общая характеристика диссертации
реклама
На правах рукописи АЛЕКСАНДРОВА Антонина Юрьевна РЕОРГАНИЗАЦИЯ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА, ЛЕЖАЩАЯ В ОСНОВЕ ДВИЖЕНИЯ КЛЕТОК 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н.Н. Блохина РАМН, Отделе математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова Научный консультант: Официальные оппоненты: член-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор Ю.М. Васильев Доктор биологических наук, профессор Смирнова Елена Александровна, Кафедра клеточной биологии и гистологии Биологического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова Доктор биологических наук, профессор Ширинский Владимир Павлович НИИ экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научного комплекса Росздрава Доктор биологических наук, профессор Надеждина Елена Сергеевна Институт белка РАН Ведущая организация: Институт цитологии РАН Зашита состоится «21» февраля 2012 г. В 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр.12, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан «____» _________________2011 г. Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ. Актуальность проблемы Способность к движению является одним из основных свойств животных клеток. Движение клеток и клеточных слоев лежит в основе таких процессов, как формирование различных органов в эмбриогенезе, заживление ран и развитие воспалительных процессов. Движение клеток бывает очень разнообразно, зависит от типа клеток и от условий, в которых осуществляется миграция. Например, клетки эпителиального происхождения обычно перемещаются группами или целыми слоями, сохраняя при движении межклеточные контакты. Такой тип миграции называется групповым движением клеток. Наоборот фибробласты двигаются в индивидуальном порядке и демонстрируют так называемый мезенхимальный тип клеточного движения. При различных патологиях нарушается характер движения клеток. В частности в процессе развития злокачественных опухолей клетки приобретают способность проникать в соседние ткани и органы (инвазировать) или могут образовывать отдаленные очаги роста - метастазы. Способность клеток опухоли к инвазии и метастазированию является одной из основных причин смертности людей, страдающих от онкологических заболеваний. В процессе опухолевой прогрессии клетки претерпевают существенные морфологические изменения, что и приводит к приобретению ими несвойственных ранее способностей и изменению характера движения. В частности эпителиальные клетки при развитии опухоли претерпевают так называемый эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) при котором нарушаются межклеточные контакты, клетки приобретают фибробластоподобную форму, могут двигаться поодиночке. При этом существенно возрастает возможность их индивидуальной миграции и они могут инвазировать в близлежащие органы. В последнее время был так же описан так называемый мезенхимально - амебоидный переход (МАП), в результате которого клетки начинают двигаться на амебоидный манер, напоминающий движение лимфоцитов. При этом резко увеличивается скорость движения индивидуальных клеток в 3х-мерном матриксе и практически пропадает зависимость движения клеток от контактов с субстратом или активности ферментов, растворяющих матрикс - матриксных металлопротеаз (ММП). Картина усложняется тем, что при определенных условиях клетки могут возвращаться к прежнему способу миграции, что очень затрудняет попытки найти способы регуляции движения и ингибирования инвазии опухолевых клеток. Это свойство опухолевых клеток было описано несколько лет назад и называется пластичность опухолевых клеток (Wolf et al., 2003). Поэтому чрезвычайно важно знать, какие механизмы отвечают за тот или иной способ миграции и что регулирует движение клеток. 3 Давно показано, что в основе движения клеток лежат перестройки цитоскелета, в частности актинового цитоскелета. Выделяют несколько основных этапов движения - образование протрузий на ведущем краю клетки, закрепление этих протрузий с помощью адгезионных структур, подтягивание и перенос тела клетки за счет акто-миозинового сокращения. Известно, что основной механизм формирования актиновых филаментов - это полимеризация сети на краю клетки. Однако оставалось неясным, каким образом густая равномерная сеть актина перестраивается в пучки микрофиламентов, способные к сокращению. Так же был неизвестен вклад каждой из составляющих клеточного движения - образования протрузии и акто-миозинового сокращения в эффективность клеточной миграции. В последнее время был сделан огромный методологический скачок, появились новые методы микроскопии - фазово-контрастная микроскопия с компьютерным усилением, конфокальная микроскопия, электронная томография, открывающие новые возможности в исследовании клеточных структур. С помощью трансфекции белков, меченных флуорохромами, появилась возможность наблюдать за динамикой и активацией индивидуальных белков при движении живых клеток. В связи с этим представляется актуальным с применением этих новых методов исследовать динамику формирования и реорганизации цитоскелета при движении нормальных клеток, чтобы понимать, какие механизмы лежат в основе клеточного движения. Как уже отмечалось выше, при прогрессии опухолей резко меняется морфология и характер движения клеток. Различия в строении актинового цитоскелета у нормальных и трансформированных клеток были описаны ранее. Общепринят факт, что опухолевые клетки отличаются от нормальных отсутствием крупных пучков микрофиламентов - стресс-фибрилл и крупных зрелых фокальных контактов. Для трансформированных клеток характерно или полное отсутствие пучков микрофиламентов, или остаточные актиновые пучки и наличие мелких точечных фокальных комплексов. Но вопрос о том, как и почему указанные изменения приводят к возникновению у опухолевых клеток способностей к инвазии в соседние ткани, остается открытым. Цели настоящей работы. Исходя из сказанного выше, в настоящей работе были поставлены две основные цели: 1. Исследовать перестройки актинового цитоскелета, лежащие в основе движения нормальных клеток, проанализировать вклад разных составляющих полимеризации актиновой сети и акто-миозиновой сократимости - для обеспечения эффективного клеточного движения, выяснить роль образования адгезионных структур в реорганизации актинового цитоскелета. 4 2. Исследовать изменения морфологии клеток и цитоскелета, возникающие при опухолевой трансформации и приводящие к изменению характера клеточного движения и приобретению клетками инвазивного фенотипа. Задачи исследования: 1. Используя в качестве активаторов клеточного движения скэттер-фактор (HGF/SF) (для эпителиальных клеток) и опухолевый промотор форболовый эфир PMA (для фибробластов) исследовать изменения морфологии клеток и цитоскелета при инициации движения, определить роль системы микротрубочек и транспорта внутриклеточных частиц в миграции клеток. 2. С помощью специфических ингибиторов, исследовать роль основных составляющих клеточного движения – формирования протрузий на ведущем крае и актин-миозинового сокращения для эффективного движения клеток. 3. С примененим современных микроскопических техник (видеомикроскопии живых клеток, метода компьютерно-усиленного фазового контраста, видеонаблюдения за меченными белками, инъецированными в клетку и т.д.) исследовать структуру и динамику ведущего края клетки при движении. 4. С помощью коррелятивной видео и электронной микроскопии и с применением электронной томографии исследовать ультраструктуру и динамику актинового цитоскелета и адгезионных структур на ведущем крае при движении клеток. Исследовать на белковом уровне динамику формирования адгезионных структур с субстратом и предложить модель реорганизации актинового цитоскелета при движении клеток. 5. Исследовать роль второй составляющей – акто-миозинового сокращения для движения клеток с помощью высокоспецифичных ингибиторов актомиозинового сокращения. Для этого исследовать динамику движения клеток, регуляцию направленности движения и формирование клеточного монослоя в условиях ингибирования сократительной активности. 6. Исследовать изменения характера движения клеток, вызванного неопластической трансформацией с помощью нескольких альтернативных методов и проанализировать, какие именно морфологические изменения существенны для приобретения клетками инвазивного поведения. 7. Исследовать ультраструктуру актинового цитоскелета фибробластов с разной степенью трансформации и выявить нарушения строения цитоскелета определяющие проявление инвазивного фенотипа. 8. Для выяснения механизмов изменения клеточной морфологии при трансформации проанализировать влияние экспрессии онкогенов (N-Ras) на 5 морфологию фибробластов. Исследовать изменения морфологии и цитоскелета фибробластов под влиянием активных кислородных радикалов (ROS). Научная новизна и практическая ценность. Исследованию подвижности клеток и механизмам, определяющим эту подвижность, уделяется огромный интерес в мире. Благодаря бурному техническому развитию микроскопии в последнее время появилось много новых методов и подходов, позволяющих изучать движение индивидуальных клеток. В настоящей работе было использовано уникальное сочетание современных методов – видеомикроскопию, метод компьютерно-усиленного фазового контраста, TIRF (тотальную интерференционно-отражательную микроскопию), конфокальную микроскопию. Для осуществления коррелятивной электронной и видеомикроскопии был разработан метод, позволяющий, сочетать видеосъемки живых клеток с последующим изучением на электронномикроскопическом уровне клеточных структур с известной жизненной историей. Впервые в сочетании с корреляционной электронной микроскопией был применен метод электронной томографии, позволяющей с высоким разрешением исследовать 3х-мерное строение адгезионных структур построить модели реорганизации цитоскелета на разных стадиях формирования ФА. Полученные модели прояснили механизмы формирования адгезионных структур и перестройки цитоскелета при движении клеток. Проведенные исследования продемонстрировали важнейшую роль формирования новых адгезионных структур в процессе реорганизации актинового цитоскелета во время клеточного движения. Исследование динамики трансфицированных в клетку белков – компонентов фокальных адгезий позволило внести существенный вклад в современное представление о строении и динамике адгезионных структур. Впервые в мире была выделена стадия инициальных фокальных адгезий, как начальная стадия формирования адгезионных структур. Ранее эта стадия не была описана исследователями из-за методических трудностей, и только использование такого широкого набора белков-маркеров и последующее исследование структуры с помощью коррелятивной электронной микроскопии позволило выделить этот этап формирования ФА. Впервые была показана роль белка VASP, как организатора сборки фокальных адгезий. Трансфекция клеток белками, меченными флуорохромами, позволила наблюдать перестройки актинового цитоскелета при движении клеток, дало возможность выяснить механизмы, регулирующие динамику цитоскелета. Были исследованы две зоны, образующиеся на активном ведущем краю - ламеллиподия и ламелла. Впервые в мире было показано, что основным процессом, определяющим быстрый ретроградный ток в ламеллиподии, 6 является полимеризация актина, тогда как медленный ретроградный ток в ламеллиподии обеспечивается акто-миозиновым сокращением. Впервые в мире было показано, что формирование адгезионных структур de novo происходит в зоне ламеллиподии и при дальнейших перестройках именно позиция этих структур определяет положение границы между ламеллиподией и ламеллой. Эти исследования вносят весомый вклад в понимание процессов перестройки цитоскелета, лежащие в основе клеточного движения. Изменение характера клеточного движения приводит к проявлению таких свойств опухолевых клеток, как способность к инвазии. Важность исследования механизмов, приводящих к подобным изменениям, сомнению не подлежит. В работе была сделана комплексная оценка изменений, вызываемых неопластической трансформацией, с применением большого набора различных методов (иммуноморфологии, электронной микроскопии, видеомикроскопии живых клеток, разнообразных тестов на эффективность миграции, биохимических исследований регуляции подвижности) на нескольких клеточных системах, включающих в себя контрольные (нетрансформированные) фибробласты и те же клетки с разной степенью трансформации, полученные в результате трансформации разными агентами. Впервые проведен сравнительный компьютерный анализ динамики активного края нормальных и трансформированных клеток и в результате показано, что характерным признаком трансформации фибробластов является значительное перераспределение псевдоподиальной активности. У трансформированных клеток существенно