2,5X MasHFBLMIX -3510
реклама
MagMIX-202 DIALAT Ltd. Информация о продукте МастерМИКС HFBL 2,5X MasHFBLMIX -3510 Для исследовательских работ in vitro для Hi-Fi ПЦР Кат.№ Количество MHB-50 MHB-100 50 реакций 100 реакций Качество МастерМикса гарантируется на протяжении не менее 1 года, при хранении всех реактивов при -20оС Внимание! Перед использованием необходимо выдержать МастерМикс при комнатной температуре (~15 мин.). МастерМиксHFBL 1Х: HF-Fuzz полимераза dA,dT,dC,dG -200M каждого Компоненты реакционного буфера MgCl2 Стабилизатор/энхансер Краски для электрофореза (Xylene Cyanol+OrangeG) Стерильная вода для ПЦР -5мл (прозрачная крышка) МастерМИКСHFBL содержит высококачественные реактивы для ПЦР амплификации ДНК непосредственно из образцов крови. Описание: МастерМиксHFBL рекомендуется для проведения амплификации ДНК, из образцов крови без выделения ДНК. МастерМиксHFBL - смесь ПЦР реагентов, содержащая стабилизатор/энхансер, усиливающий термостабилизацию фермента при повышенных температурах, улучшающий специфичность и чувствительность ПЦР. Основой МастерМИКСа является термостабильная химерная HF-Fuzz полимераза, обладающая высокой процессивностью, «точностью» амплификации и позволяющая амплифицировать низкокопийные ДНК матрицы, сложные последовательности ДНК, с содержанием GC-пар до 80%. HF-Fuzz полимераза модифицирована путем внесения мутаций для повышения термоустойчивости фермента и резистентности к различным ингибиторам ПЦР ( в частности компонентов крови). Использование МастерМикса позволяет амплифицировать последовательности ДНК - до 1,2-1,5Kb для геномной ДНК непосредственно из образца крови, без предварительного выделения ДНК. Для амплификации целевой ДНК можно использовать образцы крови стабилизированные гепарином, ЕДТА или цитратом натрия. Использование в качестве образцов : - кровь/ ЕДТА позволяет амплифицировать образцы с содержанием до 15% крови в реакции; - кровь, стабилизированная гепарином, до 15% - кровь, стабилизированная цитратом,до 5% Превышение концентрации крови выше 10% ( 5 мкл крови на 50 мкл реакционной смеси), приводит к увеличению содержания клеточного дебриса, после проведения амплификации, что может негативно сказаться на посделующей детекции ПЦР продуктов. В большом количестве случаев, использование 12,5мкл крови бывает достаточно для амплификации ДНК. Высокая процессивность и термостабильность HF-Fuzz полимеразы позволяют значительно уменьшить время амплификации, сократив его практически в 2 раза. МастерМиксHFBL содержит оптимизированную концентрацию MgCl2, которая достаточна для эффективной амплификации ДНК непосредственно из образца крови. В качестве объекта исследовании также могут быть использованы и другие образцы – пятна крови, архивные образцы крови и т.д. Эффективность амплификации будет идентичной/выше, чем при амплификации жидкой крови. Реакционная смесь, содержащая МастерМиксHFBL, после проведения амплификации может быть нанесена непосредственно на гель, без проведения дополнительных манипуляций ( добавления соответствующего буфера), что значительно сокращает время и экономит расходные материалы. DIALAT Ltd.,117 149,Moscow, Russia, Sympheropolsky blv.8, Tel.+499 613 2362, Fax.+499 613 4818 e-mail: [email protected] Протокол амплификации ДНК из образцов крови, без выделения ДНК ПЦР амплификация с использованием HF-Fuzz полимеразы близка к условиям использования PhusionHF полимеразы (ThermoFisher), Q5 полимеразы (NEB), iProof полимеразы (BioRad) т.е. HF-Fuzz полимераза лучше работает при повышенных температурах денатурации и отжига праймеров. Собирать ПЦР реакцию можно при комнатной температуре –т.