СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ МЕЖДУ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ
ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
experimental gastroenterology
СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ МЕЖДУ МЕТАБОЛИЗМОМ
ВИТАМИНОВ МИКРОБИОТОЙ И ВЫЖИВАНИЕМ ПОЗИТИВНОЙ
МИКРОФЛОРЫ ЖКТ
Громова О. А.1, 2, Торшин И. Ю.2, 3, Гарасько Е. В.1, Лиманова О. А.1, 2, Гришина Т. Р. 1,2, Рудаков К. В.3
1
ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия МЗ РФ»
2
РСЦ Института микроэлементов ЮНЕСКО, Москва
3
ГБОУ ВПО «Московский физико-технический институт», Москва
Громова О. А
E-mail: [email protected]
РЕЗЮМЕ
Перспективным направлением терапии дисбактериоза является использование так называемых метаболических пребиотиков — продуктов обмена веществ позитивной флоры (например, водный субстрат продуктов обмена веществ E. coli, S. faecalis, L. acidophilus, L. helveticus (штаммы DSM), из которых, как известно,
изготовляется препарат Хилак Форте). Проведенный нами ранее систематический анализ метаболомов
представителей позитивной микрофлоры указал на то, что последние содержат специфические биохимические механизмы для биосинтеза и переработки ряда витаминов. В настоящей работе представлены результаты систематического анализа эффектов витаминов В2, В6 и К на выживание представителей
позитивной микрофлоры на основе субстрата продуктов обмена позитивной флоры. Результаты данного
анализа позволяют уточнить молекулярные механизмы терапевтического воздействия данного препарата
с весьма сложным составом, подтверждают имеющиеся клинические данные и являются важным обоснованием для проведения последующих микробиологических исследований. Метаболиты в составе препарата способствуют нормализации обмена пиридоксальфосфата (витамин В6), флавинадениндинуклеотида
(ФАД, производное витамина В2) и никотинамид динуклеотида (НАД, производное витамина В3) — кофакторов ферментов, оказывающих существенное воздействие на выживание микробиоты. Предлагаемые
молекулярные механизмы также указывают на возможный синергизм между определенными витаминами
и микроэлементами, с одной стороны, и молекулярными компонентами препаратов на основе продуктов
жизнедеятельности микробиоты — с другой.
Ключевые слова: обмен веществ; дисбактериоз; микробиота; пребиотики.
28
SUMMARY
A perspective direction of the treatment of dysbacteriosis is the use of so-called metabolic prebiotics — products
of metabolism of positive flora (for example, water substrate of the products of metabolism of E. coli, S. faecalis,
L. acidophilus, L. helveticus (strains of DSM), out of which, as known, drug Hylak Forte is made. Our earlier systematic analysis of metabolomics, representatives of positive microflora, pointed to the fact that the latter contain
specific biochemical mechanisms for biosynthesis and processing of a number of vitamins. In the present paper
the results of a systematic analysis of the effects of vitamins B2, B6 and K on the survival of the representatives of
the positive microflora on the basis of the substrate of metabolic products of positive flora have been presented.
The results of the analysis allow us clarify the molecular mechanisms of the therapeutic effects of this drug with
a very complex structure and confirm the available clinical data and are an important foundation for subsequent
microbiological research. Metabolites in the preparation composition contribute to the normalization of metabolism of pyridoxalphosphate (vitamin B6), flavin adenin dinucleotide (FAD, a derivative of vitamin B2) and nicotinamide dinucleotide (NAD, a derivative of vitamin B3) — cofactors of enzymes that have a significant impact on
the survival of microbiota. The proposed molecular mechanisms also indicate on a possible synergies between
certain vitamins and micro elements, on the one hand, and molecular components of the preparations on the
basis of waste products of microbiota on the other.
Keywords: metabolism; dysbacteriosis; microbiota; prebiotics.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ
МЕТАБОЛОМНЫЙ АНАЛИЗ
ИССЛЕДОВАННЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ
СИМБИОТИЧЕСКОЙ И ПАТОГЕННОЙ
МИКРОФЛОРЫ
Эффективный и безопасный пребиотический препарат должен поддерживать выживание позитивной кишечной флоры и сдерживать рост негативной флоры. Механизмы действия и, следовательно,
эффективность и безопасность пребиотических
препаратов были рассмотрены нами ранее с использованием анализа метаболомов — то есть массивов всех метаболитов одного микроорганизма
[1–3]. Наиболее типичными представителями симбиотической микрофлоры являются физиологические штаммы Escherichia coli, Streptococcus faecalis,
представители Lactobacillus. Именно на основе экстрактов нормофизиологических штаммов этих
бактерий изготовлен препарат Хилак Форте.
Так как Хилак Форте содержит часть метаболома
бактерий, соответствующих позитивной микрофлоре, сравнение метаболомов этих микроорганизмов с метаболомами бактерий условно патогенной флоры указывает на наиболее вероятные
молекулярные пути, посредством которых осуществляется терапевтическое воздействие препарата. Суммарная информация по метаболомам
исследованных микроорганизмов представлена на
рис. 2 *. Установлено существование 396 метаболитов, общих для исследованных представителей позитивной микрофлоры, и 350 метаболитов, общих
для представителей условно патогенной флоры.
Сравнительный анализ метаболомов этих микроорганизмов показал, что у данных представителей
нормофлоры присутствуют определенные метаболические маршруты, которых не существует ни у одного
из исследованных представителей условно патогенной
*
На цветной вклейке в журнал.
experimental gastroenterology
синергидного эффекта при совместном использовании с витаминами В6, В2, К, селеном,
глутатионом (рис. 1) *.
