ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ МАССИРОВАННОЙ

Реклама
2012
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 54, ¹ 12
ÈÇÓ×ÅÍÈÅ ÂËÈßÍÈß ÌÀÑÑÈÐÎÂÀÍÍÎÉ ÁÅÇÐÀÄÈÀÖÈÎÍÍÎÉ ÏÅÐÅÑÀÄÊÈ
ÊÎÑÒÍÎÃÎ ÌÎÇÃÀ ÎÒ ÌÎËÎÄÛÕ ÌÛØÅÉ ÑÒÀÐÛÌ
ÍÀ ÏÐÎÄÎËÆÈÒÅËÜÍÎÑÒÜ ÆÈÇÍÈ
© Ì. Â. Êîâèíà,1, * Â. À. Çóåâ,2 Ã. Î. Êàãàðëèöêèé,3 Þ. Ì. Õîäàðîâè÷3
Èíñòèòóò áèîõèìèè èì. À. Í. Áàõà ÐÀÍ, 2 Íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé èíñòèòóò ýïèäåìèîëîãèè
è ìèêðîáèîëîãèè èì. Í. Ô. Ãàìàëåè Ìèíçäðàâñîöðàçâèòèÿ ÐÔ
è 3 Èíñòèòóò áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè èì. àêàäåìèêîâ Ì. Ì. Øåìÿêèíà è Þ. À. Îâ÷èííèêîâà ÐÀÍ, Ìîñêâà;
* ýëåêòðîííûé àäðåñ: [email protected]
1
Ì. Â. Êîâèíà è äð.
Îáíîâëåíèå òêàíè — èçâåñòíîå ÿâëåíèå, çàêëþ÷àþùååñÿ â çàìåùåíèè ñòàðåþùèõ è îòìèðàþùèõ
êëåòîê ðàçëè÷íûõ òêàíåé îðãàíèçìà ïîòîìñòâîì ëîêàëüíûõ èëè öèðêóëèðóþùèõ ñòâîëîâûõ êëåòîê
(ÑÊ). Èíòåðåñíîé è àêòóàëüíîé çàäà÷åé ÿâëÿåòñÿ óâåëè÷åíèå ñðîêà æèçíè ñòàðåþùåãî îðãàíèçìà çà ñ÷åò
äîíîðñêèõ ÑÊ, ñïîñîáíûõ ñòèìóëèðîâàòü îáíîâëåíèå åãî òêàíåé. Â íàñòîÿùåé ðàáîòå ìû èññëåäîâàëè
âîçìîæíîñòü ïðèìåíåíèÿ ÑÊ êîñòíîãî ìîçãà äëÿ óâåëè÷åíèÿ ïðîäîëæèòåëüíîñòè æèçíè. Äëÿ ýòîé öåëè
áûëè ñîçäàíû õèìåðíûå ìûøè ëèíèè C57BL/6, ïîëó÷åííûå ïðè òðàíñïëàíòàöèè êîñòíîãî ìîçãà (ÊÌ)
îò ìîëîäûõ 1.5-ìåñÿ÷íûõ äîíîðîâ ê ñòàðûì 21.5-ìåñÿ÷íûì ðåöèïèåíòàì. Òðàíñïëàíòàöèþ ïðîâîäèëè
ïðè ïîìîùè íåäàâíî ðàçðàáîòàííîãî ìåòîäà ìàññèðîâàííîé áåçðàäèàöèîííîé ïåðåñàäêè ÊÌ, ïîçâîëèâøåãî òðàíñïëàíòèðîâàòü 1.5%108 êëåòîê, ÷òî ñîñòàâëÿåò îêîëî 25 % îò îáùåãî êîëè÷åñòâà ñîáñòâåííûõ
êëåòîê ÊÌ ìûøè.  áîëåå ðàííèõ ðàáîòàõ ïðè òðàíñïëàíòàöèè ÊÌ èñïîëüçîâàëè çíà÷èòåëüíî ìåíüøåå
êîëè÷åñòâî äîíîðñêèõ êëåòîê (5%106), ÷òî ñîñòàâëÿåò îêîëî 1 % îò îáùåãî êîëè÷åñòâà êëåòîê ÊÌ ìûøè. Ðåöèïèåíò ïðåäâàðèòåëüíî ïîëó÷àë ëåòàëüíóþ (äëÿ êîíòðîëüíûõ æèâîòíûõ) äîçó ðåíòãåíîâñêîãî
îáëó÷åíèÿ, ÷òî èñêëþ÷àëî âîçìîæíîñòü ïðîäëåíèÿ æèçíè ýòèì ìåòîäîì.  ðåçóëüòàòå ïðèìåíåíèÿ ìîäèôèöèðîâàííîãî ìåòîäà ñðåäíÿÿ ïðîäîëæèòåëüíîñòü äîæèòèÿ (ñ 21.5 ìåñ) êîíòðîëüíîé ãðóïïû ñîñòàâèëà 3.4 ìåñ, à ýêñïåðèìåíòàëüíîé — 4.9 ìåñ, ÷òî ñîîòâåòñòâóåò ïðèðîñòó 1.5 ìåñ, èëè 44 %.
