РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова На правах рукописи АБУШИК ПОЛИНА АЛЕКСАНДРОВНА МЕХАНИЗМЫ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ, ВЫЗВАННОЙ АКТИВАЦИЕЙ РЕЦЕПТОРОВ ГЛУТАМАТА В ЦЕНТРАЛЬНЫХ И ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ НЕЙРОНАХ КРЫС Специальность 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Антонов С.М. Санкт-Петербург 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ………………………………………………………....5 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ……...………………………………....6 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ …..………………………………………………12 1.1 Строение и функции глутаматергического синапса ….………..….….…....12 1.2 Структурно-молекулярная организация рецепторов глутамата …………..14 1.2.1 АМПА/KA–ионотропные рецепторы глутамата ……………….......17 1.2.2 NMDA-чувствительные ионотропные рецепторы глутамата ..........20 1.2.3 Метаботропные рецепторы глутамата ……………………………...25 1.3 Нейротоксическое действие глутамата ……………………………..............28 1.4 Глутамат-индуцированная дисрегуляция кальциевого баланса клетки......30 1.5 Рецепторы глутамата в периферической нервной системе…………..…….34 1.6 Гомоцистеин, как эндогенный агонист рецепторов глутамата ………........36 Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДИКИ ………………………………………….…….39 2.1. Приготовление первичных культур нейронов……………..….….…….…..39 2.1.1. Первичная культура нейронов коры головного мозга крыс …............40 2.1.2. Первичная культура нейронов тригеминального ганглия крыс….…..42 2.2. Идентификация нейронов и глиальных клеток в культурах……..……..….43 2.2.1. Идентификация клеток в первичной культуре коры головного мозга крыс ……………………………………………………………………………...43 2.2.2. Идентификация клеток в первичной культуре тригеминального ганглия крыс ……………………………………………………………………45 2.3. Флуориметрическая регистрация внутриклеточного Ca2+ ...………..…..…46 2.4. Флуориметрическое определение митохондриального мембранного потенциала ..………………………………………………………………………...48 2.5. Регистрация токов нейронов методом локальной фиксации потенциала...49 2.6. Определение апоптотических и некротических клеток путем последовательного окрашивания акридиновым оранжевым и бромистым этидием ……………………………………………………………………………..50 2.7. Порядок проведения экспериментов ………………..…………………........51 3 2.8. Обработка данных …………………………….……………….………….….53 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ..……………………………………………………..……55 3.1. Исследование состава рецепторов глутамата, обеспечивающих вход Са2+ при действии агонистов рецепторов глутамата в нейронах первичной культуры коры мозга крыс ………………………………………………………………..…..55 3.1.1 Внутриклеточные Са2+ ответы и токи в нейронах при действии агонистов рецепторов глутамата NMDA и АМПА/KA типа ..……................55 3.1.2. Зависимость внутриклеточных Са2+ ответов нейронов от Са2+ внеклеточного раствора……………………………………..….………………57 3.1.3. Вклад NMDA рецепторов различного субъединичного состава в генерацию внутриклеточного Са2+ сигнала …………………………………..58 3.1.4. Вклад АМПА рецепторов различного субъединичного состава в генерацию внутриклеточного Са2+ сигнала и интегральных токов....………60 3.2. Исследование нейротоксического эффекта гомоцистеина на нейроны первичной культуры коры мозга крыс……………………………………………63 3.2.1. Нейротоксический эффект долговременного действия гомоцистеина……………………………………………………………………63 3.2.2. Внутрикелеточные Са2+ ответы при кратковременном и долговременном действии гомоцистеина ……………….................................65 3.2.3. Интегральные токи, вызванные гомоцистеином....................................67 3.3. Исследование нейротоксического эффекта гомоцистеина на нейроны первичной культуры тригеминального ганглия крыс……………………………69 3.3.1. Внутриклеточные Са2+ ответы при действии гомоцистеина …….…..69 3.3.2. Интегральные токи, вызванные гомоцистеином……………………....72 3.3.3. Нейротоксический эффект долговременного действия гомоцистеина……………………………………………………………………73 3.4. Сравнительная характеристика ответов нейронов коры и тригеминального ганглия крыс на гомоцистеин, NMDA и глутамат……….......75 3.4.1. Внутриклеточные Са2+ ответы………………………………………….75 3.4.2. Митохондриальный мембранный потенциал…………….……...…….78 4 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ …………………………………………………………..83 ВЫВОДЫ ………………………………………………………………………......93 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ …………………………………………………………95 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АО акридиновый оранжевый БЭ бромистый этидий АМПА α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота GPCR G-белок-связанный рецептор (G-protein coupled receptor) [Ca2+]i концентрация внутриклеточного Ca2+ Гли глицин Глу глутамат ГЦ гомоцистеин IP3 инозитол-трифосфат КА каинат mit мембранный митохондриальный потенциал мГлуР5 метаботропный рецептор глутамата 5 типа МД митохондриальная деполяризация NMDA N-метил-D-аспартат ОКД отсроченная кальциевая дисрегуляция PKC протеинкиназа С Rho123 родамин 123 ЭПР эндоплазматический ретикулум ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность возбуждающим проблемы. медиатором L-глутамат центральной (Глу) является нервной основным системы (ЦНС) млекопитающих (Curtis et al., 1959), который обеспечивает проведение возбуждения от нейрона к нейрону в глутаматергических синапсах. Благодаря участию постсинаптических рецепторов Глу в синаптической пластичности, сам Глу вовлечен в такие когнитивные функции, как обучение и память. Однако в условиях гиперактивации различных типов рецепторов Глу, в нейронах могут развиваться нейродегенеративные процессы, связанные с нарушением Са2+ регуляции, которые запускают внутриклеточные сигнальные каскады, приводящие к гибели нейронов (Khodorov, 2004). Известно, что нейротоксичность Глу участвует в патогенезе таких социально значимых неврологических заболеваний как эпилепсия, ишемический инсульт, мигрень, боковой амилотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона. В связи с этим, изучение механизмов нейротоксического действия Глу и агонистов его рецепторов является одним из наиболее актуальных направлений в современной нейробиолгии. Известно, что в первую очередь, нейротоксическое действие Глу реализуется в глутамат-чувствительных нейронах ЦНС. Однако часть нейродегенеративных заболеваний, сопряженных с гиперакивацией рецепторов Глу развивается на периферии, в нейронах неглутаматергической природы. Тем не менее, вопрос экспрессии рецепторов Глу и механизмов нейротоксического действия Глу в тканях периферической нервной системы (ПНС) остается мало изученным. Исследование механизмов развития патологических процессов на целом мозге и ПНС, затруднено из–за их сложной структурной организации и ограничений в применимости современных методов исследований. Большой прогресс в изучении многих аспектов нейродегенерации был достигнут в экспериментах на первичных культурах ткани различных отделов мозга (Bading et al., 1995; Kim, Pae, 1996; Kim et al., 1999), так как данный экспериментальный 7 подход позволяет контролировать внеклеточную среду и рост клеток, дает возможность для исследования внутриклеточных механизмов и межнейронных взаимодействий в нейронной сети. Тем не менее, остается открытым вопрос о сохранности структурно-функциональной специализации нейронов, выделенных из эмбриональной ткани и подверженных культивированию в течение нескольких дней. Являются ли нейроны, выращенные в искусственных условиях гомогенными по своим функциональным свойствам? – Исследование данного вопроса представляется весьма актуальным для правильной интерпретации результатов, полученных на первичной культуре нейронов, и их сопоставления с процессами, происходящими в нейронах мозга взрослых животных. На сегодняшний день известно, что патогенез многих нейродегенеративных заболеваний сопряжен с увеличением концентрации гомоцистеина (ГЦ) в кровотоке и цереброспинальной жидкости (Kruman et al., 2002; Sachdev, 2005). Данная аминокислота может накапливаться в результате нарушения синтеза метионина и цистеина, вызванного недостатком фолиевой кислоты и витаминов группы В, или вследствие, генетически обусловленного полиморфизма – точечной мутации, заключающейся в замене с цитозина (С) на тимин (Т) в нуклеотиде (C677T) гена 5’-10’-метилентетрагидрофолат редуктазы (Rozen 1997; Sachdev, 2005; Isobe, Terayama, 2010). Исследования последних лет показали, что ГЦ может взаимодействовать с сайтом связывания Глу или глицина NMDA рецептора (Poddar, Paul, 2013), а значит может быть рассмотрен как новый эндогенный активатор рецепторов Глу (Lipton et al., 1997). Известно, что чрезмерная активация NMDA рецепторов вызывает сильный окислительный стресс, и как следствие, сильную деполяризацию митохондрий (Reyes et al., 2012). Наряду с этим было показано, что в одних экспериментальных моделях, например в эпителиальных клетках, ГЦ вызывал окислительный эффект (Outinen et al., 1998), а в других, таких как нейроны и астроциты, оказывал восстанавливающий эффект (Loureiro et al., 2010). В связи с этим, вопрос вовлеченности ГЦ в индукцию окислительного стресса пока остается открытым. 8 Несмотря на то, что из-за актуальности для практической медицины изучение цитотоксического действия ГЦ является активно развивающимся направлением нейробиологии, нейротоксическое действие ГЦ, его вовлеченность в окислительный стресс и роль ГЦ в Са2+ сигнализации в центральных и периферических нейронах остаются мало изученными. Цель исследования. В центральных и периферических нейронах крыс исследовать рецепторные механизмы нейротоксического действия агонистов рецепторов глутамата, вызывающие накопление Са2+ и изменение митохондриального мембранного потенциала. Для достижения указанной цели были поставлены следующие конкретные задачи исследования. 1. Изучить динамику увеличения концентрации кальция, вызванного активацией NMDA и АМПА рецепторов в нейронах коры мозга крыс in vitro. 2. C использованием избирательных блокаторов, изучить субъединичный состав NMDA и АМПА рецепторов, вовлеченных в генерацию кальциевых ответов в нейронах коры мозга крыс in vitro. 3. В нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре ткани исследовать нейротоксический эффект долговременного действия гомоцистеина. 4. В нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре сопоставить амплитудно-временные характеристики внутриклеточных кальциевых ответов на гомоцистеин, NMDA и глутамат. 5. Изучить изменения митохондриального мембранного потенциала (Δφmit), вызванные кратковременным действием гомоцистеина, NMDA и глутамата в нейронах первичной культуры коры мозга и тригеминального ганглия крыс. Научная новизна. Исследованы Са2+ ответы нейронов коры мозга крыс на каинат, который является сильным нейротоксическим агентом и избирательным агонистом рецепторов АМПА типа. Впервые обнаружено, что Са2+ ответы при 9 действии каината развивались гораздо медленнее, чем при активации NMDA рецепторов в нейронах коры мозга. Это обусловлено наличием АМПА рецепторов, которые обладают различной проводимостью для Са2+ в зависимости от экспрессии GluA2 субъединицы, что отражает функциональные характеристики нейрона. Таким образом, было впервые показано, что нейроны в первичной культуре являются гетерогенными и обладают морфофунциональной специализацией, характерной для нейронов коры мозга крыс. Впервые показано, что нейротоксический эффект ГЦ определяется синергизмом активации NMDA рецепторов и метаботропных рецепторов глутамата, так как избирательные антагонисты каждого из этих рецепторов предотвращали гибель глутамат-чувствительных центральных нейронов, а также пуринергических и пептидергических периферических нейронов. Были впервые зарегистрированы интегральные трансмембранные токи, вызванные ГЦ в нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс, и продемонстрировано, что они генерируются в результате активации NMDA рецепторов. Впервые было показано, что в отличие от Глу и NMDA, ГЦ индуцирует кратковременные быстрые кальциевые ответы осцилляторного типа и не вызывает деполяризацию мембраны митохондрий на начальных этапах нейротоксического действия в нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре ткани. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Нейроны коры мозга крыс в первичной культуре ткани, по экспрессии рецепторов Глу различного субъединичного состава, являются гетерогенными и обладают морфофункциональной специализацией, характерной для нейронов коры мозга крыс. 2. сигналов Несмотря на различную медиаторную природу синаптических нейронов коры мозга и тригеминального ганглия крыс, нейротоксический эффект гомоцистеина в обоих типах нейронов развивается через активацию ионотропных NMDA рецепторов и метаботропных рецепторов глутамата 5 типа. 10 3. Гомоцистеин, в отличие от NMDA и глутамата, вызывает кратковременные быстрые кальциевые ответы осцилляторного типа и не вызывает падения митохондриального мембранного потенциала в нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре, а следовательно, не вызывает окислительный стресс на начальных этапах нейротоксического действия. Теоретическая и практическая значимость. Работа имеет значение для фундаментальной науки в области исследования нейродегенеративных процессов, участвующих в патогенезе таких социально значимых заболеваний, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона. Теоретическое значение работы состоит в расширении представлений о механизмах нейродегенерации, вызванной чрезмерной активацией рецепторов Глу. Результаты исследования могут быть полезны для понимания механизмов возникновения и развития нейродегенеративных состояний, неврологических расстройств в ЦНС и ПНС, а также для выявления возможных механизмов защиты нейронов от гибели. Результаты работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских институтов. Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, 4 из которых статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для размещения материалов кандидатских диссертаций (в том числе 3 статьи в международных журналах), 10 тезисов докладов. Апробация работы. Результаты исследования представлены на XXI и XII съезде физиологического общества им. И.М. Павлова (Калуга, 2010; Волгоград, 2013), на XVIII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), на четырнадцатом международном совещание и седьмой школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011) на III Съезде Физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Украина, Ялта, 2011), на восьмом форуме европейской федерации нейробиологов 8 th FENS Forum of Neuroscience 2012 (Испания, Барселона, 2012), на седьмом и восьмом 11 ежегодном симпозиуме Университета восточной Финляндии The Annual PostGraduate Symposium of the Doctoral Program in Molecular Medicine: Winter School (Финляндия, Нильсия, 2013, 2014) и на ежегодной встрече общества нейробиологов Neuroscience 2013 (США, Сан-Диего, 2013). Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы по исследуемой проблеме – глава 1, описания методики экспериментов – глава 2, результатов исследования – глава 3, обсуждения результатов экспериментов – глава 4, выводов и списка литературы, включающего 184 источника (из них 164 иностранных). Работа иллюстрирована 26 рисунками и 1 таблицей. 12 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Строение и функции глутаматергического синапса В 1893 году появились первые сообщения о способе взаимодействия нервных клеток через специфические контакты или синапсы. Термин синапс был введен в 1897 году Чарльзом Шеррингтоном. А открытие синаптических контактов принадлежит испанскому ученому Рамон-и-Кахалю, который, благодоря использованию метода Гольджи (насыщение серебром нейронов), обнаружил у большинства нейронов два функционально разных отростка: дендрит и аксон. Он впервые обосновал морфологическую самостоятельность нейронов и глиальных клеток, а также показал, что в нервной системе отсутствуют синцитиальные отношения (Cheah, Watkins, 1965). Спустя 50 лет после открытий Кахаля стало очевидным, что передача нервного импульса осуществляется через синапсы, а ключевым компонентом такой передачи является наличие в мембране окончаний нейрона синаптических рецепторов. Позже, при изучении влияния различных веществ на электрическую активность нейронов изолированного спинного мозга Куртис и Ваткинс сформировали гипотезу о медиаторной роли дикарбоновых аминокислот (Cheah, Watkins, 1965; Curtis, Johnston, 1974). В результате этих экспериментов было установлено, что Глу является основным возбуждающим медиатором в синапсах ЦНС позвоночных, и он удовлетворяет основные требования, необходимые для признания вещества медиатором. Открытие специфических рецепторов Глу стало определяющим феноменологическим признаком его медиаторной роли. Глу является заменимой аминокислотой, которая не способна проникать через гематоэнцифалический барьер, т.е. не поступающей в мозг через кровь. Молекула глутаминовой кислоты имеет достаточно простую структуру HOOC– СН2–СН2–СН(NH2)–СООН (Curtis, Johnston, 1974; Антонов и др., 1988; Калинина и др., 1989; Collingridge, Singer 1990). Еѐ синтез происходит в основном внутри нейронов мозга, хотя небольшая часть Глу находится в глиальных клетках астроцитах. Глу может быть синтезирован несколькими путями: из αкетоглутарата с помощью прямого восстановительного аминирования или 13 трансаминирования, из глутамина ферментом глутаминазой, а также из орнитина ферментом орнитинаминотрансферазой (Петров и др., 1997). Известно, что глутаматергические синапсы широко распространены в большинстве отделов ЦНС, в частности, в коре больших полушарий мозга, в гиппокампе, черной субстанции, мозжечке, стриатуме, среднем мозге, гипоталамусе и в спинном мозге. Переносчики Глу, которые являются интегральными белками плазматической мембраны, осуществляют транспорт-захват Глу из синаптической щели и его перенос внутрь глиальных клеток и нейронов (Masson et al., 1999; Tanaka 2000; Антонов, 2001). За счет функционирования данных переносчиков в синаптической щели поддерживается низкая концентрация медиатора (Ноздрачев и др., 2001; Никколс и др., 2003). В цитозоле нейронов и глиальных клеток концентрация Глу достигает 10 мМ. Известно, что благодаря энергии трансмембранных ионных градиентов происходит захват Глу против его химического градиента. Так как для Na+ и K+ (примерно 140 мМ Na+ во внеклеточной среде и около 10 мМ внутри клеток; и наоборот 130 мМ К + внутри клеток и порядка 3 мМ снаружи) поддерживается самый большой электрохимический градиент между внеклеточной и внутриклеточной средой, молекулы Глу транспортируются в клетку совместно с ионами Na+, при этом происходит выход ионов К+. Доказательством этого служит опыт по замене ионов Na+ на ионы Li+ в наружной среде, что приводило к блокированию транспорта Глу (Антонов 1989). Попав в нейроны, Глу накапливается в синаптических везикулах с помощью протонзависимых везикулярных транспортеров (рис. 1.1). Из глиальных клеток в нейроны Глу транспортируется с небольшими метаболическими превращениями. В астроцитах Глу превращается в глутамин за счет фермента глутаминсинтазы. Важно, что глутамин способен проходить через билипидные мембраны, неактивируя рецепторы Глу. Таким образом, глутамин захватывается нейронами из внеклеточного пространства. Митохондриальный фермент нейронов глутаминаза превращает глутамин обратно в Глу, кторорый снова попадает в синаптическую везикулу (Masson et al., 1999). 14 Глутаматергический синапс, подобно другим химическим синапсам, представляет собой сложное структурное образование, состоящее из пресинаптической мембраны (пресинапс, чаще всего это концевое разветвление аксона), постсинаптической мембраны (постсинапс, чаще всего это участок мембраны тела или дендрита другого нейрона), а также синаптической щели. Важным участником синаптической передачи являются глиальные клетки, поддерживающие локальный гомеостаз в синаптической щели. Еще до того, как были выяснены многие существенные особенности процесса высвобождения медиатора, было установлено, что пресинаптические окончания проявляют спонтанную секреторную активность. Постоянно выделяемые небольшие порции медиатора вызывают в постсинаптической клетке токи, называемые спонтанными миниатюрными постсинаптическими токами. При исследовании нервно-мышечного синапса лягушки было обнаружено, что в мышце в области постсинаптической мембраны сами по себе, без всякого воздействия на нерв, через случайные промежутки времени возникают небольшие колебания потенциала (Fatt, Katz, 1950). Высвобождение медиатора, несвязанное с нервным импульсом помогло установить его квантовый характер - в покое в химическом синапсе медиатор выделяется небольшими порциями (Зефиров, 2000). 1.2 Структурно-молекулярная организация рецепторов глутамата В ЦНС находится порядка 108 глутаматергических нейронов. С помощью методов электрофизиологии и молекулярной биологии, было выявлено существование 4 типов глутаматных рецепторов. Среди 4 типов глутаматных рецепторов 3 типа являются ионотропными рецепторами и 1 тип метаботропным рецептором. К ионотропным рецепторам глутамата относятся: (N-метил-Dаспартатные (NMDA) рецептры, каинатные (KA) рецепторы и рецепторы 2амино-3(3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-ил) пропионовой (AMПA) кислоты. Эти 15 рецепторы являются лиганд-управляемыми ионными каналами. Современная классификация ионотропных рецепторов основана на их разной чувствительности к действию N-метил-D-аспарагиновой кислоты, 2-амино-3(3-гидрокси-5- метилизоксазол-4-ил) пропионовой кислоты и каината. Все ионотропные рецепторы Глу являются тетрамерами. В соответствии с классификацией международной организации по изучению генома человека (HUGO, URL: http://www.genenames.org/) по фармакологии и структурной гомологии субъединицы ионотропных рецепторов Глу разделяют на: субъединицы GluA1 – GluA4 (AMПA рецепторы), субъединицы GluK1 – GluK5 (КА рецепторы), субъединицы GluN1,GluN2A–2D, NR3A–3B (NMDA рецепторы) и субъединицы GluD1, GluD2 (delta-глутаматные рецепторы) (Sobolevsky et al., 2009). Метаботропные рецепторы глутамата разделяют на три группы (рис. 1.1): I группа, в основном экспрессируются на постсинапсе (mGluR1 и mGluR5 подтипы), II группа (mGluR2, mGluR3 подтипы) и III группа (mGluR4, mGluR6mGluR8 подтипы) метаботропных рецепторов глутамата, представлены на пресинаптическом окончании и участвуют в регуляции выброса Глу (Grueter, Winder, 2009). Известно, что в нормальных условиях у млекопитающих все типы рецепторов Глу активируются самим Глу и, возможно, L-аспартатом (McBain, Mayer, 1994; Dingledine et al., 1999). В отличие от ЦНС позвоночных, у беспозвоночных рецепторы Глу могут формировать катионный или анионный канал, и при этом возможна регистрация как деполяризующего, так и гиперполяризующего ответа клеток при аппликации агонистов (Shinozaki 1988). Данные о клонировании субъединиц рецепторов Глу (Hollmann et al., 1989) позволили узнать аминокислотные последовательности рецепторных субъединиц и их топологию в мембране. На данное время клонированно 18 субъединиц рецепторов Глу, для которых возможено редактирование, приводящие к изменению аминокислотной последовательности (Sobolevsky 2003; Traynelis et al., 2010). Известно, что субъединицы всех известных рецепторов Глу, включая 16 АМПА, каинатные, NMDA и delta-глутаматные рецепторы, имеют подобную архитектуру (Traynelis et al., 2010). Рисунок 1.1. Схематическое представление глутаматергического синапса, с указанием возможного положения различных рецепторов глутамата. ЭПР – эндоплазматический ретикулюм, EAAT – транспортер глутамата. Объяснения в тексте. Все ионотропные рецепторы Глу имеют одинаковую топологию строения, и являются мембранными протеинами, которые состоят из четырѐх частей, образующих ионный канал. Субъединицы включают в себя четыре домена (рис. 1.2.