Результаты метаболомного анализа позволили утверждать, что метаболиты в составе Хилак Форте способствуют выживанию позитивной флоры и в то же время могут
тормозить рост патогенной микрофлоры кишечника. В настоящей работе представлены
результаты систематического исследования
эффектов витаминов В2, В6 и К на выживание
представителей позитивной микрофлоры, на
основе водного субстрата продуктов обмена
веществ продуктов обмена веществ E. coli,
S. faecalis, L. acidophilus, L. helveticus (штаммы
DSM), из которых изготовляется препарат
Хилак Форте.
29
Известно, что любые хронические заболевания
сопровождаются полигиповитаминозом — сочетанным дефицитом многих витаминов. При этом
взаимосвязь между полигиповитаминозом и заболеванием двунаправлена. С одной стороны, полигиповитаминоз зачастую развивается как следствие
того или иного заболевания. С другой — полигиповитаминоз затрудняет полное клиническое выздоровление, способствует снижению иммунитета
и переходу заболевания в хроническую форму (хронический тонзиллит, бронхит, стоматит, хронический колит и др.).
Важным фактором в этиологии полигиповитаминоза является дисбактериоз кишечника, приводящий к значительному снижению усвоения
витаминов из пищи и витаминно-минеральных
комплексов.
Дисбактериоз кишечника — нарушение баланса
между позитивной и патогенной флорой в сторону
патогенной. В терапии дисбактериоза используются препараты активной позитивной микрофлоры (пробиотики) и пребиотики — олигосахариды
и другие вещества натурального или синтетического происхождения, селективно стимулирующие рост/выживание нормофлоры. Применение
пребиотиков устраняет проблему генетической
совместимости между индивидуальной микробиотой хозяина и принимаемыми штаммами пробиотиков. Клинические исследования показывают
перспективность использования метаболических
пребиотиков (например, Хилак Форте — водный
экстракт продуктов обмена веществ E. coli, S. faecalis,
L. acidophilus, L. helveticus, а именно штаммы DSM).
Этот препарат, подобно олигосахаридным пребиотикам, стимулирует рост позитивной микробиоты.
Метаболические пребиотики отличаются весьма сложным составом, что существенно затрудняет
анализ механизмов молекулярного фармакологического воздействия этих препаратов. В нашей предыдущей работе был проведен сравнительный метаболомный анализ позитивной микрофлоры, лежащей
в основе препарата Хилак Форте [1]. Результаты
проведенного анализа показали, что среди молекулярных компонентов Хилак Форте (RatioPharm
GmbH, ФРГ) могут присутствовать такие важнейшие для выживания нормофлоры сигнальные молекулы, как аутоиндукторы 1-го и 2-го типов (посредством которых контролируется образование
бактериальных пленок позитивной микрофлоры).
Было установлено, что позитивная флора в основе
Хилак Форте производит и потребляет метаболиты,
связанные с переработкой желчных кислот, биосинтезом и биотрансформациями витаминов, селена,
пребиотических сахаров, короткоцепочечных жирных кислот и т. д. На основе анализа возможных молекулярных компонентов были сформулированы
новые механизмы терапевтического воздействия
данного препарата, открывающие перспективы
экспериментальная гастроэнтерология
ВВЕДЕНИЕ
E XPE R I ME NTA L & CLI N ICA L GASTROE NTE ROLOGY
ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
МЕТАБОЛИТЫ НОРМОФЛОРЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В БИОСИНТЕЗЕ ВИТАМИНОВ
Данные метаболиты входят в состав метаболомов только представителей позитивной флоры
Метаболит
Биохимический маршрут
Функция
Фосфонооксибутаноат, 4-фосфогидрокситреонин
Биосинтез пиридоксаль фосфата
Пиридоксаль
Переработка пиридоксаль фосфата
2,5-диамино-6-(5-фосфо-Dрибозиламино) пиримидин-4;
Метаболизм витамина В6
Биосинтез флавина
Метаболизм витамина В2
Менахинолы, менахиноны
Биосинтез 8-менахинола (К2)
Биосинтез витамина K, восстановление никотинамидного кофермента НАД с образованием НАДН
Никотинат
Циклический путь переработки
НАД
Синтез витамина В3
6,7-диметил-8-(1-D-рибитил)лумазин; рибофлавин
Таблица 2
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФУНКЦИИ ФАДЗАВИСИМЫХ БЕЛКОВ КЛЕТОК МИКРОБИОТЫ (на примере E. coli)
Число
белков
Код функции по БД GO
Функция
37 GO: 0009055
Перенос электрона в процессах энергетического метаболизма аминокислот
и короткоцепочечных жирных кислот, метаболизм кофермента НАД
21
GO: 0048038
Связывание хинона
10
GO: 0009060
Аэробное дыхание, аэротаксис
8
GO: 0042773
Синтез АТФ
7
GO: 0009437
Метаболизм карнитина
6
GO: 0006099
Цикл трикарбоновых кислот (короткоцепочечных жирных кислот)
5
GO: 0003995
Ацил-КоА дегидрогеназа
5
GO: 0006744
Биосинтез убихинона, поддержка антиоксидантного ресурса Микробиоты
4
GO: 0006537
Биосинтез глутамата
4
GO: 0030976
Связывание тиаминпирофосфата
флоры. В частности, были установлены метаболиты,
связанные с биосинтезом ряда витаминов (табл. 1),
и наличие этих молекул в экстрактах продуктов жизнедеятельности нормофлоры будет ускорять рост
позитивной флоры. Однако не был проведен анализ
соответствующих биохимических маршрутов. Одной
из целей настоящей работы является детальное рассмотрение биохимических маршрутов, связанных
с метаболизмом витаминов: метаболизм витамина
В6, биосинтез и функции рибофлавина, биосинтез
и функции витамина K и взаимосвязи этих маршрутов с выживаемостью нормофлоры ЖКТ.