возрастает доля активного клеточного края и соответственно уменьшается стабильный край. При трансформации клеток изменяется не только распределение, но и характер псевдоподиальной активности: протрузии на переднем крае становятся более мелкими, а частота их образования и частота образования раффлов значительно возрастает. Эти изменения коррелируют с изменениями строения актиновой сети в ламеллиподии, а также с отсутствием полноценных контактов клетки с субстратом. С помощью метода платиновых реплик (электронная микроскопия) выявлена ультраструктурная основа такого перераспределения: нарушение регулярности актиновой сети, появление большого количества «дыр» в подмембранном слое актина на ведущем краю клетки и разрушение краевого актинового пучка, в норме стабилизирующего боковые края клеток. В результате исследования клеточных линий, находящихся на разных стадия опухолевой трансформации, показано, что по мере нарастания таких признаков трансформации, как изменение ультраструктуры цитоскелета и перераспределения активности ведущего края, изменяется характер миграции клеток. Движение одиночных трансформированных клеток носит менее направленный характер и скорость их миграции падает, в основном в результате отсутствия поляризации активности на ведущем крае. Одновременно появляется 7 и/или усиливается способность к трехмерной миграции через поры камеры Бойдена и способность к инвазии. Проведенная работа дает основание предположить, что именно перераспределение псевдоподиальной активности, вызванное изменениями структуры актинового цитоскелета, в результате которого, трансформированные клетки легко меняют направление движения, является определяющим в проявлении способности опухолевых клеток к инвазии. Впервые показано, что, по крайней мере одним из механизмов, лежащих в основе изменения морфологии и подвижности клеток является накопление активных кислородных радикалов (ROS) под действием гиперэкспрессии онкогена N-Ras, и одним из путей возвращения нормального фенотипа может быть обработка клеток антиоксидантами (в нашем случае N-ацетил цистеином). Полученные результаты имеют не только теоретическое, но и важное научнопрактическое значение, так как показывают новые подходы к нормализации морфологии и движения опухолевых клеток и открывают новые направления исследований в области клеточной биологии и антиопухолевой терапии. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: 1. Наиболее важным этапом, определяющим движение клеток, является формирование активного ведущего края. Акто-миозиновая сократимость существенна для упорядочивания движения и правильного формирования клеточных слоев. 2. Две зоны ведущего клеточного края - ламеллиподия и ламелла- отличаются по структуре, динамическим характеристикам и по механизмам, обеспечивающим динамику актиновой сети. Положение границы ламеллиподия-ламелла и дальнейшая реорганизация актинового цитоскелета при движении клеток определяется образованием ФА. 3. Образование ФА начинается в ламеллиподии с формирования инициальной фокальной адгезии. Белком-организатором сборки ФА является VASP, который первым появляется в точке ФА. Инициальные ФА являются необходимой стадией формирования ФА, хотя еще не сопряжены с выраженной структурной организацией актиновой сети. 4. Характерным признаком неопластической трансформации фибробластов является перераспределение краевой активности. При этом существенно увеличивается доля активного и, соответственно, сокращается доля стабильного края, а также изменяется характер псевдоподиальной активности на ведущем крае клетки. Эти признаки нарастают по мере нарастания степени трансформации клеток. 5. Изменение характера и распределения краевой активности у трансформированных клеток связано с нарушениями структуры 8 цитоскелета, видимыми при электронно-микроскопических исследованиях. Это приводит к изменению характера клеточной миграции и появлению у опухолевых клеток способностей к инвазии. 6. По крайней мере одним из молекулярных механизмов, лежащих в основе указанных изменений цитоскелета в результате трансформации является возрастание уровня реактивных кислородных радикалов (ROS) в результате оверэкспрессии онкогена N-Ras. Обработка таких клеток антиоксидантом NAC (N-ацетил цистеином) приводит к нормализации фенотипа и подвижности клеток. Конкретное участие автора заключалось в планировании исследования, разработке методологии, выборе моделей, составлении программы. Проведение экспериментов, получение научных результатов, анализ этих результатов, формулировка научных положений и выводов проводились диссертантом самостоятельно. Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены на Международном симпозиуме ,,Биологическая подвижность,, Пущино, 1994; The Cytoskeletal and Cell Function Meeting, Cold Spring Harbor, NY, 1995; International Congress"Cyto-skeleton and Cancer", Les Embiez(Var), France, 1995; конференции «Цитокелет и клето чная регуляция». Пущино, 11 – 12 мая, 2000 года; 17th European Cytoskeleton Forum, Nyon-Geneva, Switzerland ,2002; FEBS special Meeting on Cytoskeletal Dynamics: From Cell Biology to Development and Disease, 2004, Helsinki, Finland ; Adhesion meeting 2005. Podosomes-invalopodia-focal adhesions. Munich, Germany; Advanced workshop on Integrated approaches in Cytoskeleton Research, 2005, Luxembourg ; 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2008», С.-Петербург, 2008; ХII Российском онкологическом конгрессе, Москва, 2008 г.; на школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток», С-Петербург, 2008 г.; The American Society for Cell Biology, 49th Annual Meeting, San Diego, CA,2009 and 50th Annual Meeting, Philadelphia, PA, 2010; 13 международной пущинской школыконференции молодых ученых "Биология - наука ХХI века", 2009; of International symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", Pushchino, 2010. Первичная экспертиза диссертации произведена на совместной научной конференции лабораторий механизмов канцерогенеза, иммунохимии опухолей, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и лаборатории математических методов в биологии НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова в НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 12 мая 2011 года. 9 Публикации По теме диссертации опубликовано 47 печатных работ: 13 журнальных статей (из которых 8 в зарубежных журналах), одна статья в специализированном сборнике, а так же тезисы докладов в материалах Российских и международных конференций. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 250 страницах машинописного текста и состоит из Введения, Обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание Материалов и Методов исследования, Результатов исследования, состоящих из двух частей: «Исследование реорганизации цитоскелета, лежащей в основе движения нормальных клеток» и «Исследование изменений, возникающих в результате трансформации», Обсуждения полученных результатов, Выводов и Списка литературы. Работа иллюстрирована 87 рисунками и 29 таблицами. Библиография включает 393 публикаций. Работа выполнена в отделе математических методов в биологии, Научноисследовательском институте им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова; в лаборатории механизмов канцерогенеза, Института канцерогенеза Российского Онкологического научного Центра им. Н.Н. Блохина; ряд экспериментов проводили в Политехнической школе г. Лозанны, Швейцария, совместно с А.В. Верховским, и в институте молекулярной биотехнологии г. Вена, Австрия, совместно с группой проф. Д.В. Смолла. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Клеточные культуры. Подбору клеточных линий для наших исследований мы уделяли особое внимание. В работе было использовано 16 различных клеточных линий эпителиальных клеток и фибробластов мыши, крысы, собаки и человека. Культивирование клеток проводилось при обычных условиях – 37оС и 5% СО2. Методы световой микроскопии, использованные в работе: Фазовый контраст с компьютерным усилением. Фазовоконтрастная микроскопия с компьютерным усилением была предложена и описана ранее А. Верховским (Verkhovsky et al., 2003). Метод основан на том, что после компьютерного вычитания фона из фазово-контрастного изображения, получаемого с видеокамеры, можно повысить контрастность видеокадров и в результате существенно улучшить качество итогового изображения. 10 Флуоресцентная микроскопия. Для флуоресцентного окрашивания актиновых филаментов, фокальных контактов, миозина II, ДНК и p34 субъединицы Arp2/3комплекса применяли фиксацию параформальдегидом (PFA). Покровные стекла, предварительно промытые теплой средой без сыворотки, фиксировали теплым 3,7% раствором PFA на бессывороточной среде DMEM 15 минут. Затем отмывали фосфатным буфером (PBS) 3 раза по 5 минут и обрабатывали 0,1% раствором Triton X100, разведенным на PBS, в течение 3 минут, после снова проводили отмывку PBS три раза по 5 минут. Для окрашивания микротрубочек применялась фиксация клеток холодным метанолом в (-20оС) в течение 20 минут. В работе были использованы следующие антитела и красители: hVIN-1 (Sigma, США); antizyxin 164D (Transduction Lab); anti-myosin (non-muscle) BT561 (Biomedical Technologies Inc); anti-p34-Arc/ARPC2 (Upstate, США) DM1A (Sigma, США); TRITC-anti-rabbit IgG (H+L) (Jackson Immuno Research); TRITC-goat-anti-mouse (Sigma, США); Аlexa 488 goat anti-mouse, Аlexa 488 goat anti-rabbit, Alexa Fluor 488 phalloidin (Molecular Probes); DAPI (Sigma, США). При окрашивании антитела использовали в разведении, рекомендованном производителем. Препараты заключали в раствор эльванола на PBS и затем исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan (Zeiss, Германия) c масляными объективами Plan-Neofluolar ×100 и ×40. Микрофотосъемку препаратов осуществляли с использованием цифровой камеры Olympus DP70 с программным обеспечением (DP Controller). Конфокальная микроскопия. Для более подробного исследования строения актинового цитоскелета часть иммунофлуоресцентно окрашенных препаратов снимали на конфокальном микроскопе (Zeiss, Германия) с увеличением объектива Plan-Neofluar ×100. Полученные Z-серии обрабатывались при помощи программы Image Examiner, в результате чего были получены Z-сечения клеток и измерена средняя толщина ламеллы и средняя толщина раффла. Видеомикроскопия. Видеосъемку осуществляли в специальных камерах для прижизненной съемки, при температуре 37оС, на микроскопах Axioplan (Zeiss, Германия) с объективами Plan-Neofluar x25 и x40, и Nikon Eclipse-Ti с объективом Plan-Neofluar х40. Использовались техники DIC микроскопии, фазово-контрастной микроскопии с компьютерным усилением (Alexandrova et al, 2008), TIRFмикроскопии, для съемки применяли цифровые камеры с охлаждением Hamamatsu (Mode C8484-05G) и Orca-ER Hamamatsu с программным обеспечением Wasabi (Hamamatsu, Япония) и Metamorph. Продолжительность съемки и межкадровые интервалы выбирались в зависимости от задачи эксперимента. Трансфекция живых клеток. Для исследования динамики формирования фокальных адгезий и реорганизации цитоскелета мы использовали метод трансфекции в клетку ДНК белков, меченых флуорохромами (GFP, RFP, mCherry) и с помощью 11 флуоресцентной микроскопии непосредственно следили за перераспределением окрашенных структур в процессе клеточного движения. Трансфекцию проводили с помощью липофектамина (Helicon, USA) и Superfect (Qiagen), согласно инструкциям производителей. Анализ динамики формирования и подвижности клеточных структур. Для анализа динамических преобразований на активном крае клетки (скорости ретроградного движения актина, подвижности адгезионных структур, псевдоподиальной активности и т.