ÎÁÇÎÐ Íåâðîëîãè÷åñêèé âåñòíèê — 2008 — Ò. XL, ÓÄÊ: 616.832—004—085

ÎÁÇÎÐ
Íåâðîëîãè÷åñêèé âåñòíèê — 2008 — Ò. XL,
âûï. 4 — Ñ. 91—100
ÓÄÊ: 616.832—004—085
ÁÎÊÎÂÎÉ ÀÌÈÎÒÐÎÔÈ×ÅÑÊÈÉ ÑÊËÅÐÎÇ:
ÑÒÐÀÒÅÃÈß ÃÅÍÍÎ-ÊËÅÒÎ×ÍÎÉ ÒÅÐÀÏÈÈ
Ðóñòåì Ðîáåðòîâè÷ Èñëàìîâ1, Àëüáåðò Àíàòîëüåâè÷ Ðèçâàíîâ1,2,
Àíäðåé Ïàâëîâè÷ Êèÿñîâ1,3
Êàçàíñêèé ãîñóäàðñòâåííûé ìåäèöèíñêèé óíèâåðñèòåò, êàôåäðà ãèñòîëîãèè, 420012, ã. Êàçàíü,
óë. Áóòëåðîâà, 49, e-mail: rustem.islamov@gmail.com, 2Êàçàíñêèé ãîñóäàðñòâåííûé óíèâåðñèòåò,
êàôåäðà ãåíåòèêè áèîëîãî-ïî÷âåííîãî ôàêóëüòåòà, 420008, óë. Êðåìëåâñêàÿ 18,
å-mail: rizvanov@gmail.com, 3Áàíê ñòâîëîâûõ êëåòîê Êàçàíñêîãî ãîñóäàðñòâåííîãî ìåäèöèíñêîãî
óíèâåðñèòåòà, e-mail: kiassov@mail.ru
1
Ðåôåðàò. Îáîáùåíû äàííûå î ãåííîé òåðàïèè áîêîâîãî
àìèîòðîôè÷åñêîãî ñêëåðîçà, ïîëó÷åííûå ñ ïîìîùüþ
àíòèñìûñëîâûõ
îëèãîíóêëåîòèäîâ,
êîðîòêîé
èíòåðôåðèðóþùåé ÐÍÊ è ýêñïðåññèîííûõ âåêòîðîâ. Âïåðâûå
ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû òðàíñôåêöèè êîðîòêîé
èíòåðôåðèðóþùåé ÐÍÊ, êîìïëåìåíòàðíîé ìÐÍÊ
ìóòèðîâàííîãî ãåíà ñóïåðîêñèääèñìóòàçû SOD1 ÷åëîâåêà,
â ìîòîíåéðîíû ïîÿñíè÷íîãî îòäåëà ñïèííîãî ìîçãà
òðàíñãåííûõ G93A ìûøåé. Ðàññìîòðåíî âîçìîæíîå
ïðèìåíåíèå ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûõ êëåòîê
ïóïîâèííîé êðîâè äëÿ òåðàïèè áîêîâîãî àìèîòðîôè÷åñêîãî
ñêëåðîçà.
Êëþ÷åâûå ñëîâà: áîêîâîé àìèîòðîôè÷åñêèé ñêëåðîç,
ñòâîëîâûå êëåòêè êðîâè ïóïîâèíû, êëåòî÷íàÿ òåðàïèÿ,
ãåíåòè÷åñêàÿ ìîäèôèêàöèÿ ñòâîëîâûõ êëåòîê.
ßÍ ÀÌÈÎÒÐÎÔÈß ÑÊËÅÐÎÇÛ: ÃÅÍ-ʌǕ Í• Ê
ÒÅÐÀÏÈßÑÅ ÑÒÐÀÒÅÃÈßÑÅ
Кñò•ì Ðîáåðò óëû Èñëàìîâ1, Àëüáåðò Àíàòîëüåâè÷
Ðèçâàíîâ1, 2, Àíäðåé Ïàâëîâè÷ Êèÿñîâ1, 3
1
Êàçàí ä•œë•ò ìåäèöèíà óíèâåðñèòåòû, ãèñòîëîãèÿ
êàôåäðàñû, 420012, Êàçàí ø•Ÿ•ðå, Áóòëåðîâ óðàìû, 49í÷û
éîðò, e-mail: rustem.islamov@gmail.com, 2Êàçàí ä•œë•ò
óíèâåðñèòåòû, òóôðàê-áèîëîãèÿ ôàêóëüòåòûíû• ãåíåòèêà
êàôåäðàñû, Êàçàí ø•Ÿ•ðå, Êðåìëü óðàìû, 18í÷å éîðò,
e-mail: rizvanov@gmail.com, 3Êàçàí ä•œë•ò ìåäèöèíà
óíèâåðñèòåòûíû• ê•œñ• êœç•í•êë•ðå áàíêû,
e-mail: kiassov@mail.ru
Àíòèì•ãúí• îëèãîíóêëåîòèäëàð, êûñêà èíòåðôåðèðëû
ðèáîíóêëåèí êèñëîòàñû (ÐÍÊ) Ÿ•ì ýêñïðåññ âåêòîðëàð
ÿðä•ìåíä• ÿñàëãàí ÿí àìèîòåðàïèÿñå ñêëåðîçûíû• ãåí
òåðàïèÿñå ì•ãúëœìàòëàðû ãîìóìèë•øòåðåëã•í. Êåøåíå•
êûñêà èíòåðôåðèðëû ÐÍÊ òðàíñôåêöèÿñå, SOD1
ñóïåðîêñèääèñìóòàçàñûíäàãû ìóòèðëàíãàí ãåíûíû•
êîìïëåìåíòàð ìÐÍÊñû, òû÷êàííàðíû• òðàíñãåíëû G93A
àðêà ìèåíå• áèë šëåøå ìîòîíåéðîíû í•òè••ë•ðå áåðåí÷å
òàïêûð êèòåðåëã•í.
Òšï òšøåí÷•ë•ð: ÿí àìèîòðîôèÿ ñêëåðîçû, êåíäåê
êàíûíû• ê•œñ• êœç•í•êë•ðå, êœç•í•ê òåðàïèÿñå, ê•œñ•
êœç•í•êë•ðåí ãåíåòèê ìîäèôèêàöèÿë•œ.
AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS:
STRATEGY IN GENE-STEM CELL THERAPY
Rustem R. Islamov1, Albert A. Rizvanov1,2,
Andrei P. Kiyasov1,3
1
Kazan State Medical University, histology hair, 420012,
Kazan, Butlerov street, 49, e-mail: rustem.islamov@gmail.com,
2
Kazan State University, chair of genetics of biology-soil
faculty, 2 Stem cell bank at Kazan State MedicalUniversity.
Kazan, Kremlevskaya street, 18, å-mail: kiassov@mail.ru
This review addresses latest results in gene therapy of
amyotrophic lateral sclerosis using antisense oligonucleotides,
siRNA and expression vectors. For the first time we present data
on transfection of siRNA complementary to human mutant SOD1
mRNA into motor neurons of lumbar spinal cord transgenic G93A
in mice. The use of genetically modified stem cells from umbilical
cord blood for cell therapy of amyotrophic lateral sclerosis has
been studied
Key words: amyotrophic lateral sclerosis, umbilical cord
blood stem cells, cell therapy, genetic modification of stem cells.
Á
îêîâîé àìèîòðîôè÷åñêèé ñêëåðîç îòíîñèòñÿ
ê ãðóïïå íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ çàáîëåâàíèé
ñ ïðîãðåññèðóþùåé ãèáåëüþ äâèãàòåëüíûõ
íåéðîíîâ ãîëîâíîãî è ñïèííîãî ìîçãà.
Çàáîëåâàíèå íåèçëå÷èìî, ëåòàëüíîñòü äîñòèãàåò
100%, ñðåäíÿÿ ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè — îêîëî
5 ëåò ñ ìîìåíòà óñòàíîâëåíèÿ äèàãíîçà. 50% ïàöèåíòîâ óìèðàþò â òå÷åíèå 3 ëåò. Èç 100 òûñÿ÷
íàñåëåíèÿ ñòðàäàþò îêîëî 5 ÷åëîâåê, êàæäûé ãîä
ðåãèñòðèðóþò îäèí íîâûé ñëó÷àé íà 100 òûñÿ÷
íàñåëåíèÿ. Ñðåäíèé âîçðàñò íà÷àëà çàáîëåâàíèÿ —
55 ëåò. Âåðîÿòíîñòü âîçíèêíîâåíèÿ óâåëè÷èâàåòñÿ
91
Ð.Ð. ÈÑËÀÌÎÂ, À.À. ÐÈÇÂÀÍÎÂ, À.Ï. ÊÈßÑÎÂ
ñ âîçðàñòîì. Ïðåîáëàäàþùèé ïîë — ìóæñêîé
(2:1). Ýòèîëîãèÿ è ïàòîãåíåç ãèáåëè íåéðîíîâ ïðè
íàèáîëåå ÷àñòîé (ñïîðàäè÷åñêîé) ôîðìå
çàáîëåâàíèÿ íåèçâåñòíû, íî ÷àñòü ñëó÷àåâ
ñåìåéíîé ôîðìû çàáîëåâàíèÿ îáóñëîâëåíà
äîìèíàíòíûìè ìóòàöèÿìè ãåíà SOD1 (21q22.1–
q22.2), êîäèðóþùåãî Cu/Zn–ñóïåðîêñèääèñìóòàçó
[44]. SOD1 — ãëàâíûé ôåðìåíò àíòèîêñèäàíòíîé
çàùèòû êëåòêè — ëîêàëèçóåòñÿ â ÿäðå, öèòîçîëå è
ìèòîõîíäðèÿõ. Ãîìîäèìåð ñîñòîèò èç äâóõ
ñóáúåäèíèö, êàæäàÿ èç êîòîðûõ ñîäåðæèò îäèí
Cu-ñâÿçûâàþùèé, îäèí Zn-ñâÿçûâàþùèé äîìåíû
è äèñóëüôèäíûé ìîñòèê. Èçâåñòíî áîëåå 100 ìóòàöèé ãåíà SOD1 — ýòî ïðåèìóùåñòâåííî
òî÷å÷íûå ìóòàöèè, õàðàêòåðèçóþùèåñÿ çàìåíîé
îäíîé àìèíîêèñëîòû èç 153 àìèíîêèñëîòíûõ
îñòàòêîâ áåëêà.
Çíà÷èòåëüíûé ïðîãðåññ â ïîíèìàíèè ìåõàíèçìîâ ðàçâèòèÿ çàáîëåâàíèÿ è ëå÷åíèÿ ñ ïîìîùüþ
ìîëåêóëÿðíûõ è êëåòî÷íûõ òåõíîëîãèé áûë
ïîëó÷åí â ýêñïåðèìåíòàõ íà òðàíñãåííûõ ìûøàõ
G93A, ýêñïðåññèðóþùèõ ìóòèðîâàííûé ãåí SOD1
÷åëîâåêà. Ó òàêèõ ìûøåé ðàçâèâàåòñÿ
ïðîãðåññèðóþùàÿ äåãåíåðàöèÿ äâèãàòåëüíûõ
íåéðîíîâ (êàê è ïðè ñåìåéíîé ôîðìå áîêîâîãî
àìèîòðîôè÷åñêîãî ñêëåðîçà ó ÷åëîâåêà) [19, 35, 40].
Ïîääåðæàíèå æèçíè íåéðîíîâ, âñòóïèâøèõ â
ïàòîëîãè÷åñêèé ïðîöåññ, è âîññòàíîâëåíèå
óòðà÷åííûõ ìåæêëåòî÷íûõ ñâÿçåé â íåðâíîé òêàíè
ìîãóò ñóùåñòâåííî ïîâûñèòü êà÷åñòâî è
ïðîäîëæèòåëüíîñòü
æèçíè
áîëüíûõ.