БИОСИНТЕЗ И ФУНКЦИИ
РИБОФЛАВИНА
30
№2/2013
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
Таблица 1
В результате проведенного метаболомного анализа было установлено, что такие метаболиты, как
фосфорибозил аминопиримидин (название по
международной номенклатуре IUPAC 2,5-диамино-6- (5-фосфо-D-рибозиламино) -пиримидин-4)
и рибитил лумазин (международное название 6,7-диметил-8- (1-D-рибитил) -лумазин), уникальны для позитивной флоры, лежащей в основе препарата Хилак
Форте.
Эти два метаболита важны для синтеза рибофлавина. Рибофлавин, в свою очередь, необходим для образования белковых кофакторов флавинадениндинуклеотида (ФАД) и флавинмононуклеотида (ФМН).
Фосфорибозил аминопиримидин образуется в результате гидролиза гуанидинтрифосфата (ГТФ)
ферментом ГТФ-циклогидролазой II (ribA). Этот
Mg-, Zn-зависимый фермент катализирует удаление дифосфата и другие трансформации структуры ГТФ, осуществляя тем самым первый шаг
биосинтеза рибофлавина (рис. 3) *. При дефицитах
цинка и магния активность данного фермента упадет, что отрицательно скажется на динамике синтеза рибофлавина. Поэтому обеспеченность этими
микронутриентами весьма важна для поддержания
жизнедеятельности нормофлоры.
Таким образом, вхождение молекул фосфорибозил аминопиримидина и рибитил лумазина в состав препарата Хилак Форте будет способствовать
интенсификации синтеза рибофлавина из этих
промежуточных продуктов. Второй из обсуждаемых метаболитов, рибитил лумазин, потребляется
ферментом рибофлавин-синтетазой (ribC), который
катализирует последний шаг в биосинтезе рибофлавина (рис. 4) **.
Активация синтеза рибофлавина в представителях нормофлоры будет приводить к лучшей
обеспеченности клеток микробиоты коферментом
ФАД (флавинадениндинуклеотид) — коферментом,
принимающим участие в окислительно-восстановительных процессах. Восстановленная форма
кофермента (ФАДH2) является переносчиком энергии и используется как субстрат в реакциях окислительного фосфорилирования в митохондриях.
При окислении восстановленной формы ФАДH2
выделяется энергия, запасаемая в форме двух молекул АТФ. ФАД образуется из рибофлавина (рис. 5).
ФАД-зависимые ферменты вовлечены широкий круг процессов выживания клеток микробиоты. Например, в E. coli известно более 70
ФАД-зависимых белков, то есть белков, для активности которых ФАД принципиально необходим.
Большинство этих белков вовлечены в энергетический метаболизм клетки, в том числе в процессы аэробного дыхания, катаболизма аминокислот
и углеводов, цикл трикарбоновых кислот (цикл
Кребса). В табл. 2 приведен краткий обзор молекулярных функций ФАД-зависимых белков.
В частности, ФАД-зависимые белки алкилгидроперексид редуктаза (ген ahpF) и универсальный
* На цветной вклейке в журнал.
** На цветной вклейке в журнал.
белок стресса (ген uspA) необходимы для защиты клеток микробиоты от повреждений
клеточной ДНК. ФАД-зависимая глутатионредуктаза (ген gor) служит той же цели,
поддерживая высокий уровень восстановленного глутатиона в цитозоле.
Интересно отметить существование среди
ФАД-зависимых белков тех, которые опосредуют
сигналы окружающей среды, принципиально важные для выживания бактерий позитивной флоры.
Например, аэротаксис рецептор (ген aer) формирует сигнал для аэротаксиса нормофлоры — то
есть для движения клеток по направлению к пузырькам воздуха в кишечном транзите, так как
кислород необходим для процессов аэробного
окисления. Данный белок контролирует уровни
протонов и окислительно-восстановительный баланс клетки, используя ФАД как окислительновосстановительный датчик для контроля уровня
поступающего в клетку кислорода. Другой пример — ФАД-зависимый белок-антирепрессор YcgF
связывает и освобождает белок-репрессор транскрипции YcgE от связанных им участков ДНК при
снижении температуры, активируя тем самым гены
энергетического метаболизма, необходимые для
выживания клеток микробиоты.
Также напомним, что одной из наиболее важных
функций кофермента ФАД, производного рибофлавина (витамин В2), является его участие в метаболических процессах основного кофермента
энергетического метаболизма клеток микробиоты — никотинамидадениндинуклеотида (НАД,
НАДH, НАДР, NAD, NADР, рис. 6), производного
витамина В3 (витамин РР). Этот кофермент, присутствующий во всех живых клетках, входит в состав
ферментов-дегидрогеназ, катализирующих окислительно-восстановительные реакции; выполняет
функцию переносчика электронов и водорода.
Таким образом, кофермент ФАД, активация
синтеза которого возможна в присутствии вышеназванных метаболитов фосфорибозил аминопиримидина и рибитил лумазина, необходим для
синтеза витамин-РР-зависимого кофермента НАД.
experimental gastroenterology
экспериментальная гастроэнтерология
31
Рис. 5. Химическая структура рибофлавина (слева) и белкового кофермента флавинадениндинуклеотида (ФАД, справа).
