уменьшение активности естественных - Цитология

Реклама
2006
ÖÈÒÎËÎÃÈß
Ò î ì 48, ¹ 5
ÓÌÅÍÜØÅÍÈÅ ÀÊÒÈÂÍÎÑÒÈ ÅÑÒÅÑÒÂÅÍÍÛÕ ÊÈËËÅÐÎÂ
ÏÎ ÎÒÍÎØÅÍÈÞ Ê ÒÐÀÍÑÔÎÐÌÈÐÎÂÀÍÍÛÌ ÔÈÁÐÎÁËÀÑÒÀÌ 3T3-SV40,
ÎÁÐÀÁÎÒÀÍÍÛÌ N-ÀÖÅÒÈËÖÈÑÒÅÈÍÎÌ
© Í. À. Ôèëàòîâà, Ê. Ì. Êèðïè÷íèêîâà, È. À. Ãàìàëåé1
Í. À. Ôèëàòîâà, Ê. Ì. Êèðïè÷íèêîâà, È. À. Ãàìàëåé
Óìåíüøåíèå àêòèâíîñòè åñòåñòâåííûõ êèëëåðîâ
1
Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã;
ýëåêòðîííûé àäðåñ: [email protected]i.ru
Äëèòåëüíîå ïðèñóòñòâèå àíòèîêñèäàíòà N-àöåòèëöèñòåèíà (NAC, 10 ìÌ) â ñðåäå êóëüòèâèðîâàíèÿ
òðàíñôîðìèðîâàííûõ ìûøèíûõ ôèáðîáëàñòîâ ëèíèè 3T3-SV40 íå ìåíÿåò èõ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê ëèòè÷åñêîìó äåéñòâèþ åñòåñòâåííûõ êèëëåðîâ (ÅÊ) — ñïëåíîöèòîâ ìûøåé. Óäàëåíèå NAC èç ñðåäû êóëüòèâèðîâàíèÿ ïðèâîäèò ê òîìó, ÷òî ÷åðåç 18—20 ÷ àêòèâíîñòü ÅÊ ïî îòíîøåíèþ ê êëåòêàì 3T3-SV40 çíà÷èòåëüíî óìåíüøàåòñÿ: çíà÷åíèå öèòîòîêñè÷åñêîãî èíäåêñà (ÖÈ) ñòàíîâèòñÿ ðàâíûì 4.6 ± 2.4 (ïðîòèâ
31.8 ± 2.4 â êîíòðîëå), ïðèáëèæàÿñü ê çíà÷åíèþ ÖÈ íåòðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê. Íîðìàëüíûå ìûøèíûå ôèáðîáëàñòû 3T3 â òåõ æå ýêñïåðèìåíòàëüíûõ óñëîâèÿõ ñîõðàíÿþò óñòîé÷èâîñòü ê äåéñòâèþ ÅÊ.
Äàííûå ñâèäåòåëüñòâóþò î òîì, ÷òî äåéñòâèå NAC ìîæåò ïðèâîäèòü ê ÷àñòè÷íîé ðåâåðñèè òðàíñôîðìèðîâàííîãî ôåíîòèïà êëåòîê 3T3-SV40. Ïðåäïîëàãàåòñÿ, ÷òî ÷àñòè÷íàÿ ðåâåðñèÿ òðàíñôîðìèðîâàííîãî
ôåíîòèïà ñâÿçàíà ñ èçìåíåíèåì ñòðóêòóðû è ñâîéñòâ ïîâåðõíîñòíûõ áåëêîâ êëåòêè è, âîçìîæíî, êîìïîíåíòîâ âíåêëåòî÷íîãî ìàòðèêñà.
Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: åñòåñòâåííûå êèëëåðû, òðàíñôîðìèðîâàííûå ôèáðîáëàñòû, öèòîòîêñè÷åñêèé
èíäåêñ, N-àöåòèëöèñòåèí.
íà ðàçíûå ïîêàçàòåëè èììóííîãî ñòàòóñà îðãàíèçìà, ïîçâîëÿþò ñäåëàòü ëèøü ñàìûé îáùèé âûâîä: äëÿ ïîääåðæàíèÿ ãîìåîñòàçà èììóííîé ñèñòåìû íåîáõîäèì
îïðåäåëåííûé ðåäîêñ-áàëàíñ (Viora et al., 2001; Watzl et
al., 2003).
 ïðåäûäóùèõ ðàáîòàõ ìû ïîêàçàëè, ÷òî ïðÿìîå
äåéñòâèå àíòèîêñèäàíòîâ, â òîì ÷èñëå N-àöåòèëöèñòåèíà
(NAC), âûçûâàåò è ôóíêöèîíàëüíûå, è ìîðôîëîãè÷åñêèå
èçìåíåíèÿ íîðìàëüíûõ è òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê
(Ãàìàëåé è äð., 2003, 2004; Åôðåìîâà è äð., 2004). Ó êëåòîê 3T3-SV40 ýòè èçìåíåíèÿ âûðàæàþòñÿ â ÷àñòè÷íîé
ðåâåðñèè òðàíñôîðìèðîâàííîãî ôåíîòèïà (Ãàìàëåé è
äð., 2004; Åôðåìîâà è äð., 2004).
Çàäà÷à íàñòîÿùåé ðàáîòû — âûÿñíèòü, êàê îáðàáîòêà òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê 3T3-SV40 àíòèîêñèäàíòîì NAC âëèÿåò íà ñïîñîáíîñòü ÅÊ èììóííîé ñèñòåìû
ðàñïîçíàâàòü è ëèçèðîâàòü ýòè êëåòêè.