а): внеклеточный N-терминальный домен, внеклеточный лиганд-связывающий домен, C-терминальный домен и трансмембранный домен, включающий в себя три сегмента и одну возвратную петлю (Sobolevsky et al., 2009). Различные типы рецепторов Глу сформированы различными сочетаниями субъединиц. Так AMПA рецепторы состоят из четырех видов субъединиц, KA рецепторы и NMDA рецепторы – из пяти (Dingledine et al.,1999). 17 1.2.1 АМПА/KA–ионотропные рецепторы глутамата АМПА/KA рецепторы обладают гораздо более быстрой кинетикой активации, они вовлечены в генерацию постсинаптических потенциалов. При быстрых возбуждающих этом открывание ионных каналов АМПА/KA рецепторов не зависит от величины мембранного потенциала. Такие каналы относятся к потенциал-независимому типу и опосредуют потенциалнезависимое возбуждение в нейрональных синапсах. АМПА рецепторный ионный канал может состоять из четырех различных субъединиц (GluA1–GluA4), в то время как KA рецептор может состоять из пяти различных типов субъединиц (GluK1–GluK5). Рисунок. 1.2. Структура АМПА рецептора. (а) Структура субъединицы АМПА рецептора. (б) АМПА рецептор как тетрамерный комплекс, состоящий из четырех субъединиц GluR1,3,4 и GluR2. Природный канал АМПА рецептора представляет собой тетрамерную структуру, состоящую из четырех субъединиц GluA1 – GluA4, каждая из которых состоит из N-терминального домена, формирующего конструкцию рецептора, лиганд-связывающего домена. Этот домен закрывает канал, трех трансмембранных доменов (M1, M3 и M4), возвратной петли (M2), соединяющей 18 пору канала с цитоплазматическим C-терминальным доменом, который влияет на транспорт канала (рис. 1.2.а). Считается, что гетеромерный рецептор состоит из двух GluA2 субъединиц и двух других GluA1, GluA3 или GluA4 (рис. 1.2.б) (Mansour et al., 2001; Greger et al., 2003; 2007; Isaac et al., 2007). Q/R-сайт, локализованный в поре канала над M2 доменом, оказывает сильное влияние на биофизические свойства АМПА рецептора, изменяя проводимость канала для двухвалентных катионов и его чувствительность к полиаминам (Jonas , Burnashev, 1995, Hume et al., 1991; Blaschke et al., 1993; Washburn, Dingledine, 1996). Q-сайт представлен глутамином и находится в GluA1, GluA3 и GluA4 субъединицах, Rсайт представлен аргинином только в GluA2 субъединице (рис.1.2.б). АМПА рецепторы, не включающие в свой состав GluA2, обладают проводимостью для Ca2+ и легко блокируются эндогенными внутриклеточными полиаминами (например, спермином). Каналы рецепторов, имеющих GluA2 субъединицу, пропускают только Na+ и K+, и нечувствительны к полиаминам. Таким образом, чувствительность к полиаминам, с последующим блокированием рецептора, определяется отсутствием или наличием GluA2 субъединицы (Washburn et al., 1997; Fleming, England, 2010). KA рецепторы имеют пять типов субъединиц GluK1 – GluK5, кодируемых генами GRIK1–GRIK5 соответственно (Dingledine et al.,1999). Структурно KA рецептор представляет собой комплекс, состоящий из четырех субъединиц. Важно, что субъединицы GluK4 и GluK5 могут формировать функциональный рецептор лишь в присутствии одной из GluK1-GluK3 субъединиц (Dingledine et al.,1999). Рецепторы KA, подобно АМПА рецепторам, имеют N-терминальный домен, лиганд-связывающий домен, сегменты M1–M4, включая возвратную петлю (M2). Ионный канал, сформированный KA рецептором, проницаем только для Na+ и K+. Открывание канала KA рецептора происходит быстрее, чем канала АМПА рецептора (Huettner 2003). В отличие от АМПА рецепторов, KA рецепторы играют второстепенную роль в передаче сигнала. Скорее, рецепторы KA принимают большее участие в синаптической пластичности (Contractor et al., 2000; Trussell, Fischbach, 1989). 19 Физиологическая роль рецепторов не-NMDA типа изучена не так хорошо, как NMDA рецепторов, что объясняется отсутствием широкого набора специфических агонистов и антагонистов АМПА/КА типа рецепторов. KA является смешанным агонистом KA и АМПА рецепторов, при этом активируя, он не вызывает десенситизацию АМПА рецепторов (Kiskin et al., 1986). Из наиболее известных конкурентных антагонистов АМПА/KA рецепторов можно назвать CNQX (6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион), который селективно блокирует их в присутствии в среде глицина (Гли). Это происходит из-за большего сродства CNQX к Гли-связывающему сайту в NMDA рецепторно-ионофорном комплексе, чем в АМПА/KA рецепторе. Впервые с использованием аргиотоксина636 (Herlitze et al., 1996), он же – аргиопин (Гришин и др., 1986; Магазаник и др., 1986; Antonov et al., 1987), было показано, что эффективность блокады каналов АМПА рецепторов также, как и Ca2+ проводимость, определяется отсутствием в структуре рецептора GluА2 субъединицы. В частности, если в состав АМПА рецептора входит GluА2, то канал непроницаем для Ca2+ и все каналоблокаторы неэффективны. Эти закономерности справедливы для ИЭМ-1460 – блокатора Са2+ проницаемых АМПА рецепторов, не содержащих GluA2 субъединицу (Antonov et al., 1995; Antonov et al., 1998; Магазаник и др., 1984). Этот блокатор с ЕД50 около 1 мкМ блокирует канал Ca2+-проницаемых АМПА рецепторов (Magazanik et al., 1997). Для блокады каналов NMDA рецепторов и Ca2+-непроницаемых АМПА рецепторов необходимы более чем на порядок большие концентрации ИЭМ-1460 (Magazanik et al., 1997; Antonov, Johnson, 1996). Известно, что разные типы нейронов коры и гиппокампа экспрессируют AMПA рецепторы различного субъединичного состава. В частности, пирамидные нейроны коры и гиппокампа экспрессируют AMПA рецепторы, содержащие GluА2, а вставочные нейроны – АМПА рецепторы, не содержащие GluА2 (Samoilova et al., 1999). Использование избирательных блокаторов АМПА рецепторов позволяет соотнести типы действия ИЭМ-1460 на внутриклеточный Ca2+ сигнал, вызванный гиперактивацией АМПА рецепторов с помощью КА, с 20 морфофункциональными типами нейронов коры (Angulo et al., 1997; Kondo et al., 1997; Kumar et al., 2002). Для исследования нейротоксического действия Глу и агонистов широко применяются первичные культуры ткани. Однако вопрос гетерогенности в отношении эксспресии рецепторов Глу в нейронах первичной культуры коры мозга остается неясным и является одной из задач данной работы. Этот вопрос является принципиально важным с точки зрения нейробиологии, так как до сих пор не известно, сохраняют ли клетки в культуре ткани исходный субъединичный состав рецепторов Глу на плазматической мембране. К тому же мало изучена Са 2+ регуляция при действии КА, как агониста АМПА/КА рецепторов. Этот вопрос также является предметом исследования данной работы. 1.2.2 NMDA-чувствительные ионотропные рецепторы глутамата NMDA рецептор включает в свой состав: сайт специфического связывания медиатора (Глу) в лиганд-связывающем домене, сайт связывания коагониста (Гли) и аллостерические модуляторные сайты, расположенные во внеклеточной области рецептора и в ионном канале (сайты связывания двухвалентных катионов и потенциалзависимый Mg2+-связывающий участок). Показано, что NMDA рецептор является гетеромерной структурой, состоящий из субъединиц трех типов: GluN1, GluN2A – GluN2D, GluN3A – 3B. Один рецептор всегда состоит из четырех субъединиц, при этом GluN1 субъединица является необходимой для формирования рецептора, так как при ее отсутствии рецептор не способен активироваться (Pachernegg et al., 2012). Структурные различия GluN2 субъединиц определяют функциональную гетерогенность NMDA рецепторов в различных нейрональных клетках (Pachernegg et al., 2012). Более того, соотношение субъединиц, входящих в состав рецепторного комплекса, может изменяется с возрастом и в зависимости от степени активности синапсов. 21 Все субъединицы NMDA рецепотра расположены в мембране одинаково. Каждая субъединица имеет три трансмембранных домена (М1, М3 и М4), и один внутримембранный домен М2, N-терминальный домен, расположенный внеклеточно, и внутриклеточный С-терминальный домен. В образовании канала рецептора участвуют М2 домены четырѐх субъединиц (рис. 1.3). Сайт связывания Глу находится на двух доменах, расположенных на N-терминальном домене перед М1 доменом и на М3–М4 петле, соответственно, причем эти домены принадлежат GluN2 субъединицам. Те же самые места на субъединицах GluN1 и GluN3 типа служат местом связывания (Гли) (Pachernegg et al., 2012). В зависимости от субъединичного состава NMDA рецепторы могут приобретать различные свойства. Например, NMDA рецепторы с GluN2A cубъединицей, десенситизируются быстрее, чем рецепторы, содержащие GluN2D субъединицу. Основным молекулярным механизмом, который ограничивает длительность постсинаптического сигнала, является десенситизация рецепторов Глу. Более того, все ионотропные рецепторы Глу различаются по кинетическим параметрам десенситизации. Известно, что NMDA рецепторы переходят медленно в десенситизированное состояние, при этом описано множествомеханизмов их десенситизации. В отличие от NMDA рецепторов, АМПА/KA рецепторы переходят в десенситизированное состояние быстро, при этом их десенситизации больше (Dingledine et al., 1999). Известно, что в зависимости от скоростей открытия и закрытия каналов рецепторов Глу, десенситизация может увеличивать или уменьшать длительность синаптических токов (Jones, Westbrook, 1996; Johnson, Ascher, 1987). Большую роль в функциионировании ионотропных рецепторов Глу играют пост-трансляционные модификации, наиболее важной из которых является фосфорилирование рецепторных субъединиц. Известно, что в мозге млекопитающих 10 – 70 % GluN1 и GluN2 субъединиц NMDA рецепторов фосфорилированы по нескольким сайтам. В основном именно изменение соотношения фосфорилированых и нефосфорилированых субъединиц определяет 22 возможности регуляции глутаматергической синаптической передачи (Dingledine et al., 1999). Рисунок 1.3. Структура NMDA рецептора. Соединения, способные избирательно взаимодействовать с Глу связывающим сайтом NMDA рецептора, называют агонистами и конкурентными антагонистами NMDA рецептора. А соединения, блокирующие канал NMDA рецептора назвают неконкурентными антагонистами. Агонистами Глу связывающего сайта NMDA рецептора кроме Глу являются сам NMDA, иботеновая кислота, аспартат и другие. Антагонистам конкурентного типа действия являются D,L-AP5 (D,L-APV), D,L-AP7, CPP и другие. Они взаимодействуют с местами связывания Глу, предотвращая активацию рецептора (Калинина и др., 1989). NMDA рецептор, помимо сайта связывания для Глу, имеет специфический сайт связывания для коагониста Гли, который взаимодействует с рецептором при низких концентрациях - ЕС50 составляет 10 – 30 мкМ (Jоhnsоn, Ascher, 1987; Sinоr et al., 2000). Известно, что связывание Гли с GluN1 субъединицей увеличивает вероятность активации NMDA рецептора, при этом уменьшеется скорость 23 десенситизации. Более того, в малых концентрациях (1 – 10 мкМ) Гли увеличивает амплитуду токов, вызванных активацией NMDA рецепторов. В отсутствие Гли рецепторы NMDA типа активируются слабо или не активируется Глу вовсе. Известно, что агонистом сайта связывания Гли на NMDA рецепторе является эндогенный D-серин. Одним из эндогенных антагонистов, для сайта связывания Гли является кинуриновая кислота, которая синтезируется в глиальных клетках. Эффект блокады кинуриновой кислотой NMDA-вызванных токов может быть снят за счет добавления Гли или D-серина. Важно, что в отличие от других ионотропных рецепторов Глу, каналы NMDA рецепторов являются потенциалозависимыми. Так при обычном потенциале покоя (от -70 мВ до -80 мВ) NMDA практически не вызывает входящие токи. При увеличении потенциала покоя токи значительно возрастают и достигают максимума при мембранном потенциале от -30 до -20 мВ. Прежде всего, это связано с тем, что при потенциале покоя -70 мВ, канал NMDA рецептора, независимо от открытия канала, блокирован ионами Mg2+(Mayer et al., 1984; Nоwak et al., 1984; Antоnоv, Jоhnsоn, 1999). При деполяризации мембраны сродство Mg2+ к каналу NMDA рецептора снижается и канал в отсутствии Mg2+ обретает способность проводить ионы Na+ и Ca2+ в нейрон (Mayer et al., 1984; Nоwak et al., 1984). Механизм блокирующего действия Mg2+ заключается в том, что Mg2+ взаимодействует с специальным сайтом связывания, препятствуя прохождению других ионов через канал. Обычно, в дальнейшем Mg2+ диссоциирует обратно во внеклеточный раствор. Место связывания наружного Mg2+ расположено достаточно глубоко в области трансмембранной поры рецептора, на которой происходит полное падение мембранного потенциала. В результате сродство наружного Mg2+ к его месту связывания в канале зависит от мембранного потенциала: чем отрицателее мембранный потенциал, тем выше сродство Mg2+ и эффективность его блока канала. Таким образом, можно сказать, что Mg2+ является одним из важнейших эндогенных модуляторов. Известно, что наружный Mg2+ способен потенцировать активность NMDA рецептора, как повышая сродство Гли к рецептору (Antоnоv, Jоhnsоn, 1999; Wang, MacDоnald, 24 1995), так и посредством Гли–независимого механизма (Paоletti et al., 1995). В определенных условиях Mg2+ также проникает через каналы NMDA рецептора (Antоnоv, Jоhnsоn, 1999; Mayer, Westbrооk, 1987). Поскольку в условиях патологии происходит существенное изменение нормальных ионных градиентов, регуляция эффективности блока наружным Mg2+ может иметь существенное значения для функционирования нейронов и нейрональных сетей. Часто, активация NMDA рецепторов приводит к деполяризации нейронов, так как открытые каналы рецепторов способные проводить ионы Na+. Более того, каналы NMDA рецепторов обладают проницаемостью для ионов Са2+, которые по электрохимическому градиентувходят в нейрон при активации NMDAрецепторов, что является весьма существенным для функционирования ЦНС в целом (Burnashev et al., 1992). Известно, что канал NMDA рецептора имеет несколько последовательных сайтов связывания для ионов Mg2+, Са2+ и Zn2+, которые являются наиболее значимыми эндогенными регуляторами рецепторов Глу (Antоnоv et al., 1998). Кроме Mg2+ в регуляции работы NMDA рецепторов также участвуют ионы Zn2+, которые снижают деполяризацию мембраны, вызванную активацией NMDA рецепторов в центральных нейронах (Christine, Chоi, 1990). Одним из отличий в механизмах действия Mg2+ и Zn2+ является расположение точек действия ионов: точка связывания для Zn2+ находится рядом с участком связывания Глу, во то время как точка связывания Mg2+ находится глубоко внутри канала. Также известно, что синаптические пузырьки глутаматергических нервных окончаний содержат кроме Глу ионы Zn2+, которые высвобождаются вместе с медиатором в синаптическую щель во время передачи нервного импульса. Если АМПА рецептор и NMDA рецептор колоколизованы, Глу активирует АМПА рецептор, вызывая локальную деполяризацию постсинаптической мембраны, и как следствие приводит к снятию Mg2+ блока каналов NMDA рецептора. Общий возбуждающий постсинаптический ток приобретает более медленный временной ход и сопровождается входом Ca2+ в клетку (Магазаник, 2004). При увеличении поступленя Ca2+ в цитоплазму нейрона может происходить 25 потенциация рецепторов Глу за счет их фосфорилирования. Однако если стимуляция рецепторов будет чрезмерно длительной, то в клетке будут включаться механизмы апоптоза, вызванные увеличением накопления свободного Ca2+, которое способно индуцировать процессы образования активных форм кислорода (АФК). Таким образом, NMDA рецепторы способны пропускать ток только в результате деполяризации постсинаптической мембраны, которая в физиологических условиях следует за стимуляцией АМПА рецепторов и приводит к разблокированию NMDA канала. Эта уникальная особенность NMDA рецепторов и их высокая проницаемость для Ca2+ позволяют рецепторам Глу NMDA типа играть важную роль в ЦНС, участвуя в таких функциональных процессах, как синаптическая пластичность, обучение, формирование памяти, развитие мозга в эмбриогенезе. 1.2.3. Метаботропные рецепторы глутамата В середине 1980-х, было открыто существование не образующих ионный канал рецепторов Глу – метаботропных рецепторов, которые могут стимулировать продукцию инозитол-1,4,5-трифосфата (Sladeczek et al., 1985; Sugiyama et al., 1987). Это открытие привело к разделению рецепторов Глу на два типа: ионотропные и метаботропные рецепторы Глу. На данный момент открыто и клонировано 8 подтипов метаботропных рецепторов Глу, которые относятся к С-классу G-белок-связанных рецепторов (GPCR, G-protein coupled receptor). Подтипы метаботропных рецепторов Глу по фармакологии, по сходствам в механизмах связывания Глу и по гомологии первичных последовательностей подразделяют на три группы: I группа метаботропных рецепторов Глу (mGluR1 и mGluR5 субъединицы), имеет GqPCR, II группа (mGluR2 и mGluR3 субъединицы) и III группа (mGluR4, mGluR6, mGluR7, mGluR8) метаботропных рецепторов Глу имеет Gi/o-белок-связанный рецептором (Conn, Pin, 1997). 26 Рисунок 1.4.1. Структура метаботропного рецептора глутамата. 7ТМ – семь спиральных трансмембранных доменов (Conn, Pin, 1997; Kunishima et al., 2000). GPCR рецептор представляет собой интегральный транс-мембранный белок, содержащий 7 спиральных доменов. Он состоит из пяти основных доменов: N-терминальный домен, лиганд связывающий домен, состоящий из двух частей, цистеин-обогощенный внеклеточный домен, семиспиральный трансмембранный (7ТМ) домен, связанный с трипептидом, образующим G-белок и С-терминальный домен (рис. 1.4.1). Результаты кристаллографических исследований показали, что внеклеточная часть метаботрапного рецептора Глу содержит две глобулярные доли, разделенные небольшой щелью, которые образуют ортостерический лиганд-связывающий домен (Kunishima et al., 2000). Несмотря на то, что Глу является первичным лигандом для данного сайта, важно, что большинство возбуждающих аминокислот нервной ткани также могут взаимодействовать с данным сайтом связывания (Conn, Pin, 1997). Было выявлено, что 7ТМ домен тоже содержит аллостерический сайт связывания лиганда (Kunishima et al., 2000). Вторичная внутриклеточная петля 7ТМ домена 27 обладает избирательностью и может взаимодействовать с G-белком, а третичная петля, имеющая консервативную первичню структуру, играет решающую роль в активации этого G-белка. Взаимодействие между первичной, третичной петлей и С-терминальным доменом регулирует эффективность связывания рецептора с Gбелком. C-терминальный домен играет ключевую роль в трафике метаботропного рецептора Глу и регуляции его работы (Grueter, Winder, 2009). Метаботропные рецепторы Глу I группы функционально связаны с внутриклеточными сигнальными молекулами, в частности, со скаффолд белками (scaffold proteins) семейства Homer, которые связывают С-терминальный домен рецептора с инозитол-трифосфатным (IP3) рецептором (Nanou et al., 2009; Sylantiev et al., 2013). В частности, все больше авторов сообщают о возможном регулировании метаботропными рецепторами Глу I группы рецепторов NMDA и АМПА типа через семйество белков Homer, активирующих протеинкиназы С (PKC) (Yu et al., 1997; Alagarsamy et al., 2001; Lea et al., 2002; Nanou et al., 2009; Auger, Ogden, 2010; Bertaso et al., 2010; Moutin et al., 2012; Sylantiev et al., 2013). Активация метаботропных рецепторов Глу I группы (mGluR1 и mGluR5 субъединицы) приводит к активации фосфолипазы С и запуску гидролиза фосфоинозитолов, с последующим выходом Са2+ из внутриклеточных депо за счет активации IP3 рецепторов ЭПР и активации PKC (рис. 1.4.2) (Nanou et al., 2009). Метаботропные рецепторы Глу II группы (субъединицы mGluR2 и mGluR3), умеренно экспрессированы в таких структурах мозга, как гиппокамп, префронтальная кора и миндалевидная железа, которые ассоциированны с развитием тревожными расстройств. Наиболее часто метаботропные рецепторы Глу II группы функционируют на пресинапсе, регулируя выброс медиатора в синаптическую щель, за счет ингибирования потенциал-зависимых Са2+ каналов (Grueter, Winder, 2009). 28 Рисунок 1.4.2. Механизм регуляции внутриклеточного Са2+ при активации метаботропных рецепторов глутамата I группы. PLC – фосфолипаза С, PIP2 – фосфатидилинозитол-дифосфат, DAG – диацилглицерол, PKC – протеинкиназа С, IP3 – инозитол-трифосфат, IP3R – инозитолтрифосфатный рецептор. Как и II группа, III группа метаботропных рецепторов Глу связана с ингибированием продукции цАМФ и модулированием ионных каналов. Однако в отличие от других групп, III группа, в первую очередь, экспрессирована в пресинаптическом окончании и уменьшает выделение нейромедиатора, тем самым снижая эффективность глутаматергической или ГАМК-ергической синаптической передачи (Grueter, Winder, 2009). Известно, что метаботропные рецепторы Глу экспрессированы во многих тканях ЦНС. Однако результаты последних лет демонстрируют, что данный тип рецепторов Глу также экспрессирован в нейронах ПНС (Turman et al. 2002; Carlton, Hargett, 2007; Lee, Ro, 2007), где их роль пока остается неясной. Вопрос вовлеченности метаботропных рецепторов Глу в нейрональные механизимы токсичности в клетках ПНС является одной из задач данного исследования. 