ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ» Айрапетов Марат Игоревич

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ «ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ»
На правах рукописи
Айрапетов Марат Игоревич
ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ДОФАМИНОВОЙ И ГРЕЛИНОВОЙ
СИСТЕМ В ОНТОГЕНЕЗЕ В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛИЗАЦИИ
У КРЫС
03.01.04 – биохимия
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Научные руководители:
кандидат медицинских наук
Бычков Е.Р.,
доктор медицинских наук,
профессор Шабанов П.Д.
Санкт-Петербург – 2015
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
стр.
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………….………….5
ГЛАВА
1.
ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИЕ
И
ГРЕЛИНОВЫЕ
МЕХАНИЗМЫ
АЛКОГОЛЬНОЙ ЗАВИСИМОСТИ (АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР)…….………..13
1.1. Современные представления о дофаминовой системе…………...……………13
1.1.1.
Дофамин
и
дофаминергические
системы
мозга.
Дофаминовая
нейропередача………………………………………………………………....………13
1.1.3. Классификация рецепторов дофамина………………………………………..16
1.1.4. Области экспрессии и локализации рецепторов дофамина…………………17
1.1.5. Онтогенез дофаминовой системы мозга……………………………….…..…19
1.1.6. Функциональная роль рецепторов дофамина………………….……………..23
1.1.7.
Роль
дофамииновой
системы
головного
мозга
в
механизмах
подкрепления……………………………………………………………..…………...30
1.2. Современные представления о грелиновой системе…….……………………..33
1.2.1. Грелин и грелиновая система………………………………………..….……..33
1.2.2. Рецептор грелина……………………………………………………….………34
1.2.3. Физиологическая роль грелина…………………………………..……………35
1.2.4. Онтогенез грелиновой системы………………………………….……………37
1.2.5.
Роль
грелиновой
системы
головного
мозга
в
механизмах
подкрепления……………………………………………………………..…..……….39
1.2.6. Значение грелиновой системы головного мозга в алкогольной и
наркотической зависимости……………………………………………….…………42
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ….………………………………….……….45
2.1. Выбор объекта исследования….………………………………………….……..45
2.2. Определение срока беременности у крыс….…………………………….……..45
2.3. Процедура хронической алкоголизации……………………………..…………45
2.4. Взятие материала…………………………………………………………………46
2.5. Экстракция РНК фенол-хлороформным методом…………………...…………47
3
2.6. Экстракция РНК с использованием тризола……………………..………..……48
2.7. Обработка ДНКазой……………………………………………..………….……48
2.8. Обратная транскрипция………………………………………………….………48
2.9. Полимеразная цепная реакция…………………….…………………….………49
2.10. Агарозный гель-электрофорез ............................................................................50
2.11. Мультиплексная ПЦР с детекцией в режиме реального времени…….……..49
2.12. Высокоэффективная жидкостная хроматография c электрохимической
детекцией……………………………………….…………….………………….…….52
2.13. Иммуноферментный анализ……………………………………………………53
2.14. Статистические методы анализа…………………………………………….…53
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ….………...……55
3.1. Влияние алкоголизации матерей на дофаминовую систему мозга плодов в
пренатальный и в ранний постнатальный периоды…….……………………..……55
3.1.1. Влияние алкоголизации матерей на содержание ДА и ДОФУК в переднем
мозге
плодов
в
пренатальный
и
в
ранний
постнатальный
периоды………………………………………….…………………………………….55
3.1.2. Влияние алкоголизации матерей на экспрессию мРНК дофаминовых
рецепторов и КОМТ в переднем мозге плодов в пренатальный и в ранний
постнатальный периоды……………………….…………….…………………..……60
3.2. Влияние алкоголизации матерей на формирование грелиновой системы в
пренатальный и ранний постнатальный периоды…………………………………..68
3.2.1. Влияние алкоголизации матерей на экспрессию мРНК грелинового
рецептора в переднем мозге плодов в пренатальный и ранний постнатальный
периоды…………………………………………………………….……….…………68
3.2.2. Влияние алкоголизации матерей на уровень дезацилгрелина в сыворотке
плодов в пренатальный и ранний постнатальный периоды…….………………….70
3.3. Влияние хронической алкоголизации и последующей отмены алкоголя на
грелиновую систему взрослых крыс….…………….……………….……………….71
4
3.3.1. Влияние хронической алкоголизации и последующей отмены алкоголя на
экспрессию мРНК грелинового рецептора в структурах мозга взрослых
крыс……………………………………………………………….…….………….…..71
3.3.2. Влияние хронической алкоголизации и последующей отмены алкоголя на
содержание дезацилгрелина в сыворотке крови взрослых крыс….……….………73
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ….…………………75
ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………….…………….………..…….……….85
ВЫВОДЫ………………………….…………………………………..………………87
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ…….…………….…….………..89
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................90
ПРИЛОЖЕНИЕ……………………….………………………………………………91
ЛИТЕРАТУРА…………….…………………………………………………………104
5
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования
В головном мозге высших млекопитающих существует специализированная
система нейронов, дофаминергических (ДА-ергических) по своей химической
организации,
которая
опосредует
эффекты
психостимулирующих
средств
(Bjorklund, Dunnett, 2007; Beaulieu, Gainetdinov, 2011). Эта система имеет
довольно четкую структурно-функциональную организацию и включает передний
мозговой пучок, прилежащее ядро, вентральную область покрышки и медиальную
префронтальную кору (Missale et al., 1998; Bjorklund, Dunnett, 2007; Beaulieu,
Gainetdinov, 2011). Она описывается как мезокортиколимбическая система мозга.
По сути, эта система является жестко детерминированной исполнительной
системой, которая в большинстве случаев отвечает на раздражение активацией
(введение психостимуляторов) или угнетением (под действием, например,
нейролептиков). Возможности изменения активности мезокортиколимбической
системы повышаются при действии на нее различных нейромодуляторов, прежде
всего, пептидной природы, рецепторы которых ко-локализованы на аксонах ДАергической проводящей системы (Шабанов П.Д., Сапронов Н.С., 2010). Одной из
таких управляющих систем рассматривается грелиновая система (Perello et al.,
2010).
Первоначально
считалось,
что
грелиновая
система
ответственна
исключительно за контроль потребления пищи (Wren et al., 2000) и регуляцию
энергетического баланса (Lall et al., 2001; Tschop et al., 2000). Однако последними
исследованиями,
выполненными
в
том
числе
и
в
ФГБНУ
«Институт
экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург), показано, что система грелина
вовлекается не только в регуляцию аппетита, но и в подкрепляющие эффекты
наркогенных субстанций (Айрапетов М.И. и др., 2013).
Степень разработанности темы
Вопрос, каким образом грелиновая система мозга вовлекается в механизмы
естественного (потребление пищи, воды) и искусственного (введение наркогенов)
6
подкрепления, остается до настоящего времени не ясным. Известно только, что
грелин (или его компоненты – ацилированный грелин, дезацилгрелин и
обестатин) активирует холинергическую и ДА-ергическую системы мозга
посредством
пре-
и/или
постсинаптической
сигнализации
прямо
через
специфические грелиновые рецепторы (GHSR) в вентральной области покрышки,
структуре, в которой локализованы ДА-ергические нейроны, формирующие
передний медиальный мозговой пучок, опосредующий подкрепляющие эффекты
наркогенов. Этот пучок четко локализован, содержит около 50 тысяч аксонов и
дает восходящие проекции в большинство эмоциогенных структур лимбической
системы (миндалина, прилежащее ядро, ядра ложа конечной полоски, безымянная
субстанция, вплоть до префронтальной коры мозга). Таким образом, значение
грелиновой системы в механизмах подкрепления и зависимости от разных
наркогенов, включая алкоголь, до сих пор не определено. Более того,
онтогенетический аспект этой проблемы вовсе не изучался. Это определило цели,
задачи и дизайн настоящей работы.
Цель исследования
Изучить особенности формирования дофаминовой и грелиновой систем в
онтогенезе в условиях хронической алкоголизации у крыс.
Задачи исследования
1. Исследовать уровень дофамина (ДА) и его основного метаболита
диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) в переднем мозге в онтогенезе у крыс,
рожденных от алкоголизированных матерей.
2. Исследовать уровень экспрессии разных подтипов рецепторов дофамина
и активность катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ) в переднем мозге в онтогенезе
у крыс, рожденных от алкоголизированных матерей.
3. Исследовать экспрессию мРНК грелинового рецептора в структурах мозга
у взрослых крыс в условиях полунасильственной хронической алкоголизации и в
переднем мозге в онтогенезе у крыс, рожденных от алкоголизрованных матерей.
7
4. Исследовать уровень дезацилгрелина в плазме крови у взрослых крыс в
условиях полунасильственной хронической алкоголизации и в онтогенезе у крыс,
рожденных от алкоголизированных матерей.
Научная новизна
В результате проведенных исследований получены новые данные об
участии системы грелина в механизмах формирования зависимости от этанола, в
том числе на разных этапах пренатального и раннего постнатального развития. В
частности, показано, что алкоголизация беременных самок крыс тормозит
развитие
ДА-ергической
системы
(снижается
содержание
ДА,
ДОФУК,
активность КОМТ, но увеличивается экспрессия Д2-подтипов рецепторов ДА)
головного мозга плодов в пре- и ранний постнатальный период развития. Перевод
кормящих самок на водный режим (без алкоголя) восстанавливает активность ДАергической системы мозга крыс к 17-му дню постнатального развития. Уровень
дезацилгрелина (активной формы грелина) в плазме крови половозрелых крыс в
условиях
полунасильственной
хронической
алкоголизации
снижается,
а
экспрессия мРНК грелинового рецептора в головном мозге увеличивается. В
пренатальный период в головном мозге плодов экспрессия мРНК грелинового
рецептора в период алкоголизации матерей не меняется. Однако в постнатальный
период у крысят, матери которых оставались на режиме алкоголизации или
переводились на водный режим, экспрессия мРНК в головном мозге плодов в
головном мозге была повышена. В то же время в плазме крови содержание
дезацилгрелина было сниженным. Полученные данные подтверждают участие
системы грелина в механизмах формирования зависимости от этанола. В
частности,
доказано,
что
эмоциональные
расстройства,
связанные
с
алкоголизацией, вовлекают не только ДА-ергическую систему мозга, традиционно
рассматриваемую как мишень действия этанола, но и систему грелина. Последняя
имеет представительство как на периферии (дезацилгрелин), так и в головном
мозге (ацилированный грелин, обестатин) и может выполнять модулирующую
функцию на ДА-ергическую систему мозга, реализуемую как прямо, через
8
специфические
рецепторы
грелина,
локализованные
на
ДА-ергических
терминалях, так и опосредованно через включение механизмов обратной связи.
Это открывает возможности создания антагонистов рецепторов грелина или иных
антигрелиновых веществ, которые смогут подавлять алкогольную мотивацию
либо устранять или уменьшать подкрепляющие свойства наркогенов, включая
этанол.
Теоретическая и практическая значимость
Научно-теоретическая значимость работы определяется доказательством
непосредственного участия системы грелина (дезацилгрелин, рецепторы грелина
GHSR) в механизмах ответа организма и головного мозга, в частности, на
алкоголизацию. Этот ответ обычно описывают как реакцию ДА-ергической
системы мозга, опосредующей разнообразные эмоционально-мотивационные
реакции. В данном исследовании доказано модулирующее действие грелина на
ДА-ергические
ответы,
проявляющееся
изменением
активности
подтипов
рецепторов ДА и активности ферментов катаболизма катехоламинов в головном
мозге. Главным практическим результатом исследования стало выяснение факта,
что алкоголизация крыс в период беременности меняет экспрессию мРНК
рецепторов грелина GHSR в переднем мозге, которая способна восстанавливаться
в постнатальный период независимо от того, алкоголизировалась ли мать или нет
в
период
вскармливания.
То
есть,
вероятность
развития
дисфункции
эмоциональных реакций, вызванных алкоголизацией в период беременности, в
постнатальный
период
уменьшается.
Это
подтверждает
существующие
основополагающие выводы, что эмоциональные расстройства по типу девиантных
отклонений связаны, в основном, с воздействиями неблагоприятных факторов
среды именно в ранний постнатальный период (у крыс с 4-го по 17-й день жизни),
а не в пренатальный период жизни животного (Шабанов П.Д. и др., 2004). Второй
практический вывод работы состоит в обосновании возможности создания
антагонистов
грелина
как
антиаддиктивной направленности.
