на правах рукописи МИХАЙЛОВА Валентина Анатольевна Фенотипические и функциональные характеристики лейкоцитов периферической крови и их микрочастиц при преэклампсии 14.03.03 - патологическая физиология 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2015 2 Работа выполнена в лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта». Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Сельков Сергей Алексеевич Заведующий лабораторией иммунологии с группой по диагностике СПИД Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта». Доктор биологических наук Соколов Дмитрий Игоревич Ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии с группой по диагностике СПИД Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта». Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Розанова Ольга Егоровна Старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального научно-биологического агентства» Доктор биологических наук Самойлович Марина Платоновна Ведущий научный сотрудник лаборатории гибридомной технологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт цитологии Российской академии наук». Защита диссертации состоится «___» ___________ 2015 года в _______ часов на заседании диссертационного совета Д 001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Институт экспериментальной медицины» по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины» по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12, или на сайте http://www.iemrams.spb.ru/russian/dissov02.htm. Автореферат разослан «____» _____________ 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета, Доктор медицинских наук Дыбан П.А. 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Одним из распространенных осложнений беременности является преэклампсия, патогенез которой во многом связан с нарушением перфузии маточно-плацентарного ложа. Эта патология развивается после 20 недели беременности и для неё характерно развитие полиорганной недостаточности [Айламазян Э.К., 2008]. Развитие патофизиологического процесса при преэклампсии сопровождается изменением основных популяций лейкоцитов в периферической крови [Соколов Д.И., 2012] и децидуальной оболочке [Wilczynski J.R., 2003]. Изменение состава и функциональных характеристик лейкоцитов децидуальной оболочки приводит к развитию воспалительной реакции в зоне маточно-плацентарного контакта, которая может приобретать системный характер и приводить к манифестации клинических проявлений преэклампсии [Соколов Д.И., 2012]. При беременности, осложненной преэклампсией, для эндотелиальных клеток в зоне маточно-плацентарного контакта характерна экспрессия адгезионных молекул ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1 [Tziotis J., 2002], что, наряду с изменением секреции хемокинов клетками децидуальной оболочки и плаценты, может способствовать хемотаксису, адгезии и трансэндотелиальной миграции лейкоцитов из периферической крови в маточно-плацентарный комплекс. В литературе имеются разрозненные данные о фенотипических характеристиках лейкоцитов периферической крови матери при преэклампсии, тогда как их функциональные свойства остаются практически неисследованными, что определяет актуальность определения паттернов экспрессии адгезионных молекул и хемокиновых рецепторов лейкоцитами периферической крови и проведения функциональных тестов адгезии и трансэндотелиальной миграции лейкоцитов. Одной из популяций лейкоцитов, присутствующих в децидуальной оболочке на протяжении всей беременности, являются NK-клетки. При преэклампсии NK-клетки могут вносить вклад в развитие воспаления в зоне маточноплацентарного контакта за счет секретируемых цитокинов и цитотоксической активности [Goldman-Wohl, 2008]. В настоящее время в литературе представлены противоречивые данные о функциональной активности NK-клеток при преэклампсии, с чем связана актуальность изучения данной популяции лейкоцитов. В настоящее время одним из новых направлений исследований становится изучение феномена образования микровезикул (микрочастиц) эукариотическими клетками и их участие в межклеточных взаимодействиях. Как физиологическая беременность, так и беременность, осложненная преэклампсией, сопровождается повышением количества микрочастиц в плазме крови [Biro E., 2007]. При развитии воспаления в децидуальной оболочке возможно образование лейкоцитами микрочастиц, однако их фенотип, а также их влияние на свойства лейкоцитов при преэклампсии не изучены. Изменение функционального состояния лейкоцитов при преэклампсии может быть связано с различием в характеристиках микрочастиц клеток, присутствующих в периферической крови, поэтому исследование состава микрочастиц и эффектов, оказываемых ими на клетки, представляется актуальным. 4 Целью работы явилось изучение характеристик лейкоцитов и их микрочастиц, выделенных из периферической крови женщин с беременностью, осложненной преэклампсией. Задачи исследования: 1. Оценить in vitro особенности адгезии и трансэндотелиальной миграции мононуклеаров периферической крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией. 2. Охарактеризовать экспрессию поверхностных рецепторов лейкоцитами периферической крови у женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией. 3. Изучить активность NK-клеток периферической крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией. 4. Оценить характеристики микрочастиц плазмы периферической крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией. 5. Изучить in vitro влияние микрочастиц плазмы крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией, на функциональные свойства моноцитоподобных клеток линии THP-1. Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение функциональных характеристик, связанных со способностью лимфоцитов и моноцитов к адгезии и трансмиграции in vitro, у женщин с физиологической беременностью и с преэклампсией. Показано, что интенсификация функции адгезии к эндотелиальным клеткам мононуклеаров беременных женщин с преэклампсией не ведет к усилению функции транэндотелиальной миграции in vitro. Впервые проведенный комплексный сравнительный анализ экспрессии адгезионных молекул и рецепторов для цитокинов лейкоцитами периферической крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией, выявил повышение экспрессии адгезионных молекул CD18 CD8+ Т-лимфоцитами, CD11с NK-клетками, рецептора к IFNγ (CD119) моноцитами. Проведенный анализ функциональной активности NK-клеток периферической крови in vitro выявил снижение экспрессии гликопротеина CD107a, ассоциированного с лизосомальными мембранами. Выявлена повышенная экспрессия TRAIL NK-клетками периферической крови при преэклампсии. Впервые проведена комплексная оценка поверхностных рецепторов, представленных на мембранах микрочастиц плазмы периферической крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией. Впервые проведено изучение влияния микрочастиц плазмы периферической крови женщин с физиологической беременностью и беременностью, осложненной преэклампсией, на моноцитоподобные клетки линии THP-1. Теоретическая и практическая значимость. Выявленная при преэклампсии по сравнению с физиологической беременностью повышенная экспрессия адгезионных молекул CD8+ Т-лимфоцитами, моноцитами и повышенное количество CD11c+ NK-клеток в периферической крови свидетельствует об изменении функциональной активности этих клеток. Повышенная при преэклампсии 5 экспрессия рецепторов к IFNγ моноцитами и нейтрофилами отражает активированное состояние этих лейкоцитов. Следствием активированного состояния моноцитов и повышенной экспрессии адгезионных молекул лимфоцитами может являться установленная нами повышенная адгезия лимфоцитов и моноцитов к активированному эндотелию. Впервые на основании оценки экспрессии NKклетками CD107a и TRAIL, установлено, что преэклампсия сопровождается изменением функционального состояния NK-клеток периферической крови, при котором основным механизмом индукции апоптоза клеток-мишеней становится TRAIL-зависимый путь. Впервые проведенная комплексная оценка фенотипических характеристик микрочастиц плазмы крови позволила установить, что преэклампсия сопровождается повышением содержания в периферической крови микрочастиц с фенотипом CD45+CD16+CD56-. Впервые установлено, что микрочастицы плазмы крови женщин с преэклампсией в отличие от микрочастиц плазмы крови женщин с физиологической беременностью снижают экспрессию молекул CD18 и CD54 моноцитоподобными клетками линии THP-1, что отражает наличие регуляторной функции у микрочастиц. Обнаруженные различия экспрессии поверхностных молекул популяциями лейкоцитов, а также различия в содержании в периферической крови микрочастиц с определенным фенотипом у женщин с физиологической беременностью и женщин с преэклампсией в дальнейшем могут лечь в основу разработки методов выявления пациентов группы риска по развитию преэклампсии. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Преэклампсия сопровождается повышенной экспрессией CD18 CD8+ Тлимфоцитами, CD11с NK-клетками и CD119 моноцитами периферической крови и повышенной функцией адгезии лимфоцитов и моноцитов in vitro как к интактному, так и к активированному эндотелию. Данные фенотипические и функциональные характеристики лимфоцитов и моноцитов при преэклампсии могут определять их миграцию в децидуальную оболочку и их участие в развитии воспаления. 2. При преэклампсии происходит смена стратегии цитотоксических эффектов NK-клеток, отражающаяся в снижении способности реализовывать цитотоксический ответ с образованием гранзимов и перфорина, что характеризуется сниженной по сравнению с физиологической беременностью экспрессией CD107a NK-клетками после активации. Преэклампсия по сравнению с физиологической беременностью характеризуется присутствием в периферической крови повышенного количества TRAIL+ NK-клеток, что указывает на предрасположенность NK-клеток индуцировать TRAIL-опосредованный апоптоз клеток-мишеней. 3. Повышенное у женщин с физиологической беременностью по сравнению с небеременными женщинами количество микрочастиц с фенотипом CD45+CD16+CD56+ может отражать гибель цитотоксических NK-клеток. Развивающаяся при преэклампсии воспалительная реакция отражается в присутствии в кровеносном русле повышенного количества микрочастиц, образованных нейтрофилами и моноцитами. Преэклампсия сопровождается сниженным 6 количеством микрочастиц, образованных NK-клетками, что может быть связано с нарушением механизмов развития иммунологической толерантности, а именно дефектом в индукции гибели активированных NK-клеток, что определяет цитотоксические эффекты в зоне маточно-плацентарного контакта. 4. Микрочастицы плазмы периферической крови женщин с физиологической беременностью и с преэклампсией в условиях in vitro по-разному изменяют активность моноцитоподобных клеток линии THP-1, проявляя регуляторные свойства. Микрочастицы женщин с физиологической беременностью снижают экспрессию рецептора для IL-8 и повышают экспрессию адгезионных молекул CD18 и CD54 клетками линии THP-1. Микрочастицы женщин с преэклампсией по сравнению с микрочастицами женщин с физиологической беременностью повышают экспрессию CD181 клетками линии THP-1. Реализация работы. По материалам диссертации опубликовано 29 научных работ, в том числе 9 статей в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов диссертационных исследований. Личное участие автора заключалось в проведении экспериментальных исследований, статистической обработке, обобщении и анализе полученных результатов, и подготовке статей. Методическая помощь была оказана с.