д.) мы анализировали отснятые видеопоследовательности, используя режим "Кимограф" в програмных обеспечениях Metamorph и ImageJ. В этом режиме были построены кимограммы (диаграмма, показывающая смещение отдельной точки вдоль заданной линии в течение заданного времени) (Hinz et al, 1999; Bear et al, 2002). Для этого выбирается узкий участок изображения (линия) и на кимограмме выстраивается последовательность этих линий во временной развертке. Смещение каждой точки вдоль выбранного участка видно по образующимся наклонным линиям на кимограмме, а угол наклона показывает скорость смещений. Анализ миграционных способностей клеток. Исследование способностей клеток к миграции мы проводили а) методом длительного наблюдения за миграциями индивидуальных клеток (Ломакина, Александрова, 2009); б) исследованием миграции клеток в экспериментальную рану (Alexandrova et al., 2006) и в) исследованию миграции через миллипоровые фильтры, покрытые и нет матригелем, согласно протоколу производителя (BD Falcon). Использованные ингибиторы и модуляторы движения В экспериментах использовали следующие ингибиторы: Y27632 – ингибитор Rho-киназы, 45 мкМ (Calbiochem); блеббистатин – ингибитор АТФ-азной активности немышечного миозина II, 45, 75 и 100 мкМ (Toronto Research Chemicals Inc.) (10 мМ раствор в DMSO); ингибиторы полимеризации актина – латрункулин А, 0.5, 1, 2 мкМ (Calbiochem) и цитохалазин D 0.2 мкг/мл (Sigma); колцемид (Sigma), – агент, деполимеризующий микротрубочки,0,2 - 0.5 мкг/мл в зависимости от постановки опыта и типа клеток; таксол (пакситаксель, Sigma, 0,2 мкм)– агент стабилизирующий микротрубочки; ингибитор Rho-киназы НА1077 в дозе 30мкМ; ингибитор протеинкиназ Н7 (30мкМ). Форболовый эфир PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) (Sigma Chemical Co., Louis. MO) – активатор протеин киназы С, добавляли к клеткам в концентрации 50 нг/мл за 5 – 6 часов перед началом съемки; D-сфингозин, ингибитор протеин киназы С, в концентрации 5мкМ. Выявление экспрессии белка Ras и определение активности металлопротеаз проводили после электрофоретического разделения белков в 15% 12 полиакриламидном геле с помощью иммуноблотинга и зимографии по стандартным методикам. Электронная микроскопия. Электронная микроскопия применялась для исследования ультраструктуры цитоскелета и ФА. Были использованы два подхода: Метод платиновых реплик. Исследование цитоскелета на фиксированных препаратах, высушенных методом перехода критической точки и напыленных углеродом и платиной по методу, разработанному Т. Свиткиной (Svitkina and Borisy, 1998; Svitkina, 2007). Платиновые реплики исследовали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEOL 1200EX (JEOL, Япония) и CCD камеры ORIUS 835.10W (Gatan) с програмным обеспечением Gatan Digital Micrograph. Изображения представляли в инвертированном виде. Электронная томография. Были исследованы серии снимков, сделанных при повороте негативно окрашенных препаратов с помощью FEI Tecnai F30 Helium (Polara) микроскопа при 300kV и охлаждении примерно до 80оК. Автоматическое сканирование и поворот осуществлялся с помощью программного обеспечения SerialEM версия 2.7.х или 2.8.х. Угол поворота был от -60о до + 60о. Для построения каждой томограммы были использованы серии двух поворотов, полученных при вращении вдоль ортогональных осей. Изображения фиксировали с помощью CCD- камеры Gatan UltraScan 4000. Томограммы на основании полученных серий были получены с помощью программного обеспечения IMOD (the Boulder Laboratory) для трехмерной электронной микроскопии клеток (Kremer et al., 1996; Frangakis and Hegerl, 2005). Для построения моделей использовали полученные Z-стеки, состоящие, как правило, из 90 – 120 секций, каждая около 0.75 нм толщиной. Каждый филамент мы прослеживали и рисовали по всей длине вручную в программе IMOD. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЕОРГАНИЗАЦИИ ЦИТОСКЕЛЕТА, ЛЕЖАЩЕЙ В ОСНОВЕ ДВИЖЕНИЯ НОРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК Исследование инициальных процессов движения клеток и выяснение роли полимеризации актина и акто-миозиновой сократимости в движении клеток. Начальным этапом работы было исследование процессов инициации клеточного движения. В настоящей работе для исследований инициальных процессов клеточного движения было использовано две системы: 1) активация подвижности эпителиальных клеток с помощью HGF/SF (скэттер-фактора) и 13 2) активация движения крысиных фибробластов линии Rat 2/5 с помощью форбологвого эфира PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate). На этих системах было показано, что активация клеточного движения сопряжена с поляризацией клеток и формированием выраженного ведущего края. Необходимым условием для такой поляризации было наличие интактной системы микротрубочек. Так действие HGF/SF на формирование ведущего края и сопутствующие перестройки актинового цитоскелета полностью ингибируются при разрушении микротрубочек с помощью колцемида (2 мкг/мл) или при нарушении динамики их кругооборота с помощью таксола (0.2 мкМ). В литературе существовало мнение, что "разбегание" эпителиальных клеток под действием HGF/SF в первую очередь обусловлено нарушением межклеточных контактов. Для проверки этой гипотезы исследовали действие HGF/SF на многоядерные клетки MDCK, полученные в результате обработки исходных эпителиальных клеток цитохалазином Д (0.2 мкг/мл). Многоядерные клетки содержали 2-8 ядер, были по размеру равны небольшому островку эпителиальных клеток и по периметру демонстрировали псевдоподиальную активность. В работе было показано, что обработка таких клеток HGF/SF приводит к перераспределению псевдоподиальной активности и "разбеганию" многоядерных клеток на отдельные фрагменты, которые остаются связанными между собой узкими длинными участками цитоплазмы. Такое разбегание совершенно аналогично разбеганию отдельных клеток из эпителиального островка под действием HGF/SF. Таким образом, было продемонстрировано, что именно поляризация и формирование ведущего края является наиболее существенным процессом для инициации клеточного движения. Принято считать, что направленное клеточное движение обеспечивается двумя основными процессами: полимеризацией актиновой сети на ведущем краю клетки и подтягиванием тела клетки за счет акто-миозинового сокращения. Задачей этой работы было выявить вклад каждой из этих составляющих в эффективное клеточное движение. Для этого были проанализированы действие ингибиторов полимеризации актина (латрункулина и цитохалазина Д) и действие ингибиторов акто-миозиновой сократимости (блеббистатина и Y27632) на два основных процесса, демонстрирующих клеточную подвижность: а) распластывание клеток на субстрате и б) миграция клеток в экспериментальную рану. В процессе распластывания площадь клеток увеличивается, и, кроме того фибробласты поляризуются, т.е. эффективность распластывания клеток можно оценить по увеличению площади распластывания и степени поляризации. В опытах были использованы крысиные фибробласты REF52. Показано, что обработка клеток ингибиторами сократимости не тормозит распластывания клеток, а наоборот площадь клеток несколько увеличивается, а степень поляризации возрастает очень сильно по сравнению с контролем (Рис.1). 14 Обработка клеток низкими дозами цитохалазина Д и латрункулина А сильно ингибирует распластывание фибробластов. Таким образом для распластывания клеток наиболее критичным является полимеризация актиновой сети на краю клетки. Данные, полученные при ислледовании действия ингибиторов на миграционные способности клеток представлены на Рис. 2. Рис. 1. Действие ингибиторов полимеризации актина (латрункулина А и цитохалазина Д) и ингибиторов акто-миозиновой сократимости (блеббистатина и Y27632) на распластывание фибробластов REF52. Из Рис. 2 видно, что ингибиторы полимеризации актиновой сети существенно замедляют миграцию клеток, и напротив, обработка клеток ингибиторами сократимости приводит к обратному эффекту и способность клеток к миграции увеличивается. При этом хвостовые участки двигающихся клеток сильно удлиняются, т.к. не могут подтягиваться из-за нарушения сократимости. Это и является причиной существенного увеличения поляризации клеток в результате обработки их блеббистатином или Y27632. Рис. 2. Действие ингибиторов полимеризации актина (латрункулин А и цитохалазин Д) и ингибиторов сократимости (блеббистатин и Y27632) на миграцию фибробластов. 15 Рис. 3. Густая культура фибробластов REF52, окраска актина ФИТЦ-фаллоидином. А- контроль; Б – клетки в присутствии ингибитора Y27632. Стрелки указывают места, где клетки перекрываются друг с другом ламеллиподиями. Была исследована способность фибробластов к формированию монослоя у контрольных клеток и в присутствии ингибиторов сократимости (Рис. 3). Нормальные фибробласты в густой культуре формируют монослой, плотно соприкасаясь с соседними клетками, но не залезая на них. Обработка клеток Y27632 приводит к тому, что фибробласты образуют многослойные культуры. Длинные хвостовые участки налегают на соседние клетки. Кроме этого видно, что клетки могут пересекаться и за счет широких ламелл (Рис. 3Б, отмечено стрелками). Полученные результаты означают, что акто-миозиновая сократимость не играет существенной роли в осуществлении клеточного движения, а скорее важна для «правильного» формирования клеточных слоев и соответственно для формирования органной структуры. Таким образом, наиболее существенным процессом для движения клеток является именно образование новых протрузий на ведущем краю клеток. Исследование динамических преобразований на ведущем активном крае в процессе распластывания и движения клеток. Поскольку, как было показано, формирование ведущего края является наиболее существенным этапом клеточного движения, дальнейшей задачей стало исследование структуры и динамики ведущего края. С помощью флуоресцентной видеомикроскопии и метода компьютерно-усиленной фазово-конрастной микроскопии, предложенного А. Верховским (Verkhovsky et al., 2003) исследовали динамические преобразования на ведущем крае клетки при движении. Было показано, что на ведущем краю можно выделить две четко выраженных зоны, отличающихся по динамике актина и между ними видна ясная граница (Рис. 4). 16 Рис. 4. Фибробласт REF52 через 5 часов после посадки на стекло. В клетку инъецировали актин, меченный родамином, и исследовали ее с помощью техники фазового контраста (А) и флуоресцентной микроскопии (Б). Головками стрелок (А) обозначено зона быстрого актинового тока (ламеллиподия), пунктирными линиями (А) указан район, использованный для построения кимограмм (В, Г), стрелки на кимограмме (В) указывают наклон линий интенсивности, отражающие скорость актинового тока. Масштаб 5мкм, на кимограммах вертикальный масштаб 2 мкм, горизонтальный - 2 мин. Крайняя зона – ламеллиподия - обозначена стрелками на Рис. 4 А. Видно, что ламеллиподия отличается от ламеллы, расположенной ближе к центру клетки, более высокой концентрацией актина (Рис. 4 Б) и различиями структуры, видимыми как на фазовом контрасте, так и на флуоресценции. Кимограммы, построенные на флуоресцентном изображении и на фазовом контрасте показывают одинаковую скорость актинового тока (0,8 мкм/мин в ламеллиподии и 0,6 мкм/мин в ламелле). Было показано, что скорости обратного актинового тока могут различаться в разных клетках, в зависимости от их состояния и фазы движения. Так скорости тока в ламеллиподии могут быть от 0.5 до 7 мкм/мин, а скорости тока в ламелле – от 0.05 до 2.5 мкм/мин соответственно, но, в одной и той же клетке всегда скорость тока в ламеллиподии много выше, чем в ламелле и между ними существует четкая динамическая граница. Таким образом, было показано, что на активном ведущем краю имеются две зоны, различающиеся по строению и динамике, и между этими зонами существует четко выраженная граница. Эти зоны соответствуют описанным ранее ламеллиподии и ламелле (Salmon et al., 2002; Ponti et al., 2004). Ширина зоны ламеллиподии зависит от активности клетки, и так же как и фактическая скорость ретроградного тока может изменяться в зависимости от типа и от состояния клеток, но разница между быстрым током в ламеллиподии и более медленным в ламелле всегда остается существенной. Следующей задачей данной работы было исследование молекулярных механизмов, регулирующих ретроградный ток актина в ламеллиподии и ламелле. Для этого прямо под микроскопом были добавлены ингибиторы: 17 а) полимеризации актиновых филаментов (цитохалазин Д в дозе 0,2 мкМ), или б) ингибитор сократимости НА1077 в дозе 30мкМ (Рис.5). Добавление цитохалазина Д приводит к немедленному аресту распластывания и уменьшению скорости обратного актинового тока в ламеллиподии с 2,6 мкм/мин до 0,4 мкм/мин. Скорость актинового тока в ламеллиподии становится равной скорости тока в ламелле, исчезает граница между этими двумя зонами, т.е. фактически ламеллиподия исчезает и остается только ламелла. Пунктирная линия на кимограмме Е показывает время добавления 30мкМ НА1077, которое приводит к уменьшению скорости ламеллярного тока (от 1 до 0,4 мкм/мин), не вызывая изменений в динамике актинового тока в ламеллиподии (4,5 мкм/мин). Таким образом, было показано, что за существование ламеллиподии отвечает полимеризация актиновых филаментов на краю клетки, тогда как динамика актина в ламелле определяется акто-миозиновой сократимостью. Рис. 5. Влияние ингибиторов полимеризации актина и акто-миозиновой сократимости на динамику обратного тока актина в ламеллиподии и ламелле. Распластывание клетки меланомы В16, экспрессирующей GFP-актин. Фазово-контрастная (А) и флуоресцентная микроскопия (Б), анализ кимограмм аналогичен Рис. 4. Пунктирная линия, отмеченная "CD" на кимограмме В показывает время добавления цитохалазина Д 0,2 (мкМ). (Д) Усиленный фазовый контраст и кимограммы (Е) распластывающегося фибробласта линии Swiss 3T3. Пунктирная линия на кимограмме Е показывает время добавления 30мкМ НА1077. Масштаб 5мкм, на кимограммах вертикальный масштаб 2 мкм, горизонтальный - 2 мин. 18 Наличие четкой границы между ламеллиподией и ламеллой предполагает, что именно в районе этой границы и происходит переключение механизмов, отвечающих за ретроградный ток актина. Эта граница была определена на основе как анализа скорости, резко меняющейся при переходе от одной зоне к другой, так и на анализе текстуры актиновой сети, видной и на флуоресцентных изображениях и на фазовом контрасте (Рис. 4, 5). Интересно, что эта граница не гладкая, а состоит из нескольких сегментов. Выступы этих сегментов соотносятся на концах с радиально расположенными пучками актиновых филаментов, т.