Иммуногенность терапевтических протеинов

РАЗВИТИЕ ФАРМАКОТЕРАПИИ
Иммуногенность
терапевтических протеинов
В
Сеткина С. Б.,
Шеряков А. А.
РУП «Центр экспертиз
и испытаний в здравоохранении»,
Минск
недрение в клиническую практику биотехнологических лекарственных средств явилось
важным этапом в фармакотерапии, поскольку сделало возможным воспроизведение и применение сложнейших протеинов как в случае их недостаточной выработки в организме, так
и в целях регуляции физиологических процессов на ферментативно-рецепторном уровне. На
данный момент разработано и внедрено в клиническую практику более чем 60 рекомбинантных человеческих протеинов (включая рекомбинантные антитела), из которых ряд зарегистрирован и продолжает регистрироваться и на нашем рынке. Расшифровка всех 30 000 генов
генома человека и продолжающееся бурное развитие биотехнологической фармацевтической
промышленности являются определяющими факторами постоянного появления новых лекарственных средств, представляющих собой инструменты мощного фармакотерапевтического
воздействия на макромолекулярном уровне. Однако открывающиеся уникальные возможности
терапии с использованием медицинских протеинов оказались сопряжены со столь же уникальными проблемами, не характерными для низкомолекулярных лекарственных средств. Эти проблемы обусловлены, прежде всего, принципиальными отличиями терапевтических протеинов
от низкомолекулярных лекарственных средств:
1) размер молекул биофармацевтических протеинов может достигать 150 000 дальтон, превышая тем самым размер стандартных молекул химических веществ от 100 до 1 000 раз и являясь причиной существенной гетерогенности (структурно-конформационных и агрегационных различий). При этом для белковых молекул характерна сложная при воспроизведении
трехмерная пространственная структура, которой присуща высокая чувствительность
к разнообразным факторам, как в ходе процесса производства, так и в процессе дальнейшего хранения и обращения [1, 2, 8];
2) синтез рекомбинантных протеинов осуществляется про- или эукариотическими клетками,
для которых, помимо присущей им собственной вариабельности, характерна выраженная
зависимость от культуральных условий и производственного процесса. Даже при жестко
контролируемых культуральных условиях была продемонстрирована высокая степень гетерогенности рекомбинантных протеинов [1, 8, 18, 19];
3) процесс синтеза рекомбинантных протеинов сопровождается сложными процессами выделения, очистки и стабилизации, которые могут являться как причиной изменений самих
белковых молекул, так и источником примесей в конечном фармацевтическом продукте [2,
8, 18, 19];
4) относительная химическая и конформационная нестабильность медицинских протеинов
требует наличия уникальных вспомогательных веществ для гарантии стабильности на протяжении достаточного срока годности, что может в зависимости от состава лекарственной
формы обуславливать различия в биологическом действии. При этом вспомогательные вещества, добавляемые с целью стабилизации генно-инженерных протеинов, могут, в том числе, приводить к образованию иммуногенных эпитопов [2];
«Рецепт» № 4 (60), 2008
37
Иммуногенность терапевтических протеинов
5) для некоторых медицинских генно-инженерных протеинов используется технологический
прием гликозилирования или пегилирования. Различия в способе гликозилирования, помимо вариабельности фармакокинетических свойств, могут обуславливать и биологическую
вариабельность, поскольку производителями используются различные подходы к количеству «пришиваемых» мономеров, месту присоединения к белковой молекуле, технологическим условиям осуществления этого процесса [1, 3, 8];
6) для синтетических лекарственных средств химико-аналитические методы могут быть использованы с целью определения подлинности, предсказуемых продуктов деградации,
а также примесей, связанных с процессом химического синтеза. Для биофармацевтических
препаратов, с присущей им сложной трехмерной структурой и огромным количеством потенциально возможных примесей клеточного и ферментативного характера наряду со всеми возможными вариантами проявления гетерогенности и продуктами деградации, эти возможности определения крайне ограничены [1, 8, 19].
Вышеуказанные факторы могут приводить к тому типу изменений биофармацевтических
молекул, которые практически не выявляются рутинными аналитическими методами, представляя при этом различимую антигенную мишень для иммунной системы. При этом клинические последствия иммунной реакции на терапевтические протеины могут варьировать
от временного появления антител, не имеющего клинически значимых проявлений, до тяжелых
представляющих угрозу для жизни состояний. В целом, последствия нежелательной иммунной
реакции рассматриваются с точки зрения изменения эффективности и изменения безопасности
рекомбинантного протеина [2, 8, 10].