н.с. отдела иммунологии ФГБНУ «ИЭМ» Стариковой Э.А. при освоении метода трансэндотелиальной миграции. Атомно-силовая микроскопия препаратов микрочастиц, выделенных из плазмы периферической крови, была выполнена совместно с сотрудниками биологического факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета Бенкеным К.А. и Онохиным К.В., за что автор выражает им благодарность. Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на X юбилейном Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2009), XIII Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в СанктПетербурге» (Санкт-Петербург, 2009), II Европейском Конгрессе по иммунологии (Берлин, Германия, 2009), на 14-ом Международном конгрессе по Иммунологии (Кобе, Япония, 2010), I Ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых 2010» (Санкт-Петербург, 2010), XVI Межгородской конференции молодых ученых «Актуальный проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2010), на XI Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2010), 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010), Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010), на XVII Межвузовской конференции молодых ученых «Актуальный проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2011), XIV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), 17-ом Международном студенческом медицинском конгрессе (ISCOM 2011) (Гронинген, Голландия, 2011), на XII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2011), II Ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых 2011» (Санкт-Петербург, 2011), Международной конференции «Programmed Cell Death in Biology and Medicine» (Москва, 7 2012), XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2012), XVIII Международной медико-биологической конференции молодых исследователей, посвященной двадцатилетию факультета СПбГУ «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2015). Объем и структура диссертации. Материалы диссертации включают введение, обзор литературы, описание материалов и методов, полученные результаты, обсуждение, общее заключение, выводы, список сокращений и список литературы. Текст диссертации изложен на 190 страницах, содержит 10 таблиц, 46 рисунков и 11 приложений. Список литературы состоит из 367 работ. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Получено разрешение Этического Комитета ФГБУ «НИИ АГ им.Д.О.Отта» СЗО РАМН на проведение исследований. Обследовано 422 женщины во время и вне беременности: здоровые небеременные женщины, в анамнезе у которых были одни и более родов (I группа), соматически здоровые женщины с физиологически протекающей беременностью (ФБ) (38-39 недель, группа II) и беременные женщины с преэклампсией (ПР) (3839 недель, группа III). Критериями включения для I группы являлись отсутствие беременности на момент исследования, согласие на проведение исследования. Критериями исключения для I группы являлись острая или обострение хронической инфекционной патологии, сахарный диабет I и II типов, аллергические реакции, аутоиммунные заболевания, заболевания сердечно-сосудистой системы, отказ от проведения обследования. Возраст женщин II и III групп находился в интервале от 17 до 48 лет и в среднем составил 30,8±5,9 лет. Критериями включения для II группы являлись срок беременности 38-39 недель, одноплодная беременность, отсутствие осложнений беременности, согласие на участие в исследовании. Критериями включения для III группы являлись срок беременности 3839 недель, наличие клинических проявлений преэклампсии, одноплодная беременность, согласие на участие в исследовании. Критериями исключения для II и III групп являлись сахарный диабет I и II типов, сахарный диабет беременных на инсулинотерапии, многоводие, маловодие, урогенитальная инфекция, острая или обострение хронической инфекционной патологии, аутоиммунные заболевания, аллергические реакции, гипертоническая болезнь и другие заболевания системы кровообращения, отказ от проведения исследования. Все беременные женщины наблюдались врачами в акушерских отделениях ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта». Диагноз преэклампсии у женщин третьей группы установлен в отделении физиологии и патологии беременности ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» в соответствии с Международной классификацией болезней X пересмотра на основании клинических симптомов различной степени выраженности. Получено информированное согласие пациенток на обследование. Объектом исследования явилась периферическая кровь. Культуры клеток: эндотелиальные клетки (ЭК) линии Ea.Hy 926 культивировали в среде DMEM/F12 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 50 мкг/мл сульфата гентамицина, 2 мМ L-глютамина, HAT. Моноцитоподобные 8 клетки линии ТНР-1 культивировали в среде RPMI-1640, 10% ЭТС, 2 мМ Lглютамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США). Адгезия к эндотелиальным клеткам и трансэндотелиальная миграция мононуклеаров периферической крови. ЭК культивировали в 24-луночном планшете, затем в часть лунок с ЭК вносили 100 ЕД/мл TNFα (препарат «Рефнолин», Латвия) и инкубировали 22 часа. Затем все лунки отмывали трижды раствором Хенкса. Выделенные методом центрифугирования в градиенте плотности мононуклеары периферической крови вносили в лунки (1×106 клеток в 500 мкл культуральной среды) и культивировали 30 минут (5% СО2, 37ºС). Затем трижды отмывали монослой ЭК от неадгезировавших клеток раствором Хенкса. Адгезировавшие клетки вместе с монослоем ЭК переводили в суспензию путем 5-минутной экспозиции в растворе