потенциальных
лекарственных
средств
9
Методология и методы исследования
Методология
исследования
состояла
в
изучении
биохимических
последствий пренатального и постнатального воздействия этанола на организм
беременных самок крыс Вистар и их потомства в период вскармливания, а также в
процессе хронической алкоголизации взрослых крыс. В качестве основных
методов исследования было определение экспрессии мРНК разных подтипов
рецепторов ДА, ферментов катаболизма катехоламинов (КОМТ), рецептора
грелина GHSR и содержания ДА и его метаболитов (ДОФУК) в головном мозге, а
также концентрации дезацилгрелина в плазме крови крыс. Исследования
выполнены с соблюдением всех правил доказательной медицины.
Положения, выносимые на защиту
1. Алкоголизация крыс в период беременности изменяет активность ДАергической системы мозга, что проявляется снижением уровня ДА, а также мРНК
КОМТ в структурах переднего мозга, а также увеличением содержания мРНК
длинного и короткого сплайс-вариантов дофаминового рецептора Д2-типа.
Параллельно снижается уровень дезацилгрелина в сыворотке крови плодов однако
экспрессия мРНК рецептора грелина в мозге компенсаторно увеличивается.
Отмена алкоголизации у самок крыс в период вскармливания потомства ведет к
частичному восстановлению биохимических изменений в головном мозге крысят
в период с 4-го по 17-й день их жизни.
2. Полунасильственная алкоголизация взрослых крыс 15%-ным раствором
этанола в течение 6-ти месяцев существенно не меняет уровень экспрессии мРНК
грелинового рецептора в эмоциогенных структурах мозга (прилежащее ядро,
гипоталамус, гиппокамп, префронтальная кора). Однако отмечается снижение
содержания дезацилированного грелина в сыворотке крови, развивающегося в
процессе хронической алкоголизации.
3. В период отмены этанола после его хронического введения в головном
мозге крыс развиваются процессы, противоположные зарегистрированным при
10
алкоголизации. В частности, увеличивается экспрессия мРНК грелинового
рецептора во фронтальной коре, вентральной тегментальной области и
прилежащем ядре с дальнейшей ее нормализацией к 7-му дню абстиненции. В
гипоталамусе уровень мРНК грелинового рецептора в указанные сроки не
нормализуется. В сыворотке крови увеличивается концентрация дезацилгрелина,
но не достигает нормальных значений.
4. Отдельные компоненты грелиновой системы мозга реагируют не
одинаково (даже разнонаправлено) на отмену алкоголя. В эмоциогенных
структурах, обеспечивающих подкрепляющие эффекты алкоголя (прилежащее
ядро, вентральная тегментальная область) экспрессия мРНК грелинового
рецептора, как правило, увеличивается, а в структурах, ответственных за
регуляцию пищевого поведения и энергетического обмена (гипоталамус),
напротив, снижается.
Степень достоверности и апробация материалов исследования
Степень
достоверности
определяется
достаточным
числом
экспериментальных животных (490 взрослых и новорожденных крыс Вистар),
рандомизацией и формированием групп сравнения и активного контроля,
адекватными
биохимическими,
молекулярными,
фармакологическими
и
токсикологическими методами исследования, длительными сроками наблюдения и
корректными методами статистической обработки.
Реализация результатов работы
Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедр
фармакологии и нормальной физиологии Военно-медицинской академии имени
С.М. Кирова, кафедры фармакологии Санкт-Петербургского государственного
педиатрического медицинского университета МЗ РФ. Работа выполнена в
соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками ФГБНУ
«Институт экспериментальной медицины». Материал диссертации вошел в
11
грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований РАН
(РФФИ №10-04-00473а).
Апробация результатов
Материалы диссертации доложены на IV Съезде фармакологов России
(Казань, 2012); VII Съезде физиологов Сибири (Красноярск, 2012); II
Всероссийской
биомедицинской
научной
науки
конференции
третьего
молодых
тысячелетия»
ученых
«Проблемы
(Санкт-Петербург,
2012);
Всероссийской научной конференции «Фармакологическая протекция» (СанктПетербург, 2013), на заседаниях отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (2011-2015).
Работа рассмотрена и одобрена комитетом по этике ФГБНУ «Институт
экспериментальной медицины».
Публикации
По теме диссертации опубликовано в 11 научных работ, включая 5
журнальных статей (из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ) и 6
тезисов.
Личный вклад автора
Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в
планировании экспериментов, их непосредственном выполнении, обработке
полученных результатов, обсуждении результатов, написании статей и тезисов,
написании диссертации и автореферата.
Объем и структура диссертации
Диссертация оформлена и изложена в соответствии с ГОСТом РФ и состоит
из введения, главы обзора литературы, материалов и методов исследования, трех
глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов,
практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 131
12
странице машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком и 15 таблицами.
Библиографический указатель содержит 254 наименования, в том числе 10
отечественных и 244 иностранных.
13
ГЛАВА 1. ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИЕ И ГРЕЛИНОВЫЕ МЕХАНИЗМЫ
АЛКОГОЛЬНОЙ ЗАВИСИМОСТИ (АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР)
1.1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ДОФАМИНОВОЙ СИСТЕМЕ
1.1.1. Дофамин и дофаминергические системы мозга. Дофаминергическая
нейропередача
Дофамин (ДА) – нейромедиатор, вырабатываемый в мозге людей и
животных. По химической структуре ДА относят к катехоламинам. ДА является
биохимическим предшественником норадреналина и адреналина. Выделяют
следующие
основные
ДА-системы
мозга:
нигростриатную,
тубероинфундибулярную, мезолимбическую и мезокортикальную; две последние
объединяются в единую мезолимбокортикальную систему (рис. 1) (Nestler et al.,
2001;
Bjorklund,
Dunnett,
2007).
В
литературе
описано
так
же
цитоархитектоническое разделение ДА-систем мозга на мезотеленцефалическую
и диэнцефалическую (Раевский К.С. и др., 1996; Новоселов И.А., 2003; Bjorklund,
Dunnett, 2007; Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Рис. 1. Основные скопления дофаминергических нейронов в мозгу крыс (Лебедев,
2002). А12 – аркуатное ядро; А13 – зона инсерта; А14 – перивентрикулярное ядро;
А8, А9, А10 – черная субстанция.
14
ДА
синтезируется
гидроксилируется
в
из
L-тирозина,
который
L-3,4-диоксифенилаланин
внутринейронально
(L-ДОФА)
при
участии
тирозингидроксилазы. Затем из L-ДОФА образуется ДА под действием
декарбоксилазы L-ароматических аминокислот. Синтеза ДА на разных стадиях
регулируется по принципу «обратной связи» (Nestler et al., 2001; Lajtha et. al.,
2007). ДА, содержащийся в нервном окончании, подвергается процессу
компартментализации. Согласно одной из классификаций (Arbuthnott et al., 1990;
Lajtha et. al., 2007) выделяют три основных «пула» ДА: 1) новосинтезируемый ДА
высвобождается путем экзоцитоза при деполяризации нервного окончания. Этот
пул
истощается
альфа-метил-р-тирозином
(блокатор
синтеза
ДА)
и
нечувствителен к действию резерпина, (вызывает опустошение нейрональных
запасов ДА). 2) везикулярный пул ДА, который является его основным местом
хранения внутри терминали, и не принимает участия в потенциал-зависимом
высвобождении нейротрансмиттера (истощается под действием резерпина, но
остается устойчивым к эффектам альфа-метил-р-тирозина). За счет этого пула
восполняется ДА, высвобождающийся путем экзоцитоза, если скорость его
высвобождения
преобладает
цитоплазматический,
пул
над
ДА,
скоростью
синтеза.
непосредственно
участвует
3)
в
третий,
процессах
высвобождения и обратного захвата нейротрансмиттера (рис. 2) (Раевский К.С. и
др., 1996; Новоселов И.А., 2003).
Существует альтернативная модель депонирования ДА, в которой выделяют
два основных пула: лабильное депо (цитоплазматический пул) и стабильное депо
(везикулярный пул) (Leviel et al., 1989; Pivonello et al., 2007; Brady et. al., 2012).
Высвобождаясь из варикозных окончаний нейронов в синаптическую щель, ДА
взаимодействует с пре- и постсинаптическими ДА рецепторами, а затем
инактивируется
прилегающими
во
внеклеточном
глиальными
пространстве,
клетками.
Значительная
либо
часть
захватывается
ДА
активно
закачивается из внеклеточного пространства обратно в нейрон при участии
специфического
переносчика
(ДА-транспортера)
и
подвергается
внутринейрональному метаболизму (Новоселов И.А., 2003; Brady et. al., 2012).
15
Рис. 2. Схематическая модель дофаминергического синапса (Лебедев А.А., 2002).
D1, D2, D3 D4, и D5 подтипы рецепторов дофамина. Gi – ингибирующий и Gs –
стимулирующий регуляторные белки. ВМАТ – везикулярный носитель
(транспортер).
Реакции превращения моноаминов катализируются моноаминоксидазой
(МАО) и катехол-О-метилтрансферазой (КОМТ). Главные метаболиты ДА – 3,4диоксифенилуксусная кислота (ДОФУК), образующаяся из ДА под действием
МАО и гомованилиновая кислота, в меньшей степени – 3-метокситирамин. В
отличие от ДОФУК, два последних метаболита образуются во внеклеточном
пространстве при участии КОМТ (Новоселов И.А., 2003; Matsumoto et al., 2003;
Missale et al., 2010; Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
В регуляции гомеостаза ДА-ергического нейрона участвуют специфические
переносчики – дофаминовый транспортер (ДАТ) и везикулярный моноаминовый
транспортер (ВМАТ) (Gainetdinov, Caron, 2002; Pivonello et al., 2007). ДАТ
принадлежит к семейству Na+/Cl--зависимых субстратспецифичных нейрональных
транспортеров
и
представляет
собой
мембранно-локализованный
белок,
обеспечивающий обратный захват ДА из внеклеточного пространства. ДАТ играет
ключевую роль в регуляции синаптической передачи сигнала, а также является
16
мишенью для различных фармакологических препаратов: антидепрессантов,
амфетаминов и кокаина, номифензина (Jones et al., 1999; Missale et al., 2010).
BMAT участвует в процессе транспортировки ДА в синаптические везикулы
(Miller et al., 1999; Pivonello et al., 2007). Нарушение функционирования ДАТ и
ВМАТ связывают с дисфункцией транссинаптической передачи сигнала,
процессами токсического повреждения нейронов и некоторыми нервными и
психическими заболеваниями (синдром Паркинсона, алкоголизм, шизофрения,
депрессия) (Новоселов, 2003; Alcaro et al., 2007).
1.1.3. Классификация рецепторов дофамина
По эффектам на систему внутриклеточного синтеза цАМФ, ДА рецепторы
делятся на две группы: Д1-подтип (активирует аденилатциклазную систему
клетки (АЦ) и стимулирует накопление вторичного посредника цАМФ) и Д2подтип, (ингибирует АЦ или не оказывает на нее действия) (Clark, White, 1997;
Missale et al., 1998; Lajtha, 2007; Brady et al., 2012).
Методами молекулярной биологии идентифицировано и охарактеризовано
еще три рецепторных подтипа – Д3, Д4 и Д5. ДА-рецепторы относятся к
семейству
метаботропных
рецепторов
нейротрансмиттеров
и
гормонов,
сопряженных с гетеротримерными G-белками (ГТФ-связывающими) (Pivonello et
al., 2007).
Для генов ДА-рецепторов характерно отсутствие интронов в кодирующих
областях генов Д1- и Д5-рецепторов и разное их количество у представителей Д2семейства (Sokoloff et al., 1990; Van Tol et al., 1991; Missale et al., 2010). Наличие
интронов
в
кодирующей
области
Д2-подобных
рецепторов
объясняет
существование у них сплайсинговых форм, что было показано для Д2- и Д3подтипов. Изоформы Д3-рецептора – это нефункциональные белки; у Д2рецептора существуют две изоформы – Д2S (короткая изоформа) и Д2L (длинная
изоформа) (Gingrich, Caron, 1993; Missale et al., 2010). Функциональных различий
у двух изоформ Д2-рецептора к настоящему времени не выявлено. Обе изоформы
17
обладают схожим паттерном экспрессии в структурах мозга, однако транскрипты
Д2S представлены менее широко (Monsma et al., 1989; Pivonello et al., 2007;
Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Таким образом, семейство ДА-рецепторов включает два основных подтипа:
Д1-подобные, к которому относят Д1- и Д5-рецепторы, и Д2-подобные, в котором
выделяют Д2-, Д3- и Д4-рецепторы (Раевский К.С. и др., 1996; Hiroi et al., 2002;
Lajtha et al., 2007; Brady et al., 2012).