Âëèÿíèå ìàññèðîâàííîé áåçðàäèàöèîííîé ïåðåñàäêè êîñòíîãî ìîçãà
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: ìàññèðîâàííàÿ òðàíñïëàíòàöèÿ, êîñòíûé ìîçã, ñòâîëîâûå êëåòêè, ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè, äîæèòèå.
 íàñòîÿùåå âðåìÿ ñ÷èòàåòñÿ, ÷òî ìíîãèå òêàíè
âçðîñëîãî îðãàíèçìà ñïîñîáíû ê ðåãåíåðàöèè (ñàìîîáíîâëåíèþ) çà ñ÷åò ðåçèäåíòíûõ èëè öèðêóëèðóþùèõ
ñòâîëîâûõ êëåòîê (ÑÊ). Ñàìîîáíîâëåíèå òêàíåé ïðîèñõîäèò íåïðåðûâíî: òàê, â ñåðäöå êðûñ îêîëî 7 % êëåòîê çàìåùàåòñÿ åæåìåñÿ÷íî (Kajstura et al., 1996), îáíîâëåíèå
æå êðîâè è ýïèòåëèàëüíûõ òêàíåé ïðîèñõîäèò çíà÷èòåëüíî áûñòðåå. Ó÷àñòèå íå òîëüêî ëîêàëüíûõ, íî è öèðêóëèðóþùèõ ÑÊ â îáíîâëåíèè òêàíåé áûëî ïðîäåìîíñòðèðîâàíî ìíîãî÷èñëåííûìè ðàáîòàìè ïî ðàçíîïîëîé
òðàíñïëàíòàöèè,
ñîïðîâîæäàþùåéñÿ
çíà÷èòåëüíûì
y/x-õèìåðèçìîì (Körbling et al., 2002; Herzog et al., 2003;
Thiele et al., 2004). Çíà÷åíèå ýòèõ ðàáîò îñîáåííî âîçðîñëî ñåé÷àñ, êîãäà ñ ïîìîùüþ ýêñòðàêîðïîðàëüíîãî îïëîäîòâîðåíèÿ ðîäèòåëüñêèõ ãàìåò è îòáîðà çèãîò (Grewal
et al., 2004), à òàêæå ñ ïîìîùüþ ðåïðîãðàììèðîâàíèÿ ñîìàòè÷åñêèõ êëåòîê (Takahashi, Yamanaka, 2006; Wang
et al., 2011) ïîÿâèëàñü âîçìîæíîñòü ñîçäàâàòü òðàíñïëàíòàöèîííûé êëåòî÷íûé ìàòåðèàë, ãåíåòè÷åñêè èäåíòè÷íûé êëåòêàì ïàöèåíòà.
Íàøè ïðåäûäóùèå ðàáîòû in vitro ïîêàçàëè, ÷òî íåäèôôåðåíöèðîâàííûå ÑÊ äåéñòâèòåëüíî ìîãóò ïðè îïðåäåëåííûõ óñëîâèÿõ ýôôåêòèâíî äèôôåðåíöèðîâàòüñÿ â
òîò êëåòî÷íûé òèï, ê êîòîðîìó ïðèíàäëåæèò èõ êëåòî÷íîå ìèêðîîêðóæåíèå (Êîâèíà, Õîäàðîâè÷, 2011). Ýòî
îáúÿñíÿåò íå âïîëíå ïîíÿòíóþ ðàíåå ýôôåêòèâíîñòü ïåðåñàäêè êîñòíîãî ìîçãà ïðè èñöåëåíèè íå òîëüêî áîëåçíåé êðîâè (àíåìèÿ Ôàíêîíè; Gluckman et al., 1995), íî è
òàêèõ ñèñòåìíûõ çàáîëåâàíèé, êàê ìóêîïîëèñàõàðèäîç è
ñòàð÷åñêàÿ òóãîóõîñòü (Birkenmeier et al., 1991; Iwai et al.,
2001; Corti et al., 2004; Willenbring et al., 2004). Ìóêîïîëèñàõàðèäîç âûçûâàåòñÿ íåäîñòàòî÷íîñòüþ ôåðìåíòîâ, òðåáóåìûõ äëÿ äåãðàäàöèè ãëþêîçàìèíîâ, íàêàïëèâàþùèõñÿ
â ëèçîñîìàõ êëåòîê ìíîãèõ îðãàíîâ, âûçûâàÿ èõ äèñôóíêöèþ è ñîêðàùåíèå ñðîêà æèçíè. Òðàíñïëàíòàöèÿ ñèíãåííûõ êëåòîê êîñòíîãî ìîçãà îò çäîðîâûõ ìûøåé ïðèâîäèëà
ê óâåëè÷åíèþ ïðîäîëæèòåëüíîñòè æèçíè ñ 0.5 äî êîíòðîëüíîé — 2 ãîäà. Ïðè ýòîì ëèçîñîìàëüíàÿ àêòèâíîñòü âîññòàíàâëèâàëàñü ïîëíîñòüþ èëè ÷àñòè÷íî âî âñåõ èññëåäîâàííûõ òêàíÿõ: äëÿ òèìóñà, ñåëåçåíêè, êîñòíîãî ìîçãà âîññòàíîâëåíèå áûëî ïîëíûì, äëÿ ëåãêèõ ñîñòàâèëî 50 %, äëÿ
ïî÷åê è ïå÷åíè — 20, äëÿ ìîçãà — 7 % (Birkenmeier et al.,
1991). Ýòîò ðåçóëüòàò ëîãè÷íî îáúÿñíÿåòñÿ çàìåùåíèåì
òêàíåé ïîòîìñòâîì êëåòîê êîñòíîãî ìîçãà äîíîðà, îäíàêî
àâòîðû íå îïðåäåëÿëè ñòåïåíü õèìåðèçìà. Â ñëåäóþùåé
ðàáîòå ýòîãî òèïà áûëî ïîêàçàíî èçëå÷åíèå íàñëåäñòâåííîãî çàáîëåâàíèÿ êîæè òðàíñïëàíòàöèåé ÊÌ; õèìåðèçì
êîæè áûë îïðåäåëåí è ñîñòàâèë îò 10 äî 30 %, à õèìåðèçì
ñëèçèñòîãî ýïèòåëèÿ ÆÊÒ — 50 % (Wagner et al., 2010).