Ïåðñïåêòèâíûìè ìåòîäàìè ëå÷åíèÿ áîëüíûõ,
ñòðàäàþùèõ íåéðîäåãåíåðàòèâíûìè çàáîëåâàíèÿìè, ÿâëÿþòñÿ êîððåêöèÿ ýêñïðåññèè ãåíà,
îòâåòñòâåííîãî çà ðàçâèòèå çàáîëåâàíèÿ,
òðàíñïëàíòàöèÿ ñòâîëîâûõ êëåòîê, à òàêæå
ñî÷åòàíèå ãåííîé è êëåòî÷íîé òåðàïèè —
òðàíñïëàíòàöèÿ ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûõ
ñòâîëîâûõ êëåòîê.
Ìîäåëèðîâàíèå áîêîâîãî
àìèîòðîôè÷åñêîãî ñêëåðîçà
Ìóòàíòíûå ëèíèè æèâîòíûõ (â ïåðâóþ î÷åðåäü
ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûå ìûøè),
ïîëó÷åííûå ñ ïîìîùüþ òðàíñãåííûõ
òåõíîëîãèé, — óäîáíàÿ áèîëîãè÷åñêàÿ ìîäåëü äëÿ
èçó÷åíèÿ ïàòîãåíåçà çàáîëåâàíèé, ñâÿçàííûõ ñ
ìóòàöèåé èçâåñòíîãî ãåíà, à òàêæå äëÿ ðàçðàáîòêè
ìåòîäîâ ëå÷åíèÿ çàáîëåâàíèÿ, âûçâàííîãî
ìóòàöèåé äàííîãî ãåíà. Ëèíèÿ ìûøåé B6SJL-Tg
(SOD1-G93A)dl1Gur/J ñîçäàíà â ëàáîðàòîðèè Mark
E. Gurney ïðè Ñåâåðî-çàïàäíîì óíèâåðñèòåòå
ÑØÀ (Northwestern University, USA). Òðàíñãåííûå
92
ìûøè G93A ýêñïðåññèðóþò ìóòàíòíûé ãåí
÷åëîâåêà — Cu/Zn–ñóïåðîêñèääèñìóòàçó SOD1
(Gly93®Ala; ãëèöèí çàìåù¸í íà àëàíèí â ïîçèöèè
93). Ìûøè õàðàêòåðèçóþòñÿ ïðîãðåññèðóþùåé
äåãåíåðàöèåé ìîòîíåéðîíîâ, êàê ïðè áîêîâîì
àìèîòðîôè÷åñêîì ñêëåðîçå ÷åëîâåêà [19, 35, 40].
 ðåçóëüòàòå íåîáðàòèìîé äåãåíåðàöèè õîëèíåðãè÷åñêèõ íåéðîíîâ ñïèííîãî ìîçãà è ñòâîëà
ãîëîâíîãî ìîçãà æèâîòíûå óìèðàþò íà ôîíå
ïðîãðåññèðîâàíèÿ ïàðàëè÷à ñêåëåòíûõ ìûøö [19].
Ó ìûøåé G93A, ýêñïðåññèðóþùèõ ìóòàíòíûé
ãåí SOD1 [25], îïèñàíû 4 ïîñëåäîâàòåëüíûå ñòàäèè
çàáîëåâàíèÿ: 1) ïðåäøåñòâóþùàÿ ïîÿâëåíèþ
ìûøå÷íîé ñëàáîñòè; 2) áûñòðîãî ïðîãðåññèðîâàíèÿ, âî âðåìÿ êîòîðîé ðàçâèâàåòñÿ
ìûøå÷íàÿ ñëàáîñòü (áîëåå ÷åì 50% çà 2 íåäåëè);
3) ìåäëåííîãî ïðîãðåññèðîâàíèÿ, ïðîäîëæàþùàÿñÿ 4—11 íåäåëü; 4) ñòàäèÿ ïàðàëè÷à.
Ìûøè ñòàíîâÿòñÿ ïàðàëèçîâàííûìè íà îäíó èëè
áîëåå êîíå÷íîñòåé â âîçðàñòå 5—6 ìåñÿöåâ.
Áîëüøèíñòâî ìîòîíåéðîíîâ íå ïîãèáàåò âïëîòü äî
òåðìèíàëüíîé ñòàäèè çàáîëåâàíèÿ, êîòîðàÿ
íàáëþäàåòñÿ ïðèìåðíî ÷åðåç 9 íåäåëü îò íà÷àëà
áîëåçíè. Íà ñåãîäíÿøíèé äåíü ñîçäàíî íåñêîëüêî
ëèíèé òðàíñãåííûõ ìûøåé, îòëè÷àþùèõñÿ
òåìïàìè ðàçâèòèÿ è òÿæåñòüþ çàáîëåâàíèÿ. Ýòè
ïàðàìåòðû êîððåëèðóþò ñ êîëè÷åñòâîì êîïèé
ìóòàíòíîãî ãåíà, ýêñïðåññèðóþùèõñÿ ó ðàçíûõ
ëèíèé æèâîòíûõ. Òàê, ó æèâîòíûõ, èìåþùèõ
18 êîïèé ãåíà, çàáîëåâàíèå âîçíèêàåò
ïðèáëèçèòåëüíî íà 2—3 ìåñÿöà ïîçæå, ÷åì ó
ìûøåé, ó êîòîðûõ 25 êîïèé ìóòàíòíîãî ãåíà.
 ïèòîìíèê ïîäîïûòíûõ æèâîòíûõ «Ïóùèíî»
ïðè ôèëèàëå Èíñòèòóòà áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè
èì. àêàäåìèêà Ì.Ì. Øåìÿêèíà è àêàäåìèêà
Þ.À. Îâ÷èííèêîâà ÐÀÍ (ôèëèàë ÈÁÕ ÐÀÍ) ëèíèÿ
B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J ïîñòóïèëà â 2006 ã.
èç ïèòîìíèêà The Jackson Laboratory (USA) íà
ñðåäñòâà ïî ãîñóäàðñòâåííîìó êîíòðàêòó
¹ 02.442.11.7319 (2006-ÐÈ-19.0/001/320).
Ïî äîãîâîðó ñ Êàçàíñêèì ãîñóäàðñòâåííûì
óíèâåðñèòåòîì ïèòîìíèê «Ïóùèíî» îòâå÷àåò çà
ïîääåðæàíèå ëèíèè è ïðîèçâîäñòâî òðàíñãåííûõ
ìûøåé
B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J.
Âåòåðèíàðíîå ñâèäåòåëüñòâî, âûäàííîå
ïèòîìíèêîì ïîäîïûòíûõ æèâîòíûõ «Ïóùèíî»,
ïîäòâåðæäàåò êà÷åñòâî ïîëó÷åííûõ æèâîòíûõ è
èõ ïðèãîäíîñòü äëÿ ýêñïåðèìåíòàëüíûõ
èññëåäîâàíèé. Ïðîòîêîë ãåíîòèïèðîâàíèÿ
(ïîëèìåðàçíàÿ öåïíàÿ ðåàêöèÿ — ÏÖÐ
ñ èñïîëüçîâàíèåì ñïåöèôè÷åñêèõ ïðàéìåðîâ)
îïóáëèêîâàí íà ñàéòå «The Jackson Laboratory».
ÁÎÊÎÂÎÉ ÀÌÈÎÒÐÎÔÈ×ÅÑÊÈÉ ÑÊËÅÐÎÇ: ÑÒÐÀÒÅÃÈß ÃÅÍÍÎ-ÊËÅÒÎ×ÍÎÉ ÒÅÐÀÏÈÈ
Äëÿ ãåíîòèïèðîâàíèÿ îáðàçöû òêàíåé èç
ïèòîìíèêà «Ïóùèíî» íàïðàâëÿþòñÿ â Èíñòèòóò
ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè èì. Â.À. Ýíãåëüãàðäòà
ÐÀÍ (ÈÌÁ ÐÀÍ). Ãåíîòèïèðîâàíèå îñóùåñòâëÿåòñÿ â ëàáîðàòîðèè ìîëåêóëÿðíîé èììóíîëîãèè
ÈÌÁ ÐÀÍ ïîä ðóêîâîäñòâîì äîêò. áèîë. íàóê
Ä.Â. Êóïðàøà.
Ïðè÷èíû ãèáåëè ìîòîíåéðîíîâ
ïðè ìóòàöèè ãåíà SOD1
Ìåõàíèçìû, ïðèâîäÿùèå ê ãèáåëè íåéðîíîâ
ïðè ìîäåëèðîâàíèè áîêîâîãî àìèîòðîôè÷åñêîãî
ñêëåðîçà, îñòàþòñÿ íåÿñíûìè. Â íàñòîÿùåå âðåìÿ
ñóùåñòâóåò ðÿä ïðåäïîëîæåíèé, ñîãëàñíî êîòîðûì
õîëèíåðãè÷åñêèå ìîòîíåéðîíû ñïèííîãî ìîçãà è
ñòâîëà ãîëîâíîãî ìîçãà âñòóïàþò â àïîïòîç.
Öèòîòîêñè÷åñêîå äåéñòâèå ìóòàíòíîãî SOD1
ìîæåò áûòü îáóñëîâëåíî îëèãîìåðèçàöèåé áåëêîâ
â âûñîêîìîëåêóëÿðíûå ñòðóêòóðû, ïîâûøåííîé
ïåðîêñèäàçíîé àêòèâíîñòüþ ôåðìåíòà, à òàêæå
ïðîäóêöèåé ïåðîêñèíèòðèòà (ONOO–) [6, 11, 24,
26, 49]. Âçàèìîäåéñòâèå ìóòàíòíîãî áåëêà ñ
ìèòîõîíäðèÿìè, áåëêàìè öèòîñêåëåòà èëè
øàïåðîíàìè ïðèâîäèò ê ãèáåëè ìîòîíåéðîíîâ
ïóò¸ì àïîïòîçà. Èíûìè ñëîâàìè, ïîâðåæäàþùåå
äåéñòâèå SOD1 íà ìèòîõîíäðèè âûçûâàåò íå
òîëüêî èõ äèñôóíêöèþ, íî è àêòèâèðóåò ìèòîõîíäðèàëüíûé ïóòü àïîïòîçà â ìîòîíåéðîíàõ [15].
Âàæíóþ ðîëü â ïàòîãåíåçå ìíîãèõ
íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ çàáîëåâàíèé èãðàþò
ñòðóêòóðíî-ôóíêöèîíàëüíûå èçìåíåíèÿ â àêñîíàõ,
â ÷àñòíîñòè íàðóøåíèÿ àêñîííîãî òðàíñïîðòà.
Íàêîïëåííûå çà ïîñëåäíåå âðåìÿ äîêàçàòåëüñòâà
îá óíèôèöèðîâàííûõ ìîëåêóëÿðíûõ ìåõàíèçìàõ
ðàçâèòèÿ ìíîãèõ ìåäëåííî ïðîãðåññèðóþùèõ
íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ çàáîëåâàíèé ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî íàðóøåíèÿ àêñîííîãî
òðàíñïîðòà — ñóùåñòâåííûé êîìïîíåíò
ïàòîãåíåçà ãèáåëè íåéðîíîâ (íàðÿäó ñ íàêîïëåíèåì
àáåððàíòíûõ áåëêîâ, îáðàçîâàíèåì ïðîòîôèáðèëë,
äèñôóíêöèåé óáèêâèòèíçàâèñèìîãî ïðîòåîëèçà,
îêèñëèòåëüíûì ñòðåññîì, ïîâðåæäåíèåì
ìèòîõîíäðèé è äð.). Â íîðìå ïðîäóêò ýêñïðåññèè
SOD1 òðàíñëèðóåòñÿ íå òîëüêî â ïåðèêàðèîíå, íî
è â àêñîïëàçìå, à ïîòîì òðàíñïîðòèðóåòñÿ â ñîñòàâå
ìåäëåííîãî àíòåðîãðàäíîãî òðàíñïîðòà [4, 36]. Ïîâèäèìîìó, àáåððàíòíûé SOD1 íàêàïëèâàåòñÿ â
àêñîíå è ïðåïÿòñòâóåò äâèæåíèþ ìàêðîìîëåêóë,
â ÷àñòíîñòè ïîëèìåðîâ òóáóëèíà ïî àêñîíó [47].
