ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ФЛАВОНОИДОВ

Реклама
ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2011. №2. С. 117–122.
УДК 615.322
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ФЛАВОНОИДОВ ЛИСТЬЕВ
ОСИНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ
©
И.Ю. Лобанова, В.Ф. Турецкова*
Алтайский государственный медицинский университет, пр. Ленина, 40,
Барнаул, 656038 (Россия), e-mail: [email protected]
Исследован состав флавоноидов листьев осины обыкновенной (Populus tremula L.), семейство ивовых (Salicaceae),
род тополь (Populus), произрастающей в Алтайском крае. Методами экстракции и последующей адсорбционной колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте выделена сумма четырех флавоноидных соединений. Изучение выделенных флавоноидов проведено хроматографическими (ТСХ и ВЭЖХ) и спектроскопическими методами сравнением с
достоверно известными образцами, при этом идентифицированы гликозиды флавонола, такие как гиперозид и рутин.
Исследования гидролизата выделенной суммы флавоноидов свидетельствуют о преобладании в изучаемом сырье гликозидов кверцетина и кемпферола.
Ключевые слова: Populus tremula L., листья, хроматография, флавоноиды, кверцетин, кемпферол, рутин, гиперозид.
Введение
В последние годы внимание многих исследователей привлекает растительное сырье, содержащее фенольные
соединения, в том числе флавоноиды, что обусловлено их безвредностью и широким спектром биологической активности. Одним из перспективных растительных источников фенольных соединений является осина обыкновенная (Populus tremula L.). В настоящее время наиболее изучена в фитохимическом отношении такая часть данного
растения, как кора, при этом имеются работы по изучению биологически активных веществ (БАВ) не только гидрофильной, но и липофильной фракций [1– 5]. Наибольший интерес в исследуемом нами аспекте представляют
данные по изучению фенольных соединений гидрофильной фракции коры осины обыкновенной различных регионов, согласно которым в вышеназванном сырье выявлено наличие таких классов фенольных соединений, как флавоноиды (кверцетин, рутин, гиперозид, хризин); фенологликозиды (сацилин, популин, триандрин, саликортин, вималин); фенолокислоты (п-кумаровая, феруловая, кофейная, коричная); дубильные вещества [1, 2, 6]. Установлено,
что указанные БАВ коры осины обыкновенной обусловливают противовоспалительное, противоязвенное, анальгезирующее, спазмолитическое, противоопухолевое, противоописторхозное действия экспериментальных экстракционных препаратов из данного вида сырья [1, 3, 7–9].
Химический состав фенольных соединений листьев и почек осины обыкновенной несколько отличается
от коры. В работах зарубежных авторов указывается на наличие в листьях осины таких флавоноидов, как
кверцетин, кемпферол, изорамнетин, лютеолин, но при этом не указано, находятся они в форме агликонов или
гликозидов [6, 10]. Наряду с этим количественное определение флавоноидов в листьях осины в ряде работ
ученых Украины и Санкт-Петербурга проводится в пересчете на рутин, имеются сведения о присутствии в
указанном сырье флавоноида кверцетрина [3, 5, 11]. В почках осины обнаружено 17 флавоноидов, среди которых преобладают производные кемпферола и кверцетина [12]. По данным литературы, состав фенологликозидов коры, листьев и почек осины достаточно близок, отличия заключаются в том, что в листьях и почках не
установлено наличия фенологликозида вималина, но в листьях присутствует тремулацин [5, 6, 12].
В плане использования вышеуказанных видов сырья для разработки лекарственных препаратов, прежде
всего противовоспалительного действия, кроме коры осины, привлекают внимание листья, так как они имеют
большие сырьевые запасы, разнообразный состав фенольных соединений и широко используются в народной
медицине в качестве противовоспалительных, противоревматических, обезболивающих средств [13].
*
Автор, с которым следует вести переписку.