Ëèòè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü åñòåñòâåííûõ êèëëåðîâ (ÅÊ)
îòíîñèòñÿ ê öåëîìó ðÿäó ïîêàçàòåëåé, ïî êîòîðûì îöåíèâàþò èììóííûé ñòàòóñ îðãàíèçìà. ÅÊ — ýòî íåñåíñèáèëèçèðîâàííûå áîëüøèå ãðàíóëÿðíûå ëèìôîöèòû, îñóùåñòâëÿþùèå íå çàâèñèìûé îò àíòèòåë è êîìïëåìåíòà
ëèçèñ øèðîêîãî ñïåêòðà êëåòîê-ìèøåíåé — îïóõîëåâûõ, çàðàæåííûõ âèðóñàìè è íåêîòîðûõ íîðìàëüíûõ
(êàê ýìáðèîíàëüíûõ, òàê è êëåòîê çðåëîãî îðãàíèçìà).
ÅÊ èãðàþò âàæíóþ ðîëü â èììóííîì íàäçîðå çà ñîñòîÿíèåì êëåòî÷íîé ïðîëèôåðàöèè è öèòîäèôôåðåíöèðîâêè
(ñì. îáçîð: Moretta, Moretta, 2004).
Íåñìîòðÿ íà òî ÷òî ÅÊ îòêðûòû åùå 30 ëåò íàçàä è
èíòåíñèâíî èçó÷àþòñÿ, äî ñèõ ïîð äî êîíöà íåÿñíà ïðèðîäà è òåõ ñòðóêòóð, êîòîðûå ðàñïîçíàþòñÿ íà êëåòêàõ-ìèøåíÿõ, è òåõ, êîòîðûå ñëóæàò ðàñïîçíàþùèìè äåòåðìèíàíòàìè ó ÅÊ. Îäíèì èç ìåòîäè÷åñêèõ ïðèåìîâ
äëÿ ðåøåíèÿ ýòîé ïðîáëåìû ñëóæèò îáðàáîòêà êëåòîê-ìèøåíåé àãåíòàìè, êîòîðûå èçìåíÿþò èõ ïîâåðõíîñòíûé ôåíîòèï, â ðåçóëüòàòå ÷åãî îäíè ïîâåðõíîñòíûå àíòèãåíû ýêñïðåññèðóþòñÿ äîïîëíèòåëüíî, à äðóãèå óòðà÷èâàþòñÿ, âñëåäñòâèå ÷åãî ÷óâñòâèòåëüíîñòü êëåòîê-ìèøåíåé ê äåéñòâèþ ÅÊ ìîæåò ñóùåñòâåííî èçìåíÿòüñÿ.
Ê ÷èñëó òàêèõ àãåíòîâ îòíîñÿòñÿ àêòèâíûå ôîðìû êèñëîðîäà (ÀÔÊ) è àíòèîêñèäàíòû. Íåìíîãî÷èñëåííûå äàííûå èç ëèòåðàòóðû ñâèäåòåëüñòâóþò î ïîïûòêàõ ïîíÿòü
è îïðåäåëèòü ðîëü ýòèõ ñîåäèíåíèé âî âçàèìîîòíîøåíèÿõ ÅÊ è êëåòîê-ìèøåíåé. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû
ïðîòèâîðå÷èâû (Van Kessel et al., 1987; Malori et al.,
1994; Nariai (Nakada) et al., 2000), à ýêñïåðèìåíòû (in
vivo è in vitro), îïèñûâàþùèå âëèÿíèå àíòèîêñèäàíòîâ
Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà
Ê ë å ò ê à ì è - ì è ø å í ÿ ì è ñëóæèëè ýìáðèîíàëüíûå
ìûøèíûå ôèáðîáëàñòû ëèíèè Balb/3T3 (êëåòêè 3T3) è
òàêèå æå ôèáðîáëàñòû, òðàíñôîðìèðîâàííûå âèðóñîì
SV40 (êëåòêè 3T3-SV40), à òàêæå êëåòêè ýðèòðîáëàñòîçà
÷åëîâåêà K562. Êëåòêè ïîëó÷åíû èç Ðîññèéñêîé êîëëåêöèè êëåòî÷íûõ êóëüòóð Èíñòèòóòà öèòîëîãèè ÐÀÍ.
Êëåòêè êóëüòèâèðîâàëè â ñðåäå ÄÌÅÌ ñ äîáàâëåíèåì
10 % ýìáðèîíàëüíîé ñûâîðîòêè äî îáðàçîâàíèÿ ìîíîñëîÿ. Àíòèîêñèäàíò NAC (Sigma, ÑØÀ) ââîäèëè â ñðåäó
438
Óìåíüøåíèå àêòèâíîñòè åñòåñòâåííûõ êèëëåðîâ
439
êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòîê äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 10
(äëÿ êëåòîê 3T3-SV40) èëè 20 (3T3) ìÌ íà 24 ÷. Çàòåì
ñðåäó çàìåíÿëè íà ñâåæóþ, íå ñîäåðæàùóþ NAC, è êóëüòèâèðîâàëè åùå 24 ÷. Ïåðåæèâàþùèå êóëüòóðû êëåòîê
ôîòîãðàôèðîâàëè ñ ïîìîùüþ öèôðîâîé ôîòîêàìåðû.
Ê ë å ò ê è - ý ô ô å ê ò î ð û âûäåëÿëè èç ñåëåçåíêè èíòàêòíûõ ìûøåé-ñàìöîâ ëèíèè C3HA ìàññîé 18—20 ã,
ïîëó÷åííûõ èç ïèòîìíèêà «Ðàïïîëîâî» ÐÀÍ. Èç ñåëåçåíêè ãîòîâèëè êëåòî÷íûå ñóñïåíçèè, îñâîáîæäåííûå îò
ýðèòðîöèòîâ ñ ïîìîùüþ îñìîòè÷åñêîãî øîêà ïî îïèñàííîé ðàíåå ìåòîäèêå (Ìàëûãèí, Àïðåëèêîâà, 1982), è
ïîäñ÷èòûâàëè â êàìåðå Ãîðÿåâà êîëè÷åñòâî ÿäðîñîäåðæàùèõ êëåòîê — ñïëåíîöèòîâ.