Ïðè ýòîì ïîäàâëåíèå ýêñïðåññèè ãåíà,
êîäèðóþùåãî ë¸ãêèé áåëîê (70 êÄ)
íåéðîôèëàìåíòíîãî òðèïëåòà NF-L ó SOD1-ìóòàíòíûõ ìûøåé, ïðîäëåâàåò âðåìÿ æèçíè
æèâîòíûõ ïîñëå âîçíèêíîâåíèÿ ïåðâûõ
ñèìïòîìîâ çàáîëåâàíèÿ, ÷òî ñâÿçàíî ñ
óìåíüøåíèåì íàãðóçêè íà òðàíñïîðòíûå ïîòîêè â
àêñîíå [46]. Ïîõîæèå íàðóøåíèÿ àêñîííîãî
òðàíñïîðòà âûÿâëåíû ó ìóòàíòíûõ ìûøåé,
èçáûòî÷íî ýêñïðåññèðóþùèõ òÿæ¸ëûé áåëîê
(210 êÄ) íåéðîôèëàìåíòíîãî òðèïëåòà ÷åëîâåêà
NF–H [12, 13].
Ãåííàÿ òåðàïèÿ áîêîâîãî
àìèîòðîôè÷åñêîãî ñêëåðîçà
Ëå÷åíèå íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ çàáîëåâàíèé,
ïàòîãåíåç êîòîðûõ îáóñëîâëåí ìóòàöèÿìè
êîíêðåòíûõ ãåíîâ, òðåáóåò âìåøàòåëüñòâî â
îðãàíèçì áîëüíîãî íà ãåíåòè÷åñêîì óðîâíå. Ãåííàÿ
òåðàïèÿ ïîçâîëÿåò êàê ïîäàâèòü, òàê è óñèëèòü
ýêñïðåññèþ ãåíà-ìèøåíè. Â íàñòîÿùåå âðåìÿ äëÿ
êîððåêöèè ýêñïðåññèè ãåíà-ìèøåíè ñóùåñòâóåò
ðÿä ïîäõîäîâ (íàïðèìåð, àíòèñìûñëîâûå
îëèãîíóêëåîòèäû, ýêñïðåññèîííûå âåêòîðû, ÐÍÊèíòåðôåðåíöèÿ); íåêîòîðûå èç ïîäõîäîâ íàõîäÿòñÿ
â ñòàäèè ýêñïåðèìåíòîâ, òîãäà êàê äðóãèå óæå
ïðîõîäÿò êëèíè÷åñêèå èñïûòàíèÿ.
Àíòèñìûñëîâûå îëèãîíóêëåîòèäû. Îäèí èç
ïåðâûõ ìåòîäîâ âìåøàòåëüñòâà â ýêñïðåññèþ
ãåíà — ïðèìåíåíèå àíòèñìûñëîâûõ îëèãîíóêëåîòèäîâ, ò.å. îäíîöåïî÷å÷íûõ ÄÍÊ èëè
ÐÍÊ, êîìïëåìåíòàðíî âçàèìîäåéñòâóþùèõ ñ
ìÐÍÊ-ìèøåíüþ. Àíòèñìûñëîâàÿ ÐÍÊ ïðåïÿòñòâóåò òðàíñëÿöèè áåëêà, òîãäà êàê
àíòèñìûñëîâàÿ ÄÍÊ îáðàçóåò ãèáðèä ÄÍÊ/ÐÍÊ,
êîòîðûé ðàçðóøàåòñÿ ÐÍÊàçîé Í. Ñîçäàíèå
àíòèñìûñëîâûõ îëèãîíóêëåîòèäîâ ïåðâîíà÷àëüíî
áûëî íàïðàâëåíî íà áëîêèðîâàíèå ìÐÍÊ
òåëîìåðàçû, èìåþùåé âûñîêóþ àêòèâíîñòü â
îïóõîëåâûõ êëåòêàõ. Ïðèìåíèòåëüíî ê
íåéðîäåãåíåðàòèâíûì çàáîëåâàíèÿì òåõíîëîãèÿ
àíòèñìûñëîâûõ îëèãîíóêëåîòèäîâ èìååò
ïðàêòè÷åñêîå çíà÷åíèå ïðè çàáîëåâàíèÿõ,
âûçâàííûõ ìóòàöèÿìè êîíêðåòíûõ ãåíîâ. Òàê, ïðè
ââåäåíèè òðàíñãåííûì ìûøàì G93A,
ýêñïðåññèðóþùèì
ôåíîòèï
áîêîâîãî
àìèîòðîôè÷åñêîãî ñêëåðîçà, àíòèñìûñëîâûõ
îëèãîíóêëåîòèäîâ, êîìïëåìåíòàðíûõ ìÐÍÊ
ñóïåðîêñèääèñìóòàçû SOD1 ïðîèñõîäèëî
çíà÷èòåëüíîå ñíèæåíèå ñîäåðæàíèÿ ìÐÍÊ SOD1
è áåëêà SOD1 â òêàíÿõ ãîëîâíîãî è ñïèííîãî ìîçãà.
Êðîìå òîãî, ó òàêèõ ìûøåé íàáëþäàëè
çàìåäëåííîå ðàçâèòèå ñèìïòîìîâ çàáîëåâàíèÿ [42].
ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèÿ. Â 2006 ã. çà îòêðûòèå
ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèè Andrew Z. Fire èç
Ñòàíôîðäñêîãî óíèâåðñèòåòà è Craig C. Mello èç
Ìàññà÷óñåòñêîãî óíèâåðñèòåòà áûëè óäîñòîåíû
93
Ð.Ð. ÈÑËÀÌÎÂ, À.À. ÐÈÇÂÀÍÎÂ, À.Ï. ÊÈßÑÎÂ3
Íîáåëåâñêîé ïðåìèè. ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèÿ —
ýâîëþöèîííî êîíñåðâàòèâíûé ìåõàíèçì
ïîñòòðàíñêðèïöèîííîé áëîêàäû ñèíòåçà áåëêà.
Êîìïëåìåíòàðíîå âçàèìîäåéñòâèå êîðîòêîé
èíòåðôåðèðóþùåé ÐÍÊ (siRNA) â ñîñòàâå
êîìïëåêñà RISC (RNA induced silencing complex)
ñ ìÐÍÊ-ìèøåíüþ çàêàí÷èâàåòñÿ äåãðàäàöèåé
ìÐÍÊ è êàê ñëåäñòâèå ïðåêðàùåíèåì ñèíòåçà
áåëêà. Ñïîñîáíîñòü siRNA â êóëüòóðå êëåòîê è íà
ìîäåëÿõ áîëåçíåé ÷åëîâåêà ó æèâîòíûõ
èíèöèèðîâàòü ïîñòòðàíñêðèïöèîííîå «ìîë÷àíèå»
ãåíîâ, àññîöèèðîâàííûõ ñ êîíêðåòíûìè
çàáîëåâàíèÿìè, îïðåäåëèëà íîâîå íàïðàâëåíèå â
ãåííîé òåðàïèè. Ñîâåðøåíñòâîâàíèå ñïîñîáîâ
äîñòàâêè ìîëåêóëû siRNA â êëåòêó è
ïîòåíöèàëüíàÿ âîçìîæíîñòü ëàáîðàòîðíîãî
ñèíòåçà
âûñîêîñïåöèôè÷íîé
siRNA,
êîìïëåìåíòàðíîé ëþáîé èçâåñòíîé ìÐÍÊ,
îòêðûâàåò øèðîêèå ïåðñïåêòèâû ïðèìåíåíèÿ
ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèè â ëå÷åíèè èíôåêöèîííûõ,
îíêîëîãè÷åñêèõ è íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ
çàáîëåâàíèé (áîêîâîé àìèîòðîôè÷åñêèé ñêëåðîç,
õîðåÿ Õàíòèíãòîíà, áîëåçíü Àëüöãåéìåðà). Ïðè
ñêðåùèâàíèè òðàíñãåííûõ SOD1-ìûøåé ñ
ìûøàìè, ýêñïðåññèðóþùèìè àíòè-SOD1 siRNA,
ó ïîòîìñòâà òðàíñêðèïöèÿ siRNA, êîìïëåìåíòàðíîé ìÐÍÊ ìóòèðîâàííîãî ãåíà,
ïðåäîòâðàùàëà äåãåíåðàöèþ ìîòîíåéðîíîâ [41].
Âíóòðèìûøå÷íàÿ [38] èëè èíòðàñïèíàëüíàÿ [39]
èíúåêöèÿ âèðóñíîãî âåêòîðà, ýêñïðåññèðóþùåãî
siRNA (êîìïëåìåíòàðíîé ìÐÍÊ ìóòèðîâàííîãî
SOD1) òðàíñãåííûì G93A-ìûøàì, ïðèîñòàíàâëèâàëî íà÷àëî çàáîëåâàíèÿ è çíà÷èòåëüíî
óâåëè÷èâàëî âðåìÿ æèçíè G93A-ìûøåé.
Ïîëó÷åííûå íàìè ðåçóëüòàòû ñâèäåòåëüñòâóþò,
÷òî siRNA ìîæåò ðåòðîãðàäíî òðàíñïîðòèðîâàòüñÿ
ïî àêñîíàì ìîòîíåéðîíîâ è ñåëåêòèâíî
áëîêèðîâàòü ýêñïðåññèþ áåëêà-ìèøåíè [33]. Íàìè
âïåðâûå áûëà âûïîëíåíà òðàíñôåêöèÿ siRNA â
àêñîíû ìîòîíåéðîíîâ ïîÿñíè÷íîãî îòäåëà
ñïèííîãî ìîçãà ìûøåé G93A ïóò¸ì àïïëèêàöèè
siRNA, êîìïëåìåíòàðíîé ìÐÍÊ ìóòàíòíîãî ãåíà
÷åëîâåêà SOD1, íà öåíòðàëüíûé îòðåçîê
ïåðåðåçàííîãî ñåäàëèùíîãî íåðâà (ðèñ. 1). ×åðåç
24 ÷àñà ïîñëå îïåðàöèè áûëà èçó÷åíà ýêñïðåññèÿ
ìÐÍÊ SOD1 â ïîÿñíè÷íîì îòäåëå ñïèííîãî ìîçãà
ñ ïîìîùüþ ÏÖÐ â ðåàëüíîì âðåìåíè. Êîëè÷åñòâî
ìÐÍÊ SOD1 â ñïèííîì ìîçãå íà îïåðèðîâàííîé
ñòîðîíå ïîñëå àïïëèêàöèè ôóíêöèîíàëüíîé siRNA
ñòàëî â äâà ðàçà íèæå, ÷åì â êîíòðëàòåðàëüíîé
ñòîðîíå. Ïîñëå àïïëèêàöèè êîíòðîëüíîé siRNA
óðîâåíü ìÐÍÊ SOD1 íà îïåðèðîâàííîé è
94
Ðèñ. 1. Àïïëèêàöèÿ êîðîòêîé èíòåðôåðèðóþùåé ÐÍÊ,
êîìïëåìåíòàðíîé ìÐÍÊ ìóòèðîâàííîãî ãåíà
ñóïåðîêñèääèñìóòàçû SOD1 ÷åëîâåêà, íà öåíòðàëüíûå
íåðâíûå îòðîñòêè ïåðåðåçàííîãî ñåäàëèùíîãî íåðâà
òðàíñãåííûõ G93A ìûøåé. L4–L5 — ñåãìåíòû
ñïèííîãî ìîçãà.
