и стрептовидина или визуализирующей системы), при этом первичные антитела служат для вторичных антигенами. Иммуногистохимическое исследование было проведено с антителами к глиофибриллярному кислому белку Monoclonal Mouse Anti-Human Glial Fibrillary Acidic Protein Clone 6F2 Dako Denmark; синаптофизину Monoclonal Mouse AntiSynaptophysin Clone SY 38 Dako Denmark; ядерному маркеру делеции гена INI1 Monoclonal Mouse Antibody Clone MRQ-27 Roche разведение 1:250, экспозиция 30 минут при комнатной температуре; LIN28A Polyclonal Antibody A177, #3978, Cell Signaling Inc, Boston, MA, USA разведение 1:50, экспозиция 30 минут при комнатной температуре, но лучше при 370 С; эпителиальному мембранному антигену ЕМА Monoclonal Mouse Anti-Human Epithelial Membrane Antigen Clone E29 Dako Denmark; цитокератину 7 Anti-Keratin 7 Monoclonal Antibody клон OVTL12/30 Thermo Fisher Scientific разведение 1:50; общему лейкоцитарному антигену CD45 Monoclonal Mouse Anti-Human CD45, Leucocyte Common Antigen Clones 2B11 + PD7/26 Dako Denmark; маркеру меланомы НМВ45 Monoclonal 69 Mouse Anti-Human Melanosome Clone HMB45 Dako Denmark; Monoclonal Mouse Anti-Human CD99, MIC2 Gene Product Ewing’s Sarcoma Marker Clone 12E7 Dako Denmark; Anti-Human IDH1 R132H astrocytoma and oligodendroglioma tumor cell marker mouse monoclonal antibody (Dianova clone: H09 разведение 1:20); AntiB-Raf Antibody Catalogue Number 07-453 Merck Millipore; Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys27) Antibody H3K27me Catalogue Number 07-449 Millipore. Иммуногистохимическое исследование проводилось как вручную, так и с использованием полуавтоматического иммуностейнера Lab Vision Autostainer 360 ThermoScientific (в условиях ФГБНУ «НИИ НХ») согласно протоколам, рекомендуемым производителями приборов. 2.5.2.1. Методика иммуногистохимического исследования 1. Депарафинация срезов в серии ксилолов 2. Дегидратация в спиртах восходящей концентрации 3. Промывка в дистиллированной воде 4. Демаскировка в буфере Tris при pH 6,0 и температуре 97С в течение 2 часов 5. Промывка в дистиллированной воде 6. Блокирование активности эндогенной пероксидазы 3% раствором перекиси водорода 7. Промывка в фосфатно-бикарбонатном буфере PBS при pH 7,0 8. Нанесение блокирующей сыворотки 9. Инкубация с антителами при комнатной температуре в течение 30 минут 10.Нанесение визуализирующей системы 70 11.Нанесение диаминобензидина для проявления экспрессии антител 12.Докрашивание гематоксилином 13.Оценка результатов по наличию (или отсутствию) экспрессии в опухолевых клетках, эндотелии сосудов или по степени выраженности экспрессии. 2.5.3. Флуоресцентная гибридизация in situ в глиобластомах Флуоресцентная гибридизация in situ случаях детских глиобластом и в [39, 101, 293, 294] проведена в 136 77 случаях глиобластом взрослых. Флуоресцентная гибридизация in situ — цитогенетический метод, который применяют для определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. При FISH используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флуорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флуоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин — при помощи флуоресцентно-меченных антител. Флуоресцентная гибридизация in situ (Fluorescence in situ hybridization FISH) была проведена во всех случаях со следующими коммерческими пробами Vysis Abbott Molecular: LSI (Locus Specific Identifier) N-MYC (2p24) Spectrum Green/CEP (Chromosome Enumeration Probe) 2 Spectrum Orange Probe; LSI 4q12 Tricolor Rearrangement Probe (LSI SCFD2 (4q12) Spectrum Green/LSI LNX (4q12) Spectrum Orange/LSI PDGFRA/KIT (4q12) Spectrum Aqua); LSI EGFR (7p12) Spectrum 71 Orange/CEP 7 7p11.1-q11.1 Alpha Satelite DNA Spectrum Green Probes; LSI C-MYC (8q24.12-q24.13) Spectrum Orange Probe/CEP 8 (D8Z2) 8p11.1-q11.1 Alpha Satellite DNA Spectrum Green Probe; LSI CDKN2A p16 (9p21) Spectrum Orange/CEP 9 (9p11-q11) Spectrum Green Probes; LSI PTEN (10q23) Spectrum Orange/ CEP 10 10p11.1-q11.1 Alpha Satellite DNA Spectrum Green Probes и коммерческими пробами Abnova: CDK4 Texas Red (12q14.1)/CEN12q FITC (12q12) FISH Probe, CDK6 FISH Probe, CCND1 Texas Red (11q13)/CEN11p FITC (11p11.12) FISH Probe, CCND2 Texas Red/CEN12p FITC FISH Probe. 2.5.3.1. Методика флуоресцентной гибридизации in situ 1. Депарафинация срезов в серии ксилолов 2. Дегидратация в спиртах восходящей концентрации 3. Обработка пепсином 4. Денатурация и гибридизация с ДНК-зондами в гибридизационной камере HYBrite в течение 16-18 часов 5. Отмывка в двух промывочных буферах 6. Контрастирование и заключение препарата в среду DAPI I 7. Визуализация с использованием микроскопа Axioscop 40, оснащенного фильтрами DAPI, FITC, ORANGE, GREEN/ORANGE и AQUA Результаты оценивались после подсчета сигналов в 200 отдельно лежащих ядрах Сбалансированный профиль – наличие в 90% ядер двух сигналов от контрольной пробы и двух сигналов от исследуемой пробы Делеция - наличие в 90% ядер двух сигналов от контрольной пробы и одного сигнала от исследуемой пробы 72 Моносомия - наличие в 90% ядер одного сигнала от контрольной пробы и одного сигнала от исследуемой пробы Полисомия - наличие в 90% ядер от трех до семи сигналов от контрольной пробы и от трех до семи сигналов от исследуемой пробы Добавка - наличие в 90% ядер двух сигналов от контрольной пробы и от трех до семи сигналов от исследуемой пробы Амплификация - наличие в 90% ядер двух сигналов от контрольной пробы и восьми и более сигналов от исследуемой пробы. Часть методов исследования была проведена на любезно прдоставленном оборудовании отделения педиатрической нейроонкологии German Cancer Research Center in the Helmholtz Association (DKFZ), Heidelberg, Germany. У всех пациентов исследуемой и контрольной групп часть материала после операции удаления опухоли была немедленно заморожена в жидком азоте и хранилась при -80 С. Из замороженных опухолевых фрагментов были изготовлены криостатные срезы и окрашены гематоксилином и эозином для оценки качества материала. Далее было проведено извлечение ДНК и РНК из замороженных фрагментов опухоли с использованием наборов и прилагающихся к наборам протоколов Trizol (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) и RNeasy Midi spin columns (Qiagen). Качество и концентрация ДНК были анализированы спектрофотометрически на приборе Nanodrop (Wilmington, USA). Качество и концентрация РНК были анализированы с помощью прибора Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Извлеченные ДНК и РНК хранили при -80С. 73 2.5.4. Сравнительная геномная гибридизация глиобластом Сравнительная геномная гибридизация – это молекулярный цитогенетический метод для анализа количества копий и плоидности ДНК при сравнении изучаемого образца с референсным [22, 31, 136, 205, 313]. Метод позволяет определять добавки и потери как целых хромосом, так и участков хросомом, но определяет только несбалансированные хромосомные нарушения. Сбалансированные хромосомные нарушения (реципрокные транслокации – взаимный обмен участками между хромосомами; инверсии – поворот участка хромосомы на 180%; замыкание хромосомы в кольцо) не могут быть определены методом сравнительной геномной гибридизации потому, что при сбалансированных хромосомных аберрациях не происходит количественных изменений. При сравнительной геномной гибридизации ДНК извлекается из исследуемого образца, к ней добавляется контрольная ДНК, обе ДНК метятся соответствующими флуорохромами (обычно красного и зеленого цвета), далее происходит денатурация и гибридизация, результаты анализируется нормализуются в специальном сканере по уровню окрашивания. и Высокая интенсивность свечения исследуемого образца в определенном локусе указывает на добавку этого локуса, в то время как высокое свечение референсного образца в определенном локусе говорит о потере указанного локуса в исследуемом образце. Нейтральный цвет (желтый как слияние красного и зеленого) показывает отсутствие разницы между исследуемым и референсным образцами в данном локусе. Сравнительная геномная гибридизация проведена в 48 случаях детских глиобластом сравнительной и в 77 геномной случаях глиобластом гибридизации взрослых. (Array-based Для проведения comparative genomic hybridization array-CGH) были напечатаны микроарреи с использованием прибора 74 Gene Machines Steinbrenner Laborsysteme GMBH. Предварительно были отобраны геномические клоны, извлечена BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ДНК и для увеличения концентрации BAC ДНК была проведена полимеразная цепная реакция с олигонуклеотидными праймерами. Все праймеры были тестированы, чтобы исключить амплификацию от геномной ДНК. ПЦРпродукт был анализирован при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. 2.5.4.1. Методика сравнительной геномной гибридизации 1. Извлечение ДНК из замороженной опухолевой ткани – оптимальное количество ДНК для aCGH – 500 ng 2. Мечение ДНК – nick translation Для 30 µl реакции К 1 µg исследуемой ДНК добавить 3 µl реакционной смеси dNTP (0.2 mM dATP, dCTP, dGTP; 500 mM Tris/ HCl, pH 7.8; 50 mM MgCl2; 100 µM dithiothreitol; 100 µg/ml bovine serum albumin), 0.5 µl dTTP (0.2 mM), 1 µl digoxigenin или biotin conjugated dUTP (1 ng/µl), 3 µl DNA polymerase I/DNase I (Gibco BRL, Breda, The Netherlands), 0–1 µl diluted DNase I (Gibco BRL). Довести объем до 30 µl бидистиллированной водой. Инкубировать 1.5–2 часа при температуре 15°C. Инактивировать ферменты при 70°C 15 минут. Исследовать ДНК электрофорезом в 1% агарозном геле (5 µl/на образец) с ethidium bromide при 100 V 30 минут. Для оптимальных условий гибридизации разбег пробы в геле должен быть между 500 и 1500 kb. Если размер пробы больше, то добавить DNase I и 3 µl DNA polymerase I, инкубировать при 15°C 15–30 минут и повторить инактивацию ферментов и электрофорез. 75 3. Блокирование повторяющихся ДНК последовательностей добавлением Cot-1 DNA 4. Гибридизация К 500 ng исследуемой ДНК, меченной с красным флуоресцентным красителем добавляли 500 ng референсной женской или мужской ДНК, меченной с зеленым флуоресцентным красителем Преципитация этанолом – добавить 0.1×объема 3 M NaAc и 2× объема EtOH, центрифугировать при 10 000 оборотов 30 минут Удалить надосадочную жидкость и сушить пеллету на воздухе Растворить пеллету в 6 µl гибридизационной смеси (50% deionised formamide, 10% dextran sulphate in 2× SSC, pH 7.0. хранить при −20°C) Денатурировать микроарреи (предметные стекла с нанесенными генными клонами) в 70% formamide/2× SSC (20× SSC: 0.3 M sodium citrate, 3 M NaCl, pH 7.0) в водяной бане при 80°C в течение 5 минут Обработать стекла в спиртах восходящей концентрации (70%/96%/100%) Денатурировать смесь ДНК в водяной бане при 80°C 10 минут, после осторожно, избегая образования пузырей, перенести ее на стекла и накрыть покровным стеклом Гибридизовать 4 дня при 40°C в приборе Gene TacTM Hybridization Station Version: 3,61 Genomic Solutions Осторожно удалить покровные стекла Промывать 5 минут в буфере 2×SSC при комнатной температуре Промывать 3 раза по 5 минут в 0.1× SSC при 45°C. 76 Сканирование в DNA Microarray Scanner with Superscan High-Resolution Technology (Agilent Technologies) 2.5.4.2. Анализ результатов сравнительной геномной гибридизации Соотношение красных и зеленых флуоресцентных сигналов в парных образцах измерялось по всей длине каждой хромосомы, при этом делеции проявлялись в тестовом образце в красном цвете, амплификации в зеленом цвете, а участки хромосом, равно распределенные в тестовой и референсной ДНК проявлялись желтым цветом. Данные обеспечения были the нормализованы microarray data с использованием программного analysis software свечения всех ChipYard http://www.dkfz.de/genetics/ChipYard/. Интенсивность флуоресцентного точек была отфильтрована (локальное фоновое свечение >3, средняя интенсивность <1.3; стандартное отклонение log <0.2) и нормализована. Точки с низким качеством сигнала и немогогенным сигналом были удалены из анализа. Для каждого эксперимента индивидуальный порог для добавок/потерь был определен как +/- 3 стандартных отклонения сбалансированных от областях среднего хромосом. соотношения Область всех была клонов расценена в как несбалансированная, если как минимум два соседних клона перекрывали пороговое соотношение. Несбалансированные участки с линейным коэффициентом менее 0.5 были расценены как гомозиготные делеции, так как порог среднего количества аберраций был менее 1, что показывает наличие как минимум субпопуляции клеток с гомозиготной делецией. Добавки с линейным коэффициентом выше 2 расценивались как амплификации. Картирование хромосом базировалось на the Ensembl (version 17) или на the University of California at Santa Cruz genome database. Клоны с неполным картированием, с потерей около 20% образца (точки) и имеющие заведомо известный количественный полиморфизм согласно Database 77 of Genomic Variants http://projects.tcag.ca/variation/project.html были исключены из дальнейшего анализа. В результате были анализированы 4,796 клонов. Логарифмически нормализованные данные доступны в the National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ 2.5.5. Полное экзомное секвенирование глиобластом Полное экзомное секвенирование [69, 81, 102, 114, 149, 248, 250, 254, 262] проведено 48 детским глиобластомам. Секвенированием белков и нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) называется процесс определения их аминокислотной или нуклеотидной последовательности. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов (next-generation sequencing) и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК, получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК и даже полных геномов организмов. В настоящее время для секвенирования генов чаще применяют метод Сенгера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить, при помощи полимеразной цепной реакции. Секвенирование полного генома обычно осуществляют при помощи технологий Next-generation sequencing (в частности, с помощью Illumina). Метод Illumina/Solexa — разработанный компанией метод Solexa. секвенирования В основе нового метода поколения, лежит принцип секвенирования путем синтеза. Одноцепочечные фрагменты ДНК закрепляются на твердой подложке, ДНК-зависимая ДНК-полимераза синтезирует 78 комплементарную цепь, встраивание каждого нового нуклеотида регистрируется с помощью камеры. В методе Solexa используются 3'модифицированные нуклеотиды с присоединенными флуоресцентными метками разных цветов. Модификация нуклеотидов не позволяет ДНК-полимеразе присоединить больше одного нуклеотида. Флуоресценция инициируется коротким импульсом лазера и тип присоединенного нуклеотида определяется по цвету флуоресцентной метки. Модификация нуклеотида блокируется (полимераза теперь может двигаться дальше) и цикл повторяется снова. В результате удается определить последовательность ДНК длиной до 250 нуклеотидов. 2.5.5.1. Методика полного экзомного секвенирования 1. Подготовка ДНК Фрагментация исследуемой двуцепочечной ДНК. Пришивание к двуцепочечным фрагментам с помощью ДНК-лигазы небольшого ДНК-фрагмента — адаптера. Адаптер состоит из двух олигонуклотидов, частично комплементарных друг другу. При смешении таких олигонуклеотидов образуется «вилка», «ножка» которой состоит из двуцепочечной ДНК (в том участке, где олигонуклеотиды комплементарны), две «ручки» состоят из одноцепочечной ДНК. Лигаза пришивает два адаптера за «ножку» к каждому концу исследуемого фрагмента ДНК. Амплификация полученных фрагментов ДНК. В результате образуется множество фрагментов двуцепочечной ДНК, на одном конце — первый олигонуклеотид, составляющий адаптер, на другом конце — второй. 2. Подготовка ячейки Ячейка содержит внутри 8 дорожек. В каждой дорожке может секвенироваться отдельный образец. На поверхность каждой дорожки пришиваются одноцепочечные олигонуклеотиды, идентичные использованным при создании адаптера. Из-за комплементарности 79 адаптеру исследуемую данные олигонуклеотиды ДНК и служить праймерами будут для связывать мостиковой амплификации. В одном из олигонуклеотидов есть участок для рестриктазы. 3. Мостиковая амплификация Плавление исследуемой ДНК и отжиг уже одноцепочечных еѐ фрагментов на закрепленных на подложке праймерах. Добавка в систему всех составляющих для полимеразной цепной реакции кроме праймеров, праймерами служат иммобилизованные олигонуклеотиды. Построение полимеразой комплементарной цепи. На данном этапе каждый исследуемый фрагмент представляет собой двуцепочечную ДНК, конец одной из цепей которой пришит к поверхности ячейки. Плавление двуцепочечной ДНК, в результате которого происходит расхождение комплементарных цепей ДНК. Цепь ДНК, которая не была закреплена на поверхности, удаляется. На данном этапе каждый исследуемый фрагмент представляет собой одноцепочечную ДНК, пришитую к поверхности ячейки. Цепь ДНК образует незакрепленным комплементарное концом со взаимодействие вторым своим иммобилизованным олигонуклеотидом. Теперь фрагмент расположен в виде «мостика» — один конец пришит к поверхности, другой держится за счет комплементарных взаимодействий. Построение комплементарной цепи с помощью полимеразы, в качестве праймера используется второй олигонуклеотид. После плавления и удаления незакрепленных цепей ДНК фрагмент представляет собой две одноцепочечные ДНК, прикрепленные к поверхности. Свободный конец каждой из цепей может образовать мостик с иммобилизованным олигонуклеотидом. Далее повторяются 80 этапы достраивания полимеразой комплементарной цепи и удаление незакрепленных цепей ДНК. После амплификации вокруг каждого закрепленного фрагмента появляется большое количество его копий, половина из которых расположена «вверх ногами». расщепляющей Добавлением один из рестриктазы, прикрепленных олигонуклеотидов достигается вымывание ненужных копий. На данном этапе все копии ДНК, полученные в результате амплификации из начального фрагмента, расположены одинаково. 4. Секвенирование Происходит синтез компрементарной цепи с помощью ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, встраивание каждого нового нуклеотида регистрируется с помощью камеры. В систему добавляются праймеры и ДНК-полимераза. В систему добавляются 3′-O-азидометил 2′-деоксинуклеозид трифосфаты (A, C, G и T), каждый с отделяемой флуоресцентной меткой своего цвета. Наличие 3′-O-азидометила не позволяет ДНК-полимеразе присоединить больше одного нуклеотида. Происходит присоединение модифицированного нуклеотида, полимеразой оставшиеся одного нуклеотиды вымываются. Ячейка освещается коротким импульсом лазера. Присоединенный флуорофор светится своим цветом. Так как после амплификации вокруг каждой молекулы ДНК имеется в наличии множество еѐ копий, возможна регистрация света множества одинаковых флуорофоров. Добавление в систему вещества TCEP - (tris(2- carboxyethyl)phosphine), из-за которого флуорофор и азидометил отделяются и вымываются. 3′-гидроксильная группа становится доступной для присоединения ещѐ одного нуклеотида. 81 Далее происходит нормализация и обработка результатов. 2.5.5.2. Анализ результатов полного экзомного секвенирования Идентификация соматических мутаций осуществлялась следующим образом: вариант мутации, выявленный в опухоли, подтверждался в качестве кандидата соматической мутации в том случае, если в нормальном меченном образце имелось как минимум 10 прочтений, покрывающих эту позицию, нулевой вариант других прочтений, а данный вариант (на момент октября 2011 г.) не был ранее описан и зарегистрирован в базе данных dbSNP131 или базе данных «1000 геномов». Для каждого из найденных кандидатов соматических мутаций, была проведена нормализация результатов для выявления возможных артефактов секвенирования и ошибок. Пятнадцать вариантов были идентифицированы как типичные артефактные последовательности GGC (гуанин-гуанин-цитозин). 2.5.6. Метиляционное профилирование ДНК в глиобластомах Метиляционное профилирование ДНК [56, 97, 114, 173, 242] проведено в 136 случаях детских глиобластом и в 77 случаях глиобластом взрослых. Метилирование ДНК — это модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности ДНК, поэтому метилирование ДНК относится к эпигенетической составляющей генома. Метилирование ДНК заключается в присоединении метильной группы к цитозину в составе CpG-динуклеотида в позиции С5 цитозинового кольца. Метилированный цитозин может затем окисляться особыми ферментами, что в конечном итоге приводит к его деметилированию обратно в цитозин. Чаще всего метилирование ДНК определяют с помощью бисульфитного секвенирования. Бисульфит действует на одноцепочечную ДНК, конвертируя цитозин в CpG-динуклеотиде в урацил. В случае, если этот цитозин метилирован, то есть к его пятому атому углерода присоединена метильная группа, то такой цитозин не 82 конвертируется в урацил. Таким образом, бисульфит изменяет последовательность ДНК в зависимости от ее структуры метилирования, и после его воздействия можно установить, какие CpG-динуклеотиды были метилированы, сравнив измененную последовательность с исходной. 2.5.6.1. Основные методы бисульфитного секвенирования 1. Пиросеквенирование В пиросеквенировании используют полимеразную цепную реакцию с праймерами, амплифицирующими как измененную, так и не измененную бисульфитом ДНК. Соотношение числа метилированных и неметилированных цитозинов в амплифицируемой последовательности определяется по соотношению количества нуклеотидов «аденин» и «гуанин» в синтезируемой комплементарной последовательности. 2. Метиляционно-специфичная полимерная цепная реакция (MSP) В данном методе используются праймеры, специфичные или только к преобразованной бисульфитом ДНК или только к непреобразованной. К первым праймерам прикрепляются только участки, которые были метилированы, а ко вторым — те, которые не были метилированы, что лишает необходимости секвенировать участки после амплификации. 3. Методы, основанные на микрочипах Использование ДНК-микрочипов дает возможность расширить описанные выше методы для анализа структуры метилирования на уровне всего генома. Олигонуклеотиды ДНК-микрочипа делают специфичными к метилированию и соответствующими интересующим CpG-участкам. Одни комплементарны измененной бисульфитом последовательности (в которой CpG-участок не был метилирован), другие — неизмененной. Примером такого метода служит Illumina methylation assay. 83 Существуют также методы, не основанные например, комбинированный бисульфитный на секвенировании, рестриктационный анализ и иммунопреципитация метилированной ДНК. Для изучения метилирования ДНК на уровне генома в данной работе был использован Illumina methylation assay. Образцы (замороженная ткань и кровь от 166 детских глиобластом (впоследствии 30 детских глиобластом были исключены как опухоли другой нозологии) и 77 взрослых глиобластом, 10 контрольных образцов: неопухолевая ткань головного мозга от 4 детских и 2 взрослых пациентов, 2 образца неметилированного контроля (ампилицированная ДНК на уровне тотального генома) и 2 образца метилированного контроля (ДНК обработанная были M.SssI) HumanMethylation450 BeadChip исследованы согласно с протоколу помощью и Illumina инструкциям, предложенным изготовителем прибора. 2.5.6.2. Методика метиляционного профилирования ДНК с использованием Illumina HumanMethylation450 BeadChip 1. Бисульфидная конверсия – обработка ДНК бисульфитом натрия, после которой неметилированный цитозин переходит в урацил, в то время как метилированный цитозин остается без изменений. 2. Денатурация и нейтрализация образцов, их подготовка к амплификации. 3. Инкубирование в течение 12 часов ДНК для амплификации (количество ДНК увеличивается в несколько тысяч раз). 4. Фрагментация ДНК под действием ферментов, электрофореза в геле не требуется. 5. Преципитация (осаждение) ДНК добавлением изопропанола и центрифугированием при 40С. 6. Ресуспендирование (повторное гибридизационном буфере. смешивание) ДНК в 84 7. Загрузка фрагментированной и растворенной ДНК в специальный чип, который помещается в гибридизационную станцию для Illumina выявления метилированных и неметилированных CpG островков. 8. Отмывка негибридизированной ДНК. 9. Удлинение и окрашивание в капиллярах проточной камеры. Удлинение одноосновных нуклеотидов с использованием захвата ДНК как шаблона (матрицы), встраивание меченных участков и определение уровня метилирования CpG участков. 10.Сканирование чипа с использованием Illumina iScan и обработка результатов. 2.5.6.3. Анализ данных метиляционного профилирования Интенсивность метилированных и неметилированных сигналов была нормализована с использованием программы the Illumina GenomeStudio program. Для оценки результатов применялись следующие критерии исключения из исследования: удалялись пробы с мишенями на Х и Y хромосомах, а также пробы, содержащие однонуклеотидный полиморфизм (single-nucleotide polymorphism (dbSNP132) в пределах пяти пар оснований и включающие, как мишень CpGучастки, а также пробы, которые не картировались идентично и однозначно с референсным геномом человека, допускалось только одно несовпадение. Для каждого исследуемого CpG-островка имелись две специфических пробы, одна из которых была разработана для метилированного локуса, другая соответственно для неметилированного локуса, которые выявлялись при гибридизации ДНК. Выявленные метилированные и неметилированные локусы вступали в гибридизацию с меченными специальным красителем дидеоксинуклеотидами ddNTP (dideoxynucleotides - ингибиторы ДНК-полимеразы, используются в при секвенировании ДНК), далее происходила квантификация (сведение качественных характеристик к количественным), то есть определялись 85 метилированные и неметилированные аллели. (http://www.illumina.com/technology/infinium_methylation_assay.ilmn). Данные о метилировании ДНК были суммированы по значению М как ранее рекомендовано Du et al. [86] по формуле: M = log 2 (max(сигнал В,0) + 1 / max(сигнал A,0) + 1) где ―сигнал А‖ и ―сигнал В‖ означают интенсивность неметилированных и метилированных проб. CIMP-положительные (G-CIMP-positive ―glioma-CpG island methylator phenotype) и CIMP-негативные опухоли были определены с использованием кластерных методов. Кластерирование выполнено на основе анализа 450 тысяч CpG-островков, расположенных на аррее Illumina Infinium Human-Methylation450 BeadChip. Для кластерирования было отобрано 7914 точек (CpG-островков). 2.5.6.4. Оценка статуса метилирования гена MGMT в глиобластомах В аннотации программы 176 CpG проб были связаны с геном MGMT. Для оценки статуса метилирования гена MGMT была использована модель, предложенная Bady et al. [28]. Статус метилирования промоутера гена MGMT (хромосома 10: регион 131264700-131266300), определяемый методом Illumina HumanMethylation450 BeadChip был исследован методом логистической регрессии [198, 213]. Двухступенчатая процедура была использована для построения модели рассчета вероятности метилирования промоутера гена MGMT. Во-первых, все одновариантные модели были тестированы и только пробы значительно связанные с метилированием были отобраны с использованием логарифмического теста отношения правдоподобия (the log-likelihood ratio test 86 (LRT)) и теста коррекции Бонферрони (статистический метод, считается наиболее простым и консервативным методом для контроля частоты ошибок). Во-вторых, для построения оптимальной логистической модели был использован информационный критерий Акаике Akaike (Akaike information criterion (AIC) – определяет относительное качество статистической модели, основываясь на данных). Производительность модели была оценена, основываясь на начальной загрузке данных с целью ее коррекции. Такая процедура проверяет процесс, используя соответствие оригинальной модели и обеспечивает смещение значения, определяемого разницей между индексом исходной базы данных и средними индексами после процедуры передискретизации образцов после 200 повторений. Передискретизация (от англ. ―resampling‖) – изменение частоты дискретного сигнала, алгоритмы передискретизации широко применяются при обработке изображений. Индекс каппа и пропорция корректной классификации были использованы для оценки согласованности данных между наблюдаемым и прогнозируемым статусом метилирования. M-значение распределения проб, выбранных моделью, сравнивались попарно в квантиль-квантильном участке (QQ-plot) для пяти наборов данных с использованием непараметрического теста Холмогорова-Смирнова (предназначен для проверки гипотезы о принадлежности выборки некоторому закону распределения) для равномерного распределения. 2.5.7. Полимеразная цепная реакция в исследовании глиобластом Полимеразная цепная реакция [29, 58, 114, 264] проведена 136 детским глиобластомам и 77 глиобластомам взрослых. Полимеразная цепная реакция — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определѐнных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале. Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет выявлять мутации. Метод основан на многократном избирательном копировании определѐнного участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов in vitro. При этом происходит 87 копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. Для проведения ПЦР необходимы два праймера (прямой праймер и праймер с обратной последовательностью), комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. Реакция происходит в три этапа: денатурация, отжиг с праймером и элонгация (удлинение) цепочки ДНК. Полимеразная цепная реакция проводилась со стандартными буферами в стандартных условиях с использованием 20 ng ДНК и GoTaq® DNA Polymerase (Promega, Madison, WI, USA) и состояла из 35 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига с праймером при 56°C в течение 40 секунд и удлинения цепи при 72°C в течение 50 секунд в общем объеме 15 mL. Фрагмент экзона 2 гена Н3.3, содержащий 240 пар оснований и кодирующий регион, был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием 25 ng ДНК со следующими праймерами: Н3.3 праймер с прямой последовательностью 5'-TGTTTGTAGTTGCATATGGG-3' и Н3.3 праймер с обратной последовательностью 5'-biotin-TACAAGAGAGACTTTTGTCC-3'. Фрагмент каталитического домена IDH1 перекрывающий длину 129 пар оснований и включающий кодон 132 был амплифицирован с использованием 60 ng каждого праймера: IDH1 праймер с прямой последовательностью CGGTCTTCAGAGAAGCCATT и IDH1 праймер с обратной последовательностью GCAAAATCACATTATTGCCAAC. Для подтверждения были использованы следующие контрольные праймеры: IDH1 праймер с прямой последовательностью ACCAAATGGCACCATACGA и IDH1 праймер с обратной последовательностью TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT, создающие фрагмент из 254 пар оснований в тех же самых условиях выполнения полимеразной цепной реакции. Фрагмент длиной 173 пары основания, включающий кодон 600 гена BRAF амплифицировался методом ПЦР при аналогичных условиях реакции с 88 использованием 100 ng ДНК и по 60 ng каждого праймера – праймера с прямой последовательностью TGCTTGCTCTGATAGGAAAATG и праймера с обратной последовательностью CCACAAAATGGATCCAGACA. 2.5.8. Прямое секвенирование глиобластом Прямое секвенирование [29, 58, 264] проведено в 136 случаях детских глиобластом и в 77 случаях глиобластом взрослых. Два микролитра ПЦР продукта требовалось для реакции секвенирования с использованием BigDye® Terminator v3.1 Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Реакция состояла из 25 циклов с денатурацией при 95°C в течение 30 секунд, отжига с праймером при 56°C в течение 15 секунд и удлинения цепи при 60°C в течение 240 секунд. Последовательности определялись с использованием полуавтоматического секвенатора (ABI® 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) и программного обеспечения Sequence Pilot version 3.1™ (JSI-Medisys, Kippenheim, Germany.) Мутация H3.3 (K27M или G34R/V – однобуквенные обозначения аминокислот см. Приложение 3) исследовалась следующим образом: ПЦР продукты H3.3, содержащие оба мутационных кодона 27 и 34 анализировались со следующими праймерами: Н3.3 праймер с прямой последовательностью 5'-TGTTTGTAGTTGCATATGGG-3' и Н3.3 праймер с обратной последовательностью 5'-biotin-TACAAGAGAGACTTTTGTCC-3'. Мутация гена IDH1 R132H анализировалась с использованием 12 ng IDH1 праймера с прямой последовательностью CGGTCTTCAGAGAAGCCATT. В сомнительных с случаях был выполнен второй цикл секвенирования использованием контрольного праймера с обратной последовательностью IDH1 TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT при идентичных условиях реакции. Мутация BRAF V600E или V600R изучалась в аналогичных условиях. В сомнительных случаях выполнялся второй цикл секвенирования со вторым 89 набором праймеров: праймер с прямой последовательностью TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA и праймер с обратной последовательностью GGCCAAAAATTTAATCAGTG, создающих фрагмент из 224 пар оснований в тех же самых условиях выполнения полимеразной цепной реакции. 