E XPE R I ME NTA L & CLI N ICA L GASTROE NTE ROLOGY
ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
Таблица 3
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФУНКЦИИ НАДЗАВИСИМЫХ БЕЛКОВ КЛЕТОК МИКРОБИОТЫ (на примере E. coli)
Число
белков
Код функции по БД GO
38
GO: 0009055
27
GO: 0048038
Связывание хинона для повышения антиоксидантного ресурса микробиоты
11
GO: 0009061
Анаэробное дыхание, переработка уксусной и муравьиной кислот, этанола
и глицерина
9
GO: 0006099
Цикл трикарбоновых кислот (Кребса)
Функция
Реакции переноса электронов (энергетический метаболизм, в том числе метаболизм белков, жиров и углеводов)
9
GO: 0008615
Процессы биосинтеза пиридоксина
8
GO: 0009060
Аэробное дыхание
7
GO: 0009103
Биосинтез липополисахаридов бактериальной стенки для повышения
устойчивости против неблагоприятных факторов (химических, вирусных,
бактериальных)
6
GO: 0009447
Обезвреживание путресцина (устранение «дурного запаха» изо рта)
6
GO: 0046677
Активация защитных реакций для повышения выживаемости на фоне воздействия антибиотиков, детоксикация соединений азота
Таблица 4
ПИРИДОКСИНЗАВИСИМЫЕ ФЕРМЕНТЫ E. COLI
Отдельно указаны магний-зависимые ферменты. Ферменты с неизвестной функцией (n = 12) исключены
32
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
№2/2013
Рис. 6. Химическая структура кофермента никотинамид адениндинуклеотидфосфата (NADP).
Биохимический процесс
Число
ферментов
Биосинтез аминокислот, потенцирование белково-синтетической функции нормофлоры
25
Kbl argD bioA alr dadX tyrB aspC ilvE metC metB
cysM lysA gadA gadB alaA alaC hisC ltaE selA ilvA
ybdL spec malY thrC trpB avtA
Деградация аминокислот, детоксикация
9
gabT adiA speA (Mg) dsdA gcvP tdcB ldcC astC tnaA
Метаболизм витамеров В6, поддержка усвоения
витамина В6
8
pdxA (Mg) epd pdxB serC ybhA (Mg) pdxY pdxJ pdxK
Утилизация макро- и микроэлементов (углерода, серы, селена и др.) из различных источников,
детоксикация
7
puuE iscS sufS csdA dcyD patA Cof (Mg)
Метаболизм углеводов, энергетический метаболизм бактериальной клетки
6
yihX (Mg) glgC glgP rffA malP arnB
Биосинтез биотина, фолатов, тиамина, стимуляция усвоения витаминов и поддержание
витаминного баланса
4
bioF pabC thiD glyA
Синтез порфиринов, обезвреживание желчных
кислот
2
hemL hemC
Кодовые обозначения ферментов/генов
МЕТАБОЛИЗМ ВИТАМИНА В6
Связанные с биосинтезом витамина В6 метаболиты, найденные в ходе метаболомного
анализа (фосфонооксибутаноаты, производные пиридоксаля, пиридоксилактон и др.),
производят витамин В6 не столько для нужд
организма хозяина, сколько для поддержания метаболической активности самой
микробиоты. По данным настоящего анализа, производное витамина В6 пиридоксаль
фосфат входит в состав более чем 70 таких важных
для E. coli ферментов, как глутамат декарбоксилаза
(синтез короткоцепочечных жирных кислот, профилактика диабета), триптофаназа (расщепление
аминокислоты триптофана), цистеин десульфураза
(утилизация серы из цистеина, обезвреживание
токсинов, связанных с SH-группами), порфиринобилиноген деаминаза (обезвреживание желчных
кислот), аденилосукцинат синтаза и аминобутират
синтаза (метаболизм короткоцепочечных жирных
кислот, профилактика запоров) и других, поддерживающих разнообразные процессы внутри бактериальной клетки (табл. 4). Являясь кофактором
белка, вовлеченного в транспорт и переработку
мальтозы (ген MalY, цистатионазная активность),
пиридоксаль фосфат напрямую определяет способность E. coli перерабатывать мальтозу и, следовательно, необходим для выживания этой и других
бактерий микробиоты [4].
Найденные в ходе метаболомного анализа фосфонооксибутаноат, 4-фосфогидрокситреонин и пиридоксаль служат для синтеза активной формы пиридоксина (пиридоксаль 5-фосфата) в позитивной
флоре кишечника. Фосфонооксибутаноат и 4-фосфогидрокситреонин могут трансформироваться
друг в друга и затем каждый из них трансформируется в 3-амино-1-гидроксиацетон-1-фосфат, из
которого синтезируется активная форма витамина
В6, пиридоксин и пиридоксаль фосфат. Метаболит
4-фосфогидрокситреонин (3-гидроксигомосерин
фосфат) является обязательным промежуточным
продуктом биосинтеза пиридоксаль-5’-фосфата
в E. coli [5]. Превращение 4-фосфогидрокситреонина
в упоминаемый выше 3-амино-1-гидроксиацетона1-фосфат осуществляется цинк-зависимым ферментом PdxA дегидрогеназой (рис. 7) *.
*
На цветной вклейке в журнал.
experimental gastroenterology
экспериментальная гастроэнтерология
инициирует реакцию клеток микробиоты на
стресс и преобразует токсичные метаболиты
метилглиоксаля в ацетол. Флавогемопротеин
(hmp) участвует в детоксикации химически
активного оксида азота NO, избыточно образующегося в аэробных процессах, и защищает микробиоту от различных токсичных
соединений азота, играя центральную роль
в инициировании ответа клеток микробиоты на нитрозативный стресс.
33
Этот кофермент нужен для поддержания активности многочисленных НАД-зависимых белков:
например убихинон оксидоредуктазы, киназы изоцитрат дегидрогеназы, формиатдегидрогеназы H,
глицерин дегидрогеназы и многих других. В табл. 3
приведены молекулярные функции белков, активность которых зависит от НАД.
