Федеральная целевая программа

<Номер соглашения>
<Номер постера>
Федеральная целевая программа
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014—2020 годы»
Науки о жизни
Тема: Разработка методов получения модифицированных высокоаффинных ДНК-аптамеров и создание на их основе нового
эффективного средства для противоопухолевой терапии
Руководитель проекта: в.н.с. Фролова Е.И
Соглашение 14.604.21.0110
на период 2014 - 2016 гг.
Получатель субсидии: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им.
академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Цели и задачи проекта
Разработка нового функционального инструментария, с помощью которого будет возможно быстро и эффективно получать олигонуклеотидные
соединения, избирательно связывающие наиболее востребованные биологические мишени – высокогликозилированные секретируемые белки и белки,
расположенные на поверхности клеток.
Создание нового терапевтического средства – противоопухолевого ДНК-аптамера на основе модифицированных нуклеотидов, нацеленного на
опухолевый рецептор CD47. ДНК-аптамер будет обладать большей аффинностью и специфичностью в отношении своей мишени, чем разрабатываемые
аналоги – моноклональные антитела, а также большей или равной биодоступностью.
Ожидаемые результаты проекта
Разработка новой технологии получения модифицированных нуклеозидтрифосфатов, обладающих высокой аффинностью к полисахаридам, в том числе, составляющим гликозидную часть белка. Определение
структуры функциональной группы и длины линкера, соединяющего ее с нуклеозидом, обеспечивающие максимальное сродство к полисахаридам с сохранением способности являться субстратом для термостабильной
ДНК-полимеразы. Создание мощного инструмента для получения высокоаффинных лигандов гликозилированных мишеней - секретируемых белков и поверхностных белков-рецепторов – наиболее частых мишеней
для терапии метаболических расстройств, онкопатологий, моно-и полигенных заболеваний.
Создание нового средства для терапии онкопатологий – блокирующего ДНК-аптамера против рецептора CD47. Аптамер будет обладать высокой стабильностью в биологических жидкостях, высокой аффинностью к
CD47 и, как следствие, меньшей эффективной дозировкой при системном применении, чем у моноклональных антител, а также значительно более высокой биодоступностью вследствие существенно меньшего
размера молекулы.
Еще один результат проекта - получение систематических сведений о влиянии структуры функциональных групп, содержащих ароматические бороновые кислоты, и длины линкеров на их способность эффективно
связывать полисахариды в составе гликозилированных белков. Такие сведения облегчат дальнейшую разработку иных модифицированных нулкеозидтрифосфатов, обладающих избирательным сродством к другим
классам мишеней.
Перспективы практического использования
Предполагается, что блокирующий аптамер на CD47 будет обладать высокой эффективностью как в составе монотерапии, так и в составе комплексной химиотерапии в роли адъювантного средства. В этом случае
ожидается возникновение синергического эффекта от применения химических агентов – цитостатиков, непосредственно угнетающих пролиферацию опухолевых клеток и анти-CD47-препаратов, позволяющих
иммунной системе пациента эффективно атаковать опухолевые клетки. После проведения необходимых клинических испытаний терапевтический аптамер может применяться непосредственно в составе уже
существующей комплексной химиотерапии. Одновременно с этим терапевтический ДНК-аптамер за счет своей более высокой биодоступности, меньшей иммуногенности и ожидаемого более высокого сродства к
белку-мишени будет обладать рядом преимуществ по сравнению с функциональными аналогами – моноклональными антителами. Другим важным конкурентным преимуществом терапевтического аптамера является
существенно более низкая стоимость производства и высокая стабильность соединения, что может дополнительно облегчить его внедрение в медицинскую практику и максимально широкое применение.
Практические сведения о влиянии функциональных групп и соединяющих их линкеров на свойства и эффективность модифицированных ДНК-аптамеров будут востребованы в ходе разработки новых модификаций
нуклеозидтрифосфатов для создания аптамеров, обладающих повышенным сродством к специфическим группам мишеней.
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Cu-AAC
PCR (Deep Vent)
FITC-меченый прямой праймер
Биотин-меченый обратный праймер
Был создан экспрессирующий вектор и линия-продуцент
Получена серия модифицированных нуклеозидтрифосфатов, содержащих присоединенные к
рекомбинантного внеклеточного фрагмента рецептора CD47, проведена
азотистым основаниям бороновые функциональные группировки, различающиеся по заряду и
очистка рекомбинантного белка, который впоследствии был использован
длине соединяющего линкера. После проведения испытаний были отобраны варианты (dNTP-3 и
для постановки селекции аптамерных библиотек
вNTP-6), сочетающие высокую аффинность и способность участвовать в ПЦР
Разделение цепей
на Streptavidin
MagBeads
Смесь двуцепочечных
модифицированных
фрагментов ДНК
SELEX с элюцией
SIRPa
Конструирование вектора, экспрессирующего CD47-TEV-tagRFP
(3295) BamHI
CD47 extracellular
CMV7 promoter
RSV LTR
CMV enhancer
1000
2000
gag
(2867) XbaI
S a l I (4087)
3000
4000
env
RRE
3' LTR ( U3)
5000
WPRE
cPPT/CTS
CMV promoter
CMV promoter 5' LTR (truncated) HIV-1
TEV site
10 x His tag
Хроматографическая
очистка на Ni-NTA
Factor Xa site
pLCMV-CD47-TEV-tRFP-10xHT
Упаковка
псевдовирусных
частиц
Иммобилизированны
й на микроносителях
антиген
Отбор
высокоаффинных
аптамеров
После проведения селекции были отобраны наиболее аффинные
Заражение
клеточной
культуры
Сортировка
флуоресцирующих
клеток
Экспансия в
жидкой среде
варианты аптамеров, как из модифицированных, так и из природной
библиотек, после чего при помощи иммунологического теста
определено, что два модифицированных варианта обладают большей
аффинностью к мишени, чем наилучший немодифицированный.
Проводятся работы по определению эффективности действия
Готовый продуцент секретируемого фрагмента CD47TEV-tagRFP (выраженная флуоресценция заметна только
от очагов плотного нарастания клеток)
отобранных аптамеров на прерывание взаимодействия между CD47 и его
лигандом SIRPa.
Партнеры проекта
Индустриальный партнер: ООО “ДНК-синтез”. Сфера деятельности: разработка и производство составляющих компонентов диагностических тестов,
реактивов, а также укомплектованных наборов для лабораторных и клинических исследований.
Весь объем внебюджетных средств предоставлен индустриальным партнером.
<Номер соглашения>
<Номер постера>