2.5.9. Статистический анализ выживаемости у нейрохирургических больных с глиобластомами Для анализа общей выживаемости был использован метод Kaplan-Meier. Общая выживаемость была подсчитана от даты операции хирургического удаления опухоли до смерти от прогрессии основного заболевания (пациенты, погибшие по другим причинам не включались в исследование) или до даты сбора последних катамнестических данных. Безрецидивная выживаемость была определена как промежуток времени от даты операции хирургического удаления опухоли до даты прогрессии заболевания или в случае отсутствия прогрессии заболевания до даты сбора последних катамнестических данных. Для мультивариантного анализа была использована регрессивная модель Кокса. Оценка степени зависимости функции риска от независимых переменных – клинико-молекулярных факторов - проводилась с обеспечением 95% доверительного интервала и р-значения теста отношения правдоподобия. 90 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЛОГИИ ГЛИОБЛАСТОМ У НЕЙРОХИРУРГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ 3.1. Морфологическая и молекулярная дифференциальная диагностика низкодифференцированных злокачественных опухолей головного мозга у детей Гистологический диагноз «глиобластома WHO grade IV» был поставлен согласно критериям, установленным в текущей классификации ВОЗ опухолей центральной нервной системы издания 2007 г. [187]. Согласно данной классификации глиобластома (синоним – «мультиформная глиобластома») представляет собой наиболее частую первичную опухоль головного мозга и наиболее злокачественную опухоль с преимущественной астроцитарной дифференцировкой. Гистологическими признаками глиобластомы являются – ядерная атипия, клеточный полиморфизм (или плеоморфизм, включающий в себя мелкие, недифференцированные, липидизированные, гранулярные и гигантские клетки), митотическая активность, микроваскулярная пролиферация (пролиферация эндотелия сосудов), тромбозы сосудов и некрозы (рисунок 9). 91 Рисунок 9. Гистологические признаки глиобластом. А – ядерная атипия и клеточный полиморфизм. Б – митозы. В – пролиферация эндотелия сосудов. Г – тромбированные сосуды. Д – некрозы с псевдопалисадными структурами. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение Х100. 92 Выделяют следующие гистологические типы глиобластом (рисунок 10): 1. Мелкоклеточная глиобластома – характеризуется мелкими округлыми расположенными близко друг у другу мономорфными клетками с гиперхромными ядрами, высоким ядерно-цитоплазматическим индексом и умеренной атипией. 2. Глиобластома с олигодендроглиальным компонентом – такие опухоли содержат фокусы клеток, по строению сходных с олигодендроглиомой. 3. Глиобластома с гигантскими многоядерными клетками – при преобладании этих клеток в гистологической структуре опухоли уместен термин «гигантоклеточная глиобластома». 4. Гемистоцитарная глиобластома – не менее 25% клеточного состава опухоли представлено тучными астроцитами (гемистоцитами), другой особенностью является очаговая периваскулярная лимфоидная инфильтрация. Также в структуре глиобластом могут встречаться гранулярные клетки, рабдоидные клетки, жировые клетки, периваскулярные лимфоциты и метаплазия (появление эпителиоидных клеток и железистых структур). В архиве патолого-анатомического отделения ФГБНУ «НИИ НХ» были подобраны гистологические препараты и парафиновые блоки 166 детских глиобластом (позднее после проведения дополнительных исследований 30 детских опухолей были исключены из исследования) и 77 взрослых глиобластом, диагностированные в период с 1998 по 2013 годы. Препараты были повторно пересмотрены тремя нейропатоморфологами (А.Г.К., Л.В.Ш. и М.В.Р), диагноз ―Глиобластома WHO grade IV» был подтвержден, каких-либо гистологических особенностей у глиобластом различных возрастных групп выявлено не было. 93 Рисунок 10. Гистологические типы глиобластом. А - мелкоклеточная глиобластома. Б - глиобластома с олигодендроглиальным компонентом. В глиобластома с гигантскими многоядерными клетками. Г - гемистоцитарная глиобластома. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение Х100. 94 Гистологически подавляющее большинство детских опухолей (114 случаев) принадлежали к классическим мультиформным глиобластомам (рисинок 11А), в 20 опухолях из 114 были выявлены периваскулярные псевдорозетки (рисунок 11Б); 27 опухолей показывали крупноклеточную гистологию и эпителиоидные особенности с крупными толстостенными сосудами и некрозами (рисунки 11В и 11Г); 17 опухолей были классифицированы как мелкоклеточные (6 опухолей из 17 мелкоклеточных глиобластом имели ПНЭО-подобные участки с формированием нейробластических розеток (рисунок 11Д)); 8 глиобластом имели преимущественно гемистоцитарную клеточную композицию. Глиобластомы у взрослых показывали следующее распределение по гистологической структуре: 32 опухоли были отнесены к мультиформным глиобластомам, 29 имели гемистоцитарную гистологию, 13 глиобластом были мелкоклеточными и 3 глиобластомы были классифицированы как глиобластомы с олигодендроглиальным компонентом. 95 Рисунок 11. Гистологические особенности глиобластом. А - мультиформная глиобластома. Б - периваскулярные розетки. В - толстостенные сосуды. Г эпителиоидные особенности. Д - ПНЭО-подобные участки и нейробластические розетки. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение Х200. 96 Далее на основании было проведено иммуногистохимическое исследование, которого и последующего обсуждения гистологических особенностей из исследования были исключены четыре (2%) опухоли: 2 атипических тератоидно-рабдоидных опухоли (исключены на основании отрицательной ядерной экспрессии INI1 в клетках опухоли при сохранной экспрессии в эндотелии сосудов (рисунок 12), гистологически ранее были классифицированы как мелкоклеточные глиобластомы), одна эмбриональная опухоль с многорядными розетками (исключена на основе выраженной положительной экспрессии LIN28A (рисунок 14), гистологически ранее была классифицирована как мелкоклеточная глиобластома с ПНЭО-подобными участками) и одна анапластическая эпендимома (исключена на основании точечной цитоплазматической экспрессии ЕМА и экспрессии GFAP, подчеркнувшего периваскулярные псевдорозетки (рисунок 16), ранее была классифицирована как классическая мультиформная глиобластома с периваскулярными псевдорозетками). Иммуногистохимическое исследование глиобластом выявило выраженную положительную экспрессию глиофибриллярного кислого белка в цитоплазме опухолевых клеток, экспрессию синаптофизина в ПНЭО-подобных участках глиобластом, тотальную ядерную экспрессию INI1, отсутствие экспрессии лейкоцитарных маркеров. Далее материал от 166 детских опухолей (после проведения дополнительных исследований у 30 детских опухолей диагноз ―глиобластома‖ был изменен и опухоли были исключены из исследования) и 77 взрослых глиобластом был подготовлен для проведения исследования на уровне тотального генома на платформе Illumina HumanMethylation450 BeadChip. Данное исследование подтвердило диагноз глиобластомы в 136 случаях детских опухолей из 166 и в 77 случаях взрослых опухолей из 77 глиобластом (т.е. в 100% случаев для взрослых глиобластом). Подробное описание с иллюстрациями исключенных 97 из исследования опухолей изначально диагностированных как глиобластомы представлено на страницах 101-117. Что касается ранее исключенных после иммуногистохимического исследования опухолей (2 АТРО, 1 ETMR и 1 анапластическая эпендимома) – классификатор Illumina распознал эти опухоли как два случая атипической тератоидно-рабдоидной опухоли (рисунок 13), одну эмбриональную опухоль с многорядными розетками (рисунок 15) и одну анапластическую эпендимому (рисунок 17) - данные случаи были исключены из исследования. 98 Рисунок 12. Атипическая тератоидно-рабдоидная опухоль. А - окраска гематоксилином и эозином, увеличение Х100. Б - иммуногистохимическое исследование с антителом INI1, увеличение Х100. Отсутствие ядерной экспрессии INI1 в клетках атипической тератоидно-рабдоидной опухоли, при сохранной экспрессии INI1 в мозговой ткани и эндотелии сосудов (показано стрелками ). Стрелками ← показаны очаги некрозов. 99 Рисунок 13. Молекулярный профиль атипической тератоидно-рабдоидной опухоли с характерными для данного новообразования изменениями на 22 хромосоме (показано стрелкой), полученный при исследовании Illumina Infinium Human-Methylation450 BeadChip. Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22 (chr 1 - chr 22), ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 100 Рисунок 14. Эмбриональная опухоль с многорядными розетками. А - окраска гематоксилином и эозином, увеличение Х100. Б - иммуногистохимическое исследование с антителом LIN28A, увеличение Х100. 101 ← Рисунок 15. Молекулярный профиль эмбриональной опухоли с обилием нейропиля и истинными розетками, полученный при исследовании Illumina Infinium Human-Methylation450 BeadChip. Характерная отличительная особенность этой опухоли – наличие уникальной амплификации локуса 19q13.42, кодирующего микроРНК (показано стрелкой). Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22 (chr 1 - chr 22), ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 102 Рисунок 16. Анапластическая эпендимома. А - окраска гематоксилином и эозином, увеличение Х100. Б - иммуногистохимическое исследование с антителом GFAP, увеличение Х150. Экспрессия GFAP подчеркивает периваскулярные псевдорозетки. В - иммуногистохимическое исследование с антителом ЕМА, увеличение Х200. Точечная экспрессия ЕМА в цитоплазме клеток анапластической эпендимомы. 103 ← Рисунок 17. Молекулярный профиль супратенториальной анапластической эпендимомы с характерным для данной локализации слиянием генов c11-orf95-RELA и потерей на хромосоме 8 (показано стрелкой), полученный при исследовании Illumina Infinium Human-Methylation450 BeadChip. Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22 (chr 1 chr 22), ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 104 Также исследование на уровне тотального генома показало, что из 26 опухолей ранее диагностированных как глиобластомы и имеющих гистологические признаки злокачественных астроцитарных глиом, 22 (13%) оказались плеоморфными ксантоастроцитомами и 4 (2%) глиомами низкой степени злокачественности – эти опухоли также были исключены из дальнейшего исследования. Четыре исключенных из дальнейшего исследования опухоли, согласно результатам молекулярного исследования с помощью Illumina HumanMethylation450 оказавшимися глиомами низкой степени злокачественности (рисунок 19), гистологически были представлены астроцитомами с признаками малигнизации и некрозами с псевдопалисадными структурами (рисунок 18), то есть согласно классификации опухолей ЦНС ВОЗ от 2007 соответствовали гистологическому диагнозу ―глиобластома WHO grade IV». Все четыре опухоли возникли у маленьких детей (трех мальчиков и одной девочки) в возрасте от 2 месяцев до 1 года 4 месяцев, это были супратенториальные полушарные опухоли, две из которых были удалены тотально, другие две субтотально; метастазирование опухоли отсутствовало во всех случаях. Прогрессия опухоли и смерть от основного заболевания произошли у одного мальчика, трое других детей были живы без признаков прогрессии заболевания в течение 35, 39 и 42 месяцев соответственно. Ни одна из четырех опухолей не имела каких-либо цитогенетических аберраций; мутаций генов H3F3A, IDH1 или BRAF V600E также не было выявлено. 105 → Рисунок 18. Гистологическая картина опухоли у ребенка младше 2 лет соответствует глиобластоме (некроз с псевдопалисадными структурами в центре показан стрелкой →), в то время как молекулярный профиль данной опухоли (см. рисунок 19) соответствует глиомам низкой степени злокачественности. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение Х100. 106 Рисунок 19. Молекулярный профиль глиомы низкой степени злокачественности у ребенка младше 2 лет с астроцитомой, имеющей гистологические признаки злокачественности (см. рисунок 18). Характерная отличительная особенность этой опухоли – сбалансированный геном. Профиль получен при исследовании Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22 (chr 1 - chr 22), ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 107 Из 22 опухолей, классифицированных методом Illumina как плеоморфные ксантоастроцитомы особенности (рисунок злокачественных 22), все опухоли астроцитарных имели глиом гистологические (рисунок 20А) с выраженным полиморфизмом ядер и клеток, большим количеством митозов, наличием толстостенных крупных сосудов, очаговой пролиферацией эндотелия сосудов, обширными очагами некрозов на фоне тромбированных сосудов и некрозами с псевдопалисадными структурами, также опухоли содержали эозинофильные гранулярные тельца и периваскулярную лимфоидную инфильтрацию. Из 22 опухолей 13 возникли у мальчиков, 9 опухолей - у девочек. У двух пациентов опухоли развились в возрасте 3 лет, у 8 пациентов – в возрасте от 4 до 7 лет, у 11 пациентов – в возрасте от 8 до 15 лет и еще две опухоли возникли у шестнадцатилетних детей. 18 (82%) плеоморфных ксантоастроцитом имели супратенториальную локализацию, 17 опухолей были полушарными, одна плеоморфная ксантоастроцитома поражала таламус; 3 опухоли (14%) располагались в среднем мозге и 1 опухоль (4%) имела спинальную локализацию на уровне С4-Th5 позвонков. 11 плеоморфных ксантоастроцитом (50%) были удалены полностью (все опухоли за исключением одной имели полушарную локализацию), 11 опухолей были удалены субтотально. Прогрессия заболевания возникла в 14 случаях (64%), в большинстве случаев (12 случаев – 86%) это был продолженный рост опухоли, в одном случае наступили последовательное локальное рецидивирование и дистантное метастазирование опухоли и в одном случае метастазирование опухоли по оболочкам головного и спинного мозга при стабилизации процесса в области первичной опухоли; смерть от прогрессии заболевания наступила у 8 пациентов (36%). Что касается молекулярных особенностей плеоморфных ксантоастроцитом, то 13 опухолей (59%) имели мутацию BRAF V600E или V600R, выявленную методом прямого секвенирования (рисунок 21) и подтвержденную в 100% случаев иммуногистохимическим 108 исследованием (рисунок 20Б); мутации генов H3F3A или IDH1 не было выявлено ни в одной опухоли. Три опухоли (14%) имели метилированный ген MGMT. 17 опухолей (77%) имели сбалансированный профиль и отсутствие цитогенетических аберраций, в четырех опухолях имелись единичные аберрации – амплификация гена MYCN, две гомозиготных делеции гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q. В одной опухоли имелось сочетание аберраций: гомозиготной делеции гена CDKN2A и потери хромосомы 10q. 109 Рисунок 20. Гистологическая картина опухоли соответствует глиобластоме (выраженный полиморфизм ядер и клеток, участки плотного расположения клеток, некроз с псевдопалисадными структурами), в то время как молекулярный профиль данной опухоли (см. рисунок 22) соответствует плеоморфной ксантоастроцитоме с малигнизацией. А - окраска гематоксилином и эозином, увеличение Х100. Б – иммуногистохимическое исследование с антителом Anti-BRaf, увеличение Х100. 110 Рисунок 21. Электрофореграмма. Мутация гена BRAF V600R в плеоморфной ксантоастроцитоме с малигнизацией, выявленная методом прямого секвенирования генов. Нуклеотиды в комплементарных парах А-Т и G-C метятся четырьмя различными флуорохромными красителями: аденин (A) - зеленым цветом, гуанин (G) - черным цветом, цитозин (C) - синим цветом и тимин (T) - красным цветом. При возникновении мутации происходит замена одной аминокислоты на другую, что приводит к замене пар оснований, в данном случае имеет место замена валина на аргинин и гуанина на аденин в позиции 57. Верхняя электрофореграмма – использован праймер с прямой последовательностью, нижняя электрофореграмма – праймер с обратной последовательностью. 111 Рисунок 22. Молекулярный профиль плеоморфной ксантоастроцитомы, имеющей гистологические признаки малигнизации и гомозиготную делецию гена CDKN2A локус 9р21 (показано стрелкой). Профиль получен при исследовании Illumina Infinium Human-Methylation450 BeadChip. Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22 (chr 1 chr 22), ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 112 Для определения роли молекулярных маркеров и клинико- патологических параметров была использована регрессивная модель Кокса для плеоморфных ксантоастроцитом, не выявившая значимого влияния какого-либо фактора на выживаемость. Также мы сравнили безрецидивную и общую выживаемость глиом низкой степени злокачественности, плеоморфных астроцитом и глиобластом (рисунки 23 и 24) – 5-летняя общая выживаемость для глиобластом детского возраста составила 10%, для плеоморфных ксантоастроцитом с малигнизацией 48%, для определения 5-летней общей выживаемости для детей с молекулярными особенностями глиом низкой степени злокачественности было недостаточно данных, но трое из четырех пациентов были живы без признаков прогрессии заболевания на момент окончания сбора катамнестических исследований 35, 39 и 42 месяца соответственно. 113 p=0,00002 Безрецидивная выживаемость 1,2 1 0,8 LGG (n-4) PXA (n-22) GBM (n-136) 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 Время в месяцах Рисунок 23. Сравнение безрецидивной выживаемости в детских астроцитарных опухолях, имеющих гистологические признаки злокачественности, классифицированных согласно молекулярному диагнозу на глиомы низкой степени злокачественности (LGG), плеоморфные ксантоастроцитомы (PXA) и глиобластомы (GBM). 114 p=0,0001 Общая выживаемость 1,2 1 0,8 LGG (n-4) PXA (n-22) GBM (n-136) 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 Время в месяцах Рисунок 24. Сравнение общей выживаемости в детских астроцитарных опухолях, имеющих гистологические признаки злокачественности, классифицированных согласно молекулярному диагнозу на глиомы низкой степени злокачественности (LGG), плеоморфные ксантоастроцитомы (PXA) и глиобластомы (GBM). 115 Основываясь на опыте и трудностях, с которыми нам пришлось столкнуться в процессе постановки диагноза, мы разработали алгоритм гистологической и молекулярной диагностики злокачественных опухолей центральной нервной системы (рисунок 25). Особенно трудна диагностика опухолей у маленьких детей, когда под идентичной гистологической картиной низкодифференцированной злокачественной опухоли может скрываться множество нозологических единиц с абсолютно разными подходами к лечению. Гистологически низкодифференцированные злокачественные опухоли построены из обширных солидных участков мелких округлых клеток с высоким ядерноцитоплазматическим индексом, митозами, тонкостенными сосудами и сосудами с явлениями пролиферации эндотелия, полями некрозов с псевдопалисадными структурами и/или без псевдопалисадных структур по периферии некротической ткани (рисунок 10А). При такой гистологической картине обязательно проведение иммуногистохимического тератоидно-рабдоидной исследования. опухоли Для необходимо исключения атипической иммуногистохимическое исследование с INI1, для АТРО характерна мутация гена INI1 и в ядрах опухолевых клеток не будет экспрессии антитела при сохранной экспрессии в эндотелии сосудов и нормальной мозговой ткани (рисунок 12). Наличие в опухоли истинных розеток малого размера и розовых очагов нейропиля позволяют заподозрить эмбриональную опухоль с обилием нейропиля и истинными розетками или эмбриональную опухоль с многорядными розетками, для которой характерна выраженная экспрессия LIN28A в розетках и каналах (рисунок 14), а также амплификация локуса 19q13.42, кодирующего экспрессию микро РНК. Определенные трудности возникают при дифференциальном диагнозе между глиобластомой и анапластической эпендимомой, в этом случае может помочь иммуногистохимическое исследование с ЕМА - при эпендимоме обычно выявляется точечная экспрессия ЕМА в цитоплазме опухолевых клеток (рисунок 16). Нейробластома ЦНС имеет выраженную экспрессию синаптофизина, хотя 116 очаговую экспрессию синаптофизина можно найти в глиобластоме и даже в анапластической эпендимоме. Кроме того, различия между глиобластомой и ПНЭО ЦНС очевидны для нейрохирурга во время операции удаления опухоли. Что касается дифференциального диагноза центральной и периферической ПНЭО, то необходимо обращать внимание на точную локализацию опухоли и связь с твердой мозговой оболочкой и височной костью, а также положительную мембранную экспрессию CD99. Исключить лимфопролиферативный процесс, меланому и эпителиальное поражение позволит исследование с CD45, НМВ45 и СК7 соответственно. Попытаться отличить полиморфноклеточную глиобластому и плеоморфную ксантоастроцитому с малигнизацией можно с учетом более поверхностной локализации последней, наличием кисты, возможной связи с твердой мозговой оболочкой, наличием эозинофильных гранулярных телец, периваскулярной лимфоидной инфильтрации, крупных клеток с оптически пустой цитоплазмой и положительной экспрессии BRAF (рисунок 20Б), мутация этого гена является отличительной особенностью плеоморфной ксантоастроцитомы и, согласно нашим данным, в глиобластомах встречается только в единичных случаях. Также для дифференциального диагноза глиобластомы и плеоморфной ксантоастроцитомы может быть использован метод флуоресцентной гибридизации in situ с зондами к онкогенам EGFR и PDGFRA, амплификации которых не встречаются в плеоморфных ксантоастроцитомах. Но объективных критериев позволяющих гистологически или иммуногистохимически отличить плеоморфную ксантоастроцитому сегодняшний день не существует. с малигнизацией от глиобластомы на 117 ИГХ Злокачественная опухоль Антитело или зонд Степень выраженности экспрессии Диагноз INI1 или BAF-47 Отсутствие экспрессии в ядрах при сохранной экспрессии в эндотелии сосудов АТРО LIN28 Позитивная экспрессия в низкодифференцированной части и в многорядных розетках, в участках нейропиля нет экспрессии ETMR Synaptophysin Выраженная экспрессия нейрональных маркеров при отсутствии глиальных и мезензимальных маркеров Нейробластома EMA Точечная цитоплазматичес кая экспрессия Анапластическая эпендимома CD45 Выраженная цитоплазматичес кая экспрессия Лимфопролифер ативный процесс CD99 Мембранная экспрессия Саркома Юинга HMB45 Выраженная цитоплазматичес кая экспрессия Меланома СК7 Выраженная цитоплазматичес кая экспрессия Метастаз рака BRAF Выраженная цитоплазматичес кая экспрессия Плеоморфная ксантоастроцито ма GFAP Выраженная цитоплазматичес кая экспрессия Глиобластома H3K27me Отсутствие ядерной экспрессии при сохранной экспрессии в эндотелии сосудов Глиобластома с мутацией гена H3F3A вариант К27М IDH1 Выраженная цитоплазматичес кая экспрессия Глиобластома EGFR Амплификация Глиобластома PDGFRA Амплификация Глиобластома FISH Рисунок 25. Алгоритм диагностики низкодифференцированных злокачественных опухолей центральной нервной системы, основанный на иммуногистохимическом выявлении экспрессии определенных маркеров и амплификаций онкогенов EGFR и PDGFRA. 118 3.2. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методами Illumina HumanMethylation450 BeadChip, сравнительной геномной гибридизации (array-based comparative genomic hybridization a-CGH) и флуоресцентной гибридизации in situ (Fluorescence in situ hybridization FISH) 3.2.1. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методом Illumina HumanMethylation450 BeadChip Исследование цитогенетических аберраций с использованием Illumina HumanMethylation450 BeadChip показало, что большинство и детских и взрослых опухолей имеют множественные нарушения в геноме (рисунки 26-28). В нашей серии мы наблюдали только 3 детских глиобластомы без каких-либо цитогенетических аберраций, среди взрослых глиобластом случаев со сбалансированным профилем без наличия добавок и/или делеций хромосом не было. Нами были выявлены и анализировались следующие цитогенетические аберрации: амплификации генов EGFR, PDGFRA, MYC/MYCN, CDK/CCND, а также гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q. Амплификация гена EGFR была выявлена в 11% глиобластом у детей, но гораздо чаще встречалась во взрослой популяции (29%), в то время как амплификация гена PDGFRA показывала обратную зависимость и чаще возникала в опухолях детского возраста: 15% против 5% амплификаций у взрослых. Амплификации генов MYC/MYCN и CDK/CCND встречались в двух возрастных группах приблизительно с равной частотой: амплификации генов MYC/MYCN в 11% детских глиобластом и 9% взрослых опухолей, амплификации генов CDK/CCND в 19% и 18% соответственно. Гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q значительно преобладали во взрослой популяции 119 глиобластом и составляли 29% и 61% против 15% и 35% в детских опухолях соответственно (см.таблицу 3.) Таблица 3 Сравнение выявленных методом Illumina HumanMethylation450 BeadChip цитогенетических аберраций в исследуемой и контрольной группах Р χ2 CHISQ.TEST Цитогенетические Исследуемая Контрольная аберрации группа (n-136) группа (n-77) Амплификация 15 (11 %) 22 (29%) < 0,00007 20 (15%) 4 (5%) < 0,000004 15 (11%) 7 (9%) 0,48 26 (19%) 14 (18%) 0,79 21 (15%) 22 (29%) 0,002 47 (35%) 47 (61%) < 0,00000009 гена EGFR Амплификация гена PDGFRA Амплификация генов MYC/MYCN Амплификации генов CDK/CCND Гомозиготная делеция гена CDKN2A Потеря хромосомы 10q Цитогенетические аберрации возникали в глиобластомах любой локализации приблизительно с равной частой у мальчиков и девочек во всех возрастных группах. Связь выявленных аберраций и клинических особенностей в исследуемой подгруппе суммирована в таблице 4. 120 Таблица 4 Анализ цитогенетических аберраций, выявленных методом Illumina HumanMethylation450 BeadChip в исследуемой группе (n-136) Амплификация гена EGFR (n-15 11%) Амплификация гена PDGFRA (n-20 15%) (n-15 11%) Гомозиготная делеция гена генов CDK/CCND CDKN2A (n-21 15%) (n-26 19%) Потеря хромосомы 10q (n-47 35%) Амплификация генов MYC/MYCN Амплификация Пол Мальчики (n-69) 7 (10%) 11 (16%) 7 (10%) 11 (16%) 8 (12%) 29 (42%) Девочки (n-67) 8 (12%) 9 (13%) 8 (12%) 15 (22%) 13 (19%) 18 (26%) 0 0 0 0 0 1/1 старше 6 месяцев – 0 0 0 0 0 0 Возраст 0 - до 6 месяцев (n-1) до 1 года (n-0) 1 год – 3 года (n-5) 0 1 (20%) 0 1 (20%) 0 2 (40%) 4 года - 7 лет (n-36) 3 (8%) 3 (8%) 4 (11%) 7 (19%) 8 (22%) 15 (42%) 8 лет - 15 лет (n-69) 7 (10%) 12 (17%) 8 (11%) 14 (20%) 10 (14%) 23 (33%) 16 лет – 18 лет (n-25) 5 (20%) 4 (16%) 3 (12%) 4 (16%) 3 (12%) 6 (24%) 121 Таблица 4 Продолжение Локализация Супратенториальная (n-104) 14 (13%) 16 (15%) 12 (11%) 16 (15%) 20 (19%) 38 (36%) Таламус (n-34) 2 (6%) 4 (12%) 2 (6%) 2 (6%) 6 (18%) 11 (32%) Полушария (n-70) 12 (17%) 12 (17%) 10 (14%) 14 (20%) 14 (20%) 27 (38%) Инфратенториальная (n-20) 1 (5%) 2 (10%) 2 (10%) 8 (40%) 0 4 (20%) Ствол (n-18) 1 (6%) 2 (11%) 2 (11%) 7 (39%) 0 4 (22%) Мозжечок (n-2) 0 0 0 1/2 0 0 0 2 (17%) 1 (8%) 2 (17%) 1 (8%) 5 (42%) 6 (9%) 12 (19%) 10 (16%) 9 (14%) 7 (11%) 19 (30%) 4 (10%) 1 (2%) 11 (27%) 13 (32%) 19 (46%) Спинальная (n-12) Степень резекции по данным протоколов операции и послеоперационных КТ или МРТ Тотальное удаление (n-64) Субтотальное удаление 5 (12%) (n-41) Частичное удаление (n-16) 3 (19%) 3 (19%) 2 (12%) 1 (6%) 1 (6%) 3 (19%) Биопсия (n-15) 1 (7%) 1 (7%) 2 (13%) 5 (33%) 0 6 (40%) 122 Таблица 4 Окончание Сочетание с другими аберрациями Амплификация гена EGFR (n-15) Амплификация гена PDGFRA (n-20) Амплификация генов MYC/MYCN (n-15) Амплификация генов CDK/CCND (n-26) Гомозиготная делеция гена CDKN2A (n-21) Потеря хромосомы 10q (n-47) Прогрессия заболевания - 2 (10%) 3 (20%) 2 (8%) 3 (14%) 4 (9%) 2 (13%) - 5 (33%) 8 (31%) 2 (10%) 13 (28%) 3 (20%) 5 (25%) - 7 (27%) 2 (10%) 7 (15%) 2 (13%) 8 (40%) 7 (47%) - 5 (24%) 12 (26%) 3 (20%) 2 (10%) 2 (13%) 5 (19%) - 13 (28%) 4 (27%) 13 (65%) 7 (47%) 12 (46%) 13 (62%) 13 (12%) 17 (16%) 13 (12%) 18 (17%) 15 (14%) 34 (32%) Локальный рецидив (n-85) 12 (14%) 13 (15%) 8 (9%) 12 (14%) 10 (12%) 26 (31%) Метастазирование (n-20) 1 (5%) 2 (10%) 5 (25%) 5 (25%) 5 (25%) 5 (25%) 2/2 0 1/2 0 2/2 10 (13%) 8 (11%) 14 (18%) 11 (14%) 25 (33%) - (n-107) Локальный рецидив метастазирование (n-2) Смерть (n-76) и 0 11 (14%) 123 ← ↑ Рисунок 26. Молекулярный профиль глиобластомы, в геноме которой выявлена амплификация гена PDGFRA локус 4q12 (показано стрелкой) и делеции хромосом 10, 11, 13, 14 и 16 (показано красным цветом и стрелкой). Также в данной опухоли выявлена мутация гена H3F3A вариант K27M. Профиль получен при исследовании Illumina Infinium Human-Methylation450 BeadChip. Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22 (chr 1 - chr 22), ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 124 ← Рисунок 27. Молекулярный профиль глиобластомы, в геноме которой выявлена амплификация гена IRS2 локус 13q34 (показано стрелкой). Также в данной опухоли выявлена мутация гена H3F3A вариант G34R/V. Профиль получен при исследовании Illumina Infinium Human-Methylation450 BeadChip. Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22 (chr 1 chr 22), ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 125 Рисунок 28. Молекулярный профиль глиобластомы, в геноме которой выявлена амплификация гена EGFR локус 7р11.12 (показано стрелкой). В данной опухоли мутация гена H3F3A отсутствует. Профиль получен при исследовании Illumina Infinium Human-Methylation450 BeadChip. Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22 (chr 1 - chr 22), ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 126 3.2.2. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методом сравнительной геномной гибридизации Сравнительная геномная гибридизация была проведена в 48 случаях детских глиобластом и в 77 случаях взрослых опухолей. Среди амплификаций (увеличение количества копий гена) наиболее часто встречались следующие: амплификации генов MYCN, EGFR, CDK4 и PDGFRA (рисунки 29-32). Следует отметить, что амплификация гена MYCN наблюдалась в 12% детских опухолей и 4% взрослых глиобластом; амплификация гена EGFR была выявлена в 12% и в 29% в детских и взрослых глиобластомах соответственно; амплификацию гена CDK4 имели 6% детских глиобластом и 18% взрослых опухолей; амплификация гена PDGFRA – 10% у детей и 5% у взрослых; амплификацию гена MYC удалось выявить в 6% случаев детских глиобластом и в 2% случаев у взрослых больных с глиобластомами; амплификация гена CDK6 - в 6% и 7% соответственно у детей и взрослых. Таким образом, в детской серии преобладали амплификации генов MYC/MYCN и PDGFRA, в то время как глиобластомы у взрослых чаще демонстрировали амплификации генов EGFR и CDK4. Гомозиготная делеция гена CDKN2A (рисунок 32) и потеря хромосомы 10q (рисунок 30) наблюдались в обеих возрастных сериях приблизительно в равных пропорциях: гомозиготную делецию гена CDKN2A имели 17% детских глиобластом и 29% взрослых глиобластом, а потеря хромосомы 10q была выявлена в 54% и 60% детских и взрослых глиобластом соответственно. 127 Рисунок 29. Цитогенетический профиль глиобластомы, имеющей множественные амплификации генов MDM4 (локус 1q32.1), EGFR (локус 7р11.12) и MYC (локус 8q24.13). Профиль получен при исследовании опухоли методом сравнительной геномной гибридизации. Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22, ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 128 Рисунок 30. Цитогенетический профиль глиобластомы с амплификацией гена MYCN (локус 2p24.3) и потерей 10q. Профиль получен при исследовании опухоли методом сравнительной геномной гибридизации. Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22, ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 129 Рисунок 31. Цитогенетический профиль глиобластомы с амплификацией гена PDGFRA (локус 4q12). Профиль получен при исследовании опухоли методом сравнительной геномной гибридизации. Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22, ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 130 3,5 3 2,5 ← Амплификация 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 -1 ➚ Гомозиготная делеция CDKN2A -1,5 Рисунок 32. Цитогенетический профиль глиобластомы с амплификацией гена CDK4 (локус 12q14.1) и гомозиготной делецией CDKN2A (локус 9p21). Профиль получен при исследовании опухоли методом сравнительной геномной гибридизации. Ось абсцисс (ось х) – хромосомы от 1 до 22, ось ординат (ось у) – степень выраженности количественных изменений на хромосомах (от +1 (амплификация) до -1 (делеция)). 