к фермент обладает невысокой остаточной активностью при комнатной температуре. Приготовьте мастермикс для соответствующего количества образцов, исходя из приведенных ниже пропорций. Смешайте следующие компоненты : Компонент 50L 25L Конечные 1Х концентрации реакция реакция Вода для ПЦР ( без ДНКаз) 2.5x МастерМиксHFBL Праймеры Образец крови* до 50L 20L x 1-5 мкл до 25L 10L x 0.5-2,5мкл 1X 0.3-0.5 M каждого - 2,5Х Матер МиксHFBL содержит оптимальное количество MgCL2 ,в конечной 1Х концентрации. В некоторых случаях необходима оптимизация наиболее эффективной концентрации MgCL2. *-для образцов крови, стабилизированной цитратом не следует превышать конечную концентрацию крови 2,5-5% (1-2,5мкл для реакций в конечном объеме 50мкл). *-В качестве образца могут быть использованы образцы пятен крови (цельной или стабилизированной) на бумажном носителе. В случае использования образцов с FTA-карт (Whatman) следуйте инструкции производителя для подготовки пробы к амплификации. В большинстве случаев, пятна площадью 1мм2 вполне достаточно для амплификации ДНК фрагмента до 1-1,5Kb. При внесении образца крови убедитесь, что образец находится в растворе, а не на стенке пробирки (перед проведением ПЦР рекомендуется провести центрифугирование, коротко). Рекомендованныий объем ПЦР реакции – 50 мкл. Условия Амплификации 2-х стадийный ПЦР ToC 1) Начальная денатурация Денатурация Отжиг Элонгация Финальная элонгация o время 3-х стадийный ПЦР ToC o время 98 C 2-5 мин 98 C 2-5 мин 98oC 65-72oC3) 72oC 4oC 5-10 сек 15 сек/Kb 1-2 мин hold 98oC 55-722) 72oC 72oC 4oC 5-10 сек 10-30 сек 15-30 сек/Kb2) 1-2 мин hold Кол-во циклов 1 25-35 1 1)- При амплификации геномной ДНК, для начальной денатурации достаточно 2 мин. При использовании образца крови, в качестве ДНК матрицы рекомендованное время начальной денатурации -5 мин., для полного лизиса клеток крови. Для HF-Fuzz полимеразы рекомендуется скорректировать температуру отжига в пределах +310оС, по сравнению с ПЦР условиями амплификации с использованием Taq полимераз или ферментов на основе Taq (смеси Taq+Pfu, Taq+KlenTaq, KlenTaq+Pfu и т.д.) 2)- Оптимальная температура Тm, рекомендуется как наименьшая температура плавления одного из праймеров, для стандартных олигонуклеотидов <22 н.п. - Для сравнительно не сложных ДНК матриц (плазмидная ДНК, фаговая ДНК, BAC клоны) время элонгации может быть уменьшено до 15 сек/Kb. Для геномной ДНК (человеческой) рекомендуется элонгация не менее 30 сек на 1 Kb, при амплификации ДНК фрагментов превышающих 2Kb. Для фрагментов ДНК длиной менее 1,5Кb. элонгацию можно ограничить 15 сек/Kb. НЕ РЕКОМЕНДУЕТСЯ превышать указанное время элонгирования во избежание образования неспецифических продуктов и уменьшения выхода целевого продукта. 3)- Для проведения двух-стадийной ПЦР, рекомендуется подбирать праймеры, Тm которых находится в пределах 62-70оС. В случае если Тm пары праймеров лежит в области 62-65оС, рекомендуется пользоваться простым равенством для определения стартовой температуры отжига/элонгирования – (72о+ Тm праймера с минимальным значением)/2. Если Тm праймеров (обоих) > 65oC , то рекомендованная совмещенная температура отжига/элонгирования будет находиться в интервале 70-72оС. Для определения наиболее эффективной Т отжига/элонгирования рекомендуется провести амплификацию в градиенте – это позволит сократить время оптимизации ПЦР. При использовании цельной/стабилизированной крови в качестве матрицы для амплификации – не рекомендуется превышать концентрацию крови свыше 5% (в большинстве случаев достаточно 1-2мкл на реакцию в 50 мкл объеме), в виду образования значительного количества клеточного дебриса в процессе амплификации. DIALAT Ltd.,117 149,Moscow, Russia, Sympheropolsky blv.8, Tel.+499 613 2362, Fax.+499 613 4818 e-mail: [email protected]