версена. Анализ адгезировавших к ЭК мононуклеаров проводили на цитофлюориметре FACScan с использованием антител к CD3, CD16, CD56, CD4, CD8, CD14. При оценке трансэндотелиальной миграции 45000 ЭК вносили во вставки с поликарбонатным фильтром (размер пор 8 мкм, BDFalkon, США) в среде DMEM/F12, 10% ЭТС и инкубировали 24 часа (37˚С, 5% СО2). В верхнюю камеру вставки вносили мононуклеары периферической крови(1×106 клеток в 200 мкл среды DMEM/F12, 10% ЭТС). В нижнюю камеру вносили 700 мкл той же среды. В часть нижних камер вносили 50 Ед/мл TNFα и инкубировали 24 часа (37˚С, 5% СО2). После инкубации собирали клетки, мигрировавшие в нижнюю камеру, окрашивали антителами к CD45, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD14 (BD, США) и оценивали количество лимфоцитов и моноцитов периферической крови с помощью цитофлюориметра FACSCantoII. Экспрессию лейкоцитами периферической крови адгезионных молекул, рецепторов к хемокинам и ростовым факторам оценивали с помощью метода проточной цитофлюориметрии с помощью FACSCantoII. Обрабатывали клетки цельной периферической крови антителами CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD56, CD11a, CD11b, CD11c, СD18, CD29, CD49d, CD31, CD44, CD47, CD51/CD61, CD36, CD54, CD58, CD62L, CD62E, CD62P, CD138, CD106, интегрину β7,CD192, CD134, CD 196, CXCR5, CD197, CD119, CD184,CD114, CD116, CD140b, CD140a (BD, США). Для оценки функциональной активности NK-клеток периферической крови мононуклеары периферической крови выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин, инкубировали 4 часа 1 млн клеток в 1мл среды RPMI-1640, 10% ЭТС (37°С, 5% CO2). Часть клеток инкубировали в присутствии антител к CD107a и 8 мкг\мл монензина. Вторую часть клеток от тех же пациенток инкубировали в присутствии антител к CD107a, 8 мкг\мл монензина, и стандартного реагента для активации лейкоцитов (активатора), содержащего 2,5 мкг\мл РМА и 0,5 мкг\мл иономицина. После инкубации клетки обрабатывали антителами к CD3, CD16, CD56, CD54. При анализе экспрессии TRAIL клетки периферической крови обрабатывали антителами к CD3, CD16, CD56, TRAIL. Экспрессию анализировали на цитофлюориметре FACSCantoII. Атомно-силовая микроскопия микрочастиц периферической крови. Все растворы и среды для выделения микрочастиц были предварительно профиль- 9 трованы через фильтр с диаметром пор 0,1 мкм. Периферическую кровь центрифугировали 15 минут (2600g, +10ºС) и 10 минут (9900g, +10ºС) для осаждения тромбоцитов. Затем центрифугировали надосадок 20 минут (19800g, +10ºС) для осаждения микрочастиц, после обработки холодным раствором Хенкса без CaCl2 центрифугировали 20 минут (19800g, +10ºС). Полученные микрочастицы разводили в растворе Хенкса без CaCl2 и наносили на покровные стекла, покрытые полилизином с добавлением 10% формалина, и высушивали при 37оС. После фиксации препараты промывали в дистиллированной воде и высушивали. Атомно-силовая микроскопия препаратов микрочастиц выполнена на сканирующем зондовом микроскопе Интегра Аура (NT-MDT, Россия) сотрудниками биологического факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета Бенкеным К.А. и Онохиным К.В., за что автор выражает им благодарность. Для анализа микрочастиц периферическую кровь последовательно центрифугировали при 2600g, 9900g, 19800g. Микрочастицы разводили в растворе Хенкса с 0,35% бычьего сывороточного альбумина, обрабатывали антителами к CD45, CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD56, CD62L, CD62P, CD54, CD41a и оценивали на цитофлюориметре FACSCantoII. Оценка влияния микрочастиц плазмы крови на функциональные свойства клеток линии THP-1. Микрочастицы плазмы периферической крови выделяли путем последовательных центрифугирований (2600g, 9900g, 19800g). За 22 часа до стимуляции микрочастицами клетки линии ТНР-1 рассевали в 24-луночный планшет (1х106 клеток/мл) и инкубировали (37°С, 5% CO2). В часть лунок вносили 50 ЕД/мл TNFα. На следующий день клетки отмывали раствором Хенкса. Выделенные из периферической крови микрочастицы разводили RPMI-1640, 10% ЭТС пропорционально исходному объему образца плазмы крови и вносили в лунки с клетками THP-1, культивировали 24 часа. Затем клетки THP-1 отмывали раствором Хенкса, обрабатывали реагентом FcBlock, антителами к CD11a, CD11b, CD11c, СD18, CD29, CD49d, CD31, CD47, CD54, интегрину β7, HLA-DR, CD119, CD181, CD182, CD120a, VEGFR1, VEGFR2 и анализировали на цитофлюориметре FACSCantoII. Статистический анализ проводили в программе STATISTICA 7.0 с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Адгезия и миграция мононуклеаров через эндотелий. Применяли два варианта модельных систем in vitro: интактный эндотелий и активированный TNFα эндотелий. Установлена сниженная адгезия лимфоцитов к интактному эндотелию в группе II по сравнению с группой I (рисунок 1). Количество лимфоцитов, адгезировавших к активированному эндотелию, было выше, чем лимфоцитов, адгезировавших к интактному эндотелию. Указанные различия могут определять миграцию лимфоцитов беременных женщин в децидуальную оболочку, так как эндотелий в зоне маточно-плацентарного контакта находится в активированном состоянии и экспрессирует адгезионные молекулы ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, PECAM-1. Выявленное при ФБ повышенное количество моноцитов, 10 адгезировавших к интактному эндотелию, может являться следствием изменения экспрессии адгезионных молекул на моноцитах. В группе III по сравнению с группой II количество лимфоцитов, адгезировавших к активированному эндотелию, было выше, что обусловлено повышенной экспрессией адгезионных молекул на активированном эндотелии и может быть следствием изменения экспрессии адгезионных молекул отдельными популяциями