Среди НАД-зависимых ферментов, особо следует отметить те, которые необходимы для выживания нормофлоры кишечника при различных
внешних условиях. Например, ферменты комплекса окисления жирных кислот (fadB, fadJ и т. д.) участвуют в аэробной и анаэробной деградации длинноцепочечных жирных кислот. НАД-зависимый
фермент изоцитрат дегидрогеназа (icdA) является
необходимой составляющей цикла трикарбоновых
кислот (цикл Кребса) и необходим для переработки
сахаров бактериями микробиоты. В то же время
НАД-зависимый фермент киназа изоцитрат дегидрогеназы (aceK) позволяет бактериям нормофлоры
синтезировать АТФ в обход цикла Кребса через
глиоксилатный шунт при наличии в среде других
источников углерода. Так, при избытке глюкозы
активен вышеупомянутый фермент изоцитрат дегидрогеназа, а если бактерия использует в качестве источника углерода ацетат (уксусная кислота)
или этанол, то киназа изоцитрат дегидрогеназы
«выключает» фермент изоцитрат дегидрогеназу
и ориентирует метаболизм клетки на доступный
источник углерода. Параллельно происходит эффективное обезвреживание ацетата и этанола
в кишечном транзите.
Несмотря на то что уксусная кислота, этанол,
муравьиная кислота, глицерин являются нормальными продуктами кишечного метаболизма, избыток этих веществ может оказывать негативное
влияние на функцию ЖКТ. Например, избыток
глицерина вызывает диарею; избытки муравьиной и уксусной кислот стимулируют эрозивные
процессы. Существуют и другие НАД-зависимые
ферменты, необходимые для переработки вышеназванных веществ. Например, фермент формиатдегидрогеназа H (fdhF) разлагает муравьиную кислоту
на водород и углекислый газ в анаэробных условиях. Другой НАД-зависимый фермент, глицерин
дегидрогеназа (gldA), катализирует НАД-зависимое
окисление глицерина в дигидроксиацетон и позволяет микроорганизмам нормофлоры использовать
глицерин в качестве источника углерода в анаэробных условиях. В E. coli важная роль этого фермента
заключается также в регулировке внутриклеточного уровня дигидроксиацетона путем обратной
конвертации дигидроксиацетона в глицерин.
Ряд НАД-зависимых ферментов участвует
в процессах детоксикации, что весьма важно как
для выживания нормофлоры, так и способствует
обезвреживанию токсических метаболитов в организме хозяина. Фермент глицеральдегид-3-фосфатредуктаза (ген gpr) катализирует восстановление и детоксикацию глицеральдегид-3-фосфата,
E XPE R I ME NTA L & CLI N ICA L GASTROE NTE ROLOGY
ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
34
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
№2/2013
Делеция гена PdxA дегидрогеназы оказывает
существенное воздействие на выживание позитивной флоры: удаление гена вызывает торможение
биосинтеза пиридоксина и значительно тормозит
рост бактерий позитивной флоры [6]. Дефицит цинка также будет вызывать торможение метаболизма
пиридоксина. Таким образом, фосфонооксибутаноат, 4-фосфогидрокситреонин и пиридоксаль
(предположительно содержащиеся в составе Хилак
Форте) будут способствовать накоплению пиридоксина в микроорганизмах позитивной флоры.
Пиридоксин является принципиально необходимым для активации упоминаемых в табл. 4 пиридоксин-зависимых ферментов.
Рассмотрим некоторые из пиридоксин-зависимых ферментов на примере E. coli. Несколько
В6-зависимых ферментов необходимы для выживания бактерий в определенных условиях обеспеченности теми или иными молекулами-источниками биоэлементов. Иначе говоря, эти ферменты
важны для усвоения биоэлементов из пищевого
транзита. Например, В6 -зависимая 4-аминобутират аминотрансфераза puuE обеспечивает перенос аминогруппы гамма-аминобутирата (ГАМК)
в альфа-кетоглутарат, что важно для использования продукта гнилостного брожения путресцина
в качестве источника азота и углерода. Путресцин
также является основным молекулярным компонентом, приводящим к «дурному запаху» изо рта.
Фермент цистеин десульфураза (sufS) необходим
для удаления элементарной серы и селена из цистеина и селеноцистеина для синтеза аланина и для
сохранения серы и селена внутри бактерий нормофлоры. Магний-зависимый фермент гидроксиметилпиримидин пирофосфат фосфатаза Cof (Mg)
создает устойчивость позитивной флоры к антибиотикам, уменьшая формирование токсических
форм этих ксенобиотических веществ.
Ряд В6-зависимых ферментов необходимы для
поддержания внутри- и внеклеточного рН (кислотности), одного из принципиальных факторов выживания бактериальной клетки. Фермент глутамат
декарбоксилаза альфа-gadA конвертирует глутамат в гамма-аминобутират (ГАМК), поддерживая
внутриклеточный рН, близкий к нейтральному.
Фермент лизиндекарбоксилаза ldcC обеспечивает
конвертацию L-лизина в кадаверин и поддерживает
гомеостаз рН, нейтрализуя кислые побочные продукты брожения углеводов. В то же время фермент
аргинин декарбоксилаза adiA регулирует рН перерабатывая аргинин из белков.
Из микробиологии известно, что различные
организмы могут использовать совершенно разные
транспортные/метаболические механизмы для усвоения определенных питательных веществ, причем потребности в тех или иных формах витаминов соответствует этим механизмам. Пиридоксин
гидрохлорид оказывает дифференцированное
воздействие на различные виды бактерий: например, подавляет рост альфа-гемолитического
стрептококка [7], но поддерживает рост необходимых для организма бактерий рода Lactobacillus [8; 9].
E. coli использует для процессов роста три
нефосфорилированные формы витамина B 6 [10].