Åñòåñòâåííóþ êèëëåðíóþ àêòèâíîñòü
ñ ï ë å í î ö è ò î â (êëåòîê-ýôôåêòîðîâ) îöåíèâàëè ñ ïîìîùüþ 3H-óðèäèíîâîãî öèòîòîêñè÷åñêîãî òåñòà (Hashimoto, Sudo, 1971) â ìîäèôèêàöèè Ðûêîâîé ñ ñîòðóäíèêàìè
(1981). Êëåòêè-ìèøåíè ìåòèëè 3H-óðèäèíîì, ïîñëå ÷åãî
êëåòêè îòìûâàëè îò îñòàòêîâ 3H-óðèäèíà è NAC. Ñîîòíîøåíèå ýôôåêòîðîâ è ìèøåíåé ñîñòàâëÿëî 20 : 1. Óðîâåíü åñòåñòâåííîé êèëëåðíîé àêòèâíîñòè îöåíèâàëè ñ
ïîìîùüþ öèòîòîêñè÷åñêîãî èíäåêñà (ÖÈ), îòðàæàþùåãî
äîëþ ïîãèáøèõ êëåòîê â %.
Ðåçóëüòàòû
Êëåòêè 3T3 ÿâëÿþòñÿ èììîðòàëèçîâàííûìè íåòóìîðîãåííûìè ôèáðîáëàñòàìè è øèðîêî èñïîëüçóþòñÿ â
ðàçëè÷íûõ èññëåäîâàíèÿõ êàê íåòðàíñôîðìèðîâàííûå â
êà÷åñòâå êîíòðîëüíûõ (íîðìàëüíûõ) êëåòîê â ïàðå ñ
òðàíñôèöèðîâàííûìè ôèáðîáëàñòàìè 3T3 (Rubin et al.,
1996; Rubin, 2001). Òðàíñôåêöèÿ êëåòîê 3T3 áîëüøèì
T-îíêîãåíîì âèðóñà SV40 ïðèâîäèò ê êëåòî÷íîé òðàíñôîðìàöèè â ðåçóëüòàòå ñòàáèëüíîé èíòåãðàöèè ïëàçìèäíîé ÄÍÊ â ãåíîì êëåòêè-õîçÿèíà (Verge et al., 1995).
Ââåäåíèå 10 ìÌ NAC â êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó êëåòîê
3T3-SV40 íà 5—20 ÷ âûçûâàåò ïîñòåïåííîå èçìåíåíèå
èõ ìîðôîëîãèè. Íà ïðèæèçíåííîé ôîòîãðàôèè êëåòîê
(ñì. ðèñóíîê, à, á) âèäíî, ÷òî êëåòêè òåðÿþò êîíòàêòû,
îêðóãëÿþòñÿ, êëåòî÷íûé ìîíîñëîé ðàçðóøàåòñÿ, è ýòè
èçìåíåíèÿ, êàê ìû ïîêàçàëè ðàíåå, êîððåëèðóþò ñ ðàçáîðêîé àêòèíîâûõ íèòåé è ïîÿâëåíèåì â êëåòêàõ ñêîïëåíèé àìîðôíîãî àêòèíà (Åôðåìîâà, 2004). Óäàëåíèå àíòèîêñèäàíòà ïóòåì çàìåíû êóëüòóðàëüíîé ñðåäû íà íîâóþ,
íå ñîäåðæàùóþ NAC, ïðèâîäèò ê ïîëíîìó âîññòàíîâëåíèþ êëåòî÷íîãî ìîíîñëîÿ (ñì. ðèñóíîê, â). Àíàëîãè÷íàÿ
êàðòèíà íàáëþäàåòñÿ è äëÿ êëåòîê 3T3 (ôîòîãðàôèè íå
ïîêàçàíû).
Äàííûå, ïðåäñòàâëåííûå â òàáëèöå, ïîêàçûâàþò, êàê
èçìåíÿþòñÿ ôèçèîëîãè÷åñêèå ñâîéñòâà, à èìåííî ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê äåéñòâèþ ÅÊ òðàíñôîðìèðîâàííûõ ôèáðîáëàñòîâ 3T3-SV40, ïîäâåðãíóòûõ äåéñòâèþ NAC. Ïåðåä ïðîâåäåíèåì öèòîòîêñè÷åñêîãî òåñòà NAC âñåãäà
óäàëÿëè èç ñðåäû. Ëèòè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü ÅÊ ïî îòíîøåíèþ ê êëåòêàì 3T3-SV40, êóëüòèâèðóåìûì â òå÷åíèå
20 ÷ â ïðèñóòñòâèè NAC, ïðàêòè÷åñêè íå ìåíÿåòñÿ. Îäíàêî ÷åðåç 18—24 ÷ ïîñëå óäàëåíèÿ àíòèîêñèäàíòà ôóíêöèîíàëüíûå ñâîéñòâà êëåòîê ïðèíöèïèàëüíî èçìåíèëèñü — ÖÈ ñíèçèëñÿ ïðèáëèçèòåëüíî â 7 ðàç (ñ 31.8 äî
4.6 %), ÷òî îçíà÷àåò ïîòåðþ ÷óâñòâèòåëüíîñòè òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê 3T3-SV40 ê ÅÊ. È ýòî ñâîéñòâî ñîõðàíÿåòñÿ êëåòêàìè åùå 1 ñóò, ò. å. â öåëîì â òå÷åíèå
48 ÷ ïîñëå óäàëåíèÿ àíòèîêñèäàíòà. Íåîáõîäèìî çàìåòèòü, ÷òî â òå÷åíèå îïûòà âñå ïðîöåäóðû (äîáàâëåíèå
Ïðèæèçíåííûå ôîòîãðàôèè êëåòîê 3T3-SV40 â íîðìå (à), ÷åðåç
20 ÷ ïîñëå ââåäåíèÿ â ñðåäó êóëüòèâèðîâàíèÿ àíòèîêñèäàíòà
N-àöåòèëöèñòåèíà (á) è ÷åðåç 24 ÷ ïîñëå óäàëåíèÿ åãî èç ñðåäû
(â).