118
И.Ю. ЛОБАНОВА, В.Ф. ТУРЕЦКОВА
Одними из основных групп БАВ, обусловливающих противовоспалительное действие лекарственных
препаратов, являются не только простые фенольные соединения, но и флавоноиды [14]. Учитывая вышеизложенное и отсутствие информации о составе флавоноидов листьев осины обыкновенной Сибирского региона, представляется целесообразным изучение их компонентного состава.
Цель настоящей работы – выделение и изучение состава флавоноидов листьев осины обыкновенной,
заготовленных в Алтайском крае.
Экспериментальная часть
Растительный материал. В качестве объекта исследования использовали листья осины обыкновенной (Populus tremula L.), семейство ивовых (Salicaceae), род тополь (Populus), заготовленные после окончания плодоношения в окрестностях Барнаула (конец июня 2009 г.). Сырье сушили до воздушно-сухого состояния, упаковывали в двойные бумажные мешки и хранили в сухом прохладном месте. Гербарные образцы растения хранятся на кафедре фармацевтической технологии Алтайского государственного медицинского университета.
Общие экспериментальные условия
1. В качестве экстрагента для извлечения суммы флавоноидов из сырья был использован 40% этиловый спирт, который по данным наших предыдущих исследований наряду с 70% этиловым спиртом обеспечивает наибольшую полноту экстракции флавоноидов листьев осины обыкновенной [15].
2. Для выделения фенольных соединений из полученного извлечения применяли метод адсорбционной колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте (фракция 50–160 μm, Германия, «Fluka») [16].
3. Кислотный гидролиз гликозидов флавоноидов проводили путем растворения 5 мг выделенных веществ в 10 мл 10% раствора кислоты хлороводородной с последующим нагреванием на кипящей водяной
бане в колбе с обратным холодильником в течение 2,5 ч [17].
4. Хроматографирование флавоноидов методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) осуществляли
на пластинках Sorbfil ПТСХ-П-В в системах растворителей н-бутанол –уксусная кислота – вода (4 : 1 : 5) и
н-бутанол – уксусная кислота – вода (4 : 1 : 2) [1].
5. На хроматограммах флавоноиды обнаруживали по характерному свечению в УФ-свете при длине
волны 365 нм до и после обработки хроматограмм 5% спиртовым раствором алюминия хлорида [17].
6. Разделение выделенных флавоноидных соединений и их гидролизатов методом ВЭЖХ проводили
на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «Институт хроматографии
”«ЭкоНова“», Новосибирск), с последующей компьютерной обработкой результатов исследования, с использованием программы «МультиХром» для «Windows». Хроматографическая колонка PrоntoSIL 120-5С18 AQ, 2,0×75 мм. Подвижная фаза: А – 0,01% водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУК); В –
100% ацетонитрил. Скорость подачи элюента – 100 мкл/мин, объем пробы – 2 мкл, температура колонки –
35 °С; градиент 5 – 55% элюента Б.
7. Детектирование веществ осуществляли в УФ-области при длинах волн 220, 254, 300, 360 нм. Идентификацию веществ проводили по времени удерживания, УФ-спектрам, снятым в процессе хроматографирования в сравнении с рабочими стандартными образцами (РСО) флавоноидных соединений и спектральным отношениям (Sλ /S220) [18].
8. В качестве стандартных образцов использовали такие флавоноиды, как рутин, кверцетин, кемпферол, кверцетрин (Sigma-Aldrich, Германия), гиперозид, изорамнетин, лютеолин (Sigma-Aldrich, США), мирицетин (Sigma-Aldrich, Франция).
Обсуждение результатов
Листья осины обыкновенной экстрагировали 40% этиловым спиртом методом противоточного многоступенчатого экстрагирования в батарее из 5 перколяторов [1]. Данная концентрация спирта была выбрана
нами ранее в качестве оптимальной с позиции не только полноты извлечения БАВ, но и экономического
аспекта, так как содержание флавоноидов в извлечениях, изготовленных с использованием 40 и 70% этилового спирта, было практически равно (соответственно 2,005+0,012% и 2,016+0,017% в пересчете на гиперозид) и находилось в пределах ошибки опыта [15].