1.3. Нейротоксическое действие глутамата Несмотря на то, что в Глу является оснвным возбуждающим медиатором ЦНС, в условиях чрезмерной активации его рецепторов могут наблюдаться 29 процессы, приводящие к гибели нейронов. Данный процесс получил название «эксайтотоксичность» (от англ. «excitotoxicity» – токсичность, развивающаяся при возбуждении). Известно, что эксайтотоксичность участвует в патогенезе многих нейродегенеративных расстройствах и связана с накоплением Са2+ в цитозоле нейронов (Choi, 1995). Более того, известно, что образование свободных радикалов, вызванное накоплением Са2+, способствует усилению нейротоксического действия эндогенного Глу (Stout et al., 1998; Nicholls, Budd, 2000; Vergun et al., 2001). В условиях нормального функционирования организма гибель нейронов в основном осуществляется по механизму апоптоза. Другой механизм гибели клеток – некроз, который характеризуется быстрым увеличением клетки и нарушением целостности плазматической мембраны. Оба механизма клеточной гибели могут быть вызваны факторами, которые вызывают нарушения в функционировании клеток. Для клеток ЦНС такими факторами являются энергетическая депривация, недостаток кислорода (ишемия) и перевозбуждение (Choi, 1992; Lipton, 1999). В большинстве случаев, нарушение функционирования синаптической передачи связано со значительным изменением концентрационных ионных градиентов внутри и снаружи нейронов: увеличение концентрации Na+ и существенное снижение концентрации K+ внутри клеток (Choi 1987). Так как направление транспорта переносчиков Глу зависит от содержания ионов Na+ и K+ снаружи и внутри нейронов, вместо захвата медиатора из наружного раствора происходит освобождение Глу за счет реверсии транспорта (Antonov, Magazanik, 1988; Антонов, Магазаник, 1989; Szatkowski et al., 1990). Показано, что данный механизм освобождения Глу задействован в условиях энергетической депривации (Rossi et al., 2000). Подобные нарушения приводят к увеличению свободной концентрации Глу в межклеточном пространстве. К постсинаптическим факторам нейродегенерации относятся: активация рецепторов Глу с последующей деполяризацией мембраны нейронов, нарушение мембранных ионных градиентов и приток Ca2+ в нейроны, который запускает внутриклеточные каскады, 30 приводящие к гибели клетки (Khodorov, 2004). В дальнейшем эти процессы могут привести к нейродегенерации, которая инициирует гибель нейронов по механизму апоптоза и некроза (Mironova et al., 2007; Sibarov et al., 2012). Огромное количество заболеваний является следствием цитотоксичности Глу. К ним относятся болезни Паркинсона, Альцгеймера, Гентингтона, шизофрения, судорожный синдром, включая эпилепсию, гипоксии различного происхождения (Meldrum, 1993). При гипоксии большой выход Глу за счет реверсии транспорта вызывает повышение его внеклеточной концентрации, и как следствие, генерацию деполяризации с последующей дисфункцией нейронов (Lipton, 1999). Считается, что протекание шизофрении частично связано со снижением эффективности рецепторов NMDA типа. глутаматергической Так, введение передачи за подавления неконкурентного антагониста фенциклидина, блокирующего NMDA рецепторы, приводило к возникновению симптомов этого заболевания. Было показано, что нарушения функции NMDA рецепторов коррелируют с ментальными расстройствами, наблюдаемыми у больных шизофренией (Parsons et al., 1998). Известно, что нейротоксическому действию Глу наиболее подвержены нейроны лобных долей коры мозга и гиппокампа (Khodorov, 2004). В связи с этим нейроны коры мозга крыс в первичной культуре являются удобным объектом для исследования нейротоксических механизмов, вызванных гиперактивацией рецепторов Глу. Поскольку нарушения функционирования глутаматергичеких систем участвует в патогенезе многих заболеваний ЦНС исследование эксайтотоксичности Глу является актуальной задачей не только для фундаментальной науки, но и для практической медицины. 1.4. Глутамат-индуцированная дисрегуляция кальциевого баланса клетки В настоящее время известно, что токсическое действие Глу приводит к нарушению ионного баланса клетки, который в свою очередь, инициирует 31 митохондриальную дисфункцию, приводящую к гибели нейрона (Khodorov, 2004). Было показано, что активированные рецепторы Глу открывают ассоциированные с ними ионные каналы, через которые в нейрон поступают ионы Na+ и Са2+ , а в межклеточное пространство выходят ионы К+. Вход Na+ в нейроны приводит к деполяризации мембраны и Са2+ начинает поступать в клетки через потенциалзависимые Са2+-каналы (Choi, 1985). При активации рецепторов Глу Са2+ поступает в цитоплазму также из эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и митохондрий (DiPolo, Beauge, 1988). Выход Са2+ из ЭПР, в частности, вызывается инозитолтрифосфатом (Sladeczek et al., 1985), который образуется в результате активации фосфоинозитидного обмена под влиянием взаимодействия Глу с метаботропным рецептором пятого типа (мГлуР5) (Rae et al., 2000). Существуют механизмы, поддерживающие ионный баланс и обеспечивающие быстрое и своевременное восстановление [Ca2+]i в условиях кратковременного действия Глу. Они включают в себя 3 этапа (рис.1.5): • удаление Ca2+ из нейрона Ca2+-АТФазой и Na+/Ca2+-обменником; • захват Ca2+ митохондриями и ЭПР; • захват Ca2+ в цитозоле Ca2+-связывающими белками. Ранее была возбуждающих показана взаимосвязь аминокислот и между токсическим действием накоплением внутриклеточного Ca2+ при гиперактивации рецепторов NMDA типа (Hartley et al., 1993; Eimerl, Schramm, 1994). Если в норме концентрация свободного Ca2+ в цитоплазме ниже 0,1 мкМ, то после активации рецепторов Глу нейронов концентрация этого иона может составлять 8–16 мкМ (Brustovetsky, Dubinsky, 2002). Тогда же было выявлено, что нейроны при глутаматной стимуляции накапливают Са2+ в митохондриях (Khodorov 1996; White, Reynolds, 1995). Эти органеллы в присутствии избытка фосфата могут аккумулировать 200 нМ Са2+/мг собственного белка (Nicholls, Scott, 1980). Накопление Са2+ митохондриями зависит от мембранного потенциала этих органелл, что указывает на электрогенный характер транспорта Са2+ в митохондриях. Таким образом, мембранный потенциал митохондрий может рассматриваться как фактор, вносящий вклад в регуляцию концентрации Са2+ в 32 цитоплазме нейрона, что должно наблюдаться и в условиях активации рецепторов Глу. Рисунок 1.5. Механизмы, поддерживающие ионный баланс Са2+ в нейронах. Предполагается, что развитие глутаматной токсичности непосредственно связано со способностью митохондрий депонировать Са2+ (Budd, Nicholls, 1996; Nicholls, Budd, 2000; Stout et al., 1998; Vergun et al., 2001). Учитывая тот факт, что на цитоплазматической стороне NMDA рецептора существуют участки для связывания Са2+ (Bindokas, Miller, 1995), при попадании Са2+ на эти участки происходит инактивация NMDA-каналов. Митохондрии находятся вблизи этих Са2+-связывающих центров и могут активно перехватывать эти ионы, понижая локальную концентрацию Са2+ рядом с местами связывания и, таким образом, предотвращая закрытие NMDA-канала. Захват Са2+ митохондриями не предотвращает накопление Са2+ в других участках тела нейрона в условиях активации NMDA-каналов, что ведет к Ca2+ «перегрузке» сначала цитоплазмы, а впоследствии и митохондрий. Считается, что в нормальных физиологических 33 условиях захват Са2+ митохондриями может быть необходимым условием предупреждения преждевременной инактивации NMDA-каналов (Nicholls, Budd, 2000). Высокая [Ca2+]i является обязательным условием гибели нейронов, вызванной гиперстимуляцией NMDA рецепторов, при наличии электрогенного транспорта Са2+ в митохондриях (Stout et al., 1998). Это указывает на определяющую роль митохондрий в инициации гибели нейронов при глутаматной токсичности. Видимо, именно вызванная кальциевой «перегрузкой» дисфункция митохондрий, требующая функционирования дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования, является ключевым моментом инициации гибели нейронов. Литературные данные, полученные за последнее десятилетие, позволяют схематично представить предполагаемую последовательность событий при гиперактивации рецепторов Глу, приводящей к нарушению ионного баланса нейронов (рис. 1.6). Первоначально массивный вход Са2+ и Na+ в цитоплазму нейрона вызывает митохондриальную деполяризацию (МД) за счет захвата Са2+ и его депонированием митохондриями. Вторичная МД, или отсроченная кальциевая дисрегуляция (ОКД), наступает тогда, когда уровень концентрации Са2+ в митохондрии достигает критического уровня. Затем происходит падение митохондриального мембраного потенциала (Δφmit) и открытие PT-поры, через которую осуществляется выход AIF (апоптоз индуцирующего Постепенно Са2+ накапливается в цитоплазме фактора). – происходит вторичное возрастание [Са2+]i, которое совместно с МД, супрессией Са2+/Н+-помпы на митохондриях и ингибированием Na+/Са2+-обменника, приводит к ухудшению удаления Са2+ из клетки. При этом вторичная МД также вызывает дефицит АТФ за счет гидролиза и ингибирования еѐ синтеза. В ответ на повышение [Са 2+]i и [Nа+]i Са2+-помпа и Na+/Са2+-обменник также стимулируют потребление АТФ ионными помпами. Таким образом, вторичное возрастание [Са2+]i и митохондриальная дисфункция приводят к закислению внутриклеточной среды и образованию АФК, которые индуцируют гибель нейрона (рис. 1.6) (Khodorov, 2004). 34 Рисунок 1.6. Схематичное представление предполагаемой последовательности событий при гиперактивации рецепторов глутамата, приводящей к нарушению ионного баланса нейронов 1.5. Рецепторы глутамата в периферической нервной системе Общепризнано, что Глу является основным возбуждающим медиатором в ЦНС млекопитающих (Curtis et al., 1956). Однако было показано, что Глу участвует в передаче афферентного сигнала на периферии, тем самым демонстрируя вовлеченность в работу ноцицептивных и других сенсорных проводящих путей (Carozzi et al., 2008; Collingridge et al., 2010; Kung et al., 2013). Повсеместное распространение Глу в ЦНС и ПНС затрудняет решение вопроса о 35 конкретной функции Глу, функциональной роли его рецепторов и глутаматергической передачи в различных тканях организма. Было показано, что сенсорные нейроны, участвующие в ноцицепции, могут синтезировать Глу и экспрессировать рецептор Глу (Wanaka et al., 1987; Kearst, Stephensen, 2000), и тем самым обеспечивать глутаматергическую передачу в ПНС. Активация этих нейронов приводит к высвобождению Глу в периферические и центральные терминали, тем самым участвуя в механизмах ноцицепции (deGroot et al., 2000; Basbaum et al., 2009; Kung et al., 2013). Множество исследований показали, что сома сенсорных нейронов экспрессирует ионотропные и метаботропные рецепторы Глу (Sato et al., 1993; Carlton, Hargett, 2007; Willcockson, Valtschanoff, 2008). Более того, нейроны сенсорного ганглия обладают такими ферментами, как глутаминаза, глутамин синтетаза (Miller et al., 2002; Ohara et al., 2009), везикулярным транспортером Глу (VGLUT 1, 2 и 3 типа), глутамат-аспартатным транспортером – GLAST и транспортером Глу – GLT1 (Oliveira et al., 2003; Carozzi et al., 2008; Yang et al., 2013), обеспечивающими продукцию, высвобождение и утилизацию Глу клеткой. Однако поскольку сомы сенсорных нейронов в перферических ганглиях не имеют синапсов, вопрос механизмов действия Глу в сенсорном ганглии пока остается открытым. Развитие таких неврологических заболеваний как боковой амиотрофический склероз и мигрень в первую очередь происходит в тканях ПНС, и связаны с увеличением активности глутаматеригической системы как в ПНС, так и ЦНС. В качестве модели для исследования механизмов нейродегенерации в тканях ПНС наиболее часто используют первичную культуру спиномозгового ганглия и первичную культуры нейронов тригеминального ганглия, обладающую в основном сенсорными нейронами (Malin et al., 2007). Тригеминальный ганглий ассоциирован с V ветвью черепно-мозгового нерва, расположенной в основании черепа, и входит в состав тройничного нерва. В тригеминальном ганглии заложены первые чувствительные нейроны тройничного нерва, дендриты которых образуют сам тройничный нерв, а аксоны идут к телам вторых нейронов, 36 заложенных в мозговом веществе ствола мозга. Нейроны тригеминального ганглия передают болевые ответы от тканей головы, в частности от кожи, слизистых оболочек, пульпы и оболочек головного мозга. Большинство сенсорных нейронов тригеминального ганглия являются пуринергичесими, пептидергическими и модулируются серотонином. В основном, ноцицептивные нейроны экспрессируют P2X3 рецепторы, активируемые АТФ, и капсаицин чувствительные TRPV1 рецепторы (Simonetti et al., 2006). Так же в нейронах тригеминального ганглия были выявлены рецепторы Глу NMDA типа (GluN2A, GluN2B) и метаботропные рецепторы Глу I группы (Turman et al., 2002; Lee, Ro, 2007; Willcockson, Valschanoff, 2008; Lo, Zhao, 2011). Однако роль рецепторов Глу в тканях ПНС, и в частности, в нейронах тригеминального гаглия пока остается неясной и является одним из вопросов данной работы. 1.6. Гомоцистеин, как эндогенный агонист рецепторов глутамата Гомоцистеин (2-амино-4-меркаптобутановая кислота, ГЦ) – аминокислота, в норме принимающая участие в синтезе метионина и цистеина, с последующим образованием глутатиона внутри клетки. Увеличение концентрации ГЦ в плазме крови и цереброспинальной жидкости человека называется гипергомоцистеинемия, и может быть классифицировано как умеренная (16-30 мкМ), средняя (30-100 мкМ) и сильная (>100 мкМ) гипергомоцистеинемия (Shi et al., 2002). На сегодняшний день известно, что умеренная гипергомоцистеинемия вовлечена в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний (Brattstrom, Wilcken, 2000; Ueland et al., 2000) и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона (Kuhn et al., 2001; Kruman et al., 2002; Sachdev, 2005; Boldyrev, Johnson, 2007), шизофрения (Levine et al., 2002), боковой амилотрофический склероз (Zoccolella et al., 2012). Гипергомоцистеинемия может быть вызвана дефицитом фолиевой кислоты, витаминов группы B (Stabler et al., 1988; Joosten et al., 1993; Sachdev, 2005; Ganapathy et al., 2011) или генетически 37 обусловленным полиморфизмом – точечной мутации, приводящей к замене цитозина (С) на тимин (Т) в нуклеотиде (C677T) гена 5’-10’- метилентетрагидрофолат редуктазы (Rozen 1997; Isobe, Terayama, 2010). Особенно важно, что данный полиморфизм вовлечен в патогенез мигрени с аурой (Lea et al., 2009; Oterino et al., 2010) – комплексного неврологического расстройства, развивающееся в тригеминально-сосудистой системе (ПНС) и в коре головного мозга (ЦНС) (Messlinger, 2009). В настоящее время нейротоксический эффект ГЦ интенсивно изучается в нейронах ЦНС (Sachdev, 2005; Poddar, Paul, 2013), однако механизм его действия в ПНС остается неизвестным. Сейчас общепринято, что мигрень ассоциирована с распространяющейся корковой депрессией (Гиниатуллин, 2011; Moskowitz, 2007). Обычно увеличение возбудимости мозговых тканей при мигрени с аурой обусловлено избытком Глу во внеклеточном пространстве (Pietrobon, Moskowitz, 2013). Глу, активируя ионотропные и метаботропные рецепторы, приводит к нейрональной деполяризации и потенциально к нейротоксичности. Так наиболее важными в генерации распространяющейся корковой депрессии являются NMDA рецепторы (Chavel et al., 2012). Традиционно принято считать, что NMDA рецепторы экспрессированы в нейронах ЦНС, однако исследования последних десятилетий показали, что данный тип рецепторов может быть экспрессирован и в некоторых типах нейрональных клеток ПНС (Turman et al., 2002; Lee, Ro, 2007; Willcockson, Valschanoff, 2008; Lo, Zhao, 2011). Из числа метаботропных рецепторов Глу, наиболее распространенных в клетках ЦНС считается мГлуР5 рецептор (Lee, Ro, 2007; Parpura, Verkhratsky, 2013). Научно-исследовательские результаты последних лет показали важную роль периферических NMDA рецепторов в проведении хронической боли (Zhou, Sheng, 2013). Так, избирательные антагонисты NMDA рецепторов могут применяться для подавления боли, вызванной воспалительной реакцией (Carlton, 2001). С этим также согласуются результаты нескольких исследований, которые обнаружили экспрессию NMDA и мГлуР5 рецепторов в тканях ПНС (Turman et al. 2002; Lee, Ro, 2007). Существует 38 лишь несколько электрофизиологических исследований, показавших взаимодействие ГЦ с Глу-связывающим сайтом NMDA рецептора (Lipton et al., 1997; Ganapathy et al., 2011). В связи с этим данный подтип рецепторов может быть рассмотрен в качестве потенциальной мишени для высоких концентраций ГЦ (Poddar, Paul, 2013). Другие исследования показали, что ГЦ также может взаимодействовать с I группой метаботропных глутаматных рецепторов (Shi et al., 2003; Yeganeh et al., 2013). Так же, возможно, что мГлуР5 могут быть «промотером» активации NMDA рецепторов через фосфорилирование, зависимое от PKC (Sylantyev et al., 2013). Подобное взаимодействие между этими двумя типами рецепторов Глу в клетках ПНС и ЦНС открывает широкий диапазон для исследования механизмов нейродегенеративных и неврологических состояний. Гиперактивация NMDA рецепторов часто ассоциирована с окислительным стрессом в нейронах (Tenneti et al., 1998; Reyes et al., 2012). С другой стороны, известно, что ГЦ может также инициировать окислительный стресс в некоторых экспериментальных моделях (Matte et al., 2004). Однако в эндотелиальных клетках ГЦ снижает окислительный эффект (Outien et al., 1998), а в некоторых исследованиях ГЦ проявляет восстанавливающие свойства (Perna et al., 2003; Loureiro et al., 2010). Таким образом, вопрос участия ГЦ в окислительном стрессе остается открытым и является одной из целей данной работы. 39 РАЗДЕЛ 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДИКИ 2.1. Приготовление первичных культур нейронов С целью обеспечения стерильности во время приготовления нейрональных культур все манипуляции (препарирование, приготовление необходимых растворов, посев клеток и т.д.) осуществлялись в стерильном вертикальном ламинарном шкафу (ВЛ-12, РФ). Все манипуляции с животными были выполнены в соответствии с международными стандартами и рекомендациями «Объединения специалистов по работе с лабораторными животными» (the Federation for Laboratory Animal Science Associations, Великобритания). Животных усыпляли с использованием СО2 ингаляции (Ditcher 1978; LiSmerin et al., 1996) в специальной пластиковой камере. Углекислый газ подавался в камеру в течение 1 – 2 минут. Констатация смерти производилась по отсутствию сердцебиения у крыс. После остановки сердца животного ткань продолжает жить в течение нескольких минут, поэтому важно как можно быстрее извлечь необходимые ткани и провести все операции по получению клеток коры головного мозга и клеток тригеминального ганглия крыс, иначе процент погибших нейронов среди выделенных клеток будет очень большим. Инструменты, используемые в опытах автоклавировали в настольном паровом стерилизаторе (ГК-10, РФ) при 120оС в течение 30 мин. Все среды для культивирования нейронов приготавливали в стерильных условиях. Каждый компонент среды предварительно фильтровали с помощью стерильных фильтров с диаметром поры 0,2 мкм (GyroDisc, Бельгия). Подсчет клеток производился с использованием камеры Фукса-Розенталя. Количество живых клеток оценивали с помощью теста на трипановый синий (Биолот, РФ). Раствор трипанового синего, приготовленный на физиологическом растворе, добавляли в суспензию клеток в соотношении 1:1 для получения его конечной концентрации 0,2 %. Исходя из количества живых клеток, производили необходимый подсчет объема среды для получения требуемой плотности культуры. 40 Посев клеток осуществляли на стекла (диаметром 7 предварительно обработанные поли-D-лизином (Sigma-Aldrisht, – 30 мм), США) в концентрации 0,2 мг/мл. Для выращивания культур использовали СО2-инкубатор (IG150, Jouan, Франция), поддерживающий постоянную температуру (37 оС) и содержание СО2 (5 %). Через каждые два дня ростовую среду в чашках Петри с культурами клеток заменяли на свежую. 2.1.1. Первичная культура нейронов коры головного мозга крыс Для того чтобы приготовить культуру нейронов определенного отдела головного мозга, необходима изоляция этой области на стадии эмбрионального развития, когда структура уже сформирована. Использование ранних стадий эмбрионального развития для приготовления культур нейронов приведет к тому, что культура не будет обладать структурной специфичностью, а также будет представлять собой неоднородную смесь нейронов различной химической специализации. К тому же головной мозг эмбрионов с небольшим сроком развития еще очень мал, что может создать методические трудности для выделения необходимого участка мозга и не обеспечит необходимого количества нейронов для проведения экспериментов. Именно поэтому, для получения первичной культуры нейронов коры головного мозга крыс использовали эмбрионы на 16 – 17 день пренатального развития. К этому сроку кора уже достаточно сформирована и может быть идентифицирована, однако нейроны находятся в процессе дифференцировки и обладают способностью выживать и дифференцироваться в искусственных условиях культивирования. Использование эмбрионов более поздних сроков или же новорожденных крысят сопряжено с дополнительными экспериментальными трудностями, а также с существенным понижением выживаемости клеток при их ферментативной диссоциации и культивировании. 41 Для получения животных с датированным сроком беременности использовали метод вагинальных мазков (Сахаров 1933; Кабак 1968; Эскин 1968). Лабораторные грызуны (в т.ч. крысы) относятся к полиэстральным животным. Эстральный цикл у крыс состоит из пяти последовательных стадий: проэструса, эструса, метэструса I, метэструса II и диэструса. Каждой стадии эстрального цикла соответствует определенный клеточный состав влагалищного мазка. Используя данный метод, из группы крыс линии Вистар, отбирались самки на стадии проэструса – раннего эструса и вечером этого же дня подсаживались к самцам. Утром следующего дня производили анализ микроскопического содержимого вагинальных мазков на наличие сперматозоидов. Процедура повторялась до обнаружения сперматозоидов в мазке, данный день считался первым днем беременности животного (Детлаф 1975). На 16-17 день беременности крыс помещали в специальную пластиковую камеру и усыпляли с использованием СО2 ингаляции. После извлечения эмбрионы очищали от всех оболочек и помещали в чашку Петри с раствором Хенкса. Выделенный головной мозг очищали от оболочек. Выделение коры головного мозга эмбрионов производили при низких температурах (чашку Петри с раствором Хенкса ставили на сосуд со льдом) под микроскопом МБС-9 (ЛОМО, РФ) при 10 кратном увеличении. Необходимость использования льда, а также безтеплового источника света (использовались световоды) при выделении коры эмбрионов определяется тем, что низкая температура (около 0оС) при препаровке обеспечивает максимальную выживаемость нейронов мозга. В ходе препарирования вначале удаляли мозжечок, затем одно полушарие отделялось от другого. После удаления мягкой оболочки головного мозга, хорошо видимую область дифференцирующейся коры отделяли и использовали для культивирования. Полученный материал подвергали ферментативной обработке с использованием трипсина (0,04 мг/мл; Sigma-Aldrich, США) в течение 45 мин. Для остановки ферментативного процесса и образования конгломератов клеток использовали ингибитор трипсина (0,4 мг/мл; Sigma-Aldrich, США) и ДНКазу (0,4 42 мг/мл; Sigma-Aldrich, США). Далее клетки подвергали центрифугированию в течение 5 мин со скоростью 1500 об/мин с использованием низкооборотной центрифуги (В3.11, Jouan, Франция). Надосадочная жидкость, не содержащая клетки, удалялась. Затем клетки промывали чистым раствором Хенкса. Для полной остановки ферментативных процессов и отмывки применяемых препаратов эту операцию производили трижды. Клетки культивировали в питательной среде (83 % DМЕМ с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 2,0 мМ глутамина, 5 % ростовой среды F12, 25,0 мМ Hepes; Биолот, РФ) в 35 мм чашках Петри в объѐме 2 мл при начальной плотности посева 1.3x105 кл/мл. Клетки культивировали не менее 7 дней, через каждые два дня среду в чашках Петри с культурами нейронов заменяли на свежую. 