Ýòè ôàêòû ïðèâåëè ó÷åíûõ ê âûâîäó î òîì, ÷òî êîñòíûé
883
Ì. Â. Êîâèíà è äð.
884
ìîçã êðîìå êðîâåòâîðíûõ è ñòðîìàëüíûõ êëåòîê ñîäåðæèò êëåòêè, ñïîñîáíûå äèôôåðåíöèðîâàòüñÿ â çðåëûå
êëåòêè ìíîãèõ äðóãèõ òêàíåé (Herzog et al., 2003).
Òåì íå ìåíåå ïîêà íåÿñíî, ìîæåò ëè òàêàÿ ðåãåíåðàöèÿ çàìåäëèòü íîðìàëüíûé ïðîöåññ ñòàðåíèÿ. Ïîñêîëüêó
ïðèìåíÿâøèåñÿ ðàíåå ìåòîäèêè ïåðåñàäêè ÊÌ òðåáîâàëè
æåñòêîãî ðåíòãåíîâñêîãî îáëó÷åíèÿ, íåãàòèâíî âëèÿþùåãî íà ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè êîíòðîëüíûõ æèâîòíûõ (Birkenmeier et al., 1991), ñîîáùåíèÿ îá óñïåøíûõ
ïîïûòêàõ ïðèìåíåíèÿ ýòîãî ìåòîäà äëÿ ïðîäëåíèÿ æèçíè
ïðè íîðìàëüíîì ñòàðåíèè îòñóòñòâóþò. Â äàííîé ðàáîòå
ìû îïèñûâàåì âëèÿíèå íà ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè
ìàññèðîâàííîé áåçðàäèàöèîííîé òðàíñïëàíòàöèè ñòàðûì
ìûøàì ÊÌ ìîëîäûõ äîíîðîâ.
Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà
 û ä å ë å í è å ê î ñ ò í î ã î ì î ç ã à.  êà÷åñòâå äîíîðîâ êîñòíîãî ìîçãà èñïîëüçîâàëè ìûøåé ëèíèè C57BL/6
â âîçðàñòå 6 íåä. Äîíîðîâ ÊÌ óìåðùâëÿëè ñ ïîìîùüþ
ìåòîäà öåðâèêàëüíîé äèñëîêàöèè è ñàíèðîâàëè 70%-íûì
ýòàíîëîì. Âûäåëåíèå êîñòíîãî ìîçãà ïðîâîäèëè ñîãëàñíî
ìåòîäèêå (Colvin et al., 2004) ñ íåáîëüøèìè ìîäèôèêàöèÿìè. Âíà÷àëå âûðåçàëè ïîçâîíî÷íèê è ÷åðåï, îñâîáîæäàëè èõ îò îêðóæàþùèõ òêàíåé, ñïèííîãî è ãîëîâíîãî ìîçãà ñ ïîìîùüþ ñòåðèëüíûõ ñêàëüïåëÿ, íîæíèö è ïèíöåòà.
Õâîñòîâóþ ÷àñòü ïîçâîíî÷íèêà óäàëÿëè. Î÷èùåííûå òàêèì îáðàçîì ïîçâîíî÷íèê è êîñòè ÷åðåïà èçìåëü÷àëè ñ
ïîìîùüþ ñòåðèëüíûõ ïåñòèêà è ñòóïêè â 1—2 ìë îõëàæäåííîãî ñòåðèëüíîãî HBSS-áóôåðà ñëåäóþùåãî ñîñòàâà:
0.44 ìÌ ôîñôàò êàëèÿ, 5.37 ìÌ õëîðèä êàëèÿ, 0.34 ìÌ
äâóõîñíîâíûé ôîñôàò íàòðèÿ, 136.89 ìÌ õëîðèä íàòðèÿ
è 5.55 ìÌ D-ãëþêîçà. Ïîëó÷åííóþ ñìåñü ôèëüòðîâàëè
÷åðåç 4 ñëîÿ ìåëêîÿ÷åèñòîé êàïðîíîâîé òêàíè è ïðîìûâàëè â ñâåæåì áóôåðå HBSS, ïîñëå ÷åãî ïðîèçâîäèëè
öåíòðèôóãèðîâàíèå ïðè ìÿãêèõ óñëîâèÿõ (50 g). Îñàäîê
ðåñóñïåíäèðîâàëè â 1 ìë HBSS, êîëè÷åñòâî êëåòîê ïîäñ÷èòûâàëè ïðè ïîìîùè êàìåðû Ãîðÿåâà, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿëè HBSS äî ôèíàëüíîé êîíöåíòðàöèè 5%107 êëåòîê
â 1 ìë. Îáùåå êîëè÷åñòâî âûäåëåííûõ êëåòîê ðàçëè÷íûõ
ðàçìåðîâ è ìîðôîëîãèè ñîñòàâëÿëî 3.5—4.5%108.