1.1.4. Области экспрессии и локализации рецепторов дофамина
Наибольшее количество рецепторов ДА локализуется в ЦНС. В последние
годы ДА-рецепторы были обнаружены и в других периферических органах, таких
как: питуитарные и паратиреоидные железы, почки, сердце (Missale et al., 1998;
Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Д1-рецептор наиболее широко богато представлен в мозге у крыс, обезьян и
человека (Dearry et al., 1990; Fremeau et al., 1991; Pivonello et al., 2007). Основное
количество мРНК Д1-рецептора было найдено экспрессируется в стриатуме,
прилежащем ядре и зрительных бугорках (Dearry et al., 1990; Bergson et al., 1995;
Lajtha et al., 2007; Brady et al., 2012). Небольшой уровень мРНК Д1-рецептора
экспрессируется обнаруживается в лимбической системе, гипоталамусе и
таламусе (Dawson et al., 1988; Missale et al., 2010). В ряде областей (ретикулярная
часть черной субстанции) выявлен высокий уровень Д1-рецепторного белка, тогда
как соответствующая ему мРНК не найдена. Это позволяет предположить, что в
указанные структуры Д1-рецептор попадает по терминальным проекциям
нейронов из других областей мозга (Dearry et al., 1990; Weiner et al., 1991;
Pivonello, 2007).
Д5-рецептор распространен в мозге гораздо беднее. Его локализация
ограничивается гиппокампом, латеральным мамиллярным и парафасцикулярным
ядрами таламуса (Meador-Woodruff et al., 1992; Missale et al., 2010). Значительное
содержание мРНК Д5-рецептора найдено в некоторых ростральных отделах
18
переднего мозга, включая кору, латеральный таламус, стриатум; в меньшей
степени – черную субстанцию, медиальный таламус и гиппокамп (Choi et al.,
1995; Lajtha et al., 2007; Brady et al., 2012).
Наибольшая экспрессия Д2-дофаминовых рецепторов определяется в
стриатуме, обонятельных бугорках, центральной части прилежащего ядра
(Jackson, Westlind-Danielson, 1994; Pivonello et al., 2007). Соответствующая Д2рецептору мРНК найдена в префронтальной, цингулярной и энторинальной коре,
миндалине и гиппокампе, следовые ее количества обнаружены в гипоталамусе,
компактной части черной субстанции и вентральной покрышки области
(Bouthenet et al., 1991; Jackson, Westlind-Danielson, 1994; Lajtha et al., 2007; Brady
et al., 2012).
Д3-подтип рецепторов ДА в наибольшей степени экспрессируется в
лимбических отделах и обонятельных бугорках, в меньшей степени Д3-рецептор
представлен в гиппокампе и некоторых кортикальных областях. Незначительное
количество мРНК Д3-рецептора выявлено в компактной части черной субстанции,
вентральной области покрышки и мозжечке (Bouthenet et al., 1991; Lajtha et al.,
2007; Brady et al., 2012).
Области наибольшей экспрессии Д4-рецептора сходны с таковыми для Д3рецептора и представлены фронтальной корой, миндалиной, гиппокампом и
гипоталамусом (Van Tol et al., 1991; Missale et al., 1998; Beaulieu and Gainetdinov,
2011). Высокий уровень мРНК Д4-рецептора имеется в сетчатке, ретикулярной
части черной субстанции, в бледном шаре, таламусе (Mrzliak et al., 1996; Pivonello
et al., 2007).
На
субклеточном
уровне
ДА
рецепторы
локализуются
в
области
синаптических контактов (пре- или постсинаптических), а также на соме и
дендритах ДА-нейронов (Tarazi et al., 1998; Missale et al., 2010). В последние годы
активно
изучаются
пресинаптические
рецепторы,
расположенные
на
терминальных окончаниях, а также рецепторы, локализованные на теле и
дендритах
ДА-нейронов,
выполняют
ауторегуляторную
функцию
в
ДА-
нейропередаче, и обозначаются термином «ауторецепторы». Выделяют три типа
19
деятельности ауторецепторов ДА. Это регуляция импульсной активности, синтеза
нейротрансмиттера и его высвобождения (Nestler et al., 2001; Missale et al., 2010;
Beaulieu, Gainetdinov, 2011). Активация пресинаптических ауторецепторов
тормозит синтез и высвобождение ДА, тогда как стимуляция соматодендритных
рецепторов ДА вызывает подавление импульсной активности нейрона, вторично
приводя к снижению выброса ДА в области синаптических окончаний (Nestler et
al., 2001; Pivonello et al., 2007). Имеются также дендритные ауторецепторы,
непосредственно регулирующие процесс высвобождения ДА (Westerink et al.,
1994; Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Фармакологические и нейрохимические исследования ДА-ауторецепторов
показали, что они принадлежат к семейству Д2-подобных рецепторов (Morelli et
al., 1988; Starke et al., 1989; Pivonello et al., 2007). В отношении Д1-подтипа
рецепторов
было
подтверждено
их
преимущественно
постсинаптическое
расположение в структурах мозга (Tarazi et al., 1998). Д3-рецепторы мозга могут
функционировать
подобно
Д2-ауторецепторам,
ингибируя
синтез
и
высвобождение ДА (Joseph et al., 2002). Д4-подтип рецептора расположен
преимущественно постсинаптически (Rivera et al., 2002; Beaulieu, Gainetdinov,
2011).
ДА-ауторецепторы более чувствительны к эффектам селективных лигандов
Д2-рецепторов и обладают более быстрым процессом десенситизации, по
сравнению с постсинаптическими рецепторами (Cooper et al., 1991; Elsworth, Roth,
1996 Missale et al., 2010).
1.1.5. Онтогенез дофаминовой системы мозга
Онтогенез дофаминовой системы мозга изучен довольно подробно с
помощью
ВЭЖХ,
электронной
микроскопии,
иммуногистохимии,
радиолигандных и молекулярно-биологических методов (Antonopoulos et al., 2002;
Di Giovanni et al., 2009; Brady et al., 2012).
20
У крыс концентрация моноаминов в центральной нервной системе при
рождении низка и составляет 8 - 12% от концентрации у взрослых особей
(Herregodts et al., 1990; Lajtha et al., 2007; Brady et al, 2012). Содержание ДА в
мозге нарастает быстро, так что к 2-х недельному возрасту соответствует
примерно 50% от содержания у взрослых. К 4-х недельному возрасту содержание
ДА находится в пределах от 80% до 100% от взрослых значений.
Полосатое тело представляет собой область мозга, которая получает
наиболее плотную ДА-ергическую иннервацию. В стриатуме содержание ДА при
рождении колеблется от 11% до 13% от содержания у взрослых крыс (Giorgi et al.,
1987; Lajtha et al., 2007). В полосатом теле содержание ДА повышается несколько
медленнее. Содержание ДА в полосатом теле возрасте 2-х недель составляет лишь
28%, а на 3-й неделе - 50% от содержания у взрослого животного. В полосатом
теле концентрация ДА достигает взрослых значений на 50 - 60-й день после
рождения (Giorgi et al., 1987; Lajtha et al., 2007).
У крыс экспрессия Д1-рецептора в онтогенезе была исследована методом
гибридизации мРНК in situ. В полосатом теле, обонятельном бугорке и коре
сигнал
обнаруживался начиная
с 14-го дня пренатального развития и
последовательно увеличивался на 16-й, 18-й и 21-й дни гестации (Schambra et al.,
1994; Antonopoulos et al., 2002).
В полосатом теле крысы плотность Д1-рецепторов при рождении составляет
примерно 10% от плотности у взрослого (Jung and Bennet, 1996; Di Giovanni et al.,
2009). Наиболее быстро содержание Д1-рецепторов полосатого тела нарастае в
течение первой и второй недели постнатального развития. Так, плотность Д1рецепторов в полосатом теле к концу первой недели жизни колеблется от 22% до
41% от плотности у взрослых (Lajtha et al., 2007; Brady et al., 2012).
Иммуногистохимические
исследования
подтверждают,
что
Д1-рецепторы
достигают распределения и плотности взрослых уже в раннем постнатальном
периоде. На 3-й неделе жизни плотность Д1-рецепторов в полосатом теле
колеблется в диапазоне от 110% до 200% от плотности у взрослых (Murrin and
21
Zeng, 1990; Schambra et al., 1994; Teicher et al., 1995; Lajtha et al., 2007; Brady et al.,
2012).
У крысы Д1-рецепторы в префронтальной коре так же достигают взрослых
значений распределения и плотности в раннем постнатальном онтогенезе (Leslie
et al., 1991; Di Giovanni et al., 2009). Плотность Д1-рецепторов в этой области
коры на 1-й неделе после рождения колеблется от 50% до 59% от плотности у
взрослых. Д1-рецепторы в префронтальной коре также сверхэкспрессируются в
раннем постнатальном онтогенезе. Плотность Д1-рецепторов, на 2-й неделе после
рождения превышает 200% от плотности у взрослых особей (Leslie et al., 1991;
Antonopoulos et al., 2002). У человека уровни мРНК и белка Д1-рецептора
динамично нарастают в процессе постнатального онтогенеза (Rothmond et al.,
2012).
Д2-рецепторы развиваются в онтогенезе подобно Д1-рецепторам. У крысы
мРНК
Д1-рецептора
в
полосатом
теле,
обонятельном
бугорке
и
коре
обнаруживалась, начиная с 14-го дня гестации. Сигнал последовательно
увеличивался на 16-й, 18-й и 21-й дни постнатального развития (Schambra et al.,
1994). Плотность Д2-рецепторов при рождении колеблется в диапазоне 5 - 18% от
плотности у взрослых (Broaddus and Bennett, 1990; Rao et al., 1991; Jung, Bennett,
1996; Di Giovanni et al., 2009), к концу первой недели жизни нарастает до 25 45%, и к концу 2-ой недели жизни достигает взрослых значений (Schambra et al.,
1994; Jung, Bennet, 1996; Antonopoulos et al., 2002).
Имеются данные о гиперэкспрессии Д2-рецепторов в полосатом теле уже в
раннем постнатальном онтогенезе. У крысы до 3-х недельного возраста плотность
Д2-рецептора в полосатом теле составляет 200% от плотности взрослого (Gelbard
et al., 1989; Teicher et al., 1995; Lajtha et al., 2007; Brady et al., 2012). В стриатуме
крысы
экспрессия
мРНК
Д2-рецептора
определяется
при
рождении,
увеличивается до максимума к 28-му дню жизни и постепенно уменьшается в
возрасте 6 месяцев - один год. Экспрессия мРНК Д2-рецептора на 1-й день после
рождения составляет около 75% от 28-ми дневного значения. ПЦР aнализ
альтернативного сплайсинга мРНК Д2-рецепторов у крыс показал, что развитие
22
двух изоформ идет параллельно т.е. соотношение мРНК Д2L/Д2S-рецепторов
остается постоянным в различных возрастных группах (Srivastava et al., 1992;
Antonopoulos et al., 2002; Di Giovanni et al., 2009). У человека уровень мРНК L- и
S-изоформ Д2-рецептора наиболее высок у новорожденных и грудных детей и
постепенно уменьшается с возрастом (Rothmond et al., 2012).
Пренатальное развития Д3-рецептора исследовано слабо. В эмбрионах
крысы 10-11-го дня гестации экспрессия мРНК Д3-рецептора обнаруживалась, и
увеличивалась к 14-му дню пренатального развития. При рождении плотность Д3рецептора в прилежащем ядре колеблется от 5% до 13% от плотности взрослого
(Demotes-Mainard et al., 1996; Stanwood et al., 1997; Antonopoulos et al., 2002). В
отличие от Д1- и Д2-рецепторов, Д3-рецепторы развиваются в течение более
длительного периода послеродовой жизни. У крысы плотность Д3-рецептора в
прилежащем ядре на 1-й неделе жизни достигает 45% от плотности взрослого и
достигает взрослых значений после 3-х недельного возраста (Demontes-Mainard et
al., 1996; Lajtha et al., 2007).