лимфоцитов при ПР. 100 80 60 40 20 0 % ** ◙◙ ◙◙ # ◙ ◙# * лимфоциты (адгезия лимфоциты (адгезия моноциты (адгезия к моноциты (адгезия к к интактному к активированному интактному активированному эндотелию) TNFα эндотелию) эндотелию) TNFα эндотелию) Рисунок 1. Адгезия мононуклеаров к эндотелию. * - p<0,05, **- p<0,01 по сравнению с группой I; # - p<0,05 по сравнению с группой II. ◙ - p<0,05; ◙◙ - p<0,01 - различия внутри группы. Адгезия моноцитов к активированному эндотелию при ПР была выше, чем при ФБ, что связано с локальным воздействием цитокинов и хемокинов на моноциты в зоне маточно-плацентарного кровотока. Как спонтанная, так и индуцированная TNFα, трансэндотелиальная миграция моноцитов in vitro в группе II была выше, чем в группе I, в то время как миграция лимфоцитов была снижена (рисунок 2). Рисунок 2. Трансэндотелиальная миграция мононуклеаров.*- p<0,05 по сравнению с группой I; # - p<0,05 по сравнению с группой II. 11 Сниженная трансмиграция обусловлена сниженной адгезией лимфоцитов к интактному эндотелию и связана со снижением способности лимфоцитов мигрировать в ткани в отсутствие активационных сигналов от эндотелия. В присутствии TNFα в группе II относительное количество мигрировавших лимфоцитов снижено, а моноцитов – повышено по сравнению с группой I. В группе III по сравнению с группой II снижено относительное количество лимфоцитов, спонтанно мигрировавших в нижнюю камеру (рисунок 2), что указывает на недостаточность повышенной при ПР адгезии к активированному эндотелию лимфоцитов для завершения трансмиграции в отсутствии дополнительных хемокинов и цитокинов, секретируемых в условиях воспаления в зоне маточно-плацентарного контакта. Экспрессия поверхностных маркеров лейкоцитами периферической крови. В группе II по сравнению с группой I увеличено количество CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, CD3+CD4+ Т-лимфоцитов, NK-клеток, экспрессирующих интегрин β7, CD29, CD49d, увеличена интенсивность экспрессии моноцитами CD11c, CD11b, CD54, CD62P, CD47, CD29, CD31 (таблица 1). Выявленные изменения экспрессии адгезионных молекул популяциями лимфоцитов и моноцитами могут определять выявленную in vitro повышенную адгезию к эндотелию при физиологической беременности. В группе III по сравнению с группой II интенсивность экспрессии CD18 CD3+CD8+ Т-лимфоцитами в 6,5 раз выше. В группе III по сравнению с группой II снижено количество CD3+CD4+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD47, CD44, CD49d, а количество CD11c+ NKклеток повышено. В группе III по сравнению с группой II интенсивность экспрессии моноцитами CD11c, CD54, CD47, CD49d снижена, но повышено количество CD119+ моноцитов и интенсивность экспрессии ими CD119 (таблица 1). Повышенная при ФБ экспрессия адгезионных молекул CD8+ Т-лимфоцитами, CD4+ Тлимфоцитами, NK-клетками и моноцитами указывает на возможность этих клеток мигрировать в децидуальную оболочку и регионарные лимфатические узлы. При ПР повышенная экспрессия CD18 CD8+ Т-лимфоцитами, CD11с NKклетками свидетельствует о возможности миграции этих клеток в децидуальную оболочку, что вместе с нарушениями механизмов индукции толерантности может определять развитие воспаления в децидуальной оболочке. Экспрессия CD119 моноцитами при ПР определяет их готовность к участию в развитии воспалительной реакции. Функциональная активность NK-клеток периферической крови. Количество CD107a+ NK-клеток повышалось в присутствии активатора по сравнению с их начальным количеством во всех группах пациентов (таблица 2), что указывает на способность NK-клеток отвечать на стимуляцию. В группе III по сравнению с группой II количество CD107a+ NK-клеток было ниже после инкубации в присутствии активатора (таблица 2), что свидетельствует о сниженной гранзим-опосредованной цитотоксической активности NK-клеток при ПР. Количество TRAIL+ NK-клеток повышено в группе III (25,9% {11,9%; 43,9%}) по сравнению с группой II (12,8 % {5,3%; 20,4%}, # - p<0,05). 12 Таблица 1. Экспрессия лейкоцитами поверхностных маркеров (медианы). Группа I (n=27) Группа II (n=22) ОтноОтноИнтенсивИнтенсивсительсительПопуляция лейкоцитов ность эксность эксное коное копрессии, прессии, личеличеMFI MFI ство, % ство, % CD3+CD8+Integrin β7+ 36,2 817 48,1 ** 1070 ** CD3+CD8+CD29+ 18,9 662 26,6 * 874 * CD3+CD8+CD49d+ 78,6 2056 91,9 * 2345 CD3+CD8+CD18+ 19,4 486 30,1 576 CD3+CD4+ Integrin β7+ 18,4 486 28,0 *** 665 ** CD3+CD4+ CD29+ 25,0 961 31,1 * 1104 * CD3+CD4+CD49d+ 53,1 1699 71,5 *** 2054 * CD3+CD4+CD47+ 97,4 5369 99,2 6034 * CD3+CD4+CD44+ 26,8 729 25,8 602 CD3-CD16+CD56+ Integrinβ7+ 3,4 144 8,9 ** 233 CD3-CD16+CD56+CD29+ 22,1 865 32,9 * 1076 CD3-CD16+CD56+CD49d+ 83,1 1572 93,2 ** 2067 *** CD3-CD16+CD56+CD11c+ 42,9 1831 51,8 2226 CD14+CD11c+ 98,9 4351 98,9 11047 *** CD14+CD11b+ 83,0 279 91,2 ** 4130 *** CD14+CD54+ 98,9 3669 99,3 6845 *** CD14+CD62P+ 82,9 266 80,7 3164 *** CD14+CD47+ 68,7 2856 86,9 * 3817 *** CD14+CD29+ 72,5 2210 85,3 3133** CD14+CD31+ 99,4 1170 99,0 16765 *** CD14+CD119+ 46,5 3 65,6 1971 *** CD14+CD49d+ 91,3 16313 86,8 3575 *** Группа III (n=24) Относи- Интенсивтельное ность эксколиче- прессии, ство, % MFI 38,8 ## 764 ### 21,8 584 ## 78,4 ### 1783 ### 17,4 # 3890 # 24,6 519 # 30,4 779 ### 56,6 # 1306 ### 95,7 ### 3923 ### 14,7 ## 336 ### 11,6 229 27,5 698 ## 89,9 1632 ## 60,2 # 2286 98,9 9071 # 92,8 4239 99,0 5587 ## 84,4 2726 79,8 2985 # 91,5 2639 99,1 15422 80,7 # 2090 # 87,9 2226 ## *- p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001 по сравнению с группой I; # - p<0,05, ## p<0,01, ### - p<0,001 по сравнению с группой II. MFI - относительные единицы флуоресценции. Таблица 2. Экспрессия CD107a NK-клетками периферической крови. Группа I Группа