Îá. 6.3%, îê. 4%.
NAC è åãî ïîñëåäóþùåå óäàëåíèå) îñóùåñòâëÿëè òîëüêî
ñî ñðåäîé, îñòàâëÿÿ êëåòêè íà îäíîé è òîé æå ïîäëîæêå
áåç ïåðåñåâà. Åñëè ÷åðåç 24 ÷ ïîñëå óäàëåíèÿ NAC êëåòêè ïåðåñåÿòü, òî èõ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê ÅÊ âîçðàñòàåò
ïî÷òè â 2 ðàçà ïî ñðàâíåíèþ ñ êëåòêàìè, íå ïîäâåðãàâøèìèñÿ ïåðåñåâó (ñì. òàáëèöó). Òàêèì îáðàçîì, êëåòêè
Í. À. Ôèëàòîâà, Ê. Ì. Êèðïè÷íèêîâà, È. À. Ãàìàëåé
440
Åñòåñòâåííàÿ êèëëåðíàÿ àêòèâíîñòü ñïëåíîöèòîâ
ìûøåé C3HA ïî îòíîøåíèþ ê êëåòêàì 3T3-SV40
è 3T3, îáðàáîòàííûì N-àöåòèëöèñòåèíîì (NAC)
Êëåòêè-ìèøåíè
K562
3T3-SV40
3T3
Óñëîâèÿ îáðàáîòêè
—
—
Ââåäåíèå 10 ìÌ NAC, 20 ÷
Óäàëåíèå NAC, 24 ÷
Óäàëåíèå NAC, 48 ÷
Óäàëåíèå NAC ñ ïåðåñåâîì
êëåòîê, 24 ÷
—
Ââåäåíèå 20 ìÌ NAC, 20 ÷
Óäàëåíèå NAC, 24 ÷
ÖÈ, % x ± sx
19.9 ± 2.8
31.8 ± 2.4
27.8 ± 4.1
4.6 ± 2.4
5.9 ± 2.3
9.6 ± 4.8
0.7 ± 0.4
5.3 ± 1.4
2.2 ± 0.6
Ï ð è ì å ÷ à í è å. Ñîîòíîøåíèå êëåòîê-ýôôåêòîðîâ è êëåòîê-ìèøåíåé ñîñòàâëÿåò 20 : 1. Äëÿ êàæäîãî ñëó÷àÿ äàíû ñðåäíèå çíà÷åíèÿ
öèòîòîêñè÷åñêîãî èíäåêñà (ÖÈ) èç 12—18 èçìåðåíèé â òðåõ ýêñïåðèìåíòàõ.
3T3-SV40 â âîññòàíîâëåííîì ïîñëå óäàëåíèÿ NAC ìîíîñëîå ïðèîáðåòàþò ïðèçíàêè íåòðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê 3T3 è ïåðåñòàþò óçíàâàòüñÿ ÅÊ.
Äàííûå äëÿ íîðìàëüíûõ êëåòîê 3T3 òàêæå ïðåäñòàâëåíû â òàáëèöå. Âî âñåõ âàðèàíòàõ îïûòîâ (â ïðèñóòñòâèè NAC è ïîñëå åãî óäàëåíèÿ) èõ ÷óâñòâèòåëüíîñòü ê
äåéñòâèþ ÅÊ îñòàåòñÿ íà î÷åíü íèçêîì óðîâíå. Îòìå÷åíî ëèøü íåçíà÷èòåëüíîå óâåëè÷åíèå ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÅÊ ïî îòíîøåíèþ ê êëåòêàì 3T3, íàõîäÿùèìñÿ
18—20 ÷ â ïðèñóòñòâèè NAC. Äëÿ ñðàâíåíèÿ ìû ïðîâåëè
ýêñïåðèìåíòû ñ êëåòêàìè K562, êîòîðûå èñïîëüçóþò â
öèòîòîêñè÷åñêîì òåñòå â êà÷åñòâå êðèòåðèÿ ëèòè÷åñêîé
àêòèâíîñòè ÅÊ (Chernysh et al., 2002). ÖÈ â äàííîì ñëó÷àå îêàçàëñÿ äàæå ìåíüøå (19.9 %), ÷åì äëÿ êëåòîê
3T3-SV40, êîíòðîëüíûõ è ïðîøåäøèõ îáðàáîòêó NAC
(ñì. òàáëèöó).
Îáñóæäåíèå
Ðàíåå ìû ïîêàçàëè ðÿä ìîðôîëîãè÷åñêèõ è ôóíêöèîíàëüíûõ èçìåíåíèé êëåòîê â ïðèñóòñòâèè NAC (Ãàìàëåé
è äð., 2001, 2003; Åôðåìîâà è äð., 2004). Âñå ýòè èçìåíåíèÿ îáðàòèìû, åñëè òîëüêî íå ïîçäíåå ÷åì ÷åðåç 24 ÷
óäàëèòü NAC èç ñðåäû êóëüòèâèðîâàíèÿ êëåòîê, â ïðîòèâíîì ñëó÷àå êëåòêè ïîãèáàþò (Ãàìàëåé è äð., 2003).
