ДЕСТРУКЦИЯ ХИТОЗАНА В РАСТВОРЕ ПОД ДЕЙСТВИЕМ

Реклама
раздел ХИМИЯ
44
УДК 541.64:536
ДЕСТРУКЦИЯ ХИТОЗАНА В РАСТВОРЕ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ФЕРМЕНТА
ГИАЛУРОНИДАЗЫ
© В. В. Чернова1, В. П. Володина2, Е. И. Кулиш1*, С. В. Колесов1
1
Башкирский государственный университет
Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел.: +7 (340) 273 66 08.
2
Институт органической химии Уфимского научного центра РАН
Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Е-mail: [email protected]
Рассмотрены особенности протекания ферментативной деструкции хитозана в растворах уксусной кислоты под действием фермента гиалуронидаза. Оценено влияние концентрации хитозана, концентрации фермента и концентрации уксусной кислоты в растворе, а
также температуры процесса на степень ферментативного разложения хитозана в растворе. По степени падения молекулярных масс в ходе деструкции предполагается, что неспецифический фермент гиалуронидаза разрушает основную цепь хитозана.
Ключевые слова: хитозан, фермент, деструкция, молекулярная масса.
Уникальные свойства получаемого из возобновляемого природного сырья природного полисахарида хитозана (ХТ) – его совместимость с тканями человека, биоинертность и бактериостатичность, влагопроницаемость и другие свойства –
делают его полимером, пригодным для использования в медицинских целях [1, 2]. Среди многочисленных достоинств ХТ – его биоразрушаемость до
обычных для организма веществ. Это определяет
возможность использования данного полимера при
создании биодеградируемых полимерных носителей в виде пленок, например, в терапии ожоговых
ран [3–5]. В условиях медицинского применения
хитозановых материалов их биодеградация осуществляется под действием неспецифических ферментов (в том числе ферментов, присутствующих на
коже – коллагеназы, гиалуронидазы и др.). В связи
с этим рассмотрение факта деструктирующего
влияния на ХТ неспецифических ферментов представляется важной задачей как с научной, так и с
практической точек зрения.
В качестве объектов исследования был выбран
образец ХТ (ТУ 6-09-05-296-76, фирма «Химмед»
Россия), полученный щелочным дезацетилированием крабового хитина (степень деацетилирования
~75% с Мη=120000), и ферментный препарат гиалуронидаза (ГУП «Иммунопрепарат», Уфа). Растворы ХТ готовили перемешиванием в течение 8–
10 часов при комнатной температуре. В качестве
растворителя была использована уксусная кислота
концентрацией 1, 5 и 10 г/дл. Ферментный препарат, предварительно растворенный в небольшом
количестве воды, вносили в раствор ХТ непосредственно перед началом изучения процесса деструкции. Температура проведения процесса составляла
25, 35 и 40 °С. Глубину деструктивного превращения ХТ в растворе оценивали по падению относительной вязкости раствора ХТ в присутствии фермента ∆η по отношению к относительной вязкости
исходного раствора ХТ η0, (в %). Значение относительной вязкости раствора фермента составляло
* автор, ответственный за переписку
менее 1% от вязкости раствора ХТ, и его вклад в
значения вязкости раствора не учитывался. Характеристическую вязкость ХТ определяли вискозиметрически в буферном растворе, состоящем из 0.3 м.
уксусной кислоты и 0.2 М ацетата натрия, согласно
стандартной методике [6]. Ошибка эксперимента
составляла не более 5%.
Фермент гиалуронидаза катализирует реакции
гидролитического расщепления и деполимеризации
основного компонента соединительной ткани – гиалуроновой кислоты [7]. Гиалуроновые кислоты представляют собой высокомолекулярные линейные биополимеры, молекулы которых построены из чередующихся остатков D-глюкуроновой кислоты и Nацетил-D-гликозамина, соединенных β-(1→4)- и β(1→3)-связями (рис. 1.а). ХТ является аминополисахаридом, т.е. веществом с близкой к гиалуроновой
кислоте химической структурой (рис. 1.б), и, как оказалось, под действием гиалуронидазы в нем также
протекает процесс ферментативного разложения.
Как показали вискозиметрические исследования, выдержка растворов ХТ в присутствии фермента в течение 26 часов сопровождается постепенным уменьшением относительной вязкости раствора, что свидетельствует о протекании процесса
деструкции. Однако как видно из рис. 2, для того,
чтобы процесс деструкции стал ощутим, требуются
весьма существенные количества фермента. Наличие фермента в растворе порядка 0.1–0.5% масс. по
отношению к ХТ не вызывает заметного уменьшения относительной вязкости раствора. Ощутимым
процесс деструкции становится только лишь при
содержании фермента ≥1% масс.