2.1.2. Первичная культура нейронов тригеминального ганглия крыс Для приготовления культуры клеток тригеминального ганглия крыс, необходима изоляция ганглия на 10 день постнатального развития, когда структура уже сформирована. Использование более ранних стадий развития для приготовления данного типа культуры приведет к тому, что культура не будет обладать необходимой структурной специфичностью. Более того, тригеминальный ганглий новорожденных и эмбрионов достаточно мал, что делает невозможным выделение данной ткани. В связи с этим, для получения первичной культуры клеток тригеминального ганглия крыс использовали крысят на 10 день постнатального развития. К этому сроку ганглий сформирован и дифференцирован, при этом клетки обладают достаточной способностью выживать в условиях культивирования. Использование более взрослых крысят сопряжено с дополнительными методическими трудностями, а также с существенным понижением выживаемости клеток при их ферментативной диссоциации и культивировании. 43 На 10-й день постнатального развития животное помещали в специальную пластиковую камеру и усыпляли с использованием СО2 ингаляции. После извлечения головного мозга тригеминальный ганглий, находящийся ниже основания мозга, очищали от менингиальной оболочки и помещали в чашку Петри с охлажденной бессывороточной ростовой средой F12 (Sigma-Aldrich, США). Полученный материал подвергали ферментативной обработке трипсином (0,5 мг/мл; Sigma-Aldrich, США), коллагеназой (1,0 мг/мл; Sigma-Aldrich, США) и ДНКазой (0.2 мг/мл; Sigma-Aldrich, США) в течение 20 мин при температуре 37оС с использованием ротацинного термостатируемого шейкера (Termomixer®, Eppendorf, Германия) со скоростью 1100 об/мин. Для остановки ферментативного процесса использовали ингибитор трипсина (2,5 мг/мл; Sigma-Aldrich, США). Далее клетки подвергали центрифугированию в течение 5 мин со скоростью 1000 об/мин с использованием низкооборотной центрифуги (В3.11, Jouan, Франция). Надосадочная жидкость, не содержащая клетки, удалялась. После подсчета клеток и их рассева, клетки тригеминального ганглия крыс культивировали в течение 3-5 дней в питательной среде (89 % F-12 (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 1 % смеси пеницилина-стрептомицина; Биолот, РФ) в 35 мм чашках Петри в объѐме 2 мл при начальной плотности посева 1.3x105 кл/мл. 2.2. Идентификация нейронов и глиальных клеток в культурах 2.2.1. Идентификация клеток в первичной культуре коры головного мозга крыс Эксперименты проводили на первичной культуре нейронов, выделенных из коры головного мозга эмбрионов крыс. Это была смешанная культура нейронов, содержащая использовался также в глиальные основном клетки. Для морфологический идентификации критерий. нейронов Большинство изолированных из мозга нейронов были пирамидными клетками коры. Их можно 44 было хорошо визуализировать с помощью метода прижизненной микроскопии с использованием фазового контраста (рис. 2.1). Это были нейроны с пирамидным соматическим участком диаметром 15–20 мкм, с хорошо выраженными отростками, разветвленными и значительно удаленными от тел клеток уже на 5 день культивирования. Кроме того, культура содержала большое количество вставочных нейронов. Рисунок 2.1. Нейроны (черные стрелки) и глиальные клетки (белые стрелки) в первичной культуре коры мозга крыс методом световой микроскопии (DIV7). Масштабная линия – 100 мкм. В культуре присутствовали глиальные клетки, которые легко можно было отличить от нейронов по размеру (более 20 мкм) и морфологическим особенностям. Одной из особенностей первичной культуры клеток коры мозга крыс является то, что глиальные клетки лежат ниже слоя нейронов, что хорошо выявляется с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии, когда фокальная плоскость сканирования достаточно узка и в зону интереса попадает лишь слой нейронов. При использовании обычной флуоресцентной микроскопии в зону регистрации попадали как нейроны, так и глиальные клетки. В 45 зависимости от экспериментальных задач в работе были использованы оба типа – конфокальная и флуоресцентная микроскопия. В процессе развития культуры отмечался рост и ветвление отростков, образование многочисленных нервных пучков и сплетений. Было обнаружено, что к 7 – 10 дню инкубации нейроны формируют полноценную нейрональную сеть, что совпадает с ранее опубликованными данными (Ichikawa et al., 1993). В связи с этим для экспериментов по изучению нейродегенеративных процессов использовалась культура нейронов коры головного мозга крыс после 7 – 10 дней развития (DIV 7 – 10) в искусственных условиях. 2.2.2. Идентификация клеток в первичной культуре тригеминального ганглия крыс Для идентификации нейронов и глиальных клеток использовался в основном морфологический критерий. Большинство изолированных из тригеминального ганглия нейронов были достаточно крупными клетками (свыше 40 мкм). Их можно было хорошо визуализировать с помощью метода прижизненной микроскопии с использованием фазового контраста (рис. 2.2). В культуре присутствовали глиальные клетки – сателлитные глиальные клетки, которые легко можно было отличить от нейронов по размеру (меньше 10 мкм) и морфологическим особенностям. В отличие от первичной культуры клеток коры мозга, в культуре клеток тригеминального ганглия крыс сателлитные глиальные клетки лежат на одном уровне с нейронами. Ко 2 дню культивирования нейроны, окруженные мелкими сателлитными глиальными клетками, формируют полноценную нейрональную сеть, что совпадает с ранее опубликованными данными (Ceruti et al., 2008). 46 Рисунок 2.2. Нейроны (черные стрелки) и сателлитные глиальные клетки (белые стрелки) в первичной культуре клеток тригеминального ганглия крыс (DIV3). Метод световой микроскопии. Масштабная линия – 100 мкм. В связи со сроками формирования нейронной сети в культуре, для экспериментов по исследованию нейродегенеративных процессов в нейронах ПНС использовали первичную культуру клеток тригеминального ганглия крыс на 3-5 день развития. 2.3. Флуориметрическая регистрация внутриклеточного Ca2+ Визуализацию внутриклеточного Са2+ в клетках первичных культур проводили с использованием флуоресцентного зонда Fluo-3 AM (Invitrogene, США), позволяющего получить относительные значения концентрации [Ca2+]i в микромолярном диапазоне. Флуорофор вводили в клетки в форме ацетоксиметилового эфира – AM (4 мкМ, 45 мин, в темноте, 23 – 25оС). Затем клетки инкубировали в темноте на протяжении 15 мин в физиологическом растворе для деэтерификации с образованием внутри клеток мембранно-непроникающего Fluo-3. 47 Для проведения флуориметрических экспериментов на инвертированном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 MP (Leica Microsystems, Германия) покровные стекла с клетками переносили в регистрационную/перфузионную камеру POCmini Chamber System (LaCon, Германия), которая помещалась на подвижный предметный столик инвертированного конфокального микроскопа. Для получения регистрации на флуоресцентном микроскопе покровные стекла с культурой клеток переносили в регистрационную/перфузионную камеру, которая помещалась на подвижном предметном столике инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus IX-70 (Olympus, Япония). Возбуждение Fluo-3 для обоих систем осуществляли светом аргонового лазера с длиной волны 488 нм. Эмиссию флуорохрома регистрировали в спектральном диапазоне 500 – 580 нм с частотой сканирования от 0,03 до 2 кадр/с, в зависимости от времени эксперимента. Полученное конфокальное изображение оцифровывали при помощи программного обеспечения Leica LAS AF (Leica Microsystems, Германия) (рис. 2.3). Для клеток, отвечающих на воздействие, строили графики зависимости интенсивности свечения от времени с использованием данного программного обеспечения. Рисунок 2.3. Пример изображений первичной культуры нейронов, полученных на конфокальном микроскопе Leica SP5. а. Изображение в проходящем свете. б. Изображение на пике флуоресценции Fluo-3. Масштабная линия – 100 мкм. 48 Изображения, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus IX-71, были оцифрованы и построены графики зависимости интенсивности свечения от времени с использованием системы TILL Photonics (TILL Photonics, Германия). 2.4. Флуориметрическое определение митохондриального мембранного потенциала Для измерения митохондриального мембранного потенциала ( mit) использовали витальный флуоресцентный краситель родамин 123 (Rho123, Invitrogene, США) (Vergun et al., 2003; Duchen 2012). Флуорофор (5 мкМ) загружался в клетки в течение 30 мин в полной темноте при комнатной температуре (23 – 25оС). Для проведения флуориметрических экспериментов с Rho123 на инвертированном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 MP , покровные стекла с клетками переносили в регистрационную/перфузионную камеру POCmini Chamber System. Возбуждение Rho123 осуществляли светом аргонового лазера с длиной волны 488 нм. Эмиссию флуорохрома регистрировали в спектральном диапазоне 500 – 560 нм. Частота сканирования составляла 0,03 кадр/с. В качестве контроля для измерения mit использовали протонофор carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP, 4 мкМ; Sigma-Aldrich, США), который приводит к полному разобщению дыхательной цепи – падению mit, вызывая тем самым максимум эмиссии Rho123 (Duchen 2012). Полученные конфокальные изображения с флуоресценцией Rho123 оцифровывали при помощи программного обеспечения Leica LAS AF, и строили графики зависимости интенсивности свечения от времени с использованием данного программного обеспечения. 49 2.5. Регистрация токов нейронов методом локальной фиксации потенциала ( Патч-кламп регистрацию токов проводили в конфигурации «целая клетка» (Hamill et al., 1981) на нейронах с 10 по 16 день культивирования (10-16 days in vitro, DIV). В опытах использовали внеклеточный перфузионный раствор следующего состава (концентрации указаны в мМ): NaCl, 140; KCl, 2.8; CaCl2, 2.0; MgCl2, 1.0; HEPES 10, при pH 7.2–7.4. Во всех экспериментах для измерения токов из раствора был исключен Mg2+. Кроме того, в безмагниевом растворе выполнены все эксперименты с использованием блокаторов NMDA рецепторов. Внутриклеточный раствор для заполнения микроэлектрода имел следующий состав (мМ): 9 NaCl, 17.5 KCl, 121.5 K-глюконат, 1 MgСl2, 10 HEPES, 0.2 EGTA, 2 MgATP, 0.5 NaGTP (Han, Stevens, 2009). Патч-пипетки для регистрации были вытянуты из боросиликатного стекла с внешним диаметром 1,5 мм и внутренним филаментом (Sutter Instrument #BF150-86-10, Sutter Instruments Company, США). Для регистрации токов применяли усилитель MultiClamp 700B c системой сбора данных Digidata 1440A и программное обеспечение pClamp v10.2 (Molecular Devices, США). Частота дискретизации составляла 20000 изм/с с предварительной аналоговой фильтрацией (эквивалент фильтра Бесселя 8 порядка) с частотой среза 1.4 кГц для удаления высокочастотных шумов. Позиционирование кончика микроэлектрода выполняли микроманипулятором MP-85 (Sutter Instruments Company, США) под визуальным контролем на инвертированном микроскопе Nikon Diaphot TMD (Nikon, Япония). Для аппликации тестовых веществ использовали систему быстрой смены растворов на базе BPS-4 (Ala Scientific Instruments, США). Регистрацию токов, вызванных агонистами, а также анализ их частоты выполняли в программе Clampfit 10.2, входящей в пакет pClamp. 50 2.6. Определение апоптотических и некротических клеток путем последовательного окрашивания акрединовым оранжевым и бромистым этидием Для определения погибших нейронов методом конфокальной микроскопии использовались флуорохромы акридиновый оранжевый (АО) (0,001%) и бромистый этидий (БЭ) (0,001%). Поскольку апоптоз может запускаться при нормальном развитии нейронов в культуре, необходимо было учитывать его вклад в сравнении с экспериментально вызванным апоптозом. Полученные статистические данные показали, что процент апоптотических клеток в интактной культуре был незначителен и соответствовал нормальным физиологическим условиям (Simonetti et al., 2006; Mironova et al., 2007), поэтому в дальнейшем его вклад не учитывался. Для определения соотношения живых, апоптотических и некротических клеток покровные стекла с культурой клеток обрабатывали АО в течение 20 с, после чего АО отмывали физиологическим раствором. После отмывки АО культуру обрабатывали БЭ в течение того же периода времени. Непосредственно перед регистрацией флуоресценции методом конфокальной микроскопии производилась тщательная отмывка препарата физиологическим раствором для предотвращения фоновой флуоресценции за счет остаточной концентрации флуорохромов в растворе. Для проведения измерения флуоресценции АО и БЭ окрашенные покровные стекла с клетками переносили в регистрационную/перфузионную камеру, которая помещалась на подвижный предметный столик инвертированного конфокального микроскопа Leica TCS SP5 MP. Возбуждение флуорохрома проводили аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Эмиссию АО регистрировали в зеленой области спектра (максимум излучения приходится на 530 нм), а БЭ в красной области (максимум излучения приходится на 620 нм). Регистрация изображения осуществлялась двумя независимыми каналами конфокального микроскопа. Результирующее изображение получали путем наложения двух изображений, зарегистрированных в разных (зеленой и красной) областях спектра с помощью программного обеспечения Leica LAS AF. Ядра 51 нейронов, у которых имеется деструкция плазматической мембраны, окрашивались БЭ и излучали красный свет. Ядра живых нейронов окрашивались АО и светились зеленым цветом, а ядра апоптотических нейронов светились желто-оранжевым цветом, вследствие закисления внутриклеточной среды и изменения спектра эмиссии АО (Zelenin 1996). Подсчет соотношения количества живых апоптотических и некротических клеток проводили с помощью плагина http://sibarov.ru/index.php?slab (http://rsbweb.nih.gov/ij/), (Sibarov который et проводит al., 2012) подсчет для количества ImageJ пикселей зеленого, желтого и красного цвета с каждого изображения. 2.7. Порядок проведения экспериментов Эксперименты на клетках первичной культуры коры мозга крыс, проводили на 7 – 10 день in vitro (DIV). В опытах с нейронами коры мозга использовали физиологический раствор следующего состава: 140 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, pH = 7.2 – 7.4. Эксперименты на клетках первичной культуры тригеминального ганглия крыс, проводили на 3 – 5 день in vitro (DIV). В опытах с нейронами тригеминального ганглия использовали физиологический раствор следующего состава: 152 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 10 мМ глюкоза, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ Mg Cl2, pH = 7.2 – 7.4. Различия в составах физиологических растворов для первичных культур клеток обусловлены различными физиологическими условиями существования тканей в организме млекопитающих. После загрузки флуорохромов в клетки покровное стекло с культурой клеток для проведения опытов фиксировали в регистрационной/перфузионной камере, которую помещали на предметный столик сканирующего конфокального микроскопа или на столик флуоресцентного микроскопа. Камеру подключали к системе общей и быстрой локальной перфузии. На протяжении всего эксперимента (10 – 90 мин) клетки перфузировали с помощью общей перфузии 52 физиологическим раствором со скоростью 1 мл/мин. Действующие вещества апплицировались на клетки с помощью быстрой локальной перфузии с аналогичной скоростью. Полное замещение раствора вокруг нейронов происходило менее чем за 1 сек. Так как в нейронах внеклеточный Mg2+ блокирует каналы NMDA рецептора, в опытах c NMDA использовали физиологический раствор, не содержащий Mg2+. Для индукции нейротоксического стресса были выбраны насыщающие концентрации агонистов рецепторов Глу, представленные в таблице 2.1. При аппликации NMDA и ГЦ всегда добавляли аминокислоту Гли – ко-агонист NMDA рецепторов в концентрации, присутствующей в ростовой среде (100 мкМ). Действующие вещества Концентрация, мкМ NMDA 30 KA 30 D,L-гомоцистеин (ГЦ) 100 или 500 Глутамат 300 Глицин (ко-агонист NMDA рецептора) 30 или 100 αβАТФ 10 Капсаицин 0,2 KCl 50×103 MTEP 10 AP-5 50 Ифенпродил 10 ИЭМ-1460 3 Таблица 2.1 Концентрации различных агонистов и антагонистов, используемыеx в экспериментах. 53 Для анализа долговременного действия высоких концентраций ГЦ клетки в первичной культуре коры мозга и тригеминального ганглия крыс инкубировали в течение 5 или 24 часов в ростовой среде (контрольные условия) или ростовой среде, содержащей 100 или 500 мкМ D,L–ГЦ (важно, что только L-форма ГЦ является биологически активной, поэтому действующая концентрация вещества вдвое меньше апплицируемой) и в комбинации с 50 мкМ L-AP-5 или 10 мкМ MTEP (3-((2-метил-4-тиазолил)этинил)пиридин). Ростовая среда для первичных культур клеток содержит в своем составе 100 мкМ Гли. В связи с этим, в экспериментах по исследованию Са2+ ответов и mit ГЦ всегда апплицировали совместно с 100 мкМ глицина, как ко-агониста NMDA рецепторов. Регистрацию флуоресценции проводили с помощью сканирующего конфокального инвертированного микроскопа Leica SP5 MF с иммерсионными объективами HCX APO 20х/0,70 и 63х/1,44 (Leica Microsystems, Германия), оснащенного медленной перфузией, обеспеченной перистальтическим насосом (LongerPump BT100-1L, Loading Longer Precision Pump Co. Ltd, Китай) и быстрой локальной перфузией собственной сборки (ИЭФБ РАН). Регистрацию флуоресценции на инвертированном микроскопе Olympus IX71 с объективом 10x/0,30 (Olympus, Япония) и с системой TILL Photonics, проводили с использованием медленной и быстрой локальной перфузионной системы Rapid Solution Changer RSC-200 (BioLogic Science Instruments, Франция). Полученные изображения были оцифрованы с использованием программного обеспечения Leica LAS AF и Till Photonics, соответственно. 2.8. Обработка данных Полученные данные подвергались статистической обработке с использованием компьютерных программ МS Excel, Origin 6.1, SigmaPlot 8 и GraphPad Prizm 5. При установлении достоверности различий данных использовали t-критерий Стьюдента и U-критерий Манна-Уитни (ANOVA). На 54 рисунках каждая из точек, отложенных на графике, является средним ± стандартная ошибка, определенная по 4 – 10 опытам. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Исследование состава рецепторов глутамата, обеспечивающих вход Ca2+ при действии агонистов рецепторов Глу в нейронах первичной культуры коры мозга крыс 3.1.1. Внутриклеточные Са2+ ответы и токи в нейронах при действии агонистов рецепторов глутамата NMDA и АМПА/KA типа Была проведена серия экспериментов с использованием флуоресцентного зонда Fluo-3 с целью определения динамики внутриклеточного Са2+ сигнала при действии избирательных агонистов рецепторов глутамата: NMDA и КА. Ранее в экспериментах с использованием рациометрического красителя Fura-2 AM было показано, что концентрация внутриклеточного Са 2+ в нейронах коры мозга в контрольных условиях составляет около 50 нМ (Abushik et al., 2013), что соответствует нормальным физиологическим параметрам. При этом увеличение интенсивности свечения Fura-2 прямопропорционально увеличению интенсивности свечения Fluo-3 (Abushik et al., 2013). В связи с этим, при анализе Са2+ ответов в нейронах с помощью Fluo-3 можно говорить об относительном увеличении внутриклеточной концентрации. Результат экспериментов представлен на рис. 3.1. Динамики нарастания интенсивности флуоресценции при действии 30 мкМ NMDA и 30 мкМ КА существенно различались. При аппликации NMDA нейроны отвечали резким повышением интенсивности флуоресценции, которое являлось результатом увеличения [Cа2+]i. Достигнув максимума, интенсивность флуоресценции оставалась на стационарном уровне, что вероятно отражало вход свободного Са2+ в нейроны (рис. 3.1.а). В присутствии КА, в отличие от NMDA, динамика роста флуоресцентного Са2+ сигнала значительно варьировала: в отдельных нейронах наблюдалось резкое повышение, сходное по кинетике с NMDA, а в большинстве нейронов происходило медленное градуальное нарастание флуоресценции, достигавшее максимума после 30 мин воздействия КА (рис. 3.1.б). 56 Очевидно, что внутриклеточный Ca2+ сигнал при активации АМПА/KA рецепторов развивается медленно, но после ≈30 мин достигает средней величины интенсивности флуоресценции, полученной при активации NMDA рецепторов. Для обоих агонистов рецепторов Глу после 40 мин проявляется ОКД, которая при использовании Fluo-3 выглядит, как резкое увеличение интенсивности свечения, достигающее насыщения (рис. 3.1.б). Это связано с низкой константой диссоциации Fluo-3 AM для Ca2+ (325 нМ). Рисунок 3.1. Сопоставление динамики внутриклеточных Ca2+ ответов и токов в нейронах при длительном действии 30 мкМ NMDA и 30 мкМ КА с использованием Fluo-3. (а) Динамика увеличения интенсивности флуоресценции Са2+ в нейронах при действии 30 мкМ NMDA. (б) Динамика увеличения интенсивности флуоресценции Са2+ в нейронах при действии 30 мкМ КА. Для всех частей рисунка ось ординат – относительная интенсивность свечения (за 1 принято свечение в контроле). Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са2+ ответ одного нейрона. (в) Ток в нейроне первичной культуры коры мозга крыс, демонстрирующий ответ на 30 мкМ NMDA при мембранном потенциале -70 мВ. (г) 57 Ток, демонстрирующий ответ нейрона на аппликацию 30 мкМ КА при мембранном потенциале -70 мВ. Момент аппликации и длительность действия NMDA и KA показаны линией над графиками. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов 4 – 5. При регистрации постсинаптических токов методом локальной фиксации потенциала в конфигурации «целая клетка» было выявлено, что время нарастания входящего тока при действии 30 мкм NMDA или 30 мкМ КА быстро достигает своего максимума и остается на неизменном уровне на протяжении всего времени действия агонистов (рис. 3.1.в и рис.3.1.г). Для обоих агонистов время нарастания входящего тока соответствует времени, необходимому агонисту для достижения насыщающей концентрации в регистрационной камере. 3.1.2. Зависимость внутриклеточных Са2+ ответов нейронов от Са2+ внеклеточного раствора Известно, что высокая проницаемость каналов NMDA рецепторов обеспечивает вход Ca2+ снаружи в нейроны и запуск ОКД (Jones, Westbrook, 1996; Евстратова и др., 2008; Burnashev et al., 1995). Удаление Ca2+ из физиологического раствора до ОКД приводит к исчезновению Ca2+ сигнала даже в присутствии Глу или NMDA (Евстратова и др., 2008; Burnashev et al., 1995; Khodorov 2004). В связи с различием динамики внутриклеточного Ca2+ ответа при действии NMDA и КА возникает вопрос о происхождении Ca2+ (из наружного раствора или из внутриклеточных депо) и путях его доставки в цитозоль нейронов при активации АМПА рецепторов. В экспериментах с Fluo-3 аппликация NMDA (рис. 3.2.а) и КА (рис. 3.2.