Íî êëåòêè 3T3-SV40, êàê ïîêàçàëî íàñòîÿùåå èññëåäîâàíèå, íå âîçâðàùàþòñÿ ïîñëå óäàëåíèÿ NAC â èñõîäíîå
ñîñòîÿíèå (ïî êðàéíåé ìåðå â òå÷åíèå 2 ñóò), à ïðèîáðåòàþò íåêîå íîâîå ñîñòîÿíèå ñ ÷åðòàìè, õàðàêòåðíûìè
äëÿ íîðìàëüíûõ êëåòîê 3T3. Ïðèñóòñòâèå NAC èçìåíÿåò
ðåäîêñ-áàëàíñ êëåòêè, ïîâûøàÿ ñîäåðæàíèå ãëóòàòèîíà
è óâåëè÷èâàÿ óñòîé÷èâîñòü ê îêèñëèòåëüíîìó ñòðåññó
(Spolarics, Wu, 1997), íî îáðàòèìî (Ãàìàëåé è äð., 2004).
Êëåòêè 3T3-SV40, ïðîøåäøèå îáðàáîòêó NAC ñ ïîñëåäóþùèì óäàëåíèåì åãî èç ñðåäû êóëüòèâèðîâàíèÿ, âìåñòå ñ ìîðôîëîãè÷åñêèìè èçìåíåíèÿìè ïðåòåðïåâàþò è
ôèçèîëîãè÷åñêèå, à èìåííî: êàê è íîðìàëüíûå êëåòêè,
3T3 ïåðåñòàþò óçíàâàòüñÿ è ëèçèðîâàòüñÿ ÅÊ, ÷òî ïîäòâåðæäàåò ñäåëàííûé ðàíåå âûâîä î ÷àñòè÷íîé ðåâåðñèè
òðàíñôîðìèðîâàííîãî ôåíîòèïà (Ãàìàëåé è äð., 2004;
Åôðåìîâà è äð., 2004).
Àíòèîêñèäàíò NAC ÿâëÿåòñÿ èñòî÷íèêîì ñóëüôãèäðèëüíûõ ãðóïï è èñïîëüçóåòñÿ â ýêñïåðèìåíòàëüíîé è
êëèíè÷åñêîé ïðàêòèêå êàê âîññòàíàâëèâàþùèé àãåíò,
ñäâèãàþùèé îêèñëèòåëüíî-âîññòàíîâèòåëüíûé áàëàíñ
êëåòêè â ñòîðîíó àíòèîêñèäàíòîâ, ãëàâíûì îáðàçîì âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà — îñíîâíîãî âîññòàíîâèòåëüíîãî êîìïîíåíòà êëåòêè (Spolarics, Wu, 1997; ñì. îáçîð:
Zaffarulah, 2003). Áèîëîãè÷åñêèå ýôôåêòû, âûçûâàåìûå
äåéñòâèåì NAC íà êëåòêè, è âíóòðèêëåòî÷íûå ìîëåêóëÿðíûå ñîáûòèÿ, âåäóùèå ê íèì, ÷ðåçâû÷àéíî ðàçíîîáðàçíû è íå îïèñûâàþòñÿ åäèíîé ñõåìîé (Zafarullah et al.,
2003). Òàê, íàïðèìåð, NAC óñèëèâàåò àäãåçèþ ýïèäåðìîèäíûõ êëåòîê A431 è åñòåñòâåííûõ êèëëåðîâ (Rivabene et al., 1995), â ýíäîòåëèàëüíûõ êëåòêàõ âëèÿåò íà ýêñïðåññèþ àäãåçèâíûõ ìîëåêóë (Walther et al., 1999), ñïîñîáåí in vivo ïðåäîòâðàùàòü êàíöåðîãåíåç, èíâàçèþ è
ìåòàñòàçèðîâàíèå ýíäîòåëèàëüíûõ êëåòîê (Aluigi et al.,
2000), èíãèáèðîâàòü èíâàçèþ îïóõîëåâûõ êëåòîê çà ñ÷åò
óìåíüøåíèÿ ïðîäóêöèè è àêòèâíîñòè ìàòðèêñíîé ìåòàëëîïðîòåèíàçû 9 (Kawakami et al., 2001), ìåíÿòü àêòèâíîñòü òðàíñêðèïöèîííûõ ôàêòîðîâ (Ãîí÷àð è äð., 2003;
ñì. ëèòåðàòóðó â îáçîðå: Zafarullah, 2003). Ýòè è ìíîãèå
äðóãèå ïðèìåðû ãîâîðÿò î òîì, ÷òî ýòîò ïðîñòîé àíòèîêñèäàíò ñïîñîáåí âìåøèâàòüñÿ ãëóáîêî âî âíóòðèêëåòî÷íûå
ïðîöåññû. Ïîñêîëüêó NAC îáðàòèìî îñòàíàâëèâàåò ïðîëèôåðàöèþ íîðìàëüíûõ êëåòîê 3T3, íî íå îñòàíàâëèâàåò
ïðîëèôåðàöèþ òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê 3T3-SV40
(Ãàìàëåé è äð., 2003), ìîæíî ïðåäïîëàãàòü ñîõðàííîñòü ãåíîìà òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê ïðè åãî äåéñòâèè.