В этом представителе нормофлоры были установлены три особенных биохимических пути,
обеспечивающих синтез пиридоксальфосфата
в отсутствие активности фермента фосфоэритронат дегидрогеназы (PdxB), вовлеченного в стандартный путь биосинтеза [11]. При дефиците
активности данного фермента (например, вследствие дефицитов тех или иных микронутриентов)
синтез В 6 осуществляется на основе метаболитов биосинтеза серина с участием упомянутого
4-фосфогидрокситреонина, что повышает выживаемость этой необходимой для микробиоты
бактерии в условиях нутриентного дефицита.
Таким образом, пиридоксин и другие формы
витамина В 6 необходимы для выживания нормофлоры кишечника. И наоборот, здоровая нормофлора обеспечивает синтез витамина В 6 из
продуктов пищевого транзита, способствуя профилактике дефицита пиридоксина и патологий,
связанных с дефицитом этого витамина. Поэтому
прием Хилак Форте, оказывая поддержку биохимических путей метаболизма пиридоксина, может
способствовать развитию нескольких клинических
эффектов. Во-первых, поддерживая рост нормофлоры у пациентов с деформациями микробиоты,
он будет способствовать устранению запаха изо
рта, обусловленного отчасти избытком путресцина.
Во-вторых, поддерживая метаболизм короткоцепочечных жирных кислот, он нормализует динамику пищевого транзита. В-третьих, поддержка
пиридоксинового метаболизма способствует вытеснению патогенной и условно патогенной флоры.
Таким образом, молекулярные компоненты, например препарата Хилак Форте, могут активировать синтез витаминов В2 (рибофлавин), РР (никотинамид), В6 (пиридоксин), которые играют важные
роли в ферментативных реакциях, обеспечивающих выживание нормофлоры кишечника. Наличие
в среде питания этих витаминов или же метаболитов, стимулирующих их синтез/накопление, необходимо для роста бактерий [12]. Обогащение
питательной среды бактерий нормофлоры этими
и другими витаминами группы В улучшает синтез молочной кислоты и стимулирует процессы
клеточного роста [13]. Фолаты, витамины РР, В5, В6
и В2 значительно стимулируют рост лактобактерий
и синтез экзополисахаридов [14; 15], повышающих
устойчивость нормофлоры к негативным воздействиям. Исследование 10 штаммов Lactobacillus
показало, что витамины группы В способствуют
росту лактобактерий, более активному использованию простых сахаров и синтезу короткоцепочечных кислот [16]. Вещества, специфически тормозящие активность ФАД-зависимых ферментов,
характеризуются значительной антибиотической
активностью [17].
В метаболомах представителей позитивной микрофлоры кишечника, входящих в состав экстракта для
приготовления препарата Хилак Форте, установлено
наличие менахинонов и менахинолов. Эти вещества,
образующие различные формы витамина К (рис. 8),
входят в состав плазменных мембран бактерий, где
они играют важную роль в переносе электронов,
окислительном фосфорилировании и повышении
антиоксидантного ресурса нормофлоры.
Витамином K называют группу структурно похожих жирорастворимых витаминов, являющихся
производными менахинонов. В организме человека
витамин К необходим для активации определенных белков посредством так называемых посттрансляционных изменений. Например, витамин
К принципиально необходим для активации белков
свертывания крови и белков метаболических путей
соединительной и костной тканей. Витамин K1,
также известный как филлохинон или менадион,
синтезируется растениями. Нормофлора толстого
кишечника синтезирует витамин K 2 и также способствует конвертации витамина K1 в K 2 [18].
Менахинолы и менахиноны важны для метаболизма короткоцепочечных жирных кислот.
В частности, фермент хинолин-фумарат редуктаза
(ген QFR, также известен как FrdA, рис. 9)* — интегральный мембранный комплекс, являющийся
одним из неотъемлемых компонентов анаэробного
дыхания микробиоты. Это фермент катализирует заключительный этап анаэробного окисления.
Мембранно-растворимый менахинол переносит
электроны к этому ферменту, связываясь непосредственно с клеточной мембраной. Хинолин-фумарат
редуктаза также является ФАД-зависимым ферментом. Делеции гена FrdA снижают окисление
сукцината и фумарата на 75% [19]. Соответственно
к подобному эффекту будет приводить и дефицит
менахинона. Поэтому наличие менахинона в составе Хилак Форте будет способствовать повышению
антиоксидантного ресурса микробиоты и активации процессов клеточного дыхания.
Помимо хинолин-фумарат редуктазы менахинон и менахинол участвуют и в других окислительно-восстановительных процессах, важных для
выживания микробиоты. В частности, менахинон необходим в цикле Кребса для трансформации
малата в оксалоацетат, лактата — в пируват;
*
На цветной вклейке в журнал.
менахинол способствует восстановлению
кофермента НАД. Кроме того, менахинон
участвует в биосинтезе гема из протопорфириногена IX и оротата из дигидрооротата.
Следует также отметить, что среди витаминов с антиоксидантными свойствами витамин
С может играть особую роль в поддержании
выживания именно позитивной микрофлоры.