В общем случае степень деструктивного превращения ХТ от содержания фермента в растворе
зависит нелинейным образом (рис. 3).
Влияние концентрации ХТ в растворе на степень его ферментативного превращения имеет характер экстремальной зависимости между степенью падения относительной вязкости и его содержанием в растворе (рис. 4).
Вестник Башкирского университета. 2009. Т. 14. №1
ISSN 1998-4812
45
а)
O
H
H
OH
H
H
H
OH
O
H
H
H
H
O
H
NH
O
H
H
H
OH
OH
O
H
H
O
H
OH
O
H
CH2OH
COOH
CH2OH
COOH
H
H
OH
H
OH
O
NH
C=O
C=O
CH3
CH3
б)
CH2OH
CH2OH
O
H
H
OH
O
H
O
H
H
OH
O
H
H
H
H
H
NH
NH2
C=O
CH3
Y
X
Рис. 1. Фрагмент цепи гиалуроновой кислоты (а) и хитозана (б).
лярная структура полимера в разных концентрационных режимах принципиально различна [8].
В области разбавленного раствора надмолекулярная структура раствора представляет собой изолированные набухшие макромолекулярные клубки
ХТ, доступность звеньев которых для взаимодействия с ферментом высока.
Рис. 2. Изменение вязкости раствора хитозана от времени
выдержки с ферментом. Концентрация хитозана в растворе –
2 г/дл. Концентрация уксусной кислоты в растворе – 1 г/дл.
Соотношение фермент:ХТ в растворе 0.5: 99.5 (1), 1: 99 (2),
5: 95 (3) и 10: 90 (4). Температура процесса 25 °С.
Данный характер зависимости может быть
объяснен, если учесть тот факт, что область концентраций ХТ порядка 0.35–0.4 г/дл соответствует
области кроссовера, т.е. области перехода полимера
из разбавленного раствора к раствору полуразбавленному. Несмотря на небольшую количественную
разницу в значениях содержания ХТ в растворе до
и после точки кроссовера, качественно надмолеку-
Рис. 3. Изменение вязкости раствора хитозана от содержания в растворе фермента. Концентрация уксусной кислоты в растворе – 1 г/дл. Выдержка раствора хитозана с
ферментом – 3 часа. Содержание хитозана в растворе
0.2 г/дл (1), 0.3 г /дл (2), 0.4 г /дл (3), 0.7 г /дл (4), 1.0 г/дл
(5) и 2.0 г/дл (6). Температура процесса 25° С.
46
Рис. 4. Изменение вязкости раствора хитозана от его содержания в растворе. Концентрация уксусной кислоты в
растворе – 1 г/дл. Выдержка раствора хитозана с ферментом – 3 часа. Соотношение фермент:ХТ 1:99 (1), 5:95(2),
10:90 (3). Температура процесса 25° С.
При переходе к полуразбавленному режиму
раствор представлен перекрывающимися между
собой агрегатами макромолекул, создающими определенные диффузионные затруднения для взаимодействующего с ними фермента. Очевидно, что
доступность звеньев полимера для взаимодействия
с ферментом с переходом к полуразбавленному раствору уменьшается, что, вероятно, и сопровождается
уменьшением степени деструкции ХТ в растворе.
Повышение температуры проведения реакции ферментативной деструкции ХТ приводит к
увеличению степени ферментативного разложения
(рис. 5), на котором сказывается, однако, изменение
концентрации используемой в качестве растворителя уксусной кислоты.
По всей вероятности для растворов уксусной кислоты каждой концентрации имеется свой температурный оптимум, соответствующий максимальной степени
раздел ХИМИЯ
деструкции ХТ. Соответственно и для каждой температуры процесса имеется определенная концентрация уксусной кислоты, обеспечивающая наибольшую глубину
превращения ХТ. Например, при 25° С максимальной
степени деструкции ХТ соответствует концентрация уксусной кислоты в растворе равная 5 г/дл (рис. 6).
Очевидно, что наблюдаемые закономерности измерения относительной вязкости отражают объективно
проходящие в растворе ХТ процессы ферментативного
разложения полимера.
Изменения молекулярной массы ХТ в ходе деструкции рассчитаны по уравнению Марка-Куна-Хаувинка
для ХТ в буферном растворе [9, 10] (табл.).