Ïî ñîâðåìåííûì ïðåäñòàâëåíèÿì, îñíîâîé óçíàâàíèÿ ÅÊ êëåòîê-ìèøåíåé ÿâëÿåòñÿ íàëè÷èå ñïåöèàëüíûõ
ðåöåïòîðîâ ó ÅÊ (ñ îáùèì íàçâàíèåì «ðåöåïòîðû åñòåñòâåííîé öèòîòîêñè÷íîñòè»), ê êîòîðûì íà ïîâåðõíîñòè
ó êëåòîê-ìèøåíåé èìåþòñÿ ëèãàíäû ðàçëè÷íîãî òèïà
(ñì. îáçîð: Moretta, Moretta, 2004). Íàëè÷èå òàêèõ ìîëåêóë ÿâëÿåòñÿ ñèãíàëîì ê èíàêòèâàöèè ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÅÊ. Ïðîöåññ êëåòî÷íîé òðàíñôîðìàöèè è(èëè) âèðóñíûå èíôåêöèè ïðèâîäÿò ê óòðàòå èëè íåäîñòàòî÷íîé
ýêñïðåññèè ýòèõ ëèãàíäîâ, ÷òî äåëàåò êëåòêó-ìèøåíü äîñòóïíîé äëÿ âçàèìîäåéñòâèÿ ñ ÅÊ è ïîñëåäóþùåãî ëèçèñà (Long, Rajagopalan, 2002; Moretta, Moretta, 2004). Êðîìå òîãî, êàê íåäàâíî ïîêàçàíî, ñòðåññîâûå ôàêòîðû ìîãóò ìîäèôèöèðîâàòü ìîëåêóëû-ëèãàíäû êèëëåðíûõ
ðåöåïòîðîâ íà ïîâåðõíîñòè êëåòîê-ìèøåíåé, â ðåçóëüòàòå ÷åãî óìåíüøàåòñÿ èíãèáèðîâàíèå êëåòêîé-ìèøåíüþ
ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÅÊ, è êëåòêà-ìèøåíü ìîæåò áûòü
ðàñïîçíàíà è ëèçèðîâàíà ÅÊ (Long, Rajagopalan, 2002;
Michaëlsson et al., 2002).
Ââåäåíèå NAC â ñðåäó íîðìàëüíûõ êëåòîê 3T3,
ïî-âèäèìîìó, ÿâëÿåòñÿ òåì ñòðåññîâûì ôàêòîðîì, êîòîðûé âûçûâàåò íåêîòîðîå óâåëè÷åíèå èõ ÖÈ, íî, âî-ïåðâûõ, îíî ïîëíîñòüþ îáðàòèìî, à âî-âòîðûõ, îíî íå ñòîëü
çíà÷èòåëüíî, ÷òîáû ðàññìàòðèâàòü åãî êàê ïðèíöèïèàëüíîå èçìåíåíèå ñâîéñòâ ýòèõ êëåòîê. Óìåíüøåíèå ÷óâñòâèòåëüíîñòè (âïëîòü äî åå ïîòåðè) ê ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÅÊ êëåòîê 3T3-SV40, ïðîøåäøèõ îáðàáîòêó NAC,
ìîæíî îáúÿñíèòü òîëüêî òåì, ÷òî NAC, âîññòàíàâëèâàÿ
SH-ãðóïïû êàêèõ-òî ïîâåðõíîñòíûõ áåëêîâ êëåòêè, ìåíÿåò â êîíöå êîíöîâ è åå ñâîéñòâà. Ïðè÷åì èçìåíåíèå
ñâîéñòâ êëåòêè ïðîèñõîäèò íå â ïðèñóòñòâèè àíòèîêñèäàíòà, à ëèøü ïîñëå åãî óäàëåíèÿ. Ïîêà òðóäíî ñêàçàòü,
ïî÷åìó èìåííî óäàëåíèå àíòèîêñèäàíòà ïðèâîäèò ê ïîÿâëåíèþ íîâûõ ñâîéñòâ ó òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê.
Ìîæíî ëèøü ïðåäïîëàãàòü, ÷òî ïóòü âîçâðàòà êëåòîê ê
èñõîäíîìó ñîñòîÿíèþ ïîñëå óäàëåíèÿ àíòèîêñèäàíòà íå
Óìåíüøåíèå àêòèâíîñòè åñòåñòâåííûõ êèëëåðîâ
ïîâòîðÿåò ïóòü èçìåíåíèé, êîòîðûå îíè ïðåòåðïåëè â
åãî ïðèñóòñòâèè â ñèëó âûçâàííûõ èì íåîáðàòèìûõ èçìåíåíèé. Èçìåíåíèÿ ìîãóò ïðîèñõîäèòü íå òîëüêî ñ áåëêàìè ñàìîé êëåòêè, íî è ñ êîìïîíåíòàìè âíåêëåòî÷íîãî
ìàòðèêñà. Â ïîëüçó ýòîãî ïðåäïîëîæåíèÿ ãîâîðÿò äàííûå ýêñïåðèìåíòîâ, â êîòîðûõ êëåòêè 3T3-SV40 ïîñëå
óäàëåíèÿ NAC ñíèìàëè ñ ïîäëîæêè è ïåðåñåâàëè íà íîâûå ÷àøêè.  ýòîì ñëó÷àå ÷óâñòâèòåëüíîñòü êëåòîê
3T3-SV40 ê ÅÊ ñóùåñòâåííî âîçðàñòàëà ïî ñðàâíåíèþ ñ
êëåòêàìè, íå ïîäâåðãàâøèìèñÿ ïåðåñåâó â õîäå âñåãî ýêñïåðèìåíòà.