е. вероятно совпадают с фокальными контактами. Поэтому следующим шагом наших исследований стал детальный анализ соотношения между динамикой актинового тока и адгезионными контактами. Такой анализ приведен на Рис. 6. Видно, что положение фокальных адгезий, меченных YFP-паксиллином, совпадает с границей ламеллиподия - ламелла. Рис. 6. Изменение динамики актинового тока в ламеллиподии при формировании ФА. Распластывающийся фибробласт линии REF-52, экспрессирующий YFP-паксиллин. (A) Наложение изображений, полученных с помощью усиленного фазового контраста (серое изображение) и флуоресцентной микроскопии (красный) (слева) и кимограмма (справа). (Б) Выборочные кадры из видеопоследовательности в районе, обозначенном белым квадратом на (А), демонстрируют формирование новых ФА и соответствующего смещения границы между ламеллой и ламеллиподией, время указано в мин:сек. Белыми головками стрелок указано образование ФА. Масштаб 5 мкм, на кимограммах вертикальная черта - 2 мкм, горизонтальная - 2 мин. 19 Анализ кимограмм (фазовый контраст наверху, флуоресценция посередине и наложение двух изображения - внизу) показывает, что быстрый ток актина не заходит за места адгезий. В то же время зона медленного активного тока выдвигается вперед одновременно с образованием новых фокальных адгезий. Стрелки на кимограммах нарисованы параллельно линиям с одинаковой интенсивностью и показывают скорость быстрого тока (4,5 мкм/мин), скорость медленного тока (0,5 мкм/мин) и скорость скольжения вновь образованной фокальной адгезии (0,15 мкм/мин) Новые ФА (паксиллин-позитивные точка, обозначенная головкой стрелки) формируются в зоне ламеллиподии в течение 30 сек (Б). При этом наблюдается нарушение (завихрение) тока, видимое на фазовом контрасте как усиление оптической плотности в передней части ФА. Вслед за формированием ФА следует выдвижение ламеллы (темная граница между ламеллиподией и ламеллой видна на фазовом контрасте). Изложенные выше исследования предполагают, что формирование ФА определяет положение границы между двумя зонами активного клеточного края. Чтобы проанализировать динамическую организацию активного края в отсутствии ФА мы посадили клетки на субстрат, покрытый поли-L-лизином в бессывороточной среде, т.е. в отсутствии сывороточных белков и белков внеклеточного матрикса. Рис. 7. Граница ламеллиподия-ламелла не образуется в отсутствии ФА. Фибробласт REF-52 распластывался в бессывороточной среде на подложке, покрытой полилизином (poly-L-lysine). Кимограмма построена вдоль пунктирной линии, нарисованной на левом изображении. Масштаб 5 мкм, на кимограммах вертикальная черта - 2 мкм, горизонтальная - 2 мин. В этих условиях клетки прикрепляются к субстрату и распластываются, но ФА и стресс-фибрилл не образуется. После посадки клетки начинают быстро распластываться на поли-L-лизине, но через некоторое время процесс останавливается на стадии, когда образуется довольно широкие равномерно распластанные края и выступающая центральная часть клетки (Рис. 7). Анализ динамических и структурных характеристик распластывания показал, что в этих условиях ретроградный ток на активном краю равномерный от края и до околонуклеарной части клетки, структура так же равномерная и нет деления на ламеллиподию и ламеллу. Кимограмма на рисунке показывает равномерный 20 ретроградный актиновый ток со скоростью 1,6 мкм/мин. Скорость тока в таких клетках или одинаковая по всей ширине распластанного края, или постепенно уменьшается к центру клетки и по своим значениям промежуточная между быстрым и медленным током у клеток, распластывающихся в обычных условиях. Таким образом, две зоны не образуются в отсутствии ФА, доказывая тот факт, что граница между ламеллиподией и ламеллой не только пространственно совпадает с ФА, но и зависит от их наличия. Так же было показано, что начало формирования всех ФА происходит в зоне ламеллиподии (подсчитано 194 события – формирования ФА в 8 распластывающихся клетках). Если ингибировать образование ламеллиподии с помощью ингибитора полимеризации актина цитохалазина Д, образования новых ФА не происходит. Медленный ток актина, наблюдаемый позади от краевой линии ФА существует не только в зоне ламеллы, свободной от крупных пучков микрофиламентов, но так же и внутри фазово-плотных пучков, соответствующих стресс-фибриллам и оканчивающихся в местах фокальных контактов. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ ОБРАЗОВАНИЯ ФОКАЛЬНЫХ АДГЕЗИЙ ПРИ ДВИЖЕНИИ КЛЕТОК. ИНИЦИАЛЬНЫХ В качестве маркера инициальных ФА использовали белок VASP, так как ранее было показано, что VASP появляется на самых ранних стадиях формирования адгезионных контактов (Rottner et al., 1999). Кроме того VASP участвует в полимеризации актина на активном клеточном крае и поэтому у клеток, трансфицированных флуоресцентно-меченым VASP в момент образования протрузий внешний край ламеллиподии окрашивается. Таким образом, этот белок может одновременно четко обозначать границы клетки, выступать маркером краевой активности и маркером инициальных ФА. Для проведения исследования динамики формирования ФА исследуемые клетки, помимо VASP, были трансфицированы плазмидами, несущими ДНК других белков фокальных адгезий, слитыми с флуоресцирующими белками GFP или RFP. Во всех случаях совместной экспрессии VASP и любого другого белка ФА сначала в зоне ламеллиподии формировалась точка, положительно окрашиваемая на VASP, и позже, с задержкой в 20 -50 секунд в эту точку приходил и другой исследуемый белок ФА. Исследована совместная динамика VASP c винкулином, паксиллином, зиксином и трансмембранным белком ФА бета-3-интегрином, который может служить маркером взаимодействия клетки с субстратом. В качестве примера обработки полученных результатов анализ динамической ко-локализации VASP c бета-3-интегрином представлен на Рис. 8. На рисунке показаны первый и последний кадр видеопоследовательности движения клетки В16, трансфицированной mCherry-VASP (красный) и EGFP-бета-3-интегрином (зеленый) (Рис. 8 А), а также монтаж из последовательности кадров одного из 21 участков ламеллиподии с вновь образующимися ФА (обозначено белой стрелкой). На графике интенсивности флуоресценции в точке возникновения ФА видно два пика интенсивности VASP (красная линия). Первый соответствует времени прохождения через исследуемую точку краевой линии VASP, а второй – формированию ФА. Зеленая линия показывает интенсивность бета-3-интегрина в этой же точке. Видно, что бета3-интегрин пришел в образующуюся ФА с задержкой 10 кадров (50 секунд) по сравнению с VASP и максимальная интенсивность бета-3-интегрина была достигнута на 15 кадров (75 секунд) позже, чем максимальная интенсивность VASP. Рис. 8 Динамическая ко-локализация mCherryVASP и EGFP-бета-3-интегрина в клетке В16. A – два кадра видеопоследовательности совместной динамики mCherryVASP и EGFP-бета-3-интегрина, снятые с интервалом 40 секунд. Б – монтаж последовательности кадров участка, обозначенного рамкой, интервал между кадрами секунд. Белой стрелкой показано место возникновения ФА. В – график изменения интенсивности свечения в месте возникновения ФА во время клеточного движения. Красный – изменение интенсивности VASP, зеленая линия – изменение интенсивности бета-3-интегрина. Общее количество кадров – 121.. 22 Для того, чтобы исследовать степень встраивания белков ФА во вновь образующиеся структуры, проводили следующие эксперименты. Непосредственно после того, как были отсняты видеофильмы с формированием новой ФА, проводили экстракцию клеток раствором Тритона Х-100 прямо под микроскопом. С помощью такого подхода было показано, что основные белки ФА – VASP, винкулин, паксиллин, бета-3-интегрин после экстракции остаются в точках новых ФА, т.е. они на самых ранних стадиях образования ФА структурно закреплены в этих точках. Белок зиксин, ранее описанный, как компонент более зрелых ФА (Zaidel-Bar et al., 2003), демонстрирует сходную динамику включения при образовании ФА, т.е. также как и остальные белки ФА концентрируется в точке формирующейся ФА на 20-40 секунд позднее VASP. При этом оказалось, что при экстракции Тритоном Х-100, зиксин не остается в точках формирующихся ФА. Это означает, что несмотря на то, что хотя зиксин, также как и другие белки, концентрируется в VASP-положительных точках при формировании ФА, он еще не вовлечен в структуру и не закреплен . Вероятно для закрепления зиксина требуется дополнительное условие (например, дополнительное механическая сила, обусловленная наличием локальных ретракций на ведущем краю клетки). Именно поэтому в предыдущих работах, основанных в основном на исследовании фиксированных и экстрагированных клеток, зиксин не регистрировался в ранних ФА, а встречался только в истинных фокальных контактах, образованных при созревании фокальных комплексов под действием дополнительного актомиозинового натяжения (Zaidel-Bar et al., 2003). Одним из методов исследования ФА является интерференционно-рефлекторная микроскопия (IRM), с помощью которой можно выявить участки клетки, близко прилегающие к поверхности субстрата (Izzard and Lochner, 1980). С помощью IRM Иззард и Лохнер выделили «черные контакты» - места близкого прилегания клетки к субстрату (расстояние между мембраной и поверхностью субстрата 10-15 нм), , названные ими фокальные контакты, и «серые контакты» (расстояние между клеткой и субстратом около 30 нм), названные «близкими контактами». Среднее расстояние между клеткой и субстратом вне ФА > 100 нм. Как показали дальнейшие исследования, фокальные контакты, идентифицированные с помощью флуоресценции, выглядят, как черные штрихи, а фокальные комплексы, как черные точки. С помощью IRM исследовали инициальные ФА, и показали, что инициальные точки, обогащенные VASP, относились к «серым» контактам, согласно определению Иззарда и Лохнера. Эти серые точки часто входили в состав довольно широкой серой полосы, лежащей в основании ламеллиподии, и представляли собой локальные затемнения в тех местах, где VASP совпадал с интегрином. Несмотря на то, что эти точки были темно-серые, они были заметно светлее истинно «черных» контактов, удлиненных структур, расположенных в 23 центральной части клетки и содержащих VASP и интегрин. Это означает, что клеточная мембрана в этих точках подходит довольно близко к поверхности, но не так близко, как в местах фокальных контактов. Вероятно, это происходит потому, что в точке инициальной ФА клетка присоединяется к субстрату через интегриновые рецепторы, но эта точка очень мала и не создает области "черного" контакта. Таким образом, была показана роль белка VASP, как организатора формирования новых ФА – инициальных ФА. Было показано, что инициальные ФА – это нестабильные структуры, в быстро двигающейся клетке (например, меланоме В16) большинство из них существует только в течение нескольких минут, пока зона ламеллиподии не пройдет через это место, а далее они растворяются. Для их дальнейшего созревания требуется дополнительные факторы, например локальные ретракции края клетки. Но при этом эта стадия является необходимой, так как все более зрелые ФА (фокальные комплексы и фокальные контакты) развиваются на месте инициальных ФА. Чтобы полно охарактеризовать эту начальную стадию формирования ФА, надо было исследовать строение актиновой сети в области инициальных ФА. Из-за их нестабильности это было возможно сделать, только применив коррелятивную видео и электронную микроскопию. Этот метод позволяет последить формирование новой ФА под TIRF микроскопом, а потом, с помощью электронного микроскопа, исследовать структуру ФА с известной историей. Было исследовано более 50 клеток и проанализировано строение VASPположительных инициальных ФА. Показано, что если новые ФА формируются в основании филоподий или на месте локальной ретракции, то на электронномикроскопическом уровне на месте VASP-положительной точки актиновые филаменты собираются в небольшие, короткие пучки, состоящие из нескольких филаментов. Если в клетку трансфицировать винкулин и зиксин, эти белки, как правило, обнаруживается в составе таких ФА. Если новые ФА формируются в ламеллиподии и не связаны с локальными ретракциями, в этих точках не удается выявить специфической структуры актиновой