Сходным образом с Д3-рецептором, у крысы экспрессия мРНК Д4рецептора обнаруживалась при рождении, увеличилось до максимума на 3-й день,
и снижалась к 28-му дню жизни. Содержание мРНК Д4-рецептора на первый день
составляло 50% от уровня 3-го дня, и снижалась примерно на 50% на 28-й день
жизни. В возрасте от 6-ти месяцев до 1 года экспрессия мРНК Д4-рецептора
оставалась неизменной (Nair et al., 1995; Lajtha et al., 2007). Исследований по
онтогенезу Д5-рецептора крайне мало. У человека уровень мРНК Д5-рецептора в
процессе постнатального онтогенеза уменьшается (Rothmond et al., 2012).
Имеются данные об онтогенезе белков регулирующих обмен дофамина,
таких как: ДАТ, тирозингидроксилаза, дофамин-бета-гидроксилаза, и КОМТ
(Lajtha et al., 2007; Brady et al., 2012). В целом, содержание этих белков
увеличивается в процессе пренатального и раннего постнатального периодов.
Исключение составляет КОМТ, активность которой в мозге крыс постепенно
снижается, начиная с 16-го дня гестации до момента рождения. На 4-й и 8-й часы
постнатального развития активность КОМТ увеличивается (Parvez et al., 1979).
23
Экспрессия мРНК КОМТ в гипоталамусе крысы была максимально выражена на
1-й и 2-й день после рождения и постепенно снижалась к 16-му дню
(Antonopoulos et al., 2002; Shirakawa, 2004). У человека уровень мРНК и белка
КОМТ достигает пика у новорожденных и грудных детей, и постепенно
уменьшается с возрастом (Rothmond et al., 2012).
1.1.6. Функциональная роль рецепторов дофамина
ДА-ергической системе отводят ключевую роль в контроле локомоторной
активности; планировании, иницииации и выполнении моторных программ;
регуляции нейроэндокринных составляющих мотивации, стрессорных реакций,
страха и агрессии; механизмах формирования зависимости, и контроля поведения
(Berke, Hyman, 2000; Alcaro et al., 2007; Beaulieu, Gainetdinov, 2011) Нарушение
ДА-ергической регуляции в мозге тесно ассоциируется с патогенезом ряда
нервных и психических заболеваний, таких как: болезнь Паркинсона и
Альцгеймера, синдромом де Ла Туретта, шизофрения, наркотическая и
алкогольная зависимость (Berke, Hyman, 2000; Alcaro et al., 2007).
Наиболее хорошо изучена роль ДА-ергической системы мозга в регуляции
моторной активности. Значение ДА было показано локальным введением в
черную субстанцию крыс нейротоксина 6-гидроксидофамина, вызывавшего
деструкцию нигростриатных ДА-ергических проекций и последующую акинезию
(в случае билатерального разрушения) или дискинезию, и спонтанное вращение в
направлении, ипсилатеральном к поврежденной стороне (при унилатеральном
разрушении черной субстанции) (Zetterstrom et al., 1986; Lajtha et al., 2007; Brady
et al., 2012). При введении непрямого ДА-миметика амфетамина животные с
унилатеральным
значительное
повреждением
черной
субстанцией
усиление ипсилатерального вращения,
демонстрировали
тогда
как инъекция
апоморфина (селективного агониста ДА-рецепторов) стимулировала интенсивное
вращение в контрлатеральном направлении. Последнее блокировалось Д2антагонистом
галоперидолом,
что
позволило
предположить
участие
Д2-
24
опосредованного рецепторного механизма (Ungerstedt, 1971; Beaulieu, Gainetdinov,
2011). Эти результаты указывают на важность ДА-ергической ситемы мозга в
регуляции локомоторного поведения.
Системное введение селективного Д1-агониста SKF38393 в широком
диапазоне доз стимулирует выраженную реакцию груминга у крыс (Wachtel et al.,
1992; Beaulieu, Gainetdinov, 2011). Прямая инфузия SKF38393 в стриатум или
прилежащее ядро, также вызывала различные паттерны гиперактивности и
стереотипного поведения (Meyer et al., 1993), тогда как внутрижелудочковое
введение
антисенсов
к
мРНК
Д1-рецепторов
подавляло
SKF38393-
стимулированный груминг (Zhang et al., 1994). Эти данные позволили заключить
наличие собственной функциональной роли у Д1-подтипа ДА-рецепторов в
различных аспектах моторного поведения. В дальнейшем было показано, что
селективная блокада Д1-рецепторов (с помощью Д1-антагониста SCH23390)
эффективно угнетает спонтанную локомоторную активность и каталепсию;
подавляет гиперактивность и стереотипное поведение у мышей и крыс, вызванное
введением психостимуляторов; и предотвращает апоморфиновую стереотипию
(Alcaro et al., 2007). Более того, SCH23390 задерживает инициацию двигательных
реакций
в
поведенческих
тестах
с
положительным
и
отрицательным
подкреплением, подавляет подкрепляющие свойства амфетамина, кокаина и
самостимуляции (Furmidge, 1991; Maldonaldo et al., 1993; Alcaro et al., 2007; Lajtha
et al., 2007; Brady et al., 2012).
В последние годы для изучения функциональной роли отдельных белков
стали широко использовать методы мутационного анализа. Эксперименты с
мышами-нокаутами показали, что гомозиготные особи Д1-/- не склонны к ранней
эмбриональной гибели, но отличаются задержкой роста и развития, и в отсутствии
специальной диеты погибают в возрасте отлучения от груди. При обогащении
пищи гидратированными продуктами такие мыши легко набирают вес и
достигают взрослого возраста. Д1-нокауты обладают нормальной координацией
движений и двигательной активностью. Исследования стриатума у таких
животных показало, что при нормальном морфологическом строении нейроны не
25
связывают лиганды Д1-рецепторов, более того в нейронах стриатума Д1-/-мутантов
наблюдается
снижение
экспрессии
мРНК
субстанции
Р,
колоколизованной с Д1-рецепторами (Drago, 1994; Xu, 1994, Karlsson et al., 2008).
В поведенческих тестах у Д1-нокаутов выявлено снижение спонтанной и
индуцированной локомоторной активности, дефицит стоек на задних лапах, и
нарушение целостности паттернов груминга. Важным отличительным признаком
Д1-мутантов служит дефицит двигательного возбуждения в ответ на введение Д1агониста SKF81297 или психостимуляторов (Xu, 1994; Miner et al., 1995; Drago,
1996, Karlsson et al., 2008).
Данные о подавлении экспрессии с-Fos (маркера нейрональной активности)
в структурах мозга Д1-нокаутов, при введении амфетамина или кокаина,
указывают на ключевую роль Д1-рецепторов в механизмах активирующих
эффектов психостимуляторов. Кроме того, нарушение реализации моторных
программ
в
ответ
на
введение
психостимуляторов
у
Д1-нокаутов
не
сопровождалось исчезновением подкрепляющих свойств фармакологических
агентов (в частности, кокаина) (Новоселов И.А., 2003). Полученные данные
позволили
заключить,
принципиальную
роль
что
в
дофаминовые
рецепторы
реализации
механизмов
Д1-подтипа
играют
дофаминергической
нейропередачи в мозге (Новоселов, 2003; Karlsson et al., 2008).
Участие рецепторов Д2-подтипа в поведенческих реакциях изучено
наиболее полно. Для селективных агонистов Д2-рецепторов зависимость дозаэффект имеет инвертированный U-образный вид: в малых «пресинаптических»
дозах
действие
агонистов
ассоциируется
с
подавлением
ДА-ергической
нейропередачи, снижением двигательной активности, и седативным действием;
тогда как высокие дозы стимулируют двигательную активность и стереотипное
поведение (Arnt et al., 1987). Подобный механизм показан для целого ряда Д2лигандов (Eilam et al., 1992; Stable 1992; Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Антагонистами Д2-подобных рецепторов являются представители группы
нейролептиков, которые в терапевтических дозах подавляют локомоторную и
26
ориентировочно-исследовательскую активности, а в высоких дозах - вызывают
каталепсию (Wanibuchi, Usuda, 1990; Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Мыши, нокаутированные по гену Д2-рецептора, обладают поведенческим
фенотипом, отличным от такового у Д1-нокаутов. Гомозиготные Д2-мутанты
демонстрировали серьезные отклонения в период развития по сравнению с диким
фенотипом, сниженную способность к размножению, выраженные нарушения
координации, сохранения и поддержания позы; поведенческие тесты выявили у
них нарушения в инициации движения и спонтанной двигательной активности
(Baik et al., 1995; Jung et al., 1999; Clifford et al, 2000; Sealfon et al., 2000).
Нейрохимические исследования Д2-нокаутов показали сысокое содержание
метаболитов ДА – ДОФУК и ГВК в дорзальном стриатуме и повышенный уровень
экспрессии Д3-рецепторов, начиная с раннего постнатального развития (Jung et
al., 1999). Введение морфина стимулировало двигательную активность у таких
животных, сходным образом с Д1-нокаутами. Однако, в отличие от последних,
подкрепляющий эффект опиоидов на Д2-нокаутах не проявлялся.
Одним из наиболее обсуждаемых вопросов психофармакологии ДАрецепторнов является взаимодействие Д1- и Д2-рецепторов в процессе
реализации целостного континиума поведенческих реакций. Так, эффекты
селективных Д2-агонистов могут быть предотвращены не только введением
соответствующих Д2-антагонистов, но и введением антагонистов Д1-рецепторов
или опустошением запасов эндогенного ДА (Walters et al., 1987; Bjorklund et al.,
2007). Системное введение Д1- и Д2-агонистов, или локальное их введение в
стриатум, вызывает значительно более интенсивный локомоторный ответ, чем
инъекция каждого из агонистов в отдельности (Walters et al., 1987; Bordi, Meller,
1989; Waddington et al., 2001; Bjorklund et al., 2007; Beaulieu and Gainetdinov, 2011).
Подобный кооперативный эффект Д1- и Д2-рецепторов отмечается и при
электрофизиологической
регистрации
активности
нейронов
в
структурах
базальных ганглиев (Neve et al., 2004; Bjorklund et al., 2007). Полученные данные
послужили основанием для гипотезы о функциональном синергизме между Д1- и
Д2-рецепторами:
активация
Д1-рецепторов
необходима,
чтобы
эффект,
27
опосредуемый Д2-рецепторами проявился с максимальной силой (Waddington et
al., 2001; Neve et al., 2004).
Синергический эффект взаимодействия Д1- и Д2-рецепторов отмечается не
только на моделях локомоторной активности или каталепсии. Ряд авторов
указывает на совместное участие Д1- и Д2-рецепторов в процессах обучения и
памяти: например, совместная активация этих рецепторов в гиппокампе у крыс и
в префронтальной коре у обезьян облегчала приобретение и закрепление
различных инструментальных навыков (Levin, Rose, 1995; Neve et al., 2004).
Известны случаи, когда Д1- и Д2-рецепторы оказывали не кооперативное, а скорее
противоположное действие (Eilam et al, 1992; Daly, Waddington, 1992; Neve et al.,
2004; Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Функциональное значение Д3-, Д4- и Д5-рецепторов ДА изучено
достаточно слабо. Д3-рецепторы относятся к авторецепторам, оказывают
тормозное действие на импульсную активности ДА нейронов групп А9 и А10
(Lejeune, Millan, 1995; Neve et al., 2004) и участвуют в пресинаптической
регуляции высвобождения ДА (Joseph et al., 2002). Предпочтительное лимбикокортикальное распределение Д3-рецепторов и их пресинаптическая локализация,
позволяют предположить, что Д3-рецепторы могут быть вовлечены в различные
физиологические
рецепторами.
и
патофизиологические
Известно
участие
процессы,
Д3-подтипа
в
опосредуемые
патогенезе
Д2-
шизофрении,
биполярных аффективных расстройствах, и наркоманий (Caine, Koob, 1993;
Kennedy et al., 1995; Parsian et al., 1995; Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Введение селективного агониста Д3-рецептора (7-OH-DPAT) стимулирует
гипотермию; этот эффект может быть полностью предотвращен инъекцией
S14297,
селективного
антагониста
Д3-рецепторов
(Millan
et
al.,
1994).