Так, марганец-зависимый фермент аскорбат
6-фосфат лактоназа (ulaG) необходим для
возможности использовать L-аскорбиновую
кислоты в качестве единственного источника
углерода в анаэробных условиях роста (рис. 10)*
[3]. При этом, как показал результат настоящего анализа, данный фермент имеется у S. faecalis, E. coli и отсутствует у изученных представителей негативной
микрофлоры кишечника. Марганец, являющийся
неотъемлемой частью этого фермента, необходим,
таким образом, для усвоения микробиотой витамина
С. Поэтому прием витамина С будет способствовать
выживанию именно позитивной флоры.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Клинические исследования показывают перспективность использования метаболических пребиотиков (экстрактов продуктов обмена веществ
позитивной флоры) для стимулирования роста нормофлоры. Метаболический пребиотик Хилак Форте
содержит значительное количество метаболитов,
водных субстратов продуктов обмена веществ из
таких представителей микробиоты, как Escherichia
coli, Streptococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus
и Lactobacillus helveticus. Сравнительный метаболомный анализ показал, что метаболиты в составе
Хилак Форте могут способствовать нормализации метаболизма микробиотой таких важных для
выживания клеток микробиоты кофакторов, как
пиридоксальфосфат (витамин В6), флавинадениндинуклеотид (ФАД) и никотинамид динуклеотида
(НАД), оказывающих существенное воздействие
на энергетический метаболизм и антиоксидантный
ресурс микробиоты (рис. 11)*. Результаты настоящего анализа также позволяют предположить существенный синергизм между витаминами группы
В (прежде всего витаминов В2, РР и В6) и определенными микроэлементами (цинк, марганец, магний),
с одной стороны, и с молекулярными компонентами
препарата Хилак Форте — с другой. Последнее делает весьма актуальным проведение исследований микроэлементного состава аналогичных препаратов.
35
БИОСИНТЕЗ И ФУНКЦИИ ВИТАМИНА K
experimental gastroenterology
экспериментальная гастроэнтерология
Рис. 8. Пример структуры бактериального менахинона (менахинон-8). Менахинол отличается от менахинона
заменой одной из групп =О на –ОН.
E XPE R I ME NTA L & CLI N ICA L GASTROE NTE ROLOGY
ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
36
№2/2013
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
ЛИТЕРАТУРА
1. Лиманова О. А. Избирательная модуляция роста позитивной
флоры кишечника — новая концепция воздействия метаболического пребиотика Хилак Форте / О. А. Лиманова, И. Ю. Торшин,
Е. В. Гарасько, О. А. Громова // Consilium Medicum. — 2012. — № 20
(253). — С. 47–56.
2. Torshin I. Yu. Bioinformatics in the post-genomic era: physiology
and medicine / I. Yu. Torshin. — Nova Biomedical Books, NY, USA
2007. — ISBN: 1600217524.
3. Caspi R. MetaCyc: a multiorganism database of metabolic pathways
and enzymes / R. Caspi, H. Foerster, C. A. Fulcher, R. Hopkinson,
J. Ingraham, P. Kaipa, M. Krummenacker, S. Paley, J. Pick, S. Y. Rhee,
C. Tissier, P. Zhang, P. D. Karp // Nucleic Acids Res. — 2006. — Vol.
34. — D511–5116.
4. Schlegel A. Network regulation of the Escherichia coli maltose system /
A. Schlegel, A. Bohm, S. J. Lee, R. Peist, K. Decker, W. Boos // J. Mol.
Microbiol. Biotechnol. — 2002. — Vol. 4, No. 3. — P. 301–307.
5. Zhao G. 4-Phospho-hydroxy-L-threonine is an obligatory intermediate in pyridoxal 5’-phosphate coenzyme biosynthesis in Escherichia coli
K-12 / G. Zhao, M. E. Winkler // FEMS Microbiol. Lett. — 1996. — Vol.
135, No. 2–3. — P. 275–280.
6. Wetzel D. K. Functional complementation between the PDX1 vitamin
B6 biosynthetic gene of Cercospora nicotianae and pdxJ of Escherichia
coli / D. K. Wetzel, M. Ehrenshaft , S. A. Denslow, M. E. Daub // FEBS
Lett. — 2004. — Vol. 564, No. 1–2. — P. 143–146.
7. Sherman S. P. Pyridoxine inhibition of a symbiotic streptococcus /
S. P. Sherman, J. A. Washington 2nd. // Am. J. Clin. Pathol. — 1978. — Vol.
70, No. 4. — P. 689–690.
8. Vera Pingitore E. Influence of vitamins and osmolites on growth
and bacteriocin production by Lactobacillus salivarius CRL 1328
in a chemically defi ned medium / E. Vera Pingitore, E. M. Hebert,
F. Sesma, M. E. Nader-Macias // Can. J. Microbiol. — 2009. — Vol. 55,
No. 3. — P. 304–310.
9. Mulligan J. H. Transport and metabolism of vitamin B6 in lactic acid
bacteria / J. H. Mulligan, E. E. Snell // J. Biol. Chem. — 1977. — Vol. 252,
No. 3. — P. 835–839.
10. Yamada R. H. Uptake and utilization of vitamin B6 and its phosphate
esters by Escherichia coli / R. H. Yamada, T. Tsuji, Y. Nose // J. Nutr. Sci.
Vitaminol (Tokyo). — 1977. — Vol. 23, No. 1. — P. 7–17.
11. Kim J. Th ree serendipitous pathways in E. coli can bypass a block
in pyridoxal-5’-phosphate synthesis / J. Kim, J. P. Kershner, Y. Novikov,
R. K. Shoemaker, S. D. Copley // Mol. Syst. Biol. — 2010. — Vol. 6. — P. 436.
12. Mandelstam J. Class II reactions: Synthesis of small molecules / J. Mandelstam, K. Mcquillen // Biochemistry of bacterial growth. 2nd ed. — New
York: Wiley, 1976. — P. 202–250.
13. Xu G. Q. Effects of vitamins on the lactic acid biosynthesis of Lactobacillus paracasei NERCB 0401 / G. Q. Xu, J. Chu, Y. P. Zhuang, Y. H. Wang,
S. L. Zhang // Biochem. Eng. J. — 2008. — Vol. 38. — P. 189–197.
14. Cerning J. arbon source requirement for exopolysaccharide production
by Lactobacillus casei CG11 and partial structure analysis of the polymer /
J. Cerning, C.M.G.C. Renard, J. F. Th ibault, C. Bouillanne, M. Landon,
M. Desmazeaud, L. Topisirovic // Appl. Environ. Microbiol. — 1994. —
Vol. 60. — P. 3914–3919.