Èòàê, îáíàðóæåííîå íàìè èçìåíåíèå àêòèâíîñòè ÅÊ
ïî îòíîøåíèþ ê òðàíñôîðìèðîâàííûì êëåòêàì, îáðàáîòàííûì NAC â óñëîâèÿõ íàøåé ýêñïåðèìåíòàëüíîé
ìîäåëè, ñâèäåòåëüñòâóåò ïðåæäå âñåãî îá èçìåíåíèè
ñâîéñòâ ïîâåðõíîñòè êëåòîê-ìèøåíåé. Âîçíèêíîâåíèå
íîâûõ ñâîéñòâ ìîæåò áûòü ñâÿçàíî íå òîëüêî ñ èçìåíåíèÿìè ïîâåðõíîñòíûõ ñòðóêòóð êëåòêè è ñòîÿùèìè çà
íèìè âíóòðèêëåòî÷íûìè ñîáûòèÿìè, íî è ñî ñòðóêòóðíûìè èçìåíåíèÿìè êîìïîíåíòîâ âíåêëåòî÷íîãî ìàòðèêñà.
Àêòèâíîñòü ÅÊ ïî îòíîøåíèþ ê îïóõîëåâûì êëåòêàì ìîæåò ñëóæèòü ïîêàçàòåëåì ñòåïåíè òðàíñôîðìèðîâàííîñòè êëåòîê-ìèøåíåé. Ïîëó÷åííûå íàìè äàííûå îá
óìåíüøåíèè ÷óâñòâèòåëüíîñòè òðàíñôîðìèðîâàííûõ
êëåòîê ê ëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ÅÊ ñâèäåòåëüñòâóþò î
òîì, ÷òî àíòèîêñèäàíò NAC ñïîñîáåí âëèÿòü íà ïîêàçàòåëè èììóííîãî ñòàòóñà îðãàíèçìà. Ïîèñê îñíîâíîé ìèøåíè äåéñòâèÿ NAC â ðàçðàáîòàííîé íàìè ýêñïåðèìåíòàëüíîé ìîäåëè — íàøà äàëüíåéøàÿ çàäà÷à.
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå ÐÔÔÈ
(ïðîåêòû 04-04-49186 è 06-48586).
Ñïèñîê ëèòåðàòóðû
Ãàìàëåé È. À., Àêñåíîâ Í. Ä., Åôðåìîâà Ò. Í., Êèðïè÷íèêîâà Ê. Ì. 2003. Âëèÿíèå àãåíòîâ, èçìåíÿþùèõ âíóòðèêëåòî÷íûé
óðîâåíü àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà, íà õàðàêòåð ðàñïðåäåëåíèÿ
êëåòîê ëèíèé 3T3 è 3T3-SV40 ïî ôàçàì êëåòî÷íîãî öèêëà. Öèòîëîãèÿ. 45 (1) : 26—33.
Ãàìàëåé È. À., Åôðåìîâà Ò. Í., Êèðïè÷íèêîâà Ê. Ì., Êîìèññàð÷èê ß. Þ., Õàéòëèíà Ñ. Þ. 2004. Èíâàçèÿ áàêòåðèé â
êëåòêè 3T3 è 3T3-SV40, îáðàáîòàííûå àíòèîêñèäàíòîì. Ðîñ.
ôèçèîë. æóðí. èì. È. Ì. Ñå÷åíîâà. 90 (8) : 430.
Ãàìàëåé È. À., Ïîëîçîâ Þ. Ñ., Àêñåíîâ Í. Ä., Äàðèåâà Ç. À.,
Êèðïè÷íèêîâà Ê. Ì., Ïîñïåëîâà Ò. Â. 2001. Êëåòî÷íûé öèêë è
îáðàçîâàíèå àêòèâíûõ ôîðì êèñëîðîäà â ôèáðîáëàñòàõ ãðûçóíîâ. Öèòîëîãèÿ. 43 (6) : 595—601.
Ãîí÷àð È. Â., Áóðîâà Å. Á., Äîðîø Â. Í., Ãàìàëåé È. À., Íèêîëüñêèé Í. Í. 2003. Àêòèâàöèÿ ðåöåïòîðà EGF è ôàêòîðîâ
STAT â çàâèñèìîñòè îò îêèñëèòåëüíî-âîññòàíîâèòåëüíîãî ñòàòóñà êëåòîê A431. Öèòîëîãèÿ. 45 (5) : 478—487.
Åôðåìîâà Ò. Í., Êèðïè÷íèêîâà Ê. Ì., Õàéòëèíà Ñ. Þ., Ãàìàëåé È. À. 2004. Ïåðåñòðîéêè àêòèíîâîãî öèòîñêåëåòà â êëåòêàõ 3T3 è 3T3-SV40 â ïðèñóòñòâèè àíòèîêñèäàíòîâ. Öèòîëîãèÿ. 46 (5) : 395—403.
Ìàëûãèí À. Ì., Àïðåëèêîâà Î. Í. 1982. Åñòåñòâåííàÿ ïðîòèâîîïóõîëåâàÿ àêòèâíîñòü ñïëåíîöèòîâ ìûøåé C3HA. Ýêñïåðèì. îíêîë. 4 (3) : 37—39.
Ðûêîâà Ì. Ï., Ñïèðàíäå È. Â., Çåäãåíèäçå Ì. Ñ., Ëÿõîâ Â. Â., Ôóêñ Á. Á. 1981. Íîâàÿ âûñîêî÷óâñòâèòåëüíàÿ òåõíèêà
òåñòèðîâàíèÿ íîðìàëüíûõ êèëëåðîâ. Èììóíîëîãèÿ. 1 : 88—90.
441
Aluigi M. G., De Flora S., D’Agostini F., Albini A., Fassina G.