б) в бескальциевом физиологическом растворе на время от 25 до 40 мин не сопровождалась увеличением интенсивности флуоресценции в нейронах, а добавление наружного Ca2+ запускало внутриклеточный Ca2+. Перфузия физиологическим раствором, содержащим 2 мМ Са2+, вызывала резкое повышение [Ca2+]i. Результаты экспериментов демонстрируют, что как и в 58 случае NMDA рецепторов, источником повышения [Ca2+]i в нейронах при активации АМПА/КА рецепторов Глу является внеклеточный Ca2+. Рисунок 3.2. Зависимость внутриклеточного Ca2+ сигнала в нейронах от наличия Ca2+ в физиологическом растворе при длительном действии 30 мкМ NMDA и 30 мкМ КА, с использованием Fluo-3. (а) Динамика увеличения интенсивности флуоресценции Fluo-3 в нейронах при действии 30 мкМ NMDA в бескальциевом физиологическом растворе и в физиологическом растворе, содержащем 2 мМ Ca2+. (б) Динамика увеличения интенсивности флуоресценции Fluo-3 в нейронах при действии 30 мкМ KA в бескальциевом физиологическом растворе и в физиологическом растворе, содержащем 2 мМ Ca2+. Для всех частей рисунка ось ординат – относительная интенсивность свечения (за 1 принято свечение в контроле). Момент аппликации и длительность действия NMDA, KA и Ca2+ показаны линией над графиками. Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са2+ ответ одного нейрона. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов – 3. 3.1.3. Вклад NMDA рецепторов различного субъединичного состава в генерацию внутриклеточного Са2+ сигнала Для исследования субъединичного состава NMDA рецепторов, экспрессированных в нейронах первичной культуры клеток коры мозга крыс, использовали аллостерический ингибитор ифенпродил (10 мкМ), который избирательно связывается с внеклеточным доменом GluN2B субъединицы, 59 снижая вероятность открытия канала NMDA рецептора (Williams 1993; Whittemore et al., 1997; Traynelis et al., 2010). Ифенпродил (10 мкМ), апплицированный на фоне действия 30 мкМ NMDA, снижал [Ca2+]i до 10 % от контрольных значений (рис. 3.3.а). В случае, когда блокатор подавался совместно с NMDA, ифенпродил также предотвращал рост внутриклеточного Ca2+ до момента отмывки ингибитора (рис. 3.3.б). Рисунок 3.3. Блокирование внутриклеточных Са2+ ответов нейронов первичной культуры коры мозга крыс избирательным аллостерическим ингибитором GluN2B субъединицы NMDA рецептора – ифенпродилом при действии 30 мкМ NMDA, с использованием Fluo-3. (а) Динамика интенсивности флуоресценции Fluo-3 в нейронах при действии 30 мкМ NMDA и последующей аппликацией 10 мкМ ифенпродила. (б) Динамика интенсивности флуоресценции Fluo-3 в нейронах при сочетанном действии 30 мкМ NMDA и 10 мкМ ифенпродила с его последующей отмывкой. Для всех частей рисунка ось ординат – относительная интенсивность свечения (за 1 принято свечение в контроле). Момент аппликации и длительность действия NMDA и ифенпродила показаны жирной линией над графиками. Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са2+ ответ одного нейрона. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов – 3. Оба эксперимента ясно демонстрируют, что большинство нейронов первичной культуры клеток коры мозга крыс экспрессируют NMDA рецепторы 60 GluN1/GluN2B субъединичного состава, что согласуется с ранее опубликованными данными по анализу мРНК (Kiss et al., 2012). 3.1.4. Вклад АМПА рецепторов различного субъединичного сстава в генерацию внутриклеточного Са2+ сигнала и интегральных токов Известно, что проницаемость каналов АМПА рецепторов для Ca2+ и эффективность блокады каналоблокаторами определяется наличием в их структуре GluA2 – субъединицы (Burnashev et al., 1992). При ее отсутствии канал обладает проницаемостью для Ca2+ и хорошо блокируется. Например, ЕД50 блокады каналов АМПА рецепторов, не содержащих GluA2, для ИЭМ-1460 составляет примерно 1 мкМ (Magazanik et al., 1997), а для АМПА рецепторов, имеющих в составе GluA2, эта величина на порядки больше (Antonov et al., 1995; Antonov, Johnson 1996; Magazanik et al., 1997). Мы использовали ИЭМ-1460 для выявления роли Ca2+-проницаемых АМПА рецепторов, в генерации Са2+ ответов при действии КА. Hейроны по типу Са2+ ответов на ИЭМ-1460 разделились на три группы примерно равные группы (рис. 3.4.1): 1) сочетанная аппликация КА и ИЭМ-1460 вызывала кратковременное повышение [Ca2+]i, которое затем, по-видимому, блокировалось; отмывка ИЭМ1460 приводила к значительному увеличению [Ca2+]i (рис. 3.4.1, выделены зеленым цветом); 2) сочетанная аппликация КА и ИЭМ-1460 вызывала повышение [Ca2+]i, сопровождавшееся Ca2+ осцилляциями; отмывка ИЭМ-1460 не приводила к каким-либо изменениям (рис. 3.1.4.1, выделены синим цветом); 3) сочетанная аппликация КА и ИЭМ-1460 вызывала повышение [Ca2+]i, сопровождавшееся существенными Ca2+ осцилляциями, отмывка ИЭМ-1460 приводила к значительному увеличению [Ca2+]i (рис. 3.4.1, выделены красным цветом). 61 Рисунок 3.4.1. Три типа внутриклеточных Ca2+ ответов в нейронах на сочетанную аппликацию 30 мкМ KA и 3 мкМ ИЭМ-1460. Представлены данные из одного опыта. На (а) каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са 2+-ответ одного нейрона. Подробное описание типов ответов дано в тексте. Для всех частей рисунка ось ординат – относительная интенсивность свечения (за 1 принято свечение в контроле). Линии над графиками показывают момент аппликации KA и ИЭМ-1460. В части (б) рисунка находятся три флуоресцентных изображения нейронов, зарегистрированных в моменты, отмеченные пунктирными линиями над соответствующими регистрациями. Масштабная линия – 100 мкм. На изображениях кружками отмечены тела нейронов, Са2+ ответ которых анализировали в эксперименте. «Контроль» - флуоресцентное изображение после 5 минут инкубирования нейронов в физиологическом растворе; «ИЭМ-1460 + КА» – флуоресцентное изображение на 17 минуте эксперимента в момент действия 3 мкМ ИЭМ-1460 и 30 мкМ КА; «КА» – флуоресцентное изображение на 57 минуте эксперимента в момент действия 30 мкМ КА. Число опытов – 3. 62 В дальнейшем, при анализе токов в нейронах коры мозга, вызванных действием 30 мкМ КА совместно с 3 мкМ ИЭМ-1460, были выявлены различия в степени блокирования ИЭМ-1460 КА-вызванных токов в различных клетках (рис. 3.4.2). В некоторых нейронах, 3 мкМ ИЭМ-1460 не блокировал входящий ток через АМПА рецепторы (рис. 3.4.2.а), в другой группе клеток антагонист оказывал не большой блокирующий эффект - ингибирование на 8 % ) (рис. 3.4.2.б). В части нейронов 3 мкМ ИЭМ-1460 вызвало сильное блокирование входящего тока (60 – 85 % ингибирования) через АМПА рецепторы (рис. 3.4.2.в и рис. 3.4.2.г). Всего проанализировано 24 нейрона. Полученные данные согласуются с экспериментами по анализу внутриклеточных Са2+ ответов в присутствии ИЭМ-1460, и могут быть объяснены гетерогенностью нейронов в культуре в отношении GluA2 содержащих и несодержащих АМПА рецепторов. Рисунок 3.4.2. Токи в различных нейронах коры мозга, вызванные активацией АМПА рецепторов 30 мкМ КА в контроле и совместно с 3 мкМ ИЭМ-1460 при мембранном 63 потенциале -70 мВ. (а) КА-вызванный входящий ток в нейроне нечувствительном к ИЭМ-1460. (б) КА-вызванный входящий ток в нейроне умеренно (8 %) блокируемый 3 мкМ ИЭМ-1460. (в) КА-вызванный входящий ток в нейроне, блокируемый (на 60 %) 3 мкМ ИЭМ-1460. (г) КАвызванный входящий ток в кортикальном нейроне, сильно блокируемый (на 85 %) 3 мкМ ИЭМ1460. Линии над графиками показывают момент и длительность аппликации KA и ИЭМ-1460. Число зарегичтрированных нейронов – 24. Таким образом, вариабельность Са2+ ответов, вызванных активаций АМПА рецепторов, определяется не только различными механизмами Са2+ входа, но и отражает гетерогенность популяции нейронов первичной культуры коры мозга крыс в отношении экспрессии Са2+-проницаемых и непроницаемых АМПА рецепторов. 3.2. Исследование нейротоксического эффекта гомоцистеина на нейроны первичной культуры коры могза крыс 3.2.1. Нейротоксический эффект долговременного действия гомоцистеина Ранее в лаборатории ИЭФБ РАН было показано, что Глу в концентрации свыше 300 мкМ, селективные агонисты NMDA и АМПА/KA рецептров глутамата – NMDA (30 мкМ, совместно с ко-агонистом NMDA рецепторов 30 мкМ глицина) и КА, соответственно после 240 минут действия вызывают гибель более 60 % нейронов по механизму апоптоза и некроза в первичной культуре клеток коры мозга крыс (Mironova et al., 2007; Sibarov et al., 2012). В связи с этим, было интересно исследовать долговременное действие ГЦ, как возможного эндогенного агониста рецепторов Глу, в патологических концентрациях 100 и 500 мкМ на клетки первичной культуры коры мозга крыс. В результате определения количества погибших нейронов методом конфокальной микроскопии с использованием АО и БЭ (Mironova et al., 2007) было выявлено, что 100 мкМ ГЦ после 24 часов действия в ростовой среде 64 первичной культуры клеток коры мозга крыс оказывает нейротоксическое действие (рис. 3.5.а). Так было показано, что процент живых нейронов после действия 100 мкМ ГЦ составил 50 ± 3 % (рис. 3.5), а 500 мкМ ГЦ снижало процент живых нейронов до 26 ± 3 % (рис.3.5.б ). Рисунок 3.5. Нейротоксическое действие гомоцистеина (ГЦ) на нейроны первичной культуры коры мозга крыс. (а) Флуоресцентное изображение нейронов в первичной культуре к коры мозга крыс после 24 часов в контрольных условиях («контроль») и после действия 100 мкМ ГЦ, полученное с помощью окрашивания АО и БЭ. Масштабная линейка 100 мкм. (б) Гистограмма процента живых клеток после 24 ч действия в контроле, после действия только 100 мкМ или 500 мкМ ГЦ, или 100 мкМ ГЦ совместно с 50 мкМ AP-5 или 10 мкМ MTEP. Представлены данные со стандартной ошибкой (* - p<0.05 , ** - p <0.01) по 3-5 экспериментам. Интересно, что аппликация 100 мкМ ГЦ совместно с избирательным антагонистом NMDA рецепторов – AP-5 (50 мкМ) не вызывала гибели нейронов, а процент живых клеток составил 63 ± 2 % и достоверно не отличался от значений, полученных в контроле (p>0,05, количество опытов – 5) (рис.3.5.б). Более того, MTEP – избирательный блокатор мГлуР5, так же предотвращал гибель нейронов. Процент живых клеток составил 62 ± 2 % и также достоверно не отличался от значений, полученных в контроле (p>0,05, количество опытов – 5) рис.3.5.б). 65 Таким образом, нами впервые было выявлено, что нейротоксичность ГЦ в нейронах первичной культуры коры мозга крыс реализуется через ионотропный рецептор глутамата NMDA и мГлуР5 типа. 3.2.2. Внутриклеточные Са2+ ответы при кратковременном и долговременном действии гомоцистеина Поскольку было обнаружено, что ГЦ после 24 часов действия в концентрации 100 мкМ и выше оказывает нейротоксический эффект на нейроны коры мозга крыс, было интересно исследовать внутриклеточные Са2+ответы, вызванные кратковременной (2 мин) аппликацией 100 мкМ ГЦ. Полученные результаты представлены на рис. 3.6. В качестве маркера нейрона после аппликации ГЦ на клетку подавали 50 мкМ KCl, вызывающего открытие Са2+ каналов через деполяризацию, которая характерна для возбудимых тканей, к которым относятся нейроны (Simonetti et al., 2006). Кратковременная аппликация 100 мкМ ГЦ вызывала Са2+ ответы осцилляторного типа (рис. 3.6.а), отличного от ответов, вызванных NMDA или КА, в 80 % нейронов (рис. 3.6.б). Интересно, что сочетанная аппликация 100 мкМ ГЦ совместно с 50 мкМ AP-5 или 10 мкМ MTEP снижала количество клеток, дающих Са2+ ответ с 80 ± 3 % до 39 ± 5 % в случае AP-5 и до 39 ± 6 % в случаем MTEP. Долговременное действие (60 мин) 100 мкМ ГЦ вызывало Ca2+ответы (рис. 3.6.в), сходные по динамике с ответами на NMDA и KA при их долговременном действии. Интересно, что аппликация ГЦ совместно с AP-5 или MTEP не полностью снижала количество нейронов, дающих Ca2+ ответ. Только сочетанная аппликация ГЦ совместно с 50 мкм AP-5 и 10 мкМ MTEP полностью предотвращала увеличение [Са2+]i. 66 Рисунок 3.6. Внутриклеточные Са2+ ответы, вызванные кратковременным и долговременным действием 100 мкМ гомоистеина (ГЦ) на нейроны коры мозга крыс. (а) Са2+ ответ одиночного нейрона, вызванный аппликацией 100 мкМ ГЦ на 2 мин. 50 мкМ KCl использованы в качестве маркера нейрона. Ось ординат – относительная интенсивность свечения Fluo-3 (за 1 принято свечение в контроле). Момент аппликации и длительность действия ГЦ и KCl показаны жирной линией над графиком. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов – 4. (б) Процентное соотношение нейронов, дающих Са2+ ответ на кратковременную аппликацию (2 мин) 100 мкМ ГЦ одного, или в комбинации с 50 мкМ AP-5 или 10 мкМ MTEP. Представлены данные со стандартной ошибкой (* - p<0.05 , ** - p <0.01) по 3-5 экспериментам. (в) Са2+ ответы нейронов, вызванные долговременной (50 мин) аппликацией 100 мкМ ГЦ. Ось ординат – относительная интенсивность свечения Fluo-3 (за 1 принято свечение в контроле). Момент аппликации и длительность действия ГЦ показаны линией над графиком. Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са2+ ответ одного нейрона. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов – 3. Полученные данные на культуре нейронов коры мозга крыс показали, что ГЦ в высоких концентрациях может оказывать нейротоксический эффект, который предотвращается избирательными антагонистами рецепторов NMDAтипа и мГлуР5 типа – AP-5 и MTEP, соответственно. Важно, что аналогично действию Глу, нейротоксическое действие ГЦ запускается чрезмерным входом Са2+ через ионотропные рецепторы глутамата NMDA типа и выход Са2+ из внутриклеточных депо, активируемых метаботропным рецептором глутамата мГлуР5 типа (Nanou et al., 2009). 67 3.2.3. Интегральные токи, вызванные гомоцистеином Для выявления кинетики входящих токов при быстрой аппликации 100 мкМ гомоцистеина на нейронах коры мозга была проведена серия экспериментов, в которой исследовали природу входящих токов, активируемых ГЦ и сопоставляли кинетику ответов с ответами на NMDA методом локальной фиксации потенциала (patch-clamp) в конфигурации «целая клетка». 100 мкМ ГЦ, как и 30 мкМ NMDA (оба агониста апплицировались со 100 мкМ Гли) в части нейронов вызывали интегральные входящие токи одинаковой амплитуды (рис. 3.7.а). Ток, вызванный NMDA быстро достигает стационарного уровня (плато). При этом ток, вызванный аппликацией ГЦ достигал стационарного уровня медленнее, а его амплитуда на уровне плато была меньше, чем у тока вызванного NMDA. Возможно, это связано с различной аффиностью агонистов к рецепторам и отражает разную кинетику десенситизации. Кратковременная аппликация 50 мкМ AP-5 на фоне действия 100 мкМ ГЦ (совместно с 100 мкМ Гли) вызывала практически полное блокирование интегрального тока (рис.3.7.б), подтверждая ранее полученные результаты, что в механизм действие ГЦ, в большей степени вовлечены рецепторы глутамата NMDA типа. Интересно, что 10 мкМ ифенпродила, избирательного агониста GluN2B субъединицы NMDA рецептора, не влияло на интегральный входящий ток, указывая, что в ГЦ активирует NMDA рецепторы, не содержащие GluN2B субъединицу. Дополнительные эксперименты с антагонистом АМПА рецепторов - CNQX, не представленные в работе, исключили вовлеченность АМПА рецепторов нейронов коры в эффект действия гомоцистеина, так как CNQX не вызывал блокады интегрального тока. Для выявления роли мГлуР5 рецепторов в генерации входящих интегральных токов совместно с 100 мкМ ГЦ на нейроны коры мозга апплицировали 10 мкМ MTEP (рис. 3.7.в). В большинстве нейронов избирательный антагонист мГлуР5 не вызывал блокирования входящего тока. 68 Тем самым, указывая на малый вклад мГлуР5 рецепторов в генерацию входящих токов при действии 100 мкМ ГЦ. Рисунок 3.7. Входящие интегральные токи, вызванные гомоцистеном (ГЦ) в нейронах коры мозга крыс при мембранном потенциале -70 мВ. (а) Интегральные токи, вызванные 30 мкМ NMDA (выделенный черным цветом) и 100 мкМ ГЦ (выделеный зеленым цветом), в присутствии ко-агониста глицина. (б) Интегральный ток, вызванный 100 мкМ ГЦ в присутствии 50 мкМ AP-5, 10 мкМ ифенпродила не блокировало входящий ток. (в) Интегральный ток, вызванный 100 мкМ ГЦ и сочетанной аппликацией ГЦ с 10 мкМ MTEP. Представлены данные из одного эксперимента. Число клеток – 57. Таким образом, данные результаты продемонстрировали, что в первую очередь в механизм действия ГЦ вовлечены рецепторы глутамата NMDA типа, не содержащие GluN2B субъединицу. 69 3.3. Исследование нейротоксического эффекта гомоцистеина на нейроны первичной культуры тригеминального ганглия крыс Нейротоксическое действие Глу достаточно хорошо и подробно изучено на различных структурах ЦНС, однако известно, что большинство нейродегенеративных и неврологических состояний развивается не только в головном мозге, но и в ПНС. В связи с этим, в качестве модели ПНС мы использовали первичную культуру нейронов тригеминального ганглия крыс, который находится за пределами ЦНС, но при этом анатомически наиболее приближен к головному мозгу крыс. Тригеминальный ганглий крыс, являющийся частью ноцицептивной системы млекопитающих, имеет в своем составе пептидергические, пуринергические нейроны и нейроны смешанного типа (Simonetti et al., 2006), которые экспрессируют на мембране P2X3 и/или TRPV1 рецепторы, участвующие в ноцицепции. 3.3.1. Внутриклеточные Са2+ ответы при действии гомоцистеина Были проанализированы Са2+ ответы нейронов тройничного ганглия крыс. Кратковременная аппликация (2 мин) 100 мкМ ГЦ совместно с 100 мкМ Гли вызывала Ca2+ ответы трех типов в нейронах тройничного ганглия (рис. 3.8.а): 32 % клеток давали быстрый одиночный ответ (красный), 44 % клеток давали осцилляторный ответ (синий) и 23 % давали нарастающий ответ (зеленый). Интересно, что в отличие от нейронов коры мозга крыс, где на ГЦ отвечали 80 ± 3 % нейронов (рис. 3.8.б), в первичной культуре тригеминального ганглия крыс на кратковременную аппликацию 100 мкМ ГЦ отвечали 63 ± 6 % нейронов (рис. 3.8.б). Однако как в случае с нейронами коры мозга крыс, сочетанная аппликация 100 мкМ ГЦ совместно с 50 мкМ AP-5, блокирующими NMDA 70 рецепторы, снижала количество нейронов, отвечающих увеличением [Са 2+]i, до 22 ± 4 % (рис. 3.8.б). В подтверждение гипотезы, что ГЦ активирует NMDA рецепторы, были проведены дополнительные эксперименты по аппликации 100 мкМ ГЦ в отсутствии ко-агониста NMDA рецептора – глицина. Количество нейронов, дающих Са2+ ответ на кратковременное действие 100 мкМ ГЦ в отсутствии Гли, было значительно меньше и составило 41 ± 5 % против 63 ± 6 % (в присутствии Гли). Сочетанная аппликация 100 мкМ ГЦ и 10 мкМ MTEP также снижала процентное количество нейронов, отвечающих увеличением [Ca2+]i до 21 ± 4 %. Это так же подтверждает полученные ранее данные, что помимо ионотропных рецепторов Глу NMDA типа ГЦ активирует мГлуР5. Рисунок 3.8. Внутриклеточные Са2+ ответы на кратковременную аппликацию 100 мкМ гомоцистеина (ГЦ) нейронов тригеминального ганглия крыс. (а) Три типа Са2+ ответов 71 нейронов на действие 100 мкМ ГЦ в течение 2 мин: быстрый одиночный ответ (красный), осцилляторный ответ (синий) и нарастающий ответ (зеленый). Момент аппликации и длительность действия ГЦ, 10 мкМ αβАТФ, 200 нМ капсаицина и 50 мМ KCl показаны линиями над графиками. Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са2+ ответ одного нейрона. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов – 5. (б) процентное соотношение нейронов, генерирующих Са2+ ответ на кратковременную аппликацию (2 мин) 100 мкМ ГЦ одного, или в комбинации с 50 мкМ AP-5 или 10 мкМ MTEP. Представлены данные со стандартной ошибкой (* - p<0.05 , ** - p <0.01) по 5 экспериментам. (в) Круговая гистограмма фенотипа нейронов, дающих Са2+ ответ на кратковременную аппликацию (2 мин) 100 мкМ ГЦ. Нейроны, экспрессирующие P2X3 рецепторы (отвечают на αβАТФ; синий и фиолетовый), нейроны, экспрессирующие TRPV1 рецепторы (отвечают на капсаицин; красный и фиолетовый, нейроны не имеющие в составе мембраны P2X3 и TRPV1 рецепторы (зеленый). Представлены данные по 5 экспериментам. Для идентификации фенотипа нейронов, отвечающих на действие ГЦ, на клетку в течение 2 секунд апплицировали 10 мкМ αβАТФ и 200 нМ капсаицина агонисты двух главных ноцицептивных Са2+-проницаемых рецепторов - P2X3 и TRPV1 рецепторов, соответственно (Simonetti et al., 2006). В качестве маркера нейронов на 2 сек апплицировали 50 мМ KCl (Simonetti et al., 2006). На рисунке 3.7.в представлена круговая диаграмма, отображающая процентное соотношение различных фенотипов нейронов, отвечающих на ГЦ в первичной культуре тригеминального ганглия крыс: 47,1 % нейронов, отвечающих увеличением [Ca2+]i при действии ГЦ, отвечали на 10 мкМ αβАТФ и 200 нМ капсаицина, указывая на ко-экспрессию P2X3 и TRPV1 рецепторов, соответственно (рис.3.7.в). 13,7 % нейронов, дающих Са2+ ответы на ГЦ, отвечали на αβАТФ или капсаицин, и 25,5 % нейронов не реагировали на активацию P2X3 и TRPV1 рецепторов (рис.3.8.в). В результате проведенных экспериментов не было выявлено какойлибо зависимости типов Са2+ ответов на ГЦ от фенотипа нейрона. Долговременное действие 100 мкМ ГЦ в течение 50 мин вызывает Ca2+ ответы, схожие по динамике роста с ответами от 30 мкМ NMDA, сигнализируя об ОКД, которая впоследствии может приводить к гибели нейронов. Увеличение [Ca2+]i на 100 мкМ ГЦ предотвращалось, если ГЦ апплицировался совместно с 72 сочетанной аппликацией 50 мкМ AP-5 и 10 мкМ MTEP. Это подтверждает вовлеченность ионотропных рецепторов глутамата NMDA типа и мГлуР5 в механизм кратковременного и долговременного действия ГЦ. 3.3.2 Интегральные токи, вызванные гомоцистеином Аналогично нейронам коры мозга, в нейронах тригеминального ганглия кратковременная аппликация 50 мкМ AP-5 вызывала практически полное блокирование интегрального тока, вызванного 100 мкМ ГЦ (совместно с 100 мкМ Гли) (рис.3.8.а), подтверждая, что в механизм действия ГЦ в нейронах ПНС в большей степени вовлечены рецепторы глутамата NMDA типа. В отличие от нейронов коры мозга, в части тригеминальных нейронов 30 мкМ NMDA (совместно с Гли) не вызывало интегральных токов, в то время как 100 мкМ ГЦ вызывал небольшой ток, полностью блокируемый 10 мкМ MTEP (рис. 3.9.б). Также была выявлена популяция клеток (не представлены на рисунке), в мембране которых имелись NMDA и мГлуР5 рецепторы, где MTEP вызывал небольшое изменение входящего тока. Рисунок 3.9. Возбуждающие интегральные токи, вызванные 30 мкМ NMDA и 100 мкМ гомоцистеина (ГЦ) в нейронах тригеминального ганглия крыс при мембранном потенциале -70 73 мВ. (а) Входящие интегральные токи вызванные 30 мкМ NMDA и 100 мкМ ГЦ, с последующей аппликацией 50 мкМ AP-5, блокирующего ток в одиночном нейроне. (б) Интегральный ток в NMDA-нечувствительном нейроне, вызванный 100 мкМ ГЦ и полостью блокируемый 10 мкМ MTEP. Представлены данные из одного эксперимента. Число клеток – 38. Таким образом, в культуре нейронов тригеминального ганглия, в отличие от культуры нейронов коры мозга, существуют нейроны, экспрессирующие на мембране только мГлуР5 рецепторы. Данный тип клеток будет давать Са 2+ ответ, отличные от ответов в нейронах коры (предполагаем, что это одиночный Са 2+ ответ (рис. 3.8.а)) на действие 100 мкМ ГЦ, что подтверждается экспериментальными данными, представленными ранее в работе (рис. 3.8.а). 3.3.3. Нейротоксический эффект долговременного действия гомоцистеина Длительное увеличение [Ca2+]i в клетках тригеминального ганглия крыс может потенциально приводить к Са2+-зависимой сенситизации ноцицептивных нейронов, ОКД и впоследствии к клеточной гибели по механизму апоптоза. Для исследования нейротоксического эффекта долговременного действия ГЦ на нейроны тригеминального ганглия крыс использовали метод определения количества погибших нейронов с помощью конфокальной микроскопии с использованием АО и БЭ (Mironova et al., 2007). Было выявлено, что 100 мкМ ГЦ после 24 часов действия в ростовой среде первичной культуры клеток тригеминального ганглия крыс оказывает нейротоксическое действие (рис. 3.10.