êîíòðëàòåðàëüíîé ñòîðîíàõ íå ðàçëè÷àëñÿ. Òàêèì
îáðàçîì, siRNA ïóò¸ì èíòåðíàëèçàöèè ïîïàäàåò
â àêñîíû ìîòîíåéðîíîâ, ðåòðîãðàäíî
òðàíñïîðòèðóåòñÿ â ïåðèêàðèîíû è áëîêèðóåò
òðàíñëÿöèþ àáåððàíòíîãî SOD1. Äëÿ áîëüøåé
ýôôåêòèâíîñòè çàõâàòà è ðåòðîãðàäíîãî
òðàíñïîðòà siRNA ìîæåò áûòü êîíúþãèðîâàíà
(íàïðèìåð, ñ íåéðîòðîôèíîì-3 èëè Ñ-ôðàãìåíòîì
ñòîëáíÿ÷íîãî òîêñèíà). Äàëåå ïóò¸ì èíúåêöèè â
îðãàíû êîíúþãèðîâàííàÿ siRNA ìîæåò áûòü
öåëåíàïðàâëåííî äîñòàâëåíà â ïåðèêàðèîíû
íåéðîíîâ, èííåðâèðóþùèõ ýòè îðãàíû, ÷òî
ÿâëÿåòñÿ àëüòåðíàòèâîé âåêòîðíîé òðàíñôåêöèè
íåðâíûõ êëåòîê.
Ýêñïðåññèîííûå âåêòîðû. Îäíèì èç
ïåðñïåêòèâíûõ ìåòîäîâ äîñòàâêè ãåíåòè÷åñêîãî
ìàòåðèàëà ê ìèøåíÿì ÿâëÿþòñÿ íåâèðóñíûå è
âèðóñíûå âåêòîðû. Íåîòúåìëåìàÿ ÷àñòü âåêòîðà —
íàëè÷èå ýêñïðåññèîííîé êàññåòû, îáû÷íî
ñîñòîÿùåé èç ïðîìîòîðà, ðåêîìáèíàíòíîãî ãåíà è
ñèãíàëà äëÿ òåðìèíèðîâàíèÿ è ïîëèàäåíèëèðîâàíèÿ ìÐÍÊ. Ñ ïîìîùüþ ìåòîäîâ ãåííîé
èíæåíåðèè ìîæíî ñîçäàòü ãåíåòè÷åñêèå âåêòîðû,
ýêñïðåññèðóþùèå ëþáûå ðåêîìáèíàíòíûå ãåíû.
 íàñòîÿùåå âðåìÿ ïðèìåíÿþò ýêñïðåññèîííûå
âåêòîðû íà îñíîâå ðàçëè÷íûõ âèðóñîâ
(àäåíîâèðóñû, àäåíî-àññîöèèðîâàííûå âèðóñû,
ãåðïåñâèðóñû, ðåòðîâèðóñû) è ïëàçìèä.
Ðåòðîâèðóñû äëÿ ãåííîé òåðàïèè íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ çàáîëåâàíèé ïðèìåíÿþò äëÿ äîñòàâêè
ðàçíûõ ôàêòîðîâ ðîñòà è íåéðîòðîôè÷åñêèõ
ÁÎÊÎÂÎÉ ÀÌÈÎÒÐÎÔÈ×ÅÑÊÈÉ ÑÊËÅÐÎÇ: ÑÒÐÀÒÅÃÈß ÃÅÍÍÎ-ÊËÅÒÎ×ÍÎÉ ÒÅÐÀÏÈÈ
ôàêòîðîâ [37], òàê êàê ïðè áîëåçíÿõ Àëüöãåéìåðà,
Ïàðêèíñîíà, Õàíòèíãòîíà è ïðè áîêîâîì
àìèîòðîôè÷åñêîì ñêëåðîçå â ÖÍÑ ñíèæàåòñÿ
ýêñïðåññèÿ íåéðîòðîôè÷åñêèõ ôàêòîðîâ. Òàê, ïðè
èíôèöèðîâàíèè òðàíñãåííûõ ìûøåé G93A
âèðóñíûì âåêòîðîì, ýêñïðåññèðóþùèì VEGF [2]
èëè IGF-1 [23], ñóùåñòâåííî ïðèîñòàíàâëèâàëîñü
ðàçâèòèå
çàáîëåâàíèÿ
è
çíà÷èòåëüíî
óâåëè÷èâàëîñü âðåìÿ æèçíè ìûøåé. È â òî æå
âðåìÿ ïðè êëèíè÷åñêèõ èñïûòàíèÿõ íå íàøëè
ïîëîæèòåëüíîãî ýôôåêòà [14, 50].
Ðèñ. 2. Äâóõêàññåòíàÿ ýêñïðåññèîííàÿ ïëàçìèäà pBud
CE4.1, îäíîâðåìåííî ýêñïðåññèðóþùàÿ êëîíèðîâàííûå
íåéðàëüíóþ ìîëåêóëó àäãåçèè L1 è ñîñóäèñòûé
ýíäîòåëèàëüíûé ôàêòîð ðîñòà VEGF.
Íàìè íà îñíîâå ïëàçìèäíîãî âåêòîðà pcDNA3.1
áûëè ïîëó÷åíû ãåíåòè÷åñêèå êîíñòðóêöèè,
ýêñïðåññèðóþùèå ðàçëè÷íûå ãåíû ÷åëîâåêà:
ýðèòðîïîýòèíà (pcDNA-EPO), àíòèàïîïòîçíîãî
áåëêà (pcDNA-Bcl2), ìîëåêóëû íåéðàëüíîé àäãåçèè
L1 (pcDNA-hL1CAM), ñîñóäèñòîãî ýíäîòåëèàëüíîãî ôàêòîðà ðîñòà (pcDNA-VEGF121,
pcDNA-VEGF165, pcDNA-VEGF189), ôàêòîðà
ðîñòà ôèáðîáëàñòîâ (pcDNA-FGF2). Äëÿ
ïîâûøåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè äîñòàâêè êîìáèíàöèé
òåðàïåâòè÷åñêèõ ãåíîâ â êëåòêè-ìèøåíè ìû
ïðèìåíèëè äâóõêàññåòíóþ ýêñïðåññèîííóþ
ïëàçìèäó pBud CE4.1, êîòîðàÿ ïîçâîëÿåò
îäíîâðåìåííî è íåçàâèñèìî ýêñïðåññèðîâàòü äâà
ðåêîìáèíàíòíûõ ãåíà. Ìû âïåðâûå ïîëó÷èëè
ïëàçìèäó pBud-VEGF-L1CAM, ýêñïðåññèðóþùóþ
ìîëåêóëó íåéðàëüíîé àäãåçèè L1 äëÿ ïîâûøåíèÿ
òðîïíîñòè òðàíñôåöèðîâàííûõ êëåòîê ê íåðâíîé
òêàíè è VEGF165, îáëàäàþùóþ ÿðêî
âûðàæåííûìè àíãèîãåííûìè è íåéðîïðîòåêòîðíûìè ñâîéñòâàìè (ðèñ. 2).
Ãåííî-êëåòî÷íàÿ òåðàïèÿ áîêîâîãî
àìèîòðîôè÷åñêîãî ñêëåðîçà
Òðàíñïëàíòàöèþ ñòâîëîâûõ, ïðîãåíèòîðíûõ è
äèôôåðåíöèðîâàííûõ êëåòîê àêòèâíî èññëåäóþò
êàê ñïîñîá äîñòàâêè â ïîâðåæä¸ííóþ òêàíü
òðîôè÷åñêèõ ôàêòîðîâ è ìîëåêóë àäãåçèè, êîòîðûå
ïîääåðæèâàþò â òêàíè ðåöèïèåíòà âûæèâàíèå
íåéðîíîâ, îáåñïå÷èâàþò ðåãåíåðàöèþ óòðà÷åííûõ
êëåòîê è âîññòàíîâëåíèå ìåæêëåòî÷íûõ êîíòàêòîâ.
Ïðè ýòîì âðÿä ëè ìîæíî ðàññ÷èòûâàòü íà
çàìåùåíèå ïîãèáøèõ íåéðîíîâ òðàíñïëàíòèðîâàííûìè êëåòêàìè. Ñ÷èòàåòñÿ, ÷òî â
òàêñîíîìè÷åñêîì ðÿäó íà äîëþ îòðîñòêîâ,
ôîðìèðóþùèõ àññîöèàòèâíûå, êîìèññóðàëüíûå è
ïðîåêöèîííûå âîëîêíà, ïðèõîäèòñÿ îòíîñèòåëüíî
áóëüøèé îáú¸ì ìîçãà. Òàê, áåëîå âåùåñòâî
ñîñòàâëÿåò 5% îò êîðêîâîé ìàíòèè ó êðûñ, 35% ó
ïðèìàòîâ è 45% ó ÷åëîâåêà [17]. Ïîä÷åðêí¸ì, ÷òî
â êîíòåêñòå íåâðîëîãè÷åñêèõ áîëåçíåé ãëàâíûå
òåðàïåâòè÷åñêèå ìåðîïðèÿòèÿ äîëæíû áûòü
íàïðàâëåíû íà ïåðèêàðèîíû, à íå íà îòðîñòêè
íåðâíûõ êëåòîê. Ïîýòîìó òðàíñïëàíòèðóåìûå
êëåòêè äîëæíû îáåñïå÷èâàòü âûæèâàíèå íåðâíûõ
êëåòîê ðåöèïèåíòà, ïðåäîòâðàùàòü âòîðè÷íóþ
äåãåíåðàöèþ íåéðîíîâ, ïîääåðæèâàòü ðîñò
íåðâíûõ âîëîêîí è âîññòàíàâëèâàòü óòðà÷åííûå
ìåæíåéðîííûå ñâÿçè.
Ýêñïåðèìåíòàëüíîå îáîñíîâàíèå âûáîðà êëåòîê
ÿâëÿåòñÿ àêòóàëüíîé çàäà÷åé äëÿ óëó÷øåíèÿ
ðåçóëüòàòîâ ðåãåíåðàöèîííîé ìåäèöèíû.
Âîçìîæíîñòè êëåòî÷íîé òåðàïèè â ÖÍÑ
èíòåíñèâíî èçó÷àþòñÿ äëÿ ïðåîäîëåíèÿ
ïîñòòðàâìàòè÷åñêèõ è ïîñòèøåìè÷åñêèõ äåôåêòîâ
íåðâíîé òêàíè, à òàêæå äëÿ ëå÷åíèÿ íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ çàáîëåâàíèé. Äëÿ íåéðîòðàíñïëàíòàöèè øèðîêî ïðèìåíÿþò ýìáðèîíàëüíûå
ñòâîëîâûå êëåòêè, ñòâîëîâûå ìåçåíõèìíûå êëåòêè
êîñòíîãî ìîçãà, ñòâîëîâûå êëåòêè ïóïîâèííîé
êðîâè. Áîëåå ïåðñïåêòèâíû â ýòîì ñìûñëå
ñòâîëîâûå êëåòêè ïóïîâèííîé êðîâè. Îñíîâàíèåì
äëÿ òðàíñïëàíòàöèè ýòèõ êëåòîê ñ öåëüþ
ñòèìóëÿöèè ðåãåíåðàöèè íåðâíîé òêàíè ÿâëÿþòñÿ
èõ ïðèãîäíîñòü êàê äëÿ àëëî-, òàê è äëÿ
àóòîòðàíñïëàíòàöèè ó ÷åëîâåêà, èõ íèçêàÿ
èììóíîãåííîñòü, äîñòóïíîñòü, ïðîñòîòà ïîëó÷åíèÿ
è õðàíåíèÿ. Íåìàëîâàæíî è îòñóòñòâèå ýòè÷åñêèõ
è ðåëèãèîçíûõ ïðîòèâîðå÷èé, ñâÿçàííûõ ñ
èñïîëüçîâàíèåì ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ
êëåòîê. Â ïóïîâèííîé êðîâè ïðèñóòñòâóþò
ñòâîëîâûå êëåòêè, ñïîñîáíûå äàâàòü íà÷àëî
ñïåöèàëèçèðîâàííûì êëåòêàì ðàçíûõ òêàíåé.