2000. Antiapoptotic and antigenotoxic effects of N-acetylcysteine
in human cells of endothelial origin. Anticancer Res. 20 : 3183—
3187.
Chernysh S., Kim S. I., Bekker G., Pleskach V. A., Filatova N. A., Anikin V. B., Platonov V. G., Bulet P. 2002. Antiviral and
antitumor peptides from insects. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 99 :
12 628—12 632.
Hashimoto Y., Sudo E. 1971. Evaluation of cell damage in immune reactions by release of radioactivity from 3H-uridine labeled
cells. Gann. 62 : 139—145.
Kawakami S., Kageyama Y., Fujii Y., Kihara K., Oshima H.
2001. Inhibitory effect of N-acetylcysteine on invasion and MMP-9
production of T24 human bladder cancer cells. Anticancer Res. 21 :
213—219.
Long E. O., Rajagopalan S. 2002. Stress signals activate natural killer cells. J. Exp. Med. 196 : 1399—1402.
Malori W., D’Ambrosio A., Rainaldi G., Rivabene R., Viora M.
1994. Thiol supplier N-acetylcysteine enhances conjugate formation between natural killer cells and K562 or U937 targets but increases the lytic function only against the latter. Immunol. Lett. 43 :
209—214.
Michaëlsson J., Teixeira de Matos C., Achour A., Lanier L. L.,
Karre K., Soderstrom K. 2002. A signal peptide derived from hsp60
binds HLA-E and interferes with CD94/NKG2A recognition.
J. Exp. Med. 196 : 1403—1414.
Moretta L., Moretta A. 2004. Unravelling natural killer cell
function: triggering and inhibitory human NK receptors. EMBO J.
23 : 255—259.
Nariai (Nakada) N., Kitagawa K., Nariai K., Kosaka T., Kuwabara M., Kiuchi Y. 2000. Active-oxygen involvement in canine
NK-mediated cytotoxicity. Vet. Med. Sci. 62 : 457—460.
Rivabene R., Viora M., Matarrese P., Rainaldi G., D’Ambrosio A., Malorni W. 1995. N-acetylcysteine enhances cell adhesion
properties of epithelial and lymphoid cells. Cell Biol. Int. 19 :
681—686.
Rubin H. 2001. Multistage carcinogenesis in cell culture. Develop. Biol. (Basel). 106 : 61—66.
Rubin H., Chow M., Yao A. 1996. Cellular aging, destabilization, and cancer. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 93 : 1825—1830.
Spolarics Z., Wu J. X. 1997. Role of glutathione and catalase in
H2O2 detoxification in LPS-activated hepatic endothelial and Kupffer cells. Amer. J. Physiol. 273 : G1304—G1311.
Van Kessel K. P., Van Strijp J. A., Van Kats-Renaud H. J.,
Miltenburg L. A., Van Der Tol M. E., Fluit A. C., Verhoef J. 1987.
Further evidence against a role for toxic oxygen products as lytic
agents in NK cell-mediated cytotoxicity. Immunology. 62 : 675—
678.
Velge P., Bottreau E., Kaeffer B., Van-Langendonck N. 1995.
The loss of contact inhibition and ancorage-dependent growth
are key steps in the acquisition of Listeria monocytogenes susceptibility phenotype by non-phagocytic cells. Biol. Cell. 85 : 55—
66.
Viora M., Quaranta M. G., Straface E., Vari R., Masella R.,
Malorni W. 2001. Redox imbalance and immune functions: opposite effects of oxidized low-density lipoproteins and N-acetylcysteine. Immunology. 104 : 431—438.
Walther M., Kaffenberger W., Van Beuningen D. 1999. Influence of clinically used antioxidants on radiation-induced expression
of intercellular cell adhesion molecule-1 on HUVEC. Int. J. Radiat.
Biol. 75 : 1317—1325.
Watzl B., Bub A., Briviba K., Rechkemmer G. 2003. Supplementation of a low-carotenoid diet with tomato or carrot juice modulates immune functions in healthy men. Ann. Nutr. Metab. 47 :
255—261.
Zafarullah M., Li W. Q., Sylvester J., Ahmad M. 2003. Molecular mechanisms of N-acetylcysteine actions. CMLS Cell Mol.
Life Sci. 60 : 6—20.
Ïîñòóïèëà 5 XII 2005
442
Í. À. Ôèëàòîâà, Ê. Ì. Êèðïè÷íèêîâà, È. À. Ãàìàëåé
N-ACETYLCYSTEINE REDUCES TRANSFORMED 3T3-SV40 FIBROBLAST SENSITIVITY
TO LYSIS BY NATURAL KILLER CELLS
N. A. Filatova, K. M. Kirpichnikova, I. A. Gamaley1
Institute of Cytology RAS, St. Petersburg;
1 e-mail: [email protected]
We have shown that 18—20 h cultivation of transformed mouse fibroblasts 3T3-SV40 in the presence of
antioxidant, N-acetylcysteine (NAC, 10 mM), did not change their sensitivity to lysis by natural killer (NK) mouse splenocytes. However, in 18—20 h after NAC removal 3T3-SV40 cells demonstrated resistance to NK cell
activity. The cytotoxicity index (CI) was reduced up to 4.6 ± 2.4 % (in comparison with the control value
31.8 ± 2.4 %) approximating to the value in non-transformed 3T3 mouse fibroblasts. Normal 3T3 cells were resistant to NK action in all experimental conditions (CI varied within 0.7—5.3 %). These results show that NAC
can induce partial reversion of transformed phenotype. We suggest that this effect may be due to the NAC-induced modifications of the cell surface and extracellular matrix proteins.
K e y w o r d s: natural killers, N-acetylcysteine, cytotoxicity index, transformed fibroblasts 3T3-SV40.
Скачать