II ОтносиОтносиУсловия ИнтенсивИнтенсивтельное тельное инкубации ность эксность экспресколичеколичепрессии, MFI сии, MFI ство, % ство, % Инкубация без 0,5 1754 1,1 1744 активатора {0,2; 2,4} {1240; 2172} {0,4; 2,7} {649; 1873} 10,8 2957 7,4 3447 Инкубация с {5,6; 18,2} {2282; 3417} {4,0; 11,0} {2550; 4621} активатором ◙◙◙ ◙◙ ◙◙◙ ◙◙◙ Группа III ОтносиИнтенсивность тельное экспрессии, количеMFI ство, % 1,1 1170 {0,6; 1,7} {824; 1604} 4,5 3292 {2,6; 6,0} {2056; 3618} ◙◙◙# ◙◙◙ ◙◙ - p<0,01, ◙◙◙ - p<0,001 (различия внутри группы); # - p<0,05 по сравнению с группой II. MFI - относительные единицы флуоресценции. Содержание и фенотипические характеристики микрочастиц периферической крови. При помощи атомно-силовой микроскопии поля зрения 20х20 мкм определили популяцию сферических объектов плазмы 13 периферической крови в диапазоне высот 50-900 нм с максимумом 230 нм. Мажорная популяция микрочастиц находилась в диапазоне высот 100-300 нм. Гранулометрический анализ поля зрения 5х5 мкм показал средний диаметр микрочастиц плазмы крови составил 330 нм. В группе II общее содержание микрочастиц превышает их количество в группе I (p<0,001), что отражает активно протекающие процессы межклеточных взаимодействий в фетоплацентарном комплексе. В группе II по сравнению с группой I повышено количество микрочастиц с фенотипом NK-клеток (CD45+CD16+CD56+, CD45– CD16+CD56+) и Т-хелперных лимфоцитов (СD3+CD4+) (таблица 3), что может быть следствием гибели цитотоксических NK-клеток и активации CD4+ Тлимфоцитов при индукции толерантности. При ПР не происходит гибели цитотксических NK-клеток, что отражается в выявленном сниженном количестве микрочастиц CD45+CD16+CD56+ по сравнению с ФБ. Количество микрочастиц NK-клеток с фенотипом CD45+CD16–CD56+ было вдвое выше при ПР, что может отражать гибель NKклеток с фенотипом CD16dimCD56bright в децидуальной оболочке, обладающих регуляторными функциями. Источником микрочастиц с фенотипом CD45+CD16+CD56– могут быть NK-клетки, моноциты и нейтрофилы. Так как количество специфичных для NK-клеток микрочастиц снижено при ПР, возможно преимущественное происхождение микрочастиц CD45+CD16+CD56– из моноцитов и нейтрофилов при их активации в зоне маточно-плацентарного контакта. Таблица 3. Количество микрочастиц, экспрессирующих поверхностные маркеры. Группа I (n=21) Комбинации поверхАбсолютное колиностных маркеров чество, в 1 мл CD45+ CD16+ CD56+ 298 {188; 600} CD45+ CD16+ CD56– 1610 {834; 600} CD45+CD16– CD56+ 765 {418;, 1234} CD45–CD16+ CD56+ 3832 {1359; 5824} CD3+ CD4+ 563 {330; 1065} Группа II (n=20) Группа III (n=24) Абсолютное количе- Абсолютное количество, в 1мл ство, в 1мл 9389{4974; 17894}** 840 {465; 1372} ## 541 {292; 1225}* 9923{4032;17433}## 520 {161; 888}* 981 {784; 1658} # 5989 {2170; 18934}* 8274 {3443; 18439} 1707 {686; 3302}* 970 {802; 1639} *- p<0,05, ** - p<0,001 по сравнению с группой I; # - p<0,05, ##- p<0,001по сравнению с группой II. Влияние микрочастиц плазмы крови на клетки линии THP-1. При воздействии микрочастиц группы II по сравнению с группой I in vitro снижается экспрессия CD181 интактными и предварительно активированными TNFα клетками линии THP-1 (рисунок 3). Можно предположить, что при аналогичном влиянии микрочастиц на клетки в условиях in vivo сниженная экспрессия рецептора к IL-8 может влиять на миграцию клеток в ткани и в том числе в децидуальную оболочку, учитывая, что IL-8 секретируется клетками децидуальной оболочки и плаценты [Соколов, 2012]. Экспрессия CD18 и CD54 клетками THP-1 повышена при влиянии микрочастиц плазмы женщин группы II по сравнению с группой I, что указывает на существование контроля миграции клеток в ткани со стороны присутствующих в плазме 14 крови микрочастиц. Экспрессия CD181 интактными и предварительно активированными клетками ТНР-1 подавлялась после введения микрочастиц группы III, но в меньшей степени, чем при действии микрочастиц группы II. Возможно, что в условиях in vivo аналогичное увеличение экспрессии CD181 на моноцитах под влиянием микрочастиц, присутствующих в плазме крови при ПР, может способствовать миграции моноцитов в зону воспаления. Экспрессия рецепторов CD18 и CD54 активированными клетками THP-1 снижалась при воздействии микрочастиц группы III. Вероятно, аналогичное влияние микрочастиц, присутствующих в плазме при ПР, в ситуации in vivo на моноциты периферической крови может компенсировать повышенную активность моноцитов при ПР. Рисунок 3. Влияние микрочастиц плазмы на экспрессию поверхностных молекул моноцитоподобными клетками линии ТНР-1. * - p< 0,05 по сравнению с группой I; # - p<0,05 по сравнению с группой II. Таким образом, наблюдающаяся на фоне повышенной экспрессии адгезионных молекул лейкоцитами при ФБ сниженная функция адгезии и трансэндотелиальной миграции лимфоцитов через эндотелий указывают на определяющую роль хемокинов в привлечении лейкоцитов в децидуальную оболочку. Повышенная адгезия и трансэндотелиальная миграция моноцитов через эндотелий при ФБ может быть вызвана повышенной экспрессией моноцитами CD11b, CD11c,CD29, CD31, CD47, CD62P. ФБ сопровождается появлением в периферической крови 15 микрочастиц лейкоцитов, вызывающих изменение экспрессии адгезионных молекул и рецептора к цитокину IL-8 моноцитоподобными клетками линии THP-1. ПР сопровождается развитием воспалительной реакции в децидуальной оболочке и в плаценте, секрецией провоспалительных цитокинов и повышением экспрессии адгезионных молекул эндотелиальными клетками в зоне маточноплацентарного контакта. Выявленная повышенная экспрессия адгезионных молекул CD8+ Т-лимфоцитами, моноцитами, NK-клетками определяет возможность миграции этих клеток в децидуальную оболочку. При ПР лейкоциты находятся в