Ê íàñòîÿùåìó âðåìåíè îõàðàêòåðèçîâàíû
95
Ð.Ð. ÈÑËÀÌÎÂ, À.À. ÐÈÇÂÀÍÎÂ, À.Ï. ÊÈßÑÎÂ
âûäåëåííûå èç ïóïîâèííîé êðîâè ñòâîëîâàÿ
êðîâåòâîðíàÿ êëåòêà (CD34, CD31, CD59, Sca-1,
Thy1, Oct-4, Nanog, SOX2, FGF-4), ñòâîëîâàÿ
ìåçåíõèìíàÿ êëåòêà, ïðîãåíèòîðíàÿ ýíäîòåëèàëüíàÿ êëåòêà (CD34, GATA2, Flk-1); êëåòêà
SP (side population), ñïîñîáíàÿ äèôôåðåíöèðîâàòüñÿ â ìèîãåííîì è êðîâåòâîðíîì íàïðàâëåíèÿõ, à òàêæå êëåòêè, ýêñïðåññèðóþùèå
ñïåöèôè÷åñêèå CD-ìàðê¸ðû è äàþùèå íà÷àëî
ðàçíûì êëåòî÷íûì òèïàì. Òàê, ñòâîëîâàÿ êðîâåòâîðíàÿ êëåòêà ìîæåò âûõîäèòü èç êðîâîòîêà è
çàñåëÿòü ñåðäöå, ãîëîâíîé ìîçã, ïå÷åíü èëè
ñêåëåòíûå ìûøöû. Äàëåå â çàâèñèìîñòè îò
ìèêðîîêðóæåíèÿ ñòâîëîâàÿ êðîâåòâîðíàÿ êëåòêà
ìîæåò äèôôåðåíöèðîâàòüñÿ â ìèîáëàñòû ñêåëåòíîé è ñåðäå÷íîé ìûøå÷íîé òêàíè, ãåïàòîöèòû,
ýíäîòåëèàëüíûå êëåòêè ñîñóäîâ, íåéðîíû,
îëèãîäåíäðîöèòû, àñòðîöèòû [5, 21, 29, 30, 31, 32].
Ïîñëå ïîäòâåðæäåíèÿ òðàíñäèôôåðåíöèðîâêè
ñòâîëîâîé êðîâåòâîðíîé êëåòêè è ñòâîëîâîé
ìåçåíõèìíîé êëåòêè â íåéðàëüíîì íàïðàâëåíèè
íà÷àëèñü èíòåíñèâíûå èññëåäîâàíèÿ íåéðîòðàíñïëàíòàöèè ýòèõ êëåòîê â ýêñïåðèìåíòå.
Òðàíñïëàíòàöèÿ ïóïîâèííûõ êëåòîê êðîâè
÷åëîâåêà òðàíñãåííûì ìûøàì G93A ïðîäëåâàëà
èõ æèçíü, à òåðàïåâòè÷åñêèé ýôôåêò çàâèñåë îò
êîëè÷åñòâà òðàíñïëàíòèðîâàííûõ êëåòîê [10, 16].
Áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ââåä¸ííûå âíóòðèâåííî êëåòêè
ïóïîâèííîé êðîâè ìèãðèðîâàëè ïðåèìóùåñòâåííî
â ìåñòà äåãåíåðàöèè íåðâíîé òêàíè, õîòÿ ýòè
êëåòêè òàêæå áûëè îáíàðóæåíû è â äðóãèõ îðãàíàõ
[18]. Êðîìå òîãî, áûëî óñòàíîâëåíî, ÷òî
òðàíñïëàíòèðîâàííûå
êëåòêè
÷åëîâåêà
ýêñïðåññèðîâàëè íåéðîíàëüíûå ìàðê¸ðû
(íàïðèìåð, íåñòèí, íåéðîíàëüíàÿ ôîðìà
β-òóáóëèíà TuJ1, ãëèàëüíûé ôèáðèëëÿðíûé
êèñëûé áåëîê GFAP). Ïðè ìîäåëèðîâàíèè
èíñóëüòà ó êðûñ òðàíñïëàíòàöèÿ êëåòîê
ïóïîâèííîé êðîâè óìåíüøàëà êëèíè÷åñêèå
ïðîÿâëåíèÿ èøåìèè ìîçãà [8]. Òàêèì îáðàçîì,
âìåñòå ñ ïîÿâëåíèåì äîêàçàòåëüíûõ ýêñïåðèìåíòîâ
ïî ýôôåêòèâíîñòè òðàíñïëàíòàöèè êëåòîê
ïóïîâèííîé êðîâè æèâîòíûì ñ ôåíîòèïîì
íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ çàáîëåâàíèé ÷åëîâåêà,
íàðÿäó ñ êëèíè÷åñêèìè èñïûòàíèÿìè ïî
àóòîòðàíñïëàíòàöèè CD34 ïîçèòèâíûõ êëåòîê
ïåðèôåðè÷åñêîé êðîâè áîëüíûì àìèîòðîôè÷åñêèì
ëàòåðàëüíûì ñêëåðîçîì áåç âèäèìîãî óëó÷øåíèÿ,
ñòàíîâèòñÿ î÷åâèäíûì, ÷òî ïðèìåíåíèå ñòâîëîâûõ
êëåòîê ïóïîâèííîé êðîâè ÿâëÿåòñÿ îäíèì èç
ïåðñïåêòèâíûõ íàïðàâëåíèé â êëåòî÷íîé òåðàïèè
íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ çàáîëåâàíèé.
96
Äëÿ ïîâûøåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè íåéðîòðàíñïëàíòàöèè è ñ öåëüþ äîñòàâêè â îáëàñòü
íåéðîäåãåíåðàöèè ôàêòîðîâ, ïîääåðæèâàþùèõ
âûæèâàíèå íåéðîíîâ, â íàñòîÿùåå âðåìÿ àêòèâíî
èññëåäóþò âîçìîæíîñòè ïðèìåíåíèÿ ãåíåòè÷åñêè
ìîäèôèöèðîâàííûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê, ýêñïðåññèðóþùèõ òåðàïåâòè÷åñêèå ãåíû. Ñòâîëîâûå êëåòêè,
ýêñïðåññèðóþùèå êëîíèðîâàííûé ãåí, ìîãóò
çíà÷èòåëüíî óñèëèòü òåðàïåâòè÷åñêèé ýôôåêò
òðàíñïëàíòèðîâàííûõ êëåòîê è ðåãåíåðàòîðíûé
ïîòåíöèàë îðãàíà-ìèøåíè.
Òðàíñôåêöèÿ ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ
êëåòîê ìûøè ïëàçìèäàìè, ýêñïðåññèðóþùèìè
êëîíèðîâàííûé ãåí íåéðàëüíîé ìîëåêóëû àäãåçèè
L1 (L1CAM), îáåñïå÷èâàåò íå òîëüêî âñòðàèâàíèå
ýòîé ìîëåêóëû àäãåçèè â êëåòî÷íóþ ìåìáðàíó
ñòâîëîâûõ êëåòîê, íî è ñåêðåöèþ å¸ ðàñòâîðèìîé
ôîðìû [9]. Ïîñëå òðàíñïëàíòàöèè ïîäîáíûõ
êëåòîê â òðàâìèðîâàííûé ñïèííîé ìîçã îíè
ôîðìèðîâàëè îòðîñòêè è îáíàðóæèâàëèñü â òêàíè
ðåöèïèåíòà ñïóñòÿ ìåñÿö ïîñëå òðàíñïëàíòàöèè,
òîãäà êàê àíàëîãè÷íûå, íî íåòðàíñôåöèðîâàííûå
êëåòêè âûæèâàëè ëèøü â òå÷åíèå 7 ñóòîê.
 ñëåäóþùèõ ðàáîòàõ [3] áûëî ïîêàçàíî, ÷òî
ýêñïðåññèÿ L1 íàïðàâëÿåò äèôôåðåíöèðîâêó
ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê ïî
íåéðîíàëüíîìó ïóòè. Èíòåíñèâíûå èññëåäîâàíèÿ
ïðîâîäÿòñÿ ñ öåëüþ ïîëó÷åíèÿ ãåíåòè÷åñêè
ìîäèôèöèðîâàííûõ ñòâîëîâûõ ìåçåíõèìíûõ
êëåòîê, ñïîñîáíûõ äèôôåðåíöèðîâàòüñÿ â
çàäàííîì íàïðàâëåíèè. Óñòàíîâëåíî, ÷òî
òðàíñôåêöèÿ ñòâîëîâûõ ìåçåíõèìíûõ êëåòîê
êðàñíîãî êîñòíîãî ìîçãà âèðóñíûì âåêòîðîì,
ýêñïðåññèðóþùèì ãåí òèðîçèí ãèäðîêñèëàçû,
âûçûâàåò èõ äèôôåðåíöèðîâêó â äîôàìèíåðãè÷åñêèå íåéðîíû [27].
 íàñòîÿùåå âðåìÿ ñóùåñòâóþò åäèíè÷íûå
ýêñïåðèìåíòàëüíûå ðàáîòû ïî òðàíñïëàíòàöèè
ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûõ êëåòîê
ïóïîâèííîé êðîâè äëÿ ñòèìóëÿöèè ðåãåíåðàöèè
ñåðäå÷íîé ìûøöû è ñîñóäîâ. Íàèáîëüøåå
âíèìàíèå óäåëÿåòñÿ âîçìîæíîñòè òðàíñïëàíòàöèè
êëåòîê ïóïîâèííîé êðîâè, ãåíåòè÷åñêè
ìîäèôèöèðîâàííûõ ãåíîì VEGF. Íàïðèìåð,
òðàíñïëàíòàöèÿ êëåòîê ïóïîâèííîé êðîâè,
òðàíñôåöèðîâàííûõ ãåíîì VEGF ÷åëîâåêà,
àêòèâèðóåò àíãèîãåíåç â òêàíÿõ ïðè ìîäåëèðîâàíèè õðîíè÷åñêîé èøåìèè êîíå÷íîñòåé
ó êðûñû [22] è èíôàðêòà ìèîêàðäà ó ìûøåé [7].
Òàêèì îáðàçîì, äëÿ óñòðàíåíèÿ äåôåêòîâ
íåðâíîé òêàíè, íåéðîïðîòåêöèè è ñòèìóëèðîâàíèÿ ðåãåíåðàöèè íåðâíûõ âîëîêîí
ÁÎÊÎÂÎÉ ÀÌÈÎÒÐÎÔÈ×ÅÑÊÈÉ ÑÊËÅÐÎÇ: ÑÒÐÀÒÅÃÈß ÃÅÍÍÎ-ÊËÅÒÎ×ÍÎÉ ÒÅÐÀÏÈÈ
â ÖÍÑ ïîëó÷åíèå è èñïûòàíèå ãåíåòè÷åñêè
ìîäèôèöèðîâàííûõ êëåòîê êðîâè ïóïîâèíû
ìîæíî ñ÷èòàòü ïåðñïåêòèâíûì íàïðàâëåíèåì â
ãåííî-êëåòî÷íîé òåðàïèè íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ
çàáîëåâàíèé. Ïðè ýòîì âîçìîæíî òåñòèðîâàíèå
ìíîæåñòâà êîíêðåòíûõ ïîäõîäîâ (íàïðèìåð,
ïðèìåíåíèå ðàçëè÷íûõ êëåòî÷íûõ òèïîâ
ïóïîâèííîé êðîâè, ðàçíûå ãåíåòè÷åñêèå
ìîäèôèêàöèè êëåòîê ïåðåä òðàíñïëàíòàöèåé,
âàðèàíòû ïî ñðîêàì, êîëè÷åñòâó è ñïîñîáó
ââåäåíèÿ êëåòîê íåïîñðåäñòâåííî â îáëàñòü
òðàâìû, êðîâîòîê, áèîìàòðèêñ).