15. Kojic M. Analysis of exopolysaccharide production by Lactobacillus casei CG11 isolated from cheese / M. Kojic, M. Vujcic, A. Banina,
P. Cocconcelli, J. Cerning, L. Topisirovic // Appl. Environ Microbiol. —
1992. — Vol. 58. — P. 4086–4088.
16. Ewe J. A. Viability and growth characteristics of Lactobacillus in
soymilk supplemented with B-vitamins / J. A. Ewe, W. N. Wan-Abdullah,
M. T. Liong // Int. J. Food Sci. Nutr. — 2010. — Vol. 61, No. 1. — P. 87–107.
17. Zhao Y. Discovery and development of the covalent hydrates of trifluoromethylated pyrazoles as riboflavin synthase inhibitors with antibiotic
activity against Mycobacterium tuberculosis / Y. Zhao, A. Bacher, B. Illarionov, M. Fischer, G. Georg, Q. Z. Ye, P. E. Fanwick, S. G. Franzblau, B. Wan,
M. Cushman // J. Org. Chem. — 2009. — Vol. 74, No. 15. — P. 5297–5303.
18. Shearer M. J. Metabolism and cell biology of vitamin K / M. J. Shearer,
P. Newman // Thromb Haemost. — 2008. — Vol. 100, No. 4. — P. 530–547.
19. Baba T. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene
knockout mutants: the Keio collection / T. Baba, T. Ara, M. Hasegawa,
Y. Takai, Y. Okumura, M. Baba, K. A. Datsenko, M. Tomita, B. L. Wanner,
H. Mori // Mol. Syst. Biol. — 2006. — Vol. 2. — P. 2006–2008.
ИЛЛЮСТРАЦИЯ К СТАТЬЕ
ПИЩЕВАРИТЕЛЬНАЯ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ ЖЕЛУДКА У ДЕТЕЙ С ПОЗИЦИЙ
КЛИНИЧЕСКОЙ МОРФОЛОГИИ И ЕЕ РОЛЬ В ОЦЕНКЕ ПОКАЗАНИЙ
К НУТРИЦИОННОЙ ПОДДЕРЖКЕ
Рис. 1. Слизистая оболочка тела желудка, граница между ОСЭ и желудочными железами (стрелка), окраска — толуидиноый синий.
ИЛЛЮСТРАЦИИ К СТАТЬЕ
СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ МЕЖДУ МЕТАБОЛИЗМОМ ВИТАМИНОВ
МИКРОБИОТОЙ И ВЫЖИВАНИЕМ ПОЗИТИВНОЙ МИКРОФЛОРЫ ЖКТ
Рис. 1. Молекулярные механизмы воздействия компонентов беззародышевых водных субстратов продуктов обмена веществ позитивной
флоры кишечника.
Рис. 2. Относительные размеры метаболомов исследованных представителей кишечной микробиоты. Метаболом — массив всех метаболитов
клетки. Исследовано 4 типичных представителя позитивной флоры (Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
helveticus) и 3 представителя условно-патогенной флоры (Clostridium difficile, Staphylococcus аureus, Candida аlbicans). Модели метаболомов (в виде
списков входящих в каждый метаболом молекул) были получены с использованием программного обеспечения BioCyc [3].
Рис. 3. Гидролиз ГТФ до фосфорибозил аминопиримидина — начальная стадия синтеза рибофлавина. Показаны уравнение химической
реакции и пространственная структура Mg-, Zn-зависимого фермента ГТФ-циклогидролазы II (PDB код 2BZ0), катализирующего данную
биотрансформацию. Показаны молекула аналога ГТФ, ионы цинка
и магния в активном центре фермента.
Рис. 4. Последняя стадия синтеза рибофлавина и структура соответствующего фермента. Показано расположение рибофлавина
в активном центре фермента (PDB 1HZE).
Рис. 7. Превращение фосфогидрокситреонина и пространственная
структура фермента PdxA дегидрогеназы, поддерживающего данную
реакции (модель на основе PDB 1PS6). Показаны ион цинка и молекула
фосфогидрокситреонина в активном центре фермента.
Рис. 10. Пространственная структура марганец-зависимого фермента аскорбат 6-фосфат лактоназа (PDB 2WYM). Показан ион
марганца в активном центре (сфера).
Рис. 9. Химические процессы трансформации различных форм витамина К и пространственная структура фермента хинолин-фумарат
редуктазы. Показаны менахинон (решетчатая модель) и флавинадениндинуклеотид (ФАД, сферическая модель) в активном центре
фермента (PDB 1L0V).
Рис. 11. Молекулярные механизмы воздействия метаболитов в составе Хилак Форте на метаболизм витаминов, детоксикацию пищевого
транзита и выживание микробиоты.
ИЛЛЮСТРАЦИИ К СТАТЬЕ
СИНДРОМ ПЕРЕКРЕСТА АУТОИММУННОГО ГЕПАТИТА И ПЕРВИЧНОГО
БИЛИАРНОГО ЦИРРОЗА С ИСХОДОМ В ЦИРРОЗ ПЕЧЕНИ, ОСЛОЖНЕННЫЙ
ФАТАЛЬНЫМ ТОНКОКИШЕЧНЫМ КРОВОТЕЧЕНИЕМ
Рис. 1. Эрозии тонкой кишки.
Рис. 2. Геморрагии и эрозии тонкой кишки.