Ò ð à í ñ ï ë à í ò à ö è ÿ ê î ñ ò í î ã î ì î ç ã à. Òðàíñïëàíòàöèþ ÊÌ îñóùåñòâëÿëè ìûøàì ëèíèè C57BL/6 â
âîçðàñòå 21.5 ìåñ. Ïðåäâàðèòåëüíàÿ ïîäãîòîâêà ñóñïåíçèè êëåòîê âêëþ÷àëà â ñåáÿ ôèëüòðàöèþ ÷åðåç 4 ñëîÿ ìåëêîÿ÷åèñòîé êàïðîíîâîé òêàíè è äîáàâëåíèå 5 åä. ãåïàðèíà (Ñèíòåç, Ðîññèÿ) íà äîçó (2.5%107 êëåòîê â 0.5 ìë
HBSS) äëÿ ïðåäîòâðàùåíèÿ çàêóïîðêè ñîñóäîâ êëåòî÷íûì ìàòåðèàëîì. Õâîñò ìûøè ïðîãðåâàëè â âîäå ñ òåìïåðàòóðîé 50—55 °Ñ äî ÷åòêîãî ïðîÿâëåíèÿ ïàðíûõ õâîñòîâûõ âåí, ïîñëå ÷åãî â îäíó èç âåí ìåäëåííî (â òå÷åíèå
20 ñ) ââîäèëè äîçó êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè ñ ïîìîùüþ èíñóëèíîâîãî øïðèöà.
Òðàíñïëàíòàöèþ ïðîâîäèëè 3 äíÿ ïîäðÿä ïî 2 ðàçà â
ñóòêè ñ èíòåðâàëîì 8—16 ÷, ÷òî äîâîäèëî êîëè÷åñòâî òðàíñïëàíòèðîâàííûõ êëåòîê äî 1.5%108 íà êàæäîãî ðåöèïèåíòà.
Ñ ò à ò è ñ ò è ÷ å ñ ê à ÿ î á ð à á î ò ê à ð å ç ó ë ü ò à ò î â.
Àïïðîêñèìàöèþ ýêñïåðèìåíòàëüíûõ ðåçóëüòàòîâ ïðîâîäèëè ñ ïîìîùüþ ïðîãðàììû Origin (êîìïàíèÿ OriginLab,
ÑØÀ) íà îñíîâå S-îáðàçíîé ôóíêöèè Áîëüöìàíà âèäà:
F ( t ) = 100 –
100
1+ e
– t +τ
t0
,
ãäå F(t) — äîëÿ îñîáåé, äîæèâøèõ äî âîçðàñòà t, îò ÷èñëåííîñòè ýêñïåðèìåíòàëüíîé ãðóïïû íà ìîìåíò çàâåðøåíèÿ öèêëà òðàíñïëàíòàöèé, t — ïðîäîëæèòåëüíîñòü
æèçíè, ñîîòâåòñòâóþùàÿ ïåðåãèáó êðèâîé âûæèâàíèÿ
(50 % æèâûõ), t0 — ïîëîãîñòü êðèâîé âûæèâàíèÿ (ñîîòâåòñòâóåò âðåìåíè, òðåáóåìîìó äëÿ óìåíüøåíèÿ ïîïóëÿöèè âäâîå â ïåðèîä ìàêñèìàëüíîé ñìåðòíîñòè, ò. å. â
òî÷êå ïåðåãèáà).
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Âíà÷àëå íàìè áûëè ïîäîáðàíû óñëîâèÿ ìàññèðîâàííîé òðàíñïëàíòàöèè êëåòîê êîñòíîãî ìîçãà ìûøàì.