Äèôôåðåíöèðîâàíèå ñòâîëîâûõ êëåòîê
êðîâè ïóïîâèíû, òðàíñôåöèðîâàííûõ VEGF
è L1CAM, â ýíäîòåëèàëüíûå êëåòêè ñîñóäîâ
ñïèííîãî ìîçãà ïîñëå òðàíñïëàíòàöèè â
ðåòðîîðáèòàëüíîå ïðîñòðàíñòâî ìûøåé G93A
Ðàíåå íàìè áûëà âûäâèíóòà ãèïîòåçà, ÷òî
ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûå ñòâîëîâûå êëåòêè
ïóïîâèííîé êðîâè, òðàíñôåöèðîâàííûå
ïëàçìèäíûìè âåêòîðàìè, ýêñïðåññèðóþùèìè ãåíû
íåéðàëüíîé ìîëåêóëû àäãåçèè L1 è ñîñóäèñòîãî
ýíäîòåëèàëüíîãî ôàêòîðà ðîñòà VEGF, çíà÷èòåëüíî
óñèëèâàþò òåðàïåâòè÷åñêèé ýôôåêò ñòâîëîâûõ
êëåòîê ïóïîâèííîé êðîâè ó òðàíñãåííûõ ìûøåé
G93A ñ ôåíîòèïîì áîêîâîãî àìèîòðîôè÷åñêîãî
ñêëåðîçà [1]. Ïðè ôîðìèðîâàíèè òêàíè äëÿ
îáðàçîâàíèÿ êëåòî÷íûõ ñîîáùåñòâ âàæíóþ ðîëü
èãðàþò ïðîöåññû óçíàâàíèÿ è àäãåçèè. Êëåòî÷íóþ
àäãåçèþ îáåñïå÷èâàþò ñïåöèôè÷íûå äëÿ êàæäîãî
òèïà òêàíåé ìîëåêóëû àäãåçèè. Ìîëåêóëà àäãåçèè
L1CAM ïîääåðæèâàåò âûæèâàíèå íåéðîíîâ è ðîñò
àêñîíîâ. Ýêñïðåññèÿ ãåíà ìîëåêóëû àäãåçèè L1,
ñèíòåç ýòîãî áåëêà è ïîñëåäóþùåå âñòðàèâàíèå åãî
â êëåòî÷íóþ ìåìáðàíó òðàíñïëàíòèðîâàííûõ è,
âîçìîæíî, êëåòîê ðåöèïèåíòà ìîæåò èìåòü âàæíîå
ñòèìóëèðóþùåå âëèÿíèå íà ðåãåíåðàòîðíûé ðîñò
àêñîíîâ. Ñîñóäèñòûé ýíäîòåëèàëüíûé ôàêòîð
ðîñòà (VEGF) îáîñíîâàííî ñ÷èòàåòñÿ îäíèì èç
íàèáîëåå ïåðñïåêòèâíûõ ôàêòîðîâ ðåãåíåðàöèè.
VEGF ïðèíàäëåæèò ñåìåéñòâó ïîëèïåïòèäîâ ñ
âàñêóëîãåííîé àêòèâíîñòüþ â ýìáðèîãåíåçå è
àíãèîãåííîé àêòèâíîñòüþ ïðè îïóõîëåâîì ðîñòå,
ãèïîêñèè è ðåãåíåðàöèè. VEGF êîíòðîëèðóåò
ïðîëèôåðàöèþ è äèôôåðåíöèðîâêó ýíäîòåëèàëüíûõ êëåòîê ïðè íåîâàñêóëÿðèçàöèè, ÷òî
ïðåäñòàâëÿåòñÿ âàæíûì äëÿ íîðìàëèçàöèè
êðîâîñíàáæåíèÿ â î÷àãå äåãåíåðàöèè. Êðîìå òîãî,
VEGF ÿâëÿåòñÿ è íåéðîïðîòåêòîðíûì ôàêòîðîì.
Îí ïîääåðæèâàåò âûæèâàíèå íåéðîíîâ, ÷òî,
ñîãëàñíî íàøèì äàííûì, îñóùåñòâëÿåòñÿ ÷åðåç
ðåöåïòîð Flk-1.
Ðèñ. 3. Ãåííî-êëåòî÷íàÿ òåðàïèÿ áîêîâîãî àìèîòðîôè÷åñêîãî ñêëåðîçà ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûìè
êëåòêàìè ïóïîâèííîé êðîâè, ýêñïðåññèðóþùèìè êëîíèðîâàííûå íåéðàëüíóþ ìîëåêóëó àäãåçèè L1CAM è
ñîñóäèñòûé ýíäîòåëèàëüíûé ôàêòîð ðîñòà VEGF. L1CAM îáåñïå÷èâàåò àäðåñíóþ ìèãðàöèþ ñòâîëîâûõ êëåòîê
ïóïîâèííîé êðîâè ÷åëîâåêà â íåðâíóþ òêàíü, VEGF êîíòðîëèðóåò ïðîëèôåðàöèþ òðàíñïëàíòèðîâàííûõ êëåòîê,
èõ äèôôåðåíöèðîâêó â ýíäîòåëèàëüíûå êëåòêè, à òàêæå îêàçûâàåò íåéðîïðîòåêòîðíûé ýôôåêò.
97
Ð.Ð. ÈÑËÀÌÎÂ, À.À. ÐÈÇÂÀÍÎÂ, À.Ï. ÊÈßÑÎÂ
Ìàòðèöåé äëÿ ÏÖÐ-àìïëèôèêàöèè ìûøèíîãî
ãåíà L1CAM ïîñëóæèëà ïëàçìèäà p924-NeoIpPGK-mL1, ïîäàðåííàÿ Ì. Schachner (Zentrum für
Molekulare Neurobiologie Hamburg, University of
Hamburg, Germany). Ìàòðèöåé äëÿ ÏÖÐ-àìïëèôèêàöèè ÷åëîâå÷åñêîãî ãåíà VEGF165 áûëà
ïðèìåíåíà ïëàçìèäà pCMV-VEGF, ïðåäîñòàâëåííàÿ Ñ.Ë. Êèñåë¸âûì (Èíñòèòóò áèîëîãèè
ãåíà ÐÀÍ, Ìîñêâà). Âåêòîðíûå êîíñòðóêöèè
pcDNA-VEGF è pcDNA-L1CAM áûëè ñîçäàíû íà
îñíîâå ïëàçìèäû pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen)
êëîíèðîâàíèåì ïðîäóêòîâ ÏÖÐ-àìïëèôèêàöèè ïî
óíèêàëüíûì ñàéòàì ðåñòðèêöèè. Ìîíîíóêëåàðíóþ
ôðàêöèþ êðîâè ïóïîâèíû ÷åëîâåêà ïîëó÷àëè ñ
ïîìîùüþ ñòàíäàðòíîé ìåòîäèêè îñàæäåíèÿ êëåòîê
â ïëîòíîñòè ôèêîëëà. Âûäåëåííûå êëåòêè
òðàíñôåöèðîâàëè ìåòîäîì ýëåêòðîïîðàöèè
ïëàçìèäàìè pcDNA-VEGF è pcDNA-L1CAM.
Ïîñëå òðàíñôåêöèè êëåòêè èíêóáèðîâàëè â
òå÷åíèå 24 ÷àñîâ â ñðåäå RPMI1640, ñîäåðæàùåé
10%
áû÷üåé
ôåòàëüíîé
ñûâîðîòêè.
Òðàíñïëàíòàöèþ âûïîëíÿëè ïóò¸ì èíúåêöèè â
ðåòðîîðáèòàëüíîå ïðîñòðàíñòâî ìûøåé G93A
1x106 ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûõ êëåòîê.
Èììóíîôëóîðåñöåíòíûé àíàëèç ïîÿñíè÷íîãî
îòäåëà ñïèííîãî ìîçãà âûÿâèë ÷åëîâå÷åñêèå
êëåòêè ÷åðåç 3 ìåñÿöà ïîñëå òðàíñïëàíòàöèè. Ïðè
ýòîì êîëè÷åñòâî êëåòîê, ýêñïðåññèðóþùèõ
÷åëîâå÷åñêèå àíòèãåíû, óâåëè÷èëîñü îò ìîìåíòà
òðàíñïëàíòàöèè, à ÷àñòü òðàíñïëàíòèðîâàííûõ
êëåòîê äèôôåðåíöèðîâàëàñü â ýíäîòåëèàëüíûå
êëåòêè ñ îáðàçîâàíèåì íîâûõ êðîâåíîñíûõ
ñîñóäîâ. Íà îñíîâàíèè ïîëó÷åííûõ ðåçóëüòàòîâ
ìîæíî ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ïëàçìèäíûå âåêòîðû,
ýêñïðåññèðóþùèå L1CAM è VEGF, ïîâûøàþò
àäðåñíóþ ìèãðàöèþ ñòâîëîâûõ êëåòîê ïóïîâèííîé
êðîâè ÷åëîâåêà â íåðâíóþ òêàíü, èõ ïðîëèôåðàöèþ
è äèôôåðåíöèðîâêó â ýíäîòåëèàëüíûå êëåòêè.
Îáðàçîâàíèå æå íîâûõ êðîâåíîñíûõ ñîñóäîâ â
ó÷àñòêàõ íåéðîäåãåíåðàöèè ñïèííîãî ìîçãà
îêàçûâàåò
íåéðîïðîòåêòîðíûé
ýôôåêò,
îáåñïå÷èâàþùèé äîñòàâêó ðàçíûõ òðîôè÷åñêèõ è
ðîñòîâûõ ìîëåêóë ê íåðâíûì êëåòêàì. Êðîìå òîãî,
VEGF ÷åðåç ðåöåïòîðû Flk-1ïîääåðæèâàåò
âûæèâàíèå íåéðîíîâ (ðèñ. 3).
Çàêëþ÷åíèå
Îäíèì èç ôóíäàìåíòàëüíûõ ñâîéñòâ îðãàíèçìà
ÿâëÿåòñÿ ðåãåíåðàöèÿ — âîññòàíîâëåíèå
óòðà÷åííîé èëè ïîâðåæä¸ííîé ñòðóêòóðû îðãàíà.