Для выделения флавоноидов из листьев осины обыкновенной была выбрана схема с использованием
полиамидного сорбента, примененная ранее учеными Пятигорской фармацевтической академии и Алтайского государственного медицинского университета для разделения фенольных соединений из ив Северного
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ФЛАВОНОИДОВ …
119
Кавказа и коры осины обыкновенной соответственно [1, 16]. Преимуществом данной методики, на наш
взгляд, является то, что она позволяет последовательно элюировать с колонки сначала водой простые фенольные соединения, а затем спиртом этиловым – флавоноиды. При этом полученное спиртовое извлечение
упаривали под вакуумом при температуре 40–50 °С до небольшого объема, разбавляли водой 1 : 1 и помещали в холодильник на сутки. Выделившийся осадок липофильных веществ отделяли, фильтрат дополнительно обрабатывали хлороформом. Очищенный водный экстракт наносили на колонку полиамидного сорбента. Удаление простых фенольных соединений с колонки проводили водой, после чего сумму флавоноидов элюировали 40% спиртом этиловым. Спиртовые элюаты с полиамидного сорбента упаривали под вакуумом и помещали в холодильник. Через 10–15 суток наблюдали кристаллизацию флавоноидов (рис. 1).
Для идентификации выделенных веществ и продуктов их кислотного гидролиза использовали данные
ТСХ, ВЭЖХ, сравнение с достоверно известными образцами.
Результаты хроматографического разделения выделенной суммы флавоноидов листьев осины обыкновенной методом ТСХ в системе растворителей н-бутанол – уксусная кислота – вода (БУВ) (4 : 1 : 5) и продуктов их гидролиза в системе н-бутанол – уксусная кислота – вода (БУВ) (4 : 1 : 2) представлены в таблице 1.
По данным ТСХ видно, что на хроматограмме выделенной суммы флавоноидов отмечается наличие 4
пятен, имеющих коричневое окрашивание в УФ-свете, которые приобретают желто-зеленую флюоресценцию после обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида,
что характерно для флавонол-3гликозидов, флавонов или их гликозидов [17]. При этом по величине
Rf и характеру флюоресценции
пятно №3 соответствует аналогичным показателям РСО рутина; пятно №4 – аналогичным показателям
РСО гиперозида.
На хроматограмме гидролизата флавоноидов появляются 5
пятен, 3 из которых до обработки
реактивом в УФ-свете имеют коричневое окрашивание, одно –
светло-коричневое и одно – светложелтое. После обработки 5% раствором алюминия хлорида все пятна приобретают желто–зеленую
флюоресценцию. По величине Rf и
характеру флюоресценции пятно
№3 соответствует аналогичным
показателям РСО гиперозида. Сопоставление исследуемых хроматограмм до и после гидролиза свидетельствует об исчезновении на хроматограмме гидролизата пятна рутина и пятна с Rf=0,39, но при этом
появляются 3 новых пятна (Rf=0,42;
0,73; 0,79), которые, по нашему
мнению, являются агликонами или
монозидами флавоноидов. Пятно
№5 по величине Rf и цвету флюоресценции одновременно соответствует
аналогичным показателям
Рис. 1. Схема выделения флавоноидов из листьев осины
РСО кверцетина и кемпферола.