Селективные агонисты Д3-рецепторов блокируют двигательную активность, тогда
как Д3-антагонисты, наоборот, активируют моторные функции (Waddington et al.,
2001). Например, 7-OH-DPAТ при системном введении вызывает у крыс
отчетливый двухфазный ответ: в малых дозах – ингибирует спонтанную
локомоцию и реакцию принюхивания, а в больших – активирует эти процессы
28
(Daly, Waddington, 1993; McElroy et al., 1994; Alcaro et al., 2007). Предполагается,
что сами по себе Д3-рецепторы оказывают умеренное ингибирующее влияние на
двигательную
активность.
Их
селективная
стимуляция
наблюдается
при
использовании малых доз 7-OH-DPAT. В тоже время, активирующий эффект
больших доз Д3-агонистов на локомоторные функции может быть достигнут
благодаря
сопутствующей
стимуляции
пресинаптических
Д2-подобных
рецепторов. В целом, совместное участие Д2- и Д3-рецепторных подтипов в
контроле двигательной активности представляется неоднозначным (Neve et al.,
2004; Alcaro et al,, 2007).
В отличие от Д2-мутантов, нокауты по Д3-рецептору развиваются
нормально, являются фертильными, и демонстрируют быстро проходящую
гиперактивность при помещении в новую обстановку (Jung et al, 1999; Wong et al.,
2003). Повышенная иследовательская активность у гиперактивных Д3-нокаутов
может быть связана с снижением уровня тревожности, которое было выявлено у
таких животных в тестах открытое поле и приподнятый крестообразный лабиринт
(Ассili et al., 1996). Использование двойных нокаутов показало, что Д3-рецепторы
вносят существенный вклад в контроль локомоторных функций и активно
взаимодействуют с Д1- и Д2-рецепторами. Так, у мышей Д2/Д3-нокаутов
изменения двигательного фенотипа оказались сходными с таковыми у Д2нокаутов, но были выражены значительно сильнее (Jung et al., 1999; Wong et al.,
2003). Представляло интерес получить двойных мышей Д2/Д3-нокаутов.
Оказалось, что у Д1/Д3-мутантов спонтанная двигательная активность и
тревожное поведение не отличаются от дикого типа. Таким образом, двойная
делеция Д1- и Д3-рецепторов остановила исследовательскую гиперактивность и
сниженный уровень тревожности, характерные для Д3-нокаутов, одновременно
исправив слабый исследовательский фенотип Д1-нокаутов (Karasinska et al., 2000).
Рассматриваются несколько механизмов возможного взаимодействия Д1-,
Д2-, и Д3-рецепторов. Солоколизация этих рецепторов на одной клеточной
мембране допускает их прямое взаимодействие, или взаимодействие на уровне
субмембранных структур, таких как G-белки, аденилатциклаза и МАР-киназный
29
каскад. Так, Д1- и Д3-рецепторы, могут формировать гетеро- или олигодимерные
комплексы и физически взаимодействовать друг с другом в ответ на связывание
агонистов (Missale, 2010; Wang, 2013).
Д4-рецепторы – это преимущественно постсинаптические рецепторы
(Rivera et al, 2002) и их ограниченная экспрессия в моторных регионах мозга
предполагает незначительное участие в контроле двигательных функций (Missale
et al., 1998). Высокое сродство атипичного нейролептика клозапина к Д4рецепторам, плотность которых увеличивается в мозге у больных шизофренией,
позволило предположить участие Д4-подтипа в патогенезе психических и
эмоциональных расстройств (Van Tol et al., 1991; Seeman, Van Tol, 1994; Beaulieu,
Gainetdinov, 2011). Однако, последующее изучение новых высокоселективных Д4антагонистов (L-745,870; фанансерин) показало их неэффективность как
антипсихотических препаратов (Truffinet et al., 1999).
Анализ поведения мышей-нокаутов по гену Д4-рецептора, указывает на
участие этих рецепторов в механизмах спонтанной локомоторной активности и
гиперактивности при действии психостимуляторов (Rubinstein et al., 1997; Neve et
al., 2004). Так, гомозиготные Д4-нокауты обнаруживали меньший уровень
спонтанной
локомоторной
активности,
и
одновременно,
повышенную
чувствительность к активирующему действию кокаина, метамфетамина и этанола.
Функциональная роль Д5-подтипа рецепторов остается практически
неизвестной. Во многом это связано с отсутствием селективных лигандов,
позволяющих надежно отличить Д1- и Д5-рецепторные подтипы между собой. На
основании иммуногистохимических данных об экспрессии этого рецептора в
парафасцикулярном ядре таламуса (получающего афферентные проекции от
Черной субстанции и посылающего эфферентные проекции к стриатуму) было
сделано предположение, что Д5-рецепторы этой структуры могут выполнять
интегративную роль в обработке восходящих и нисходящих информационных
потоков (Sibley et al., 1999; Neve et al., 2004).
Мыши-нокауты по гену Д5-рецептора, росли и развивались нормально, а по
достижении взрослого возраста давали потомство (Waddington et al., 2001). В
30
тесте ткрытое поле Д5-нокауты были достаточно подвижны, с более высоким
уровнем
горизонтальной
и
вертикальной
двигательной
активности,
чем
нормальные животные. При этом Д5-мутанты не демонстрировали повышенной
тревожности, и превосходили животных дикого типа в тестах на моторную
координацию. Это позволило предположить, что Д5-рецепторы могут оказывать
некоторое ингибирующее влияние на локомоторную активность животных в
привычной для них обстановке (Waddington et al., 2001; Neve et al., 2004).
1.1.7. Роль дофаминовой системы головного мозга в механизмах подкрепления
В качестве субстратной основы механизмов подкрепления выделяют, в
основном, мезолимбическую ДА-ергическую систему мозга (Corbett, 1992;
Шабанов П.Д., Лебедев А.А., 2001; Лебедев А.А., 2002; Pivonello, 2007; Brady,
2012). Структурными звеньями данной системы являются ядра вентральной
покрышки, гипоталамические структуры, миндалевидный комплекс, прилежащее
ядро, ядра уздечки, прозрачная перегородка, обонятельный бугорок, медиальная
префронтальная кора (МПК) (Corbett, 1992; McBride et al., 1999; Шабанов П.Д.,
Лебедев А.А., 2001; Pivonello, 2007; Bjorklund, 2007).
Введение агонистов ДА (фенамина, апоморфина и др.) активировало
систему положительного подкрепления. В то же время, введение антагонистов ДА
(галоперидола, пимозида, спироперидола) вызывало уменьшение частоты реакции
самостимуляции (Leith, 1983). Следует отметить, что фенамин в дозе 1 мг/кг
значительно повышает уровень ДА в МПК и значительно снижает порог
самостимуляции структур мезолимбической системы (Moghaddam et al., 1990;
Pivonello, 2007). Низкие дозы агониста ДА рецепторов апоморфина увеличивают
пороги самостимуляции латерального гипоталамуса, а высокие дозы, напротив, их
снижают (Fouriezos, Francis, 1992). В то же время, внутрибрюшинное введение
селективного агониста Д2-рецепторов бромокриптина в дозах 1-4 мг/кг не влияет
на пороги самостимуляции (Markou, Koob, 1992). Существуют вещества,
непосредственно не влияющие на ДА, но тем не менее изменяющие деятельность
31
мезолимбической
системы.
На
мезолимбическую
систему
оказывают
модулирующее влияние опиоиды, а также нейротензин и холецистокинин.
Установлено, что опиоиды участвуют в перестройке хемореактивных свойств
мембран нейронов (Simasko, Weiland, 1984; Pivonello, 2007; Brady, 2012). Эти
данные соответствуют выводам других исследователей, показавших, что
унилатеральные микроинъекции в МПК нейромедина (аналог нейротензина)
вызывает зависимое от дозы снижение самостимуляции этой структуры мозга
(Ferrer et al., 1992; Bjorklund, 2007). Исследователи приходят к заключению, что в
основе ингибирующего эффекта нейротензина на самостимуляцию МПК не лежит
способность нейротензина связывать ДА. Полученные экспериментальные
данные
предполагают
нейромодуляторную
роль
этого
нейропептида
в
самостимуляции МПК. В другом исследовании было показано, что аналог
холецистокинина
церулеин
ингибирует
самостимуляцию
латерального
гипоталамуса (Herberg et al., 1992). Самостимуляция мозга способна активировать
дискретные нейрональные опиоидные системы (Stein, 1993; Bjorklund, 2007).
Самостимуляция
пептидов
в
ВОП
вызывает
центральной
селективное
нервной
системе.
высвобождение
опиоидных
D-амфетамин
увеличивает
чувствительность крыс к подкрепляющей электрической стимуляции мозга.
Таким свойством обладают большинство психомоторных стимуляторов и опиатов
(Marcus, Kornetsky, 1974). Кокаин и морфин специфично снижают пороги
подкрепляющей электрической стимуляции мозга в дозах 5 и 10 мг/кг (Esposito et
al., 1978) и 4-8 мг/кг (Marcus, Kornetsky, 1974; Bjorklund, 2007) соответственно.
Более того, если психомоторные стимуляторы и морфин вводятся совместно, они
имеют синергичные эффекты на поведение самостимуляции (Izenwasser,
Kornetsky, 1989; Bjorklund, 2007). Многие исследователи пришли к выводу, что
общим в действии наркотических веществ является активация подкрепляющих
систем мозга (Koob, Goeders, 1989; Bjorklund, 2007) и именно это свойство
объясняет
их
награждающие
и
впоследствии
подкрепляющие
эффекты.
Эксперименты, в которых эффекты психомоторных стимуляторов и опиатов
блокируются налоксоном, являются дополнительным свидетельством в поддержку
32
существования общего нейронального субстрата для награждающих свойств
опиатов и психомоторных стимуляторов (Bain, Kornetsky, 1987; Knapp, Kornetsky,
1989; Pivonello, 2007; Brady, 2012). С целью выявления специфических областей
мозга, принимающих участие в эффектах опиатов и психомоторных стимуляторов
на реакцию самостимуляции, ряд исследователей прибегал к микроинъекциям
веществ. Например, было показано, что микроинъекции кокаина и морфина в
отдельные области мезокортиколимбической системы облегчают поведение
самостимуляции. Действительно, унилатеральная микроинъекция морфина в ВОП
потенциирует
подкрепляющие
эффекты
самостимуляции
латерального
гипоталамуса и приводит к снижению порогов награждающей стимуляции
прилегающего ядра (Bauco et al., 1993; Pivonello, 2007). Более того, наблюдается
самовведение как морфина, так и психомоторных стимуляторов в различные
структуры мезокортиколимбической системы мозга (Goeders et al., 1986;
Bjorklund, 2007). Однако результат введения этих классов веществ не всегда
совпадает и во многом зависит от места микроинъекции в пределах
мезолимбической системы. Так, микроинъекция амфетамина в прилегающее ядро
облегчает награждающий эффект электрической стимуляции ВОП, в то же время
инъекция морфина в прилегающее ядро при прочих равных условиях или снижает
или не влияет на самостимуляцию ВОП (Van Wolfswinkel, Van Ree, 1985;
Pivonello, 2007; Brady, 2012).
33
1.2. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ГРЕЛИНОВОЙ СИСТЕМЕ
1.2.1. Грелин и грелиновая система
Грелиновая система принимает участие в ряде физиологических функций, в
частности, в регуляции пищевого поведения и веса тела, перистальтики желудка и
кишечника, эндокринной функции (стимуляция секреции гормона роста),
регуляции метаболизма липидов и глюкозы, а так же вовлечена в формирование
лекарственной, наркотической и алкогольной зависимости (Tschop et al., 2000;
Wren et al., 2000; Lall et al., 2001; Dickson et al., 2011).
Грелиновая
система
включает
три
пептида,
биосинтез
которых
контролируется одним геном. У мыши и человека ген грелина имеет в своем
составе по пять экзонов (Chen, 2009). Продуктами экспрессии грелинового гена
являются три формы пептидов, а именно ацилированный грелин, дезацилгрелин и
обестатин. Кроме того, к сигнальной системе грелинов относят грелиновые
рецепторы.
Грелин это пептидный гормон, содержащий 28 аминокислотных остатков,
полученный
последовательной
предшественника
препрогрелина
протеолитической
и
прогелина.
деградацией
Грелин
белкового
преимущественно
синтезируется в желудке и секретируется в общий кровоток. В плазме грелин
существует в двух формах: ацетилированный грелин и деацетилированный
грелин.