131 Некоторое несоответствие процентного соотношения выявленных методами Illumina HumanMethylation450 BeadChip и сравнительной геномной гибридизации цитогенетических аберраций объясняется, на наш взгляд, более высокой разрешающей способностью и большей точностью, а также чувствительностью и специфичностью метода Illumina HumanMethylation450 BeadChip и увеличением количества исследованных случаев детских глиобластом почти в три раза с 48 до 136 опухолей. Но общая тенденция - более частного возникновения в детских глиобластомах амплификации генов PDGFR и MYC/MYCN и преобладания амплификации гена EGFR в глиобластомах взрослых – осталась неизменной и была подтверждена в том числе и данными, полученными при проведении флуоресцентной гибридизации in situ, выполненной 136 детским глиобластомам и 77 глиобластомам взрослых и повторившей результаты, полученные методом Illumina HumanMethylation450 BeadChip. Сравнение выявленных различными методами цитогенетических аберраций в детских и взрослых глиобластомах показано в таблице 5. 132 Таблица 5 Сравнение цитогенетических аберраций в детских и взрослых глиобластомах, выявленных методами Illumina HumanMethylation450 BeadChip и сравнительной геномной гибридизации aCGH Цитогенетичес- Детские Детские Взрослые Взрослые кие аберрации глиобласто- глиобластомы глиобластомы глиобластомы метод Illumina мы Human aCGH метод метод Illumina метод aCGH Human Methylation450 (n-48) Methylation450 BeadChip BeadChip (n-136) (n-77) Амплификация 11% (n-77) 12% 29% 29% 10% 5% 6% 18% 9% 6% 12% 18% 25% 15% 17% 29% 29% 35% 54% 61% 60% гена EGFR Амплификация 15% гена PDGFRA Амплификация 11% генов MYC/MYCN Амплификация 19% генов CDK/CCND Гомозиготная делеция гена CDKN2A Потеря хромосомы 10q 133 3.2.3. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методом флуоресцентной гибридизации in situ Основные цитогенетические аберрации в глиобластомах, выявленные методами Illumina HumanMethylation450 BeadChip и сравнительной геномной гибридизации, были подтверждены флуоресцентной гибридизацией in situ и показаны на рисунках 33 и 34. 134 А Рисунок 33. Амплификации онкогенов, выявленные флуоресцентной гибридизацией in situ. А - амплификация (увеличение количества копий) гена EGFR (локус 7р11.12) в глиобластоме. Красные сигналы EGFR (локус 7р11.12), зеленые сигналы – центромера 7 хромосомы CEP 7 (локус 7p11.1-q11.1). Б амплификация (увеличение количества копий) гена PDGFRA (локус 4q12) в глиобластоме. Красные сигналы LNX (локус 4q12), зеленые сигналы SCFD2 (локус 4q12), голубые сигналы – PDGFRA (локус 4q12). В - амплификация (увеличение количества копий) гена MYCN (локус 2p24.3) в глиобластоме. Зеленые сигналы MYCN (локус 2p24.3), красные сигналы – центромера 2 хромосомы СЕР2 (локус 2p11.1-q11.1). 135 Рисунок 34. Цитогенетические аберрации, выявленные флуоресцентной гибридизацией in situ. А - гомозиготная делеция CDKN2A (p16) (локус 9p21) в сочетании с моносомией 9 хромосомы в глиобластоме. Красные (единичные) сигналы CDKN2A (локус 9p21), зеленые сигналы - центромера 9 хромосомы CEP 9 (локус 9p11-q11). Б - моносомия хромосомы 10q в глиобластоме. Красные сигналы - PTEN (локус 10q23), зеленые сигналы центромера 10 хромосомы CEP 10 (локус 10p11.1-q11.1). 136 3.2.4. Связь выявленных в глиобластомах цитогенетических аберраций с гистологической картиной опухоли В большинстве случаев амплификациии генов EGFR, PDGFRA, MYC/MYCN и CDK/CCND были выявлены в изоморфноклеточных глиобластомах, реже цитогенетические аберрации встречались в полиморфно-клеточных, гемистоцитарных глиобластомах и глиобластомах с ПНЭО-подобными участками. Никакой четкой взаимосвязи между определенным гистологическим подтипом глиобластом у детей и взрослых и наличием тех или иных амплификаций онкогенов не наблюдалось. 137 3.3. Выявление в глиобластомах мутаций генов методами полного экзомного секвенирования (Whole exome sequencing WES) и прямого секвенирования (Direct sequencing), выявление мутантных протеинов методом иммуногистохимического исследования, выявление эпигенетических нарушений методом метиляционного анализа ДНК (DNA methylation profiling) 3.3.1. Анализ мутаций генов в глиобластомах методом полного экзомного секвенирования Методом полного экзомного секвенирования были изучены соматические немолчащие протеин-кодирующие мутации в 48 детских глиобластомах. Впервые в мире в глиобластомах у детей была выявлена повторяющаяся гетерозиготная мутация гена H3F3A, кодирующего гистон H3.3. Мутация выявлена 15 случаях (31%) в двух вариантах: с заменой лизина в позиции 27 на метионин (K27M – 9 случаев 19%) и с заменой глицина в позиции 34 на аргинин (G34R – 5 случаев 10%) или на валин (G34V – 1 случай 2%). 3.3.2. Анализ мутаций генов H3F3A, IDH1 и BRAF в глиобластомах методом прямого секвенирования Методом прямого секвенирования были изучены мутации генов H3F3A, IDH1 и BRAF. Все выявленные мутации были взаимоисключающими - то есть в генотипе опухоли встречалась только одна единственная мутация, сочетаний мутаций генов H3F3A (в том числе вариантов мутации гена H3F3A – K27M и G34R/V - однобуквенные обозначения аминокислот см. Приложение 3), IDH1 и/или BRAF не выявлено. Мутация гена H3F3A была обнаружена в 68 (50%) детских глиобластомах и в 1 (1%) взрослой глиобластоме. Мутация гена H3F3A 138 выявлена в двух вариантах: K27M (53 опухоли детских опухоли – 39% и в одном случае взрослой глиобластомы - 1%) (рисунок 35) и G34R/V (15 случаев детских глиобластом – 11%) (рисунок 36). Варианты мутации были строго связаны с определенной локализацией – мутация K27M возникала только в глубинных срединно расположенных опухолях (таламус, ствол головного мозга и спинной мозг), в то время как мутация G34R/V была выявлена только в полушарных опухолях, что и обуславливало больший процент тотально удаленных опухолей среди G34R/V мутированных глиобластом. Мутация К27М была обнаружена в 53 срединных опухолях (83%) из 64 включенных в исследование опухолях таламуса, ствола и спинного мозга. Только 11 опухолей подкорковых ганглиев не имели мутации К27М. Мутации K27M встречались в глиобластомах у детей от 1 года до 18 лет, вариант G34R/V был преобладающим в более старшем возрасте от 8 до 15 лет. Прогрессия заболевания возникла почти в половине случаев глиобластом с мутацией K27M, как в виде локального рецидива так и метастазирования. Глиобластомы с мутацией K27M также имели самые высокие показатели смертности (49% случаев). Единственная мутация K27M во взрослой глиобластоме была выявлена в распространенной от подкорковых ганглиев до теменно-височной области опухоли, развившейся у женщины 44 лет, скончавшейся от прогрессии заболевания (локальный рецидив) через 14 месяцев после проведенной операции. В пяти детских (4%) полушарных глиобластомах в возрасте от 8 до 18 лет и в 29 (38%) взрослых глиобластомах выявлена мутация гена IDH1 R132H (рисунок 37). Мутация гена BRAF V600E выявлена только в двух случаях (1%) детских глиобластом у девочек 7 и 11 лет с полушарными опухолями, в одной из этих глиобластом также имелись множественные амплификации генов EGFR, PDGFRA и MYC. 139 В 61 случае (45%) детских глиобластом указанных мутаций не выявлено. При сравнении процентного соотношения выявленных мутаций в детских и взрослых глиобластомах, ясно видно, что детские и взрослые опухоли имеют по одной ключевой часто повторяющейся мутации генов -H3F3A в детских опухолях и IDH1 в глиобластомах взрослых. Соотношение выявленных мутаций в детских и взрослых глиобластомах показано на рисунке 38. 140 А Б Рисунок 35. Электрофореграмма исследования мутации гена H3F3A методом прямого секвенирования. А - отсутствие мутации гена H3F3A K27M. Продукт прямого секвенирования генов выявляется путем капиллярного электрофореза в геле. Для этого нуклеотиды метятся четырьмя различными флуорохромными красителями: аденин - зеленым цветом, гуанин - черным цветом, цитозин - синим цветом и тимин - красным цветом. При возникновении мутации происходит замена одной аминокислоты на другую, что приводит к замене пар оснований. Б мутация гена H3F3A K27M, выявленная методом прямого секвенирования возникает в результате замены аминокислоты лизина на метионин (К27М) и характеризуется заменой пары оснований аденина на тимин (показано стрелкой ↓). 141 А Б Рисунок 36. Электрофореграмма исследования мутации гена H3F3A методом прямого секвенирования. А - отсутствие мутации гена H3F3A G34R/V. Б мутация гена H3F3A G34R/V, выявленная методом прямого секвенирования возникает в результате замены аминокислоты глицина на аргинин (G34R) или глицина на валин (G34V) и характеризуется заменой пары оснований гуанина на аденин (показано стрелкой ↓). 142 А Б Рисунок 37. Электрофореграмма исследования мутации гена IDH1 методом прямого секвенирования. А - отсутствие мутации гена IDH1. Б - мутация гена IDH1, выявленная методом прямого секвенирования возникает в результате замены аминокислоты аргинина на гистидин и характеризуется заменой пары оснований гуанина на аденин (показано стрелкой ↓). 143 K27M 39% G34R/V 11% IDH1 4% BRAF 1% wt GBM 45% А K27M 1% G34R/V 0 IDH1 38% BRAF 0 wt GBM 61% Б Рисунок 38. Процентное соотношение выявленных мутаций в глиобластомах. А – детские глиобластомы. Б - взрослые глиобластомы. 144 3.3.3. Иммуногистохимическое выявление мутантных протеинов K27M, IDH1 и BRAF в глиобластомах Оценка наличия мутации К27М иммуногистохимическим методом с помощью антитела H3K27me производилась на основании отсутствия экспрессии гистонового белка, возникающего при данной мутации - косвенный метод и не совсем точный. Отсутствие экспрессии антитела H3K27me в ядрах опухолевых клеток при сохранной экспрессии в эндотелии сосудов и единичных лимфоцитах (рисунок 39А) наблюдалось в 42 глиобластомах у детей (31%) и в 1 взрослой опухоли (1%). Однако методом прямого секвенирования мутация К27М была выявлена в 53 опухолях у детей. В 94 детских глиобластомах (из них 11 опухолей с мутацией гена H3F3A вариант K27M и 83 опухоли с отсутствием данной мутации) и в 76 глиобластомах у взрослых выявлена ядерная экспрессия К27М. Выраженная цитоплазматическая экспрессия IDH1 (рисунок 39Б) выявлена в 5 детских опухолях (4%) и в 29 глиобластомах взрослых (38%). В 48 глиобластомах у взрослых и 131 глиобластоме у детей цитоплазматической экспрессии IDH1 не наблюдалось. Таким образом, данные прямого секвенирования генов и иммуногистохимического исследования по выявлению мутантного протеина IDH1 совпали в 100% случаев. Выраженная цитоплазматическая экспрессия BRAF выявлена только в двух случаях глиобластом у детей (1%), что полностью совпало с результатами прямого секвенирования. 145 Рисунок 39. Выявление мутантных протеинов K27M и IDH1. А – иммуногистохимическое исследование с антителом H3K27me, увеличение Х200. Отсутствие ядерной экспрессии (при сохранной экспрессии в пролиферирующих сосудах) H3K27me в глиобластоме с мутацией гена H3F3A вариант К27М. Б иммуногистохимическое исследование с антителом Anti-Human IDH1 R132H, увеличение Х400. Положительная экспрессия IDH1 в глиобластоме с мутацией гена IDH1. 146 3.3.4. Выявление эпигенетических нарушений методом метиляционного анализа ДНК Метиляционный анализ выявил преимущественно гипометилированный генотип в детских опухолях – в 131 случае и в 5 случах с мутацией гена IDH1– гиперметилированный генотип. Во взрослых глиобластомах нормометилированный генотип был выявлен в 48 опухолях и гиперметилированный генотип в 29 глиобластомах, что четко коррелировало с отсутствием или наличием мутации гена IDH1. Ген MGMT был метилирован в 28 опухолях у детей (21%), чей возраст был старше 8 лет. Метилирование гена MGMT в 100% случаев сочеталось с мутацией гена IDH1 и в 73% случаев - с мутацией G34R/V, 11 детских глиобластом (17%), в которых не было выявлено вышеописанных мутаций, имели метилированный ген MGMT, также в одном случае было выявлено сочетание мутации К27М и метилирования гена MGMT у девушки 18 лет с опухолью среднего мозга, которая после 6 курсов химиотерапии Темозоломидом была жива в течение 11 месяцев без признаков прогрессии заболевания. У взрослых глиобластом метилированный ген MGMT был выявлен 34 опухолях (44%), как и в детской серии метилирование гена MGMT в 100% сочеталось с мутацией гена IDH1, также метилированный ген MGMT был выявлен в 5 опухолях с отсутствием мутации гена IDH1. Из пяти взрослых четверо были живы в период от 8 до 20 месяцев, двое с рецидивом заболевания. Одна пациента умерла через четыре месяца после операции от диффузно растущей глиобластомы, распространяющейся на ствол головного мозга. Процентное соотношение выявленных мутаций генов H3F3A и IDH1 в детских и взрослых глиобластомах с метилированным геном MGMT изображено на рисунке 40. Более подробно мутационный анализ глиобластом детского возраста представлен в таблице 6. 147 K27M 4% G34R/V 39% IDH1 18% wt GBM 39% А K27M 0 G34R/V 0 IDH1 85% wt GBM 15% Б Рисунок 40. Процентное соотношение выявленных мутаций генов H3F3A и IDH1 в глиобластомах с метилированным геном MGMT. А – детские глиобластомы. Б взрослые глиобластомы. 148 Таблица 6 Анализ выявленных методом прямого секвенирования мутаций в исследуемой группе (n-136) Мутация гена H3F3A вариант K27M (n-53 39%) Мутация гена H3F3A Мутация гена IDH1 вариант G34R/V (n-5 4%) (n-15 11%) Мутации указанных генов не выявлено (n-63 46%) Метилирование гена MGMT (метиляционный анализ) (n-28 21%) Мальчики (n-69) 26 (38%) 10 (14%) 2 (3%) 31 (45%) 15 (22%) Девочки (n-67) 27 (40%) 5 (7%) 3 (4%) 32 (48%) 13 (19%) 0 0 0 1/1 0 года (n-0) 0 0 0 0 0 1 год – 3 года (n-5) 2 (40%) 0 0 3 (60%) 0 4 года - 7 лет (n-36) 16 (44%) 0 0 20 (55%) 2 (5%) 8 лет - 15 лет (n-69) 27 (39%) 12 (17%) 3 (4%) 27 (39%) 17 (25%) 16 лет – 18 лет (n-25) 8 (32%) 3 (12%) 2 (8%) 12 (48%) 9 (36%) Пол Возраст 0 - до 6 месяцев (n-1) старше 6 месяцев – до 1 149 Таблица 6 Продолжение Локализация Супратенториальная (n-104) Таламус (n-34) Полушария (n-70) Инфратенториальная (n-20) Ствол (n-18) Мозжечок (n-2) Спинальная (n-12) Степень резекции по данным протоколов операции и послеоперационных КТ или МРТ Тотальное удаление (n-64) Субтотальное удаление (n-41) Частичное удаление (n-16) Биопсия (n-15) 23 (22%) 15 (14%) 5 (5%) 58 (56%) 27 (26%) 23 (68%) 0 18 (90%) 0 15 (21%) 0 0 5 (7%) 0 5 (15%) 53 (76%) 5 (25%) 0 27 (39%) 1 (5%) 18 (100%) 0 12 (100%) 0 0 0 0 0 0 3 (17%) 2/2 0 1 (6%) 0 0 15 (23%) 8 (12%) 3 (5%) 28 (44%) 17 (27%) 26 (63%) 3 (7%) 2 (5%) 21 (51%) 5 (12%) 6 (38%) 2 (12%) 0 7 (44%) 3 (19%) 6 (40%) 2 (13%) 0 7 (47%) 3 (20%) 150 Таблица 6 Окончание Ген MGMT метилирован 1 (4%) 11 (39%) 5 (18%) 11 (39%) 28 (100%) 14 (13%) 4 (4%) 44 (41%) 24 (22%) 12 (14%) 4 (5%) 35 (41%) 20 (24%) 1 (5%) 0 8 (40%) 1 (5%) 1/2 0 1/2 2/2 8 (11%) 0 31 (41%) 12 (16%) (n-28) Прогрессия заболевания 46 (44%) (n-107) Локальный рецидив 36 (42%) (n-85) Метастазирование (n-20) Локальный 8 (40%) рецидив и 2/2 метастазирование (n-2) Смерть (n-76) 37 (49%) 151 При сопоставлении цитогенетических аберраций и мутаций, а также эпигенетических событий (см. таблицу 7 и рисунок 41), выявленных в нашей работе, было установлено, что цитогенетические аберрации преобладают в группе с отсутствием мутации гена H3F3A у детских опухолей (детские случаи с мутациями генов IDH1 и BRAF были отнесены в группу с отсутствием мутации гена H3F3A) и отсутствием мутации гена IDH1 у взрослых глиобластом. Что касается глиобластом с метилированным геном MGMT, то в обеих возрастных группах преобладала потеря хромосомы 10q (29% в детской серии и 53% в глиобластомах взрослых), причем количество аберраций во взрослых опухолях за исключением амплификаций гена PDGFRА превышало количество цитогенетических нарушений в глиобластомах у детей с метилированным геном MGMT. Во взрослой серии гомозиготная делеция гена CDKN2A была выявлена в 10 опухолях (29%), амплификации генов CDK/CCND – в 9 опухолях (26%), амплификации генов EGFR и MYC/MYCN в 5 глиобластомах (15%), амплификация гена PDGFRA в двух опухолях (6%) из 34 с метилированным геном MGMT. 152 Таблица 7 Сочетание в генотипе опухоли цитогенетических аберраций, мутаций и метилирования гена MGMT в исследуемой группе (n-136) Амплификация гена Мутация Мутация Мутация Мутации Метили- гена гена гена указанных рование H3F3A H3F3A IDH1 генов гена вариант вариант (n-5) не выявлено MGMT K27M G34R/V (n-63) (n-28) (n-53) (n-15) 1 (2%) 0 1 (20%) 13 (21%) 4 (14%) 7 (13%) 2 (13%) 2 (40%) 9 (14%) 6 (21%) 6 (11%) 1 (7%) 1 (20%) 7 (11%) 4 (14%) 10 (19%) 3 (20%) 0 13 (21%) 5 (18%) 5 (9%) 1 (7%) 1 (20%) 14 (22%) 3 (11%) 16 (30%) 4 (26%) 1 (20%) 26 (41%) 8 (29%) EGFR (n-15) Амплификация гена PDGFRА (n-20) Амплификация генов MYC/MYCN (n-15) Амплификация генов CDK/CCND (n-26) Гомозиготная делеция гена CDKN2A (n-21) Потеря хромосомы 10q (n-47) 153 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Детские глиобластомы с мутацией H3F3A (n=68) Детские глиобластомы без мутации H3F3A (n=68) Взрослые глиобластомы с мутацией IDH1 (n=29) Взрослые глиобластомы без мутации IDH1 (n=48) Рисунок 41. Распределение цитогенетических аберраций по группам в зависимости от наличия или отсутствия мутации гена H3F3A в детских глиобластомах и от наличия или отсутствия мутации гена IDH1 во взрослых опухолях. 154 3.3.2. Кластерный анализ результатов, полученных при изучении эпигенома детских глиобластом Кластерный анализ выявил следующие метиляционные кластеры: IDH1, K27M, G34R/V и глиобластомы с отсутствием ключевых мутаций - wt GBM (wild type glioblastomas) (рисунок 42). 1. Кластер IDH1 составили 34 полушарных глиобластомы (5 детских опухолей и 29 взрослых), с выявленной в половине случаев экспрессией проневральных генов и гиперметилированным генотипом. 2. Кластер K27M - 53 детских и 1 взрослая опухоль со срединно-глубинной локализацией с преимущественной экспрессией проневральных генов, а также единичными случаями с экспрессией классических и мезенхимальных генов и гипометилированным генотипом в детских случаях. 3. Кластер G34R/V – 15 детских опухолей с полушарной локализацией, экспрессией классических генов в подавляющем большинстве случаев, а также единичными опухолями с экспрессией мезенхимальных и проневральных генов и гипометилированным генотипом. 4. Кластер wt GBM – 68 детских и 47 взрослых опухолей. Данные опухоли экспрессировали проневральные, нейральные, классические и мезенхимальные гены. Детские глиобластомы имели гипометилированный генотип, взрослые опухоли характеризовались нормометилированным генотипом. 155 K27M IDH1 G34R/V wt GBM Рисунок 42. Кластерный анализ 136 детских глиобластом. Цветовая шкала: красный цвет – метилированный участок ДНК, синий цвет – неметилированный участок ДНК. Метилированный контроль – M.Sssl-DNA (M.SssI-treated DNA), неметилированный контроль – WGA-DNA (Whole-Genome Amplified DNA). Кластерирование выполнено на основе анализа 450 тысяч CpG-островков, расположенных на аррее Illumina Infinium Human-Methylation450 BeadChip. Для кластерирования было отобрано 7914 точек (CpG-островков). 156 3.3.6. Статистический анализ выживаемости нейрохирургических больных с глиобластомами Для статистического исследования мы использовали метод анализа выживаемости Kaplan-Meier и регрессивную модель Кокса. Унивариантный анализ показал, что статистически значимым для общей выживаемости детских глиобластом является наличие амплификаций и тип выявленной мутации: наличие мутации гена H3F3A в варианте K27M или в варианте G34R/V, а также наличие мутации гена выявленных мутации IDH1 (рисунок 43). Две гена BRAF V600E в виде отдельной группы в статистическое исследование не включались в виду недостоверного количества случаев, данные два случая отнесены к случаям без выявленных мутаций генов H3F3A или IDH1. 1-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант K27M – 47%, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - 74%, для детских глиобластом с мутацией гена IDH1 – 100% и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A или IDH1 – 63%. 2-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант K27M – 8%, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - 44%, для детских глиобластом с мутацией гена IDH1 – 100% и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A или IDH1 – 31%. 3-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант K27M – 4%, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - недостаточно данных для определения, для детских глиобластом с мутацией гена IDH1 – 100% и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A или IDH1 – 19%. 157 5-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант K27M – 0, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - недостаточно данных для определения, для детских глиобластом с мутацией гена IDH1 – недостаточно данных для определения и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A или IDH1 – 13%. 158 1,2 Общая выживаемость p=0,0001 1 0,8 wt H3F3A (n-63) K27M (n-53) G34R/V (n-15) IDH1 (n-5) 0,6 0,4 0,2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Время в месяцах Рисунок 43. Общая выживаемость детей с глиобластомами в зависимости от наличия мутации генов H3F3A (варианты К27М и G34R/V) или отсутствия мутации генов H3F3A (wt H3F3A) и IDH1. 159 Разделив взрослые и детские глиобластомы в зависимости от наличия или отсутствия выявленных мутаций на две группы – детские глиобластомы с мутацией и без мутации гена H3F3A (детские случаи с мутацией генов IDH1 и BRAF были отнесены в группу опухолей с отсутствием мутации гена H3F3A) и взрослые глиобластомы с мутацией и без мутации гена IDH1, мы получили достоверные различия в общей выживаемости этих групп (рисунок 44). 1-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A - 74%, для детских глиобластом без мутации гена H3F3A – 74%, для взрослых глиобластом с мутацией гена IDH1 - 96%, для взрослых глиобластом без мутации гена IDH1 – 74%. 2-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A - 17%, для детских глиобластом без мутации гена H3F3A – 27%, для взрослых глиобластом с мутацией гена IDH1 - 85%, для взрослых глиобластом без мутации гена IDH1 – 39%. 3-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A - 0, для детских глиобластом без мутации гена H3F3A – 19%, для взрослых глиобластом с мутацией гена IDH1 - 85%, для взрослых глиобластом без мутации гена IDH1 – 0%. 5-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A - 0%, для детских глиобластом без мутации гена H3F3A – 13%, для взрослых глиобластом с мутацией гена IDH1 - 68%, для взрослых глиобластом без мутации гена IDH1 – 0%. 160 1,2 Общая выживаемость р<0,00000001 1 0,8 H3F3A (n-68) wt H3F3A (n-68) IDH1 (n-29) wt IDH1 (n-48) 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 100 Время в месяцах Рисунок 44. Общая выживаемость детей с глиобластомами в зависимости от наличия (H3F3A) или отсутствия (wt H3F3A) мутации гена H3F3A и взрослых с глиобластомами в зависимости от наличия (IDH1) или отсутствия (wt IDH1) мутации гена IDH1. 161 3.3.6.1. Регрессивная модель Кокса Мультивариантный анализ показал, что негативное влияние на прогноз при детских глиобластомах оказывают следующие факторы: наличие мутации гена H3F3A вариант K27M, наличие амплификации любого из перечисленных (EGFR, PDGFRA, MYC/MYCN, CDK/CCND) онкогенов, а также срединная и глубинная локализация опухоли (в таламусе, стволе головного мозга и спинном мозге), в то время метилированный ген MGMT позитивно влияет на прогноз заболевания. Таблица 8 Влияние клинических и молекулярных особенностей на общую выживаемость детей с глиобластомами Признаки Индекс Hazard 95% р 0.77 (0.08-0.39) 0.03 H3F3A 1.95 0.46 (0.14-0.22) 0.004 EGFR/ 1.85 0.44 (0.22-0.61) 0.006 0.35 (0.04-0.69) 0.004 0.75 (0.54-1.64) 0.007 Отношение рисков Вариант мутации гена H3F3A 2.32 (K27M/G34R/V) Мутация гена (наличие/отсутствие) Амплификация PDGFRA/ MYC/MYCN/ CDK/CCND онкогенов Локализация опухоли 1.34 (срединная/полушарная) Статус метилирования гена 0.36 MGMT (метилирован/неметилирован) 162 3.3.7. Клинико-молекулярная стратификация глиобластом Основываясь на результатах, полученных нами при цитогенетическом, мутационном и метиляционном анализе, а также оценке показателей общей выживаемости для глиобластом у детей и взрослых мы разработали молекулярную классификацию глиобластом, отдельно для каждой возрастной группы, разделив глиобластомы в зависимости от наличия или отсутствия ключевых часто возникающих мутаций генов H3F3A и IDH1 (рисунки 45-46). Первую группу детских глиобластом составили опухоли с мутацией гена H3F3A, выявленной в 50% опухолей. В этой группе были выделены две четко отличные друг от друга подгруппы в зависимости от варианта мутации гена H3F3A. Данные подгруппы различались по локализации опухолей (строго полушарных при варианте G34R/V и глубинно-срединных при варианте K27M), статусу метилирования гена MGMT и показателям общей выживаемости (более благоприятным при варианте G34R/V). Наличие мутации гена IDH1 было отличительной особенностью группы взрослых глиобластом, которые, помимо мутации гена IDH1, характеризовались гиперметилированным генотипом и строгой локализацией в больших полушариях. Детские и взрослые глиобластомы без мутации генов объединяло большее количество возникающих в них цитогенетических аберраций - в частности, амплификации гена EGFR во взрослых глиобластомах без мутации IDH1 и амплификацией гена EGFR, гомозиготной делецией CDKN2A и потерей длинного плеча хромосомы 10q в детских глиобластомах без мутации гена H3F3A. 163 Детские глиобластомы Отсутствие мутации гена H3F3A (50%) Мутация гена H3F3A (50%) Вариант К27М (39%) Таламус, ствол и спинной мозг Вариант G34R/V (11%) Часто амплификации гена EGFR, гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря 10q Большие полушария Чаще в больших полушариях MGMT метилирован в 2% MGMT метилирован в 73% MGMT метилирован в 23% 2-летняя общая выживаемость 8% 2-летня общая выживаемость 44% 2-летняя общая выживаемость 31% Рисунок 45. Клинико-молекулярная стратификация детских глиобластом. 164 Глиобластомы взрослых Мутация гена IDH1 Большие полушария Реже цитогенетические аберрации Генотип гиперметилирован G-CIMP+ Благоприятный прогноз 5-летняя общая выживаемость 68% Нет мутации гена IDH1 Чаще большие полушария Амплификация гена EGFR в 42% Генотип нормометилирован G-CIMP- Неблагоприятный прогноз 5-летняя общая выживаемость 0 Рисунок 46. Клинико-молекулярная стратификация взрослых глиобластом. 165 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 4.1.Клинико-морфологическое сопоставление полученных аберраций и их прогностическое значение в глиобластомах у нейрохирургических больных Гистологическая диагностика опухолей центральной нервной системы является важным этапом общего процесса диагностики и лечения новообразований головного мозга, включающего помимо морфологической верификации до- и послеоперационную нейровизуализацию, хирургическое удаление опухоли и адъювантную терапию. Правильно поставленный гистологический диагноз позволяет нейроонкологам выбрать соответствующий протокол лечения и контролировать заболевание. Известно, что применение обладающего противоопухолевой активностью антибиотика доксорубицина для лечения атипической тератоидно-рабдоидной опухоли улучшило показатели общей выживаемости, а глиобластомы согласно текущим протоколам лечения в отличие от ПНЭО ЦНС не требуют проведения краниоспинального облучения [57, 64, 71, 82, 208, 276, 299]. В последние годы благодаря изучению молекулярно-генетических особенностей злокачественных опухолей головного мозга у детей и разработке новых диагностических маркеров для иммуногистохимического исследования процесс гистологической верификации опухолей значительно упростился, но попрежнему требует внимательного отношения и знаний о точной локализации опухоли [50, 51, 91, 187, 151, 162, 204]. Часто как детские так и взрослые опухоли имеют сходную гистологическую картину низкодифференцированной мелко круглоклеточной злокачественной опухоли, но под описанной гистологической картиной может скрываться 166 множество новообразований, которые по биологическим свойствам и подходам к лечению представляют собой абсолютно разные группы опухолей, требующие собственных протоколов лечения [38, 42, 52, 70, 72, 96, 99, 148, 277]. Спектр опухолей у детей (особенно у детей младшего возраста), требующих проведения дифференциального диагноза с глиобластомой достаточно широк и включает прежде всего эмбриональные новообразования: атипическую тератоидно-рабдоидную опухоль, реже эмбриональную опухоль с многорядными розетками и ПНЭО ЦНС. Также в некоторых случаях трудно отличить глиобластому от анапластической эпендимомы, для которой характерна точечная экспрессия ЕМА в цитоплазме опухолевых клеток, и плеоморфной ксантоастроцитомы с признаками малигнизации. Атипическая тератоидно-рабдоидная опухоль редко показывает классическую картину опухоли с присутствием фракции лежащих отдельно друг от друга крупных рабдоидных клеток с эозинофильной цитоплазмой, содержащей глобулярные включения, и эксцентрично расположенным ядром с видимыми ядрышками и везикулярным хроматином [187], чаще она представляет собой мелко круглоклеточную опухоль, гистологически неотличимую от изоморфноклеточной глиобластомы или ПНЭО ЦНС. Заподозрить АТРО помогают возраст младше 5 лет, парастволовая локализация в перимедулярной цистерне или в мостомозжечковом углу, а также нейровизуализационные данные. Особенностями АТРО на МРТ являются кровоизлияние в опухоль [160] и контрастное усиление в виде извитого ободка, окружающего кисту или некротические участки [311]. До введения в рутинную практику иммуногистохимического исследования опухоли с антителом INI1 (Clone MRQ-27) или Anti-BAF47 BD Transduction Laboratories Clone 25/BAF47 [151, 204] некоторое количество АТРО ошибочно диагностировалось как глиобластомы или ПНЭО ЦНС. В последнее время отличить вышеперечисленные опухоли от АТРО не составляет большого труда по наличию тотальной ядерной экспрессии INI1 (BAF47) в любой супра- и 167 инфратенториальной опухоли за исключением АТРО. При этом внутренним контролем корректной работы антитела INI1 (BAF47), которое мы используем в разведении 1:250, является присутствие экспрессии INI1 в эндотелии сосудов. Для диагностики АТРО могут быть использованы и другие антитела: виментин, эпителиальный мембранный антиген ЕМА и гладкомышечный актин, которые экспрессируются преимущественно в крупных рабдоидных клетках. Также можно наблюдать экспрессию глиофибриллярного кислого белка и синаптофизина как в порции крупных клеток, так и в мелких недифференцированных клетках [50, 51, 187, 301]. Экспрессия виментина, гладкомышечного актина и ЕМА может отсутствовать в мелкоклеточной порции опухоли, что (особенно при положительной экспрессии синаптофизина) может привести к ошибочному диагнозу ПНЭО ЦНС, кроме того, АТРО возникают и у взрослых [27, 120, 188, 191, 238, 244, 274, 289, 290]. Поэтому на сегодняшний день «золотым стандартом» в постановке диагноза «атипическая тератоиднорабдоидная опухоль» является иммуногистохимическое исследование опухоли с антителом INI1 (Clone MRQ-27) или Anti-BAF47 BD Transduction Laboratories Clone 25/BAF47. Согласно текущей классификации ВОЗ опухолей ЦНС примитивная нейроэктодермальная опухоль центральной нервной системы представляет собой гетерогенную группу опухолей, состоящих из недифференцированных или низкодифференцированных клеток, нейрональной/нейробластической, астроцитарной дифференцировке. Опухоли, показывающие способных к или эпендимарной только нейрональную дифференцировку называются полушарными нейробластомами, в случае наличия ганглиозных клеток - полушарными ганглионейробластомами. Помимо полушарных нейробластом и ганглионейробластом текущая классификация от 2007 года различает медуллоэпителиому, эпендимобластому и ПНЭО ЦНС NOS – «not otherwise specified» – «не указано иное», что является 168 синонимом супратенториальной ПНЭО недифференцированных или ЦНС и используется низкодифференцированных для эмбриональных опухолей любой локализации в ЦНС, исключая большие полушария головного мозга [187]. Все ПНЭО ЦНС являются злокачественными опухолями и имеют как и глиобластома самую высшую IV степень злокачественности, но в то же время если для нейробластомы описаны редкие случаи созревания в более дифференцированную ганглионейробластому [12, 63, 216, 298], то прогноз при возникающих у детей младше 3 лет медуллоэпителиоме и эпендимобластоме крайне неблагоприятен [187]. В текущей классификации ВОЗ опухолей ЦНС упоминается эмбриональная опухоль с обилием нейропиля и истинными розетками (embryonal tumor with abundant neuropil and true rosettes ETANTR). Впервые описанная в 2000 году Eberhart et al. [90], эта опухоль характеризуется яркой морфологической картиной, основной особенностью «эпендимобластических» которой многорядных является наличие истинных розеток небольшого размера, разбросанных среди обильного розового матрикса нейропиля. В опухоли могут встречаться солидные участки скоплений низкодифференцированных клеток, каналы и трабекулярные структуры, подобные нервной трубке эмбриона, что делает эту опухоль очень похожей на эпендимобластому и медуллоэпителиому, а низкодифференцированные участки требуют проведения дифференциального диагноза с глиобластомой, АТРО и ПНЭО ЦНС. Именно из-за наличия истинных многорядных розеток для обозначения этой опухоли в 2010 году Paulus и Kleihues предложили более корректный термин «Embryonal tumor with multilayered rosettes» (ETMR) - эмбриональная опухоль с многорядными розетками [225]. Наличие истинных розеток делает необходимым проведение дифференциального диагноза с опухолями, клетки которых способны к построению истинных (но не всегда многорядных) розеток, к таким опухолям относятся АТРО, незрелая тератома и анапластическая эпендимома [51, 215]. Другой особенностью ETMR 169 является амплификация локуса 19q13.42, кодирующего микроРНК [11, 161, 230], данная амплификация может быть определена методом флуоресцентной гибридизации in situ и не встречается ни в каких других опухолях с истинными розетками кроме ETMR [107, 230]. Наиболее удобным и простым в применении в рутинной практике является предложенное нами иммуногистохимическое исследование опухоли с антителом LIN28A Cell Signaling Inc., которое позволяет безошибочно отличить ETMR от любой другой опухоли по наличию выраженной экспрессии LIN28A в цитоплазме опухолевых клеток [162], хотя некоторые авторы описывают экспрессию LIN28A в глиобластомах со стволовыми клетками и сообщают о роли LIN28A в процессе трансформации нормальной клетки в агрессивную глиальную опухолевую клетку [193]. Наблюдая наличие амплификации на локусе 19q13.42 и выраженной цитоплазматической экспрессии LIN28A в одном случае эпендимобластомы и медуллоэпителиомы мы пришли к выводу о том, что эпендимобластома, медуллоэпителиома и эмбриональная опухоль с многорядными розетками составляют единую нозологическую единицу и должны быть выделены в будущей классификации ВОЗ опухолей ЦНС в отдельную группу ПНЭО ЦНС, возникающую преимущественно у детей младше 3 лет и характеризующуюся неблагоприятным прогнозом [13, 163]. В последнее время в литературе [202, 228, 278, 297] стали появляться сообщения о глиобластомах с участками ПНЭО-подобного строения, характеризующихся наличием нейробластических розеток Homer Wright. Нам также приходилось сталкиваться с такими случаями, когда опухоль наряду с классическими признаками глиобластомы (астроцитома с выраженной атипией ядер и клеток, высокой митотической активностью, пролиферацией эндотелия сосудов и некрозами с псевдопалисадными структурами) содержала участки нейробластической дифференцировки с положительной экспрессией синаптофизина. И хотя по определению ПНЭО ЦНС могут иметь астроцитарную 170 дифференцировку [187], мы склонны считать такие опухоли скорее глиобластомами из-за выявленных нами аберраций, патогномоничных для злокачественных глиом, чем ПНЭО ЦНС с глиальной дифференцировкой. Ранее исследовав глиобластомы, АТРО, ETMR и ПНЭО ЦНС на наличие амплификаций генов EGFR, PDGFRA, MYC и MYCN, мы обнаружили, что генотип глиобластомы имеет самый большой процент (33%) цитогенетических нарушений, а по количеству амплификаций генов MYC/MYCN глиобластома превосходит группу ПНЭО ЦНС, в которой амплификации вышеописанных генов были обнаружены в 6% опухолей [14]. Выявленная нами частота амплификаций генов MYC/MYCN в ПНЭО ЦНС слегка превышает данные, полученные Miller et al. [203] и Pfister et al. [231], которые сообщают о найденных амплификациях гена MYCN в 2% и 5% соответственно, в то же время им не удалось обнаружить ни одного случая амплификации гена MYC, исследовав серии из 35 и 21 супратенториальных ПНЭО ЦНС. Наибольший процент амплификаций генов MYC/MYCN удалось обнаружить Behdad и Perry [35], которые сообщают о 33 выявленных амплификациях генов MYC/MYCN в серии из 24 супратенториальных ПНЭО ЦНС. За всю нашу практику нам ни разу не приходилось видеть одновременной амплификации генов MYC/MYCN в одной и той же опухоли, мы считаем, что это две взаимоисключающие аберрации, возможно только сочетание амплификаций генов MYC, EGFR и PDGFRA, или MYCN, EGFR и PDGFRA, возникающее в глиобластомах. Ретроспективно пересматривая низкодифференцированные злокачественные опухоли и анализируя наш опыт и трудности, с которыми нам приходилось сталкиваться при постановке диагноза, мы разработали алгоритм диагностики внутримозговых злокачественных применении иммуногистохимического опухолей, исследования и основанный на флуоресцентной гибридизации in situ – т.