Ñîãëàñíî èäåå ýêñïåðèìåíòà, òðåáîâàëîñü ââåñòè êàæäîé
ìûøè îêîëî 150 ìëí êëåòîê (1.5$108), ÷òî ñîñòàâëÿåò ïðèìåðíî ÷åòâåðòü îáùåãî êîëè÷åñòâà êëåòîê ÊÌ
âçðîñëîé ìûøè. Îêàçàëîñü, ÷òî ïðè ââåäåíèè áîëüøîãî
îáúåìà ñóñïåíçèè êëåòîê (áîëåå 1 ìë), à òàêæå ïðè âûñîêîé êîíöåíòðàöèè êëåòîê â ñóñïåíçèè (1$108—
1.5$108 êë./ìë) á*îëüøàÿ ÷àñòü ìûøåé ãèáíåò â òå÷åíèå
2—10 ìèí ïîñëå òðàíñïëàíòàöèè. Ïîýòîìó áûëè âûáðàíû ñëåäóþùèå óñëîâèÿ òðàíñïëàíòàöèè: êëåòêè ââîäÿòñÿ
øåñòüþ ïîðöèÿìè ïî 2.5$107 êëåòîê â îáúåìå 0.5 ìë ñ èíòåðâàëîì 8—16 ÷. Âàæíûì óñëîâèåì óäà÷íîé òðàíñïëàíòàöèè îêàçàëèñü äîáàâëåíèå â ñóñïåíçèþ êëåòîê ãåïàðèíà
â êîëè÷åñòâå 5 åä. íà äîçó (2.5%107 êëåòîê â 0.5 ìë) è
òùàòåëüíàÿ ôèëüòðàöèÿ êëåòîê íåïîñðåäñòâåííî ïåðåä
òðàíñïëàíòàöèåé, ÷òî ïîçâîëèëî çíà÷èòåëüíî ñíèçèòü
ïîñòòðàíñïëàíòàöèîííóþ ñìåðòíîñòü.
 êà÷åñòâå ðåöèïèåíòîâ êëåòîê ÊÌ èñïîëüçîâàëè
ìûøåé ëèíèè C57BL/6 â âîçðàñòå 21.5 ìåñ. 10 ñàìêàì
òðàíñïëàíòèðîâàëè ïî 1.5$108 êëåòîê, ïîëó÷åííûõ îò
6-íåäåëüíûõ äîíîðîâ-ñàìöîâ ýòîé æå ëèíèè. Ïðè ïðîâå-
Âëèÿíèå ìàññèðîâàííîé áåçðàäèàöèîííîé ñèíãåííîé òðàíñïëàíòàöèè êîñòíîãî ìîçãà íà ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè ìûøåé C57BL/6.
1 — ãèñòîãðàììà ïðîäîëæèòåëüíîñòè æèçíè æèâîòíûõ â êîíòðîëüíîé
ãðóïïå (ñïëîøíàÿ ëèíèÿ) è åå àïïðîêñèìàöèÿ (øòðèõîâàÿ ëèíèÿ), 2 —
ãèñòîãðàììà ïðîäîëæèòåëüíîñòè æèçíè æèâîòíûõ â ãðóïïå ðåöèïèåíòîâ, ïîäâåðãøèõñÿ òðàíñïëàíòàöèè êîñòíîãî ìîçãà (ñïëîøíàÿ ëèíèÿ), è
åå àïïðîêñèìàöèÿ (øòðèõîâàÿ ëèíèÿ). ÒÊÌ — òðàíñïëàíòàöèÿ êîñòíîãî ìîçãà.
Âëèÿíèå ìàññèðîâàííîé áåçðàäèàöèîííîé ïåðåñàäêè êîñòíîãî ìîçãà
äåíèè òðàíñïëàíòàöèè â êàæäîì ñëó÷àå êîëè÷åñòâî æèâûõ êëåòîê ÊÌ ïðåâûøàëî 90 %, ÷òî îïðåäåëÿëîñü ïîäñ÷åòîì îêðàøåííûõ òðèïàíîâûì ñèíèì êëåòîê â êàìåðå
Ãîðÿåâà. Èç 10 ðåöèïèåíòîâ 2 ïîãèáëè â õîäå öèêëà
òðàíñïëàíòàöèé, ïðåäïîëîæèòåëüíî îò îáðàçîâàíèÿ
òðîìáîâ â êðóïíûõ ñîñóäàõ. Ýòè 2 ìûøè áûëè èñêëþ÷åíû èç ñòàòèñòè÷åñêîé îáðàáîòêè. Îñòàâøèåñÿ 8 ìûøåé
íàáëþäàëèñü äî èõ åñòåñòâåííîé ñìåðòè ïàðàëëåëüíî ñ
êîíòðîëüíîé ãðóïïîé èç 9 ìûøåé òîãî æå âîçðàñòà, íå
ïîäâåðãàâøèõñÿ òðàíñïëàíòàöèè. Íà ðèñóíêå âèäåí ýôôåêò òðàíñïëàíòàöèè ÊÌ íà ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè:
êðèâàÿ 2, ñîîòâåòñòâóþùàÿ ãðóïïå ðåöèïèåíòîâ, âñåãäà
ïðîõîäèò âûøå, ÷åì êðèâàÿ 1 (êîíòðîëüíàÿ ãðóïïà).