Пострансляционное
ацилирование
грелина
необходимо
для
его
функциональной активности. Грелин ацилируется по 3-му остатку серина (Ser3)
ферментом грелин-О-ацилтрансфераза (ГОАТ). Для ацилированного грелина
характерна уникальная для олигопептидов посттрансляционная модификация, а
именно присоединение остатка октановой кислоты к аминокислотному остатку
серина путем сложноэфирной связи. Присутствие ацильного остатка является
необходимым для связывания грелина с соответствующим рецептором в ЦНС –
грелиновым рецептором типа 1а. (Sato, 2012).
34
Наибольшее внимание исследователей привлекла ацилированная форма
грелина, которая является специфическим лигандом для рецепторов подкорковых
ядер головного мозга (Kojima et al., 1999; Inhoff, 2008; Dickson et al., 2011). Не
ацилированную форму грелина или дезацилгрелин первоначально принимали за
предшественник или продукт метаболизма ацилированной формы. В последнее
время дезацилгрелину отводят самостоятельную роль в механизмах системной и
местной регуляции (Rauh, 2007). Дезацилгрелин представляет собой наиболее
стабильную и долгоживущую форму грелина, циркулирующую в плазме крови.
Относительное содержание деацилгрелина к общему грелину по данным разных
авторов составляет от 60 до 90 %, тогда как ацилированный грелин составляет до
10 % общего содержания всех форм грелина (Kempinski, 2008). Помимо этого,
ацилированный грелин быстро деградирует в образцах плазмы или сыворотки и
достоверное его определение часто связано с определенными методическими
трудностями. Деацилгрелин не активирует GHSR1a и не вызывает секрецию
гормона роста in vitro и in vivo. (Bednarek et al., 2000; Hosoda et al., 2004; Toshinai,
2006). К настоящему времени неизвестно, через какой рецептор деацилгрелин
оказывает свои биологические эффекты.
1.2.2. Рецептор грелина
Рецептор грелина стал привлекать к себе интерес с 1980-х, когда в качестве
сильного стимулятора гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система был
идентифицирован пептид под названием фактор, стимулирующий выделение
гормона роста 6 (GHRP-6), относящий к классу стимуляторов секреции ростовых
факторов (Bowers et al., 1984). Рецептор к этим лигандам (грелиновый рецептор)
был впервые описан позднее (Howard et al., 1996). В головном мозге мРНК
грелинового
рецептора
у
крыс
и
мышей
представлена
в
наибольших
концентрациях в гипоталамусе и гипофизе. Высокий уровень мРНК грелинового
рецептора также наблюдается в зубчатой извилине гиппокампа, полях СА2 и СА3
гиппокампа, черной субстанции, вентральной тегментальной области, различных
35
таламических ядрах и ядрах ствола, включая дорзальное ядро шва (Guan et al.,
1997;
Zigman
et
al.,
2006).
У
обезьян
мРНК
грелинового
рецептора
экспрессируется в гиппокампе, в грудном, поясничном и крестцовом отделах
спинного мозга (Ferens et al., 2010). Такое широкое распределение грелинового
рецептора в мозге предполагает его участие в различных физиологических
функциях организма.
Механизмы, посредством которых грелин реализует свои физиологические
эффекты, до конца не изучены. Активность рецептора не связана напрямую с
сигналом кишечник-мозг, который обеспечивает грелин, потому что рецептор
имеет постоянную активность в отсутствие грелинового лиганда (Holst et al., 2003;
Holst, Schwartz, 2004). Активность рецептора грелина может быть подавлена не
только фармакологическими антагонистами грелина, но также и с помощью
обратных агонистов (Mokrosinski, Holst, 2010). Возможно, грелиновый рецептор
регулируется независимо от грелина посредством образования гетеродимера с Д1рецептором (Jiang et al., 2006), для которого показана роль в опосредовании
приёма, предпочтения и самовведения алкоголя (Dyr et al., 1993; El-Ghundi et al.,
1998). Остаётся неизученным, каким образом Д1-рецептор влияет на центральную
грелиновую сигнализацию, а также какова физиологическая роль димеризации
рецептора грелина и Д1-рецептора.
1.2.3. Физиологическая роль грелина
В физиологических условиях грелин является системным гормоном голода
и увеличивает потребление пищи через активацию орексигенных путей в
дугообразном ядре гипоталамуса (рис. 3) (Cowley et al., 2003). У здоровых
добровольцев нормального веса грелин повышал чувство голода, делал еду более
привлекательной, увеличивал потребление пищи в условиях свободного доступа
(Wren et al., 2001a,b; Cummings et al., 2004; Druce et al., 2006).
36
Рис. 3. Схематичное изображение ключевых путей регуляции грелином
потребления пищи и поведения поиска подкрепления (Dickson et al., 2011).
АХ - ацетилхолин; АСП - агути-связанный пептид; ДА - дофамин; ГАМК - гаммааминомасляная кислота; Глу - глутамат; НПY - нейропептид Y; ПОМК проопиомеланокортин; ЛДОП - латеродорзальная область покрышки; ВОП –
вентральная область покрышки; ПЯ - прилежащее ядро; Лат.Г – латеральный
гипоталамус; ДЯ - дугообразное ядро; ГР – грелиновый рецептор; нАХР никотиновый ацетилхолиновый рецептор.
У грызунов системное и центральное введение высоких доз грелина
вызывают быстрый орексигенный ответ (Asakawa et al., 2001; Wren et al., 2000), а
хроническая
стимуляция
этого
рецептора
грелином
или
синтетическим
стимулятором секреции ростовых гормонов (GHRP-6) повышает массу жира у
грызунов (Tschop et al., 2000; Lall et al., 2001). Механизм этого явления не зависит
от ГГНС и не включает в себя гиперфагию. Возможно, грелин снижает
утилизацию жира (Tschop et al., 2000; Theander-Carrillo et al., 2006), что
подразумевает, что система обратных связей в ЦНС, опосредованная острым
орексигенным эффектом грелина, отличается от систем, активирующих запасание
37
жира.
Орексигенный
эффект
грелина
снижается
через
несколько
дней
повторяющихся системных введений грелина (Dornonville de la Cour et al., 2005).
С другой стороны, в исследовании, где крысам в течение 2-х недель вводили
грелин интравентрикулярно, был обнаружен явный орексигенный ответ (Salome et
al., 2009a,b). Это свидетельствует о сохранении в определённых условиях
восприимчивости к грелину у грелин-чувствительных систем в течение
продолжительного времени.
Уровень грелина повышается перед приёмом пищи и коррелирует с
увеличением чувства голода у здоровых людей (Cummings et al., 2001, Cummings
et al., 2004). Это указывает на то, что в физиологических условиях острые
изменения уровня грелина могут играть роль в регуляции потребления пищи
и/или служить как циркулирующий гормон голода. Это указывает на то, что
постоянная циркуляция грелина или его перепады могут служить регуляторами
потребления пищи.
В исследованиях на грызунах орексигенные эффекты грелина проявлялись
при его введении в отдельные области мозга, ответственные за подкрепление,
такие как: гипоталамус, ядро одиночного пути ствола мозга, центральное ядро
миндалины, и мезолимбическая область (Wren et al., 2001a,b; Olszewski et al.,
2003a,b; Faulconbridge et al., 2003; Naleid et al., 2005; Egecioglu et al., 2010). У
других исследователей (Egecioglu et al., 2010; Perello et al., 2010) грелин
увеличивал
потребление
пищи,
активируя
гипоталамус,
ствол
мозга
и
мезолимбическую область.
1.2.4. Онтогенез грелиновой системы
В процессе онтогенеза функции грелиновой системы выходят далеко за
рамки тех, которые описаны у взрослых. В дополнение к регуляторной роли у
взрослых животных, грелиновая система может влиять на процессы развития в
различных органах: в поджелудочной железе, желудочно-кишечном тракте и
головном мозге. У грызунов грелин и мРНК рецептора грелина обнаруживаются в
38
эмбрионах уже на стадии морулы и продолжают экспрессироваться в процессе
внутриутробного развития (Kawamura et al., 2003). У крыс высокое содержание
мРНК грелина обнаруживается на 12-й день гестации, а на 17-й день
регистрируются уже значительные уровни ацилированного и деацилированного
грелина в крови (Torsello et al., 2003; Nakahara et al., 2006). У плода высокое
содержание грелина и мРНК грелина обнаруживаются в поджелудочной железе,
тогда как в желудке они остаются низкими. Таким образом, в перинатальном
периоде поджелудочная железа является основным источником грелина, в отличие
от взрослого (Wierup et al., 2002; Chanoine, Wong, 2004).
В постнатальном онтогенезе экспрессия грелина в желудке постепенно
увеличивается и достигает уровня взрослых на 3-5-й неделе после рождения
(Hayashida et al., 2002; Torsello et al., 2003). В поджелудочной железе экспрессия
грелина постепенно снижается в период от рождения до отнятия от груди, и
становится едва уловимой во взрослом состоянии (Wierup et al., 2002). В течение
пренатального развития мРНК грелина также экспрессируется в гипофизе, легких,
половых железах и кишечнике (Tena-Sempere et al., 2002; Torsello et al., 2003;
Chanoine et al., 2004; Santos et al., 2006). Хотя эти качественные исследования дают
ценную информацию об экспрессии грелина и рецептора грелина во время
развития, необходимы дальнейшие исследования, чтобы количественно сравнить
уровни грелина и его рецептора в различных тканях в процессе онтогенеза.
Анализ методом ОТ-ПЦР также показывает, что мРНК грелинового
рецептора экспрессируется на высоком уровне в центральной нервной системе в
пренатальном и раннем постнатальном развитии. Экспрессия мРНК рецептора
грелина обнаруживается в головном и спинном мозге уже на 12-й день гестации и
продолжает быть выраженной в течение постнатальной жизни (Nakahara et al.,
2006; Inoue et al., 2010). К сожалению, подробное распределение экспрессии
мРНК грелинового рецептора в неонатальном мозге до сих пор не описано.
Необходимы
дополнительные
исследования
клеточных
и
молекулярных
механизмов, опосредующих эффекты грелина на пренатальный рост и развитие, а
также периоды максимальной чувствительности различных органов к изменениям
39
уровня грелина в онтогенезе. Предполагается, что воздействуя на рост и развитие
различных органов в пренатальном периоде, грелин может опосредовать
предрасположенность к различным заболеваниям у взрослых.
1.2.5. Роль грелиновой системы головного мозга в механизмах подкрепления
Мезолимбическая ДА-система, опосредует состояние удовлетворённости от
естественных
и
искусственных
подкрепляющих
агентов;
стимулирует
мотивационные действия, такие как поиск пищи, и вовлечена в развитие
наркотической зависимости (Engel et al., 1988; Hansen et al., 1991; Schultz et al.,
1997). В случае потребления в избытке и в течение длительного времени пища
может вызывать те же эффекты, что и наркотики (Grigson, 2002). Действительно, в
исследованиях с применением томографии у человека показаны повреждения
областей мозга, ответственных за положительное и отрицательное подкрепление,
после продолжительного приема природных и синтетических препаратов,
активирующих механизмы подкрепления (Holden, 2001; Potenza et al., 2003;
Volkow et al., 2003a,b).
Поведенческие
параллели
в
потере
контроля
между
навязчивым
перееданием и наркотической зависимостью (Davis, Woodside, 2002) привели к
поиску прямых и обратных связей грелина с системой подкрепления. Это привело
открытию, что сигнальная система грелина в головном мозге необходима для
подкрепления, вызываемого наркотиками, и для подкрепления, вызываемого
пищей (Wellman et al., 2005; Tessari et al., 2007; Jerlhag et al., 2009; Kaur, Ryabinin,
2010; Egecioglu et al., 2010; Perello et al., 2010).
Мезолимбический дофаминовый путь из ВОП в прилежащее ядро, роль
которого в подкреплении хорошо описана (Berridge, Robinson, 2003), является
важным компонентом грелиновой сигнальной системы в головном мозге.
Рецепторы к грелину есть в ВОП (Guan et al., 1997; Zigman et al., 2006), включая
субпопуляцию дофаминовых клеток в этой области, где грелиновый рецептор
40
может ассоциироваться с ДА-рецепторами (Abizaid et al., 2006; Dickson et al.,
2011).
При введении грелина внутрь желудочков мозга и в вентральную область
покрышки, грелин действует сходным образом агонистами ДА-рецепторов,
стимулирует секрецию и обмен ДА в прилежащем ядре, и повышение
локомоторной активности (Jerlhag et al., 2006a,b 2007, Abizaid et al., 2006).