сети, которая отличалась бы от структуры окружающей ламеллиподии. В составе таких ФА также обнаруживается трансфицированный GFP-винкулин, но не зиксин. Для более точного исследования трехмерной структуры ФА, находящихся на разных стадиях созревания, использовали корреляцию видеомикроскопии и электронномикроскопической томографии. На Рис. 9 дано пример анализа материала и корреляции световой и электронной микроскопии при исследовании структуры ФА. Для дальнейшего анализа были выбраны две адгезии (показаны стрелками на Рис. 9 Б). Одна - на ведущем краю клетки, представленная точкой VASP, время жизни которой около 60 секунд; другая – более зрелая штриховая адгезия, 24 размером 1,5 мкм, которая существовала на протяжении всего видеофильма и заметно за это время увеличилась в размере. Исследование структуры этих адгезий проводилось с помощью электронной томографии. Рис. 9. Процедура корреляции видео и электронных изображений ФА. А – монтаж видеопоследовательности клетки 3Т3, трансфицированной GFP-VASP и стимулированной инъекцией доминантно-активного Rac. Время указано в секундах; Б – последний кадр перед фиксацией, окраска на VASP, стрелками показаны места ФА, выбранные для дальнейших исследований. В – наложение актиновых структур, выявленных с помощью ТРИТС-фаллоидина (красный) на негативное окрашивание для точной корреляции видео и электронной микроскопии; Г – наложение окрашивания VASP на предыдущую картинку, для определения места исследуемых ФА. Было показано, что в области инициальной ФА структура актиновой сети ничем не отличается от структуры актиновой сети окружающей ламеллиподии (Рис. 10). Отдельные филаменты были прослежены и прорисованы вручную. Оказалось, что в районе инициальной ФА, также как и в окружающей ламеллиподии, есть довольно большое количество окончаний актиновых филаментов. Вопреки ожиданиям, эти свободные концы микрофиламентов не связаны с нижней или верхней поверхностью клетки, а равномерно распределены в толще ламеллиподии. В отдельных случаях толщина ламеллиподии в месте инициальной ФА была несколько больше, чем в окружающих районах, но это было показано не для всех исследованных инициальных ФА. 25 Рис. 10. Электронно-микроскопическая томограмма инициальной ФА. А – структура актинового цитоскелета ламеллиподии, место инициальной ФА обведено красным овалом. На врезке указано место исследуемой ФА. Б, В – трехмерная модель строения инициальной ФА; Б – вид сверху; В – вид сбоку. Актиновые филаменты – зеленые, концы филаментов отмечены красными точками, область инициальной ФА обведена голубой линией. Структура более зрелой ФА представлена на Рис. 11. Эта ФА имеет размеры 1,5 мкм. На Рис. 11 Б видно, что эта ФА представлена небольшим пучком, который расположен ближе к нижней поверхности клетки и начинается сразу за густой сетью микрофиламентов, типичной для ламеллиподии, т.е. адгезия находится в основании ламеллиподии. Анализ показал, что в основном филаменты, составляющие этот пучок, начинаются у нижней поверхности клетки, но часть филаментов этого пучка являются прямым продолжением филаментов из ламеллиподии. При этом выше фокального комплекса под верхней мембраной клетки актиновые филаменты организованы в сеть (Рис. 11 А). Подмембранная сеть (А) и пучок микрофиламентов (Б) хотя и разделены пространственно, но не являются абсолютно автономными структурами, так как значительное количество микрофиламентов из верхней сети переходят в состав пучка. На других препаратах было показано, что во всех адгезиях, которые можно отнести к фокальным комплексам, согласно их размеру и времени жизни, актиновые филаменты собраны в мелкие пучки, расположенные ближе к нижней поверхности клетки. Эти пучки в основном короткие, состоят всего из нескольких филаментов и не связаны с актиновыми пучками, идущими к центральной части 26 клетки. В таблице 1 представлены основные характеристики инициальных ФА, фокальных комплексов и фокальных контактов для более наглядного сопоставления этих структур. Таблица 1. Классификация адгезионных структур. Характеристики Инициальные Фокальные Фокальные ФА ФА комплексы контакты Необходимость миозин II-зависимой сократимости - - + Наличие спец. структуры на ЭМ уровне - + + Необходимость Arp 2/3-зависимой полимеризации актина + + - Структура актинового цитоскелета на месте ФА Густая сеть актиновых филаментов (ламеллиподия) Мелкие пучки из нескольких актиновых филаментов, Акто-миозиновые сократимые пучки Положение в клетке Ламеллиподия Граница лп- На конце стресслам, основание фибрилл, в центре филоподий клетки и в хвостовых отростках Белки ФА, входящие в состав Все белки ФА, но зиксин физически не включен в состав структуры Все белки ФА Все белки ФА Связь с интегрином (ВКМ) + + + IRM Серые контакты Черные контакты Черные контакты 27 Рис. 11. Электронно-микроскопическая томограмма более зрелой ФА. На врезке показано расположение исследуемой ФА. А - подмембранный слой актиновых филаментов, Б - организация цитоскелета у нижней поверхности клетки. Таким образом, было показано, что при формировании новой адгезии, существует короткоживущая стадия, которая предваряет фокальные комплексы и является совершенно обязательным этапом образования новой ФА. Эта стадия инициальные ФА - по нескольким признакам отличается от фокальных комплексов, образование которых ранее считалось первым шагом формирования ФА. ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ, ВОЗНИКАЮЩИХ В РЕЗУЛЬТАТЕ ТРАНСФОРМАЦИИ Подбор клеточных систем для исследования. Неопластическая трансформация приводит к существенному изменению формы клеток, их цитоскелета и характера движения. Изменения цитоскелета при трансформации было отмечено давно (Bershadsky and Vasiliev, 1988; Vasiliev and Gelfand, 1981; Mani et al, 2008; Polyak and Weinberg, 2009), в частности хорошо известны редукция актиновых стресс-фибрилл и нарушение созревания фокальных контактов у опухолевых клеток. Было показано также, что такая организация цитоскелета часто коррелирует с повышением локомоторной активности и/или метастатического потенциала опухолевых клеток (Pokorna et al., 1994, Sachai and Marshall, 2003), но остается неясным, каким образом эти изменения цитоскелета связаны с изменением характера клеточного движения и возникновением у клеток способности к инвазии. Нашей задачей было выявление особенностей морфологии и цитоскелета трансформированных клеток, существенных для приобретения инвазивного фенотипа. Для этих исследований мы выбрали три разные клеточные системы, включающие в себя контрольные фибробласты и их трансформированные 28 производные, для того, чтобы иметь возможность сравнивать клетки, находящиеся на разных стадиях опухолевой трансформации: 1). Модель моноонкогенной Ras-трансформациии: клетки 10(3), являющиеся иммортализованными мышиными фибробластами (Harvey and Levine, 1991), использовались нами как контроль, а 10(3)RAS – линия, полученные путем трансфекции исходной линии 10(3) плазмидой с геном конститутивно активного белка N-RASasp13, использовалась в качестве модели Ras-трансформации; 2). Линия клеток эмбриональных легочных фибробластов человека MRC5 и ее трансформированные аналоги, полученные в результате инфицирования исходной линии вирусом SV-40 - MRC5-V1 и MRC5-V2 (Huschtscha and Holliday, 1983). Обе производные линии обладают повышенной митотической активностью, у них появляются способность образовывать колонии в полужидком агаре, они положительны по T-антигену и являются иммортализованными. Однако MRC-5V2 способны расти в более бедной среде (с меньшим количеством глюкозы, без метионина), быстрее делятся, продуцируют большее количество свободного вируса на ранних пассажах, и среди них чаще встречаются полиплоидные клетки. Эти свойства позволили авторам определить MRC-5V2 как клон, обладающий более трансформированным фенотипом; 3). Нормальные подкожные фибробласты человека линии 1036 в качестве контрольных клеток и клетки опухолевого происхождения - линия фибросаркомы человека НТ1080. Фибробласты 1036 демонстрировали признаки нормальных клеток и при длительном культивировании старели. Клетки фибросаркомы хорошо образуют колонии в полужидкой среде и согласно литературным данным вызывают образование опухолей у животных, т.е. являются типичными опухолевыми клетками. Во всех этих системах контрольные клетки имели морфологию типичных фибробластов: это были хорошо распластанные, поляризованные клетки с выраженными актиновыми стресс-фибриллами, ассоциированными с крупными фокальными контактами. В результате трансформации площадь клеток уменьшалась, существенно редуцировались актиновые стресс фибриллы, а количество и размер фокальных контактов снижались. Таким образом, во всех трех системах была ярко выражена классическая морфологическая трансформация. Необходимо отметить, что степень выраженности признаков трансформации несколько отличалась среди использованных клеточных систем. Так в мышиных фибробластах 10(3), трансформированных онкогеном Ras, описанные изменения были выражены в меньшей степени, чем у других трансформированных культур, например, наблюдалось довольно большое количество клеток с остаточными пучками микрофиламентов. SV40трансформированные легочные фибробласты MRC-5V1 (в меньшей степени) и MRC-5V2 (в большей степени) по многим исследованным признакам 29 приближаются к высоко-инвазивным клеткам фибросаркомы НТ1080 и могут рассматриваться, как клетки с более выраженной морфологической трансформацией. Таким образом, в работе рассматриваются и сравниваются клетки, находящиеся на разных стадиях трансформации, что дает возможность выделить изменения, наиболее существенные для появления у клеток способностей к инвазии. С помощью конфокального микроскопа на примере системы легочных фибробластов, показаны типичные изменения актинового цитоскелета, сопровождающие трансформацию клеток и видимые на световом уровне (Рис. 12). Сами клетки становятся мельче, уменьшается количество пучков актиновых филаментов, однако сильно увеличивается толщина клеток. Нормальные клетки довольно плоские, толщина ламеллы составляет около 1 мкм и лишь в области раффлов может достигать 2 мкм. На Z-срезах клеток MRC-5V1 видно большое количество краевых раффлов, эти области утолщены, по сравнению с остальными частями ламеллы (2 мкм) и их толщина достигает 3мкм. На Z-срезах клеток MRC5V2 видно значительное утолщение ламеллы, по сравнению с контролем. Толщина ламеллы составляет в среднем около 2,3 мкм, а в области раффлов достигает 4,5 мкм. Поскольку, как было показано ранее, в движении клеток определяющую роль играет формирование ведущего края, задачей данной работы было сравнительное исследование распределения и характера краевой активности у нормальных и трансформированных клеток. Краевую активность оценивали на основе видеофильмов, полученных в результате прижизненного наблюдения за одиночными интерфазными клетками исследуемых линий в течение 10 минут. Исследование морфологических параметров клеточного края включало измерение количества и длины участков, относящихся к различным типам нестабильности (сильноактивные, слабоактивные и ретрактирующие участки). Сильноактивные – это участки, расположенные, как правило, на ведущем краю клетки, где активно образуются новые протрузии, иногда сопровождаемые локальными ретракциями; слабоактивные участки – нет постоянного образования протрузий, но есть мелкие ламеллиподии и/или филоподии; ретрактирующие участки – там, где в течение съемки наблюдается устойчивая ретракция. Анализ показал, что у всех исследованных контрольных фибробластов стабильный край занимает примерно половину всего периметра клетки (Рис. 13). Это совпадает с результатами, полученными другими авторами (Добринских, 2007). В результате трансформации существенно увеличивается доля активного края и существенно снижается доля стабильного. Причем, степень увеличения доли активного края (и соответственно снижения доли стабильного края) напрямую зависит от степени трансформации клеток. Так, в системе моноонкогенной 30 трансформации онкогеном N-Ras доля активного края увеличивается с 44% до 65%, а в системах SV40-трансформированных клеток и фибробласты кожи – фибросаркома, доля активного края увеличивается до 86-87% и до 92% соответственно. При таком существенном возрастании доли активного края клетки утрачивают полярность, и наиболее трансформированные клетки, MRC5V2 и фибросаркома НТ1080, не имеют выраженного ведущего края и практически не поляризованы. Рис. 12. Конфокальная микроскопия препаратов с флуоресцентным окрашиванием фаллоидином, коньюгированным с ФИТЦ, и построение Z-срезов. А. Клетка MRC5. Б. Клетка MRC-5V1. В. Клетка MRC-5V2. Красным выделен участок клетки, на котором был построен Zсрез. Красная линия обозначает плоскость построения Z-среза. Масштаб 5 мкм. Следует отметить, что при более длительном наблюдении (до 40 минут) у трансформированных клеток на стабильных участках наблюдалось появление активности в виде образования мелких филоподий или ламеллиподий, а иногда и развивалась сильная протрузионная активность. У контрольных клеток стабильные участки оставались «истинно стабильными» на протяжении длительного времени. Для дополнительного исследования распределения активного края применялись методы иммунофлуоресцентного окрашивания антителами к p34 31 субъединице Arp2/3-комплекса. Зонам активной Arp2/3-зависимой полимеризации актина, т.