е. наиболее простых методов диагностики, доступных в большинстве патолого-анатомических отделений. 171 Согласно этому алгоритму каждая мелко круглоклеточная опухоль должна быть исследована с антителами к INI1, LIN28A, синаптофизину, эпителиальному мембранному антигену ЕМА, общему лейкоцитарному антигену CD45, CD99, HMB45, цитокератину 7, глиофибриллярному кислому белку GFAP, BRAF, IDH1 и H3K27me, а также с помощью флуоресцентной гибридизации in situ для выявления возможных амплификаций онкогенов EGFR и/или PDGFRA, что позволит поставить правильный диагноз в случае АТРО, ETMR, полушарной нейробластомы или ганглионейробластомы, анапластической эпендимомы, лимфомы и глиобластомы, поможет отличить центральную примитивную нейроэктодермальную плеоморфную опухоль от ксантоастроцитому периферической с ПНЭО, малигнизацией, а заподозрить также выявить прогностически значимые маркеры в глиобластомах. Иммуногистохимическое выявление мутантного гистонового белка (точнее его отсутствия) антителом H3K27me Millipore косвенно укажет на наличие мутации гена H3F3A вариант К27М при небольшом количестве материала и в случае диффузной опухоли ствола поможет правильно поставить гистологический диагноз глиобластомы [286], для которой патогномоничен данный вариант мутации гена H3F3A, возникающий по данным нашей работы в 100% глиобластом ствола головного мозга. Постановка гистологического диагноза в случае опухоли ствола сложна из-за малого количества материала, нередко бывает трудно установить степень злокачественности опухоли и отличить пилоидную астроцитому от анапластической астроцитомы или глиобластомы при отсутствии в биоптате некрозов с псевдопалисадными структурами. В этом случае можно использовать антитело Ki-67 (маркер пролиферативной активности) для определения количества делящихся клеток, но на практике участки с высоким индексом мечения Ki-67 могут сочетаться с фрагментами опухоли с низкой пролиферативной активностью. В таком случае можно использовать новое предложенное Zhou et al. в 2013 году антитело anti-B7H3 antibody (Cat # BAF1027, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), мембранная 172 экспрессия которого в 100% выявляется в диффузных понтинных глиомах, кроме того создано и успешно применяется в преклинических исследованиях одноименное моноклональное антитело для таргентной терапии диффузных понтинных глиом [330]. Как показало данное исследование – особую трудность среди детских опухолей представляет дифференциальная диагностика глиобластомы и плеоморфной ксантоастроцитомы с признаками малигнизации, а также глиом с с митозами и некрозами у детей младше 1 года. Использование классификатора Illumina, созданного на базе отделения педиатрической нейроонкологиии DKFZ показало, что 14% плеоморфных ксантоастроцитом и 2% глиом низкой степени злокачественности были ошибочно диагностированы на основании только гистологической картины как глиобластомы (эти 26 случаев не были включены в данное исследование). Четыре опухоли, классифицированные согласно исследованию Illumina, как глиомы низкой степени злокачественности, возникли у детей в возрасте до 2 лет и гистологически были представлены астроцитарными глиомами с митозами, полиморфизмом ядер и клеток, пролиферацией эндотелия сосудов и некрозами с псевдопалисадными структурами. В опухолях данной группы не было выявлено каких-либо цитогенетических аберраций или мутаций генов H3F3A, IDH1, BRAF V600E. Возможно, что именно генетической принадлежностью к глиомам низкой степени злокачественности при гистологической картине глиобластом и объясняются хорошая выживаемость и возраст младше двух лет как фактор благоприятного прогноза, описанные во многих работах [10, 43, 89, 138, 257]. Трое из наших четверых пациентов, получивших до 20 курсов полихимиотерапии по протоколу Baby POG были живы без признаков прогрессии заболевания 35, 39 и 42 месяца соответственно. Также нельзя полностью исключить и феномен «созревания» опухоли, возникающий под действием химиотерапевтических препаратов и описанный для единичных случаев нейробластом, медуллобластом и глиобластом у маленьких детей [12, 63, 68, 146, 216, 298]. 173 Двадцать две опухоли были классифицированы Illumina как плеоморфные ксантоастроцитомы с признаками малигнизации. Эти впоследствии исключенные из исследования опухоли возникали у детей преимущественно в возрасте от 7 до 16 лет, 82% опухолей имели поверхностную полушарную локализацию и единичные опухоли поражали таламус, средний мозг и спинной мозг. 59% опухолей имели мутацию гена BRAF V600E или V600R, что совпадает с данными Dias-Santagata et al., обнаружившими мутацию гена BRAF V600E в 60% плеоморфных ксантоастроцитом [85]. Плеоморфные астроцитомы с признаками анаплазии по нашим данным не имеют аплификаций генов EGFR или PDGFRA, что отличает их от глиобластом. В единичном случае была выявлена амплификация гена MYCN, также в единичных плеоморфных ксантоастроцитомах с малигнизацией были обнаружены гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q. Суммируя вышеописанные особенности, при дифференциальной диагностике глиобластомы и плеоморфной ксантоастроцитомы с признаками малигнизации следует обращать внимание на более поверхностную локализацию, характерную для большинства случаев плеоморфной ксантоастроцитомы с малигнизацией (хотя текущая классификация ВОЗ опухолей ЦНС и классификатор Illumina показывают возможность и другой более редкой локализации в подкорковых ганглиях, стволе головного мозга и спинном мозге), наличие кисты, присутствие эозинофильных гранулярных телец, клеток со светлой цитоплазмой, очагов периваскулярной лимфоидной инфильтрации, выраженного полиморфизма ядер и клеток, наличие фиброзной ткани как возможной связи с твердой мозговой оболочкой, наличие мутации гена BRAF V600E и отсутствие амплификаций онкогенов EGFR и PDGFRA. Помимо мутации гена BRAF V600E и отсутствия амплификаций онкогенов EGFR и PDGFRA плеоморфную астроцитому с малигнизацией от глиобластомы отличает показатель 5-летней общей выживаемости, равный 48%, в отличие от 5-летней общей выживаемости при детских глиобластомах, составляющей 10%. Хотя объективных критериев, позволяющих четко отличить плеоморфную ксантоастроцитому с малигнизацией и гистологически злокачественную, но 174 молекулярно глиобластомы, классификатора доброкачественную на сегодняшний Illumina. глиому у детей младше 2 лет от день Плеоморфная не существует, за ксантоастроцитома исключением с признаками малигнизации требует дальнейших исследований и решения вопроса об истинном характере злокачественности данной опухоли и выборе оптимального протокола лечения – 64% плеоморфных ксантоастроцитом имели рецидив заболевания, получая лечение по протоколу для глиобластом HIT-HGG-2000/07. Возможно, более обещающим выглядит применение ингибиротов BRAF [158, 214] для лечения плеоморфной ксантоастроцитомы с малигнизацией и мутацией гена BRAF V600E. Гистологическая диагностика опухолей ЦНС - трудоемкий процесс, требующий времени, знаний и совместного диалога (нейрорентгенолога, нейрохирурга, многих специалистов нейроморфолога, нейрорадиолога и нейроонколога), также необходима осведомленность нейроморфолога о возрасте пациента и точной локализации опухоли. Ellison et al. [91] дополняют список клинических данных, помогающих в постановке диагноза, следующими деталями: пол пациента, семейный анамнез (в том числе сведения о наследственных синдромах, предрасполагающих к развитию опухолей ЦНС) и длительность клинических симптомов. В ряде случаев: при стереотаксической биопсии, опухоли ствола головного мозга или при соответствующей консистенции опухолевой ткани, позволяющей легко и безопасно удалить ее ультразвуковым аспиратором присылаемые для гистологического исследования фрагменты опухоли оказываются слишком малы, что создает определенные трудности в постановке правильного гистологического диагноза. Предложенный нами алгоритм призван систематизировать и, возможно, несколько облегчить диагностику злокачественных опухолей ЦНС. 175 4.2. Биологическое значение выявленных в глиобластомах генетических аберраций и мутаций генов и их роль для таргетной терапии опухолей у нейрохирургических больных В данной работе мы исследовали и сравнили между собой цитогенетические аберрации и мутации в двух больших сериях глиобластом у детей (136 опухолей) и взрослых (77 опухолей). Наше исследование показало, что глиобластомы у детей и взрослых при всей схожести гистологической картины имеют некоторые различия по частоте выявленных цитогенетических аберраций (в детской серии преобладала амплификация гена PDGFRA, в то время как глиобластомы у взрослых чаще демонстрировали амплификацию гена EGFR, гомозиготную делецию гена CDKN2A и делецию хромосомы 10q), что говорит о вовлечении различных молекулярных путей в развитие этих опухолей у детей и взрослых. Амплификация гена EGFR была выявлена в 11% глиобластом у детей, но гораздо чаще встречалась во взрослой популяции (29%), в то время как амплификация гена PDGFRA показывала обратную зависимость и чаще встречалась в опухолях детского возраста 15% против 5% амплификаций у взрослых. Амплификации генов MYC/MYCN и CDK/CCND встречались в двух возрастных группах приблизительно с равной частотой: амплификации генов MYC/MYCN в 11% детских глиобластом и 9% взрослых опухолей, амплификации генов CDK/CCND в 19% и 18% соответственно. Гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q преобладали во взрослой популяции глиобластом и составляли 29% и 61% против 15% и 35% в детских опухолях соответственно. Другой не менее важной находкой в детских глиобластомах является мутация гена H3F3A, обнаруженная в нашей серии в 50% опухолей. Мутация – изменение в структуре гена, например, точковые мутации, вызываемые азотистой 176 кислотой, приводят к замене основания (например, цитозин превращается в урацил) и в следующем цикле репликации образует пару с аденином (вместо гуанина), после чего изменение принимает необратимый характер. Мутации типа вставки или выпадения некоторого числа нуклеотидов, не кратного трем, ведут к ошибочной трансляции (биосинтезу белка) всей ДНК, поскольку сдвигают рамку считывания. Впервые описанная нами в 2012 г. [267] мутация гена H3F3A может проявляться в двух вариантах: вариант K27M возникает в результате замены аминокислоты лизина на метионин и характеризуется заменой пары оснований аденина на тимин и вариант G34R/V, возникающий в результате замены аминокислоты глицина на аргинин (G34R) или глицина на валин (G34V однобуквенные обозначения аминокислот см. Приложение 3) и характеризующийся заменой пары оснований гуанина на аденин. Ген H3F3A кодирует гистон Н3.3, поэтому мутация гена H3F3A является эпигенетическим событием и связана с процессом посттрансляционной модификации гистонов. Во время этого процесса может повреждаться взаимодействие гистонов с ДНК и протеинами ядра. Модификации гистонов составляют так называемый ―гистоновый код‖, который и определяет статус структуры хроматина, а также регулирует виртуально все процессы, действующие или зависящие от ДНК, включая репликацию и репарацию, регуляцию экспрессии генов и сохранность центромер и теломер [267]. Модификации гистонов обычно затрагивают область N-терминали и включают метилирование, ацетилирование и форфорилирование [59]. Мутация гена H3F3A была обнаружена в 68 (50%) детских глиобластомах и в 1 (1%) взрослой глиобластоме: вариант K27M выявлен в 53 (39%) опухолях, а вариант G34R/V в 15 (11%) случаях. Оба варианта мутации были строго связаны с определенной локализацией – мутация K27M возникала только в глубинных срединно расположенных опухолях (таламус, ствол головного мозга и спинной мозга), в то время как мутация G34R/V была выявлена только в полушарных опухолях, что и обуславливало больший процент тотально удаленных опухолей 177 среди G34R/V мутированных глиобластом. Мутация К27М была обнаружена нами в 53 срединных опухолях (83%) из 64 включенных в исследование опухолях таламуса, ствола и спинного мозга. Только 11 опухолей подкорковых ганглиев не имели мутации К27М. Мутации K27M чаще встречались в возрастной группе от 4 до 15 лет, вариант G34R/V был преобладающим в более старшем возрасте от 8 до 15 лет. Прогрессия заболевания возникала почти у всех полушарных глиобластом с мутацией G34R/V, в большинстве случаев это был локальный рецидив, в отличие от глиобластом с мутацией K27M, у которых прогрессия заболевания в виде метастазирования возникла в 17%. Различались варианты мутации гена H3F3A и по показателям общей выживаемости: опухоли с мутацией гена H3F3A вариант K27M показывали наихудшие цифры общей выживаемости. 2-летняя общая выживаемость для глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант K27M, вариант G34R/V и с отсутствием мутации гена H3F3A была соответственно 8%, 44% и 31%. Таким образом, согласно полученным нами данным можно сделать вывод о том, что глиобластомы с мутацией гена H3F3A представляют собой отдельную группу глиобластом с определенной локализацией и прогнозом, кроме того мутация гена H3F3A возникает исключительно в глиобластомах [108], а пациенты с глиобластомами с мутацией гена H3F3A вариант К27М имеют наихудшие показатели выживаемости, особенно в случае диффузных понтинных глиом [157]. Мутация гена H3F3A, кодирующего гистон Н3.3 – эпигенетическое событие, способное влиять на регуляцию генной экспрессии путем избирательного регулирования развития генов, а также длины и стабильности теломер [322], возникает мутация гена H3F3A преимущественно в детских опухолях, хотя мы наблюдали единичный случай мутации гена H3F3A вариант К27М в распространенной от подкорковых ганглиев до теменно-височной области опухоли, развившейся у женщины 44 лет, другие авторы также сообщают о редких случаях мутации гена H3F3A вариант К27М в опухолях таламуса у пациентов в возрасте от 17 до 46 лет [20]. 178 Еще онкогены несколько и лет подавляют назад считалось, что мутации активируют гены-супрессоры, тем самым запуская процесс формирования, роста и развития опухоли, но сделанные в последние годы открытия эпигенетических событий в регуляции опухолевого роста несколько расширили наши знания и понимание процесса неопластической трансформации клеток. Несомненно, что генетические и эпигенетические составляющие воздействуют друг на друга множеством путей, запуская процесс развития опухоли. В частности, геномные нарушения (хромосомные аберрации, количественные изменения на хромосомах, вставки, делеции, транслокации, мутации) и эпигенетические нарушения (гипометилирование больших по протяженности участков, локальное гиперметилирование, эпигенетическая активация и эпигенетическое молчание генов, метилированный генотип), а также мутации эпигенетических регуляторов, последовательные эффекты на эпигенетическое состояние, деаминация, перестройки и мутации генов, связанных с хроматином, а также эпигенетическое молчание генов, ответственных за восстановление структуры ДНК – всѐ это приводит к подавлению геновсупрессоров, разрушению иммунной защиты клеток, закреплению и неудалению репликативных ошибок, запускаемому опухолью воспалительному процессу, поддержке пролиферативных сигналов, активации инвазии и метастазирования, индуцированию ангиогенеза, подавлению апоптоза, нарушению энергетического баланса клетки, эпигенетическим нарушениям, нестабильности генома и мутациям и, в конечном счете, к формированию, росту и развитию опухоли [271]. Было показано, в том числе и с нашим участием [37], что мутация гена H3F3A вариант К27М, который кодирует гистон Н3.3, специфически изменяет ди- (H3K27me2) и триметилирование (H3K27me3) эндогенного гистона H3, то есть мутация гена H3F3A вариант К27М может перепрограммировать генетический ландшафт и экспрессию генов, запускающих развитие опухолей. В то же время мутация гена H3F3A вариант G34R/V не оказывает столь очевидного воздействия на метилирование эндогенного гистона, что говорит о другом 179 механизме, вовлеченном в патогенез глиобластом с мутацией G34R/V [65, 66, 304]. Схожие результаты были получены и другими авторами [40], высказавшими теорию об источниках возникновения опухолей с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V из нейроглиальных клеток-предшественниц в субвентрикулярной зоне. Кроме того, мутация гена H3F3A вариант G34R/V связана с повышенной регуляцией гена MYCN, что может давать начало возникновению глиобластом у мышей. Таким образом, стабилизация белка MYCN в G34R/V мутированных опухолях может стать одной из мишеней в терапии глиобластом [40], хотя до сих пор ингибиторов MYCN не было создано из-за особенностей структуры MYCN, состоящей почти полностью из альфа-спиралей и не имеющей поверхности для сшивания с лигандами [135]. В нашей серии из 15 глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V мы выявили только 1 случай амплификации гена MYCN. Сопоставляя гистологическую структуру опухоли и выявленные мутации, мы выяснили, что мутация гена H3F3A вариант G34R/V обнаружилась в 4 из шести опухолей, сочетающих в себе гистологические особенности глиобластомы и ПНЭО ЦНС (участки, содержащие нейробластические розетки). Также мы выявили в этой подгруппе два случая амплификации гена PDGFRA и один случай амплификации гена MYCN. Мы считаем такие опухоли глиобластомами из-за наличия патогномоничных для глиобластомы мутации гена H3F3A вариант G34R/V и амплификации гена PDGFRA и не склонны выделять особый вид опухоли – ―ПНЭО ЦНС/глиобластома‖ как Gessi et al. [106], выявившие аналогичные находки (гистологическую картину и амплификацию генов PDGFRA и MYCN). Кроме того, глиобластомы и ПНЭО ЦНС на сегодняшний момент лечатся согласно различным протоколам: ПНЭО ЦНС в отличие от глиобластом требуют проведения краниоспинального облучения, и хотя четких гистологических критериев и иммуногистохимического маркера (подобного INI1 для атипической-тератоидной рабдоидной опухоли или LIN28A для ETMR) для отличия глиобластомы от ПНЭО ЦНС на сегодняшний не существует, 180 молекулярно эти опухоли по результатам нашего исследования показывают четкие различия, кроме того, сильно отличаются эти опухоли и по интраоперационной макроскопической картине: плотные тяжистые ПНЭО и глиобластомы с зоной распада. Методом прямого секвенирования ДНК помимо мутации гена H3F3A в детских глиобластомах была изучена мутация гена IDH1 R132H. В пяти детских полушарных глиобластомах (4%) в возрасте от 8 до 18 лет выявлена мутация гена IDH1, в отличие от Antonelli et al. [25], которые не обнаружили ни одного случая мутации гена IDH1 в небольшой серии из 22 детских глиобластом. Мутация гена IDH1 во взрослых глиобластомах выявлена в 29 случаях (38%), все опухоли также имели полушарную локализацию. И детские и взрослые глиобластомы с мутацией гена IDH1 имели хорошие показатели общей выживаемости: для детей 3-летняя общая выживаемость соответствовала 100%, для взрослых показатель 5летней общей выживаемости был равен 68%. Ранее мы показали, что глиобластомы у взрослых людей не старше 55 лет (так называемые ―глиобластомы у людей молодого возраста‖) с мутацией гена IDH1, встречающейся в данной возрастной группе в 38% опухолей, имеют более благоприятные показатели общей выживаемости [15]. Та же самая тенденция справедлива и для детей, но в детских глиобластомах, к сожалению, мутация гена IDH1 встречается крайне редко и не превышает по нашим данным 4%. О ―долгожителях‖ при глиобластомах известно давно – причем возраст моложе 50 лет считался основным прогностически благоприятным фактором, Korshunov et al. еще в 2005 г. выделили глиобластому у молодых в отдельную подгруппу с отличительными молекулярными особенностями [165]. Последовавшее в 2008 г. открытие гетерозиготной использования технологии точковой мутации Next-Generation гена Sequencing IDH1 и посредством базы данных, включающей 23,219 транскриптов от 20,661 генов Parsons et al. в глиобластомах этой возрастной группы явилось поворотным моментом в исследовании генетических поломок в глиомах [222]. Открытие мутации гена IDH1 позволило 181 по-новому объяснить предложенную Korshunov et al. в 2006 г. молекулярную классификацию глиобластом, выделяющую две прогностически различные подгруппы глиобластом [164], а выявленный гиперметилированный генотип у взрослых глиобластом с мутацией гена IDH1 [285] позволяет понять, почему опухоли данной группы в отличие от большинства детских глиобластом и взрослых глиобластом с отсутствием мутации гена IDH1 чувствительны к лучевой терапии и химиотерапии алкилирующими агентами, в том числе Темозоломидом. Для определения мутации гена IDH1 и выявления прогностически наиболее благоприятного подтипа глиобластом в рутинной практике любого патологоанатомического отделения возможно использование простого в применении иммуногистохимического исследования, результаты которого в 100% случаев совпадают с прямым секвенированием генов и анализом с использованием Illumina 450k метиляционного аррея. Выявление мутации гена IDH1 (или мутантного протеина IDH1, если речь идет иммуногистохимическом исследовании) в о рекомендуемом нами глиобластомах представляется особенно важным не только из-за чувствительности опухоли к химио- и лучевой терапии, но и по причине возможной таргетной терапии ингибиторами AGI-5198 и AGI-6780, действующими на R132H IDH1 и R140Q IDH2 соответственно [104] и вакциной, вызывающей иммунный Т-клеточный ответ из-за имеющегося иммуногенного эпитопа у IDH1-мутированных глиобластом [266]. Метиляционный анализ выявил преимущественно гипометилированный генотип в детских опухолях – в 131 случаях и гиперметилированный генотип в 5 случах. Во взрослых глиобластомах нормометилированный генотип был выявлен в 48 опухолях и гиперметилированный генотип в 29 глиобластомах. Пять детских опухолей и 29 взрослых глиобластом с гиперметилированным генотипом имели мутацию гена IDH1, то есть по нашим данным гиперметилированный генотип в 100% совпадает с наличием мутации гена IDH1. 182 Статус метилирования гена исследовался MGMT согласно алгоритму, предложенному специально для метиляционого аррея Illumina [28]. Ген MGMT был метилирован в 28 опухолях у детей, чей возраст был старше 8 лет. Метилирование гена MGMT в 100% случаев сочеталось с мутацией гена IDH1 и в 73% случаев - с мутацией G34R/V, 11 детских глиобластом (17%), в которых не было выявлено вышеописанных мутаций, имели метилированный ген MGMT, также в одном случаев было выявлено сочетание мутации К27М и метилирования гена MGMT у девушки 18 лет с опухолью среднего мозга, которая после 6 курсов химиотерапии Темозоломидом была жива в течение 11 месяцев без признаков прогрессии заболевания. Единичные случаи сочетания метилированного гена MGMT и мутации гена H3F3A вариант К27М наблюдали и другие авторы [20]. У взрослых глиобластом метилированный ген MGMT был выявлен 34 опухолях (44%), как и в детской серии метилирование гена MGMT в 100% сочеталось с мутацией гена IDH1, кроме того метилированный ген MGMT был выявлен в 5 опухолях с отсутствием мутации гена IDH1. Также в нашем исследовании выявлено, что наиболее частой генетической аберрацией возникающих в детских и взрослых глиобластомах с метилированным геном MGMT является потеря хромосомы 10q, обнаруженная в 8 детских опухолях (29%) и в 18 взрослых глиобластомах (53%). Сравнивая данные по метилированию гена MGMT и глобальной структуре метилирования на уровне всего генома, мы установили, что детские глиобластомы с метилированным геном MGMT и мутацией гена IDH1 имеют гиперметилированный генотип (G-CIMP+ - Glioma-CpG-Island Methylator Phenotype), в то время как детские опухоли с метилированным геном MGMT и мутацией гена H3F3A (варианты К27М и G34R/V), а также детские глиобластомы с метилированным геном MGMT и отсутствием вышеуказанных мутаций имеют гипометилированный генотип (G-CHOP+ - Glioma-CpG Hypomethylator Phenotype) особенно в непромоутерных и теломерных участках. У взрослых глиобластом наблюдалась аналогичная картина – гиперметилированный генотип 183 был выявлен в опухолях с сочетанием метилированного гена и MGMT мутации гена IDH1. Пять взрослых глиобластом с метилированным геном MGMT и отсутствием мутации гена IDH1 имели нормометилированный генотип. Развитие и распространение структуры метилирования начинается во время эмбрионального развития и заканчивается уже во взрослом мозге, который развивается и созревает приблизительно до 21-летнего возраста. Распространение метиломной конфигурации (или структуры метилирования) совпадает по времени и идет параллельно процессу синаптогенеза, пик синаптогенеза приходится на ранний постнатальный период, далее процесс постепенно идет на убыль. В тоже самое время, густо упакованные метилированные не CG-участки (CG – цитозингуанин) накапливаются в нейронах, обеспечивая и определяя структуру метилирования человеческого нейронального генома. Считается, что динамические эпигенетические изменения возникают не только во время развития и созревания головного мозга, но также и в период обучения. Метилированная ДНК является более менее стабильной структурой, соединенной ковалентными связами, которая сохраняется в постмитотических клетках в течение всего их жизненного цикла, определяя их клеточную идентичность. Однако, статус метилирования каждого из миллиарда цитозинов в геноме представляет собой относительно гибкий в плане эпигенетической модификации субстрат, который может изменяться под действием клеточной активности [179]. Метилирование ДНК вовлечено в ключевые клеточные процессы, такие как инактивация Х хромосомы, геномный импринтинг (эпигенетический процесс, при котором экспрессия определенных генов осуществляется в зависимости от того, от какого родителя поступили аллели, при этом происходит метилирование ДНК в промоутерах, в результате чего транскрипция гена блокируется) и транскрипциональное молчание специфических генов, кроме того, структура метилирования ДНК нарушается при опухолях и некоторых импринтинговых заболеваниях [315]. 