Äëÿ ñðàâíèòåëüíîãî îïèñàíèÿ êðèâûõ ñíà÷àëà ïðîâîäèëè äâóõïàðàìåòðè÷åñêóþ àïïðîêñèìàöèþ ïî ïàðàìåòðàì t è t0 êàæäîé èç êðèâûõ.  ðåçóëüòàòå áûëî íàéäåíî
ñðåäíåå ïî äâóì êðèâûì çíà÷åíèå t0 = 1.4 ) 0.2, ïîñëå
÷åãî ïðîâîäèëè îäíîïàðàìåòðè÷åñêóþ àïïðîêñèìàöèþ
ïî ïàðàìåòðó t êàæäîé êðèâîé (âàðèàöèè t0 íå âëèÿþò íà
îïðåäåëåíèå t). Ïðè ýòîì áûëè ïîëó÷åíû ñëåäóþùèå
çíà÷åíèÿ t: t1 = 24.9 ) 0.1, t2 = 26.4 ) 0.1.
Òàêèì îáðàçîì, ñðåäíÿÿ ïðîäîëæèòåëüíîñòü äîæèòèÿ
ñ íà÷àëà ïåðèîäà íàáëþäåíèÿ (ñ âîçðàñòà 21.5 ìåñ) êîíòðîëüíîé ãðóïïû ñîñòàâèëà 24.9—21.5 = 3.4 ) 0.1 ìåñ, à
ýêñïåðèìåíòàëüíîé — 26.4—21.5 = 4.9 ) 0.1 ìåñ, ÷òî ñîîòâåòñòâóåò ïðèðîñòó 4.9—3.4 = 1.5 ) 0.1 ìåñ. Ñëåäîâàòåëüíî, òðàíñïëàíòàöèÿ ÊÌ, ïðîâåäåííàÿ ïî îïèñàííîé
ìåòîäèêå, ïðèâåëà ê óâåëè÷åíèþ âðåìåíè äîæèòèÿ íà
44 %.
Ïîëó÷åííîå ïîëîæèòåëüíîå âëèÿíèå òðàíñïëàíòàöèè
ÊÌ íà ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè çàíèæåíî èç-çà îñëîæíåíèé òðàíñïëàíòàöèè (â òîì ÷èñëå çàêóïîðêà ñîñóäîâ),
îò êîòîðûõ, î÷åâèäíî, ïîñòðàäàëè íå òîëüêî 2 ïîãèáøèå
âî âðåìÿ òðàíñïëàíòàöèè ìûøè, èñêëþ÷åííûå èç ñòàòèñòèêè, íî è âûæèâøèå, õîòÿ è â ìåíüøåé ñòåïåíè. Ìû
îæèäàåì áîëüøåãî ýôôåêòà â ñëó÷àå èñïîëüçîâàíèÿ âûñîêîêà÷åñòâåííûõ êîììåð÷åñêèõ ôèëüòðîâ äëÿ î÷èñòêè
òðàíñïëàíòèðóåìîãî ìàòåðèàëà îò àãðåãàòîâ êëåòîê.
Èìåþùèåñÿ â ëèòåðàòóðå äàííûå òàêæå ãîâîðÿò î
âîçìîæíîì âëèÿíèè òðàíñïëàíòàöèè ÊÌ íà ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè ìûøåé. Òàê, â 2004 ã. áûëà ïðåäïðèíÿòà
ïîïûòêà ïðîäëèòü æèçíü ìûøåé ñèíãåííîé áåçðàäèàöèîííîé òðàíñïëàíòàöèåé 4$106—10$106 êëåòîê ÊÌ ìîëîäûõ äîíîðîâ (Kamminga et al., 2005). Îäíàêî ýôôåêò áûë
î÷åíü íåáîëüøèì (ìåíåå 10 % âðåìåíè äîæèòèÿ), âåðîÿòíî ïîòîìó, ÷òî òðàíñïëàíòèðîâàëîñü ñðàâíèòåëüíî íåáîëüøîå êîëè÷åñòâî êëåòîê; ðåçóëüòèðóþùèé õèìåðèçì êîñòíîãî ìîçãà îêàçàëñÿ âåñüìà ñêðîìíûì (1—10 %). Îäíàêî â òîì æå ãîäó äðóãîìó íàó÷íîìó êîëëåêòèâó óäàëîñü
äîáèòüñÿ 30—37 % õèìåðèçìà (Colvin et al., 2004) ïîñëå
ïåðåñàäêè 2$108 êëåòîê ÊÌ áåç îáëó÷åíèÿ, â òî÷íîì ñîîòâåòñòâèè ñ ãèïîòåçîé ñâîáîäíîãî çàìåùåíèÿ ñòâîëîâûõ
êëåòîê (âñåãî ó çðåëîé ìûøè îêîëî 6$108 êëåòîê ÊÌ).