обыкновенной
И.Ю. ЛОБАНОВА, В.Ф. ТУРЕЦКОВА
120
Таблица 1. Хроматографические характеристики флавоноидов листьев осины обыкновенной (метод ТСХ)
№
пятна
Rf
Окраска пятен в видимом свете
1
0,39
желтая
2
0,52
желтая
3
4
0,61
0,68
желтая
желтая
1
0,42
желтая
2
0,52
желтая
3
4
5
0,68
0,73
0,79
желтая
желтая
желтая
Окраска пятна
Флюоресценция после обработв УФ-свете до обработки
ки 5% спиртовым раствором
реактивом
алюминия хлорида
Сумма флавоноидов (БУВ 4 : 1 : 5)
коричневая
желто-зеленая
коричневая
яркая желтая
коричневая
желто-зеленая
коричневая
яркая желто-зеленая
Гидролизат флавоноидов (БУВ 4 : 1 : 2)
коричневая
желто-зеленая
коричневая
желтая
Заключение
3-гликозид флавонола, флавон или гликозид флавона
3-гликозид флавонола, флавон или гликозид флавона
Рутин
Гиперозид
3-гликозид флавонола
или гликозид флавона
3-гликозид флавонола, флавон или гликозид флавона
Гиперозид
Флавонол или флавон
Флавонол или флавон
слабо-коричневый
желто-зеленая
слабо-желтая
желто-зеленая
коричневая
яркая желто-зеленая
РСО гиперозида
1
0,68
желтая
коричневая
желто-зеленая
Гиперозид
РСО рутина
1
0,61
желтая
коричневая
желто-зеленая
Рутин
РСО кверцетина
1
0,79
желтая
коричневая
желто-зеленая
Кверцетин
РСО кемпферола
1
0,80
желтая
коричневая
желто-зеленая
Кемпферол
РСО лютеолина
1
0,78
желтая
коричневая
желто-зеленая
Лютеолин
РСО изорамнетина
1
0,78
желтая
коричневая
желто-зеленая
Изорамнетин
Примечание: данные показателей Rf в таблице 1 представляют собой средние значения пяти определений, при этом отклонения полученных результатов не превышают 5%.
Для получения более полной информации о составе флавоноидов листьев осины обыкновенной нами
было проведено их разделение методом ВЭЖХ с последующей детекцией соединений при длинах волн 220,
254, 300, 360 нм. Идентификация соединений осуществлялась по времени удерживания, характеру УФспектров и спектральным соотношениям в сравнении с РСО флавоноидных соединений (рис. 2 и табл. 2).
Рис. 2. Хроматограмма флавоноидов (А) и гидролизата флавоноидов (Б) листьев осины обыкновенной
(метод ВЭЖХ); при длине волны 360 нм
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ФЛАВОНОИДОВ …
121
Таблица 2. Время удерживания, максимумы поглощения и спектральные соотношения флавоноидов
листьев осины обыкновенной и продуктов их гидролиза
№ пика
Время удерживания
(τ) , мин
Максимумы поглоСпектральные соотношения (Sλ /S220)
щения (λmax), нм
S254
S300
S360
Сумма флавоноидов
204, 255, 355
1,003
0,461
0,840
204, 256, 355
1,029
0,458
0,868
203, 257, 355
1,026
0,459
0,875
1
2
3
13,90
15,32
16,24
4
16,76
194, 265, 350
1
12,75
-
2
3
15,32
16,76
204, 256, 355
194, 265, 350
1,029
0,826
0,458
0,578
0,868
0,793
4
18,49
207, 258, 357
1,057
0,486
0,897
5
20,19
205, 263, 355
0,842
0,565
0,849
6
7
21,47
24,58
202, 255, >360
197, 265, >360
0,826
0,578
0,793
Гидролизат флавоноидов
0,257
0,185
0,058
Заключение
Рутин
Гиперозид
Гликозид флавонола
или флавона
Гликозид флавонола
или флавона
Простое фенольное
соединение
Гиперозид
Гликозид флавонола
или флавона
Агликон или моногликозид флавонола
или флавона
Агликон или моногликозид флавонола
или флавона
Кверцетин
Кемпферол
1,073
0,388
0,986
0,860
0,508
1,092
РСО гиперозида
1
15,32
204, 256, 355
1,029
0,458
0,868
Гиперозид
РСО кверцетина
1
21,47
202, 255, >360
1,073
0,388
0,986
Кверцетин
РСО кемпферола
1
24,58
197, 265, >360
0,860
0,508
1,092
Кемпферол
РСО рутина
1
13,90
204, 255, 355
1,003
0,461
0,840
Рутин
РСО мирицетина
1
18,48
207, 254, 360
0,721
0,296
0,733
Мирицетин
РСО изорамнетина
1
24,23
203, 256, >360
1,051
0,392
1,000
Изорамнетин
РСО лютеолина
1
21,37
207, 255, 265, 350
0,765
0,433
0,862
Лютеолин
Примечание: данные, приведенные в таблице 2, представляют собой средние значения пяти определений, при этом отклонения полученных результатов не превышают 5%.