Ìåäèêî-áèîëîãè÷åñêàÿ ïðîáëåìà ñòèìóëÿöèè
ðåãåíåðàöèè íåîòúåìëåìî ñâÿçàíà ñ ðàçâèòèåì
èííîâàöèîííûõ òåõíîëîãèé â ãåííî-êëåòî÷íîé
98
òåðàïèè, íà êîòîðîé îñíîâàíà ðåãåíåðàöèîííàÿ
ìåäèöèíà. Ñîâðåìåííûå íàó÷íûå ñâåäåíèÿ î
ñòèìóëÿöèè ðåãåíåðàöèè, ïåðâûå êëèíè÷åñêèå
èñïûòàíèÿ â ýòîé îáëàñòè, à òàêæå èíòåíñèâíîå
âíåäðåíèå ôèçèêè è õèìèè â ìåäèöèíó âûñîêèõ
òåõíîëîãèé îòêðûâàþò øèðîêèå ïåðñïåêòèâû
ðàçâèòèÿ ðåãåíåðàöèîííîé ìåäèöèíû. Àëëîòðàíñïëàíòàöèÿ (íàïðèìåð, ñåðäöà, ïî÷åê, ïå÷åíè)
âîøëà â øèðîêóþ ïðàêòèêó êëèíèöèñòîâ. Â òî æå
âðåìÿ ëå÷åíèå íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ çàáîëåâàíèé
ïóò¸ì òðàíñïëàíòàöèè ýìáðèîíàëüíîé òêàíè è/èëè
êëåòîê îñòà¸òñÿ ïîêà íà óðîâíå ýêñïåðèìåíòîâ â
ëàáîðàòîðèÿõ èëè (â ëó÷øåì ñëó÷àå) íà÷àòû
êëèíè÷åñêèå èñïûòàíèÿ. Âîçìîæíîñòè êëåòî÷íîé
òåðàïèè èíòåíñèâíî èçó÷àþòñÿ, íî â òî æå âðåìÿ
êëèíèöèñòû ñòàëêèâàþòñÿ ñ ýòè÷åñêèìè
ïðîáëåìàìè (íàïðèìåð, âîçìîæíîñòü ïðèìåíåíèÿ
òêàíè ïëîäà, âûñîêàÿ âåðîÿòíîñòü îïóõîëåâîé
òðàíñôîðìàöèè òðàíñïëàíòèðîâàííûõ êëåòîê,
èíôèöèðîâàíèå íåèçâåñòíûìè ìèêðîîðãàíèçìàìè
èç ñûâîðîòêè è êëåòîê æèâîòíûõ). Ïîäãîòîâëåííûå äëÿ òðàíñïëàíòàöèè ñòâîëîâûå êëåòêè
äîëæíû èìåòü ïðåäñêàçóåìûå è âîñïðîèçâîäèìûå
õàðàêòåðèñòèêè, à èìåííî ñîõðàíÿòü æèçíåñïîñîáíîñòü, àêòèâíî ðàçìíîæàòüñÿ ñ îáðàçîâàíèåì äîñòàòî÷íîãî êîëè÷åñòâà êëåòîê äëÿ
ðåãåíåðàöèè óòðà÷åííîé òêàíè, èíòåãðèðîâàòüñÿ
ñ êëåòêàìè îðãàíà-ðåöèïèåíòà, äèôôåðåíöèðîâàòüñÿ â òðåáóåìûå êëåòî÷íûå òèïû,
âîññòàíàâëèâàòü òêàíåâûé ìàòðèêñ è ôîðìèðîâàòü
íàïðàâëÿþùèå ïóòè äëÿ ðîñòà àêñîíîâ,
ó÷àñòâîâàòü â ïðîöåññå ìèåëèíèçàöèè, îêàçûâàòü
òðîôè÷åñêîå è íåéðîïðîòåêòîðíîå äåéñòâèå,
ñòèìóëèðîâàòü ðîñò àêñîíîâ è âîññòàíîâëåíèå
ìåæêëåòî÷íûõ êîíòàêòîâ. Èííîâàöèîííîå
íàïðàâëåíèå â êëåòî÷íîé òåðàïèè, îñíîâàííîå íà
ãåíåòè÷åñêîé ìîäèôèêàöèè ñòâîëîâûõ êëåòîê
ïåðåä òðàíñïëàíòàöèåé, èìååò øèðîêèå
ïåðñïåêòèâû ðàçâèòèÿ. Ýêñïðåññèîííûå âåêòîðû
ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû äëÿ àäðåñíîé ìèãðàöèè
òðàíñïëàíòèðîâàííûõ êëåòîê è ïðîäóêöèè ðàçíûõ
ðîñòîâûõ è òðîôè÷åñêèõ ìîëåêóë â ìåñòå
äåãåíåðàöèè. Íàðÿäó ñ èñïîëüçîâàíèåì
ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûõ êëåòîê,
ýêñïðåññèðóþùèõ òåðàïåâòè÷åñêèå ãåíû,
âíèìàíèå èññëåäîâàòåëåé â ïîñëåäíåå âðåìÿ
ïðèâëåêàþò èíäóöèðîâàííûå ïëþðèïîòåíòíûå
ñòâîëîâûå êëåòêè (induced pluripotent stem cells —
iPS-êëåòêè).  íà÷àëå 2007 ã. â âåäóùèõ íàó÷íûõ
æóðíàëàõ áûëè îïóáëèêîâàíû ñòàòüè òð¸õ
íåçàâèñèìûõ ãðóïï ó÷¸íûõ, â êîòîðûõ ïîêàçàíà
âîçìîæíîñòü ïîëó÷åíèÿ èíäóöèðîâàííûõ
ÁÎÊÎÂÎÉ ÀÌÈÎÒÐÎÔÈ×ÅÑÊÈÉ ÑÊËÅÐÎÇ: ÑÒÐÀÒÅÃÈß ÃÅÍÍÎ-ÊËÅÒÎ×ÍÎÉ ÒÅÐÀÏÈÈ
ïëþðèïîòåíòíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê èç
ôèáðîáëàñòîâ ìûøè ïóò¸ì òðàíñôåêöèè ÷åòûð¸õ
òðàíñêðèïöèîííûõ ôàêòîðîâ Oct4, Sox2, cMyc è
Klf4 [28, 34, 45]. Ïîëó÷åííûå êëåòêè îáëàäàþò
ñâîéñòâàìè ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê.
 êóëüòóðå iPS-êëåòêè ñïîíòàííî äèôôåðåíöèðóþòñÿ â ïðîèçâîäíûå çàðîäûøåâîé ýêòîäåðìû,
ýíòîäåðìû è ìåçîäåðìû. Â ðåçóëüòàòå òðàíñïëàíòàöèè iPS-êëåòîê â áëàñòîöèñòó ìûøè
ïîëó÷åíû æèâûå õèìåðû, ñïîñîáíûå ãåíåðèðîâàòü
ïîëîâûå êëåòêè iPS-ïðîèñõîæäåíèÿ. Ìûøèíûå
iPS-êëåòêè áûëè óñïåøíî ïðèìåíåíû äëÿ òåðàïèè
ñåðïîâèäíî-êëåòî÷íîé àíåìèè ó ìûøåé [20].
Îñåíüþ 2007 ã. áûë ñäåëàí ñëåäóþùèé øàã íà ïóòè
ñîçäàíèÿ
iPS-êëåòîê
òåðàïåâòè÷åñêîãî
íàïðàâëåíèÿ. Íåçàâèñèìûìè êîëëåêòèâàìè
àâòîðîâ ïîä ðóêîâîäñòâîì ßìàíàêà è Òîìïñîíîì
áûëè ïîëó÷åíû iPS-êëåòêè èç ôèáðîáëàñòîâ
÷åëîâåêà [43, 48]. Ñóùåñòâóþùèå íà ñåãîäíÿøíèé
äåíü ìåòîäû äåäèôôåðåíöèðîâêè ñîìàòè÷åñêèõ
êëåòîê èñïîëüçóþò ðåòðîâèðóñíóþ ñèñòåìó
ãåíåòè÷åñêîé ìîäèôèêàöèè. Ïðîáëåìà âèðóñíîé
òðàíñôåêöèè çàêëþ÷àåòñÿ â îïàñíîñòè àêòèâàöèè
èëè èíàêòèâàöèè íåêîòîðûõ ãåíîâ ñ ïîñëåäóþùåé
ìàëèãíèçàöèåé êëåòîê. Ïîýòîìó î÷åâèäíà
íåîáõîäèìîñòü ðàçðàáîòêè áèîëîãè÷åñêè
áåçîïàñíûõ ñïîñîáîâ íåâèðóñíîé äîñòàâêè
ãåíåòè÷åñêîé èíôîðìàöèè â êëåòêè, îäèí èç òàêèõ
ñïîñîáîâ — èñïîëüçîâàíèå ïëàçìèäíûõ âåêòîðîâ.
Òàêèì îáðàçîì, ãåíåòè÷åñêàÿ ìîäèôèêàöèÿ
ñòâîëîâûõ êëåòîê ïóïîâèííîé êðîâè ìîæåò áûòü
ïîëåçíà â äâóõ àñïåêòàõ: âî-ïåðâûõ, äëÿ äîñòàâêè
ñïåöèôè÷åñêèõ ðîñòîâûõ è òðîôè÷åñêèõ ôàêòîðîâ
äëÿ ïîääåðæàíèÿ æèçíåñòîéêîñòè êëåòîê ïðè
äåãåíåðàöèè ðàçëè÷íîé ýòèîëîãèè, âî-âòîðûõ, äëÿ
ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ñòâîëîâûõ êëåòîê â
èíäóöèðîâàííûå ïëþðèïîòåíòíûå ñòâîëîâûå
êëåòêè ñ èõ ïîñëåäóþùåé íàïðàâëåííîé
äèôôåðåíöèðîâêîé â òðåáóåìûå êëåòî÷íûå òèïû.
Áëàãîäàðíîñòü
Ðàáîòà ÷àñòè÷íî ôèíàíñèðîâàëàñü ãðàíòàìè:
ÐÔÔÈ ¹ 06-04-49396 è ¹ 08-04-01680, ÔÖÏ ¹
02.442.11.7319 è ¹ 02.512.11.2052, Ïðåçèäåíòà ÐÔ
«Âåäóùàÿ íàó÷íàÿ øêîëà» ÍØ-4444.2006.4 è
ÍØ-4177.2008.4. Ðàáîòà ÐÀÀ òàêæå
ôèíàíñèðîâàëàñü ðåèíòåãðàöèîííûì ãðàíòîì
ÍÀÒÎ NR.RIG.983007. Ìàòåðèàëüíî-òåõíè÷åñêàÿ
ïîääåðæêà
÷àñòè÷íî
îñóùåñòâëÿëàñü
Ðåãèîíàëüíûì
öåíòðîì
êîëëåêòèâíîãî
ïîëüçîâàíèÿ ôèçèêî-õèìè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé
âåùåñòâ è ìàòåðèàëîâ (ÐÖÊÏ ÔÕÈ) ïðè
Êàçàíñêîì ãîñóäàðñòâåííîì óíèâåðñèòåòå.
ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ
1. Èñëàìîâ, Ð.Ð. Ãåííàÿ è êëåòî÷íàÿ òåðàïèÿ
íåéðîäåãåíåðàòèâíûõ çàáîëåâàíèé / Ð.Ð. Èñëàìîâ, À.À. Ðèçâàíîâ, Ä.Ñ. Ãóñåâà, À.Ï. Êèÿñîâ // Êëåòî÷íàÿ
òðàíñïëàíòîëîãèÿ è òêàíåâàÿ èíæåíåðèÿ. — 2007. — Vol.2,
¹3. — P. 9.
2. Azzouz, M. VEGF delivery with retrogradely transported
lentivector prolongs survival in a mouse ALS model / M. Azzouz,
G.S. Ralph, E. Storkebaum et al. // Nature. — 2004. — Vol.429,
¹6990. — P. 413—417.
3. Bernreuther, C. Neural cell adhesion molecule L1transfected embryonic stem cells promote functional recovery
after excitotoxic lesion of the mouse striatum / C. Bernreuther,
M. Dihne, V. Johann et al. // J. Neurosci. — 2006. — Vol.26,
¹45. — P. 11532—11539.
4. Borchelt, D.R. Axonal transport of mutant superoxide
dismutase 1 and focal axonal abnormalities in the proximal axons
of transgenic mice / D.R. Borchelt, P.C. Wong, M.W. Becher et al. //
Neurobiol Dis. — 1998. — Vol.5, ¹1. — P. 27—35.
5. Brazelton, T.R. From marrow to brain: expression of
neuronal phenotypes in adult mice / T.R. Brazelton, F.M. Rossi,
G.I. Keshet, H.M. Blau // Science. — 2000. — Vol.290, ¹5497. —
P. 1775—1779.
6. Bruns, C.K. Impaired post-translational folding of familial
ALS-linked Cu, Zn superoxide dismutase mutants / C.K. Bruns,
R.R. Kopito // EMBO J. — 2007. — Vol. 26, ¹3. — P. 855—866.
7. Chen, H.K. Combined cord blood stem cells and gene
therapy enhances angiogenesis and improves cardiac performance
in mouse after acute myocardial infarction / H.K. Chen,
H.F. Hung, K.G. Shyu et al. // Eur. J. Clin. Invest. — 2005. —
Vol.35, ¹11. — P. 677—686.