Ãèïîòåçà ñâîáîäíîãî çàìåùåíèÿ Êâàçåíáåððè (Colvin
et al., 2004) ïðåäñêàçûâàåò åùå áîëüøóþ ýôôåêòèâíîñòü
çàñåëåíèÿ ñòàðåþùåãî ðåöèïèåíòíîãî êîñòíîãî ìîçãà ìîëîäûìè äîíîðñêèìè êëåòêàìè, ïîñêîëüêó ê ñòàðîñòè êîëè÷åñòâî ñîáñòâåííûõ êëåòîê ÊÌ ðåöèïèåíòà ðåçêî ñíèæàåòñÿ.  ïîëíîì ñîãëàñèè ñ ýòèì õèìåðèçì ñòàðûõ ðåöèïèåíòîâ â âûøåóïîìÿíóòîé ðàáîòå (Kamminga et al.,
2005) ïðåâûøàë õèìåðèçì çðåëûõ ðåöèïèåíòîâ â
10—20 ðàç (5—10 % ïðîòèâ 0.5—1 %), ò. å. ïðè óâåëè÷åíèè êîëè÷åñòâà äîíîðñêèõ êëåòîê â 10—20 ðàç (îò
5$106—10$106 äî 1$106—2$108) ñëåäóåò îæèäàòü ïðàêòè÷åñêè ïîëíîãî çàìåùåíèÿ ñòàðåþùåãî êîñòíîãî ìîçãà äî-
885
íîðñêèì. Òàêèì îáðàçîì, ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå,
ñâèäåòåëüñòâóþùèå î çíà÷èòåëüíîì âëèÿíèè òðàíñïëàíòàöèè ÊÌ íà ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè ìûøåé, ìîãóò
áûòü îáúÿñíåíû áîëüøèì êîëè÷åñòâîì òðàíñïëàíòèðîâàííûõ è âñòðîèâøèõñÿ â òêàíè ðåöèïèåíòîâ êëåòîê.
Ñëåäóþùèì ýòàïîì íàøåé ðàáîòû ñòàíåò êîëè÷åñòâåííàÿ îöåíêà ñòåïåíè ïîñòòðàíñïëàíòàöèîííîãî õèìåðèçìà è åãî êîððåëÿöèè ñ ïðîäîëæèòåëüíîñòüþ æèçíè íà
áîëüøåì êîëè÷åñòâå æèâîòíûõ ñ âàðüèðîâàíèåì êàê èñòî÷íèêîâ öèðêóëèðóþùèõ ñòâîëîâûõ êëåòîê, òàê è ëèíèé
ðåöèïèåíòîâ. Óñïåøíîå ðàçâèòèå äàííîãî íàïðàâëåíèÿ
ïîçâîëèò ðàçðàáîòàòü ïîäõîäû äëÿ òåðàïèè íå òîëüêî
ìíîæåñòâà íàñëåäñòâåííûõ çàáîëåâàíèé, íî è äëÿ çàìåäëåíèÿ ïðîöåññà ñòàðåíèÿ â öåëîì.
Êîëëåêòèâ âûðàæàåò áëàãîäàðíîñòü êîëëåãàì èç
Óíèâåðñèòåòà Òåõàñà, Öåíòð íàóê î çäîðîâüå, Õüþñòîí
(University of Texas, Health Science Center at Houston),
äîêòîðàì Ïàóëþ Ñèììîíñó è Íàòàëüå Áðóàðä (Drs. Paul
Simmons and Nathalie Brouard) çà öåííûå êîíñóëüòàöèè è
ïðîôåññîðàì Ðèêó Âåòñåëþ è Ôåðèäó Ìþðàäó (Profs.
Rick Wetsel and Ferid Murad) çà ïîìîùü â ðàçðàáîòêå è
îñóùåñòâëåíèè ïðîåêòà.
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå Ìèíèñòåðñòâà îáðàçîâàíèÿ è íàóêè ÐÔ (ÃÊ ¹ 16.512.11.2086).
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû
Êîâèíà Ì. Â., Õîäàðîâè÷ Þ. Ì. 2011. Ýôôåêòèâíàÿ äèôôåðåíöèðîâêà ýìáðèîíàëüíûõ ñòâîëîâûõ êëåòîê â ýíäîòåëèîöèòû ìåòîäîì äëèòåëüíîãî ñî-êóëüòèâèðîâàíèÿ ñ ïåðâè÷íîé
òêàíåâîé êóëüòóðîé. Â êí.: Ñòâîëîâûå êëåòêè è ðåãåíåðàòèâíàÿ ìåäèöèíà: ñáîðíèê ñòàòåé. Ì.: ÌÀÊÑ Ïðåññ. 189—200.
Birkenmeier E. H., Barker J. E., Vogler C. A., Kyle J. W.,
Sly W. S., Gwynn B., Levy B., Pegors C. 1991. Increased life span
and correction of metabolic defects in murine mucopolysaccharidosis type VII after syngeneic bone marrow transplantation. Blood.
78 : 3081—3092.
Colvin G. A., Lambert J. F., Abedi M., Hsieh C. C., Carlson J. E., Stewart F. M., Quesenberry P. J. 2004. Murine marrow
cellularity and the concept of stem cell competition: geographic
and quantitative determinants in stem cell biology. Leukemia. 18 :
575—583.
Corti S., Locatelli F., Donadoni C., Guglieri M., Papadimitriou D., Strazzer S., Del Bo R., Comi G. P. 2004. Wild-type bone
marrow cells ameliorate the phenotype of SOD1-G93A ALS mice
and contribute to CNS, heart and skeletal muscle tissues. Brain.
127 : 2518—2532.