Как видно из представленных данных, в ряде случаев степень деструкции весьма значительна – молекулярная масса ХТ падает практически в 2 раза. Кроме этого, можно отметить, что с увеличением температуры
происходит существенное нивелирование различия в
степенях деструкции для растворов ХТ, отличающихся
кислотностью среды. Как видно из данных табл., при
температуре деструкции равной 45° С степень падения молекулярной массы практически одинакова для растворов ХТ
в 1 и 10%-ной кислоте, в то время как при 25° С разница
весьма существенна (на 6800 и 37000 соответственно).
Таблица
Характеристики образцов хитозана,
выделенных из 2%-ного раствора хитозана
в уксусной кислоте (Время выдержки с ферментом –
3 часа. Соотношение фермент:ХЗ – 10:90)
Т, °С
25
35
45
[CH3COOH],
г/дл
Изменение в ходе
деструкции
∆М
∆[η]
1
0.25
6800
10
1.05
37000
1
1.45
53000
10
0.80
27000
1
0.85
29000
10
0.70
23000
Рис. 5. Изменение вязкости раствора 2%-ного хитозана от температуры. Концентрация уксусной кислоты в растворе – 1 г/дл
(а) и 10 г/дл (б). Выдержка раствора хитозана с ферментом – 3 часа. Соотношение фермент:ХТ 1:99 (1), 5:95(2) и 10:90 (3).
ISSN 1998-4812
Вестник Башкирского университета. 2009. Т. 14. №1
47
наблюдается уменьшение степени влияния фермента на процесс деструкции хитозана;
в) концентрации уксусной кислоты в растворе –
при температуре 25° С в интервале рН равных
от 2.71 до 2.21 наблюдается экстремальная зависимость степени падения относительной вязкости
с максимумом в области рН = 2.36 (соответствующей 5%-ной кислоте).
3. По степени падения молекулярных масс в ходе
деструкции можно предположить, что неспецифические ферменты разрушают основную цепь хитозана.
Работа выполнена при финансовой поддержке
РФФИ и Республики Башкортостан (грант
р_поволжье_а №08-03-97030).
ЛИТЕРАТУРА
Рис. 6. Изменение вязкости 2%-ного раствора хитозана от
кислотности среды. Выдержка раствора хитозана с ферментом – 3 часа. Соотношение фермент:ХТ 1:99 (1), 5 :95 (2)
и 10:90 (3). Температура 25° С.
Выводы
1. Обнаружен факт протекания ферментативной деструкции хитозана в растворе уксусной кислоты под действием фермента гиалуронидаза.
2. Определено влияние на степень ферментативного разложения:
а) концентрации хитозана в растворе – в интервале
концентраций 0.2–2% масс. наблюдается экстремальная зависимость степени падения относительной вязкости с максимумом в области точки кроссовера;
б) концентрации фермента в растворе – в интервале
концентраций 0.1–10% масс. как общая тенденция
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Muzzarelli R. A. Chitin. Oxford : Pergamon Press, 1977.
Марквичева Е. А. // Хитин и хитозан: получение, свойства
и применение. М.: Наука, 2002. С. 315–326.
Гальбрайх Л. С. // Соросовский образовательный журнал.
2001. Т. 7. №1.С. 51
Сливкин А. И., Лапенко В. Л., Арзамасцев А. П., Болгов А. А. //
Вестник ВГУ. 2005. Серия: Химия. Биология. Фармация.
№2. С. 73–87.
Ильина А. В., Варламов В. П. // Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение. М.: Наука, 2002. С. 79–90.
Рафиков С. Р., Будтов В. П., Монаков Ю. Б. Введение в физико-химию растворов полимеров. М.: Наука, 1978. –328 с.
Meyer K. Hyaluronidases // The Enzimes. NY: Academic
Press, 1971. V. 5, P. 307–320.
Кулиш Е. И., Володина В. П., Фаткуллина Р. Р., Колесов С. В.,
Заиков Г. Е. // Высокомолек.соед. 2008. Серия Б. Т. 50. №7.
С. 1277–1280.
Агеев Е. П., Вихорева Г. А., Матушкина Н. Н., Пчелко О. М.,
Гальбрайх Л. С. // Высокомолек.соед. 2000. Серия А. Т. 42.
№2. С. 333–339.
Гамзадзе А. И., Шлимак В. М., Скляр А. М // Асta Polymerica. 1985. Вd. 36. № 8. S. 420.
Поступила в редакцию 28.10.2008 г.
Скачать