активированном состоянии, что подтверждается данными о повышенной экспрессии CD119 моноцитами, и определяет их готовность к адгезии к эндотелию при наличии хемоаттрактанта. Выявленная in vitro повышенная адгезия лимфоцитов к активированному эндотелию при ПР отражает повышенный адгезионный потенциал лимфоцитов. Учитывая то, что эндотелиальные клетки в зоне маточно-плацентарного контакта находятся в активированном состоянии [Dye J.F, 2001], лимфоциты при ПР могут адгезировать к эндотелию и мигрировать в зону воспаления в децидуальной оболочке. При ПР изменяется функциональное состояние NK-клеток периферической крови: основным механизмом индукции апоптоза клеток-мишеней становится TRAIL-зависимый путь, а в периферической крови появляется повышенное количество микрочастиц, образованных нейтрофилами и моноцитами, что может являться следствием развивающегося в маточно-плацентарном комплексе воспаления. При ПР микрочастицы плазмы подавляют экспрессию CD18 и CD54 моноцитоподобными клетками THP-1, что делает сходным фенотип этих клеток с фенотипом клеток THP-1 при воздействии микрочастиц небеременных женщин, что может отражать нарушение системы контроля межклеточных взаимодействий при ПР на системном уровне. ВЫВОДЫ 1. Физиологическая беременность сопровождается сниженной трансэндотелиальной миграцией лимфоцитов и повышенной трансэндотелиальной миграцией моноцитов in vitro. Преэклампсия по сравнению с физиологической беременностью характеризуется повышенной адгезионной способностью лимфоцитов и моноцитов периферической крови к активированным эндотелиальным клеткам линии Ea.Hy926. Функция трансэндотелиальной миграции лимфоцитов периферической крови in vitro снижена при преэклампсии по сравнению с физиологической беременностью. 2. У женщин с физиологической беременностью по сравнению с небеременными женщинами повышена экспрессия CD8+ Т-лимфоцитами, CD4+ Т-лимфоцитами, NK-клетками адгезионных молекул CD29, CD49d, интегрин β7, а также CD62P, CD11b, CD11c, CD29, CD31, CD47, CD54 моноцитами периферической крови. При преэклампсии по сравнению с физиологической беременностью повышена экспрессия CD18 CD8+ Т-лимфоцитами, CD11с NK-клетками, а экспрессия адгезионных молекул CD4+ Т-лимфоцитами снижена. 16 3. У женщин при физиологической беременности по сравнению с небеременными женщинами для нейтрофилов и моноцитов периферической крови характерна повышенная экспрессия рецептора к IFNγ (CD119). При развитии преэклампсии экспрессия рецептора к IFNγ на моноцитах периферической крови возрастает. 4. Преэклампсия сопровождается повышением количества NK-клеток периферической крови, экспрессирующих TRAIL, при отсутствии изменений количества CD107a+ NK-клеток. При стимуляции NK-клеток in vitro количество активированных CD107a+ NK-клеток снижено при преэклампсии по сравнению с физиологической беременностью. 5. Физиологическая беременность сопровождается присутствием в плазме периферической крови повышенного количества микрочастиц преимущественно образованных NK-клетками (CD45+ CD16+ CD56+ и CD45- CD16+ CD56+). При преэклампсии по сравнению с физиологической беременностью в периферической крови повышено содержание микрочастиц преимущественно нейтрофильного и моноцитарного происхождения (CD45+CD16+CD56-). 6. Микрочастицы плазмы крови женщин с физиологической беременностью и с преэклампсией in vitro обладают разнонаправленными эффектами на экспрессию активированными моноцитоподобными клетками линии THP-1 адгезионных молекул CD18 и CD54 и на экспрессию рецептора к IL-8 (CD181) клетками линии THP1 независимо от наличия предшествовавшей активации. Список работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК России: 1. Соколов Д.И. Оценка функции адгезии к эндотелиальным клеткам различных субпопуляций мононуклеаров периферической крови беременных женщин в норме и при гестозе / Соколов Д.И., Лесничия М.В., Селютин А.В. и др. // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. –2008. –Т.7, №4. –С.34-41. 2. Михайлова В.А. Экспрессия адгезионных молекул моноцитами периферической крови при беременности / Михайлова В.А., Климовская Я.С., Аманова Н.В. и др. // Медицинская иммунология – 2010.- Т.12, №4-5. –C.337-342. 3. Михайлова В.А. Экспрессия адгезионных молекул и хемокиновых рецепторов NKклетками периферической крови при беременности / Михайлова В.А., Онохина Я.С., Сельков С.А., Соколов Д.И. // Иммунология. – 2011. - №2. – С.78-81. 4. Михайлова В.А. Цитотоксические Т-лимфоциты периферической крови матери при гестозе: экспрессия адгезионных молекул, хемокиновых рецепторов, активационных маркеров / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Еремеева Д.Р. и др. // Иммунология. – 2011. –Т.5, №32. – С.256-260. 5. Михайлова В.А. Экспрессия поверхностных маркеров на нейтрофилах при физиологической беременности и при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Онохина Я.С. и др. // Журнал акушерства и женских болезней. – 2011. – Т.LX, №6. – С.40-44. 6. Михайлова В.А. Фенотипическая характеристика CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови при физиологической беременности и при гестозе / Михайлова В.А., Онохина Я.С., Овчинникова Я.С. и др. // Медицинская иммунология. – 2012. – Т.14, №3. – С.195-200. 17 7. Михайлова В.А. Фенотипическая характеристика моноцитов периферической крови при физиологической беременности и гестозе / Михайлова В.А., Онохина Я.С., Овчинникова О.М. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Том 154, № 10. – С.466-471. 8. Михайлова В.А. Особенности трансэндотелиальной миграции мононуклеаров периферической крови при физиологической беременности и гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Сельков С.А., Соколов Д.