184 Метилирование ДНК катализируется ферментом метилтрансферразой, структура метилирования ДНК определяется отчасти первичной последовательностью ДНК, также на нее оказывают влияние и наследственные вариации. Метилированная ДНК распознается метил-CpG сшивающими доменами, которые, возможно, принимают участие в связанном с метилированием ДНК транскрипциональном подавлении генов-супрессоров. Большая часть генома млекопитающих состоит из огромных пространств (неметилированных CpG океанов), среди которых имеются редкие участки высокометилированных CpG динуклеотидов (CpG островки), разделенные между собой короткими фрагментами густоупакованных неметилированных участков [271]. Переходные зоны между CpG океанами и CpG островками называются CpG берега и демонстрируют более ткане-специфичные вариации в структуре метилирования ДНК [137]. CpG островки функционируют как промоутеры для приблизительно 60% генов у человека. CpG островки охватывают участки начала транскрипции приблизительно половины генов в геноме человека, широко представляя гены, которые либо активно экспрессируются либо готовы к транскрипции. Большинство CpG островков остаются защищенными от гиперметилирования, а устойчивые к метилированию промоутеры CpG островков характеризуются значительной ассиметричностью в распределении гуанинов и цитозинов, что приводит к формированию длинных R-образных петель [110]. Также недавно описано явление деметилирования ДНК, связанного с ТЕТ семейством протеинов, которые могут конвертировать 5-метилцитозин в 5гидроксиметилцитозин [271, 315]. Подобно структуре метилирования ДНК в нормальных клетках происходит и метилирование ДНК в геноме опухолей, каждая опухоль имеет свои особенности в структуре метилирования ДНК (называемые также метиломным ландшафтом), что говорит об эволюции опухоли в процессе роста и развития, а 185 также ее взаимодействии с возникающими в конкретный момент времени и закрепляющимися в геноме мутациями. Нами недавно были описаны особенности структуры метилирования ДНК в медуллобластомах, изученные с помощью метиляционного секвенирования ДНК на платформе Illumina: превалирующие протяженные участки гипометилирования ДНК были связаны с понижением генной экспрессии, в то время как крупные частично метилированные домены, занимающие свыше одной трети генома показывали повышение процента мутаций и молчания генов. Опухолевые CpG островки имели преимущественно бимодальную структуру метилирования и были либо полностью метилированными либо полностью неметилированными. Не-CG метилирование в опухолевом геноме почти не наблюдалось, в то время как оно являлось преобладающим в контрольных образцах взрослого мозжечка человека. Кроме того, метилирование CpG островков в медуллобластомах было немного выше, чем в ткани мозжечка, но гиперметилированного генотипа (G-CIMP+ Glioma-CpG-Island Methylator Phenotype), подобно возникающему в глиобластомах, не наблюдалось. Классический путь, обуславливающий молчание генов через промоутеры гиперметилирования в медуллобластомах не является преобладающим, в геноме медуллобластом выявлены множество по-разному метилированных промоутеров в генах, которые не экспрессировались даже в неметилированных образцах. В структуре метилирования медуллобластом также имелись CpG берега и шельфы, связанные с ткане-специфической экспрессией, наличием метилирования гистонов и активным хроматином, а также CpG долины (или каньоны) – локализованные гипометилированные участки, регулирующие ткане-специфичную экспрессию генов. Описанные выше особенности структуры метилирования ДНК в медуллобластомах могут в будущем быть использованы для таргетной терапии [134]. Мутация гена BRAF V600E, выявляемая согласно данным Broniscer et al. [49] и Kleinschmidt-DeMasters et al. [158] в 50-54% глиобластом, обнаружена нами только в 1% опухолей, классифицированных Illumina как глиобластомы, что 186 совпадает с данными Schindler at al. [264]. Гетерозиготные моноаллельные мутации гена BRAF V600E, возникающие в подавляющем большинстве случаев в экзоне 15 в позиции 600 характеризуются заменой аминокислоты валина на глутаминовую кислоту и заменой пар оснований тимина на аденин, либо заменой аминокислоты валина на аргинин (BRAF V600R) и заменой пар оснований гуанина на аденин или тимина на гуанин, также мутация гена BRAF V600E может проявляться в виде вставок пар оснований (чаще треонина) между кодонами 599 и 600. Считается, что мутация гена BRAF V600E имитирует фосфорилирование и активацию аминокислот треонина в позиции 599 и серина в позиции 602, что приводит к активации протеина и влияет на пролиферацию, дифференцировку и выживаемость клеток опухоли [264]. Мутация гена BRAF V600E выявлена только в двух случаях детских глиобластом у девочек 7 и 11 лет с полушарными опухолями, в одной из этих глиобластом также имелись множественные амплификации генов EGFR, РDGFRA и MYC. Девочка 7 лет с глиобластомой с множественными амплификациями скончалась, в то время как девочка 11 лет с глиобластомой с мутацией гена BRAF V600E и отсутствием цитогенетических аберраций оставалась жива на протяжении 14 месяцев. Мутация гена BRAF V600E по данным Broniscer et al. [49] и Kleinschmidt-DeMasters et al. [158] наиболее часто возникает в эпителиоидной глиобластоме, в единичных случаях сочетается с мутацией гена H3F3A вариант K27M или амплификацией гена EGFR. Эпителиоидная глиобластома является редким гистологическим вариантом глиобластомы и характеризуется монотонными полями небольшого размера эпителиоидных клеток с эозинофильной цитоплазмой и четкими границами, а также малым количеством звездчатых цитоплазматических отростков [51, 249]. Эпителиоидная глиобластома требует проведения дифференциального диагноза с рабдоидными опухолями, метастатической карциномой и меланомой, а по ряду гистологических особенностей и МРТ-картине эпителиоидную глиобластому очень трудно отличить от плеоморфной ксантоастроцитомы, что признают и сами авторы [158]. Гистологическая картина двух наших опухолей с мутацией гена BRAF V600E не соответствовала эпителиодной глиобластоме, одна из опухолей с 187 множественными амплификациями онкогенов по гистологическому строению соответствовала глиобластоме с выраженным полиморфизмом ядер и клеток и наличием гигантских многоядерных клеток, а вторая имела в гистологической структуре потоковые участки. Бытует мнение, что глиобластомы с мутацией гена BRAF V600E представляют собой наиболее благоприятный подтип, и Kleinschmidt-DeMasters et al. сообщают о почти 7-летней общей выживаемости в единичных случаях [158]. Согласно нашим данным, мутация гена BRAF V600E обнаруживается в очень маленьком проценте истинных глиобластом, а не плеоморфных ксантоастроцитом с малигнизацией и не может являться прогностически благоприятным фактором, скорее, в протокол лечения таких глиобластом могут быть добавлены препараты ингибиторы BRAF - например, PLX4032 (RG7204 или Vemurafenib) и GDC-0879 хорошо зарекомендовавшие себя при лечении меланомы, также часто показывающей мутацию гена BRAF V600E [78, 158, 264]. Все выявленные в нашей серии мутации были взаимоисключающими: то есть в генотипе опухоли встречалась только одна единственная мутация, сочетаний мутаций генов H3F3A (в том числе вариантов мутации гена H3F3A – K27M и G34R/V), IDH1 R132H и BRAF V600E не выявлено. Наше исследование позволило изучить генетические и эпигенетические особенности глиобластом у детей, попутно сравнив их с глиобластомами взрослых. Анализ полученных цитогенетических аберраций и мутаций показал, что гистологически идентичные детские глиобластомы представляют собой гетерогенную группу опухолей, в которой можно выделить молекулярные факторы, имеющие прогностическое значение. Мультивариантный анализ показал, что негативное влияние на прогноз при детских глиобластомах оказывают следующие факторы: наличие мутации гена H3F3A вариант K27M, наличие амплификации любого из перечисленных (EGFR, PDGFRA, MYC/MYCN, CDK/CCND) онкогенов, а также срединная и глубинная локализация опухоли (в таламусе, стволе головного мозга и спинном мозге), что делает ее недоступной 188 для макроскопически полного хирургического удаления. В то же время, метилированный ген MGMT, мутации генов IDH1 и H3F3A вариант G34R/V позитивно влияют на прогноз заболевания и определяются только в полушарных глиобластомах. Аналогичные данные об амплификации (или множественных амплификациях) любого из онкогенов EGFR, PDGFRA, MYC/MYCN или CDK/CCND как о маркере неблагоприятного прогноза, были получены и другими авторами, дополнительно обнаружившими, что амплификация гена PDGFRA имеет неблагоприятное прогностическое значение в глиобластомах с мутацией гена IDH1 [34, 232, 253]. Среди наших пяти детских глиобластом с мутацией гена IDH1 мы обнаружили два случая амплификации гена PDGFRA, оба ребенка 12 и 18 лет были живы с прогрессией заболевания через 13 и 15 месяцев после постановки диагноза. В группе взрослых глиобластом с мутацией гена IDH1 было выявлено также 2 случая амплификации гена PDGFRA у мужчин 38 и 49 лет, которые были живы без признаков прогрессии заболевания 36 и 32 месяца соответственно. Также обращает на себя внимание и частота встречаемости прогностически значимых молекулярных особенностей: неблагоприятный фактор – мутация гена H3F3A вариант K27M встречается в 39% опухолей таламуса, ствола головного мозга и спинного мозга, а метилирование гена MGMT крайне редко наблюдается в K27M–мутированных глиобластомах. Факторы, позитивно влияющие на общую выживаемость – мутации генов IDH1 и H3F3A вариант G34R/V, метилированный ген MGMT найдены нами только в полушарных опухолях соответственно в 4%, 11% и 28% случаев. Учитывая клинико-молекулярные факторы, мы разработали молекулярную классификацию глиобластом для детских и взрослых опухолей, основанную на наличии или отсутствии ключевых мутаций: мутации гена H3F3A для детской серии опухолей и мутации гена IDH1 для взрослых глиобластом. 189 Первую группу детских глиобластом мутацией гена H3F3А, выявленной в 50% опухолей. составили опухоли с В этой группе были выделены две четко отличные друг от друга подгруппы в зависимости от варианта мутации гена H3F3A. Данные подгруппы различались по локализации опухолей (строго полушарных при варианте G34R/V и глубинно-срединных при варианте K27M), статусу метилирования гена MGMT и показателям общей выживаемости (более благоприятным при варианте G34R/V). Наличие мутации гена IDH1 было отличительной особенностью группы взрослых глиобластом, которые, помимо мутации гена IDH1, характеризовались 100% метилированнным геном MGMT, гиперметилированным генотипом и строгой локализацией в больших полушариях. Характерными особенностями отсутствием мутаций генов встречаемости отсутствием H3F3A и IDH1 являлась высокая частота цитогенетических мутации гена детских и взрослых глиобластом с аберраций. H3F3A имели Детские больший глиобластомы по сравнению с с глиобластомами с мутацией гена H3F3A процент амплификаций генов EGFR и PDGFRA, чаще встречались у них гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q. В группе взрослых глиобластом с отсутствием мутации гена IDH1 наблюдалась похожая ситуация: амплификация гена EGFR была обнаружена в 42% случаев против 7%, выявленных в группе с мутацией гена IDH1. Гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q также были выявлены в большем проценте случаев в группе с отсутствием мутации гена IDH1. Сравнение количества цитогенетических аберраций в детских и взрослых глиобластомах без мутаций генов H3F3A и IDH1 показало, что в группе детских глиобластом преобладали амплификации генов MYC/MYCN, PDGFRA и CDK/CCND. В то время как взрослые глиобластомы чаще показывали амплификацию гена EGFR, гомозиготную делецию гена CDKN2A и потерю хромосомы 10q. 190 Ранее нами было выявлено [285], мутации гена что детские опухоли с отсутствием H3F3А (или с диким типом ―wild type‖ гена H3F3А) согласно данным метиляционного профилирования представлены двумя кластерами опухолей: кластер RTKI, включающий в себя опухоли с амплификацией гена PDGFRA, реже с амплификацией гена EGFR, экспрессирующие преимущественно проневральные гены, реже – классические и мезенхимальные гены и мезенхимальный кластер, представленный опухолями с амплификацией генов EGFR и PDGFRA в единичных случаях, с экспрессией одноименных мезенхимальных генов и единичной экспрессией нейральных и классических генов. В глиобластомах взрослых с отсутствием мутации гена IDH1 согласно данным метиляционного профилирования генов присутствовало три кластера: как и в детской серии - кластер RTKI и мезенхимальный кластер, а также дополнительный третий кластер RTKII (классический), куда попали опухоли с амплификацией гена EGFR, гомозиготной делецией гена CDKN2A и потерей 10q почти в каждом случае, с экспрессией преимущественно классических генов, в единичных случаях имеющие экспрессию мезенхимальных и невральных генов. Попытки классифицировать глиобластомы (преимущественно взрослые серии опухолей) на основе экспрессии тех или иных генов предпринимаются с начала 2000 годов: Phillips et al. в 2006 году [233] выделили три кластера: проневральный, пролиферативный и мезенхимальный. Глиобластомы с экспрессией проневральных генов возникали у людей более молодого возраста (40 лет), были связаны с биологическим процессом нейрогенеза и характеризовались отсутствием цитогенетических аберраций и длительной выживаемостью. Опухоли пролиферативного и мезенхимального кластеров развивались у пациентов более старшего возраста, были связаны с процессами пролиферации и ангиогенеза соответственно, характеризовались добавкой хромосомы 7, амплификацией гена EGFR, потерей хромосомы 10, делецией гена PTEN и неблагоприятными показателями общей выживаемости. Verhaak et al. в 2010 году описали четыре типа глиобластом: проневральный кластер, в котором 191 часто возникают мутации генов ТР53 и IDH1; невральный и классический кластеры с высоким процентом амплификации гена EGFR и мезенхимальный кластер с мутацией гена NF1 [305]. Далее в 2012 году Shen et al. вновь возвращаются к трем кластерам: первый подтип глиобластом характеризуется гиперметилированным генотипом (G-CIMP+) и гиперметилированием генов, вовлеченных в развитие головного мозга и нейрональную дифференцировку, опухоли этого подтипа показывают экспрессию проневральных генов; отличительной особенностью второго подтипа является наличие амплификации гена EGFR и классический экспрессионный профиль; третий подтип связан с повреждением генов NF1 и PTEN экспрессионным профилем [272]. и характеризуется мезенхимальным И наконец, Brennan et al. в 2013 году исследовали структуру метилирования ДНК и сравнив ее с четырьмя экспрессионными кластерами, доказали, что высокие показатели общей выживаемости связаны с проневнальным подтипом и возникающим в опухолях этой группы гиперметилированным генотипом (G-CIMP+), а статус метилирования гена MGMT может являться предиктивным маркером ответа на лечение только в классическом кластере глиобластом [46]. Суммируя данные из научной литературы, становится ясно, что проневральный кластер представляет собой вторичные глиобластомы у молодых людей, характезирующиеся мутациями генов TP53 и IDH1, гиперметилированным генотипом и хорошей выживаемостью, и вполне может быть обозначен согласно данным этой работы и нашей предыдущей работы [15] – кластер IDH1. Остальные три кластера: нейральный, классический и мезенхимальный – соответственно кластерами RTKI, RTKII и мезенхимальным. Ранее нами было выявлено [285], что кластер RTKII не встречается в детских глиобластомах. На данном этапе мы считаем, что два кластера RTKI и мезенхимальный могут быть объединены в одну группу: глиобластомы с отсутствием мутации гена H3F3A или wt GBM, так как кластеры RTKI и мезенхимальный не имеют разницы в показателях общей выживаемости и в их патогенезе имеет значение сигнальный путь RTK (рецептора тирозин киназы). Таргетной терапией для этих кластеров могут служить препараты- 192 ингибиторы RTK/mTOR (receptor tyrosine kinase RTK/mammalian target of rapamycin mTOR) [197, 199], тем более что на сегодняшний день становится очевидным, что детские глиобластомы с отсутствием мутации гена H3F3A и неметилированным геном MGMT не отвечают на терапию Темозоломидом. И хотя полный ответ на лечение препаратами первого поколения - ингибиторами EGFR (Gefitinib, Erlotinib), ингибиторами PDGFRA (Imatinib) описан только у единичных пациентов, а anti-VEGF антитело Bevacizumab (Avastin) применяется в лечении рецидивов глиобластом, в настоящее время созданы препараты второго поколения - ингибироты RTK, ингибиторы класса I PI3K, ингибиторы mTOR киназы (TORKinibs) и двойные ингибиторы PI3(K)/mTOR (phosphatidyloinositide 3-kinases PI3(K)//mammalian target of rapamycin mTOR), учитывающие новые знания о патогенезе глиобластом и внушающие оптимизм в плане ответа на лечение у большей группы пациентов с цитогенетическими аберрациями (аплификациями генов EGFR и PDGFRA, а также потерей хромосомы 10q с одновременной делецией гена PTEN) в глиобластомах [19, 92, 98, 103, 171, 197, 200]. Отсутствие ответа на лечение заставляет искать новые комбинации препаратов и новые методы лечения. Так определенного прогресса при лечении злокачественных глиом удается противоопухолевых препаратов алкилирующих средств и добиться комбинированием различных (например, производных нитрозомочевины, противоопухолевых средств растительного происхождения). Согласно данным Г.Л. Кобякова при использовании режима Фотемустин + Карбоплатин + Этопозид для лечения глиобластом, медиана общей выживаемости составила более 16 месяцев [7]. В культурах клеток и на ксенографтах (экспериментальных моделях глиобластомы) предпринимаются попытки применения онколитических вирусов для лечения злокачественных глиом, например, вируса простого герпеса 1-го типа [195]. Онколитические вирусы – это мутантные вирусы, способные вызывать литическую инфекцию в опухолевых клетках, не затрагивая при этом нормальных 193 клеток, а репликация мутантных вирусов поддерживается потерявшими врожденный иммунный ответ опухолевыми клетками [113]. Методами генной инженерии возможно встроить нужный ген в вектор и использовать вектор для введения нужного гена в реципиентную клетку [16]. Три вектора вируса простого герпеса 1-го типа G207, 1716 и NV1020 показали высокую противоопухолевую активность на животных моделях при глиомах, меланомах, злокачественных опухолях молочной поджелудочной железы. железы, предстательной железы, кишечника и Векторы применялись для лечения опухолей как самостоятельно, так и в сочетании с лучевой и химиотерапией. Онколитические векторы вируса простого герпеса 1-го типа, экспрессирующие «суицидные» гены или иммуностимулирующие гены, были созданы специально для разрушающего воздействия на опухолевые клетки через мультимодальные терапевтические механизмы [303]. Вирус простого герпеса 1-го типа с тимидин киназой и ганцикловиром (ganciclovir (TK/GCV)) в сочетании с Темозоломидом показал высокую эффективность в лечении глиобластомы in vitro и на животных моделях, вызывая редукцию опухолевой ткани, в то время как добавление вальпроевой кислоты не улучшило выживаемости [178, 282]. На сегодняшний день предложено проведение локальной инъекции вектора вируса простого герпеса 1го типа с тимидин киназой в ложе удаленной опухоли сразу же после операции удаления опухоли. При этом вирус простого герпеса 1-го типа с тимидин киназой будет катализировать превращение нетоксичной формы ганцикловира в токсичный аналог, встраивающийся в ДНК делящейся опухолевой клетки и запускающий апоптоз. Такой подход может улучшить выживаемость пациентов с глиобластомами, имеющими потенциальные преимущества неметилированный от прямого ген MGMT онколизиса, [302], а индукции противоопухолевого Т-клеточного ответа и развитие антиангиогенного ответа сыграют свою роль в терапии злокачественных глиом [314]. Предложенное нами разделение детских глиобластом на три группы молекулярного риска или три кластера (глиобластомы с мутацией K27M, с 194 мутацией G34R/V и с отсутствием мутации гена H3F3A) в будущем может способствовать применению дифференцированого подхода к назначению химиотерапии и таргетной терапии. К сожалению, кластер IDH1 благоприятный подтип взрослых глиобластом с мутацией наиболее гена IDH1, метилированным геном MGMT, гиперметилированным генотипом и отвечающий на терапию Темозоломидом, встречается у детей с глиобластомами крайне редко, еще реже по нашим данным встречается мутация гена BRAF, которую некоторые авторы связывают с благоприятным прогнозом в детских глиобластомах и таргетной терапией ингибиторами BRAF [78, 158]. О склонности срединно расположенных глиобластом с метастазированию известно давно [269, 307], например, в нашей работе у 17% пациентов с мутацией гена H3F3A вариант K27M прогрессия заболевания возникла в виде дистантного метастазирования по желудочковой системе и по оболочкам головного и спинного мозга, что может быть обусловлено близостью опухоли к ликворным путям. Возможно, протокол лечения таких пациентов следует дополнить применением краниоспинального облучения? Безусловно, таргетная терапия препаратами, действие которых направлено на упорядочение ремоделирования хроматина и/или посттрансляционную модификацию гистонов, должна принести пользу пациентам со срединно-глубинными глиобластомами с мутацией гена H3F3A вариант K27M. По данным мировой литературы в диффузных глиобластомах ствола головного мозга встречается высокий процент амплификации гена PDGFRA, поэтому этой группе пациентов с неблагоприятным прогнозом может быть предложена терапия ингибиторами PDGFRA [234, 326]. В нашей серии частота амплификации гена PDGFRA в опухолях ствола составила 10% от всех выявленных амплификаций этого гена: 80% были выявлены в супратенториальных глиобластомах и 10% в спинальных опухолях. Следует гетерогенности отметить, что выявление гистологически идентичных значительной глиобластом молекулярной у детей стало возможным благодаря исследованию платформе Illumina 450k. На данный момент, 195 Infinium Human-Methylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA) представляется технологией, позволяющей одновременно исследовать наличие цитогенетических аберраций и эпигенетических событий, определить структуру метилирования ДНК на уровне тотального генома и отдельных генов, воспользовавшись предложенным Bady et al. [28, 316] алгоритмом для определения статуса метилирования гена MGMT, кластерировать и классифицировать опухоли [317], по гистологической картине неотличимые друга от друга (например, опухоли у детей младше 2 лет, гистологически представленные злокачественными глиомами, но имеющие молекулярный профиль глиом низкой степени злокачественности, а также плеоморфные ксантоастроцитомы с малигнизацией, гистологически сходные с глиобластомами). Исследование каждой опухоли на платформе Illumina в будущем позволит избежать ошибок в диагностике и выбрать оптимальный (таргетный) протокол лечения в каждом конкретном случае с учетом молекулярных особенностей каждой конкретной опухоли. Хотя научные результаты, полученные в нашей работе мы можем применять и в сегодняшней рутинной практике, определяя мутации генов и мутантные белки методами прямого секвенирования и иммуногистохимического анализа, также исследуя статус метилирования гена MGMT методом пиросеквенирования. В 1999 году А.В. Голанов в своей диссертационной работе доказал, что глиобластомы являются биологически гетерогенной группой новообразований. Спустя 15 лет наше исследование полностью подтвердило этот вывод. Совершенно справедливыми, выдержавшими проверку временем остаются выводы о неблагоприятном прогностическом значении повышения экспрессии рецептора эпидермального фактора роста и об оптимальной лечебной тактике при глиобластомах, включающей в себя максимально радикальное оперативное вмешательство, проведение курса лучевой терапии и дифференцированное назначение химиотерапии [2]. Наша работа выявила молекулярные особенности детских глиобластом: мутацию гена H3F3A вариант K27M и вариант G34R/V, 196 мутацию гена IDH и метилированный ген MGMT, позволяющие прогностически классифицировать глиобластомы, что является уникальными находками для детских глиобластом и позволяет разделить их на три группы с различными клиническими, молекулярными и прогностическими особенностями – глиобластомы с мутацией гена H3F3A вариант K27M (наиболее прогностически неблагоприятный вариант, встречающийся в 39% срединно-глубинных опухолей), глиобластомы с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V (относительно благоприятный прогностический вариант, развивающийся у 11% полушарных опухолей) и опухоли с отсутствием мутации гена H3F3A (50% детских глиобластом). 197 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Согласно текущей классификации ВОЗ опухолей центральной нервной системы издания 2007 г. глиобластома представляет собой наиболее частую первичную опухоль головного мозга и наиболее злокачественную опухоль с преимущественной астроцитарной дифференцировкой, характеризующуюся низкими показателями общей выживаемости у детей и взрослых. До настоящего момента важной проблемой остается гистологическая верификация глиобластом, особенно изоморфноклеточного варианта, требующего проведения дифференциальной диагностики с другими злокачественными мелко кругло клеточными опухолями. Глиобластомы у детей представляют собой гетерогенную группу, среди которой, несмотря на низкие (не выше 10-15%) показатели 5-летней общей выживаемости, встречаются отдельные ―долгожители‖. Целью нашего исследования было оптимизировать подходы к комплексному лечению глиобластом и улучшить прогнозирование исходов лечения глиобластом на основе исследования генетических и эпигенетических нарушений в глиобластомах у детей в возрасте младше 18 лет, сравнение выявленных нарушений в геноме с контрольной группой уже исследованных глиобластом взрослых, разработка основанной на молекулярных маркерах схемы прогноза и определение возможных генов-мишеней для таргетной терапии. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: оценить нейрохирургическую тактику в зависимости от нарушений в геноме детских глиобластом; разработать алгоритм дифференциальной диагностики низкодифференцированных злокачественных опухолей головного мозга у детей, основанный на молекулярных методах; исследовать молекулярно-генетические аберрации в геноме детских глиобластом методами Illumina HumanMethylation450 BeadChip, сравнительной геномной гибридизации (Array-based Comparative 198 Genomic Hybridization a-CGH) и флуоресцентной гибридизации in situ (Fluorescence in situ hybridization FISH); изучить мутации и эпигенетические события в глиобластомах методами полного экзомного секвенирования (whole exome sequencing WES), прямого секвенирования (Direct sequencing) и метиляционного анализа ДНК (DNA methylation profiling), а также выявить мутантные протеины методом иммуногистохимического исследования; сравнить молекулярно-генетические нарушения в геноме глиобластом у детей и взрослых с целью разработки «возрастной» молекулярной стратификации; собрать катамнестические данные и оценить прогностическую значимость выявленных молекулярно-генетических нарушений, а также оценить биологическую роль выявленных аберраций и определить возможные гены-мишени для таргетной терапии. Для изучения генетических и эпигенетических нарушений в геноме детских глиобластом и сравнения их с молекулярными событиями, возникающими в глиобластомах взрослых были сформированы две группы: исследуемая и контрольная. В исследуемую группу было включено 136 пациентов с глиобластомами de novo, диагностированными в патолого-анатомическом отделении Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко» Российской академии медицинских наук в период с 1998 по 2013 годы. В исследуемую группы вошли 69 мальчиков и 67 девочек в возрасте от 4 месяцев до 18 лет, средний возраст составил 10 лет. Распределив детей с глиобластомами по возрастным группам с использованием следующей общепринятой в педиатрии шкалы: возраст до 6 месяцев, старше от 6 месяцев до 1 года, старше 1 года до 3 лет, от 4 лет до 7 лет, от 8 лет до 15 лет, от 16 лет до 18 лет, мы увидели, что наиболее часто глиобластомы у детей возникают в возрасте от 8 до 15 лет (51%), в то время как в возрасте до 1 года встречаются лишь единичные случаи, в возрастном отрезке от 199 1 года до 7 лет количество заболеваний глиобластомой постепенно возрастает с 4% в возрасте 1-3 года до 26% в период 4-7 лет, а после 16 и до 18 лет количество опухолей идет на спад, достигая 19% после 8-15 летнего максимума заболеваемости. Критериями для включения в исследуемую группу были: возраст от 4 месяцев до 18 лет, наличие достаточного количества замороженного и залитого в парафин опухолевого материала, подтверждение диагноза «глиобластома» на основании генетического исследования с помощью Illumina HumanMethylation450 BeadChip и уникального классификатора опухолей, разработанного в отделении педиатрической онкологии DKFZ, а также наличие катамнестических данных, собранных путем вызова пациента и его родственников в ФГБНУ «НИИ НХ» на обследование и консультацию либо письма или звонка пациенту и его родственникам. Контрольную группу составили 77 взрослых глиобластом – 46 мужчин и 31 женщина в возрасте от 19 до 63 лет (средний возраст 40 лет), оперированных в ФГБНУ «НИИ НХ» в период с 1999 по 2011 годы. Все пациенты исследуемой и контрольной групп были обследованы согласно принятой в ФГБНУ «НИИ НХ» схеме, включающей МРТ головного или спинного мозга с контрастированием, оценку общего функционального статуса по шкалам Лански и Карновского и неврологической симптоматики, оценку степени внутричерепной гипертензии по офтальмоскопической картине глазного дна, электроэнцефалографию, общий и биохимический анализы крови. Основные жалобы детей с глиобластомами зависели от локализации опухоли, самой частой жалобой была головная боль или боль в проекции пораженного отдела спинного мозга, постепенно нарастающие по интенсивности, а также тошнота, рвота, эпилептические приступы, пароксизмальные состояния и глазодвигательные нарушения. Взрослые пациенты с глиобластомами в основном жаловались на головные боли и нарастание общей неврологической 200 симптоматики, что и служило поводом для обращения к неврологу и проведения КТ или МРТ. И у детей и у взрослых преобладала супратенториальная локализация опухолей. 70 детских опухолей и 73 взрослых глиобластомы развились в больших полушариях, 2 взрослых и 34 детских опухоли поражали таламус, ствол головного мозга у детей поражали 18 диффузно-растущих глиобластом, в мозжечке располагались по 2 детских и взрослых глиобластомы, спинальная локализация, как и локализация в стволе головного мозга наблюдалась только в детской серии глиобластом (12 случаев). Все пациенты исследуемой группы подверглись оперативному лечению по поводу глиобластом супратенториальной, субтенториальной и спинальной локализации. Биопсия проводилась при диффузно растущих опухолях в 15 случаях, частичное удаление опухоли (по данным протоколов операций и послеоперационных КТ или МРТ без и с контрастным усилением, проведенных в течение 24-72 часов после операции) в 16, случаях субтотальное удаление опухоли (по данным протоколов операций и послеоперационных КТ или МРТ без и с контрастным усилением, проведенных в течение 24-72 часов после операции) в 41 случае, тотально опухоль была удалена у 64 пациентов. После верификации опухоли и получения гистологического диагноза пациенты в возрасте от 3 до 18 лет получили химиолучевое лечение с использованием протокола HIT-HGG-2007. У детей младше 3-х лет после операции на первом этапе проводился протокол Baby POG. Все пациенты контрольной группы также подверглись оперативному лечению: стереотаксическая биопсия проводилась при диффузно растущих опухолях в двух случаях, частичное удаление опухоли в 12 случаях, субтотальное удаление опухоли в 25 случаях, тотально опухоль была удалена у 38 пациентов. После гистологической верификации опухоли взрослые пациенты с глиобластомами были консультированы в отделении радиологии и группе 201 химиотерапии и получили химиолучевое лечение: лучевую терапию на ложе удаленной опухоли до СОД 60 Гр с одновременным приемом Темодала. Катамнестические данные были известны у всех пациентов исследуемой и контрольной групп. Глубина катамнеза составила от одного года до семи с половиной лет. От основного заболевания скончалось 76 детей (37 мальчиков и 39 девочек) и 23 взрослых (13 мужчин и 10 женщин); прогрессия заболевания в виде продолженного роста опухоли в месте операции наблюдалась у 85 детей и 38 взрослых, из них 34 ребенка и 20 взрослых больных с глиобластомами подверглись повторному оперативному вмешательству. На момент окончания сбора катамнестических данных (1 июня 2014 или дата последнего контакта с пациентом и его родственниками) из повторно оперированных по поводу рецидива опухоли были живы 10 детей и 15 взрослых. Метастазирование процесса по оболочкам головного и спинного мозга возникло у 20 детей и у 2 взрослых. На момент окончания сбора катамнестических данных трое детей с метастазированием были живы. У 2 детей и одного взрослого возникли последовательное рецидивирование и метастазирование опухоли в большие полушария головного мозга. На момент окончания сбора катамнестических данных были живы 1 ребенок и взрослый с последовательным рецидивированием и метастазированием опухоли. На момент окончания сбора катамнестических данных (1 июня 2014 или дата последнего контакта с пациентом и его родственниками) 60 детей и 54 взрослых были живы, у 31 ребенка и 25 взрослых имелась прогрессия заболевания. Для изучения биологии глиобластом были использованы следующие методы исследования: 1. Морфологическое исследование 2. Иммуногистохимическое исследование 202 3. Флуоресцентная гибридизация in situ 4. Сравнительная геномная гибридизация на микро-матрицах разрешением 0.4 МВ 5. Полное экзомное секвенирование 6. Метиляционное профилирование ДНК на платформе Illumina HumanMethylation450 BeadChip 7. Полимеразная цепная реакция 8. Прямое секвенирование Для верификации гистологического диагноза «Глиобластома WHO grade IV» было проведено иммуногистохимическое исследование для исключения других нозологий с антителами к глиофибриллярному кислому белку GFAP, синаптофизину, INI1, LIN28A, эпителиальному мембранному антигену ЕМА, цитокератину CK7, общему лейкоцитарному антигену CD45, маркеру меланомы НМВ45 и CD99. Гистологически подавляющее большинство детских опухолей (109 случаев) принадлежали к классическим мультиформным глиобластомам, в 20 опухолях из 109 были выявлены периваскулярные псевдорозетки; 5 опухолей показывали крупноклеточную гистологию и эпителиоидные особенности с крупными толстостенными сосудами и некрозами; 14 опухолей были классифицированы как мелкоклеточные (6 опухолей из 14 мелкоклеточных глиобластом имели ПНЭОподобные участки с формированием нейробластических розеток); 8 глиобластом имели преимущественно гемистоцитарную клеточную композицию. Глиобластомы у взрослых показывали следующее распределение по гистологической структуре: 32 опухоли были отнесены к мультиформным глиобластомам, 29 имели гемистоцитарную гистологию, 13 глиобластом были мелкоклеточными и 3 глиобластомы были классифицированы как глиобластомы с олигодендроглиальным компонентом. 