Влияние на эффективность. Степень изменения эффективности терапевтического протеина при ответной иммунной реакции зависит от места связывания вырабатываемых антител
с определяемой на поверхности протеина антигенной детерминантой (эпитопом). Чаще всего
антитела распознают эпитоп, не связанный с активным центром терапевтического протеина
и, следовательно, связь с ним сопряжена с меньшими клиническими последствиями. В таких
случаях, однако, возможно изменение фармакокинетики терапевтического протеина, что также
может косвенно повлиять на его эффективность. Однако изменение биологической активности
протеина вплоть до полной потери эффективности возможно при выработке так называемых
«нейтрализующих» антител, поскольку они связываются с эпитопом в непосредственной близости или в самом активном центре, либо вызывают конформационные изменения макромолекулы [10, 13].
Влияние на безопасность. Потеря эффективности и изменение профиля безопасности при
развитии неблагоприятной иммунной реакции в ответ на введение терапевтического протеина
не обязательно взаимосвязаны между собой. Развитие побочных реакций иммунологического характера при введении рекомбинантного протеина может не сопровождаться изменением
его эффективности. В целом при введении терапевтических протеинов возможно развитие как
реакций немедленного типа (например, анафилактических реакций), так и реакций гиперчувствительности замедленного типа, а также реакций, обусловленных образованием иммунных
комплексов. С точки зрения клинической значимости особое значение приобрела возможность
развития аутоиммунных реакций: перекрестная реакция антител, вырабатываемых в ответ
на введение экзогенных терапевтических протеинов, с эндогенными протеинами. Один из примеров подобного осложнения – развитие парциальной аплазии красного кроветворного ростка
преимущественно при подкожном введении одного из выпускаемых эритропоэтинов [2, 8, 10,
11, 12, 13].
В качестве примеров, уже описанных клинических неблагоприятных последствий иммуногенности генно-инженерных рекомбинантных протеинов, можно привести следующие [2, 4, 5,
8, 15]:
38
РАЗВИТИЕ ФАРМАКОТЕРАПИИ
Тип протеина
Рекомбинантный протеин
Последствия иммуногенности
Гормоны
Инсулин
Гормон роста
развитие инсулинорезистентности
понижение активности
Интерферон альфа
Интерферон бета
Интерлейкин 2, 3 и 12
понижение активности
понижение активности
понижение активности
Тканевой активатор плазминогена
Фактор VII
понижение активности
понижение активности
Анти – CD3
Анти – Her2
Анти – IgE
Анти – Respirtory Sunctial Vir.
Анти – IL-2
развитие иммунных реакций
с различными клиническими
последствиями
Цитокины
Ферменты
Антитела
развитие иммунных реакций,
варьирующих от понижения
активности до нейтрализации
эндогенного протеина
G-CSF
Факторы роста GM-CSF
Эритропоэтин
Тромбопоэтин
Поскольку активация иммунной системы в ответ на введение терапевтически протеинов
в ряде случаев проявляется неблагоприятными клиническими последствиями, крайне важным
представляется оценка тех факторов, которые могут способствовать проявлению иммуногенности рекомбинатных протеинов. В целом выделяют следующие группы факторов, которые могут
оказывать воздействие на проявление неблагоприятных иммуногенных свойств терапевтических протеинов [2, 7, 10, 13]:
Индивидуальные
особенности пациента
Режим
дозирования
Характеристика
терапевтического протеина
Возраст
Генетическая
предрасположенность
Иммунный статус пациента
с точки зрения влияния
основной или сопутствующей
патологии, а также
сопутствующей терапии
Способ введения
Длительность
лечения
Интервалы
между курсами
лечения
Доза
Структура протеина: вариации
аминокислотной последовательности;
посттрансляционные изменения
(гликозилирование, пегилирование);
физическая, химическая, ферментативная
деградация и/или модификация
(дезаминирование, окисление,
сульфатирование) в ходе процесса
производства или хранения; гибридная
структура (химерные белки)
Состав (вспомогательные
вещества и их количество)
Наличие агрегантов или
риск их образования
Наличие примесей
со свойствами адьювантов
«Рецепт» № 4 (60), 2008
39
Иммуногенность терапевтических протеинов
Из вышеуказанного следует, что целый ряд факторов, в том числе связанных непосредственно с особенностями структуры, производства и очистки генно-инженерных протеинов, могут
являться причиной различий в проявляемых иммуногенных свойствах. Для различных терапевтических протеинов описан ряд примеров, при которых различия в их индивидуальных характеристиках обусловили различия и в биологической активности:
а) для препаратов генно-инженерного инсулина из факторов, оказывающих влияние на различную по степени выраженности иммуногенность, описаны различия в структуре инсулина