Из данных, представленных на рисунке 2А и в таблице 2, следует, что в состав выделенной суммы БАВ
входит 4 флавоноидных соединения. Анализ характера УФ-спектров выявленных веществ позволяет сделать заключение о том, что они относятся к классу флавоноидов, так как имеют характерные для флавонолов и флавонов максимумы поглощения (230–255 нм, 325–355 нм) [19, 20]. Сопоставление времен удерживания, характеров
УФ-спектров соединений и их спектральных отношений с аналогичными показателями РСО позволяет вещество,
образующее пик №1, идентифицировать как рутин; вещество, образующее пик №2, – как гиперозид.
На хроматограмме гидролизата флавоноидов (рис. 2Б) по сравнению с хроматограммой суммы флавоноидов исчезают пики с τ=13,90 и τ=16,24; значительно уменьшается высота пиков с τ=15,32 и τ=16,76, и
появляются 4 новых пика (τ=18,49; τ=20,19; τ=21,47; τ=24,58), из которых наиболее выражены пики №6
(τ=21,47) и №7 (τ=24,58). Указанные изменения подтверждают данные ТСХ о гликозидном характере флавоноидов листьев осины обыкновенной.
Соединение, образующее пик №6, по времени удерживания, характеру УФ-спектра и спектральным
отношениям по сравнению с аналогичными показателями РСО идентифицировано как кверцетин. Соединение, образующее пик №7, по вышеуказанным показателям в сравнении с РСО идентифицировано как кемпферол. Вещества, которые обусловливают появление в гидролизате пиков №4 и №5, по нашему мнению,
являются продуктами не полного гидролиза гликозидов флавоноидов или неизвестными агликонами, так как
по исследуемым характеристикам они не соответствуют РСО изорамнетина, лютеолина.
И.Ю. ЛОБАНОВА, В.Ф. ТУРЕЦКОВА
122
Таким образом, полученные результаты подтверждают данные зарубежных авторов о наличии в листьях осины обыкновенной кверцетина и кемпферола, но при этом они находятся в форме гликозидов. Присутствие в сырье Алтайского региона изорамнетина и лютеолина на данном этапе подтвердить не удалось.
Выводы
1. Методами экстракции и последующей адсорбционной колоночной хроматографии на полиамидном
сорбенте из листьев осины обыкновенной, произрастающей в Алтайском крае, выделена сумма четырех
флавоноидных соединений.
2. Флавоноиды листьев осины обыкновенной в основном представлены гликозидами флавонолов или
флавонов, среди которых методом ТСХ на основании величины Rf и цвета флюоресценции и методом
ВЭЖХ на основании времени удерживания, характеров УФ-спектров и спектральных отношений в сравнении с достоверными образцами идентифицированы гиперозид и рутин.
3. Хроматографические и спектроскопические исследования гидролизата выделенной суммы флавоноидов свидетельствуют о преобладании в изучаемом сырье гликозидов кверцетина и кемпферола.
Список литературы
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Турецкова В.Ф. Теоретическое и экспериментальное обоснование рационального использования коры и побегов
облепихи крушиновидной и коры осины обыкновенной : дис. … д-ра фарм. наук. Пермь, 2001. 321 с.