е. протрузиям соответствуют ярко окрашенные полоски по периметру клеток. В контроле наблюдалось диффузное окрашивание цитоплазмы и яркий ободок свечения Arp2/3 на самой кромке ведущей ламеллы, можно было четко выделить и стабильные (неокрашенные) участки края. У трансформированных клеток сильно возрастало количество и протяженность светящихся участков. Следует отметить, что свечение отмечалось не только на крупных участках активности, но и на концах мелких ламеллиподии и филоподий, которые классифицировались нами ранее как слабоактивные участки. Рис. 13. Распределение краевой активности по периметру клеток. Сту – стабильный край клетки; сау – сильно активные участки; слау – слабо-активные участки; ру – ретрактирующие участки Таким образом, увеличение доли активного края и соответственно уменьшение доли стабильного можно считать таким же признаком трансформации, как и исчезновение в клетках стресс-фибрилл. В настоящей работе исследовали не только изменение распределения активности по периметру клетки, но также изменение динамики образования протрузий на ведущем крае клеток при трансформации. С помощью DIC видеомикроскопии и последующего построения кимограмм было выяснено, что для контрольных фибробластов типичными являются крупные, плоские и широкие протрузии и довольно низкая активность раффлинга. Раффлы образуются из не прикрепившихся протрузий, они контрастные в DIC-микроскопе и поэтому выглядят на кимограммах, как белые линии. 32 На Рис. 14 видно, что раффлы двигаются от края клетки к центру со скоростью, практически равной скорости локальной ретракции протрузий и скорости обратного тока актина в ламеллиподии. В норме наблюдаются отдельные раффлы, появляющиеся вслед за крупной протрузией (Рис.14 А). У всех трансформированных клеток частота раффлов существенно повышается (в 1,5-3,2 раза) и превышает частоту протрузий, т.е. раффлы образуются и в отсутствии видимых протрузий. У наиболее трансформированных клеток раффлы могут сливаться в единый "вал" видимый позади небольшой ламеллиподии, или располагаться в несколько рядов. Такое расположение свидетельствует о частом возникновении дорзальных раффлов, не ассоциированных с образованием протрузий, что совпадает с картиной, наблюдаемой в конфокальный микроскоп (Рис. 12 В). Рис. 14. Кимограммы, иллюстрирующие псевдоподиальную активность на ведущем крае MRC-5 (A), MRC-5V1 (Б) и MRC-5V2 (В) клеток. А. Видны крупные плоские протрузии. Б. Наблюдается активный раффлинг, протрузии более мелкие и частые, чем в контроле. В. Наблюдаются раффлы, сросшиеся в единый «вал». Ламеллоподии довольно мелкие и частые. Повышенное образование дорзальных раффлов трансформированными клетками отмечалось также другими авторами (Buccione et al., 2004). Анализ динамической активности на ведущем краю клеток показал, что в результате трансформации возрастает частота протрузий и ретракций, но размеры протрузий уменьшаются по сравнению с нормальными клетками. Поскольку характер движения ведущего края должен быть связан со структурой цитоскелета, были проведены ультраструктурные исследования актинового цитоскелета нормальных и SV40-трансформированных фибробластов на электронно-микроскопическом уровне методом платиновых реплик (Svitkina and Borisy, 1998; Svitkina, 2007). Особое внимание было обращено на строение периферических районов для анализа причин различий краевой активности у нормальных и трансформированных клеток. Электронно-микроскопическое исследование показало, что ламеллиподия на ведущем краю нормальных клеток представлена густой регулярной сетью 33 Рис. 15. Ультраструктура актинового цитоскелета контрольного фибробласта MRC5. А - общий вид протрузии, Б - участок ведущего края с ламеллиподией и филоподиями, В - большое увеличение, упорядоченная сеть актина в ламеллиподии; Г - участок стабильного края, Д - большое увеличение краевого пучка. 34 микрофиламентов (Рис. 15, А, Б, В), на краю которой видны окончания отдельных филаментов и с очень небольшими "дырками" в сети. Вдоль стабильного края клетки идет мощный пучок актиновых филаментов и с внешней стороны от этого пучка нет ни филоподий, ни ламеллиподий. Рис. 16. Ультраструктура актинового цитоскелета клетки MRC-5V2. А. Общий вид клетки Б. Тонкий «краевой пучок» актина (АП) в хвостовой части клетки с мелкими ламеллиподиями (Л), выходящими за его границы. В. Сильно-активный участок ведущего края, отмеченный белой рамкой на А. Видна небольшая ламеллиподия с нерегулярной актиновой сетью. Г. Слабоактивный участок края в боковой части клетки. Виден тонкий актиновый пучок (АП) и ламеллиподия (Л) с нерегулярной сетью актиновых микрофиламентов. 35 На Рис. 16 приведены платиновые реплики клетки MRC-5V2, как пример Ультраструктуры цитоскелета трансформированной клетки. На активном краю видны раффлы, ламеллиподия представлена гораздо менее упорядоченной сетью филаментов с большими "дырами" (Рис. 16 В). Вдоль боковой границы клетки идет тонкий и не плотный краевой пучок актина, который не ограничивает образования мелких ламеллиподий (Рис. 16 В, Г) или филоподий (Рис. 16 Г) с внешней стороны. Таким образом, полученные данные подтверждают отсутствие «истинно стабильного края» у трансформированных клеток ЛОКОМОТОРНОЕ ПОВЕДЕНИЕ НОРМАЛЬНЫХ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ И Задачей настоящей работы было выяснение вопроса как описанные нами изменения, возникающие при трансформации, влияют на локомоторную активность клеток. Для более объективной оценки локомоторных способностей клеток мы применили несколько методов оценки эффективности миграции: индивидуальная миграция одиночных клеток в отсутствии специфических стимулов, миграция клеток в экспериментальную рану и миграция клеток через миллипоровые фильтры, без дополнительного покрытия (3-D субстрат) или покрытые матригелем (модель инвазии). Во всех опытах были получены существенные различия в локомоторном поведении контрольных и трансформированных клеток, как на двумерном, так и на трехмерном субстрате. Существенные различия наблюдались в количестве клеток, вышедших в экспериментальную рану за 24 часа: в зависимости от культуры число вышедших в рану трансформированных клеток превышало количество контрольных в 2-10 раз (Рис. 17). Рис. 17. Увеличение в результате трансформации кол-ва клеток, мигрировавших в экспериментальную рану 36 Различия между нормальными и трансформированными клетками при анализе расстояния, на которое мигрировали клетки разных линий, были выражены гораздо меньше. Трансформированные клетки двигались в рану фронтом, в отличие от нормальных клеток, которые двигались поодиночке. Необходимо отметить, что клетки фибросаркомы могли открепляться от монослоя и «высеваться» в свободную область экспериментальной раны, и таким образом оккупировали свободный субстрат гораздо скорее, чем остальные исследованные линии. При анализе движения одиночных клеток без дополнительного стимула оказалось, что, вопреки ожиданиям, общий путь, пройденный трансформированными клетками не увеличивался по сравнению с контрольными. Так, различия между контрольными и трансформированными клетками в Rasсистеме оказались недостоверными, а общий путь, пройденный SV40трансформированными клетками и клетками фибросаркомы, оказался в 1,8-3,1 раза меньше, чем путь, пройденный контрольными клетками. Таким образом, скорость движения одиночных Ras-трансформированных клеток немного возросла, а скорость движения SV40-трансформированных клеток и клеток фибросаркомы даже снизилась. Стоит отметить, что скорость движения одиночных клеток наиболее морфологически трансформированных линий была более низкой, а именно 6 и 8 мкм/ч у MRC-5V2 и НТ-1080 соответственно. Наиболее важным в изменении характера миграции было то, что движение клеток всех исследованных трансформированных линий стало более ненаправленным (Рис. 18). Уменьшение направленности движения, которое можно выразить с помощью отношения эффективного пути к общему пройденному пути (D/T), четко коррелировало со степенью выраженности морфологической трансформации. Так, коэффициент D/T для контрольных клеток равнялся 0,71-0,77 и снижался до 0,510,66 у трансформированных клеток. Нужно отметить, что среди MRC-5V2 и клеток фибросаркомы наблюдалось значительное количество «стоячих» клеток. Ядра этих клеток хаотически смещались на небольшие расстояния и постоянно меняли направление движения. Часть этих клеток готовилось к делению, чем можно объяснить остановку движения. Другие явно относилась к интерфазным клеткам, но, тем не менее, не совершали направленного движения, в отличие от большинства одиночных контрольных клеток. Это свидетельствует о том, что часть трансформированных клеток попросту не способна выбрать единое направление движения в отсутствии дополнительного стимула, вероятно из-за перераспределения краевой активности вдоль всего периметра клетки и отсутствия поляризации. Примечательно, что наименьшее расстояние проходят клетки культуры НТ-1080. Для этих клеток 37 показана способность переходить от мезенхимального движения к амебоидному и инвазировать матригель (Wolf and Friedl, 2009; наши данные), возможно такой переход способствует продвижению клеток в трехмерном матриксе, но мешает движению клеток на двумерном субстрате. Рис. 18. Общий путь миграции (треки) клеток контрольных (10(3), MRC-5, 1036) и трансформированных (10(3)RAS, MRC-5V1, MRC-5V2, HT-1080) культур за 8 часов. При оценке движения клеток в трехмерном субстрате через фильтры и матригель наблюдалась иная картина. В результате Ras-трансформации клетки приобрели способность к трехмерной миграции, которая отсутствовала у контрольных 10(3) фибробластов. Контрольные человеческие фибробласты (MRC5) исходно обладали способностью к трехмерной миграции, но в результате SV40трансформации эта способность значительно увеличилась и была сравнима со способностью к трехмерной миграции у клеток саркомы. Кроме того, все исследуемые трансформированные линии, кроме 10(3)RAS, приобретали способность к инвазии, выраженную в проценте инвазии от 13-14% для SV40трансформированных линий до 47% для линии фибросаркомы (Рис. 19). Данные результаты согласуются со способностями данных линий расти в матригеле, описанными другими авторами (Huschtscha and Holliday, 1983; Wolf et al, 2003). 38 Рис. 19. Способность клеток исследуемых культур к трехмерной миграции и инвазии. Таким образом, наиболее активными в опытах по трехмерной миграции оказались клетки «наименее приспособленные» к индивидуальному движению на двухмерном субстрате (стекле), а также, обладающие способностью отделяться и «высеваться» из клеточного монослоя. В большей степени это касается клеток НТ1080 и клеток MRC-5V2, характеризующиеся наибольшими морфологическими изменениями: крайней степенью редукции актиновых пучков и фокальных контактов, практически полным отсутствием поляризации и стабильного клеточного края, наличием активного дорзального раффлинга и «блеббообразных» утолщений в зоне ведущего края. Это может свидетельствовать о том, что перераспределение псевдоподиальной активности скорее необходимо не для увеличения скорости миграции (особенно на искусственном двумерном субстрате не характерном для биологических систем), а для облегчения поиска клеткой путей инвазии. Так, поведение исследуемых нами трансформированных клеток сходно с поведением лейкоцитов при их проникновении в кровяное русло. (Nourshargh et al, 2010). Как показали недавние исследования, лейкоциты мыши при попытке преодолеть стенку сосуда проявляют «поисковое» поведение в ответ на множественную стимуляцию воспалительными факторами, выбирая для миграции места, свободные от перицитов (Wang et al., 2006; Voisin et al, 2010). Скорее всего, наблюдаемое нами ненаправленное «поисковое» движение, сопровождающееся увеличением раффлинга и наличием «блеббообразных» натеков у трансформированных клеток является аналогом подобного движения на двумерном субстрате. Тем более, что одна из используемых нами линий (НТ1080), для которой характерны все вышеперечисленные изменения способна легко переключаться с одного типа движения на другой, за счет изменения баланса малых ГТФаз семейства Rho (Yamazaki, 2005). 