как протеина, наличие белковых загрязнений отличных от инсулина, наличие различных вспомогательных веществ, физическая деградация (агрегация, абсорбция или изменение четвертичной структуры) либо химическая деградация (окисление, дезаминирование) [17];
б) для препаратов человеческого гормона роста было установлено существенное различие
между препаратами, заключавшееся в способности одного из них индуцировать выработку
стойкого титра антител вне зависимости от режима и продолжительности дозирования, что соответствовало обнаруженному высокому уровню агрегантов в этом препарате [2];
в) для препаратов группы интерферонов альфа и бета характерно большое количество
взаимосвязанных факторов, воздействующих на процесс антителообразования, среди которых
большая роль отводится экзогенным факторам (гликозилирование, стабилизация, хранение,
химическая модификация, агрегация, рН, изменения четвертичной структуры, наличие сывороточного альбумина). Представленные на рынке препараты рекомбинантного интерферона
бета отличаются помимо технологических условий производства, также по продуцирующим
клеткам (E.Coli и CHO-клетки), наличию либо отсутствию гликозилирования, аминокислотной
последовательности, вспомогательным веществам. Для препаратов интерферона альфа характерны отличия технологических условий производства, состава вспомогательных веществ, наличию либо отсутствию пегилирования. Имеющиеся данные демонстрируют различия в частоте
развития нейтрализующих антител для различных препаратов рекомбинантного интерферона
альфа и интерферона бета [4, 5, 6, 7, 14, 16];
г) для гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора было продемонстрировано выраженное различие в иммуногенности между двумя препаратами, связанное
с различиями в аминокислотной последовательности [4];
д) для представленных на рынке трех форм эритропоэтина (эпоэтин α, эпоэтин β и дарбопоэтин) характерны различия как в используемых вспомогательных веществах, так и в аспектах
гликозилирования. Различия в иммуногенности этого медицинского протеина были сопряжены
помимо различной терапевтической эффективности, также с различиями в частоте развития
иммунной реакции к эндогенному эритропоэтину с последующим редким, но представляющим
угрозу для жизни состоянием парциальной аплазии красного кроветворного ростка. Большинство данного рода осложнений развивались при длительном подкожном введении Эпрекса
пациентам с хронической почечной недостаточностью (ХПН). Принятые впоследствии регуляторные меры по исключению подкожного введения пациентам с ХПН и оптимизация режима
хранения привели к снижению частоты развития данного осложнения. Кроме этого предпринимались попытки определения влияния вспомогательных веществ на агрегацию и иммуногенность эритропоэтинов. Имеется предположение относительно возможного взаимодействия
полисорбата 80, содержащегося в концентрации 0,03 % (в 20 раз превышающей критическую
концентрацию мицеллообразования) с эритропоэтином и образованием комплекса мицелл полисорбата с протеиновыми молекулами. Так образуется крупная мультивалентная структура
и усиливаются иммуногенные свойства терапевтического протеина [10, 11, 12, 14].
Из отдельных факторов иммуногенности следует особенно отметить фактор агрегации протеинов. Агрегация является одним из аспектов гетерогенности готовых форм рекомбинантных
протеинов и представляет собой практически универсальный фактор развития неблагоприятного иммунного ответа. При этом наличие даже минимального количества агрегантов способно вызвать как нежелательную иммунную реакцию, так и нарушение иммунной толерантности
к ауто-антигенам. К факторам, способствующим образованию агрегантов, относят состав ле40
РАЗВИТИЕ ФАРМАКОТЕРАПИИ
карственной формы, структуру протеина, процесс очистки, процедуру вирусной инактивации,
условия хранения промежуточных продуктов и конечного препарата. Использование в составе
других протеинов в качестве вспомогательных веществ, например альбумина, также может приводить к образованию более иммуногенных агрегантов [10].
Ряд примесей в биотехнологических препаратах может обладать свойствами адьювантов,
повышая иммуногенность лекарственной формы. К числу таких примесей относятся протеины,
липиды или ДНК клеток-продуцентов, которые могут остаться после процесса очистки. Существуют также сведения, что силиконовое масло, используемое для силиконизации первичных
упаковочных материалов, может стимулировать выработку антител [10].
Предполагается, что иммуногенность с точки зрения клинической, является наиболее значимым отличием между низкомолекулярными лекарственными средствами и рекомбинантными протеинами. Одновременно с этим иммуногенность представляет собой крайне чувствительный параметр биологических характеристик лекарственных форм медицинских протеинов.