Gluckman E., Auerbach A. D., Horowitz M. M., Sobocinski K. A., Ash R. C., Bortin M. M., Butturini A., Camitta B. M.,
Champlin R. E., Friedrich W., Good R. A., Gordon-Smith E. C.,
Harris R. E., Klein J. P., Ortega J. J., Pasquini R., Ramsay N. K.,
Speck B., Vowels M. R., Zhang M. J., Gale R. P. 1995. Bone marrow transplantation for Fanconi anemia. Blood. 86 : 2856—2862.
Grewal S. S., Kahn J. P., Mac Millan M. L., Ramsay N. K.,
Wagner J. E. 2004. Successful hematopoietic stem cell transplantation for Fanconi anemia from an unaffected HLA-genotype-identical sibling selected using preimplantation genetic diagnosis. Blood.
103 : 1147—1151.
Herzog E. L., Chai L., Krause D. S. 2003. Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102 : 3489—3493.
Iwai H., Lee S., Inaba M., Sugiura K., Tomoda K., Yamashita T., Ikehara S. 2001. Prevention of accelerated presbycusis by
bone marrow transplantation in senescence-accelerated mice. Bone
Marrow Transplant. 28 : 323—328.
Kajstura J., Cheng W., Sarangarajan R., Li P., Li B., Nitahara J. A., Chapnick S., Reiss K., Olivetti G., Anversa P. 1996. Ne-
Ì. Â. Êîâèíà è äð.
886
crotic and apoptotic myocyte cell death in the aging heart of Fischer 344 rats. Amer. J. Physiol. 271 : H1215—H1228.
Kamminga L. M., van Os R., Ausema A., Noach E. J., Weersing E., Dontje B., Vellenga E., de Haan G. 2005. Impaired hematopoietic stem cell functioning after serial transplantation and during normal aging. Stem Cells. 23 : 82—92.
Körbling M., Katz R. L., Khanna A., Ruifrok A. C., Rondon G.,
Albitar M., Champlin R. E., Estrov Z. 2002. Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripheral-blood stem
cells. Engl. J. Med. 346 : 738—746.
Takahashi K., Yamanaka S. 2006. Induction of pluripotent
stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by
defined factors. Cell. 126 : 663—676.
Thiele J., Varus E., Wickenhauser C., Kvasnicka H. M.,
Metz K. A., Beelen D. W. 2004. Regeneration of heart muscle tissue: quantification of chimeric cardiomyocytes and endothelial
cells following transplantation. Histol. Histopathol. 19 : 201—209.
Wagner J. E., Ishida-Yamamoto A., McGrath J. A., Hordinsky M., Keene D. R., Woodley D. T., Chen M., Riddle M. J., Osborn M. J., Lund T., Dolan M., Blazar B. R., Tolar J. 2010. Bone
marrow transplantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa. Engl. J. Med. 363 : 629—639.
Wang Y., Chen J., Hu J. L., Wei X. X., Qin D., Gao J.,
Zhang L., Jiang J., Li J. S., Liu J., Lai K. Y., Kuang X., Zhang J.,
Pei D., Xu G. L. 2011. Reprogramming of mouse and human somatic cells by high-performance engineered factors. EMBO Rep. 12 :
373—378.
Willenbring H., Bailey A. S., Foster M., Akkari Y., Dorrell C.,
Olson S., Finegold M., Fleming W. H., Grompe M. 2004. Myelomonocytic cells are sufficient for therapeutic cell fusion in liver.
Nat. Med. 10 : 744—748.
Ïîñòóïèëà 27 VII 2012
LIFE EXTENSION STUDY ON HIGH-YIELD NON-MYELOABLATING BONE
MARROW TRANSPLANTATION FROM YOUNG TO OLD MICE
M. V. Kovina,1, * V. A. Zuev,2 G. O. Kagarlitskiy,3 Yu. M. Khodarovich3
1 A. N. Bach Institute of Biochemistry RAS,
N. F. Gamaleya Institute for Epidemiology and Microbiology
and 3 M. M. Shemyakin and Y. A. Ovchinnikov Bioorganic Chemistry Institute RAS, Moscow;
* e-mail: [email protected]
2
Tissue renewal is the known phenomenon, when the progeny of resident or circulated stem cells (SC) replaces the vanishing cells. The delivery of stem cells via circulation should result in stem cell homing and differentiation into wide variety of tissues and gives promise as therapy for many diseases of tissue failure including
aging itself. To test this hypothesis, we created chimeric mice C57BL/6 by bone marrow (BM) transplantation
from young 1.5 months old donors to 21.5-months old recipient mice of the same strain C57BL/6. We applied
here the recently published new transplantation technique, which allows to get high scores of chimerism due to
very high amount of transplanted cells (1.5$108 per mouse or 25 % of its total BM count). In the earlier works
only 1 % of total BM count (about 5$106 cells per mouse) was usually transplanted to lethally irradiated mice,
what excluded the possibility to apply this method for life extension. As a result of the modified technique implementation, the mean post-transplantation life (starting the 21.5 months old) of treated mice was 4.9 months
versus 3.4 months for untreated mice. The difference in 1.5 months counts for 44 % extension of mean
post-transplantation life.
K e y w o r d s: high-yield non-myeloablating bone marrow transplantation, stem cell, longevity, life extension.
Скачать