203 Основываясь на опыте и трудностях, с которыми нам пришлось столкнуться в процессе постановки гистологического диагноза, мы разработали алгоритм иммуногистохимической и молекулярной диагностики злокачественных опухолей центральной нервной системы. Особенно трудна диагностика опухолей у маленьких детей, когда низкодифференцированной под идентичной злокачественной гистологической опухоли может картиной скрываться множество нозологических единиц с абсолютно разными подходами к лечению. С помощью метода Illumina HumanMethylation450 BeadChip, сравнительной геномной гибридизации и флуоресцентной гибридизации in situ нами были выявлены и анализировались следующие цитогенетические аберрации: амплификации генов EGFR, PDGFRA, MYC/MYCN, CDK/CCND, а также гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q. Амплификация гена EGFR была выявлена в 11% глиобластом у детей и гораздо чаще встречалась во взрослой популяции (29%), в то время как амплификация гена PDGFRA показывала обратную зависимость и превалировала в опухолях детского возраста - 15% против 5% амплификаций у взрослых. Амплификации генов MYC/MYCN и CDK/CCND встречались в двух возрастных группах приблизительно с равной частотой: амплификации генов MYC/MYCN в 11% детских глиобластом и 9% взрослых опухолей, амплификации генов CDK/CCND в 19% и 18% соответственно. Гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q значительно преобладали во взрослой популяции глиобластом и составляли 29% и 61% против 15% и 35% в детских опухолях соответственно. Мутационный анализ методами полного экзомного и прямого секвенирования выявил наличие мутации генов H3F3A, IDH1 и BRAF. Все выявленные мутации были взаимоисключающими - то есть в генотипе опухоли встречалась только одна единственная мутация. Мутация гена H3F3A была обнаружена в 68 (50%) детских глиобластомах и в 1 (1%) взрослой глиобластоме. Мутация гена H3F3A выявлена в двух вариантах: K27M (53 опухоли детских 204 опухоли – 39% и в одном случае взрослой глиобластомы - 1%) и G34R/V (15 случаев детских глиобластом – 11%). Варианты мутации были строго связаны с определенной локализацией опухоли – мутация K27M возникала только в глубинных срединно расположенных опухолях (таламус, ствол головного мозга и спинной мозга), в то время как мутация G34R/V была выявлена только в полушарных опухолях, что и обуславливало больший процент тотально удаленных опухолей среди G34R/V мутированных глиобластом. Мутация К27М была обнаружена в 53 срединных опухолях (83%) из 64 включенных в исследование опухолях таламуса, ствола и спинного мозга. Только 11 опухолей подкорковых ганглиев не имели мутации К27М. В 68 (50%) случаях детских глиобластом мутации гена H3F3A не выявлено. В пяти (4%) детских полушарных глиобластомах в возрасте от 8 до 18 лет и в 29 (38%) взрослых глиобластомах выявлена мутация гена IDH1. Мутация гена BRAF V600E выявлена только в двух случаях детских глиобластом у девочек 7 и 11 лет с полушарными опухолями, в одной из этих глиобластом также имелись множественные амплификации генов EGFR, PDGFRA и MYC. Мутации генов IDH1 и BRAF встречались только в глиобластомах с диким немутированным типом гена H3F3A. Выявление мутантных протеинов K27M, IDH1 и BRAF производилось методом иммуногистохимического исследования со следующими антителами: H3K27me Millipore, Anti-Human IDH1 R132H Dianova и Anti-B-Raf Antibody Merck Millipore. Данные прямого секвенирования по выявлению мутаций и иммуногистохимического исследования по выявлению мутантных протеинов для генов IDH1 и BRAF полностью совпали. Кластерный анализ выявил следующие метиляционные кластеры: IDH1, K27M, G34R/V и глиобластомы с отсутствием ключевых мутаций - wt GBM (wilde type glioblastomas). 205 1. Кластер IDH1 составили 34 полушарных глиобластомы (5 детских опухолей и 29 взрослых), с выявленной в половине случаев экспрессией проневральных генов и гиперметилированным генотипом. 2. Кластер K27M - 53 детских и 1 взрослая опухоль со срединно-глубинной локализацией с преимущественной экспрессией проневральных генов, а также единичными случаями с экспрессией классических и мезенхимальных генов и гипометилированным генотипом в детских случаях. 3. Кластер G34R/V – 15 детских опухолей с полушарной локализацией, экспрессией классических генов в подавляющем большинстве случаев, а также единичными опухолями с экспрессией мезенхимальных и проневральных генов и гипометилированным генотипом. 4. Кластер wt GBM – 68 детских и 47 взрослых опухолей. Данные опухоли экспрессировали проневральные, нейральные, классические и мезенхимальные гены. Детские глиобластомы имели гипометилированный генотип, взрослые опухоли характеризовались нормометилированным генотипом. Метиляционный анализ выявил преимущественно гипометилированный генотип в детских опухолях – в 131 случаях, в 5 случах – гиперметилированный генотип, в 100% случаях сочетающийся с мутацией гена IDH1. Во взрослых глиобластомах нормометилированный генотип был выявлен в 48 опухолях и гиперметилированный генотип в 29 глиобластомах, что четко коррелировало с отсутствием или наличием мутации гена IDH1. Ген MGMT был метилирован в 28 опухолях у детей, чей возраст был старше 8 лет. Метилирование гена MGMT в 100% случаев сочеталось с мутацией гена IDH1 и в 73% случаев - с мутацией G34R/V, 11 детских глиобластом (17%), в которых не было выявлено вышеописанных мутаций, имели метилированный ген MGMT, также в одном случае было выявлено сочетание мутации К27М и метилирования гена MGMT. У взрослых глиобластом метилированный ген MGMT 206 был выявлен 34 опухолях (44%), как и в детской серии метилирование гена MGMT в 100% сочеталось с мутацией гена IDH1, также метилированный ген MGMT был выявлен в 5 опухолях с отсутствием мутации гена IDH1. Статистический анализ выживаемости нейрохирургических больных с глиобластомами Для анализа общей выживаемости был использован метод Kaplan-Meier. Общая выживаемость была подсчитана от даты установления диагноза до смерти от прогрессии основного заболевания (пациенты, погибшие по другим причинам не включались в исследование) или до даты сбора последних катамнестических данных. Безрецидивная выживаемость была определена как промежуток времени от даты операции хирургического удаления опухоли до даты прогрессии заболевания или в случае отсутствия прогрессии заболевания до даты сбора последних катамнестических данных. Унивариантный анализ показал, что статистически значимым для общей выживаемости детских глиобластом является наличие амплификаций и тип выявленной мутации: наличие мутации гена H3F3A в варианте K27M или в варианте G34R/V, а также наличие мутации гена IDH1. 1-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант K27M – 47%, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - 74%, для детских глиобластом с мутацией гена IDH1 – 100% и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A или IDH1 – 63%. 2-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант K27M – 8%, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - 44%, для детских глиобластом с мутацией гена 207 IDH1 – 100% и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A или IDH1 – 31%. 3-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант K27M – 4%, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - недостаточно данных для определения, для детских глиобластом с мутацией гена IDH1 – 100% и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A или IDH1 – 19%. 5-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант K27M – 0, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - недостаточно данных для определения, для детских глиобластом с мутацией гена IDH1 – недостаточно данных для определения и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A или IDH1 – 13%. Для мультивариантного анализа была использована регрессивная модель Кокса. Мультивариантный анализ показал, что негативное влияние на прогноз при детских глиобластомах оказывают следующие факторы: наличие мутации гена H3F3A вариант K27M, наличие амплификации любого из перечисленных (EGFR, PDGFRA, MYC/MYCN, CDK/CCND) онкогенов, а также срединная и глубинная локализация опухоли (в таламусе, стволе головного мозга и спинном мозге), в то время метилированный ген MGMT позитивно влияет на прогноз заболевания. Клинико-молекулярная стратификация глиобластом Основываясь на результатах, полученных нами при цитогенетическом, мутационном и метиляционном анализе, а также оценке показателей общей выживаемости для глиобластом у детей и взрослых мы разработали молекулярную классификацию глиобластом, отдельно для каждой возрастной группы, разделив глиобластомы в в зависимости от наличия или отсутствия ключевых часто возникающих мутаций генов H3F3A и IDH1. 208 Первую группу детских глиобластом составили мутацией гена H3F3A, выявленной в 50% опухолей. опухоли с В этой группе были выделены две четко отличные друг от друга подгруппы в зависимости от варианта мутации гена H3F3A. Данные подгруппы различались по локализации опухолей (строго полушарных при варианте G34R/V и глубинно-срединных при варианте K27M), статусу метилирования гена MGMT и показателям общей выживаемости (более благоприятным при варианте G34R/V). Наличие мутации гена IDH1 было отличительной особенностью группы взрослых глиобластом, которые, помимо мутации гена IDH1, характеризовались гиперметилированным генотипом и строгой локализацией в больших полушариях. Характерными особенностями отсутствием мутаций генов встречаемости отсутствием H3F3A и IDH1 являлась высокая частота цитогенетических мутации гена детских и взрослых глиобластом с аберраций. H3F3A имели Детские больший глиобластомы по сравнению с с глиобластомами с мутацией гена H3F3A процент амплификаций генов EGFR и PDGFRA, чаще встречались у них гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q. В группе взрослых глиобластом с отсутствием мутации гена IDH1 наблюдалась похожая ситуация: амплификация гена EGFR была обнаружена в 42% случаев против 7%, выявленных в группе с мутацией гена IDH1. Гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q также были выявлены в большем проценте случаев в группе с отсутствием мутации гена IDH1. Сравнение количества цитогенетических аберраций в детских и взрослых глиобластомах без мутаций генов H3F3A и IDH1 показало, что в группе детских глиобластом преобладали амплификации генов MYC/MYCN, PDGFRA и CDK/CCND. В то время как взрослые глиобластомы чаще показывали амплификацию гена EGFR, гомозиготную делецию гена CDKN2A и потерю хромосомы 10q. Изучение цитогенетических аберраций и впервые описанной нами мутации гена Н3F3A, а также мутации гена IDH1 и статуса метилирования гена MGMT 209 обогатило нас новыми знаниями в области патогенеза детских глиобластом. Исследование мутации гена Н3F3A на большой группе детских глиобластом позволило сравнить варианты мутации гена Н3F3A (K27M и G34R/V) с локализацией опухоли и определить прогностическое значение каждого типа мутации. Информация о наличии или отсутствии мутации гена Н3F3A будет способствовать более дифференцированному подходу к лечению глиобластом у детей и возможной в будущем таргетной терапии препаратами, действие которых направлено на упорядочение ремоделирования хроматина и/или посттрансляционную модификацию гистонов. Выявление мутации гена Н3F3A вариант К27М позволит на данном этапе использовать высокодозную химиотерапию с аутологичной поддержкой стволовыми клетками для лечения наиболее генетически неблагоприятного варианта глиобластомы, не опасаясь выраженных осложнений данной терапии. На сегодняшний день становится очевидным, что детские глиобластомы с отсутствием мутации гена H3F3A и неметилированным геном MGMT не отвечают на терапию Темозоломидом, вероятно, такие опухоли должны быть включены в проспективные клинические исследования с использованием препаратов-ингибиторов RTK/mTOR, в то время как в лечении глиобластом с редко возникающей мутацией гена BRAF могут быть использованы препараты-ингибиторы BRAF, а опухоли с мутацией гена IDH1, а также с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V, часто сочетающиеся с метилированным геном MGMT должны быть лечены с применением Темозоломида или ингибитором AGI-5198, действующим на IDH1 R132H. 210 ВЫВОДЫ 1. Нейрохирургическая тактика лечения глиобластом у детей объяснена и скорректирована с позиции молекулярно-генетических особенностей опухолей различной локализации. Полушарные глиобластомы следует удалять по возможности максимально полно и безопасно для пациента вследствие возможного наличия в геноме опухоли мутации гена H3F3A вариант G34R/V либо более редких мутации гена IDH1 и метилирования гена наличие MGMT; в геноме срединно-глубинных глиобластом неблагоприятной в прогностическом плане мутации гена H3F3A вариант K27M свидетельствует о том, что глиобластомам подкорковых узлов и спинного мозга следует проводить частичное удаление опухоли; диффузно растущие глиобластомы ствола головного мозга не следует оперировать в том числе и по причине мутации гена H3F3A вариант K27M. 2. Молекулярно-генетическое исследование выявило, что не все детские опухоли, имеющие гистологические признаки глиобластом, являются истинными глиобластомами. В частности, у детей младше 2 лет опухоли, гистологические расцениваемые как глиобластомы, исследовании демонстрируют профиль глиом при молекулярном низкой степени злокачественности, а гистологически убедительные глиобластомы у детей с длительной выживаемостью (5 лет и более), имеют молекулярный профиль злокачественной плеоморфной ксантоастроцитомы. Нами разработан алгоритм дифференциальной диагностики злокачественных опухолей головного мозга у детей, основанный на иммуногистохимическом исследовании характерной для глиобластом мутации гена H3F3A и возникающей в злокачественных плеоморфных ксантоастроцитомах 211 мутации гена BRAF, а также на определении характерных для детских глиобластом амплификаций генов PDGRFA и EGFR. 3. Цитогенетические аберрации в геноме детских молекулярно подтвержденных глиобластом выявляются преимущественно в возрасте от 4 до 18 лет, наиболее часто в детских опухолях возникает амплификация гена PDGRFA. 4. В геноме глиобластом имеют место следующие эпигенетические события и мутации: отличительной особенностью детских глиобластом является ключевая повторяющаяся мутация гена H3F3A, кодирующего гистон Н3.3. Данная мутация встречается в 50% детских глиобластом и представлена двумя вариантами: K27M и G34R/V, показывающими четкие клинически, биологические и прогностические различия. Мутация гена IDH1 и метилирование гена MGMT наблюдаются в детских глиобластомах гораздо реже, чем во взрослых. Метиломный анализ выявил четыре кластера в детских глиобластомах: K27M, G34R/V, IDH1 и wt GBM и два кластера в глиобластомах взрослых: IDH1 и wt GBM. 5. В геноме и эпигеноме глиобластом у детей и взрослых имеются существенные различия. Несмотря на идентичную гистологическую картину, цитогенетические профили детских и взрослых глиобластом отличаются: у детей значительно преобладают амплификации гена PDGRFA, в то время как у взрослых глиобластом превалируют амплификация гена EGFR, гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q, что говорит о вовлечении различных молекулярных путей в развитие этих опухолей у детей и взрослых. Детские глиобластомы стратифицируются на три молекулярно и прогностически различные группы: глиобластомы с мутацией гена H3F3A вариант К27М, глиобластомы с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V и глиобластомы немутированным геном H3F3A. Взрослые глиобластомы следует стратифицировать на две группы в зависимости от наличия мутации гена IDH1 или отсутствия мутации гена IDH1. 212 6. Прогностически относительно благоприятными являются следующие характеристики: метилирование гена MGMT и мутации генов IDH1 и H3F3A вариант G34R/V. Неблагоприятное прогностическое значение имеют амплификации онкогенов EGFR, PDGRFA, MYC/MYCN и CDK/CCND, мутация гена H3F3A вариант K27M и локализация опухоли в таламусе, стволе головного мозга и спинном мозге. 7. Для таргетной терапии нейрохирургических больных с глиобластомами следующие гены могут являться мишенями: для полушарных глиобластом гены H3F3A (вариант мутации G34R/V), IDH1, MGMT и в случае отсутствия вышеописанных мутаций – гены сигнального пути RTK/mTOR; для срединно-глубинных глиобластом подкорковых узлов, ствола и спинного мозга геном-мишенью является ген H3F3A (вариант мутации К27М). 213 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Современный протокол комбинированного лечения нейрохирургических больных с глиобластомами, включающий хирургическое удаление опухоли с последующей лучевой и химиотерапией, может быть усовершенствован путем индивидуального дифференцированного подхода, учитывающего топографию и молекулярные особенности опухоли. Детские полушарные глиобластомы с мутацией генов H3F3A вариант G34R/V и IDH1 и метилированным геном MGMT могут быть оперированы с максимальной безопасной для больного радикальностью, облучены и успешно лечены Темозоломидом. Для редких глиобластом с мутацией гена BRAF разработана таргетная терапия ингибиторами BRAF. Лечение срединноглубинных глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант К27М может заключаться в частичном удалении опухоли, лучевой терапии и в будущем может осуществляться препаратами, действие которых направлено на упорядочение ремоделирования хроматина и/или посттрансляционную модификацию гистонов. Глиобластомы с отсутствием мутации гена H3F3A (преимущественно полушарной локализации) на данном этапе должны быть лечены по существующим протоколам, а в дальнейшем могут быть включены в проспективные клинические исследования с использованием препаратов-ингибиторов RTK/mTOR. 2. В патолого-анатомическом отделении детские злокачественные опухоли должны быть исследованы наиболее простыми для применения в рутинной практике и экономически выгодными методами иммуногистохимического исследования и флуоресцентной гибридизацией in situ для проведения дифференциального диагноза между доброкачественной и злокачественной глиомой, эмбриональными опухолями, саркомами и лимфопролиферативными заболеваниями согласно предложенному нами алгоритму. Следование данному алгоритму поможет выявить 214 злокачественную плеоморфную ксантоастроцитому с помощью антитела Anti-B-Raf, мутации генов H3F3A вариант К27М (антитело Antitrimethyl-Histone H3 (Lys27) Antibody H3K27me) и IDH1 (антитело AntiHuman IDH1 R132H), а также – амплификации генов PDGFRA, EGFR и MYC/MYCN. 3. Согласно полученным нами данным, в полушарных глиобластомах у детей особенно важным для последующего лечения таргетным препаратом Темозоломид и прогноза заболевания является исследование статуса метилирования гена MGMT. Исследование статуса метилирования гена MGMT (например, методом пиросеквенирования) может рекомендовано для полушарных глиобластом у детей от 11 до 18 лет. быть 215 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абсалямова О.В., Аникеева О.Ю., Голанов А.В. Ассоциация нейрохирургов России. Стандарты, опции и рекомендации в лечении первичных опухолей ЦНС (2012-2013) // ООО «МСД Фармасьютикалс». - 2013 год. – 55 стр. 2. Голанов А.В. Глиобластомы больших полушарий головного мозга: результаты комбинированного лечения и факторы, влияющие на прогноз. Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук. – г. Москва. - 1999 год. – 258 стр. 3. Желудкова О.Г. Лечение опухолей головного мозга у детей // Врач. – 2011. № 12. – С. 22-27. 4. Желудкова О.Г., Горбатых C.B., Холодов Б.В. и соавт. Новый алкилирующий препарат в лечении злокачественных глиом у детей // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2003. – Том 2. - №4. - С. 97-103. 5. Желудкова О.Г., Тарасова И.С., Горбатых C.B. и соавт. Лечение анапластических астроцитом и глиобластом у детей с использованием темозоломида // Современная онкология. – 2003. – Том 4. - №2. - С. 60-62. 6. Кадыров Ш.У., Коновалов А.Н., Хухлаева Е.А. и соавт. Диффузные биталамические астроцитомы у детей и взрослых // Вопросы нейрохирургии имени Н.Н. Бурденко. – 2012. - Том 76. - №6. - C. 14-19. 7. Кобяков Г.Л. Химиотерапия в комплексном лечении больных с первичными злокачественными опухолями головного мозга. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. – 2011 год. – 49 стр. г. Москва. - 216 8. Кольман Я., Рѐм К.-Г. Наглядная биохимия: Пер. с нем. – М.: Мир, 2000. – 469 с., ил. ISBN 5-03-003304-1. 9. Кушель Ю.В. Интрамедуллярные опухоли спинного мозга (эпидемиология, диагностика, принципы лечения // Нейрохирургия . – 2008. - №3. – С. 9-17. 10.Мушинская М.В. Оптимизация лечения анапластической астроцитомы и мультиформной глиобластомы у детей. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. ФГУ "Федеральный научноклинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии". Москва. - 2010. 11.Рыжова М.В., Желудкова О.Г., Озеров С.С. и соавт. Оригинальная статья. К вопросу о классификации эмбриональных опухолей центральной нервной системы - эмбриональная опухоль с обилием нейропиля и истинными розетками: описание случая и обзор литературы / Вопросы нейрохирургии имени Н.Н. Бурденко. – 2011. - Том 75. - №4. - C. 25-33. 12.Рыжова М.В., Желудкова О.Г., Шишкина Л.В. и соавт. Созревание нейробластомы в ганглиозно-клеточную опухоль после проведенного лечения / Опухоли Головы и Шеи. - 2012. - № 3. – С. 69-72. 13.Рыжова М.В., Кушель Ю.В., Желудкова О.Г. и соавт. Медуллоэпителиома, эпендимобластома и эмбриональная опухоль с истинными розетками – единая нозологическая единица? / Вопросы нейрохирургии имени Н.Н. Бурденко. – 2013. - Том 77. - №6. - C. 51-55. 14.Рыжова М.В., Шишкина Л.В. Использование молекулярных методов в диагностике низкодифференцированных злокачественных опухолей головного мозга у детей // Вопросы нейрохирургии имени Н.Н. Бурденко. – 2015. - Том 79. - №2. - C. 4-10. 15.Рыжова М.В., Шишкина Л.В., Желудкова О.Г. и соавт. Сравнительная характеристика генетических аберраций в глиобластомах у детей и 217 взрослых // Вопросы нейрохирургии имени Н.Н. Бурденко. – 2014. - Том 78. - №2. - C. 3-11. 16.Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. Биология: В 3-х т. Т.3: Пер. с англ./Под ред. Р. Сопера – 3 изд., - М.: Мир, 2002. – 451 с., ил. ISBN 5-03-003443-9 17.Хухлаева Е.А., Коновалов А.Н., Пронин И.Н. и соавт. Нейрорадиология и принципы классификации опухолей ствола головного мозга // Медицинская визуализация. - 2011. - № 6. - С. 62-74. 18.Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме // Успехи биологической химии. – 2007. - Том. 47. - С. 3–52. 19.Abounader R. Interactions between PTEN and receptor tyrosine kinase pathways and their implications for glioma therapy. Expert Rev Anticancer Ther. (2009) 9(2): 235–245. DOI: 10.1586/14737140.9.2.235. 20.Aihara K., Mukasa A., Gotoh K., et al. H3F3A K27M mutations in thalamic gliomas from young adult patients. Neuro-Oncology. (2014) 16(1):140 – 146. DOI: 10.1093/neuonc/not144 21.Alaminos M., Davalos V., Ropero S., et al. EMP3, a myelin-related gene located in the critical 19q13.3 region, is epigenetically silenced and exhibits features of a candidate tumor suppressor in glioma and neuroblastoma. Cancer Research. (2005) 65:2565-2571. 22.Albertson D.G. and Pinkel D. Genomic microarrays in human genetic disease and cancer. Human Molecular Genetics. (2003) 12(2):145-152. 23.Anderson R.C., Kennedy B., Yanes C.L., et al. Convection-enhanced delivery of topotecan into diffuse intrinsic brainstem tumors in children. J Neurosurg Pediatr. (2013) 11(3):289-95. DOI: 10.3171/2012.10.PEDS12142 24.Angelini P., Hawkins C., Laperriere N., et al. Post mortem examinations in diffuse intrinsic pontine glioma: challenges and chances. J Neurooncol. (2011) 101:75–81. DOI: 10.1007/s11060-010-0224-7 218 25.Antonelli M., Buttarelli F.R., Arcella A., et al. Prognostic significance of histological grading, p53 status, YKL-40 expression, and IDH1 mutations in pediatric high-grade gliomas. J Neurooncol. (2010) 99:209–215. DOI: 10.1007/s11060-010-0129-5 26.Aoki Y., Hashizume R., Ozawa T., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. (2012) 108:29–35. DOI: 10.1007/s11060-011-0796-x 27.Arita K., Sugiyama K., Sano T., Oka H. Atypical teratoid/rhabdoid tumour in sella turcica in an adult. Acta Neurochir (Wien). (2008) 150:491–496. DOI: 10.1007/s00701-008-1500-y 28.Bady P., Sciuscio D., Diserens A.-C., et al. MGMT methylation analysis of glioblastoma on the Infinium methylation BeadChip identifies two distinct CpG regions associated with gene silencing and outcome, yielding a prediction model for comparisons across datasets, tumor grades, and CIMP-status. Acta Neuropathol. (2012) 124:547–560. DOI: 10.1007/s00401-012-1016-2 29.Balss J., Meyer J., Mueller W., et al. Analysis of the IDH1 codon 132 mutation in brain tumors. Acta Neuropathol. (2008) 116(6):597-602. DOI: 10.1007/s00401-008-0455-2 30.Barrow J., Adamowicz-Brice M., Cartmill M., et al. Homozygous loss of ADAM3A revealed by genome-wide analysis of pediatric high-grade glioma and diffuse intrinsic pontine gliomas. Neuro-Oncology. (2011) 13(2):212–222. DOI: 10.1093/neuonc/noq158 31.Barrett M.T., Scheffer A., Ben-Dor A., et al. Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. PNAS. (2004) 101(51):17765-17770. 32.Bartels U., Hawkins C., Vezina G., et al. Proceedings of the diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) Toronto Think Tank: advancing basic and translational 219 research and cooperation in DIPG. J Neurooncol. (2011) 105:119–125. DOI: 10.1007/s11060-011-0704-4 33.Barua N.U., Lowis S.P., Woolley M., et al. Robot-guided convection-enhanced delivery of carboplatin for advanced brainstem glioma. Acta Neurochir. (2013) 155:1459–1465. DOI: 10.1007/s00701-013-1700-6 34.Bax D.A., Mackay A., Little S.E., et al. A distinct spectrum of copy number aberrations in pediatric high-grade gliomas. Clinical Cancer Research. (2010) 16:3368-3377. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-10-0438 35.Behdad A., Perry A. Central nervous system primitive neuroectodermal tumors: a clinicopathologic and genetic study of 33 cases. Brain Pathology. (2010) 20:441– 450. DOI: 10.1111/j.1750-3639.2009.00314.x 36.Benesch M., Wagner S., Berthold F. and Wolff J.E.A. Primary dissemination of high-grade gliomas in children: experiences from four studies of the Pediatric Oncology and Hematology Society of the German Language Group (GPOH). Journal of Neuro-Oncology. (2005) 72:179–183. DOI: 10.1007/s11060-004-3546-5 37.Bender S., Tang Y., Lindroth A.M., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. (2013) 24: 1–13. http://dx.doi.org/10.1016/j.ccr.2013.10.006 38.Bernstein K. de A., Sethi R., Trofimov A., et al. Early clinical outcomes using proton radiation for children with central nervous system atypical teratoid rhabdoid tumors. Int J Radiation Oncol Biol Phys. (2013) 86(1):114-120. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijrobp.2012.12.004 39.Bishop R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. (2010) 3(1):8595. DOI: 10.1093/biohorizons/hzq009 220 40.Bjerke L., Mackay A., Nandhabalan M., et al. Histone H3.3 mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discovery. (2013) 3:512-519. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-12-0426 41.Blanc J.L., Wager M., Guilhot J., et al. Correlation of clinical features and methylation status of MGMT gene promoter in glioblastomas. J Neurooncol. (2004) 68(3):275-83. 42.Blaney S.M., Kocak M., Gajjar A., et al. Pilot study of systemic and intrathecal mafosfamide followed by conformal radiation for infants with intracranial central nervous system tumors: a pediatric brain tumor consortium study (PBTC-001). J Neurooncol. (2012) 109(3):565-571. DOI: 10.1007/s11060-012-0929-x 43.Boukas A., Panaretos P., Cowie C., et al. Congenital glioblastoma multiforme: complete resection with long-term survival and a novel technique of contralateral cystoventriculostomy. Pediatr Neurosurg. (2012) 48:327–330. DOI: 10.1159/000351411 44.Bozdag S., Li A., Riddick G., et al. Age-specific signatures of glioblastoma at the genomic, genetic, and epigenetic levels. Plos One. (2013) 8(4): e62982. DOI: 10.1371/journal.pone.0062982 45.Brat D.J., Shehata B.M., Castellano-Sanchez A.A., et al. Congenital glioblastoma: a clinicopathologic and genetic analysis. Brain Pathol. (2007) 17(3):276 – 281. DOI: 10.1111/j.1750-3639.2007.00071.x 46.Brennan C.W., Verhaak R.G.W., McKenna A., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. (2013) 155:462–477. http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.09.034 47.Broniscer A., Baker S.D., Wetmore C., et al. Phase I trial, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of vandetanib and dasatinib in children with newly diagnosed intrinsic pontine glioma diffuse. Clinical Cancer Research. (2013) 19:3050-3058. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-13-0306 221 48.Broniscer A., Gajjar A. Supratentorial high-grade astrocytoma and diffuse brainstem glioma: two challenges for the pediatric oncologist. Oncologist. (2004) 9(2):197-206. 49.Broniscer A., Tatevossian R.G., Sabin N.D. et al. Clinical, radiological, histological and molecular characteristics of paediatric epithelioid glioblastoma. Neuropathology and Applied Neurobiology. (2014) 40:327–336. DOI: 10.1111/nan.12093 50.Burger P.C., Scheithauer B.W., Kleinschmidt-DeMasters B.K., Ersen A., Rodrigues F.J., Tihan T., Rushing E.J. Diagnostic Pathology. Neuropathology / [edited by] P.C. Burger. First Edition. Amirsys, Salt Lake City, Utah, 2012. 51.Burger P.C. and Scheithauer B.W. Tumors of the Central Nervous System (AFIP atlas of tumor pathology, Series 4. Fascicle 7) American Registry of Pathology, Washington DC, 2007. 596 + xiv Pages. 52.Buscariollo D.L., Park H.S., Roberts K.B., and Yu J.B. Survival outcomes in atypical teratoid rhabdoid tumor for patients undergoing radiotherapy in a surveillance, epidemiology, and end results analysis. Cancer. (2012) 118(17):4212-9. DOI: 10.1002/cncr.27373 53.Bуeon S-J., Myung J.K., Kim S.H., et al. Distinct genetic alterations in pediatric glioblastomas. Childs Nerv Syst. (2012) 28:1025–1032. DOI: 10.1007/s00381-012-1773-1 54.Cadieux B., Ching T-T., VandenBerg S.R., and Costello J.F. Genome-wide hypomethylation in human glioblastomas associatedwith specific copy number alteration, methylenetetrahydrofolate reductase allele status, and increased proliferation. Cancer Research. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-06-1547 (2006) 66:8469-8476. 222 55.Cage T.A., Samagh S.P., Mueller S., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Childs Nerv Syst. (2013) 29:1313–1319. DOI: 10.1007/s00381-013-2101-0 56.Callinan P.A. and Feinberg A.P. The emerging science of epigenomics. Human Molecular Genetics. (2006) 15 (1):R95 –R101. DOI: 10.1093/hmg/ddl095 57.Campen C.J., Dearlove J., Partap S., et al. Concurrent cyclophosphamide and craniospinal radiotherapy for pediatric high-risk embryonal brain tumors. J Neurooncol. (2012) 110:287–291. DOI: 10.1007/s11060-012-0969-2 58.Capper D., Weißert S., Balss J., et al. Characterization of R132H mutationspecific IDH1 antibody binding in brain tumors. Brain Pathology. (2010) 20:245– 254. DOI: 10.1111/j.1750-3639.2009.00352.x 59.Carén H., Pollard S.M., Beck S. The good, the bad and the ugly: epigenetic mechanisms in glioblastoma. Molecular Aspects of Medicine. (2013) 34:849–862. http://dx.doi.org/10.1016/j.mam.2012.06.007 60.Caretti V., Hiddingh L., Lagerweij T., et al. WEE1 kinase inhibition enhances the radiation response of diffuse intrinsic pontine gliomas. Molecular Cancer Therapeutics. (2013) 12:141-150. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-12-0735 61.Caretti V., Jansen M.H., Vuurden D.G. van, et al. Implementation of a multiinstitutional diffuse intrinsic pontine glioma autopsy protocol and characterization of a primary cell culture. Neuropathol Appl Neurobiol. (2013) 39(4):426-36. DOI: 10.1111/j.1365-2990.2012.01294.x. 62.Caretti V., Zondervan I., Meijer D.I., et al. Monitoring of tumor growth and postirradiation recurrence in a diffuse intrinsic pontine glioma mouse model. Brain Pathology. (2011) 21:441–451. DOI: 10.1111/j.1750-3639.2010.00468.x 63.Chadarevian J.P. de, Montes J.L., O’Gorman A.M., Freeman C.R. Maturation of cerebellar neuroblastoma into ganglioneuroma with melanosis. A histologic, immunocytochemical, and ultrastructural study. Cancer. (1987) 59(1):69–76. 223 64.Chakravarti A., Wang M., Robins H.I., et al. RTOG 0211: a phase 1/2 study of radiation therapy with concurrent gefitinib for newly diagnosed glioblastoma patients. Int J Radiation Oncol Biol Phys. (2013) 85(5):1206-1211. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijrobp.2012.10.008 65.Chan K-M., Fang D., Gan H., et al. The histone H3.3K27M mutation in pediatric glioma reprograms H3K27 methylation and gene expression. Genes & Development. (2013) 27:985–990. http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.217778.113 66.Chan K.M., Han J., Fang D., et al. A lesson learned from the H3.3K27M mutation found in pediatric glioma. A new approach to the study of the function of histone modifications in vivo? Cell Cycle. (2013) 12(16):1–7. http://dx.doi.org/10.4161/cc.25625 67.Chassot A., Canale S., Varlet P., et al. Radiotherapy with concurrent and adjuvant temozolomide in children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma. J Neurooncol. (2012) 106:399–407. DOI: 10.1007/s11060-011-0681-7 68.Chelliah D., Sarfo-Poku C.M., Stea B.D. et al. Medulloblastoma with extensive nodularity undergoing post-therapeutic maturation to a gangliocytoma: a case report and literature review. Pediatric Neurosurgery. (2010) 46:381–384. 69.Cheung F. Global assembly of expressed sequence tags. Chapter 15. p. 193-199. RNA abundance analysis: methods and protocols, methods in molecular biology. Jin H. and Walter W.(eds.). vol. 883. 2012, XIII, 231 p. 22 illus. ISBN 978-161779-838-2. Springer Science+Business Media, LLC 2012. DOI: 10.1007/978-1-61779-839-9_15 70.Chi S.N., Zimmerman M.A., Yao X., et al. Intensive multimodality treatment for children with newly diagnosed CNS atypical teratoid rhabdoid tumor. J Clin Oncol. (2008) 27(3):385-389. DOI: 10.1200/JCO.2008.18.7724 224 71.Chinnaiyan P., Won M., Wen P.Y., et al. RTOG 0913: a phase 1 study of daily Everolimus (RAD001) in combination with radiation therapy and temozolomide in patients with newly diagnosed glioblastoma. Int J Radiation Oncol Biol Phys. (2013) 86(5):880-884. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijrobp.2013.04.036 72.Chintagumpala M., Hassall T., Palmer S., et al. A pilot study of risk-adapted radiotherapy and chemotherapy in patients with supratentorial PNET. NeuroOncology. (2009) 11:33–40. http://neuro-oncology.dukejournals.org DOI: 10.1215/15228517-2008-079 73.Chu H.H., Choi S.H., Ryoo I., et al. Differentiation of true progression from pseudoprogression in glioblastoma treated with radiation therapy and concomitant temozolomide: comparison study of standard and high-b-value diffusion-weighted imaging. Radiology. (2013) 269(3):831-40. DOI: 10.1148/radiol.13122024 74.Clarke J., Penas C., Pastori C., et al. Epigenetic pathways and glioblastoma treatment. Epigenetics. (2013) 8(8):785–795. http://dx.doi.org/10.4161/epi.25440 75.Cohen K.J., Heideman R.L., Zhou T., et al. Temozolomide in the treatment of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine gliomas: a report from the Children’s Oncology Group. Neuro-Oncology. (2011) 13(4):410 – 416. DOI: 10.1093/neuonc/noq205 76.Colosimo C., Lella G.M. di, Tartaglione T., Riccardi R. Neuroimaging of thalamic tumors in children. Child’s Nerv Syst. (2002) 18:426–439. DOI: 10.1007/s00381-002-0607-y 77.Constantini S., Miller D.C., Allen J.C., et al. Radical excision of intramedullary spinal cord tumors: surgical morbidity and long-term follow-up evaluation in 164 children and young adults. J Neurosurg. (2000) 93(2 Suppl):183-193. 225 78.Dahiya S., Emnett R.J., Haydon D.H., et al. BRAF-V600E mutation in pediatric and adult glioblastoma. Neuro-Oncology. (2014) 16(2):318 – 319. DOI: 10.1093/neuonc/not146 79.Dahlback H-S.S., Brandal P., Gorunova L., et al. Genomic aberrations in pediatric gliomas and embryonal tumors. Genes, Chromosomes & Cancer. (2011) 5D(10):788-99. DOI: 10.1002/gcc.20898 80.Das K.K., Mehrotra A., Nair A.P., et al. Pediatric glioblastoma: clinicoradiological profile and factors affecting the outcome. Childs Nerv Syst. (2012) 28:2055–2062. DOI: 10.1007/s00381-012-1890-x 81.Das S. and Vikalo H. Onlinecall: fast online parameter estimation and base calling for Illumina’s next-generation sequencing. Bioinformatics. (2012) 28(13):1677-83. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts256 82.D’cunja J., Shalaby T., Rivera P., et al. Antisense treatment of IGF-IR induces apoptosis and enhances chemosensitivity in central nervous system atypical teratoid/rhabdoid tumours cells. European journal of cancer. (2007) 43:1581– 1589. DOI: 10.1016/j.ejca.2007.03.003 83.Deb P., Sharma M.C., Chander B., et al. Giant cell glioblastoma multiforme: report of a case with prolonged survival and transformation to gliosarcoma. Childs Nerv Syst. (2006) 22:314–319. DOI: 10.1007/s00381-005-1239-9 84.Deimling A. von, Korshunov A., Hartmann C. The next generation of glioma biomarkers: MGMT methylation, BRAF fusions and IDH1 mutations. Brain Pathology. (2011) 21:74–87. DOI: 10.1111/j.1750-3639.2010.00454.x 85.Dias-Santagata D., Lam Q., Vernovsky K., et al. BRAF V600E mutations are common in pleomorphic xanthoastrocytoma: diagnostic and therapeutic implications. PLoS DOI: 10.1371/journal.pone.0017948 One. (2011) 6(3):e17948. 226 86.Du P., Zhang X., Huang C.-C., et al. Comparison of Beta-value and M-value methods for quantifying methylation levels by microarray analysis. BMC Bioinformatics. (2010) 11:587. http://www.biomedcentral.com/1471-2105/11/587 87.Dubuc A.M., Mack S., Unterberger A., et al. The epigenetics of brain tumors. Dumitrescu R. G. and Verma M. (eds.), Cancer epigenetics: methods and protocols, methods in molecular biology, vol. 863, Springer Science+Business Media, LLC 2012. p. 139-153. DOI: 10.1007/978-1-61779-612-8_8 88.Duffner P.K., Horowitz M.E., Krischer J.P., et al. The treatment of malignant brain tumors in infants and very young children: an update of the Pediatric Oncology Group experience. Neuro-Oncology. (1999) 152-161. 89.Dufour C., Grill J., Lellouch-Tubiana A., et al. High-grade glioma in children under 5 years of age: a chemotherapy only approach with the BBSFOP protocol. European Journal of Cancer. (2006) 42:2939–2945. DOI: 10.1016/j.ejca.2006.06.021 90.Eberhart C.G., Brat D.J., Cohen K.J., and Burger P.C. Pediatric neuroblastic brain tumors containing abundant neuropil and true rosettes. Pediatric and Developmental Pathology. (2000) 3:346 –352. DOI: 10.1007/s100249910049 91.Ellison D., Love S. Neuropathology. A reference text of CNS pathology. Third edition. Elsevier Mosby. 2013. 879 p. 92.Fan Q-W. and Weiss W.A. Targeting the RTK-PI3K-mTOR axis in malignant glioma: overcoming resistance. Curr Top Microbiol Immunol. (2010) 347:279– 296. DOI: 10.1007/82_2010_67 93.Fernandez C., Paula A.M. de, Colin C., et al. Thalamic gliomas in children: an extensive clinical, neuroradiological and pathological study of 14 cases. Childs Nerv Syst. (2006) 22:1603–1610. DOI: 10.1007/s00381-006-0184-6 227 94.Fogh S.E., Andrews D.W., Glass J., et al. Hypofractionated stereotactic radiation therapy: an effective therapy for recurrent high-grade gliomas. J Clin Oncol. (2010) 28(18):3048-3053. DOI: 10.1200/JCO.2009.25.6941 95.Fontanilla H.P., Pinnix C.C., Ketonen L.M., et al. Palliative reirradiation for progressive diffuse intrinsic pontine glioma. Am J Clin Oncol. (2012) 35(1):5157. DOI: 10.1097/COC.0b013e318201a2b7 96.Fouladi M., Blaney S.M., Poussaint T.Y., et al. Phase II study of Oxaliplatin in children with recurrent or refractory medulloblastoma, supratentorial primitive neuroectodermal tumors, and atypical teratoid rhabdoid tumors. A Pediatric Brain Tumor Consortium Study. Cancer. (2006) 107:2291–7. DOI: 10.1002/cncr.22241 97.Fraga M.F. and Esteller M. DNA Methylation: A Profile of Methods and Applications. BioTechniques. (2002) 33:632-649. 98.Friedman H.S., Prados M.D., Wen P.Y., et al. Bevacizumab alone and in combination with Irinotecan in recurrent glioblastoma. J Clin Oncol. (2009) 27(28):4733-4740. DOI: 10.1200/JCO.2008.19.87212-5 99.Friedman G.K., Spiller S.E., Harrison D.K., et al. Treatment of children with glioblastoma with conformal radiation, temozolomide, and bevacizumab as adjuncts to surgical resection. J Pediatr Hematol Oncol. (2013) 35(3):e123-6. DOI: 10.1097/MPH.0b013e318282cd7f. 100. Fukushima T., Katayama Y., Watanabe T., et al. Promoter hypermethylation of mismatch repair gene hMLH1 predicts the clinical response of malignant astrocytomas to nitrosourea. Clinical Cancer Research. (2005) 11:15389-1544. 101. Fuller C.E., Perry A. Fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnostic and investigative neuropathology. Brain Pathol. (2002) 12(1):67-86. 228 102. Fuller C.W., Middendorf L.R., Benner S.A. et al. The challenges of sequencing by synthesis. Nature Biotechnology. (2009) 27 (11): 1013-1023. DOI: 10.1038/nbt.1585 103. Galanis E., Anderson S.K., Lafky J.M., et al. Phase II Study of Bevacizumab in combination with Sorafenib in recurrent glioblastoma (N0776): A North Central Cancer Treatment Group Trial. Clin Cancer Res. (2013) 19(17):1–8. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-13-0708 104. Garrett-Bakelman F.E., Melnick A.M. Differentiation therapy for IDH1/2 mutant malignancies. Cell Research. (2013) 8:975-7. DOI: 10.1038/cr.2013.73 105. Garzón M., García-Fructuoso G., Guillén A., et al. Brain stem tumors in children and adolescents: single institutional experience. Childs Nerv Syst. (2013) 29:1321–1331. DOI: 10.1007/s00381-013-2137-1 106. Gessi M., Gielen G.H., Hammes J., et al. H3.3 G34R mutations in pediatric primitive neuroectodermal tumors of central nervous system (CNS-PNET) and pediatric glioblastomas: possible diagnostic and therapeutic implications? J Neurooncol. (2013) 112:67–72. DOI: 10.1007/s11060-012-1040-z 107. Gessi M., Pfister S., Hans V.H., et al. Absence of chromosome 19q13.41 amplification in a case of atypical teratoid/rhabdoid tumor with ependymoblastic differentiation. Acta Neuropathol. (2011) 121:283–285. DOI: 10.1007/s00401-010-0778-7 108. Gielen G.H., Gessi M., Hammes J., et al. H3F3A K27M mutation in pediatric CNS tumors: a marker for diffuse high-grade astrocytomas. Am J Clin Pathol. (2013) 139:345-349. DOI: 10.1309/AJCPABOHBC33FVMO 109. Gil-Gil M.J., Mesia C., Rey M. and Bruna J. Bevacizumab for the treatment of Glioblastoma. Clinical Medicine Insights: Oncology. (2013) 7:123– 135. DOI: 10.4137/CMO.S8503 229 110. Ginno P.A., Lott P.L., Christensen H.C., et al. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Molecular Cell. (2012) 45:814–825. DOI: 10.1016/j.molcel.2012.01.017 111. Gomes A.Q., Nolasco S., and Soares H. Non-coding RNAs: multi-tasking molecules in the cell. International Journal of Molecular Sciences. (2013) 14:16010-16039. DOI: 10.3390/ijms140816010 112. Gonzalez-Gomez P., Bello M.J., Arjona D., et al. Promoter hypermethylation of multiple genes in astrocytic gliomas. International Journal of Oncology. (2003) 22:601-608. 113. Grandi P., Peruzzi P., Reinhart B., et al. Design and application of oncolytic HSV vectors for glioblastoma therapy. Expert Rev Neurother. (2009) 9(4): 505–517. DOI: 10.1586/ern.09.9 114. Green M.R. and Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). 2,028 pages, illustrated, appendices, index. Three-volume set ISBN: 978-1-936113-42-2. 2012. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 115. Grimm S.A. and Chamberlain M.C. Brainstem glioma: a review. Curr Neurol Neurosci Rep. (2013) 13:346. DOI: 10.1007/s11910-013-0346-3 116. Guinipero T., Finn O.J. Cancer vaccines: emphasis on pediatric cancers. Curr Pharm Des. (2010) 16(3):292-9. 117. Gupta N., Banerjee A., Haas-Kogan D. (Eds.). Pediatric CNS tumors. Second edition. Springer Heidelberg, 2010. 118. Guss Z.D., Moningi S., Jallo G.I., et al. Management of pediatric spinal cord astrocytomas: outcomes with adjuvant radiation. Int J Radiation Oncol Biol Phys. (2013) 85(5):1307-1311. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijrobp.2012.11.022 230 119. Hales R.K., Shokek O., Burger P.C. Prognostic factors in pediatric high-grade astrocytoma: the importance of accurate pathologic diagnosis. J Neurooncol. (2010) 99:65–71. DOI: 10.1007/s11060-009-0102-3 120. Han L., Qiu Y., Xie C., et al. Atypical teratoid/rhabdoid tumors in adult patients: CT and MR imaging features. AJNR Am J Neuroradiol. (2011) 32:103– 08. DOI: 10.3174/ajnr.A2361 121. Hankinson T.C., Campagna E.J., Foreman N.K., and Handler M.H. Interpretation of magnetic resonance images in diffuse intrinsic pontine glioma: a survey of pediatric neurosurgeons. J Neurosurg Pediatrics. (2011) 8:97–102. DOI: 10.3171/2011.4.PEDS1180 122. Hansen D.V., Lui J.H., Parker P.R.L., & Kriegstein A.R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. (2010) 464:554-561. DOI: 10.1038/nature08845 123. Hargrave D. Pontine glioma. To biopsy or not to biopsy: that is the question. Br J Neurosurg. (2008) 22(5):624. DOI: 10.1080/02688690802484405 124. Hargrave D., Bartels U., Bouffet E. Diffuse brainstem glioma in children: critical review of clinical trials. Lancet Oncol. (2006)7:241–248. 125. Hargrave D., Chuang N., Bouffet E. Conventional MRI cannot predict survival in childhood diffuse intrinsic pontine glioma. J Neurooncol. (2008) 86:313–319. DOI: 10.1007/s11060-007-9473-5 126. Hart M.G., Garside R., Rogers G., et al. Temozolomide for high grade glioma. Cochrane Database of Systematic Reviews. (2013) 4:CD007415. DOI: 10.1002/14651858.CD007415.pub2. 127. Hartfuss E., Galli R., Heins N., and Gotz M. Characterization of CNS precursor subtypes and radial glia. Developmental Biology. (2011) 229:15–30. DOI: 10.1006/dbio.2000.9962 231 128. Hartmann C., Hentschel B., Wick W., et al. Patients with IDH1 wild type anaplastic astrocytomas exhibit worse prognosis than IDH1-mutated glioblastomas, and IDH1 mutation status accounts for the unfavorable prognostic effect of higher age: implications for classification of gliomas. Acta Neuropathol. (2010) 120:707–718. DOI: 10.1007/s00401-010-0781-z 129. Hayward R.M., Patronas N., Baker E.H., et al. Inter-observer variability in the measurement of diffuse intrinsic pontine gliomas. J Neurooncol. (2008) 90:57–61. DOI: 10.1007/s11060-008-9631-4 130. Hesson L., Bieche I., Krex D., et al. Frequent epigenetic inactivation of RASSF1A and BLU genes located within the critical 3p21.3 region in gliomas. Oncogene. (2004) 23:2408–2419. 131. Hipp S.J., Steffen-Smith E., Hammoud D., et al. Predicting outcome of children with diffuse intrinsic pontine gliomas using multiparametric imaging. Neuro-Oncology. 13(8):904 – 909, 2011. DOI: 10.1093/neuonc/nor076 132. Hocwald O., McFadden D., Osiovich H., Dunham C. Congenital gliosarcoma: detailed clinicopathologic documentation of a rare neoplasm. Pediatr Dev Pathol. (2009) 12(5):398-403. DOI: 10.2350/09-01-0592-CR.1. 133. Horiguchi K., Tomizawa Y., Tosaka M., et al. Epigenetic inactivation of RASSF1A candidate tumor suppressor gene at 3p21.3 in brain tumors. Oncogene. (2003) 22:7862–7865. 134. Hovestadt V., Jones D.T.W., Picelli S., et al. Decoding the regulatory landscape of medulloblastoma using DNA methylation sequencing. Nature. (2014). 510(7506):537-541. DOI: 10.1038/nature13268 135. Huang M. and Weiss W.A. G34, another connection between MYCN and a pediatric tumor. Cancer Discovery. (2013) 3(5):484-486. 232 136. Inazawa J., Inoue J. and Imoto I. Comparative genomic hybridization (CGH)-arrays pave the way for identification of novel cancerrelated genes. Cancer Sci. (2004) 95(7):559-563. 137. Irizarry R.A., Ladd-Acosta C., Wen B., et al. The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissuespecific CpG island shores. Nature Genetics. (2009) 41(2):178-186. DOI: 10.1038/ng.298 138. Jackson S., Patay Z., Howarth R., et al. Clinico-radiologic characteristics of long-term survivors of diffuse intrinsic pontine glioma. J Neurooncol. (2013) 114:339–344. DOI: 10.1007/s11060-013-1189-0 139. Jager B., Schuhmann M.U., Schober R., et al. Induction of gliosarcoma and atypical meningeoma 13 years after radiotherapy of residual pilocytic astrocytoma in childhood. Pediatric Neurosurgery. (2008) 44:153–158. DOI: 10.1159/000113120 140. Jain D., Sharma M.C., Sarkar C., et al. Correlation of diagnostic yield of stereotactic brain biopsy with number of biopsy bits and site of the lesion. Brain Tumor Pathol. (2006) 23:71–75. DOI: 10.1007/s10014-006-0204-y 141. Jakacki R.I., Yates A., Blaney S.M., et al. A phase I trial of temozolomide and lomustine in newly diagnosed high-grade gliomas of childhood. NeuroOncology. (2008) 10:569–576. DOI: 10.1215/15228517-2008-019 142. Jalali R., Raut N., Arora B., et al. Prospective evaluation of radiotherapy with concurrent and adjuvant temozolomide in children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. (2010) 77(1):113–118. DOI: 10.1016/j.ijrobp.2009.04.031 143. Jansen M.H.A., Vuurden D.G. van, Vandertop W.P., Kaspers G.J.L. Diffuse intrinsic pontine gliomas: a systematic update on clinical trials and 233 biology. Cancer Treatment Reviews. (2012) 38:27–35. DOI: 10.1016/j.ctrv.2011.06.007 144. Janssens G.O., Jansen M.H., Lauwers S.J., et al. Hypofractionation vs conventional radiation therapy for newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma: a matched-cohort analysis. Int J Radiation Oncol Biol Phys. (2013) 85(2):315-320. DOI: 10.1016/j.ijrobp.2012.04.006 145. Je E.M., Yoo N.J., Lee S.H. Mutational analysis of H3F3A, a chromatin remodeling gene in common solid tumors. APMIS. (2014) 122(1):81-2. DOI: 10.1111/apm.12124 146. Jeibmann A., Hasselblatt M., Pfister S. et al. From glioblastoma to gangliocytoma: an unforeseen but welcome shift in biological behavior. J Neurosurg Pediatrics. (2009) 4:475–478. 147. Jiao Y., Killela P.J., Reitman Z.J., et al. Frequent ATRX, CIC, FUBP1 and IDH1 mutations refine the classification of malignant gliomas. Oncotarget. (2012) 3(7):709-22. 148. Jimenez R.B., Sethi R., Depauw N., et al. Proton radiation therapy for pediatric medulloblastoma and supratentorial primitive neuroectodermal tumors: outcomes for very young children treated with upfront chemotherapy. Int J Radiation Oncol Biol Phys. (2013) 87(1):120-6. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijrobp.2013.05.017 149. Johansson S., Irgens H., Chudasama K.K., et al. Exome sequencing and genetic testing for MODY. PLoS One. (2012) 7(5):e38050. DOI: 10.1371/journal.pone.0038050 150. Jones C., Perryman L. and Hargrave D. Paediatric and adult malignant glioma: close relatives or distant cousins? Nat. Rev. Clin. Oncol. (2012) 9:400– 413. DOI: 10.1038/nrclinonc.2012.87 234 151. Judkins A.R. Immunohistochemistry of INI1 expression: a new tool for old challenges in CNS and soft tissue pathology. Adv Anat Pathol. (2007) 14(5):335-9. 152. Jung T-Y., Kim C-Y., Kim D-S., et al. Prognosis of pediatric high-grade gliomas with temozolomide treatment: a retrospective, multicenter study. Childs Nerv Syst. (2012) 28:1033–1039. DOI: 10.1007/s00381-012-1786-9 153. Kalina P. Pediatric cerebellar hemorrhagic glioblastoma multiforme. The Open Neuroimaging Journal. (2012) 6:13-15. 154. Karremann M., Rausche U., Fleischhack G., et al. Clinical and epidemiological characteristics of pediatric gliosarcomas. J Neurooncol. (2010) 97:257–265. DOI: 10.1007/s11060-009-0021-3 155. Karremann M., Rausche U., Roth D., et al. Cerebellar location may predict an unfavourable prognosis in paediatric high-grade glioma. British Journal of Cancer. (2013) 109(4):844-51. DOI: 10.1038/bjc.2013.404 156. recent Kebudi R., Cakir F.B. Management of diffuse pontine gliomas in children: developments. Paediatr Drugs. (2013). 15(5):351-362. DOI: 10.1007/s40272-013-0033-5 157. Khuong-Quang D.-A., Buczkowicz P., Rakopoulos P., et al. K27M mutation in histone H3.3 defines clinically and biologically distinct subgroups of pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Acta Neuropathol. (2012) 124:439– 447. DOI: 10.1007/s00401-012-0998-0 158. Kleinschmidt-DeMasters B.K., Aisner D.L., Birks D.K., and Foreman N.K. Epithelioid GBMs show a high percentage of BRAF V600E mutation. Am J Surg Pathol. (2013) 37(5):685–698. 159. Ko C., Kaushal A., Hammoud D.A., et al. Role of early postradiation magnetic resonance imaging scans in children with diffuse intrinsic pontine 235 glioma. Int J Radiation Oncol Biol Phys. (2012) 83(4):1252-1256. DOI: 10.1016/j.ijrobp.2011.09.046 160. Koral K., Gargan L., Bowers D.C., et al. Imaging characteristics of atypical teratoid–rhabdoid tumor in children compared with medulloblastoma. AJR. (2008) 190:809–814. DOI: 10.2214/AJR.07.3069 161. Korshunov A., Remke M., Gessi M., et al. Focal genomic amplification at 19q13.42 comprises a powerful diagnostic marker for embryonal tumors with ependymoblastic rosettes. Acta Neuropathol. (2010) 120(2):253-60. DOI: 10.1007/s00401-010-0688-8 162. Korshunov A., Ryzhova M., Jones D. T. W., et al. LIN28A immunoreactivity is a potent diagnostic marker of embryonal tumor with multilayered rosettes (ETMR). Acta Neuropathol. (2012) 124:875–881. DOI: 10.1007/s00401-012-1068-3 163. Korshunov A., Sturm D., Ryzhova M., et al. Embryonal tumor with abundant neuropil and true rosettes (ETANTR), ependymoblastoma, and medulloepithelioma share molecular similarity and comprise a single clinicopathological entity. Acta Neuropathol. (2014) 128(2):279-289. DOI: 10.1007/s00401-013-1228-0 164. Korshunov A., Sycheva R., Golanov A. Genetically distinct and clinically relevant subtypes of glioblastoma defined by array-based comparative genomic hybridization (array-CGH). Acta Neuropathol. (2006) 111: 465–474. DOI: 10.1007/s00401-006-0057-9 165. Korshunov A., Sycheva R., Golanov A. The prognostic relevance of molecular alterations in glioblastomas for patients age < 50 years. Cancer. (2005) 104:825–32. DOI: 10.1002/cncr.21221 166. Korshunov A., Sycheva R., Gorelyshev S. and Golanov A. Clinical utility of fluorescence in situ hybridization (FISH) in nonbrainstem glioblastomas of 236 childhood. Modern Pathology. (2005) 18:1258–1263. DOI: 10.1038/modpathol.3800415 167. Koshkin Ph.A., Chistiakov D.A., Chekhonin V.P. Role of microRNAs in mechanisms of glioblastoma resistance to radio- and chemotherapy. Biochemistry (Moscow). (2013) 78(4):325-334. DOI: 10.1134/S0006297913040019 168. Kothbauer K.F. Neurosurgical management of intramedullary spinal cord tumors in children. Pediatric Neurosurgery. (2007) 43:222–235. DOI: 10.1159/000098835 169. Kouzarides T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. (2007) 128:693–705. DOI: 10.1016/j.cell.2007.02.005 170. Kramm C.M., Butenhoff S., Rausche U., et al. Thalamic high-grade gliomas in children: a distinct clinical subset? Neuro-Oncology. (2011) 13(6):680 – 689. DOI: 10.1093/neuonc/nor045 171. Kreisl T.N., Kim L., Moore K., et al. Phase II Trial of single-agent Bevacizumab followed by Bevacizumab plus Irinotecan at tumor progression in recurrent glioblastoma. J Clin Oncol. (2009) 27(5):740-745. DOI: 10.1200/JCO.2008.16.3055 172. Kriegstein A. and Alvarez-Buylla A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. The Annual Review of Neuroscience. (2009) 32:149–84. DOI: 10.1146/annurev.neuro.051508.135600 173. Laird P.W. The power and the promise of DNA methylation markers. Nature Reviews. (2003) 3:253-266. 174. Lam S., Lin Y., Melkonian S. Analysis of risk factors and survival in pediatric high-grade spinal cord astrocytoma: a population-based study. Pediatric Neurosurgery. (2012) 48(5):299-305. DOI: 10.1159/000353135 175. Laprie A., Pirzkall A., Haas-Kogan D.A., et al. Longitudinal multivoxel MR spectroscopy study of pediatric diffuse brainstem gliomas treated with 237 radiotherapy. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. (2005) 62(1):20–31. DOI: 10.1016/j.ijrobp.2004.09.027 176. Lashford L.S., Thiesse P., Jouvet A., et al. Temozolomide in malignant gliomas of childhood: a United Kingdom Children’s Cancer Study Group and French Society for Pediatric Oncology Intergroup Study. J Clin Oncol. (2002) 20:4684-4691. DOI: 10.1200/JCO.2002.08.141 177. in La Torre D., Conti A., Aguennouz M., et al. Telomere Length Modulation Human Astroglial Brain Tumors. Plos One. (2013) 8(5):e64296. DOI: 10.1371/journal.pone.0064296 178. Li L-q., Shen F., Xu X-y., et al. Gene therapy with HSV1-sr39TK/GCV exhibits a stronger therapeutic efficacy than HSV1-TK/GCV in Rat C6 glioma cells. The Scientific World Journal. (2013) Article ID 951343, 10 pages. http://dx.doi.org/10.1155/2013/951343 179. Lister R., Mukamel E.A., Nery J.R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. (2013) 341(6146): 1237905–1237905. 180. Lister R., Pelizzola M., Dowen R.H., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. (2009) 462(19):315-322. DOI: 10.1038/nature08514 181. Liu B-L, Cheng J-X., Zhang X., et al. Global histone modification patterns as prognostic markers to classify glioma patients. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. (2010) 19:2888-2896. DOI: 10.1158/1055-9965.EPI-10-0454 182. Liu C., Sage J.C., Miller M.R., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. DOI: 10.1016/j.cell.2011.06.014 Cell. (2011) 146:209–221. 238 183. Liu Current C. and Zong Opinion in H. Developmental origins of brain tumors. Neurobiology. (2012) 22:844–849. http://dx.doi.org/10.1016/j.conb.2012.04.012 184. Liu X-Y., Gerges N., Korshunov A., et al. Frequent ATRX mutations and loss of expression in adult diffuse astrocytic tumors carrying IDH1/IDH2 and TP53 mutations. Acta Neuropathol. (2012) 124(5):615-25. DOI: 10.1007/s00401-012-1031-3 185. Löbel U., Sedlacik J., Reddick W.E., et al. Quantitative diffusion-weighted and dynamic susceptibility-weighted contrast-enhanced perfusion MR imaging analysis of T2 hypointense lesion components in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma. Am J Neuroradiol. (2011) 32:315–322. DOI: 10.3174/ajnr.A2277 186. Löbel U., Sedlacik J., Sabin N.D., et al. Three-dimensional susceptibility- weighted imaging and two-dimensional T2*-weighted gradient-echo imaging of intratumoral hemorrhages in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma. Neuroradiology. (2010) 52:1167–1177. DOI: 10.1007/s00234-010-0771-9 187. Louis D.N., Ohgaki H., Wiestler O.D., Cavenee W.K. (Eds.): WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System. IARC: Lyon, 2007. 188. Lutterbach J., Liegibel J., Koch D., et al. Atypical teratoid/rhabdoid tumors in adult patients: case report and review of the literature. Journal of NeuroOncology. (2001) 52: 49–56. 189. MacDonald T.J. Diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG): time to biopsy again? Pediatr Blood Cancer. (2012) 58(4):487-8. DOI: 10.1002/pbc.24090 190. Macy M.E., Birks D.K., Barton V.N. et al. Clinical and molecular characteristics of congenital glioblastoma. Neuro-Oncology. (2012) 14(7):931 – 941. DOI: 10.1093/neuonc/nos125 239 191. Makuria A. T., Rushing E.J., McGrail K.M., et al. Atypical teratoid rhabdoid tumor (AT/RT) in adults: review of four cases. Neurooncol. (2008) 88:321–330. DOI: 10.1007/s11060-008-9571-z 192. Malde R., Jalali R., Muzumdar D., et al. Gliosarcoma occurring 8 years after treatment for a medulloblastoma. Childs Nerv Syst. (2004) 20:243–246. DOI: 10.1007/s00381-003-0850-x 193. Mao X-g., Hütt-Cabezas M., Orr B.A., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes g lioblastoma tumorigenesis through a proinvasive genetic program. Oncotarget. (2013) 4(7):1050-1064. 194. Marachelian A., Butturini A. and Finlay J. Myeloablative chemotherapy with autologous hematopoietic progenitor cell rescue for childhood central nervous system tumors. Bone Marrow Transplantation. (2008) 41:167–172. DOI: 10.1038/sj.bmt.1705953 195. Martuza R.L., Malick A., Markert J.M., et al. Experimental therapy of human glioma by means of a genetically engineered virus mutant. Science. (1991) 252(5007):854-6. 196. Massimino M., Gandola L., Luksch R., et al. Sequential chemotherapy, high-dose thiotepa, circulating progenitor cell rescue, and radiotherapy for childhood high-grade glioma. Neuro-Oncology. (2005) 7:41–48. DOI: 10.1215/S1152851704000304 197. Mathewa L.K., Skulia N., Mucaja V., et al. miR-218 opposes a critical RTK-HIF pathway in mesenchymal glioblastoma. PNAS. (2014) 111(1):291–296. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1314341111 198. McCullagh P., Nelder J.A. Generalized linear models. Chapman & Hall/CRC, 1989, London. 240 199. McKay M.M. and Morrison D.K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. (2007) 26:3113–3121. DOI: 10.1038/sj.onc.1210394 200. Mellinghoff I.K., Schultz N., Mischel P.S., and Cloughesy T.F. Will kinase inhibitors make it as glioblastoma drugs? Curr Top Microbiol Immunol. (2012) 355:135–169. DOI: 10.1007/82_2011_178. 201. Messing-Jünger A.M., Floeth F.W., Pauleit D., et al. Multimodal target point assessment for stereotactic biopsy in children with diffuse bithalamic astrocytomas. Child’s Nerv Syst. (2002) 18:445–449. DOI: 10.1007/s00381-002-0644-6 202. Miller R., Perry A. Glioblastoma: morphologic and molecular genetic diversity. Arch Pathol Lab Med. (2007) 131:397–406. 203. Miller S., Rogers H.A., Lyon P., et al. Genome-wide molecular characterization of central nervous system primitive neuroectodermal tumor and pineoblastoma. Neuro-Oncology. (2011) – 13(8):866 879. DOI: 10.1093/neuonc/nor070 204. Miller S., Ward J.H., Rogers H.A., et al. Loss of INI1 protein expression defines a subgroup neuroectodermal of tumours. aggressive Brain central nervous Pathology. system (2013) primitive 23(1):19-27. DOI: 10.1111/j.1750-3639.2012.00610.x 205. Mohapatra G., Sharma J., and Yip S. Array CGH in Brain Tumors. Chapter 20. p. 325 – 338. Array Comparative Genomic Hybridization: protocols and applications, methods in molecular biology. Banerjee D. and Shah S.P.(eds.). 2013, XII, 382 p. 33 illus, 16 illus in color, Hardcover, ISNB: 978-1-62703-280-3. Vol. 973. Springer Science + Business Media, LLC 2013. DOI: 10.1007/978-1-62703-281-0_20 241 206. Mueller W.C., Deimling A. Recent Results von. Gene regulation by methylation. Cancer Res. (2009) 171:217-39. DOI: 10.1007/978-3-540-31206-2_13 207. Müller K., Schlamann A., Seidel C., et al. Craniospinal irradiation with concurrent temozolomide and nimotuzumab in a child with primary metastatic diffuse intrinsic pontine glioma. Strahlentherapie und Onkologie. (2013) 189(8):693–696. DOI: 10.1007/s00066-013-0370-x 208. Murphy E.S., Merchant T.E., Wu S., et al. Necrosis after craniospinal irradiation: results from a prospective series of children with central nervous system embryonal tumors. Int J Radiation Oncol Biol Phys. (2012) 83(5):655-660. DOI: 10.1016/j.ijrobp.2012.01.061 209. Nakamura M., Yonekawa Y., Kleihues P., Ohgaki H. Promoter hypermethylation of the RB1 gene in glioblastomas. Lab Invest. (2001) 81(1):7782. 210. Nakamura M., Watanabe T., Yonekawa Y., et al. Promoter methylation of the DNA repair gene MGMT in astrocytomas is frequently associated with G:C -> A:T mutations of the TP53 tumor suppressor gene. Carcinogenesis. (2001) 22(10):1715-1719. 211. of Neelima R., Abraham M., Kapilamoorthy T.R., et al. Pediatric gliosarcoma thalamus. Neurology India. (2012) 60(6):674-676. DOI: 10.4103/0028-3886.105222 212. Negretti L., Bouchireb K., Levy-Piedbois C., et al. Hypofractionated radiotherapy in the treatment of diffuse intrinsic pontine glioma in children: a single institution’s experience. J Neurooncol. (2011) 104:773–777. DOI: 10.1007/s11060-011-0542-4 213. Nelder J.A., Wedderburn R.W.M. Generalized linear models. J Roy Stat Soc Ser A. (1972) 135:370–384. 