а) на нейроны. Процент живых нейронов при действии 100 мкМ ГЦ составил 52 ± 1 % (рис. 3.10.б), а при действии 500 мкМ ГЦ процент живых нейронов снижался до 46 ± 4 % (рис.3.10.б). 74 Рисунок 3.10. Нейротоксическое действие гомоцистеина (ГЦ) на нейроны первичной культуры тригеминального ганглия крыс. (а) Флуоресцентное изображение нейронов в первичной культуре тигеминального ганглия крыс после 24 часов в контрольных условиях («контроль») и после действия 100 мкМ ГЦ, полученное с помощью окрашивания АО и БЭ. Масштабная линейка: 100 мкм. (б) Процентное соотношение количества живых клеток после 24 ч действия в контроле, после действия 100 мкМ или 500 мкМ ГЦ, или 100 мкМ ГЦ совместно с 50 мкМ AP-5 или 10 мкМ MTEP. Представлены данные со стандартной ошибкой (* - p<0.05 ) по 4 – 5 экспериментам. Как в случае нейронов первичной культуры коры мозга крыс, сочетанная аппликация 100 мкМ ГЦ совместно с избирательным антагонистом NMDA рецепторов – AP-5 (50 мкМ) предотвращала гибель нейронов, а процент живых клеток составил 90 ± 3 %, и достоверно не отличался от значений, полученных в контроле (p>0,05, количество опытов – 5) (рис.3.10.б). Аналогичный эффект оказывал избирательный блокатор мГлуР5 – MTEP, который также предотвращал гибель нейронов, и процент живых клеток составил 80 ± 2 % и также достоверно не отличался от значений, полученных в контроле (p>0,05, количество опытов – 5) (рис.3.10.б). Таким образом, полученные данные продемонстрировали, что нейротоксический эффект ГЦ в клетках ПНС реализуется через ионотропные рецепторы глутамата NMDA и мГлуР5 типа. Эти результаты весьма интересны, так как известно, что ноцицептивные нейроны, как большинство нейронов ПНС, не являются глутаматергичными, но несмотря на это экспрессируют рецепторы 75 глутамата (Turman et al., 2002; Lee, Ro, 2007; Willcockson, Valschanoff, 2008; Lo, Zhao, 2011 Lee, Ro, 2007; Parpura, Verkhratsky, 2013). 3.4. Сравнительная характеристика ответов нейронов коры и тригеминального ганглия крыс на гомоцистеин, NMDA и глутамат 3.4.1. Внутриклеточные Са2+ ответы В связи с тем, что ГЦ эндогенный агонист рецепторов Глу NMDA и мГлуР5 типа (Shi et al., 2003), было интересно сопоставить Ca2+ ответы, вызванные самим ГЦ, NMDA, как синтетическим агонистом ионотропных рецепторов Глу NMDA типа и самим Глу. Все эти агонисты обладают различным сродством к рецепторам Глу, а значит активируют токи, различные по кинетическим параметрам. Так, например, известно, что ГЦ в отсутствии Гли скорее свяжется с сайтом связывания Гли NMDA рецептора, чем с сайтом связывания Глу (Lipton et al., 1997). При этом NMDA уже в достаточно малой концентрации при долговременном действии вызывает сильную деполяризацию нейронов, приводящую к гибели клетки (Mironova et al., 2007; Sibarov et al., 2012). Реакция нейронов на тот или иной агонист будет зависеть от кинетики активирования рецептора, различий в Kd связывания, а также от такого фактора, как возможность утилизации агонистов клеткой. В связи с этим, для поиска различий в действии ГЦ, Глу и NMDA был проведен сравнительный анализ Ca2+ ответов при кратковременном (2 мин) действии данных агонистов на нейроны коры мозга (рис. 3.11.1) и нейроны тригеминального ганглия крыс (рис. 3.11.2). В нейронах первичной культуры коры мозга крыс общая динамика Са 2+ ответов для всех нейронов была сходна: 100 мкМ ГЦ вызывал Са 2+ ответы осцилляторного характера. 30 мкМ NMDA вызывал значительное увеличение [Ca2+]i, достигающей плато и сохраняющейся на протяжении всего времени 76 присутствия NMDA. Са2+ ответы при действии 300 мкМ глутамта были слабее, чем при действии NMDA, однако имели тот же характер (рис. 3.11.1). Рисунок 3.11.1. Внутриклеточные Са2+ ответы при действии 100 мкМ гомоцистеина (ГЦ), 30 мкМ NMDA и 300 мкМ глутамата (Глу) на нейроны первичной культуры коры мозга крыс. Ось ординат – относительная интенсивность свечения (за 1 принято свечение в контроле). Момент аппликации и длительность действия ГЦ, NMDA и Глу показаны линией над графиками. Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са 2+ ответ одного нейрона. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов – 3. Сходство реакций нейронов на различные агонисты рецепторов Глу можно объяснить тем, что нейроны коры мозга крыс достаточно гомогенны по рецепторному составу мембраны и преимущественно имеют большое количество NMDA рецепторов (Traynelis et al., 2010). ГЦ может активировать преимущественно два типа рецепторов Глу – NMDA и мГлуР5, однако является более слабым агонистом, чем Глу и NMDA (Shi et al., 2003). В нейронах первичной культуры тригеминального ганглия крыс Са2+ ответы по динамике развития можно разделить на 2 типа (рис. 3.11.2). Первый тип (рис. 3.11.2.а) схож с ответами в нейронах коры мозга крыс и представлял собой постепенное увеличение [Ca2+]i в ответ на аппликацию 100 мкМ ГЦ (совместно с Гли), 30 мкМ NMDA (совместно с Гли), и 300 мкМ Глу. Второй тип ответов (рис. 3.11.2.б) существенно отличался от динамики ответов в нейронах коры мозга крыс (рис.3.11.1) тем, что 100 мкМ ГЦ (совместно с Гли) вызывали быстрый 77 одиночный Са2+ ответ, а 30 мкМ NMDA и 300 мкМ Глу не вызывали увеличения [Ca2+]i. Рисунок 3.11.2. Внутриклеточные Са2+ ответы при действии 100 мкМ гомоцистеина (ГЦ), 30 мкМ NMDA и 300 мкМ глутамата (Глу) на нейроны первичной культуры тригеминального ганглия крыс. (а) Группа нейронов, дающих ответ на ГЦ, NMDA и Глу. (б) Группа нейронов, дающих ответы только на ГЦ. Ось ординат – относительная интенсивность свечения (за 1 принято свечение в контроле). Момент аппликации и длительность действия ГЦ, NMDA и Глу показаны линией над графиками. Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный Са2+ ответ одного нейрона. Представлены данные из одного эксперимента. Число опытов – 3. 78 Данные различия в ответах можно объяснить тем, что нейроны тригеминального ганглия крыс достаточно гетерогенны по рецепторному составу мембраны. Так одни нейроны могут иметь в своем составе преимущественно NMDA рецепторы (первый тип; рис. 3.11.2.а), а другие нейроны – только рецепторы мГлуР5 типа (второй тип ответов; рис. 3.11.2.б), которые дают Са 2+ ответ за счет выброса Са2+ из внутриклеточных депо на ЭПР (Nanou et al., 2009). Глу не вызывает аналогичных Са2+ ответов, вероятно, по причине недостатка времени для нормализации Са2+ баланса клетки и пополнения запасов депо после действия ГЦ (рис.3.11.2.б). 3.4.2. Митохондриальный мембранный потенциал Известно, что долговременная Са2+ дисрегуляция приводит к дисфункции митохондрий, нарушению функционирования дыхательной цепи, запуску окислительного фосфорилирования, и является ключевым моментом инициации гибели нейронов. В связи с тем, что ГЦ, NMDA и Глу могут оказывать нейротоксический эффект на нейроны ЦНС и ПНС, было интересно исследовать влияние данных агонистов рецепторов Глу на mit, как маркер состояния митохондрий. Флуорофор Rho123 позволяет детектировать падение контроля для определения максимального mit mit. В качестве на 2 мин после действия агонистов апплицировали протонофор FCCP в концентрации 4 мкМ, который приводит к полному разобщению дыхательной цепи, вызывая тем самым максимум эмиссии Rho123. На рис. 3.12.1 представлены mit , вызванные 100 мкМ ГЦ, 30 мкМ NMDA или 300 мкМ Глу в нейронах тригеминального ганглия крыс (рис.3.12.1.а-в) и нейронах коры мозга (рис.3.12.1.г-е). 100 мкМ ГЦ после 6 минут действия в нейронах тригеминального ганглия не вызывал сильного падения mit по сравнению с FCCP (рис. 3.12.1.а). В нейронах тригеминального ганглия крыс 79 после 6 минут действия 30 мкМ NMDA, наоборот, вызывало падение mit, сопоставимое с падением потенциала от действия FCCP (рис.3.12.1.б). 300 мкМ Глу в нейронах тригеминального ганглия крыс вызывало падение mit меньшее, чем от действия NMDA, но большее чем от действия ГЦ. В нейронах коры мозга крыс наблюдалась тенденция, сходная с изменением mit в нейронах тригеминального ганглия крыс: 100 мкМ ГЦ после 6 минут действия не вызывало сильно падения mit по сравнению с падением mit, вызванным FCCP (рис. 3.12.1.г); 30 мкМ NMDA после 6 минут действия вызывало падение падение mit mit, сопоставимое с mit от FCCP; 300 мкМ Глу вызывало большее, чем от действия ГЦ, но меньшее чем при действии NMDA. Рисунок 3.12.1. Изменение митохондриального мембраного потенциала ( mit), выявленного с использованием Rho123 в нейронах тригеминального ганглия и нейронах коры мозга крыс. В качестве контроля максимума падения (а) Падение mit, mit в нейроне на 2 мин апплицировали 4 мкМ FCCP. вызванное 6 мин действия 100 мкМ гомоцистеина (ГЦ) в нейронах 80 тригеминального ганглия крыс, (б) падение mit, вызванное при 6 мин действия 30 мкМ NMDA в нейронах тригеминального ганглия крыс, (в) падение mit, вызванное 6 мин действия 300 мкМ глутамата (Глу) в нейронах тригеминального ганглия крыс. (г) Падение mit, вызванное при 6 мин действия 100 мкМ ГЦ в нейронах коры мозга крыс, (б) падение mit, вызванное при 6 мин действия 30 мкМ NMDA в нейронах коры мозга крыс, (в) падение mit, вызванное 6 мин действия 300 мкМ Глу в нейронах коры мозга крыс. Момент аппликации и длительность действия ГЦ, NMDA, Глу и FCCP показаны линиями над графиками. Ось ординат – относительная интенсивность свечения (за 1 принято свечение в контроле). Каждая из кривых представляет собой зарегистрированный в соме флуоресцентный ответ от Rho123 одного нейрона. Число опытов – 3. Для более точного сопоставления падения mit, вызванного действием агонистов рецепторов Глу на нейроны триеминального ганглия и нейроны коры мозга крыс, было расчитано отношение: агонист mit / FCCP mit ( mit для каждого из агонистов – 100 мкМ ГЦ, 30 мкМ NMDA или 300 мкМ Глу относительно mit, вызванного действием FCCP). На рис. 3.12.2 представлены гистограммы агонист отношения mit ГЦ 3.12.2.а) mit / / FCCP mit FCCP mit . Для нейронов тригеминального ганглия (рис. составило 0,13 ± 0,01 отн.ед., Глу mit / FCCP mit составило 0,29 ± 0,04 отн.ед. и достоверно отличалось от значений, полученных при действии 100 мкМ ГЦ (р<0,05, количество опытов – 3, 38 нейронов), а NMDA / mit FCCP mit составило 0,42 ± 0,08 отн.ед. и достоверно отличалось от значений, полученных при действии 100 мкМ ГЦ (р<0,01, количество опытов – 3, 27 нейронов). Для нейронов коры мозга крыс (рис. 3.12.2.б) составило 0,13 ± 0,02 отн.ед., NMDA mit / FCCP mit Глу mit / FCCP mit ГЦ mit / FCCP mit составило 0,22 ± 0,05 отн.ед., а составило 0,41 ± 0,05 отн.ед. и достоверно отличались от значений, полученных при действии 100 мкМ ГЦ (р<0,01, количество опытов – 3, 31 нейрон) и при действии 300 мкМ Глу (р<0,05, количество опытов – 3, 21 нейрон). 81 Рисунок 3.12.2. Отношение падения митохондриального мембранного потенциала ( mit) вызваное 100 мкМ гомоцистеина (ГЦ), 30 мкм NMDA или 300 мкМ глутамта (Глу), к полному падению mit, вызванного 4 мкМ FCCP. (а) Отношение падения митохондриального мембранного потенциала вызванного, агоистами рецепторов Глу к полному падению при разобщении дыхательной цепи - mit агонист / mit FCCP в нейронах тригеминального ганглия крыс. (б) Отношение падения митохондриального мембранного потенциала вызванного агоистами рецепторов Глу к полному падению при разобщении дыхательной цепи - mit агонист / mit FCCP в нейронах коры головного мозга крыс. Представлены данные со стандартной ошибкой (* p<0.05, ** - p<0.01 ) по 3 экспериментам. Различия в значении агонист mit / FCCP mit связано с силой действия самих агонистов. NMDA являеся агонистом с высоким Kd связывания к NMDA рецептору и не имеющим естественных систем утилизации и проявляет более сильный нейротоксический эффект, чем ГЦ или Глу. ГЦ является более слабым эндогенным агонистом рецепторов Глу, чем Глу и NMDA (Shi et al., 2003). Существуют работы, говорящие о возможной утилизации нейронами и глиальными клетками не только Глу, но и ГЦ (Lu et al., 2009), за счет синтеза глутатиона из ГЦ. Таким образом, нарушение в метаболизме ГЦ может усиливать токсическое действие Глу не только в ЦНС, но и за ее пределами. Полученые результаты демонстрируют, что механизм развития нейротоксического эффекта агонистов рецепторов Глу существенно не отличается в нейронах ЦНС и ПНС, и включает в себя помимо кальциевой дисрегуляции, 82 дисфункцию митохондрий, приводящую к разобщению митохондриальной дыхательной цепи, запуску окислительного фосфорилирования, которое впоследствии может приводить к инициации гибели нейронов по механизму апоптоза. 83 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ Нормальная синаптическая функция Глу и нейродегенерация, вызванная его длительным действием (эксайтотоксичность), реализуются за счет активации ионотропрых рецепторов Глу. В нейронах коры крыс и в первичной культуре ткани нейронов коры в основном экспрессируются NMDA и АМПА рецепторы, при этом известно, что пик экспрессии KA рецепторов приходится на 12 – 14 день эмбрионального развития (Bahn et al., 1994). Роль NMDA и АМПА рецепторов для «эксайтотоксичности» очевидна. Длительное действие NMDA и КА – избирательных синтетических агонистов соответственно, NMDA и АМПА/КА рецепторов (Dingledine et al., 1999), которые не утилизируются нейронами и глиальными клетками и не способны активировать метаботропные рецепторы, вызывает гибель нейронов путем некроза и апоптоза, причем нейротоксическое действие КА сильнее, чем NMDA, судя по процентному соотношению некротических и апоптотических нейронов (Евстратова и др., 2008; Mironova et al., 2007; Sibarov et al., 2012). При действии NMDA и KA в нейронах развивается Ca2+-сигнал, сопровождающийся ОКД. Динамика повышения [Ca2+]i при действии NMDA и KA заметно различается (рис. 3.1), хотя источником Ca2+ в обоих случаях является внеклеточная среда (рис. 3.2). Если пути проникновения Ca2+ в цитоплазму нейронов для NMDA понятны канал NMDA рецептора обладает высокой проводимостью для Ca2+ (Burnashev et al., 1995), то для КА, судя по различию динамики Ca2+ ответа, они остаются не ясными и, по-видимому, могут варьировать. Одним из основных путей входа Ca2+ в нейроны, при активации рецепторов Глу являются NMDA рецепторы. Известно, что экспрессия субъединиц NMDA рецептора полностью зависит от функциональности нервной ткани и ее развития. NMDA рецепторы различаются по кинетике активации, проводимости, времени открытого состояния, параметрам блокирования канала Mg2+ и проницаемостью для Са2+ (Traynelis et al., 2010). В соответствии с этим, GluN1/GluN2A и GluN1/GluN2B рецепторы имеют схожие характеристики. Для изучения субъединичного состава NMDA рецепторов в первичной культуре нейронов коры 84 мозга, вовлеченных в Ca2+ дисрегуляцию, мы использовали избирательный антагонист GluN2B субъединицы NMDA рецептора – ифенпродил (Williams, 1993; Whittemore et al., 1997). Данное соединение является неконкурентным, потенциал-независимым антагонистом (максимальное ингибирование составляет около 90 %) GluN2B субъединицы NMDA рецептора. Ифенпродил ингибирует GluN2B-содержащие NMDA рецепторы с высокой аффиностью (ЕД50 составляет около 150 нМ) и он является в 200-400 раз более эффективным по отношению к GluN1/GluN2B рецепторам, чем к рецепторам содержащим GluN2A, GluN2C и GluN2D субъединицы (Williams, 1993; Whittemore et al., 1997). В наших экспериментах ифенпродил, когда действовал после аппликации NMDA (рис. 3.3.а) или до нее (рис. 3.3.б), частично блокировал Са2+ ответы в 70 - 90 % нейронов. Даже при аппликации насыщающей концентрации ифенпродила (10 мкМ), в 10 % нейронов [Ca2+]i продолжала расти (рис. 3.3.б). Данные результаты предполагают, что активация именно GluN1/GluN2B рецепторного канала определяет вход Са2+ через плазматическую мембрану нейрона при действии NMDA. Однако в связи с неполным ингибирование Са2+ ответов невозможно исключить вклад NMDA рецепторов иного субъединичного состава. Учитывая, что GluN2C и GluN2D субъединицы не были ранее обнаружены в первичной культуре коры мозга крыс, можно предположить, что 10 % Са2+ ответов, не блокируемых ифенпродилом, обеспечены GluN1/GluN2A субъединицами NMDA рецепторов. Полученные результаты сопоставимы с данными об экспрессии мРНК кодирующей GluN2A и GluN2B субъединицы NMDA рецептора в нейронах первичной культуры коры мозга (Zhong et al., 1994). Другим путем проникновения Ca2+ в нейроны коры могут являться Ca2+проницаемые АМПА рецепторы. Ca2+ проводимость канала АМПА рецептора определяется наличием в его структуре GluА2 субъединицы (Burnashev et al., 1992). В экспериментах с ИЭМ-1460, избирательно блокирующем GluA2 субъединицу, нейроны по типу действия разделились на три группы (рис. 3.4). Интерпретация данных схематически представлена на рис. 4.1. 85 Рисунок 4.1. Схема, интерпретирующая различные типы Ca2+ реакции нейронов на КА, выявленные с использованием ИЭМ-1460. Подробное объяснение приведено в тексте. (а) Нейрон, экспрессирующий на мембране АМПА рецепторы, не содержащие GluA2 субъединицу, (б) нейрон, экспрессирующий на мембране АМПА рецептор с GluA2 субъединицей, и (г) нейрон, экспрессирующий на мембране оба типа АМПА рецепторов. Феноменология первого типа (рис. 3.4, кривые и клетки, выделенные красным), может быть объяснена тем, что ИЭМ-1460 блокирует вход Ca2+ и, естественно, деполяризацию нейронов. Его отмывка сопровождается развитием Ca2+-сигнала (рис. 4.1а). Второй тип реакции характеризуется отсутствием эффекта ИЭМ-1460 (рис. 3.4, кривые и клетки, выделенные синим цветом), по-видимому, из-за того, что эти нейроны не экспрессируют Ca2+-проницаемые АМПА рецепторы (рис. 4.1б). Последний тип реакции (рис. 3.4, кривые и клетки, выделенные зеленым цветом, рис. 4.1в) характеризуется тем, что в плазматической мембране нейронов имеются оба типа АМПА рецепторов с проницаемыми и непроницаемыми для Ca2+ каналами. Тогда при блокировании Ca2+-проницаемых каналов АМПА рецепторов с помощью ИЭМ-1460, КА все же будет вызывать деполяризацию 86 нейронов, за счет активации АМПА рецепторов, содержащих GluA2 (с каналами, непроницаемыми для Ca2+). Отмывка ИЭМ-1460 приводит к дополнительному входу Ca2+ через разблокированные каналы АМПА рецепторы, в состав которых не входит GluА2 - субъединица. Поскольку ключевая субъединица GluА2, определяющая Ca2+-проводимость и эффективность блокирования каналов, относится к АМПА рецепторам, и KA рецепторы обладают низкой проводимостью для Са2+ (Dingledine et al., 1999), мы полагаем, что указание на KA рецепторы в схеме для реакций 1-3 типов не требуется (рис.4.1). Известно, что КА активирует АМПА рецепторы, деполяризуя мембрану, что приводит к активации Ca2+ каналов L-типа и повышению [Ca2+]i. Это подтверждают эксперименты с использованием нифедипина – блокатора Ca2+ каналов L-типа, который снижал количество Ca2+ ответов в половине кортикальных нейронов на фоне действия каината (Абушик и др., 2011). Неоднородность эффектов нифедипина, может указывать на гетерогенность популяции нейронов коры в культуре в плане механизмов повышения [Ca2+]i при активации AMПA/КА рецепторов и существовании иных КА-зависимых путей доставки Ca2+ в цитоплазму нейронов. Известно, что разные типы нейронов коры и гиппокампа экспрессируют AMПA рецепторы различного субъединичного состава. В частности, пирамидные нейроны коры и гиппокампа экспрессируют AMПA рецепторы, содержащие GluА2, а вставочные нейроны – АМПА рецепторы, не содержащие GluА2 (Samoilova et al., 1999). Это позволяет соотнести типы действия ИЭМ-1460 на внутриклеточный Ca2+ сигнал, вызванный гиперактивацией АМПА рецепторов с помощью КА, с морфофункциональными типами нейронов коры (Angulo et al., 1997; Kondo et al., 1997; Kumar et al., 2002). В этом случае нейроны на рис. 4.1, отмеченные буквой (а) и (в), представляют собой вставочные нейроны, так как обладают Са2+-проницаемыми АМПА рецепторами, не содержащими GluA2 субъединицу; отмеченные буквой (б), представляют собой пирамидные нейроны, так как экспрессируют Са2+-непроницаемые АМПА рецепторы, содержащие 87 GluA2 субъединицу. Очевидно, в первичной культуре коры мозга крыс имеются морфофункциональные типы нейронов, характерные для коры взрослых животных. Недавние результаты исследования микроповреждений, возникающих при нейродегенеративных процессах в коре мозга пациентов, страдающих мигренью, позволяют предположить вовлеченность рецепторов Глу в развитие данной патологии (Lakhan et al., 2013; Pietrobon, Moskowitz, 2013). Известно, что при мигрени, черепно-мозговой травме, инсульте и гипоксии развивается кортиковая распространяющаяся депрессия (Takano et al., 2007; Moskowitz, 2007; Tozzi et al., 2012), которая в первую очередь связана с активацией NMDA рецепторов и потенциал-зависимых Na+ каналов (Tozzi et al., 2012). Однако до сих пор неизвестно, что именно является активатором кортиковой распространяющейся депрессией. Все больше исследований говорят о вовлеченности в развитие нейродегенеративных процессов не только Глу, но и других аминокислот. Считается общепризнанным, что при таких нейродегенеративных заболеваниях как болезнь Альцгеймера (Agnati et al., 2005), болезнь Паркинсона (Kuhn et al., 2001; Kruman et al., 2002; Sachdev, 2005), боковой амилотрофический склероз (Zoccolella et al., 2012) и мигрени (Lea et al., 2009; Oterino et al., 2010) в плазме и цереброспинальной жидкости пациентов повышена не только концентрация Глу, но и наблюдается гипергомоцистеинемия - увеличение концентрации ГЦ. Нейротоксичность Глу на первичной культуре нейронов коры мозга крыс исследована достаточно хорошо (Евстратова и др., 2008; Mironova et al., 2007; Sibarov et al., 2012). А механизм действия высоких концентраций ГЦ на клетки первичной культуры нейронов коры изучен крайне мало. Известно, что Lгомоцистеиновая кислота, которая является ближайшим по строению к L-Глу соединением и ближайшим к L-ГЦ, может взаимодействовать с NMDA рецепторами и метаботропными рецепторами Глу I группы сильнее, чем сам ГЦ (Shi et al., 2003). Однако гипергомоцистеинемия связана с увеличением концентрации самого гомоцистеина в плазме и цереброспинальной жидкости (Surtees et al., 1997). В связи с этим, для исследования механизмов действия ГЦ на 88 клетки ЦНС (первичная культуры коры мозга крыс) и ПНС (первичная культура нейронов тригеминального ганглия крыс) был использован D,L-ГЦ в концентрации, соответствующий средней гипергомоцистеинемии (30 – 100 мкМ). Было выявлено, что при долговременном действии ГЦ на нейроны коры и нейроны тригеминального ганглия он вызывает гибель нейронов по механизму апоптоза, иными словами, оказывает цитотоксический эффект. Селективные антагонисты рецепторов NMDA и мГлуР5 типа - AP-5 и MTEP, соответственно предотвращали развитие клеточной гибели при долговременном действии ГЦ, как в клетках коры, так и в клетках тригеминального ганглия крыс. Эти результаты, подтвердили, что механизм действия ГЦ в клетках ЦНС и ПНС реализуется через NMDA и мГлуР5 рецепторы (Lipton et al., 1997; Shi et al., 2003; Poddar, Paul, 2009, 2013; Yeganeh et al., 2013). Кратковременное действие ГЦ вызывает в нейронах Са2+ ответы, которые различаются по своей динамике в нейронах коры и нейронах тригеминального ганглия. Однако в обоих случаях Са2+ ответы блокируются AP-5 и/или MTEP, подтверждая вовлеченность NMDA рецепторов и мГлуР5. Са2+- ответ в нейронах коры мозга крыс представлял собой Са2+ осцилляции (рис. 3.6.