И. // Иммунология. – 2012. – Т.33, №5. – С. 236-240. 9. Михайлова В.А. Выявление микрочастиц лейкоцитарного происхождения в периферической крови при физиологической беременности и при преэклампсии / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Зайнулина М.С. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2014. – Т.157, №6. – С.721-727. Тезисы докладов: 1. Михайлова В.А. Изменение адгезивных свойств мононуклеаров крови при патологии беременности – гестозе / Михайлова В.А., Сельков С.А., Соколов Д.И. // Медицинская иммунология. –2009. –Т.11, №4-5. –С.412. 2. Михайлова В.А. Секреция цитокинов и хемокинов тканью плаценты и адгезия мононуклеаров периферической крови при гестозе // Михайлова В.А., Соколов Д.И., Сельков С.А. / Материалы X юбилейного Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – 2009. –С.132-133. 3. Mikhailova V.A. Assessment of adhesion function of mononuclear leukocytes at normal pregnancy and at eclampsia / Mikhailova V.A., Selkov S.A., Sokolov D.I. // European Journal of Immunology. –2009. –Vol.39, №S1. –P.S 708-S 709. 4. Климовская Я.С. Сравнение экспрессии адгезионных молекул моноцитами периферической крови здоровых небеременных женщин и женщин с физиологическим течением беременности / Климовская Я.С., Михайлова В.А.// Материалы XVI конференции «Актуальные проблемы патофизиологии». – 2010. –С.75-76. 5. Михайлова В.А. Экспрессия адгезионных молекул NK-клетками периферической крови во время и вне беременности / Михайлова В.А., Климовская Я.С. // Материалы XVI конференции «Актуальные проблемы патофизиологии». – 2010. –С.7128-130. 6. Михайлова В.А. Функциональное состояние моноцитов периферической крови при беременности / Михайлова В.А., Климовская Я.С. // Материалы I-ой конференции «Репродуктивная медицина: взгляд молодых». – 2010. –С.28-29. 7. Mikhaylova V.A. What adhesion molecules do monocytes express at uncomplicated pregnancy? / Mikhaylova V.A., Klimovskaya Y.S., Sokolov D.I. // 17th International Student Congress of Medical Sciences. Abstact Book. – 2010. –P.243. 8. Mikhaylova V.A. Adhesion molecules of peripheral blood NK cells at pregnancy / Mikhaylova V.A., Klimovskaya Y.S., Sokolov D.I. // International Immunology Meeting Abstract – 2010. – Vol. 22, supplement №1. –P.i182. 9. Михайлова В.А. Экспрессия рецепторов NK-клетками при беременности в норме и при гестозе / Михайлова В.А., Климовская Я.С., Соколов Д.И., Сельков С.А. // Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя». –2010. –С.149. 10. Михайлова В.А. Характеристика NK-клеток у беременных с гестозом / Михайлова В.А., Соколов Д.И. // Российский иммунологический журнал. –2010. – Т. 4 (13), №4. –С.406-407. 18 11. Михайлова В.А. Адгезионные молекулы NK-клеток при беременности в норме и при гестозе / Михайлова В.А., Климовская Я.С., Соколов Д.И. // Медицинский академический журнал. – 2010. –T.10, №5. –С.214. 12. Михайлова В.А. Экспрессия хемокиновых рецепторов цитотоксическими Т-лимфоцитами периферической крови при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Соколов Д.И. // Материалы XVII конференции «Актуальные проблемы патофизиологии». – 2011. – С.109-110. 13. Михайлова В.А. Адгезионные молекулы и хемокиновые рецепторы моноцитов периферической крови при беременности, осложненной гестозом / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Максимова И.М. и др. // Медицинская иммунология. – 2011. – Т.13, №4-5. – С.432. 14. Онохина Я.С. Особенности экспрессии адгезионных молекул хелперными Т-лимфоцитами периферической крови при физиологической беременности / Онохина Я.С., Михайлова В.А., Соколов Д.И., Сельков С.А. // Медицинская иммунология. – 2011.- Т.13, №4-5. – С.433. 15. Михайлова В.А. Поверхностные маркеры хелперных Т-лимфоцитов периферической крови при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Онохина Я.С. и др. // Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – 2011. – С.148. 16. Михайлова В.А. Экспрессия адгезионных молекул цитотоксическими Т-лимфоцитами периферической крови при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Сафронова Н.Ю. // Журнал акушерства и женских болезней. – 2011. –Т.LX, №4. – С.140-141. 17. Mikhaylova V.A. Microparticles of peripheral blood leukocytes in case of healthy pregnancy and preeclampsia / Mikhaylova V.A., Ovchinnikova O.M., Sokolov D.I., Selkov S.A. // Abstract book «Programmed cell death in biology and medicine». – 2012. – P.38-39. 18. Михайлова В.А. Способы реализации NK-клетками функциональной активности при физиологической беременности и при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Онохина Я.С. и др.// Материалы XIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – 2012. – С.111-112. 19. Михайлова В.А. Оценка трансэндотелиальной миграции мононуклеаров периферической крови при беременности в норме и при гестозе / Михайлова В.А., Овчинникова О.М., Макулова М.В. и др. // Материалы XIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – 2012. – С.112-113. 20. Михайлова В.А. Изменение фенотипа моноцитов под влиянием микрочастиц периферической крови беременных женщин / Михайлова В.А., Овчинникова О.М. // Материалы XVIII конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье». – 2015. – С.342-343. Список сокращений: ПР – преэклампсия ФБ – физиологическая беременность ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка FcBlock - реагент, блокирующий неспецифическое связывание Fc-фрагментов антител HLA –человеческий лейкоцитарный антиген IFNγ – интерферонγ IL – интерлейкин MCP – моноцитарный хемотактический протеин PMA – форбол – миристат- ацетата 19 TNFα–фактор некроза опухоли α TRAIL – TNF-подобный лиганд, инициирующий апоптоз VEGF-R – рецептора фактора роста эндотелия сосудов