Системное введение грелина также воздействует на мезолимбическую ДАсистему (Jerlhag, 2008; Quarta et al., 2009), что говорит о способности
периферического грелина проникать в мезолимбическую систему мозга. Введение
антагониста рецептора грелина в ВОП блокируют способность грелина
увеличивать потребление пищи (Abizaid et al., 2006) и стимулировать
высвобождение ДА в прилежащем ядре (Jerlhag et al., 2011). Это свидетельствует,
что мишенью грелина являются грелиновые рецепторы, расположенные на
поверхности ДА-ергических клеток ВОП. Учитывая, что подкрепляющие
свойства стимулов (таких как пища и алкоголь) опосредует высвобождение ДА в
прилежащем ядре (Engel et al., 1988; Robinson, Berridge, 1993), полученные
данные указывают, что рецепторы грелина входят в состав подкрепляющей
системы мозга.
Мезолимбическая дофаминовая система вместе с холинэргической системой
образует холинергическую-дофаминергическую систему подкрепления. Хорошо
извесно, что мезолимбическая система подкрепления включает не только
рецепторы ДА, но и ацетилхолиновые рецепторы (Larsson, Engel, 2004). Приём
пищи и алкоголя повышает уровень ацетилхолина в вентральной области
покрышки и дофамина – в прилежащем ядре (Rada et al., 2000; Larsson et al.,
2005). Рецептор грелина экспрессируется в латеродорзальной области покрышки
на холинэргических клетках (Guan et al., 1997; Dickson et al., 2010), что говорит о
возможности грелина напрямую влиять на эту структуру. Введение грелина в
латеродорзальную область покрышки активирует локомоторную активность и
высвобождение ДА в прилежащем ядре (Jerlhag et al., 2007). Эти эффекты грелина
блокируются
системным
и
внутримозговым
введением
неселективного
41
антагониста никотиновых рецепторов – мекамиламина (Jerlhag et al., 2006a;
Jerlhag, 2008). Одновременно, мекамиламин блокирует способность локально
введённого в ВОП грелина повышать потребление пищи (Dickson et al., 2010).
Таким
образом,
грелин
активирует
холинэргическую-дофаминергическую
систему подкрепления.
Использование селективных антагонистов некоторых типов никотиновых и
ацетилхолиновых рецепторов показало, что способность грелина активировать
холинергическую-дофаминергическую
связь
подкрепления
опосредована
определёнными подтипами никотиновых и ацетилхолиновых рецепторов, а
именно α3β2, α6 и β3 (Jerlhag, 2008). Эти подтипы также опосредуют и
подкрепляющие свойства алкоголя – алкогольную стимуляцию и потребление
алкоголя грызунами (Larsson, Engel, 2004; Jerlhag et al., 2006b; Lof et al., 2007;
Steensland et al., 2007; Ericson et al., 2009). Блокирование данных подтипов
варениклином снижает потребление алкоголя заядлыми курильщиками (McKee et
al., 2009), а один гаплоидный фенотип гена α6 ассоциируется с тяжёлыми формами
алкогольной зависимости (Landgren et al., 2009). Чрезмерное потребление
алкоголя крысами в течение долгого периода вызывает высвобождение
ацетилхолина в ВОП, за которым следует увеличение уровня ДА в прилежащем
ядре,
что
указывает
на
активацию
алкоголем
холинэргической-
дофаминергической системы подкрепления, подобную таковой, вызываемой
грелином (Larsson et al., 2005). Видимо, нейрохимические пути действия грелина
и
алкоголя
имеют
дофаминэргическую
много
системы
общего
и
включают
подкрепления.
холинэргическую
Активность
и
ДА-ергических
нейронов в ВОП опосредована различными афферентами, и в пределах ВОП
рецептор грелина присутствует не только на ДА-ергических клетках, но также и
на пресинаптических мембранах афферентов (Abizaid et al., 2006), которые могут
опосредовать способность грелина активировать системы подкрепления.
Так,
способность
грелина
повышать
локомоторную
активность,
высвобождение ДА в прилежащем ядре и стимулировать условную реакцию
предпочтения места ослабляется неселективным агонистом НМДА-рецепторов –
42
AP5 (Jerlhag et al., 2011). Более того, грелин-индуцированная электрическая
активность дофаминергических нейронов вентральной области покрышки зависит
от возбуждающего выброса глутамата глутаматергического входа, а блокада
НМДА-рецепторов
в
ВОП
снижает
вызываемое
потреблением
пищи
высвобождение ДА в прилежащем ядре (Taber, Fibiger, 1997; Abizaid et al., 2006).
К
настоящему
времени
предполагается,
что
именно
НМДА-рецепторы
опосредуют высвобождение ДА в прилежащем ядре, наблюдаемое во время
потребления животными пищи после введения грелина (Kawahara et al., 2009).
Несмотря на бурный прогресс в изучении центральных механизмов голода,
действие антагонистов опиодных рецепторов и антагонистов орексигенного
рецептора
A
на
способность
грелина
активировать
мезолимбическую
дофаминовую систему к настоящему времени не доказано (Jerlhag et al., 2011). В
целом, предполагается, что центральная орексигенная сигнальная система
принимает участие в вызываемом грелином потреблении и поиске пищи при
голоде (Toshinai et al., 2003; Perello et al., 2010), В тоже время ряд данных
указывает на то, что грелин-индуцируемое потребление пищи и грелин-зависимое
подкрепление, отчасти регулируются разными механизмами. Тем не менее,
накопленные данные о реципрокных взаимодействиях рецепторов грелина, ДА,
ацетилхолина,
НМДА,
гамма-аминомасляной
кислоты,
энкефалинов
и
канабиноидов внутри мезокортиколимбической системы мозга свидетельствуют о
возможности в будующем использовать препараты различных групп, в том числе
антагонистов грелиновых, никотиновых или глутаматных рецепторов, для лечения
целого ряда аддитивных состояний (Dickson et al., 2011).
1.2.6. Значение грелиновой системы головного мозга в алкогольной и
наркотической зависимости
Алкогольная зависимость – это хроническое рецидивирующее заболевание
и одновременно острая социальная проблема. Доступные методы лечения
включают медицинские, психологические, и социальные мероприятия, способные
43
увеличить время между рецидивами и снизить потребление алкоголя. Алкогольная
зависимость является гетерогенным заболеванием, в развитии которого играют
роль различные сигнальные системы. Понимание сложных механизмов, лежащих
в основе этой болезни – ключ к разработка новых путей и средств лечения
алкоголизма.
Работы последних лет по изучению центральных эффектов гормона голода
грелина, показавшие тесное взаимодействия грелина и дофаминэргической
системы мозга (отвечающей за физиологические механизмы подкрепления),
привели к мысли о том, что система грелин-ДА может принимать участие не
только в регуляции пищевого поведения и энергетического баланса, но и в
формировании зависимости от наркотиков и алкоголя (Dickson et al., 2011;
Айрапетов М.И и др., 2013). Так, системное введение антагониста грелинового
рецептора ослабляет подкрепляющие свойства амфетамина и кокаина (Jerlhag et
al., 2010), и наоборот, грелин стимулирует поиск кокаина у крыс (Wellman et al.,
2005; Davis et al., 2007; Tessari et al., 2007). С другой стороны, голод,
стимулирующий подъем уровня грелина (Gualillo et al., 2002), одновременно,
усиливает поиск и самовведение кокаина и амфетамина у крыс, а так-же
повышает наркоген-зависимую локомоторную активность (Carroll et al., 1979).
В экспериментах с антагонистами рецептора грелина (BIM28163, JMV2959
D-Lys3- GHRP-6) и на мышах-нокаутах было показано снижение подкрепляющих
свойства алкоголя, которые измеряли по уровню дофамина в прилежащем ядре,
изменению локомоторной активности и реакции предпочтения места (Moulin et
al., 2007; Jerlhag et al., 2009; Kaur, Ryabinin, 2010). У людей, страдающих
алкоголизмом, выявлена корреляция между однонуклеотидным полиморфизмом в
гене рецептора грелина, потреблением алкоголя, избыточным весом и курением
(Landgren et al., 2008, 2010).
Введение грелина (в желудочки мозга, ВОП) повышает потребление
алкоголя мышами, тогда как мыши-нокауты по гену грелина демонстрируют
снижение
локомоторной
активности,
реакции
предпочтения
места,
и
высвобождения ДА в прилежащем ядре в ответ на алкоголь (Jerlhag et al., 2009).
44
На уровне структур мозга эти эффекты реализуются на уровне мезолимбической
системы
подкрепления,
поскольку
введение
грелина
непосредственно
в
гипоталамус не влияло на потребление алкоголя крысами (Schneider et al., 2007).
Системное действие грелина носит аддитивный характер и наиболее выражено у
грызунов, потреблялявших ранее алкоголь, так как введение грелина интактным
крысам, незначительно повышает потребление алкоголя (Lyons et al., 2008). У
человека гаплотипы гена грелина ассоциируются с избыточным весом,
приобретенным или наследственным алкоголизмом (Landgren et al., 2008;
Landgren et al., 2010). У здоровых добровольцев уровень грелина в плазме крови
снижался сходным образом, после приёма алкоголя или приема пищи
(Calissendorff et al., 2006; Zimmermann et al., 2007; Tschop et al., 2001). Взаимосвязь
уровня грелина в плазме крови с алкогольной зависимостью у людей остаётся
неясной, поскольку некоторые исследователи пишут о повышении, а некоторые –
о понижении уровня грелина у людей-алкоголиков (Kim et al., 2005; Kraus et al.,
2005; Addolorato et al., 2006; Hillemacher et al., 2007; Badaoui et al., 2008).
Неоднозначные результаты этих наблюдений, видимо, связаны с различной
этиологией, тяжестью заболевания, и времени забора крови.
При отмене алкоголя, уровень грелина повышается в течение начальной
фазы абстиненции и снижается до контрольных цифр в дальнейшем (Wurst et al.,
2007). В то же время потребность в алкоголе при воздержании стимулировала
подъем грелина (Addolorato et al., 2006, Leggio, 2010). Таким образом, грелин и его
рецептор могут быть одними из факторов, от которых зависит потребление и
поиск
подкрепляющих
субстанций.
Поэтому,
поиск
и
разработка
фармакологических препаратов, способных взаимодействовать с грелиновой
системой головного мозга, может быть одним из перспективных направлений в
лекарственной
состояний.
терапии
алкоголизма,
наркомании,
и
других
аддитивных
45
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Выбор объекта исследования
В работе использовали 490 крыс линии Вистар, полученных из питомника
Рапполово РАМН (Ленинградская область). В экспериментальных группах число
животных колебалось в пределах от 10-ти до 14-ти. Животных содержали в
стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария при свободном доступе к
воде и пище в условиях инвертированного света 8.00-20.00 при температуре
22±2°С.
Все опыты проведены в осенне-зимний период в соответствии с приказом
министерства здравоохранения СССР № 755 от 12 августа 1977 «О мерах по
дальнейшему
использованием
совершенствованию
экспериментальных
организационных
животных»
и
форм
одобрены
работы
с
Локальным
этическим комитетом ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».
2.2. Определение срока беременности у крыс
Спаривание производили в конце рабочего дня, при этом самцов
подсаживали к самкам в соотношении 1:2 или 1:3. Первый день беременности
устанавливали на основании обнаружения у самок сперматозоидов в вагинальном
мазке. При обнаружении сперматозоидов производили маркировку, определяли
массу тела крысы, отсаживали ее в отдельную клетку и начинали отсчет срока
беременности (Западнюк И.П., 1962).
2.3. Процедура хронической алкоголизации
В экспериментах по исследованию формирования дофаминергической
системы и грелиновой системы в онтогенезе при хронической алкоголизации 18
самок крыс, начиная с 1-го дня до окончания беременности (21-22-й день),
подвергали полунасильственной алкоголизации 15%-ным раствором этанола в
46
качестве
единственного
источника
жидкости
при
свободном
доступе
к
брикетированному сухому корму (рис 4). Половину животных после рождения
ими детенышей переводили на водный режим, вторую половину крыс продолжали
алкоголизировать до 17-го дня постнатального развития крысят. Контролем
служили 17 самок крыс, содержавшихся на обычном водном режиме. Детеныши,
рожденные от них, служили контролем крыс, матери которых были подвергнуты
алкоголизации.
Рисунок 4. Фотография крыс при проведении полупринудительной алкоголизации.