а, рис.3.9.1), отличные от характерной Са2+ динамики, вызванной действием NMDA или Глу. Это можно объяснить тем, что ГЦ является не только более слабым активатором рецепторов Глу, чем сам Глу, но, возможно, обладает селективностью в отношении NMDA рецепторов, активируя скорее GluN1/GluN2A NMDA рецепторы, количество которых в нейронах коры достаточно мало по сравнению с GluN1/GluN2B NMDA рецепторами. Известно, что нейроны в тригеминальном ганглии крыс в основном экспрессируют P2X3 и TRPV1 рецепторы, участвующие в ноцицепции, при этом существуют нейроны, которые имеют на мембране оба типа рецепторов, один тип рецепторов, и небольшая доля нейронов не имеющая ноцицептивных рецепторов вовсе. При сопоставлении Са2+ ответов, вызванных ГЦ в нейронах тригеминального ганглия, с экспрессией P2X3 и TRPV1 рецепторов было выявлено, что вызванные Са2+ответы не зависят от наличия данных типов 89 ноцицептивных рецепторов на плазматической мембране нейронов и проявляются лишь в ~60 % тригеминальных нейронов (рис. 3.7.б), в то время как в клетках коры мозга на действие ГЦ отвечают ~80 % нейронов (рис.3.6.б) В нейронах тригеминального ганглия крыс Са2+ ответы на кратковременное действие ГЦ обладали большей гетерогенностью и представляли собой динамику с одиночным пиком, динамику с множественными осцилляциями (аналогичные ответам в коре нейронов) или постепенно нарастающие Са2+ответы (рис. 3.7, рис. 3.9.2). Такое разнообразие Са2+ ответов может быть опосредовано различным составом рецепторов Глу на плазматической мембране нейронов тригеминального ганглия. Так при действии избирательного антагониста мГлуР5 – MTEP количество Сa2+ ответов на ГЦ снижалось до ~20 % (рис.3.7.б), причем практически полностью исчезали Са2+ ответы, представляющие собой одиночный пик. Избирательный антагонист NMDA рецепторов – AP-5 также снижал количесто вызванных ГЦ Са2+ ответов до ~20 % (рис.3.7.б). В этом случае снижалось количество Са2+ ответов с постепенно нарастающей динамикой. Известно, что нейроны ПНС и тригеминального ганглия, в частности, экспресируют помимо GluN1, GluN2A и GluN2B субъединицы NMDA рецептора примерно в равной степени (Turman et al., 2002), а среди метаботропных рецепторов Глу наиболее часто встречаются мГлуР5 (Lee, Ro, 2007). Таким образом, результаты данных экспериментов позволяют предположить, что Са2+ ответ с одиночным пиком (рис. 3.7.а., красный) скорее вызван активацией в основном мГлуР5 рецепторов и опосредован выходом Са2+ из внутриклеточных депо. Са2+ ответ с постоянно нарастающей динамикой вызван активацией NMDA рецепторов (рис. 3.7.а., зеленый), а Са2+ ответ с множественными осцилляциями вызван комплексной активацией мГлуР5 и NMDA рецепторов (рис. 3.7.синий). Дополнительные эксперименты с блокированием GluN2B субъединицы NMDA рецептора – ифенпродилом при кратковременном действии ГЦ, не выявили достоверного снижения количества клеток, отвечающих увеличением Са2+, по сравнению с действием чистого ГЦ. 90 Сопоставление Са2+ ответов, вызванных ГЦ, с ответами, вызванными NMDA и Глу в тригеминальном ганглии (рис.3.9.2), выявило не только различия в механизмах действия данных агонистов, но и наличие двух групп клеток: отвечающих на все агонисты увеличением [Ca2+]i (рис. 3.9.2.а) и отвечающих на ГЦ, но не на NMDA и Глу (рис.3.9.2.б). В первой группе клеток Са2+ ответы на ГЦ имели в основном динамику с множественными осцилляциями и постепенным нарастающим увеличением Са2+. В отличие от ГЦ, NMDA и Глу вызывали устойчивые Са2+ ответы, что по-видимому, отражает способность данных агонистов сильнее взаимодействовать с рецепторами Глу, чем ГЦ (Shi et al., 2003). Вторая группа клеток давала сильный Са2+ ответ в форме одиночного пика только на ГЦ. Это связано с тем, что данный тип нейронов тригеминального ганглия экспрессирует только мГлуР5, и выход Са2+ здесь происходит только за счет внутриклеточных Са2+ депо на ЭПР. Глу не вызывает аналогичных Са2+ ответов, вероятно, по причине недостатка времени для нормализации Са2+ баланса клетки и пополнении запасов депо после действия ГЦ (рис.3.9.2.б). Данные по изучению внутриклеточных Са2+ ответов согласуются с результатами электрофизиологических экспериментов. Было обнаружено, что в нейронах тригеминального ганглия кратковременная аппликация 50 мкМ AP-5 вызывала практически полное блокирование интегрального тока, вызванного 100 мкМ ГЦ (совместно с 100 мкМ Гли) (рис. 3.9.а), подтверждая, что в механизм действия ГЦ в нейронх ПНС, в большей степени вовлечены рецепторы глутамата NMDA типа. Однако в части тригеминальных нейронов 30 мкМ NMDA (совместно с Гли) не вызывало интегральных токов, в то время как 100 мкМ ГЦ вызывал небольшой ток, полностью блокируемый 10 мкМ MTEP (рис. 3.9.б). Также была выявлена популяция клеток (не представлены на рисунке), в мембране которой имелись NMDA и мГлуР5 рецепторы, где MTEP вызывал небольшое изменение входящего тока. Таким образом, в культуре нейронов тригеминального ганглия, в отличии от культуры нейронов коры мозга, существуют нейроны, экспрессирующие на мембране только мГлуР5 рецепторы. 91 Исследования последних лет показали, что гибель эмбриональных корковых нейронов при действии ГЦ реализуется не только через NMDA рецепторы, но и включает в себя ERK-MAPK и p38-MAPK киназный сигнальные пути (Poddar, Paul, 2009; Poddar, Paul, 2013). Другие исследования предполагают, что ГЦ участвует в окислительном стрессе, приводящем к гибели нейронов (Kim, Pae, 1996;Sibrian-Vazquez et al., 2010). При этом общепринято, что гиперактивация NMDA рецепторов ассоциирована с окислительном стрессом (Tenneti et al., 1998; Reyes et al., 2012). Более того, на нейронах гиппокампа было показано, что ГЦ в высокой концентрации (250 мкМ) приводит к полимеризации поли-АДФ-рибозы и истощении запасов NAD, которые вызывают митохондриальный окислительный стресс и апоптоз (Jara-Prado et al., 2003). Также было показано, что индуцированная сильная гипергомоцистеинемия вызывает перекисное окисление липидов, которое является маркером окислительного стресса клеток (Matte et al., 2004). Однако в экспериментах с изучением mit не было выявлено падения потенциала при кратковременном действии 100 мкМ ГЦ в нейронах первичной культуры тригеминального ганглия (рис. 3.10.1.а) и нейронах коры мозга (рис. 3.10.1.г). По сравнению с ГЦ, Глу вызывал большее смещение mit (рис. 3.10.2а). NMDA, как сильный синтетических избирательный агонист NMDA рецепторов, вызывал сильное снижение mit, по сравнению с ГЦ в нейронах тригеминального ганглия (рис.3.10.2.а) и по сравнению с ГЦ и Глу в нейронах коры мозга (рис. 3.10.2.б). В первую очередь данные различия можно объяснить тем, что ГЦ и Глу являются эндогенными агонистами рецепторов Глу, и для них у клетки существуют механизмы утилизации (глутаматный транспортер для Глу и образование глутатиона для ГЦ (Lu 2009)). Вероятно, что для детектирования окислительного стресса через падение mit необходимо более длительное действие агонистов – ГЦ и Глу. NMDA вызывает сильную гиперактивацию NMDA рецепторов, которая достаточно быстро приводит к Са2+ дисрегуляции с последующем падением mit, приводящим к гибели клетки. Таким образом, цитотоксический эффект ГЦ, в отличие от Глу, реализуется только через ионотропные рецепторы Глу NMDA типа и мГлуР5, вызывая в 92 первые минуты действия внутриклеточную Са2+ мобилизацию в нейронах ЦНС и ПНС, которая впоследствии может запускать необратимые изменения в клетке, приводящие к гибели нейронов, детектируемой спустя 24 часа действия ГЦ. 93 ВЫВОДЫ 1. in vitro Динамика кальциевых ответов на каинат в нейронах коры мозга крыс определяется соотношением экспрессии Са2+-проницаемых (не содержащих GluA2 субъединицу) и Са2+-непроницаемых (содержащих GluA2 субъединицу) АМПА рецепторов, что отражает функциональную специализацию нейронов, характерную для нейронов коры мозга взрослых крыс. 2. Долговременное действие гомоцистеина вызывает гибель нейронов коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре ткани и определяется синергизмом активации NMDA и метаботропных рецепторов глутамата 5 типа, так как избирательные антагонисты каждого из этих рецепторов предотвращают апоптоз. 3. Нейроны коры мозга крыс in vitro проявляют сходную реакцию на действие агонистов рецепторов глутамата. NMDA и глутамат вызывают быстрое увеличение концентрации внутриклеточного кальция, достигающее стационарного уровня, который сохраняется на протяжении всего времени действия агониста. Гомоцистеин, в отличие от NMDA и глутамата, вызывает быстро спадающие кальциевые ответы осцилляторного типа. 4. Нейроны тригеминального ганглия крыс in vitro различаются по реакции на действие агонистов рецепторов глутамата. В части нейронов гомоцистеин вызывает одиночные быстро спадающие кальциевые ответы, при этом отсутствуют ответы на NMDA и глутамат. В нейронах генерирующих типичный ответ на NMDA и глутамат, гомоцистеин вызывает либо постепенно нарастающие ответы, либо кальциевые ответы осцилляторного типа. Гетерогенность нейронов обусловлена различным соотношением экспрессии NMDA и метаботропных рецепторов глутамата 5 типа в плазматической мембране периферических нейронов. 94 5. Гомоцистеин, в отличие от NMDA и глутамата, не вызывает падение митохондриального мембранного потенциала в нейронах коры мозга и тригеминального ганглия крыс в первичной культуре ткани, а следовательно, не вызывает окислительный стресс на начальных этапах нейротоксического действия. 95 СПИСОК ЛИТЕРЫТУРЫ 1. Абушик П. А., Большаков А. Е., Сибаров Д. А., Антонов С. М. Гетерогенность механизмов кальциевого ответа на каинат и типы нейронов в первичной культуре коры мозга крыс // Биологические мембраны. 2011. Т. 28. № 1. C. 25 – 34. 2. Антонов С. М. Механизмы удаления глутамата как факторы, ограничивающие его постсинаптическое действие / Физиология и биохимия глутаматергических синапсов. Ред. Мандельштам Ю. Е.. Л.: Наука. 1989. C. 110 – 121 3. Антонов С. М. Переносчики нейромедиаторов: рецепторная, транспортная и канальная функция / Журн. эвол. биохим. и физиол. 2001. Т. 37. № 4. С. 248 – 252 4. Антонов С. М., Магазаник Л. Г. Неквантовое освобождение и активный захват глутамата в нервных окончаниях насекомого Calliophora Vicina / ДАН СССР. 1989. Т. 304. № 2. С. 483 – 486 5. Антонов С. М., Шупляков О. В., Магазаник Л. Г., Веселкин Н. П., Волкова Т. М., Гришин Е. В. Аргиопин как антагонист действия глутамата на спинальные мотонейроны лягушки / ДАН СССР. 1988. Т. 298. № 2. C. 505 – 508 6. Гиниатуллин Р. А. Нейрофизиологические механизмы мигрени и новые принципы патогенетического лечения / Казанский мед. ж. 2011. Т. 92. № 5. С. 728 – 735 7. Гришин Е. В., Волкова Т. М., Арсеньев А. С., Решетова О. С., Оноприенко В. В., Магазаник Л. Г., Антонов С. М., Федорова И. М. Структурно- функциональная характеристика аргиопина – блокатора ионных каналов из яда паука Argiope lobata / Биоорган. химия. 1986. Т. 12. № 12. C. 1121 – 1124 8. Детлаф Т. А. Объекты биологии развития / М.: Наука. Под ред. Детлаф Т.А. 1975. C. 442 – 462 96 9. Евстратова А. А., Миронова Е. В., Дворецкова Е. А., Антонов С. М. Апоптоз и рецепторная специфичность его механизмов при нейротоксическом действии глутамата / Росс. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2008, № 94, C. 380 – 393 10. Зефиров А. Л. Везикулярная гипотеза освобождения медиатора в синапсе / Соросовский образовательный журн. 2000. Т. 6. № 9. С. 10 – 16 11. Кабак Я. М. Практикум по эндокринологии. Основные методики экспериментально-эндокринологических исследований / М.: МГУ. 2-е изд. 1968. 27 c. 12. Калинина Н. И., Курчавый Г. Г., Шупляков О. В., Веселкин Н. П., Антонов С. М., Магазаник Л. Г. Гетерогенность возбуждающих синаптических входов в спинальных мотонейронах лягушки rana ridibunda / Журн. Эвол. Биохим. Физиол. 1989. Т. 25. № 6. С. 755 – 762 13. Магазаник Л.Г., Антонов С.М., Гмиро В.Е. Механизмы активации и блокирования постсинаптической мембраны, чувствительной к глутамату / Биол. мембраны. 1984. Т. 1. № 2. С. 130 – 140 14. Магазаник Л.Г. Синаптические рецепторы – молекулярная основа коммуникации нервных клеток / Вестник молодых ученых. 2004. Т. 2. Серия: науки о жизни. 2004. Т. 1. C. 100 – 112 15. Магазаник Л. Г., Антонов С. М., Федорова И. М., Волкова Т. М., Гришин Е. В. Действие яда паука Argiope lobata и его низкомолекулярного компонента – аргиопина на постсинаптические мембраны / Биол. мембраны 1986. № 3. C. 1204 – 1218 16. Николлс Дж. Г., Мартин А. Р., Валлас Б. Дж., Фукс П. А. От нейрона к мозгу / М.: Едиториал УРСС, 2003. 671 с. 17. Ноздрачев А. Д., Баженов Ю. И., Баранникова И. А. Начала физиологии / СПб: Лань, 2001. 1088 с. 18. Петров В.И., Пиотровский Л.Б., Григорьев И.А. Возбуждающие аминокислоты / Волгоград: изд. Волг. мед. акад. 1997. 167 с 19. Сахаров П.П. Лабораторные мыши и крысы / М. Медгиз. 1933. 92 c. 97 20. Эскин И.А. Основы физиологии эндокринных желез / М.: «Высшая школа». 1968. 296 c. 21. Abushik P.A., Sibarov D.A., Eaton M.J., Skatchkov S.N., Antonov S.M. Kainateinduced calcium overload of cortical neurons in vitro: Dependence on expression of AMPAR GluA2-subunit and down-regulation by subnanomolar ouabain // Cell Calcium. 2013. V. 54. № 2. P. 95 – 104. 22. Agnati L. F., Genedani S., Rasio G., Galantucci M., Saltini S., Filaferro M., Franco R., Mora F., Ferré S., Fuxe K. Studies on homocysteine plasma levels in Alzheimer's patients. Relevance for neurodegeneration / J. Neural. Transm. 2005 V. 112 № 1. P. 163 – 169 23. Alagarsamy S., Rouse S. T., Junge C., Hubert G. W., Gutman D., Smith Y., Conn P. J. NMDA-induced phosphorylation and regulation of mGluR5 / Pharmacol. Biochem. Behav. 2002. V.73. № 2. P. 299 – 306 24. Angulo M. C., Lambolez B., Audinant E., Hestrin S., Rossier J. Subunit composition, kinetic, and permeation of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells / J. Neurosci. 1997. V. 17. № 17. P. 6685 – 6696 25. Antonov S. M., Gmiro V. E., Johnson J. W. Binding sites for permeant ions in the channel of NMDA receptors and their effects on channel block / Nature Neurosci. 1998. V. 1. N. 6. P. 451 – 461 26. Antonov S. M., Grishin E. V., Magazanik L. G., Shupliakov O. V., Veselkin N. P. Argiopine blocks glutamate responses and sensorimotor transmission in motoneurones of isolated frog spinal cord / Neurosci. Lett. 1987. V. 83. № 1-2. P. 179 – 184 27. Antonov S. M., Johnson J. W. Permeant ion regulation of N-methyl-D-aspartate receptor channel block by Mg2+ / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. № 25. P. 14571 – 14576 28. Antonov S. M., Johnson J. W. Voltage-dependent interaction of open-channel blocking molecules with gating of NMDA receptors in rat cortical neurons / J. Physiol. 1996. V. 493. № Pt2. P. 425 – 445 98 29. Antonov S. M., Johnson J. W., Lukomskaya N. Y., Potapyeva N. N., Gmiro V. E., Magazanik L. G. Novel adamantane derivatives act as blockers of open ligandgated channels and as anticonvulsants / Mol. Pharmacol. 1995. V. 47. № 3. P. 558 – 567 30. Antonov S. M., Magazanik L. G. Intense non-quantal release of glutamate in an insect neuromuscular junction / Neurosci. Lett. 1988. V. 93. № 2-3. P. 204 – 208 31. Bading H., Segal M. M., Sucher N. J., Dudek H., Lipton S. A., Greenberg M. E. Nmethyl-D-aspartate receptors are critical for mediating the effects of glutamate on intracellular calcium concentration and immediate early gene expression in cultured hippocampal neurons / Neuroscience. 1995. V. 64. № 3. P. 653 – 664. 32. Bahn S., Volk B., Wisden W. Kainate receptor gene expression in the developing rat brain / J. Neurosci. 1994. V. 14. № 9. P. 5525 – 5547 33. Basbaum A. I., Bautista D. M., Scherrer G., Julius D. Cellular and molecular mechanisms of pain / Cell. 2009. V. 139. № 2. P. 267 – 284 34. Bindokas V. P., Miller R. J. Excitotoxic degeneration is initiated at non-random sites in cultured rat cerebellar neurons / J. Neurosci. 1995. V. 15, № 11. P. 6999 – 7011 35. Blaschke M., Keller B. U., Rivosecchi R., Hollmann M., Heinemann S., Konnerth A. A single amino acid determines the subunit-specific spider toxin block of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate kainate receptor channels / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. № 4. P. 6528 – 6532 36. Boldyrev A.A., Johnson P. Homocysteine and its derivatives as possible modulators of neuronal and non-neuronal cell glutamate receptors in Alzheimer’s Disease // Journal of Alzheimer’s Disease. 2007. V. 11. P: 219–228 37. Brattström L., Wilcken D. E. Homocysteine and cardiovascular disease: cause or effect? / Am. J. Clin. Nutr. 2000 V. 72. № 2. P. 315 – 323 38. Brustovetsky N., Dubinsky J. M. Limitations of cyclosporin A inhibition of the permeability transition in CNS mitochondria / J. Neurosci. 2000. V. 20. № 22. P. 8229 – 8237 99 39. Budd S. L., Nicholls D. G. Mitochondria, calcium regulation, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells / J. Neurochem. 1996. V. 67. № 6. P. 2282 – 2291 40. Burnashev N., Monyer H., Seeburg P. H., Sakmann B. Divalent ion permeability of AMPA receptor channels is dominated by the edited form of a single subunit / Neuron. 1992. V. 8. № 1. P. 189 – 198 41. Burnashev N., Zhou Z., Neher E., Sakmann B. Fractional calcium currents throught recombinant GluR channels of the NMDA, АМPА and kainite receptor subtypes / J. Physiol. 1995. V. 485. № Pt2. P. 403 – 418 42. Carlton S. M., Hargett G. L. Colocalization of metabotropic glutamate receptors in rat dorsal root ganglion cells / J. Comp. Neurol. 2007. V. 501. № 5. P. 780 – 789 43. Carozzi V, Marmiroli P, Cavaletti G. Focus on the role of Glutamate in the pathology of the peripheral nervous system / CNS Neurol Disord Drug Targets. 2008. V. 7. № 4. P. 348 – 360 44. Carpenter D.O. NMDA receptors and the molecular mechanisms of excitotoxicity in Oxidative Stress at Molecular, Cellular and Organ Levels / Еds P. Johnson, A. Boldyrev. Research Signpost, Trivandrum. 2002. P:77 – 88 45. Chauvel V., Vamos E., Pardutz A., Vecsei L., Schoenen J., Multon S. Effect of systemic kynurenine on cortical spreading depression and its modulation by sex hormones in rat / Exp. Neurol. 2012. V. 236. № 2. P. 207 – 214 46. Cheah K.S., Watkins J.C. Further syntheses in the study of structure-activity relationships of neuropharmacologically active amino acids / J. Med. Chem. 1965. V. 8. № 6. P. 821 – 824 47. Choi D.W. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture is calcium dependent / Neurosci Lett. 1985. V. 58. N. 3. P. 293 – 297 48. Choi D.W. Calcium: still center–stage in hypoxic–ischemic neuronal death / Trends Neurosci. 1995. V. 18. № 2. P. 58 – 60 49. Choi D.W. Excitotoxic cell death / J. Neurobiol. 1992. V. 23. № 9. P. 1261 – 1276 50. Choi D.W. Ionic dependence of glutamate neurotoxicity / J. Neurosci. 1987. V. 7. № 2. P. 369 – 379 100 51. Christine C.W., Choi D.W. Effects of zinc on NMDA receptor mediated channel currents in cortical neurons / J. Neurosci. 1990. V.10. N. 1. P. 108 – 116 52. Collingridge G. L., Peineau S, Howland J. G., Wang Y. T. Long-term depression in the CNS / Nat Rev Neurosci. 2010 V. 11 № 7. P. 459 – 473. 53. Collingridge G.L., Singer W. Excitatory amino acid receptors and synaptic plasticity / Trends Pharmacol. Sci. 1990. V. 11. № 7. P. 290 – 296 54. Conn P. J., Pin J. P. Pharmacology and functions of metabotropic glutamate receptors / Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1997 V. 37. P. 205 – 237 55. Contractor A., Swanson G.T., Sailer A., O'Gorman S., Heinemann S.F. Identification of the kainate receptor subunits underlying modulation of excitatory synaptic transmission in the CA3 region of the hippocampus / J. Neurosci. 2000. V. 20. № 22. P. 8269 – 8278 56. Curtis D. R., Johnston G. R. Amino acid transmitters in the mammalian central nervous system / Ergebn. Physiol. 1974. V. 69. P. 97 – 188 57. Curtis D. R., Phillis J. W., Watkins J. C. Chemical excitation of spinal neurons / Nature. 1959. V. 183. № 4661. P. 611 – 622 58. deGroot J., Zhou S., Carlton S. M. Peripheral glutamate release in the hindpaw following low and high intensity sciatic stimulation / Neuroreport. 2000. V. 11. № 3. P. 497 – 502 59. Dichter M. A. Rat cortical neurons in cell culture: culture methods, cell morphology, electrophysiology, and synapse formation / Brain Research. 1978. V. 149. № 2. P. 279 – 293 60. Dingledine R., Borges K., Bowie D., Traynelis S. The glutamate receptor ion channels / Pharmacol. Rev. 1999. V. 51. № 1. P. 7 – 61 61. DiPolo R., Beauge L. An ATP-dependent Na+/Mg2+ countertransport is the only mechanism for Mg extrusion in squid axons / Biochim. Biophys Acta. 1988. V. 946, № 2, P. 424 – 428 62. Duchen M. R. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death neurodegenerative disease / Pflugers Arch. 2012. V. 464. № 1. P. 111 – 121 and 101 63. Eimerl S., Schramm M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death / J. Neurochem. 1994. V. 62. № 3. P. 1223 – 1226 64. Fatt P., Katz B. Some observations on biological noise / Nature. 1950. V. 166. № 4223. P. 567 – 598 65. Fleming J. J., England P. M. AMPA receptors and synaptic plasticity: a chemist's perspective / Nat Chem Biol. 2010. V. 6. № 2. P. 89 – 97 66. Ganapathy P. S., White R. E., Ha Y., Bozard B. R., McNeil P. L., Caldwell R. W., Kumar S., Black S. M., Smith S. B. The role of N-methyl-D-aspartate receptor activation in homocysteine-induced death of retinal ganglion cells / Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2011. V. 52. № 8. 5515–5524 67. Greger I. H., Khatri L., Kong X., Ziff E. B. AMPA receptor tetramerization is mediated by Q/R editing / Neuron. 2003. V. 40. № 4. P. 763 – 774 68. Grueter B. A., Winder D. G. Metabotropic Glutamate Receptors (mGluRs): Functions / Encyclopedia for Neuroscience. Elselvier. 2009. P. 795 – 800 69. Hamill O. P., Marty A., Neher E., Sakmann B., Sigworth F. J. Improved patchclamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches / Pflugers Arch. 1981. V. 391. № 2. P. 85 – 100 70. Han E. B., Stevens C. F. Development regulates a switch between post- and presynaptic strengthening in response to activity deprivation / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 26. P. 10817 – 10822 71. Hartley D. M., Kurth M. C., Bjerkness L., Weiss J. H., Choi D. W. Glutamate receptor-induced 45 Ca2+ accumulation in cortical cell culture correlates with subsequent neuronal degeneration / J. Neurosci. 1993. V. 13. № 5. P. 1993 – 2000 72. Herlitze S., Raditsch M., Ruppersberg J.P., Jahn W., Monyer H., Schoepfer R., Witzemann V. Argiotoxin detects molecular differences in AMPA receptor channels / Neuron. 