39 ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ, ЛЕЖАЩИХ В ОСНОВЕ ПРИОБРЕТЕНИЯ КЛЕТКАМИ ИНВАЗИВНОГО ФЕНОТИПА. Анализ экспрессии Ras в клетках исследуемых культур. Рис. 20. Анализ экспрессии Ras в клетках исследуемых культур. Окрашивание антителами panRas (p21) и GTU88 (к γ-тубулину, р48). С помощью иммуноблотинга было показано, что вне зависимости от способа трансформации (онкогеном Ras, вирусом SV40 или при исследовании клеток из опухоли), повышенная экспрессия Ras наблюдалась в клетках всех трансформированных линий. Многими исследованиями показано, что активация Ras приводит к увеличению активности малой ГТФ-азы Rac (Bag-Zagi and Hall, 2000; Lambert et al., 2002; Reparsky et al., 2004; Strumane et al., 2006). Повышение активности Rac в свою очередь активирует белки WAVE, обеспечивающие Arp2/3-опосредованную полимеризацию актина и образование протрузий (Ridley et al., 1992; Ridley, 2001; Burridge and Wennerberg, 2004), и таким образом приводит к усилению полимеризации актина и образования псевдоподий. Поэтому активизацию псевдоподиальной активности на ведущем краю клеток при трансформации можно, хотя бы частично объяснить повышением активности Ras. Кроме того, показано, что усиленная экспрессия N-RAS приводит к увеличению количества дефосфорилированного кофилина (Chan et al., 2000; DesMarais et al., 2005), который в свою очередь может разрезать актиновые филаменты в составе краевых пучков, высвобождая свободные плюс-концы, стимулируя, таким образом, полимеризацию новых филаментов, приводящая к образованию новых протрузий. Этот факт хорошо объясняет ослабление и разрушение краевых пучков актиновых филаментов в результате трансформации. Разрушение краевых пучков ведет к потере истинно стабильных краев фибробластов, и, тем самым, к нарушению поляризации и перераспределению псевдоподиальной активности вдоль периметра клетки, описанной нами в настоящей работе. Для того, чтобы выяснить, не вызвана ли выявленная разница в способности инвазировать матригель между нормальными и трансформированными клетками появлением активности металлопротеаз у исследованных трансформированных клеток, был проведен анализ активности металлопротеаз в исследуемых линиях методом зимографии. 40 Рис. 21. Определение активности матриксных металлопротеаз у клеток исследуемых линий. Зимография. Окраска геля кумасси. Наиболее высокая активность ММР2 наблюдается у фибробластов 1036. Активность металлопротеаз у всех линий – производных эмбриональных легочных фибробластов находится на одинаковом уровне, а у клеток фибросаркомы НТ1080 активность ММР2 даже понижена, но фиксируется активность ММР-9, что согласуется с результатами, полученными другими авторами для этих клеток ранее. Таким образом, появление способности к инвазии в наших клеточных системах нельзя объяснить повышением активности металлопротеаз, т.е. действительно, инвазивное поведение этих клеток связано с изменением характера и распределения краевой активности, в основе которых лежат описанные выше изменения цитоскелета. Анализ вклада малой ГТФ-азы "трансформированного" фенотипа. Rho в формирование На разных клеточных системах нами было показано, что нарушение актомиозиновой сократимости у фибробластов ведет не только к утрате актиновых стресс-фибрилл и нарушению созревания фокальных контактов , но и к существенному изменению формы клеток. Сравнение клеток, обработанных ингибиторами акто-миозиновой сократимости с клетками, трансформированными N-Ras, показало, что изменения цитоскелета и морфологии клеток в обоих случаях напоминают друг друга. Как трансфекция онкогена Ras, так и обработка клеток ингибиторами сократимости приводит к уменьшению площади, которую клетка занимает на субстрате. Причем совместное действие онкогена и ингибиторов этот эффект не усиливает. Так же при обоих типах обработок существенно усиливается как дисперсия, так и элонгация клеток. Ранее было показано, что обработка клеток ингибиторами сократимости не только не нарушает направленного клеточного движения, но даже ведет к увеличению скорости движения клеток (Рис 2). При сравнении подвижности клеток, трансформированных N-Ras и клеток, обработанных ингибиторами сократимости, оказалось, что в обоих случаях повышается их миграционная способность (Рис. 22). 41 Рис. 22 Изменение миграционных способностей фибробластов REF52 в результате трансформации онкогеном N-Ras или обработки ингибиторами сократимости. Рис. 23. Влияние экспрессии онкогена Ras, перекиси водорода и антиоксиданта NAC на актиновый цитоскелет (зеленый) и строение фокальных контактов (красный) крысиных фибробластов линии REF52. А – контрольные REF52, Б – REF52, обработанные перекисью водорода (50 мкМ), В – REF52, трансформированные NRas, Г - REF52, трансформированные N-Ras и обработанные NAC (5мМ). 42 Таким образом, понижение активности Rho ведет к появлению у клеток некоторых морфологических признаков трансформации, а так же ведет к ускорению их движения на субстрате. Как было показано ранее (Рис. 3), клетки в присутствии ингибиторов Rho не могут формировать нормальный монослой, а формируют псевдо-многослойную культуру, довольно сильно наползая друг на друга, и этим они так же похожи на трансформированные клетки. Исходя их полученных результатов, можно предположить, что на ранних стадиях трансформации (в нашем случае трансформация одним онкогеном Ras) первичные морфологические изменения могут быть вызваны снижением контрактильности у клеток, вероятно за счет нарушения активности Rho-киназы. Выяснение роли уровня активных кислородных радикалов в формировании "трансформированного" фенотипа Для выяснения возможных молекулярных механизмов, лежащих в основе этих изменений, исследовали роль повышения реактивных кислородных радикалов (ROS) на морфологию, цитоскелет и подвижность клеток. Ранее в некоторых работах было показано, что повышенная экспрессия Ras может приводить к увеличению внутриклеточного содержания активных кислородных радикалов (Reactive Oxigen Species (ROS)) Мы решили проверить, как повышение активности ROS в клетке влияет на ее морфологию и способность к миграции. В этой серии экспериментов мы использовали эмбриональные фибробласты крысы REF52, а так же эти клетки, трансфицированные нерегулируемым конститутивно активным онкогеном N-Ras D13 и конститутивно активным онкогеном N-Ras под тетрациклиновым супрессором (линии REF52/tetRas и REF52/Ras соответственно). Клетки (REF52/tetRas культивировали в присутствии 1 мг/мл тетрациклина (Sigma). Отмывка тетрациклина приводила к индукции экспрессии онкогена Ras. Тетрациклин отмывали за 4-9 дней до эксперимента. Увеличение ROS в среде вызывали добавлением перекиси водорода, а редукцию количества ROS вызывали обработкой культуры антиоксидантом N-ацетил цистеином (NAC) в концентрации 5мМ. Было показано, что обработка клеток перекисью водорода (50мкМ в течение 4-24 часов) вызывала увеличение внутриклеточного содержания ROS на том же уровне, что и повышенная экспрессия онкогена Ras. Контрольные клетки обеих линий имели очень сходную морфологию, и являлись хорошо распластанными фибробластами с ярко выраженными актиновыми пучками и хорошо развитыми фокальными контактами (Рис. 23 А). Экспрессия онкогена Ras в обеих линиях приводила к статистически достоверному уменьшению площади клеток, увеличению их поляризации. При этом наблюдалась существенная редукция актиновых пучков, так же как и уменьшение числа и размера фокальных контактов (Рис. 23 В). 43 Указанные изменения сопровождались увеличением клеточной подвижности, выражавшейся в усилении миграции клеток, измеренной при помощи теста "экспериментальной раны" (Рис. 24). Рис. 24. Влияние экспрессии онкогена Ras и обработки клеток перекисью водорода и антиоксидантом NAC на миграцию крысиных фибробластов REF52 в экспериментальную рану. Показано количество клеток, мигрировавших в экспериментальную рану за 24 часа (количество клеток в контроле принято за 100%) Представлены результаты четырех независимых экспериментов. Мы показали, что обработка клеток перекисью водорода вызывается такие же изменения морфологии, актинового цитоскелета и фокальных контактов, как и повышенная экспрессия онкогена Ras, а именно значительное уменьшение площади клеток, увеличение индексов дисперсии и элонгации, появление большого числа мелких отростков, и к редукции актинового цитоскелета и фокальных контактов(Рис. 23Б). Кроме того перекись водорода, так же как и экспрессия Ras, приводит к значительному увеличению количества клеток, мигрировавших в экспериментальную рану (Рис. 24). Также мы показали, что сходные изменения морфологии и миграционных способностей клеток были вызваны добавлением антралина. Антралин - агент, который вызывает увеличение внутриклеточных ROS по механизму, совершенно отличному от перекиси водорода (K. Muller, 1996), таким образом существенным моментов в действии обоих этих веществ на морфологию и подвижность клеток является повышение уровня внутриклеточных ROS. Обработка клеток антиоксидантом NAC снижает уровень ROS в Rasтрансформированных клетках, что вызывает частичную реверсию Rasиндуцированных изменений и в REF52/Ras и в REF52/tet-Ras культурах. Степень поляризации трансформированных клеток снижается и становиться сравнимой с поляризацией контрольных клеток, площадь также увеличивается, хотя и не достигает контрольного уровня. Обработка контрольных REF52 клеток антиоксидантом NAC приводила к росту появлению новых актиновых пучков, а так же к увеличению количества и размеров фокальных контактов. Эти 44 морфологические изменения, вызванные обработкой трансформированных клеток NAC, сопровождались существенным подавлением миграции клеток (Рис.24). Было показано, что изменение уровня ROS, как в результате Ras-трансформации, так и при действии перекиси водорода, ведет к повышению активности малой ГТФазы Rac1 и изменению уровня фосфорилированного кофилина. Участие Rac1 и кофилина в регуляции миграции и морфологических реакций клеток описано ранее и воздействие ROS на эти регуляторные пути хорошо объясняют описанные нами изменения. Таким образом, мы показали, что, по крайней мере, частично влияние онкогена Ras на морфологию, цитоскелет, адгезионные структуры и подвижность фибробластов может объясняться повышением уровня ROS в клетках. ВЫВОДЫ 1. Наиболее важным этапом, определяющим движение клеток, является формирование активного ведущего края. Акто-миозиновая сократимость существенна для упорядочивания движения и правильного формирования клеточных слоев. 2. На ведущем краю клетки существуют две зоны – ламеллиподия и ламелла, отличающиеся по строению и динамическим характеристикам. Динамика актинового тока в ламеллиподии обеспечивается за счет полимеризации актиновой сети на краю клетки, медленный ток актина в ламелле обеспечивается за счет акто-миозинового сокращения. 3. В зоне ламеллиподии формируются инициальные фокальные адгезии (ФА), которые определяют положение границы ламеллиподия-ламелла. Формирование новой адгезии вызывает сдвиг этой границы вперед и последующее выдвижение ламеллиподии, т.е. является инициирующим шагом в выдвижении активного края. В точках первичных ФА происходит реорганизация актинового цитоскелета из однонаправленной сети, характерной для ламеллиподии в сократимые пучки микрофиламентов, включающие в себя филаменты разной направленности и миозин II. 4. Первым шагом образования ФА является формирования инициальных ФА, в которых концентрируется белок VASP. Остальные белки контактов встраиваются в структуру инициального контакта с задержкой от 0.5 до нескольких минут. Стадия инициальных ФА является обязательной при формировании адгезионных структур, но только некоторые из инициальных ФА созревают в более крупные адгезионные структуры - фокальные комплексы и фокальные контакты. Структура актинового цитоскелета в местах инициальных ФА не отличается от структуры окружающей ламеллиподии; пучки микрофиламентов, типичные для фокальных 45 комплексов и фокальных контактов появляются при их дальнейшем созревании. 5. При неопластической трансформации фибробластов происходит перераспределение краевой активности, существенно увеличивается доля активного края и соответственно сокращается доля стабильного края. Эти признаки нарастают по мере нарастания степени трансформации клеток и могут служит еще одним морфологическим критерием клеточной трансформации. 6. В результате трансформации меняется ультраструктура актинового цитоскелета. Актиновая сеть в ламеллиподии становится менее регулярной, появляется большое количество «дырок» в подмембранном слое микрофиламентов. Краевой актиновый пучок в боковых и хвостовой частях клетки существенно редуцирован и не обеспечивает стабильность клеточного края. 7. При трансформации клеток существенно изменяется не только распределение, но и характер псевдоподиальной активности: протрузии на переднем крае становятся более мелкими, а частота их образования и частота образования раффлов значительно возрастает. Эти изменения коррелируют с изменениями строения актиновой сети ламеллиподии, а также с отсутствием полноценных контактов клетки с субстратом. 