Турецкова В.Ф., Фильчукова Н.М. Изучение химического состава гидрофильной фракции коры осины обыкновенной // Вопросы клинической и теоретической медицины. Барнаул, 1994. Т. 2. С. 135–136.
Бородіна Н.В., Ковальов В.М. Кількісне визначення фенольних сполук Рopulus tremula L. // Фармаком. 2004.
№1. С. 75–78.
Кузнецов Б.Н., Левданский В.А., Кедрова Л.К. Выделение и изучение экстрактивных продуктов коры осины //
Химия растительного сырья. 1998. №3. С. 1–8.
Растительные ресурсы России. Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая
активность. Т. 2. Семейства Actinidiaceae – Malvaceae, Euphorbiaceae – Haloragaceae / отв. ред. А.Л. Буданцев.
СПб.; М., 2009. 513 с.
Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства
Paeoniaceae – Thymelaeaceae. Л., 1986. 336 с.
Зуева Е.П., Турецкова В.Ф., Крылова С.Г. Экорсин – новое противоязвенное средство растительного происхождения // Экспериментальная и клиническая фармакотерапия язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной
кишки. Создание новых гемостимуляторов. Томск, 1996. С. 25–26.
Рассыпнова С.С., Турецкова В.Ф., Зверев Я.Ф. Изучение противовоспалительного действия экстракта из коры
Populus tremula (Salicaceae) и входящих в его состав фенольных соединений // Растительные ресурсы. 2010.
Т. 46. Вып. 3. С. 103–108.
Бычкова Н.К. Противоописторхозные свойства экстракта коры осины : автореф. дис. ... канд. мед. наук. Томск,
1990. 27 с.
Bate-Smith E.E. The phenolic constituents of plants and their taxanomic significance // Bot. J. Linn. Soc. 1962. V. 58,
N371. Pp. 95–173.
Левицкая Ю.Ф., Легостаева А.Б. Микроскопический и товароведческий анализы осины листьев (Populus
tremula L.) как перспективного вида лекарственного растительного сырья // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : сб. науч. трудов. Пятигорск, 2010. С. 80–81.
Лапа И.К., Удре В.Ю. Фенольные соединения в развивающихся генеративных почках мужских и женских деревьев осины // Физиология растений. 1986. Т. 33, вып. 6. С. 1104–1112.
Кьосев П.А. Полный справочник лекарственных растений. М., 2002. 992 с.
Сафонов В.В., Лесиовская Е.Е., Саканян Е.И. Противовоспалительные свойства сухого экстракта из побегов
Caragana spinosa (L.) Vahl ex Hornem // Растительные ресурсы. 2000. Вып. 3. С. 83–90.
Лобанова И.Ю. Влияние вида экстрагента на состав извлечений из листьев осины обыкновенной // Молодежь –
Барнаулу: материалы X городской научно-практической конференции молодых ученых: в 2 т. Барнаул, 2009.
Т. 2. С. 95–96.
Компанцев В.А. Химическое изучение фенольных гликозидов некоторых видов ив Северного Кавказа: дис. …
канд. фарм. наук. Пятигорск, 1970. 105 с.
Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983. С. 67–77.
Косман В.М., Зенкевич И.Г. Информационное обеспечение для идентификации фенольных соединений растительного происхождения в обращенно-фазовой ВЭЖХ. Флавоны, флавонолы, флавононы и их гликозиды //
Растительные ресурсы. 1997. Т. 33, вып. 2. С. 14–26.
Клышев Л.К., Бандюкова В.А., Алюкина Л.С. Флавоноиды растений (распространение, физико-химические
свойства, методы исследования). Алма-Ата, 1978. 220 с.
Георгиевский В.П., Рыбаченко А.И., Казаков А.П. Физико-химические характеристики флавоноидных соединений. Ростов-на-Дону, 1977. 125 с.
Поступило в редакцию 27 мая 2010 г.
После переработки 19 октября 2010 г.
Скачать