8. Chen, J. Intravenous administration of human umbilical
cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats /
J. Chen, P.R. Sanberg, Y. Li et al. // Stroke. — 2001. — Vol.32,
¹11. — P. 2682—2688.)
9. Chen, J. Cell adhesion molecule l1-transfected embryonic
stem cells with enhanced survival support regrowth of
corticospinal tract axons in mice after spinal cord injury / J. Chen,
C. Bernreuther, M. Dihne, M. Schachner // J. Neurotrauma. —
2005. — Vol.22, ¹8. — P. 896—906.
10. Chen, R. The potential for the use of mononuclear cells
from human umbilical cord blood in the treatment of amyotrophic
lateral sclerosis in SOD1 mice / R. Chen, N. Ende // J. Med. —
2000. — Vol.31, ¹1-2. — P. 21—30.
11. Chou, S.M. Colocalization of NOS and SOD1 in
neurofilament accumulation within motor neurons of amyotrophic
lateral sclerosis: an immunohistochemical study / S.M. Chou,
H.S. Wang, K. Komai // J. Chem. Neuroanat. — 1996. — Vol.10,
¹3-4. — P. 249—258.
12. Collard, J.F. Defective axonal transport in a transgenic
mouse model of amyotrophic lateral sclerosis / J.F. Collard,
F. Cote, J.P. Julien // Nature. — 1995. — Vol.375, ¹6526. —
P. 61—64.
13. Cote, F. Progressive neuronopathy in transgenic mice
expressing the human neurofilament heavy gene: a mouse model
of amyotrophic lateral sclerosis / F. Cote, J.F. Collard, J.P. Julien //
Cell. — 1993. — Vol.73, ¹1. — P. 35—46.
14. Dawbarn, D. Neurotrophins and neurodegeneration /
D. Dawbarn, S.J. Allen // Neuropathol. Appl. Neurobiol. — 2003. —
Vol.29, ¹3. — P. 211—230.
15. Dupuis, L. Mitochondria in amyotrophic lateral sclerosis:
a trigger and a target / L. Dupuis, J.L. Gonzalez de Aguilar,
H. Oudart et al. // Neurodegener. Dis. — 2004. — Vol.1, ¹6. —
P. 245—254.
16. Ende, N. Human umbilical cord blood effect on sod mice
(amyotrophic lateral sclerosis) / N. Ende, F. Weinstein, R. Chen,
M. Ende // Life Sci. — Vol.67, ¹1. — P. 53—59.
17. Frahm, H.D. Comparison of brain structure volumes in
Insectivora and Primates. I. Neocortex / H.D. Frahm, H. Stephan,
M. Stephan // J. Hirnforsch. — 1982. — Vol.23, ¹4. — P. 375—389.
99
Ð.Ð. ÈÑËÀÌÎÂ, À.À. ÐÈÇÂÀÍÎÂ, À.Ï. ÊÈßÑÎÂ
18. Garbuzova-Davis, S. Intravenous administration of
human umbilical cord blood cells in a mouse model of
amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and
differentiation / S. Garbuzova-Davis, A.E. Willing, T. Zigova et
al. // J. Hematother. Stem Cell Res. — 2003. — Vol.12, ¹3. —
P. 255—270.
19. Gurney, M.E. Motor neuron degeneration in mice that
express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation /
M.E. Gurney, H. Pu, A.Y. Chiu et al. // Science. — 1994. —
Vol. 264, ¹5166. — P. 1772—1775.
20. Hanna, J. Treatment of sickle cell anemia mouse model
with iPS cells generated from autologous skin / J. Hanna,
M. Wernig, S. Markoulaki et al. // Science. — 2007. — Vol.318,
¹5858. — P. 1920—1923.
21. Hao, H.N. Fetal human hematopoietic stem cells can
differentiate sequentially into neural stem cells and then astrocytes
in vitro / H.N. Hao, J. Zhao, R.L. Thomas et al. // J. Hematother.
Stem Cell Res. — 2003. — Vol.12, ¹1. — P. 23—32.
22. Ikeda, Y. Development of angiogenic cell and gene
therapy by transplantation of umbilical cord blood with vascular
endothelial growth factor gene / Y. Ikeda, N. Fukuda, M. Wada
et al. // Hypertens. Res. — 2004. — Vol.27, ¹2. — P. 119—128.
23. Kaspar, B.K. Retrograde viral delivery of IGF-1 prolongs
survival in a mouse ALS model / B.K. Kaspar, J. Llado, N. Sherkat
et al. // Science. — 2003. — 3 Vol.301, ¹5634. — P. 839—842.
24. Kim, Y.J. Unsaturated fatty acids induce cytotoxic
aggregate formation of amyotrophic lateral sclerosis-linked
superoxide dismutase 1 mutants / Y.J. Kim, R. Nakatomi, T. Akagi
et al. // J. Biol. Chem. — 2005. — Vol. 280, ¹22. — P. 21515—
21521.
25. Kong, J. Massive mitochondrial degeneration in motor
neurons triggers the onset of amyotrophic lateral sclerosis in mice
expressing a mutant SOD1 / J. Kong, Z. Xu // J. Neurosci. —
1998. — Vol.18, ¹9. — P. 3241—3250.
26. Liu, R. Increased hydroxyl radical production and
apoptosis in PC12 neuron cells expressing the gain-of-function
mutant G93A SOD1 gene / R. Liu, R.K. Narla, I. Kurinov et al. //
Radiat. Res. — 1999. — Vol.151, ¹2. — P. 133—141.
27. Lu, L. Therapeutic benefit of TH-engineered
mesenchymal stem cells for Parkinson’s disease / L. Lu, C. Zhao,
Y. Liu et al. // Brain Res. Brain Res. Protoc. — 2005. — Vol.15,
¹1. — P. 46—51.
28. Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show
global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution
/ N. Maherali, R. Sridharan, W. Xie et al. // Cell Stem Cell. —
2007. — Vol.1, ¹1. — P. 55—70.
29. Mazzini, L. Stem cell therapy in amyotrophic lateral
sclerosis: a methodological approach in humans / L. Mazzini,
F. Fagioli, R. Boccaletti è äð. // Amyotroph. Lateral Scler. Other
Motor Neuron Disord. — 2003. — Vol.4, ¹3. — P. 158—161.
30. Mezey, E. Bone marrow: a possible alternative source of
cells in the adult nervous system / E. Mezey, K.J. Chandross //
Eur. J. Pharmacol. — 2000. — Vol.405, ¹1-3. — P. 297—302.
31. Mezey, E. Turning blood into brain: cells bearing neuronal
antigens generated in vivo from bone marrow / E. Mezey,
K.J. Chandross, G. Harta et al. // Science. — 2000. — Vol.290,
¹5497. — P. 1779—1782.
32. Munoz-Elias, G. Marrow stromal cells, mitosis, and
neuronal differentiation: stem cell and precursor functions /
G. Munoz-Elias, D. Woodbury, I.B. Black // Stem Cells. — 2003. —
Vol.21, ¹4. — P. 437—448.
33. Murashov, A.K. RNAi pathway is functional in peripheral
nerve axons / A.K. Murashov, V. Chintalgattu, R.R. Islamov et al. //
Faseb J. — 2007. — Vol.21, ¹3. — P. 656—670.
34. Okita, K. Generation of germline-competent induced
pluripotent stem cells / K. Okita, T. Ichisaka, S. Yamanaka //
Nature. — 2007. — Vol.448, ¹7151. — P. 313—317.
35. Price, D.L. Amyotrophic lateral sclerosis and Alzheimer
disease. Lessons from model systems / D.L. Price, P.C. Wong,
D.R. Borchelt et al. // Rev. Neurol. (Paris). — 1997. — Vol. 153,
¹8-9. — P. 484—495.
100
36. Rakhit R. Oxidation-induced misfolding and aggregation
of superoxide dismutase and its implications for amyotrophic
lateral sclerosis / R. Rakhit, P. Cunningham, A. Furtos-Matei
et al. // J. Biol. Chem. — 2002. — Vol.277, ¹49. — P. 47551—
47556.
37. Ralph, G.S. Gene therapy for neurodegenerative and
ocular diseases using lentiviral vectors / G.S. Ralph, K. Binley,
L.F. Wong et al. // Clin. Sci. (Lond). — 2006. — Vol.110, ¹1. —
P. 37—46.
38. Ralph, G.S. Silencing mutant SOD1 using RNAi protects
against neurodegeneration and extends survival in an ALS model /
G.S. Ralph, P.A. Radcliffe, D.M. Day et al. // Nat. Med. — 2005. —
Vol.11, ¹4. — P. 429—433.
39. Raoul, C. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through
RNA interference retards disease onset and progression in a
mouse model of ALS / C. Raoul, T. Abbas-Terki, J.C. Bensadoun
et al. // Nat. Med. — 2005. — Vol.11, ¹4. — P. 423—428.
40. Rosen, D.R. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase
gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis /
D.R. Rosen, T. Siddique, D. Patterson è äð. // Nature. — 1993. —
Vol. 362, ¹6415. — P. 59—62.
41. Saito, Y. Transgenic small interfering RNA halts
amyotrophic lateral sclerosis in a mouse model / Y. Saito,
T. Yokota, T. Mitani è äð. // J. Biol. Chem. — 2005. — Vol.280,
¹52. — P. 42826—42830.
42. Smith, R.A. Antisense oligonucleotide therapy for
neurodegenerative disease / R.A. Smith, T.M. Miller,
K. Yamanaka et al. // J. Clin. Invest. — 2006. — Vol.116, ¹8. —
P. 2290—2296.
43. Takahashi, K. Induction of pluripotent stem cells from
adult human fibroblasts by defined factors / K. Takahashi,
K. Tanabe, M. Ohnuki et al. // Cell. — 2007. — Vol.131, ¹5. —
P. 861—872.
44. Valentine, J.S. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic
lateral sclerosis / J.S. Valentine, P.J. Hart // Proc. Natl. Acad.
Sci. U S A. — 2003. — Vol. 100, ¹7. — P. 3617—3622.
45. Wernig, M. In vitro reprogramming of fibroblasts into a
pluripotent ES-cell-like state / M. Wernig, A. Meissner,
R. Foreman et al. // Nature. — 2007. — Vol.448, ¹7151. —
P. 318—324.
46. Williamson, T.L. Absence of neurofilaments reduces the
selective vulnerability of motor neurons and slows disease caused
by a familial amyotrophic lateral sclerosis-linked superoxide
dismutase 1 mutant / T.L. Williamson, L.I. Bruijn, Q. Zhu et al. //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1998. — Vol.95, ¹16. —
P. 9631—9636.
47. Williamson, T.L. Slowing of axonal transport is a very
early event in the toxicity of ALS-linked SOD1 mutants to motor
neurons / T.L. Williamson, D.W. Cleveland // Nat. Neurosci. —
1999. — Vol.2, ¹1. — P. 50—56.
48. Yu, J. Induced pluripotent stem cell lines derived from
human somatic cells / J. Yu, M.A. Vodyanik, K. Smuga-Otto
et al. // Science. — 2007. — Vol.318, ¹5858. — P. 1917—1920.
49. Zetterstrom, P. Soluble misfolded subfractions of mutant
superoxide dismutase-1s are enriched in spinal cords throughout
life in murine ALS models / P. Zetterstrom, H.G. Stewart,
D. Bergemalm et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2007. —
Vol.104, ¹35. — P. 14157—14162.
50. Zuccato, C. Loss of huntingtin-mediated BDNF gene
transcription in Huntington’s disease / C. Zuccato, A. Ciammola,
D. Rigamonti et al. // Science. — 2001. — Vol.293, ¹5529. —
P. 493—498.
Ïîñòóïèëà 27.07.08.
○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○