8. По мере нарастания таких признаков трансформации, как изменения цитоскелета и перераспределение активности ведущего края, изменяется характер миграции клеток. Движение одиночных трансформированных клеток носит менее направленный характер и скорость их миграции падает, в основном в результате отсутствия поляризации активности на ведущем крае. Одновременно появляется и/или усиливается способность к 3D миграции и способность к инвазии. 9. Одним из молекулярных механизмов, лежащих в основе указанных изменений цитоскелета в результате трансформации является возрастание уровня реактивных кислородных радикалов (ROS) в результате оверэкспрессии онкогена N-Ras, приводящих к повышению активности малой ГТФазы Rac и заметному увеличению активного (дефосфорилированного) кофилина. Обработка таких клеток антиоксидантом NAC (N-ацетил цистеином) приводит к нормализации фенотипа и подвижности клеток. 10. Перераспределение псевдоподиальной активности, вызванное изменениями структуры актинового цитоскелета, в результате которого трансформированные клетки легко меняют направление движения, является определяющим в проявлении способности опухолевых клеток к инвазии. 46 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК 1. Alexandrova A., Dugina V.B., Paterson H., Bershadsky A.D. Motility of intracellular particles in rat fibroblasts is greatly enhanced by phorbol ester and by over-expression of normal N-ras product // Cell Motility and Cytoskel., 1993, Vol.25, P. 254 – 266 2. Dugina V.B., A.Alexandrova, K.Lane, E.Bulanova, Vasiliev J. The role of the microtubular system in response to HGF/SF // J.Cell Sci., 1995, Vol.108, P.1659- 1667 3. Alexandrova A.Y., Dugina V.B., Ivanova O.J., Kaverina I.N., Vasiliev J.M Scatter factor induces segregation of multinuclear cells into several discrete motile domains // Cell Motil.Cytoskel., 1998, Vol.39, P.147- 158 4. Александрова А.Ю., Иванов А.А., Чумаков П.М., Копнин Б.П., Васильев Ю.М., Changes in p53 Expression Can Modify Motility of Mouse Fibroblasts and Extracellular Matrix Organization //Oncogene, 2000, Vol.19, P. 5826-5830 5. Дугина В.Б., Александрова А.Ю., Габбиани Д., Васильев Ю.М. Влияние актомиозиновой сократимости на фокальные контакты миофибробластов и структуру стресс-фибрилл // Цитология, 2002, Т. 44, С. 48-55 6. Минина С. А., Александрова А.Ю., Васильев Ю. М. Изменение формы клеток и актинового цитоскелета при трансформации, вызванной онкогеном RAS; возможная роль RHO-киназы // Доклады Академии Наук, 2003, Т.388, С. 1–3 7. Alexandrova A.Y., Kopnin P.B., Vasiliev J.M., Kopnin B.P. ROS Up-Regulation Mediates Ras-Induced Changes of Cell Morphology and Motility // Experimental Cell Research, 2006, Vol. 312, P. 2066-2073 8. Bershadsky A.D, Ballestrem C, Carramusa L, Zilberman Y, Gilquin B, Khochbin S, Alexandrova A.Y., Verkhovsky A.B., Shemesh T, Kozlov M.M. Assembly and mechanosensory function of focal adhesions: experiments and models // European Journal of Cell Biology, 2006, Vol. 85, P. 165-173 9. Александрова А.Ю. Эволюция взаимодействий клеток с внеклеточным матриксом в канцерогенезе // Биохимия, 2008, Т.73, С. 915-924 10. Shutova M. S., Alexandrova A. Y., and Vasiliev J. M. Regulation of Polarity in Cells Devoid of Actin Bundle System After Treatment With Inhibitors of Myosin II Activity // Cell Motility and Cytoskeleton, 2008; Vol.65, Р. 734-46. 11. Alexandrova AY, Arnold K, Schaub S, Vasiliev JM, Meister J-J. Comparative Dynamics of Retrograde Actin Flow and Focal Adhesions: Formation of Nascent Adhesions Triggers Transition from Fast to Slow Flow // PLoS ONE, 2008, Vol 3, e3234 12. Александрова А.Ю. Механизмы миграции культивируемых клеток // Сборник “Методы культивирования клеток” Изд-во Политехнического университета, г. Санкт-Петербург, 2008, С. 40 – 55. 13. Ломакина М.Е., Александрова А.Ю. Анализ изменений, вызываемых экспрессией онкогена N-RAS в характере и распределении псевдоподиальной активности фибробластов // Онтогенез, 2009, Т. 40, С.282-293 47 13а. Lomakina M. E. and Alexandrova A. Y. Analysis of Changes Induced by Oncogene N-RAS Expression in Pattern and Distribution of Pseudopodial Activity of Fibroblasts // Russian Journal of Developmental Biology (ISSN 1062-3604), 2009, Vol. 40, P. 222– 231. 14. Шутова М.С. Александрова А.Ю. Сравнительное исследование распластывания нормальных и трансформированных фибробластов: роль полимеризации микрофиламентов и актин-миозинового сокращения // Цитология, 2010, Т.52, С. 41-51 14а. Shutova M. S. and Alexandrova A. Y. Normal and Transformed Fibroblast Spreading: Role of Microfilament Polymerization and Actin–Myosin Contractility //Cell and Tissue Biology (ISSN 1990_519X), 2010, Vol. 4, P. 25–35. Тезисы докладов на конференциях: 15. Александрова А., Дугина В.Б., Бершадский А.Д., Васильев Ю. Регуляция скорости движения внутриклеточных частиц // Цитология, 1992, Т.34, N9, С. 46-47 16. Александрова А., Дугина В.Б. Роль движения внутрикле-точных частиц в процессе формирования ламеллярной цитоплазмы // Сборник тезисов Межд.симп. ,,Биол.подвижн., Пущино, 1994, С. 207-208 17. Дугина В.Б., Александрова А. Участие микротрубочек в процессе морфологических изменений эпителиальных клеток под действием рассеивающего фактора (HGF/SF) // Сборник тезисов Межд.симп. Биол.подвижн.,, Пущино, 1994, С. 213- 214 18. Alexandrova A.. Role of the motility of intracellular particles during lamella formation // Asia Pac.J.Molec. Biol. Biothec., 1994, V.2, N3, Р. 273 19. Alexandrova A., Dugina V.B. The significance of the microtubular system in response of the epithelial cells to HGF/SF // The Cytoskel. and Cell Function Meet. Cold Spring Harbor NY, 1995, Р. 20 20. Dugina V., Alexandrova A., Vasiliev J.M. The effect of microtubular drugs on the cytoskeletal reorganization of polynuclear MDCK cells induced by HGF/SF // Int.Congr."Cytoskeleton and Cancer", Les Embiez(Var), France, 1995, Р. 78 21. Дугина В.Б., Александрова А.Ю., Каверина И.Н. Сегрегация цитоплазмы многоядерных клеток на независимо движущиеся фрагменты под действием скеттер-фактора // Цитология, 1996, Т.38, С. 198 22. Alexandrova A.Y., Dugina V.B., Kaverina I.N. Segregation of polynyclear epithelial cells induced by scatter factor (HGF/SF) // Molecular Biol.Cell., 1996, V.7, 142a 23. Александрова А., Дугина В., Иванова О., Каверина И., Васильев Ю. Сегрегация многоядерных эпителиальных клеток на несколько подвижных доменов //Тез. Докл. на 2-ом Съезде биофизиков России, С.37 24. Alexandrova A., Chumakov P., Kopnin B., Vasiliev J. Cell morphology and extracellular matrix organization are controlled by p53 expression // Molecular Biology of the Cell, 1999, Vol.10, Р. 143a 48 25. Александрова А.Ю, Иванов А.А.,Чумаков П.М., Копнин Б.П., Васильев Ю.М. Влияние экспрессии р53 на морфологию клетки, структуру цитоскелета и образование внеклеточного матрикса // Сборник тезисов конференции «Цитокелет и клеточная регуляция». Пущино, 11 – 12 мая, 2000, С.5 26. Alexandrova A.Y., Verkhovsky A.B., Arnold E., StutmanM., Schaub S., Meister J-J., Geiger B., BershadskyA. Dynamic coupling between actin flow and focal adhesion sites //Journal of molecular cell biology, 2001, P. 215a 27. Копнин Б.П., Саблина А.А., Александрова А.Ю., Чумаков П. Новая функция опухолевого супрессора р53: контроль архитектуры, адгезии и миграции клеток // Тезисы конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза», Москва, 2001, С. 19-20 28. Alexandrova A.Y., Verkhovsky A.B., Arnold E., Stutman M., Schaub S., Meister J-J., Geiger B., BershadskyA. Dynamic coupling between actin cytoskeleton and focal contacts //Program and abstracts of 17th European Cytoskeleton Forum, Nyon-Geneva, Switzerland, 2002, Р.72 29. Александрова А., Верховский А.. Динамика активного края распластывающихся фибробластов // Цитология, 2003, Т. 45, №9, С.841-842 30. Resch G.P.; Alexandrova A., Small J.V. Correlating ultrastructure and dynamics in the actin cytoskeleton // Abstract book of FEBS special Meeting on Cytoskeletal Dynamics: From Cell Biology to Development and Disease, June 12-14, 2004, Helsinki, Finland, Р.70 31. Bershadsky A.D., Ballestrem C., Carramusa L., Zilberman Y., Arnold K., Geiger B., Alexandrova A.Y., Verkhovsky A.V., Shemesh T., Kozlov M.M. Mechanosensory function of focal adhesions: experiments and models //Adhesion meeting Podosomesinvalopodia-focal adhesions. Munich, April 28-30, Germany, 2005, P.33. 32. Alexandrova A., Resch G.P., Small J.V. Actin filament reorganisation during early adhesion formation in migrating cells // FEBS/ESF Advanced workshop on Integrated approaches in Cytoskeleton Research. Abstract Book August 27-31, 2005, Luxembourg, P.27 33. Шутова М., Александрова А. Как ползет клетка. Перестройки цитоскелета, обеспечивающие движение клеток в культуре, роль актина и миозина 2. Молекулярные механизмы процессов онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция //Сборник тезисов конференции, Москва 15-16 мая, 2006, С. 26 34. Александрова А.Ю, Шутова М.С. Ведущая роль Arp 2/3-зависимой полимеризации актина и формирования первичных адгезионных структур в перестройках актинового цитоскелета, обеспечивающих движение клеток в культуре // Цитология, 2006, Т.48, №9, С.741 35. Ваулина М.Е., Александрова А. Влияние экспрессии онкогена N-RAS на псевдоподиальную активность фибробластов при их движении // Цитология, 2006, Т.48, №9, С. 749-750 36. Шутова М.С., Александрова А. Исследование подвижности нормальных фибробластов. Роль актин-миозинового сокращения // Цитология, 2006, Т.48, №9, С. 813-814 49 37. Александрова А.Ю. Механизмы миграции культивируемых клеток // Тез. лекции на школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клетокСПетербург, 6 – 10 октября », 2008, С. 40-55 38. Александрова А.Ю., Ломакина М.Е., Шутова М.С., Васильев Ю.М. Реорганизация актинового цитоскелета фибробластов в процессе движения. Нарушения, приводящие к инвазии при опухолевой трансформации // Доклад на Х11 Российском онкологическом конгрессе, Москва, 18-20 ноября, 2008, С. 7 39. Александрова А.Ю. Нарушения регуляции подвижности фибробластов, лежащие в основе инвазии и метастазирования // Вопросы онкологии, 2008, Т.54, №54, С. 34. 40. Ваулина М.Е., Александрова А.Ю. Изменение распределения и характера псевдоподиальной активности в процессе трансформации фибробластов // Вопросы онкологии, 2008, Т.54, №54, С. 7-8 41. Shutova M.S., Alexandrova A.Y., Vasiliev J.M., Svitkina T.M. Roles of myosin II in initiation of focal adhesion assembly during their restoration after blebbistatin treatment // The American Society for Cell Biology, 49th Annual Meeting, San Diego, 2009, P.84 42. Ломакина М.Е., Александрова А.Ю. Анализ псевдоподиальной активности и локомоторного поведения трансформированных фибробластов // Сборник тезисов 13 международной пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология наука ХХI века", 2009, С.107-108 43. Ломакина М.Е. Александрова А.Ю. Изменение морфологии и характера миграции фибробластов в результате трансформации вирусом SV-40 // Цитология, 2010, Т.52, № 3, С.261-262 44. Lomakina M.E., Vasiliev J.M., Alexandrova A.Y. Associated Analysis of Protrusive Activity and Motile Behavior of Transformed Fibroblasts // Thesis of International symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", Pushchino, 2010, Р. 152-153 45. Alexandrova A.Y. Actin cytoskeleton reorganization during cell motility //Thesis of International symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", Pushchino, 2010, Р. 12-14. 46. Shutova M.S., Alexandrova A.Y., Vasiliev J.M., Svitkina T.M. Dynamics of actinmyosin and adhesion structures during cell recovery after blebbistatin treatment // Thesis of International symposium "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies", Pushchino, 2010, Р. 255-256. 47. Shutova M.S., Alexandrova A.Y., Vasiliev J.M., Svitkina T.M. Roles of Nonmuscle Myosin II in Lamellipodial Protrusion and Focal Adhesion Initiation // The American Society for Cell Biology, 50th Annual Meeting, Philadelphia, PA, 2010, Р.1217 50 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВКМ Внеклеточный матрикс МАП Мезенхимально-амебоидный переход ММП Матриксные металлопротеазы ТРИТЦ Тетраметилродамин-5- (6)-изотиоцианат ФА Фокальная адгезия ФИТЦ Флуоресцеин-изотиоцианат ЭМП Эпителио-мезенхимальный переход HGF/SF Фактор роста гепатоцитов/скэттер фактор IRM Интерференционно-рефлекторная микроскопия NAC N-ацетил цистеин PBS Фосфатный буфер PFA Фиксирующий раствор параформальдегид PMA форболовый эфир (phorbol 12-myristate 13acetate) ROS Активные кислородные радикалы VASP Vasodilator-stimulated phosphoprotein 51