Крайне важным представляется разработка методов и стратегии доклинической оценки иммуногенности и иммуногенных форм протеинов как с использованием биологических (например,
использование трансгенных иммунотолерантных мышей) и иммунологических методов стандартизации, так и современных физико-химических методов анализа. Оценка иммуногенности
должна включаться в программу клинических испытаний, а затем предусматриваться пострегистрационным планом управления рисками. Изменения в процессе производства, в составе
лекарственной формы также должны сопровождаться оценкой возможного влияния на иммуногенные свойства [8, 10, 14, 15, 18, 19, 20].
„ ЛИТЕРАТУРА
1. H. Schellekens. How similar do biosimilars need to be? Nature Biotechnology 2004; 22: 1357–
1359.
2. S. Hermeling, D. Crommelin, H. Schellekens, W. Wiskoot. Structure-Immunogenicity Relationship
of Therapeutic Proteins. Pharmaceutical Research 2004; 21: 896–903.
3. H. Liptakova, H. Schellekens. Immunogenicity of therapeutic proteins. Nephrol Dial Transplant
2003; 18: 1257–1259.
4. M. Wadhwa, A. Skog et al. Immunogenicity of Granulociyte-Macrophage Colony-stimulating
Factor (GM-CSF) Products in Patients Undergoing Combination Therapy with GM-CSF. Clinical
Cancer Research 1999; 5: 1353–1361.
5. C. Scagnolari et al. Serum Interferon (IFN)-Neutralizing Antibodies and Bioactivities of IFNs in
Patients with Severe Type II Essential Mixed Cryoglobulinemia. Clinical and Diagnostic Laboratory
Immunology. 2003; 10: 70–77.
6. D. Wang et al. Effect of Dosing Schedule on Pharmacokinetics of Alpha Interferon and Anti-Alpha
Interferon neutralizing Antibody in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2001;45:
176–180.
7. P. Kontsek. Problem of recombinant interferon alpha-2-immunogenicity in therapy. Bratisl Lek
Listy 1999; 3: 139–143
8. H. Schellekens, J. Bausch. Biopharmaceutical molecules are not created equally. The Pharmaceutical
Journa 2002; 268: 300–301.
«Рецепт» № 4 (60), 2008
41
Иммуногенность терапевтических протеинов
9. S. Hermeling. Structural aspects of the immunogenicity of therapeutic proteins : transgenic animals
as predictors for breaking immune tolerance // 2005. – Tekst. – Proefschrift Universiteit Utrecht.
10. Guideline on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. EMEA/
CHMP/BMWP/14327/2006.
11. F.Locatelli et al. Erythropoiesis- stimulating agents and antibody-mediated pure red-cell aplasia:
where are we now and where do we go from here? Nephrol Dial Transplant 2004; 19: 288-293
12. N. Casadevall et al. Pure red-cell aplasia and antierythropoietin antibodies in patients treated with
recombinant erythropoietin. N Engl J Med, Vol. 346, No. 7, p. 469–475.
13. H.Schellekens. Factors influencing the immunogenicity of therapeutic proteins. Nephrol Dial
Transplant 2005; 20: vi3–vi9.
14. S.Hermeling et al. Structural Characterization and Immunogenicity in Wild-Type and Immune
Tolerant Mice of Degraded Recombinant Human Interferon Alpha2b. Pharmaceutical Research
2005; 22: 1997–2006.
15. P. Chamberlain, A. R. Mire-Sluis. An Overview of Scientific and Regulatory Issues for the
Immunogenicity of Biological Products. Dev Biol. Basel, Karger 2003; 112: 3–11.
16. R. Steis et al. Resistance to recombinant interferon alpha-2a in hairy-cell leukaemia associated with
neutralizing anti-interferon antibodies. N Engl J Med 1988; 318: 1409–1413.
17. Annex to Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived
proteins as active substance. Non-clinical and clinical issues. Guidance on similar medicinal
products containing recombinant human soluble insulin. EMEA/CHMP/BMWP/2005
18. Comments on the CHMP Concept Paper for Similar Biological Medicinal Products Containing
Recombinant Human Insulin. CHMP/Comparability Working Party/146710/2004.
19. Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as
active substance: Quality Issues. EMEA/CHMP/BWP/49348/2005.
20. Guideline on comparability of medicinal products containing biotechnology-derived proteins as
active substance: Quality Issues. EMEA/CHMP/BWP/3207/00/Rev1.
42