242 214. Nicolaides T., Li H., Solomon D., et al. Targeted therapy for BRAF V600E malignant astrocytoma. Clin Cancer Res. (2011) 17(24):7595 – 7604. 215. Nobusawa S., Suzuki A., Nagaishi M., et al. Anaplastic ependymoma with ependymoblastic multilayered rosettes. Hum Pathol. (2013) pii: S00468177(13)00140-8. DOI: 10.1016/j.humpath.2013.03.012. 216. Ogita S., Tokiwa K., Arizono N., Takahashi T. Neuroblastoma: incomplete differentiation on the way to maturation or morphological alteration resembling maturity? Oncology. (1988) 45(3):148–52. 217. O’Halloran P.J., Farrell M., Caird J., et al. Paediatric spinal glioblastoma: case report and review of therapeutic strategies. Childs Nerv Syst. (2013) 29:367–374. DOI: 10.1007/s00381-013-2023-x 218. the Ohgaki H. and Kleihues P. Genetic alterations and signaling pathways in evolution of gliomas. Cancer Science. (2009) 100:2235–2241. DOI: 10.1111/j.1349-7006.2009.01308.x 219. Ohgaki H. and Kleihues P. Genetic pathways to primary and secondary glioblastoma. The American Journal of Pathology. (2007) 170(5):1445–1453. DOI: 10.2353/ajpath.2007.070011 220. Ohgaki H. and Kleihues P. The definition of primary and secondary glioblastoma. Clinical Cancer Research. (2012) 19(4):764–772. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-3002 221. a Okami N., Kawamata T., Kubo O., et al. Infantile gliosarcoma: a case and review of the literature. Child’s Nerv Syst. (2002) 18:351–355. DOI: 10.1007/s00381-002-0602-3 222. Parsons D.W., Jones S., Zhang X., et al. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme. Science. (2008) 321:1807–1812. 243 223. Paugh B.S., Broniscer A., Qu C., et al. Genome-wide analyses identify recurrent amplifications of receptor tyrosine kinases and cell-cycle regulatory genes in diffuse intrinsic pontine glioma. J Clin Oncol. (2011) 29(30):3999-4006. DOI: 10.1200/JCO.2011.35.5677 224. Paugh B.S., Qu C., Jones C., et al. Integrated molecular genetic profiling of pediatric high-grade gliomas reveals key differences with the adult disease. J Clin Oncol. (2010) 28(18):3061-3068. DOI: 10.1200/JCO.2009.26.7252 225. Paulus W., Kleihues P. Genetic profiling of CNS tumors extends histological classification. Acta Neuropathol. (2010) 120:269–270. DOI: 10.1007/s00401-010-0710-1 226. Paz M.F., Yaya-Tur R., Rojas-Marcos I., et al. CpG island hypermethylation of the DNA repair enzyme methyltransferase predicts response to temozolomide in primary gliomas. Clinical Cancer Research. (2004) 10:4933– 4938. 227. Perkins S.M., Rubin J.B., Leonard J.R., et al. Glioblastoma in children: a single-institution experience. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. (2011) 80(4):1117–1121. DOI: 10.1016/j.ijrobp.2010.03.013 228. Perry A., Miller C.R., Gujrati M., et al. Malignant gliomas with primitive neuroectodermal tumor-like components: a clinicopathologic and genetic study of 53 cases. Brain Pathology. (2009) 19:81–90. DOI: 10.1111/j.1750-3639.2008.00167.x 229. Petitjean A., Achatz M.I.W., Borresen-Dale A.L., et al. TP53 mutations in human cancers: functional selection and impact on cancer prognosis and outcomes. Oncogene. (2007) 26:2157–2165. DOI: 10.1038/sj.onc.1210302 230. Pfister S., Remke M., Castoldi M., et al. Novel genomic amplification targeting the microRNA cluster at 19q13.42 in a pediatric embryonal tumor with 244 abundant neuropil and true rosettes. Acta Neuropathol. (2009) 117(4):457-64. DOI: 10.1007/s00401-008-0467-y 231. Pfister S., Remke M., Toedt G., et al. Supratentorial primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system frequently harbor deletions of the CDKN2A locus and other genomic aberrations distinct from medulloblastomas. Genes, Chromosomes & Cancer. (2007) 46:839–851. DOI: 10.1002/gcc.20471 232. Phillips J.J., Aranda D., Ellison D.W., et al. PDGFRA amplification is common in pediatric and adult high-grade astrocytomas and identifies a poor prognostic group in IDH1 mutant glioblastoma. Brain Pathology. (2013) 23(5):565-73. DOI: 10.1111/bpa.12043 233. Phillips H.S., Kharbanda S., Chen R., et al. Molecular subclasses of high- grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. (2006) 9:157–173. DOI: 10.1016/j.ccr.2006.02.019 234. Puget S., Philippe C., Bax D.A., et al. Mesenchymal transition and PDGFRA amplification/mutation are key distinct oncogenic events in pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. PLos One. (2012) 7(2):e30313. DOI: 10.1371/journal.pone.0030313 235. Purkait S., Jha P., Sharma M.C., et al. CDKN2A deletion in pediatric versus adult glioblastomas and predictive value of p16 immunohistochemistry. Neuropathology. (2013) 33(4):405-412. DOI: 10.1111/neup.12014 236. Qu H-Q., Jacob K., Fatet S., et al. Genome-wide profiling using single- nucleotide polymorphism arrays identifies novel chromosomal imbalances in pediatric glioblastomas. DOI: 10.1093/neuonc/nop001 Neuro-Oncology. (2010) 12(2):153–163. 245 237. Raco A., Piccirilli M., Landi A., et al. High-grade intramedullary astrocytomas: 30 years’ experience at the Neurosurgery Department of the University of Rome ―Sapienza‖. J Neurosurg Spine. (2010) 12:144–153. DOI: 10.3171/2009.6.SPINE08910 238. Raisanen J., Hatanpaa K.J., Mickey B.E., and White III C.L. Atypical teratoid/rhabdoid tumor: cytology and differential diagnosis in adults. Diagn. Cytopathol. (2004) 31(1):60 – 63. DOI: 10.1002/dc.20064 239. Ravisankar S., Chander R.V., Devadoss P.K. Pediatric gliosarcoma with fibrosarcomatous differentiation: report of a rare case. Indian Journal of Pathology & Microbiology. (2012) 55(4):521-524. http://www.ijpmonline.org/text.asp?2012/55/4/521/107797 240. Reardon D.A., Wucherpfennig K.W., Freeman G., et al. An update on vaccine therapy and other immunotherapeutic approaches for glioblastoma. Expert Rev Vaccines. (2013) 12(6):597-615. DOI: 10.1586/erv.13.41 241. Reddy G.D., Sen A.N., Patel A.J., et al. Glioblastoma of the cerebellum in children: report of five cases and review of the literature. Childs Nerv Syst. (2013) 29(5):821-32. DOI: 10.1007/s00381-012-1996-1 242. Reinders J. & Paszkowski J. Bisulfite methylation profiling of large genomes. Epigenomics. (2010) 2(2): 209–220. 243. Reis R.M., Konu-Lebleblicioglu D., Lopes J.M., et al. Genetic profile of gliosarcomas. American Journal of Pathology. (2000) 156(2):425-432. 244. the Rezanko T., Tunakan M., Kahraman A., et al. Primary rhabdoid tumor of brain in an adult. Neuropathology. (2006) 26:57–61. DOI: 10.1111/j.1440-1789.2006.00624.x 245. Ricard D., Soussain C., Psimaras D. Neurotoxicity of the CNS: diagnosis, treatment and prevention. Rev Neurol (Paris). (2011) 167(10):737-45. DOI: 10.1016/j.neurol.2011.08.005. 246 246. Rickert C.H., Strater R., Kaatsch P., et al. Pediatric high-grade astrocytomas show chromosomal imbalances distinct from adult cases. American Journal of Pathology. (2001) 158(4):1525-1532. 247. Rivlin N., Brosh R., Oren M., and Rotter V. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: important milestones at the various steps of tumorigenesis. Genes & Cancer. (2011) 2:466-474. DOI: 10.1177/1947601911408889 248. Rizzo J.M. and Buck M.J. Key principles and clinical applications of "next-generation" DNA sequencing. Cancer Prev Res. (2012) 1–14. DOI: 10.1158/1940-6207.CAPR-11-0432 249. Rodriguez F.J., Scheithauer B.W., Giannini C. et al. Epithelial and pseudoepithelial differentiation in glioblastoma and gliosarcoma: a comparative morphologic and molecular genetic study. Cancer. (2008) 113(10): 2779–2789. DOI: 10.1002/cncr.23899 250. Roessler J., Ammerpohl O., Gutwein J., et al. Quantitative cross- validation and content analysis of the 450k DNA methylation array from Illumina, Inc. BMC Research Notes. (2012) 5:210. http://www.biomedcentral.com/1756-0500/5/210 251. Rokes C.A., Remke M., Guha-Thakurta N., et al. Sorafenib plus valproic acid for infant spinal glioblastoma. J Pediatr Hematol Oncol. (2010) 32(6):511514. DOI: 10.1097/MPH.0b013e3181d74702 252. Rowitch D.H. &. Kriegstein A.R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. (2010) 468:214-222. DOI: 10.1038/nature09611 253. Ruano Y., Ribalta T., Rodríguez de Lope A., et al. Worse outcome in primary glioblastoma multiforme with concurrent epidermal growth factor receptor and p53 alteration. Am J Clin Pathol. DOI: 10.1309/AJCP64YBDVCTIRWV (2009) 131:257-263. 247 254. Rusk N. and Kiermer V. Primer: Sequencing – the next generation. Nature Methods. (2008) 5(1):15. DOI: 10.1038/NMETH1155 255. Saito T., Hama S., Kajiwara Y., et al. Prognosis of cerebellar glioblastomas: correlation between prognosis and immunoreactivity for epidermal growth factor receptor compared with supratentorial glioblastomas. Anticancer Research. (2006) 26:1351-1358. 256. Salvati M., Lenzi J., Brogna C., et al. Childhood’s gliosarcomas: pathological and therapeutical considerations on three cases and critical review of the literature. Childs Nerv Syst. (2006) 22:1301–1306. DOI: 10.1007/s000381-006-0057-z 257. Sanders R.P., Kocak M., Burger P.C., et al. High-grade astrocytoma in very young children. Pediatr Blood Cancer. (2007) 49:888–893. DOI: 10.1002/pbc.21272 258. Sands S.A., Zhou T., O’Neil S.H., et al. Long-term follow-up of children treated for high-grade gliomas: Children’s Oncology Group L991 final study report. Journal of Clinical Oncology. (2012) 30(9):943-949. DOI: 10.1200/JCO.2011.35.75337 259. Santi M., Mena H., Wong K., et al. Spinal cord malignant astrocytomas. Cancer. (2003) 98:554 – 61. DOI: 10.1002/cncr.11514 260. Sardi I., Cetica V., Massimino M., et al. Promoter methylation and expression analysis of MGMT in advanced pediatric brain tumors. Oncology Reports. (2009) 22:773-779. DOI: 10.3892/or_00000499 261. Sato A., Sakurada K., Kumabe T., et al. Association of stem cell marker CD133 expression with dissemination of glioblastomas. Neurosurg Rev. (2010) 33(2):175-83. DOI: 10.1007/s10143-010-0239-8 262. Shendure J. & Ji H. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. (2008) 26(10):1135 – 1145. DOI: 10.1038/nbt1486 248 263. Schiff D. and Purow B. Neurology Clinical Neuro-oncology: Practice. DOI: Five (2013) new things. 3:326-333. 10.1212/CPJ.0b013e3182a1ba35 http://cp.neurology.org/content/3/4/326.full.html 264. Schindler G., Capper D., Meyer J., et al. Analysis of BRAF V600E mutation in 1,320 nervous system tumors reveals high mutation frequencies in pleomorphic xanthoastrocytoma, ganglioglioma and extra-cerebellar pilocytic astrocytoma. Acta Neuropathol. (2011) 121:397–405. DOI: 10.1007/s00401-011-0802-6 265. Schulze J.M., Wang A.Y., Kobor M.S. YEATS domain proteins: a diverse family with many links to chromatin modification and transcription. Biochem Cell Biol. (2009) 87(1):65-75. DOI: 10.1139/O08-111 266. Schumacher T., Bunse L., Pusch S., et al. A vaccine targeting mutant IDH1 induces antitumour immunity. Nature. (2014) 512(7514):324-327. DOI: 10.1038/nature13387 267. Schwartzentruber J., Korshunov A., Liu X-Y., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. (2012) 482:226-231. DOI: 10.1038/nature10 268. Sedlacik J., Winchell A., Kocak M., et al. MR imaging assessment of tumor perfusion and 3D segmented volume at baseline, during treatment, and at tumor progression in children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma. Am J Neuroradiol. (2013) 34:1450–1455. http://dx.doi.org/10.3174/ajnr.A3421 269. Sethi R., Allen J., Donahue B., et al. Prospective neuraxis MRI surveillance reveals a high risk of leptomeningeal dissemination in diffuse intrinsic pontine glioma. DOI: 10.1007/s11060-010-0301-y J Neurooncol. (2011) 102:121–127. 249 270. Sharma S., Free A., Mei Y., et al. Distinct molecular signatures in pediatric infratentorial glioblastomas defined by aCGH. Experimental and Molecular Pathology. (2010) 89:169–174. DOI: 10.1016/j.yexmp.2010.06.009 271. Shen H. and. Laird P.W. Interplay between the cancer genome and epigenome. Cell. (2013) 153:38-55. http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.03.008 272. Shen R., Mo Q., Schultz N., et al. Integrative subtype discovery in glioblastoma using iCluster. PLoS One. (2012) 7(4):e35236. DOI: 10.1371/journal.pone.0035236 273. Shiraishi S., Tada K., Nakamura H., et al. Influence of p53 mutations on prognosis of patients with glioblastoma. Cancer. (2002) 95:249–257. DOI: 10.1002/cncr.10677 274. Shonka N.A., Armstrong T.S., Prabhu S.S., et al. Atypical teratoid/rhabdoid tumors in adults: a case report and treatment-focused review. J Clin Med Res. (2011) 3(2):85-92. DOI: 10.4021/jocmr535w 275. Sirachainan N., Pakakasama S., Visudithbhan A., et al. Concurrent radiotherapy with temozolomide followed by adjuvant temozolomide and cisretinoic acid in children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. (2008) 10:577–582. http://neuro-oncology.dukejournals.org; DOI: 10.1215/15228517-2008-025 276. Solomón M.T., Selva J.C., Figueredo J., et al. Radiotherapy plus nimotuzumab or placebo in the treatment of high grade glioma patients: results from a randomized, double blind trial. BMC Cancer. (2013) 13:299. http://www.biomedcentral.com/1471-2407/13/299 277. Song K.S., Phi J.H., Cho B-K., et al. Long-term outcomes in children with glioblastoma. J Neurosurg DOI: 10.3171/2010.5.PEDS09558 Pediatrics. (2010) 6:145–149. 250 278. Song X., Allen R.A., Dunn S.T., et al. Glioblastoma with PNET-like components has a higher frequency of isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) mutation and likely a better prognosis than primary glioblastoma. Int J Clin Exp Pathol. (2011) 4(7):651-660. 279. Soussain C., Ricard D., Fike J.R., et al. CNS complications of radiotherapy and chemotherapy. Lancet. (2009) 374:1639–51. 280. Sridhar K., Sridhar R., and Venkatprasanna G. Management of posterior fossa gliomas in children. Journal of Pediatric Neurosciences. (2011) 6(Suppl1): S72–S77. DOI: 10.4103/1817-1745.85714 281. Srivastava A., Jain A., Jha P., et al. MGMT gene promoter methylation in pediatric glioblastomas. Childs Nerv Syst. (2010) 26:1613–1618. DOI: 10.1007/s00381-010-1214-y 282. Stedt H., Samaranayake H., Pikkarainen J., et al. Improved therapeutic effect on malignant glioma with adenoviral suicide gene therapy combined with temozolomide. Gene Therapy. (2013) 1–7. DOI: 10.1038/gt.2013.46 283. Steffen-Smith E.A., Shih J.H., Hipp S.J., et al. Proton magnetic resonance spectroscopy predicts survival in children with diffuse intrinsic pontine glioma. J Neurooncol. (2011) 105:365–373. DOI: 10.1007/s11060-011-0601-x 284. Steffen-Smith E.A., Venzon D.A., Bent R.S., et al. Single- and multivoxel proton spectroscopy in pediatric patients with diffuse intrinsic pontine glioma. Int J Radiation Oncol Biol Phys. (2012) 84(3):774-779. DOI: 10.1016/j.ijrobp.2012.01.032 285. Sturm D., Witt H., Hovestadt V., et al. Hotspot mutations in H3F3A and IDH1 define distinct epigenetic and biological subgroups of glioblastoma. Cancer Cell. (2012) 22:1–13. http://dx.doi.org/10.1016/j.ccr.2012.08.024 286. Sufit A., Donson A.M., Birks D.K., et al. Diffuse intrinsic pontine tumors: a study of primitive neuroectodermal tumors versus the more common diffuse 251 intrinsic pontine gliomas. J Neurosurg Pediatrics. (2012) 10:81–88. http://thejns.org/doi/abs/10.3171/2012.3.PEDS11316 287. and Suri V., Das P., Jain A., et al. Pediatric glioblastomas: A histopathological molecular genetic study. Neuro-Oncology. (2009) 11:274–280. DOI: 10.1215/15228517-2008-092 288. brain Swartling F.J., Hede S-M., Weiss W.A. What underlies the diversity of tumors? Cancer Metastasis Rev. (2013) 32(1-2):5-24. DOI: 10.1007/s10555-012-9407-3 289. Takahashi K., Nishihara H., Katoh M., et al. A case of atypical teratoid/rhabdoid tumor in an adult, with long survival. Brain Tumor Pathol. (2011) 28:71–76. DOI: 10.1007/s10014-010-0008-y 290. Takei H., Adesina A.M., Mehta V., et al. Atypical teratoid/rhabdoid tumor of the pineal region in an adult. J Neurosurg. (2010) 113:374–379. DOI: 10.3171/2009.10.JNS09964 291. Tamber M.S., Bansal K., Liang M-L., et al. Current concepts in the molecular genetics of pediatric brain tumors: implications for emerging therapies. Childs Nerv Syst. (2006) 22:1379–1394. DOI: 10.1007/s00381-006-0187-3 292. Tendulkar R.D., Panandiker A.S.P., Wu S., et al. Irradiation of pediatric high-grade spinal cord tumors. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. (2010) 78(5):1451–1456. DOI: 10.1016/j.ijrobp.2009.09.071 293. Tibiletti M.G. Interphase FISH as a new tool in tumor pathology. Cytogenetic and Genome Research. (2007) 118:229-236. 294. Tibiletti M.G., Bernasconi B., Dionigi A., Riva C. The applications of FISH in tumor pathology. Adv Clin Path. (1999) 3(4):111-118. 295. Tivnan A., McDonald K.L. Current progress for the use of miRNAs in glioblastoma treatment. DOI: 10.1007/s12035-013-8464-0 Mol Neurobiol. (2013) 48(3):757-68. 252 296. Townsend N., Handler M., Fleitz J., Foreman N. Intramedullary spinal cord astrocytomas in children. Pediatr Blood Cancer. (2004) 43:629–632. DOI: 10.1002/pbc.20082 297. Trembath D., Miller C.R., and Perry A. Gray zones in brain tumor classification evolving concepts. Adv Anat Pathol. (2008) 15(5):287–297. 298. Torres L.F., Grant N., Harding B.N., Scaravilli F. Intracerebral neuroblastoma. Report of a case with neuronal maturation and long survival. Acta Neuropathol. (1985) 68(2):110–4. 299. Tsien C., Moughan J., Michalski J. M., et al. Phase I three-dimensional conformal radiation dose escalation study in newly diagnosed glioblastoma: Radiation Therapy Oncology Group trial 98-03. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. (2009) 73(3) 699–708. DOI: 10.1016/j.ijrobp.2008.05.034 300. Uhlmann K., Rohde K., Zeller C., et al. Int. J. Distinct methylation profiles of glioma subtypes. Cancer. (2003) 106:52–59. DOI: 10.1002/ijc.11175 301. Utsuki S., Oka H., Tanaka S., et al. Importance of re-examination for medulloblastoma and atypical teratoid/rhabdoid tumor. Acta Neurochir. (2003) 145:663–666. DOI: 10.1007/s00701-003-0078-2 302. VandenDriessche T., Chuah M.K. Glioblastoma: bridging the gap with gene therapy. The Lancet Oncology. (2013) 14:789-790. http://dx.doi.org/10.1016/S1470-2045(13)70342-5 303. Varghese S. and Rabkin S.D. Oncolytic herpes simplex virus vectors for cancer virotherapy. Cancer Gene Therapy. (2002) 9:967 – 978. DOI: 10.1038/sj.cgt.7700537 304. Venneti S., Garimella M.T., Sullivan L.M., et al. Evaluation of Histone 3 Lysine 27 Trimethylation (H3K27me3) and Enhancer of Zest 2 (EZH2) in pediatric glial and glioneuronal tumors shows decreased H3K27me3 in H3F3A 253 K27M mutant glioblastomas. Brain Pathology. (2013) 23(5):558-64. DOI: 10.1111/bpa.12042 305. Verhaak R.G.W., Hoadley K.A., Purdom E., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. (2010) 17:98– 110. DOI: 10.1016/j.ccr.2009.12.020 306. Veringa S.J.E., Biesmans D., Vuurden D.G. van, et al. In vitro drug response and efflux transporters associated with drug resistance in pediatric high grade glioma and diffuse intrinsic pontine glioma. Plos One. (2013) 8(4): e61512. DOI: 10.1371/journal.pone.0061512 307. Wagner S., Benesch M., Berthold F., et al. Secondary dissemination in children with high-grade malignant gliomas and diffuse intrinsic pontine gliomas. British Journal of Cancer. (2006) 95:991–997. DOI: 10.1038/sj.bjc.6603402 308. Walker D.A., Liu J.F., Kieran M., et al. A multi-disciplinary consensus statement concerning surgical approaches to low-grade, high-grade astrocytomas and diffuse intrinsic pontine gliomas in childhood (CPN Paris 2011) using the Delphi method. Neuro-Oncology. (2013) 15(4):462–468. DOI: 10.1093/neuonc/nos330 309. Wang X., Chen J-X., Liu Y-H., et al. Mutant TP53 enhances the resistance of glioblastoma cells to temozolomide by up-regulating O6-methylguanine DNAmethyltransferase. Neurol Sci. (2013) 34:1421–1428. DOI: 10.1007/s10072-012-1257-9 310. Warren K.E., Killian K., Suuriniemi M., et al. Genomic aberrations in pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Neuro-Oncology. (2012) 14(3):326 – 332. DOI: 10.1093/neuonc/nor190 254 311. Warmuth-Metz M., Bison B., Dannemann-Stern E., et al. CT and MR imaging in atypical teratoid/rhabdoid tumors of the central nervous system. Neuroradiology. (2008) 50:447–452. DOI: 10.1007/s00234-008-0369-7 312. Weichenhan D. and Plass C. The evolving epigenome. Human Molecular Genetics. (2013) R1 –R6. DOI: 10.1093/hmg/ddt348 313. Weiss M.M., Hermsen M.A.J.A., Meijer G.A., et al. Comparative genomic hybridization. J Clin Pathol: Mol Pathol. (1999) 52:243–251. 314. Whitley R. J. and Markert J. M. Viral therapy of glioblastoma multiforme. PNAS. (2013) 110(29):11672–11673. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1310253110 315. Williams K., Christensen J. & Helin K. DNA methylation: TET proteins— guardians of CpG islands? European Molecular Biology Organization reports. (2012) 13:28–35. DOI: 10.1038/embor.2011.233 316. Wiestler B., Capper D., Hovestadt V., et al. Assessing CpG island methylator phenotype, 1p/19q codeletion, and MGMT promoter methylation from epigenome-wide data in the biomarker cohort of the NOA-04 trial. NeuroOncology. (2014). 1 – 9. DOI: 10.1093/neuonc/nou138 317. Wiestler B., Capper D., Sill M., et. al. Integrated DNA methylation and copy-number profiling identify three clinically and biologically relevant groups of anaplastic glioma. Acta Neuropathol. (2014) 128(4):561-71. DOI: 10.1007/s00401-014-1315-x 318. Wolff B., Ng A., Roth D., et al. Pediatric high grade glioma of the spinal cord: results of the HIT-GBM database. J Neurooncol. (2012) 107:139–146. DOI: 10.1007/s11060-011-0718-y 319. Wolff J.E., Rytting M.E., Vats T.S., et al. Treatment of recurrent diffuse intrinsic pontine glioma: the MD Anderson Cancer Center experience. J Neurooncol. (2012) 106:391–397. DOI: 10.1007/s11060-011-0677-3 255 320. Wong K-K., Tsang Y.T.M., Chang Y-M., et al. Genome-wide allelic imbalance analysis of pediatric gliomas by single nucleotide polymorphic allele array. Cancer Research. (2006) 66(23):11172-11178. http://cancerres.aacrjournals.org/content/66/23/11172 321. Wong L.H., McGhie J.D., Sim M., et al. ATRX interacts with H3.3 in maintaining telomere structural integrity in pluripotent embryonic stem cells. Genome Research. (2010) 20: 351-360. DOI: 10.1101/gr.101477.109 322. Wu G., Broniscer A., McEachron T.A., et al. Somatic histone H3 alterations in paediatric diffuse intrinsic pontine gliomas and non-brainstem glioblastomas. Nat Genet. (2012) 44(3): 251–253. DOI: 10.1038/ng.1102 323. Yang T., Temkin N., Barber J. et al. Gross total resection correlates with long-term survival in pediatric patients with glioblastoma. World Neurosurg. (2013) 79(3-4):537-44. http://dx.doi.org/10.1016/j.wneu.2012.09.015 324. Young R.J., Gupta A., Shah A.D., et al. MRI perfusion in determining pseudoprogression in patients with glioblastoma. Clinical Imaging. (2013) 37:41–49. http://dx.doi.org/10.1016/j.clinimag.2012.02.016 325. Yurtseven T., Ersahin Y., Demirtas E., Mutluer S. Neuroendoscopic biopsy for intraventricular tumors. Minim Invas Neurosurg. (2003) 46:293-299. 326. Zarghooni M., Bartels U., Lee E., et al. Whole-genome profiling of pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas highlights platelet-derived growth factor receptor α and poly (ADP-ribose) polymerase as potential therapeutic targets. J Clin Oncol. (2010) 28(8):1337-1344. DOI: 10.1200/JCO.2009.25.5463 327. Zhang G., Huang S., Wang Z. A meta-analysis of bevacizumab alone and in combination with irinotecan in the treatment of patients with recurrent glioblastoma multiforme. Journal of Clinical Neuroscience. (2012) 19(12):1636– 1640. 256 328. Zhang K., Wang X-Q., Zhou B., Zhang L. The prognostic value of MGMT promoter methylation in glioblastoma multiforme: a meta-analysis. Familial Cancer. (2013) 12(3):449-458. DOI: 10.1007/s10689-013-9607-1 329. Zhang X., Zhang W., Cao W.D., et al. Glioblastoma multiforme: Molecular characterization and current treatment strategy (Review). Exp Ther Med. (2012) 3(1):9–14. DOI: 10.3892/etm.2011.367 330. Zhou Z., Luther N., M. Ibrahim G.M., et al. B7-H3, a potential therapeutic target, is expressed in diffuse intrinsic pontine glioma. J Neurooncol. (2013) 111:257–264. DOI: 10.1007/s11060-012-1021-2 257 ПРИЛОЖЕНИЕ ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Протокол ведения больных c глиобластомами в до- и послеоперационном периодах 1. Обследование до операции МРТ головного или спинного мозга с контрастированием Офтальмологическое обследование Неврологический статус Общий функциональный статус Общий и биохимический анализы крови 2. Удаление опухоли. Морфологическое и генетическое исследования. 3. Обследование после операции (в течение 1 недели) КТ головного мозга или спинного мозга Неврологический статус Осмотр офтальмологом Общий и биохимический анализы крови 4. Лучевая терапия 5. Обследование после лучевой терапии (в течение 1 месяца) МРТ головного мозга или спинного мозга с контрастированием 258 Неврологический статус Общий и биохимический анализы крови 6. Химиотерапия (в период проведения химиотерапии - общий анализ крови еженедельно, биохимический анализ крови – ежемесячно) 7. Обследование после химиотерапии МРТ головного или спинного мозга с контрастированием Неврологический статус Общий и биохимический анализы крови 8. Динамическое наблюдение (обследование) 2 раза в год. МРТ головного или спинного мозга с контрастированием Неврологический статус 259 ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Список пациентов от 4 месяцев до 18 лет, оперированных в ФГБНУ «НИИ НХ» в период с 1998 по 2013 годы (исследуемая подгруппа) Порядковый номер 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 ФИО М-ко Д.Н. Я-на И.А. Ц-ни М. Я-н А.А. Р-ли И.А. М-ва К.А. У-ва А.В. Б-ов С.А. Ф-ов Е.Г. М-й М.Н. Г-на С.Л. Ш-ко Д.Н. А-ва А.Т. кызы П-к Л.А. С-ов А.В. М-ва Е.А. П-ко Ю.В. Б-ва А.М. Г-ов В.А. Е-ва Н.А. М-ев Э.Р. М-ва Х.Д. С-ва П.А. З-й Д.С. Ф-ев А.А. В-ра В.С. Х-на Д.А. К-ов Н.А. М-ва А.А. Э-ов И.Т. К-ин Д.Е. Я-ва Д.А. К-ев А.В. Т-ев М.А. Дата операции 13.10.98 19.12.98 15.04.99 20.05.99 01.09.99 22.11.99 14.12.99 11.01.00 17.05.00 15.06.00 02.08.00 24.08.00 23.10.00 История болезни 1937/98 2370/98 603/99 842/99 1747/99 2529/99 2730/99 2932/99 1317/00 1586/00 2112/00 2298/00 2857/00 30.11.00 22.01.01 24.04.02 10.06.02 19.06.02 06.03.03 15.04.03 28.05.03 30.06.03 08.09.03 25.09.03 14.10.03 16.12.03 24.12.03 25.12.03 16.02.04 19.04.04 24.05.04 12.07.04 06.09.04 25.10.04 3162/00 61/01 1185/02 1614/02 1763/02 638/03 1275/03 1733/03 2108/03 2909/03 2979/03 3387/03 4133/03 4248/03 4381/03 495/04 1288/04 1669/04 2256/04 2942/04 3614/04 260 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 М-ко А.А. Ч-ых М.Г. Д-на С.С. К-ов И.С. Г-ва С.- Л.Т. Ш-к В.В. П-ов А.О. О-ов А.Х. Т-ая М.О. К-ва О.В. С-ин А. А. Г-де Т.Э. оглы Д-на Д.А. М-ко Р.В. З-на И.И. Ш-ко М.В. С-ев М.С. А-ва К.А. С-ев В.А. У-ва Ш.Ш. кизи А-ва Д.А. Т-ва М.А. Л-ва О.Н. Х-ев С.И. У-ов Д.В. Ф-ов В.И. П-на Е.В. П-ко В.С. И-ов А.В. В-ев А.И. Л-ва А.С. Д-ко М.Е. Т-ин Э.Р. Ю-ов М.А. П-ов И.А. Б-на И.А. М-ов У.С. оглы Б-ко К.С. Д-ва З.М. К-ва В.А. Б-ко Т.В. У-ко В.Р. А-ва А.Д. 15.12.04 22.12.04 25.01.05 20.04.05 05.05.05 11.05.05 06.07.05 25.07.05 28.07.05 26.10.05 31.10.05 10.11.05 29.12.05 16.01.06 26.01.06 06.04.06 18.04.06 20.09.06 27.10.06 15.11.06 4233/04 4274/04 194/05 1360/05 1552/05 1537/05 2366/05 2610/05 2713/05 3821/05 3910/05 4026/05 4624/05 67/06 248/06 1173/06 1395/06 3592/06 4185/06 4465/06 06.12.06 15.03.07 21.03.07 03.04.07 07.05.07 23.05.07 14.06.07 04.09.07 24.09.07 07.11.07 17.01.08 31.03.08 13.05.08 21.05.08 26.05.08 19.06.08 07.07.08 4829/06 998/07 988/07 1338/07 1792/07 2035/07 2338/07 3585/07 3771/07 4591/07 94/08 1240/08 2040/08 2201/08 2197/08 2610/08 2951/08 16.07.08 28.07.08 10.09.08 17.09.08 19.02.09 03.03.09 3118/08 3302/08 3904/08 3949/08 639/09 717/09 261 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 Е-ов Н.З. Е-ва К.С. К-ва Т.А. М-ов И.В. Б-ий Р.И. Г-ко Н.А. А-ев Г.С. А-ян М.А. В-ин С.Н. Т-ов С.А. П-ов В.В. К-ва А.Х. кизи К-на К.В. С-ва Е.С. Ю-ко А.А. Д-ер Н.А. Г-ак Ю.И. Ч-ва Ю.С. М-ва Э.Е. Я-на К.К. Х-ев В.Ю. Ч-ов В.А. Б-ва М.Б. Б-ц У.А. П-ов А.Ю. З-ов Э.Р. К-ин М.И. М-к В.Д. К-на К.А. Д-ва Е.А. М-ва В.А. Т-ов А.А. Е-ва А.О. Ф-ев И.Р. А-ва Ф.Р. Е-на П.С. Б-ва М.Д. К-на В.А. Б-ин А.А. Я-к С.С. П-ку П.И. О-на В.С. К-ов А. А. И-ва Г.Н. 07.05.09 04.06.09 02.07.09 07.07.09 14.07.09 03.08.09 15.09.09 19.10.09 29.10.09 05.11.09 19.11.09 26.11.09 1789/09 2266/09 2607/09 2836/09 2895/09 3163/09 3790/09 4350/09 4540/09 4625/09 4926/09 5012/09 28.01.10 11.03.10 06.05.10 11.05.10 08.06.10 04.08.10 17.08.10 15.09.10 26.01.11 04.03.11 10.03.11 21.04.11 25.04.11 18.05.11 31.05.11 20.06.11 27.06.11 29.06.11 12.11.11 27.12.11 28.12.11 12.01.12 16.01.12 30.03.12 25.04.12 03.05.12 11.05.12 23.05.12 17.07.12 01.08.12 06.08.12 05.09.12 276/10 1061/10 2029/10 2068/10 2604/10 3531/10 3686/10 4182/10 255/11 968/11 1089/11 1976/11 2041/11 2456/11 2592/11 3052/11 3109/11 3230/11 5680/11 6603/11 6629/11 33/12 96/12 1539/12 2035/12 2229/12 2237/12 2513/12 3685/12 4079/12 4135/12 4670/12 262 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 Ч-ва А.Н. Б-ев Р.М. И-ов В.М. Е-ва К.А. Б-ев Д.М. П-ин С.А. И-ов Б.А. угли Б-с Н.Н. З-на Э.В. Б-ов М.А. П-ев Д. В. Л-ко П.В. К-ва К.Р. К-ов А.В. Т-ва Л.Р. 11.09.12 01.10.12 10.10.12 26.11.12 18.12.12 19.12.12 24.12.12 28.01.13 11.02.13 06.03.13 25.03.13 26.03.13 27.06.13 11.07.13 10.09.13 4762/12 5065/12 5304/12 5988/12 6586/12 6683/12 6706/12 348/13 655/13 1249/13 1639/13 1453/13 3476/13 3802/13 5031/13 263 Список пациентов от 19 до 62 лет, оперированных в ФГБНУ «НИИ НХ» в период с 1999 по 2011 годы (контрольная группа) Порядковый ФИО номер 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 А-ев Ю.В. Г-ва Т.Г. С-ва Т.И. О-ва С.В. В-ов Г.С. Б-ин В.А. П-ин А.В. А-ев Ш.С. М-ва А.Ю. Ч-ля И.О. Л-на В.В. С-ов М.В. З-ев А.Е. М-ко О.Н. И-ов А.В. Д-их В.И. К-ва Е.В. О-лы С.Ш. П-ва А.В. Ч-ва О.Н. Г-ов С.Б. Ш-ов Х.М. Г-ов М.Л. В-на Т.Н. Ф-ль В. А. Б-ва Г.М. У-ов В.С. Ч-ва Г.Н. Е-на А.Е. С-ва Е.И. Г-ов Е.А. Р-ва Л.И. К-ва Р.В. М-нко Г.Д. Б-ко С.А. Р-я Т.И. Дата История операции болезни 31.05.99 21.07.99 07.05.02 08.08.02 09.09.02 11.09.02 10.10.02 15.10.02 28.10.02 03.12.02 27.12.02 10.02.03 12.03.03 18.08.03 04.09.03 16.09.03 06.11.03 25.11.03 25.11.03 26.11.03 12.01.04 14.01.04 26.01.04 16.02.04 25.02.04 04.03.04 16.03.04 22.03.04 23.03.04 23.03.04 13.04.04 22.04.04 13.05.04 28.06.04 14.07.04 12.08.04 770/99 1412/99 1148/02 2323/02 2689/02 2727/02 2931/02 3041/02 3045/02 3476/02 4061/02 410/03 770/03 2745/03 2934/03 3014/03 3712/03 3916/03 3926/03 3867/03 26/04 74/04 252/04 434/04 631/04 732/04 782/04 888/04 941/04 910/04 1105/04 1308/04 1542/04 2152/04 2257/04 2653/04 264 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 К-ва Е.А. Ф-ов А.А. В-ев М.М. Х-ов Р.Р. К-ов А.А. А-ев А.А. оглы И-ов М.А. оглы М-ва О.С. Б-рь В.К. К-ин Ю.Н. Т-на Л.Э. А-ов А.М. С-ев С.Н. М-ев В.Э. В-ва Т.Н. К-й А.А. Д-ев В.А. К-ко С.Т. Г-ов К.Б. З-ва Т.Г. К-ов Е.В. Н-ин А.С. Ш-ва Л.Г. И-ин М.Е. К-ин Б.П. А-ян Н.Г. Б-ов О.В. А-на Н.П. С-ва И.Г. К-ва О.И. Д-ин А.В. Т-юк М.И. К-ов В.А. С-ва Т.Н. К-ов В.С. А-ян М.Л. П-ов А.И. К-ин Д.М. М-ин Д.А. Я-ин Р.М. Б-ов В.Ю. 06.09.04 09.09.04 13.09.04 21.09.04 29.09.04 21.10.04 2937/04 3005/04 3042/04 3117/04 3246/04 3542/04 11.11.04 3753/04 18.11.04 29.11.04 30.11.04 21.12.04 21.02.05 22.02.05 03.03.05 11.04.05 01.06.05 30.01.06 31.01.06 31.01.06 06.02.06 07.02.06 16.03.06 28.03.06 29.03.06 04.05.06 15.05.06 28.06.06 08.08.06 09.08.06 28.08.06 11.09.06 12.10.06 18.01.07 05.02.07 06.03.07 03.04.07 21.05.07 07.11.07 29.11.07 28.01.08 24.10.11 3776/04 3958/04 4041/04 4263/04 494/05 571/05 662/05 1157/05 1900/05 271/06 216/06 299/06 367/06 395/06 904/06 1074/06 1097/06 1517/06 1710/06 2272/06 2968/06 2980/06 3271/06 3470/06 3850/06 126/07 436/07 902/07 1295/07 2024/07 4584/07 4949/07 296/08 5339/11 265 ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Буквенные обозначения аминокислот Названия Трехбуквеное Однобуквенное аминокислот обозначение обозначение Аланин Ala A Аргинин Arg R Аспарагин Asn N Аспарагиновая кислота Asp D Цистеин Cys C Глутамин Gln Q Глутаминовая кислота Glu E Глицин Gly G Гистидин His H Изолейцин Ile I Лейцин Leu L Лизин Lys K Метионин Met M Фениналанин Phe F Пролин Pro P Серин Ser S Треонин Thr T Триптофан Trp W Тирозин Tyr Y Валин Val V