1996. V. 10. N. 12. P. 1131 – 1140 73. Hollmann M., O’Shea-Greenfield A., Rogers S.W., Heinemann S. Cloning by functional expression of a member of the glutamate receptor family / Nature 1989. V. 342. № 6250 P. 643 – 648 102 74. Huettner J.E. Kainate receptors and synaptic transmission / Prog. Neurobiol. 2003. V. 70. №. 5. P. 387 – 407 75. Hume R.I., Dingledine R., Heinemann S.F. Identification of a site in glutamate receptor subunits that controls calcium permeability / Science. 1991. V. 253. № 5023. P. 1028 – 1031 76. Ichikawa M., Muramoto K., Kobayashi K., Kawahara M., Kuroda Y. Formation and maturation of synapses in primary cultures of rat cerebral cortical cells: an electron microscopic study / Neurosci Res. 1993. V. 16. № 2. P. 95 – 103 77. Isaac J.T., Ashby M., McBain C.J. The role of the GluR2 subunit in AMPA receptor function and synaptic plasticity / Neuron. 2007. V. 54. № 6. P. 859 – 871 78. Isobe C., Terayama Y. A remarkable increase in total homocysteine concentrations in the CSF of migraine patients with aura / Headache. 2010. V. 50. № 10. P. 1561 – 1569 79. Jara-Prado A., Ortega-Vazquez A., Martinez-Ruano L., Rios C., Santamaria A. Homocysteine–induced brain lipid peroxidation: effects of NMDA receptor blockade, antioxidant treatment, and nitric oxide synthase inhibition / Neurotox. Res. 2003. V. 5. № 4. P. 237 – 243 80. Johnson J.W., Ascher P. Glycine potentiates the NMDA response in cultured mouse brain neurons / Nature. 1987. V. 325. № 6104. P. 529 – 531 81. Jonas P., Burnashev N. Molecular mechanisms controlling calcium entry through AMPA-type glutamate receptor channels / Neuron. 1995. V. 15.№ 5. P. 987 – 990 82. Jones M.V., Westbrook G.L. The impact of receptor desensitization on fast synaptic transmission / Trends Neurosci. 1996. V. 19. № 3. P. 96 – 101 83. Joosten E., van den Berg A., Riezler R., Naurath H. J., Lindenbaum J., Stabler S. P., Allen R. H. Metabolic evidence that deficiencies of vitamin B-12 (cobalamin), folate, and vitamin B-6 occur commonly in elderly people / Am. J. Clin. Nutr. 1993. V. 58. № 4. P. 468 – 476 103 84. Keast J. R., Stephensen T. M. Glutamate and aspartate immunoreactivity in dorsal root ganglion cells supplying visceral and somatic targets and evidence for peripheral axonal transport/ J. Comp. Neurol. 2000. V. 424. № 4. P. 577 – 587 85. Khodorov B. Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurons / Progr. Biophys. Molec. Biol. 2004. V. 86. №. 2. P. 279 – 351 86. Khodorov B., Pinelis V., Storozhevykh T., Vergun O., Vinskaya N. Dominant role of mitochondria in protection against a delayed neuronal Ca 2+ overload induced by endogenous excitatory amino acids following a glutamate pulse / FEBS Lett. 1996. V. 393. № 1. P. 135 – 138 87. Kim W. K., Choi Y. B., Rayudu P. V., Das P., Asaad W., Arnelle D. R., Stamler J. S., Lipton S. A. Attenuation of NMDA receptor activity and neurotoxicity by nitroxyl anion, NO- / Neuron. 1999. V. 24. № 2. P.461 – 469. 88. Kim W. K., Pae Y. S. Involvement of N-methyl-D-aspartate receptor and free radical in homocysteine-mediated toxicity on rat cerebellar granule cells in culture / Neurosci. Lett. 1996 V. 216. № 2. P. 117–120 89. Kiskin N. I., Krishtal O. A., Tsyndrenko A. Ya. Excitatory amino acid receptors in hippocampal neurons: kainate fails to desensitize them / Neurosci. Lett. 1986. V. 63. № 3. P. 225 – 230 90. Kiss J. P., Szasz B. K., Fodor L., Mike A., Lenkey N., Kurkó D., Nagy J., Vizi E. S. GluN2B-containing NMDA receptors as possible targets for the neuroprotective and antidepressant effects of fluoxetine / Neurochem Int. 2012. V. 60. № 2. P. 170 – 176 91. Kondo M., Sumino R., Okado H., Combinations of AMPA receptor subunit expression in individual cortical neurons correlate with expression of specific calcium-binding proteins / J. Neurosci. 1997. V. 17. № 5. P 1570 – 1581 92. Kruman I. I., Kumaravel T. S., Lohani A., Pedersen W. A., Cutler R. G., Kruman Y., Haughney N., Lee J., Evans M., Mattson M. P. Folic acid deficiency and homocysteine impair DNA repair in hippocampal neurons and sensitize them to 104 amyloid toxicity in animal models of Alzheimer’s disease. J. Neurosci. 2002. V. 22. № 5. P. 1752 – 1762 93. Kuhn W., Hummel T., Woitalla D., Muller T., Plasma homocysteine and MTHFR C677T genotype in levodopa-treated patients with PD / Neurology. 2001. V. 56. № 2. P. 281 – 282 94. Kumar S.S., Bacci A., Kharazia V., Huguenard J.R. A developmental switch of AMPA receptor subunits in neocortical pyramidal neurons / J. Neurosci. 2002. V. 22. № 8. P. 3005 – 3015 95. Kung L. H., Gong K., Adedoyin M., Ng J., Bhargava A., Ohara P. T., Jasmin L. Evidence for glutamate as a neuroglial transmitter within sensory ganglia / PLoS One. 2013 V. 8. № 7. P. e68312 96. Kunishima N., Shimada Y., Tsuji Y., Sato T., Yamamoto M., Kumasaka T., Nakanishi S., Jingami H., Morikawa K. Structural basis of glutamate recognition by a dimeric metabotropic glutamate receptor / Nature. 2000 V. 407. N. 6807. P. 971 – 977 97. Lakhan S. E., Avramut M., Tepper S. J. Structural and functional neuroimaging in migraine: insights from 3 decades of research / Headache. 2013. V. 53. № 1. P. 46 – 66 98. Lea P. M., Custer S. J., Vicini S., Faden A. I. Neuronal and glial mGluR5 modulation prevents stretch–induced enhancement of NMDA receptor current / Pharmacol Biochem Behav. 2002 V. 73. № 2. P. 287 – 298 99. Lea R., Colson N., Quinlan S., Macmillan J., Griffiths L. The effects of vitamin supplementation and MTHFR (C677T) genotype on homocysteine-lowering and migraine disability / Pharmacogenet. Genomics. 2009 V. 19. № 6. P. 422 – 428 100. Lee J. S., Ro J. Y. Peripheral metabotropic glutamate receptor 5 mediates mechanical hypersensitivity in craniofacial muscle via protein kinase C dependent mechanisms / Neuroscience. 2007. V. 146. № 1. P. 375 – 383 101. Lipton S. A. Ischemic cell death in brain neurons / Physiol. Rev. 1999. V. 79, № 4. P. 1431 – 1537 105 102. Lipton S. A., Kim W. K., Choi Y. B., Kumar S., D’Emilia D. M., Rayuda P. V., Arnelle D. R., Stamler J. S. Neurotoxicity associated with dual actions of homocysteine at the N-methyl-D-aspartate receptor / Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. V. 94. № 11. P. 5923 – 5928 103. Li-Smerin Y., Johnson J. W. Kinetics of the block by intracellular Mg 2+ of the NMDA-activated channel in cultured rat neurons / Journal of Physiology. 1996. V. 491. № 1. Р. 121 – 135 104. Lo F. S., Zhao S. N-methyl-D-aspartate receptor subunit composition in the rat trigeminal principal nucleus remains constant during postnatal development and following neonatal denervation / Neuroscience. 2011. № 178. P. 240 – 249 105. Loureiro S. O., Romão L., Alves T., Fonseca A., Heimfarth L., Moura Neto V., Wyse A. T., Pessoa–Pureur R. Homocysteine induces cytoskeletal remodeling and production of reactive oxygen species in cultured cortical astrocytes / Brain Res. 2010. № 1355. P. 151 – 164 106. Lu S. C. Regulation of glutathione synthesis / Mol. Aspects Med. 2009. V. 30. № 1-2. P. 42 – 59 107. Magazanik L.G., Buldakova S.L., Samoilova M.V., Gmiro V.E., Mellor I.R., Usherwood P.N. Block of open channels of recombinant AMPA receptors and native AMPA/kainite receptors by adamantine derivatives / J. Physiol. 1997. V. 505. № Pt3. P. 655 – 663 108. Malin S. A., Davis B. M., Molliver D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity / Nat. Protoc. 2007. V. 2. № 1. P. 152 – 160 109. Mansour M., Nagarajan N., Nehring R.B., Clements J.D., Rosenmund C. Heteromeric AMPA receptors assemble with a preferred subunit stoichiometry and spatial arrangement / Neuron. 2001. V. 32. № 5. P. 841 – 853 110. Masson J., Sagne C., Hamon M., Mestikawy S. A. Neurotransmitter transporters in the central nervous system / Pharmacol. Rev. 1999. V. 51. № 3. P.439 – 464 111. Matte C., Monteiro S. C., Calcagnotto T., Bavaresco C. S., Netto C. A., Wyse A. T. In vivo and in vitro effects of homocysteine on Na+,K+-ATPase activity in 106 parietal, prefrontal and cingulate cortex of young rats / Int. J. Dev. Neurosci. 2004. V. 22. № 4. P. 185 – 190 112. Mayer M. L., Westbrook G. L., Guthrie P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA response in spinal chord neurons / Nature, 1984. V. 309. № 5965. P. 261 – 263 113. Mayer M. L., Westbrook G. L. Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurons / J. Physiol. 1987. V. 394. P. 501 – 527 114. McBain C.J., Mayer M.L. N-methyl-D-aspartic acid receptor structure and function / Physiol. Rev. 1994. V. 74. № 3. P. 723 – 760 115. Meldrum B. Amino acids as dietary excitotoxins: a contribution to understanding neurodegenerative disorders / Brain Res. 1993. V. 18. № 3. P. 293 – 314 116. Messlinger K. Migraine: where and how does the pain originate? / Exp. Brain Res. 2009. V. 196. № 1. P. 179 – 193 117. Miller K. E., Richards B. A., Kriebel R. M. Glutamine-, glutamine synthetase-, glutamate dehydrogenase- and pyruvate carboxylase-immunoreactivities in the rat dorsal root ganglion and peripheral nerve / Brain Res. 2002. V. 945. № 2. P. 202 – 211 118. Mironova E. V., Evstratova A. A., Antonov S. M. A fluorescence vital assay for the recognition and quantification of excitotoxic cell death by necrosis and apoptosis using the confocal microscopy on neurons in culture / J. Neurosci. Methods. 2007. V. 163. № 1. P. 1 – 8 119. Moskowitz M. A. Genes, proteases, cortical spreading depression and migraine: impact on pathophysiology and treatment / Funct. Neurol. 2007. V. 22. № 3. P. 133 – 136 120. Moutin E., Raynaud F., Roger J., Pellegrino E., Homburger V., Bertaso F., Ollendorff V., Bockaert J., Fagni L., Perroy J. Dynamic remodeling of scaffold interactions in dendritic spines controls synaptic excitability / J. Cell Biol. 2012. V. 198. № 2. P. 251 – 263 107 121. Nanou E., Kyriakatos A., Kettunen P., El Manira A. Separate signalling mechanisms underlie mGluR1 modulation of leak channels and NMDA receptors in the network underlying locomotion / J. Physiol. 2009 V. 587. № Pt12. P. 3001 – 3008 122. Nicholls D. G., Scott I. D. The regulation of brain mitochondrial calcium-ion transport. The role of ATP in the discrimination between kinetic and membranepotential-dependent calcium-ion efflux mechanisms / Biochem J. 1980. V. 186, № 3, P. 833 – 839 123. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival / Physiol. Rev. 2000. V. 80. № 1. P. 315 – 360 124. Nowak L., Bregestovski P., Ascher P., Herbet A., Prochiantz A. Magnesium gates glutamate-activated channels in mouse central neurons / Nature, 1984. V. 307. № 5950. P. 462 – 465 125. Ohara P. T., Vit J. P., Bhargava A., Romero M., Sundberg C., Charles A. C., Jasmin L. Gliopathic pain: when satellite glial cells go bad / Neuroscientist. 2009 V. 15. № 5. P. 450 – 463 126. Oliveira A. L., Hydling F., Olsson E., Shi T., Edwards R. H., Fujiyama F., Kaneko T., Hökfelt T., Cullheim S., Meister B. Cellular localization of three vesicular glutamate transporter mRNAs and proteins in rat spinal cord and dorsal root ganglia / Synapse. 2003 V. 50. № 2. P. 117 – 129 127. Oterino A., Toriello M., Valle N., Castillo J., Alonso-Arranz A., Bravo Y., RuizAlegria C., Quintela E., Pascual J. The relationship between homocysteine and genes of folate–related enzymes in migraine patients / Headache 2010. V. 50. № 1. P. 99 – 168 128. Outinen P. A., Sood S. K., Liaw P. C. Y., Sarge K. D., Maeda N., Hirsh J., Ribau J., Podor T. J., Weitz J. I., Austin R. C. Characterization of the stress-inducing effects of homocysteine / Biochem. J. 1998. V. 332. № Pt1. P. 213 – 221 129. Pachernegg S., Strurz-Seebohm N., Hollmann M. GluN3 subunit-containing NMDA receptors: not just one-trick ponies / Trends Neurosci. 2012. V. 35.№ 4.P. 240 – 249 108 130. Paoletti P., Neyton J., Ascher P. Glycine-independent and subunit-specific potentiation of NMDA responses by extracellular Mg2+ / Neuron, 1995. V. 15. № 5. P. 1109 – 1120 131. Parpura V., Verkhratsky A. Astroglial amino acid–based transmitter receptors / Amino Acids. 2013. V. 44. № 4. P. 1151 – 1158 132. Parsons C. G., Dunysz W., Quack G. Glutamate in CNS disoders as a target for drug development: an uptake / Drug news perspect. 1998. V. 11. № 9. P. 523 – 569 133. Perna A. F., Ingrosso D., De Santo N. G. Homocysteine and oxidative stress / Amino Acids 2003. V. 25. № 3-4. P. 409 – 417 134. Pietrobon D. and Moskowitz M. A. Pathophysiology of migraine / Annu. Rev. Physiol. 2013. № 75. P. 365 – 391 135. Poddar R., Paul S. Homocysteine-NMDA receptor-mediated activation of extracellular signal-regulated kinase leads to neuronal cell death / J. Neurochem. 2009 V. 110. № 3. P. 1095 – 1106 136. Poddar R., Paul S. Novel crosstalk between ERK MAPK and p38 MAPK leads to homocysteine-NMDA receptor-mediated neuronal cell death / J. Neurochem. 2013. V. 124. № 4. P. 558 – 570 137. Qian A., Antonov S. M., Johnson J. W. Modulation by permeant ions of Mg(2+) inhibition of NMDA-activated whole-cell currents in rat cortical neurons / J. Physiol. 2002. V. 538. N. 1. P. 65 – 77 138. Rae M. G., Martin D. J., Collingridge G. L., Irving A. J. Role of Ca 2+ stores in metabotropic L-glutamate receptor-mediated supralinear Ca2+ signaling in rat hippocampal neurons/ J. Neurosci. 2000 . V. 20. № 23. P. 8628 – 8636 139. Reyes R. C., Brennan A. M., Shen Y., Baldwin Y., Swanson R. A. Activation of neuronal NMDA receptors induces superoxide-mediated oxidative stress in neighboring neurons and astrocytes. J. Neurosci. 2012. V. 32. № 37. P. 12973 – 12978 140. Rossi D. J., Oshima T., Attwell D. Glutamate release in severe brain ischemia is mainly by reversed uptake / Nature. 2000. V. 403. № 6767. P. 316 – 325 109 141. Rozen R. Genetic predisposition to hyperhomocysteinemia: deficiency of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) / Thromb. Haemost. 1997 V. 78. № 1. P. 523 – 526 142. Sachdev P. S. Homocysteine and brain atrophy / Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2005. V. 29. № 7, 1152–1161 143. Samoilova M. V., Buldskova S. L., Vorobjev V. S., Sharonova I. N., Magazanik L. G. The open channel blocking drug, IEM-1460, reveals functionally distinct alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptors in rat brain neurons / Neurosci. 1999. V. 94. P. 261 – 268 144. Sato K., Kiyama H., Park H. T., Tohyama M. AMPA, KA and NMDA receptors are expressed in the rat DRG neurons / Neuroreport. 1993. V. 4. № 11. P. 1263 – 1265 145. Shinozaki H. Pharmacology of the glutamate receptor / Prog. Neurobiol. 1988. V. 30. № 5. P. 399 – 435 146. Shi Q., Savage J. E., Hufeisen S. J., Rauser L., Grajkowska E., Ernsberger P., Wroblewski J. T., Nadeau J. H., Roth B. L. L-homocysteine sulfinic acid and other acidic homocysteine derivatives are potent and selective metabotropic glutamate receptor agonists / J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003 V. 305. № 1. P. 131 – 142 147. Sibarov D. A., Bolshakov A. E., Abushik P. A., Krivoi I. I., Antonov S. M. Na+,K+-ATPase functionally interacts with the plasma membrane Na+,Ca2+ exchanger to prevent Ca2+ overload and neuronal apoptosis in excitotoxic stress / J. Pharmacol. Exp. Ther. 2012. V. 343. № 3. P. 596 – 607 148. Sibrian-Vazquez M., Escobedo J. O., Lim S., Samoei G. K., Strongin R. M. Homocystamides promote free-radical and oxidative damage to proteins / Proc. Natl. Acad. Sci. USA .2010. V. 107. № 2. P. 551 – 554 149. Simonetti M., Fabbro A., D'Arco M., Zweyer M., Nistri A., Giniatullin R., Fabbretti E. Comparison of P2X and TRPV1 receptors in ganglia or primary culture of trigeminal neurons and their modulation by NGF or serotonin / Mol. Pain. 2006. № 2. P. 1-15 110 150. Sinor J. D., Du S., Venneti S., Blitzblau R. C., Leszkiewicz D. N., Rosenberg P. A., Aizenman E. NMDA and glutamate evoke excitotoxicity at distinct cellular locations in rat cortical neurons in vitro / J. Neurosci. 2000. V. 20. № 23. P. 8831 – 8837 151. Sladeczek F., Pin J. P., Recasens M., Bockaert J., Weiss S. Glutamate stimulates inositol phosphate formation in striatal neurons / Nature. 1985. V. 317. N. 6039. P. 717 – 719 152. Sobolevsky A. I., Rosconi M. P., Gouaux E. X-ray structure, symmetry and mechanism of an AMPA-subtype glutamate receptor / Nature. 2009. V. 462. № 7274. P. 745 – 756 153. Sobolevsky A. K. Channel block of glutamate receptors. Recent. Research. developments of physiology / Editor Pandalai S.G.. 2003. Kerala. India. Research signpost, P. 1-38 154. Stabler S. P., Marcell P. D., Podell E. R., Allen R. H., Savage D. G., Lindenbaum J. Elevation of total homocysteine in the serum of patients with cobalamin or folate deficiency detected by capillary gas chromatography-mass spectrometry / J. Clin. Invest. 1988. V. 81. № 2. P. 466 – 474 155. Stout A. K., Raphael H. M., Kanterewicz B. I., Klann E., Reynolds I. J. Glutamateinduced neuron death requires mitochondrial calcium uptake / Nat. Neurosci. 1998. V. 1. №. 5. P. 366 – 373 156. Sugiyama H., Ito I., Hirono C. A new type of glutamate receptor linked to inositol phospholipid metabolism / Nature. 1987. V. 325. № 6104. P. 531 – 533 157. Surtees R., Bowron A., Leonard J. Cerebrospinal fluid and plasma total homocysteine and related metabolites in children with cystathionine betasynthase deficiency: the effect of treatment / Pediatr Res. 1997 V. 42. № 5. P. 577 – 582 158. Szatkowski M., Barbour B., Attwell D. Non-vesicular release of glutamate from glial cells by reversed electrogenic glutamate uptake / Nature. 1990. V. 348. № 6300. P. 443 – 446 111 159. Sylantyev S., Savtchenko L. P., Ermolyuk Y., Michaluk P., Rusakov D. A. Spikedriven glutamate electrodiffusion triggers synaptic potentiation via a homerdependent mGluR-NMDAR link / Neuron 2013. V. 77. № 3. P. 528 – 541 160. Takano T., Tian G. F., Peng W., Lou N., Lovatt D., Hansen A. J., Kasischke K. A., Nedergaard M. Cortical spreading depression causes and coincides with tissue hypoxia / Nat. Neurosci. 2007. V. 10. № 6. P. 754 – 762 161. Tanaka K. Functions of glutamate transporters in the brain / Neuroscience. research. 2000. V. 37. № 1. P. 15 – 19 162. Tenneti L., D'Emilia D. M., Troy C. M., Lipton S. A. Role of caspases in Nmethyl-D-aspartate-induced apoptosis in cerebrocortical neurons / J. Neurochem. 1998. V. 71. № 3. P. 946 – 959 163. Tozzi A., de Iure A., Di Filippo M., Costa C., Caproni S., Pisani A., Bonsi P., Picconi B., Cupini L. M. , Materazzi S., Geppetti P., Sarchielli P., Calabresi P. Critical role of calcitonin gene-related peptide receptors in cortical spreading depression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. № 46. P. 18985 – 18990 164. Traynelis S. F., Wollmuth L. P., McBain C. J., Menniti F. S., Vance K.M., Ogden K.K., Hansen K.B., Yuan H., Myers S.J., Dingledine R. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function / Pharmacol. Rev. 2010. V. 62. № 3. P. 405 – 496 165. Trussell L. O., Fischbach G. D. Glutamate receptor desensitization and its role in synaptic transmission / Neuron. 1989. V. 3. № 3. P. 209 – 218 166. Turman J. E. Jr., Lee O. K., Chandler S. H. Differential NR2A and NR2B expression between trigeminal neurons during early postnatal development / Synapse. 2002. V. 44. № 2. P. 76 – 85 167. Ueland P. M., Refsum H., Beresford S. A., Vollset S. E. The controversy over homocysteine and cardiovascular risk / Am. J. Clin. Nutr. 2000. V. 72. № 2. P. 324 – 332 168. Vergun, O., Han, Y. Y., Reynolds, I. J. Glucose deprivation produces a prolonged increase in sensitivity to glutamate in cultured rat cortical neurons / Exper. Neurol. 2003. V. 183. № 2. P. 682 – 694 112 169. Vergun, O., Sobolevsky, A.I., Yelshansky, M.V., Keelan, J., Khodorov, B.I., Duchen, M.R. Exploration of the role of reactive oxygen species in glutamate neurotoxicity in rat hippocampal neurones in culture / J. Physiol. 2001. V. 531. № Pt1. P. 147 – 163 170. Wanaka A., Shiotani Y., Kiyama H., Matsuyama T., Kamada T., Shiosaka S., Tohyama M. Glutamate-like immunoreactive structures in primary sensory neurons in the rat detected by a specific antiserum against glutamate / Exp. Brain Res. 1987. V. 65. № 3. P. 691 – 694 171. Wang L.Y., MacDonald J.F. Modulation by magnesium of the affinity of NMDA receptors for glycine in murine hippocampal neurons / J. Physiol. 1995. V. 486. № Pt1. P. 83 – 95 172. Washburn M.S., Dingledine R. Block of alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors by polyamines and polyamine toxins / J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. V. 278. № 2. P. 669 – 678 173. Washburn M.S., Numberger M., Zhang S., Dingledine R. Differential dependence on GluR2 expression of three characteristic features of AMPA receptors / J. Neurosci. 1997. V. 17. № 24. P. 9393 – 9406 174. White R. J., Reynolds I. J. Mitochondria and Na+/Ca2+ exchange buffer glutamateinduced calcium loads in cultured cortical neurons / J. Neurosci. 1995. V. 15. № 2. P. 1318 – 1328 175. Whittemore E. R., Ilyin V. I., Woodward R. M. Antagonism of N-methyl-Daspartate receptors by sigma site ligands: potency, subtype-selectivity and mechanisms of inhibition / J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997 V. 282. № 1. P. 326 – 338 176. Willcockson H., Valtschanoff J. AMPA and NMDA glutamate receptors are found in both peptidergic and non-peptidergic primary afferent neurons in the rat / Cell Tissue Res. 2008. V. 334. № 1. P. 17 – 23 177. Williams K. Ifenprodil discriminates subtypes of the N-methyl-D-aspartate receptor: selectivity and mechanisms at recombinant heteromeric receptors / Mol. Pharmacol. 1993 V. 44. № 4. P. 851 – 859 113 178. Yang C. Q., Wei Y. Y., Leng Y. X., Zhong C. J., Zhang Y. S., Wan Y., Duan L. P. Vesicular glutamate transporter-3 contributes to visceral hyperalgesia induced by Trichinella spiralis infection in rats / Dig. Dis. Sci. 2012. V. 57. № 4. P. 865 – 872 179. Yeganeh F., Nikbakht F., Bahmanpour S., Rastegar K., Namavar R. Neuroprotective Effects of NMDA and Group I Metabotropic Glutamate Receptor Antagonists Against Neurodegeneration Induced by Homocysteine in Rat Hippocampus: In Vivo Study / J. Mol. Neurosci. 2013. V. 50. № 3. P. 551 – 557 180. Yu S. P., Sensi S. L., Canzoniero L. M., Buisson A., Choi D. W. Membranedelimited modulation of NMDA currents by metabotropic glutamate receptor subtypes 1/5 in cultured mouse cortical neurons / J. Physiol. 1997 V. 499. № Pt3. P. 721 – 732 181. Zelenin A. V. Fluorescence microscopy of lysosomes and related structures in living cells / Nature. 1966 V. 212. № 5060. P. 425 – 426 182. Zhou Q., Sheng M. NMDA receptors in nervous system diseases / Neuropharmacology. 2013. № 74. P. 69 – 74 183. Zhong J., Russell S. L., Pritchett D. B., Molinoff P. B., Williams K. Expression of mRNAs encoding subunits of the N-methyl-D-aspartate receptor in cultured cortical neurons / Mol. Pharmacol. 1994. V. 45. № 5. P. 846 – 853 184. Zoccolella S., Bendotti C., Beghi E., Logroscino G. Homocysteine levels and amyotrophic lateral sclerosis: A possible link /Amyotroph. Lateral. Scler. 2010. V. 11. № 1-2. P. 140 – 147