В поилках – 15% этанол.
В экспериментах с хронической алкоголизацией 40 взрослых животных,
крыс подвергали полунасильственной алкоголизации 15%-ным раствором этанола
в качестве единственного источника жидкости в течение 6-ти месяцев при
свободном доступе к брикетированному сухому корму. Контрольная группа
состояла из 10 крыс и в качестве источника жидкости получала воду.
Экспериментальные животные были разделены на три группы – группа
алкоголизации в течение 6-ти месяцев и группы 1-го и 7-го дня абстиненции
(отмены алкоголя).
2.4. Взятие материала
Беременных крыс на 13-й и 17-й дни гестации декапитировали, извлекали
плоды и выделяли мозг. Аналогично выделяли мозг у крысят в возрасте 4-х, 10-ти
47
и 17-ти дней жизни. Для биохимических тестов использовали структуры
переднего мозга. Секцию проводили на уровне среднего мозга, отсекая
нижлежащие отделы мозга и мозжечок по линии проекции мозжечка на
низлежащие структуры.
У крысят так же тотально собирали вытекшую кровь, инкубировали в
течение 30 мин. при +4°С и далее центрифугировали при 3000 об/мин и
температуре +4°С. Полученные образцы сыворотки крови замораживали и
хранили при -80°С до проведения иммуноферментного анализа.
Взрослых крыс декапитировали через 6 месяцев после хронической
алкоголизации и на 1-й и 7-й дни после отмены алкоголя. Мозг выделяли на
холоду. Образцы необходимых структур мозга (фронтальная кора, прилежащее
ядро, гипоталамус, миндалина, гиппокамп, вентральная тегментальная область)
немедленно замораживали в жидком азоте и хранились при температуре -80°C до
проведения ПЦР-анализа. Так же после декапитации тотально собирали
вытекшую кровь, инкубировали в течение 30 мин. при +4°С и далее
центрифугировали при 3000 об/мин и температуре +4°С. Полученные образцы
сыворотки
крови
замораживали
и
хранили
при
-80°С
до
проведения
иммуноферментного анализа.
2.5. Экстракция РНК фенол-хлороформным методом
Суммарную РНК выделяли с использованием гуанидин-тиоцианат-фенолхлороформного метода экстракции (Hillary, 2000). Пробу мозга гомогенизировали
в буфере D (4 М гуанидинтиоцианат, 30 мМ цитрат натрия, 30 мМ βмеркаптоэтанол, pH 7,0), затем центрифугировали при 13000 об/мин 5 мин,
отбирали супернатант и добавляли к нему 1 объем водонасыщенного фенола и 1/5
объема смеси хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 24:1. Суспензию
инкубировали на льду в течение 5 мин, перемешивая каждую минуту.
Центрифугировали при 13000 об/мин (4˚С) в течение 30 мин и отбирали водную
фазу.
48
В качестве осаждающего агента использовали равный объём 12 М раствора
LiCl.
Полученную
смесь
инкубировали
30
мин
при
-20˚С,
затем
центрифугировали 15 мин при 13000 об/мин. Осадок промывали 80% этанолом,
высушивали и растворяли в 40 мкл стерильной воды. Осадок подсушивали в
течение 10-15 мин. при +56˚С с открытой крышкой. К осадку добавляли 30 мкл
деионизованной воды, перемешивали и инкубировали 15 минут при +56˚С в
закрытых пробирках. После чего центрифугировали в течение 1 мин. при 13000
об/мин. Отобранную надосадочную жидкость в дальнейшем использовали для
ПЦР.
2.6. Экстракция РНК с использованием тризола
Выделение тотальной РНК проводили из 20 мг пробы мозга с
использованием реагента TRIzol («Ambion», США) в полном соответствии с
инструкцией производителя.
2.7. Обработка ДНКазой
Обработку
проб
ДНКазой
проводили
с
использованием
ДНКазы
(«Promega», США) в полном соответствии с инструкцией производителя.
После обработки ДНКазой концентрацию полученной РНК измеряли на
спектрофотометре «Implen NanoPhotometer P330» («Implen», Германия), по
отношению А260/А280 (в норме ≥ 1,9) оценивали чистоту выделенного препарата.
Для последующей работы пробы выравнивали по концентрации РНК.
2.8. Обратная транскрипция
Синтез кДНК проводили методом ОТ в 25 мкл реакционной смеси с
использованием РНК-зависимой ДНК-полимеразы вируса лейкемии мышей
Молони (M-MuLV обратной транскриптазы, «Promega», США). К образцу
тотальной РНК в количестве 0,5–1 мкг добавляли 0,5 мкг олиго-(dT) 16 праймеров
49
(«Медиген», Россия) и доводили объём смеси до 10 мкл стерильной водой
(«Sigma-Aldrich», США), свободной от ДНКаз и РНКаз (такую воду далее
использовали во всех экспериментах с НК), затем осуществляли отжиг праймеров
на матрице РНК при 70°С в течении 5 мин в твердотельном термостате «TDB120» («Biosan», Латвия), после чего пробы немедленно охлаждали на льду в
течении 2-х мин. Данный твердотельный термостат далее использовали для всех
одностадийных реакций с участием НК. Далее к 10 мкл пробы добавляли 15 мкл
реакционной смеси в однократном буфере для ОТ, которая содержала 200 единиц
M-MLV обратной транскриптазы, эквимолярную смесь четырёх dNTP по 500 мкМ
каждого и 25 единиц ингибитора РНКаз RNasin Plus (все компоненты в смеси
производства компании «Promega», США). Реакцию проводили в течение одного
часа при 42°С. Пробы кДНК хранили при -20°C в течении одного года.
2.9. Полимеразная цепная реакция
ПЦР проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 1-кратный Taqбуфер, 4 мМ MgCl2, 2,5 единицы Taq-полимеразы («Медиген», Россия),
эквимолярную смесь четырёх dNTP по 250 мкМ каждого («Promega», США), по
0,3 мкМ прямого и обратного праймеров подобранных и синтезированных в
компании «Beagle» (Россия) (табл. 1) и 2 мкл кДНК из ОТ-смеси.
Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология»,
Россия) по следующим программам:
• для Д1, Д2 и Д4: денатурация 95°С – 4 мин; затем 10 циклов: 95°С – 30 с;
60°С – 30 с с понижением на 0,5°С в каждом следующем цикле, 72°С – 30 с; затем
30 циклов: 95°С – 30 с; 55°С – 30 с, 72°С – 30 с; затем дополнительная элонгация
72°С – 4 мин.
• для Д5, КОМТ и β-актина: денатурация 95°С – 4 мин; затем 10 циклов:
95°С – 30 с; 62°С – 30 с с понижением на 0,5 °С в каждом следующем цикле, 72°С
– 30 с; затем 30 циклов: 95°С – 30 с; 57°С – 30 с, 72°С – 30 с; затем
дополнительная элонгация 72°С – 4 мин.
50
2.10. Агарозный гель-электрофорез
Детекцию ДНК-продуктов после ОТ-ПЦР проводили в 1,5% агарозном геле
на однократном TBE-буфере (0,089 М Tris-HCl; 0,089 М борная кислота и 0,002 М
ЭДТА) с бромистым этидием (до 0,5 мкг/мл) в камере для горизонтального
электрофореза «SE-2» («Helicon», Россия) при постоянном токе 60 мА
(напряжение 100–150 В). Для расчета молекулярных масс исследуемых
фрагментов ДНК использовали ДНК-маркер 100 п.н. («Медиген», Россия).
Гели проявляли трансиллюминатором «UVT-1» («Биоком», Россия) при
длине волны 312 нм и фотографировали с помощью видеосистемы для
регистрации гелей «DNA Analyser» («Лаборант», Россия), а оптическую
плотность специфических бендов измеряли в программе ScanImage (рис. 5). Для
статистической обработки плотность специфических бендов рецепторов ДА и
КОМТ соотносили с плотностью бенда бета-актина в качестве нормировочного
гена. Сравнительный анализ уровня экспрессии проводили с помощью
программного обеспечения Microsoft Office Excel 2003/2007.
Рис. 5. Фотография агарозного геля после проведения электрофореза на примере
Д2 рецептора. Вверху (жирный бенд) – Д2L изоформа рецептора, снизу (тонкий
бенд) – Д2S изоформа рецептора.
2.11. Мультиплексная ПЦР с детекцией в режиме реального времени
Мультиплексную ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили
в 30 мкл реакционной смеси, содержащей однократный Taq-буфер, 4 мМ MgCl 2, 5
единиц Taq-полимеразы («Медиген», Россия), эквимолярную смесь четырёх dNTP
51
по 330 мкМ каждого («Promega», США), 2–5 мкл кДНК, смесь специфических
прямых
и
обратных
праймеров
и
олигонуклеотидных
TaqMan
зондов,
подобранных и синтезированных в компании «Beagle» (Россия) (табл. 2).
Количественное соотношение праймеров и олигонуклеотидных TaqMan
зондов в реакционных смесях было оптимизировано экспериментально: по 0,7
мкМ праймеров и 0,47 мкМ зонда к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе; по
0,4 мкМ праймеров и 0,27 мкМ зонда к рецептору грелина.
Мультиплексную
ПЦР
проводили
в
амплификаторе
«Mx3005P»
(«Stratagene», США) по следующей программе: 95°С – 4 мин; затем 5 циклов:
95°С – 30 с; 57 °С – 30 с, 72°С – 60 с; затем 35 циклов: 95°С – 30 с; 57°С – 30 с,
72°С – 60 с с детекцией по двум каналам: FAM/ Green, JOE/ Yellow (рис. 6).
Рис. 6. Мультиплексная ПЦР в режиме реальног времени
На рисунке видны кривые флюоресценции.
Эффективность амплификации рассчитывали по углу наклона стандартной
кривой
(α),
полученной
серией
10-кратных
разведений
специфических
ампликонов, по формуле: Е = 10 -(1/α) или Е(%)= (Е – 1)*100 %. Расчет
относительной экспрессии грелинового рецептора проводили по методу дельтадельта Ct (ΔΔCt), используя глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу в качестве
нормировочного гена. Относительный уровень экспрессии гена грелинового
рецептора рассчитывали по индуктивной формуле R = 2 -[ΔΔCt] (Livak, Schmittgen,
2001).
52
Все
вычисления
осуществляли
с
использованием
программного
обеспечения Microsoft Office Excel 2003/2007.
2.12. Высокоэффективная жидкостная хроматография c электрохимической
детекцией
Определение концентрации ДА и ДОФУК проводили методом ВЭЖХ c
электрохимической детекцией на хроматографической системе «Beckman» и
электрохимического
детектора
LC-4B
«BAS»
(США).
Пробы
мозга
гомогенизировали в пяти объемах 0,1 M HCIO4 и центрифугировали при 10000g в
течение 10 мин. Надосадочную жидкость в количестве 20 мкл наносили на
аналитичecкyю колонку «Zorbax С18» («Agilent Technologies», США). ДА и
ДОФУК разделяли c использoвaнием в качестве подвижной фазы 0,1 M цитратнофосфатного буфера, содержащего 0,3 мМ октансульфоната натрия, 0,1 мМ ЭДТА и
10%-ного aцeтoнитрилa (рН 3,2). Определение ДА и ДОФУК осуществляли на
стeклоyглеродном электроде при потенциале +0,7В против Ag/AgCl электрода
сравнения. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,8 мл/мин (рис. 7)
(Krasnova et al., 2000).
Рисунок 7. Примеры типичных хроматограмм при проведении ВЭЖХ.
53
2.13. Иммуноферментный анализ
Концентрации дезацилгрелина в образцах сывороток крови определяли
путем твердофазного иммуноферментного анализа с использованием готовой
тест-системы «Rat unacylated ghrelin enzyme immunoassay kit» («SPI-BIO»
Франция) в полном соответствии с инструкцией производителя. После окончания
реакции измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм (OD 450) на
планшетном фотометре «Synergy 2» («Bio Tek», США) (рис.8). Дальнейшую
обработку результатов проводили с использованием программ Microsoft Office
Excel 2003/2007 и GraphPad Prism 6.
Рисунок 8. Фотография 96-луночной плашки при проведении ИФА
дезацилгрелина.
2.14. Статистические методы анализа
Для статистической обработки полученных количественных данных и
построения графиков применяли пакеты программ Graph Pad Prizm v.4; SPSS
Sigma Stat 3,0 и Minitab 14. В качестве статистических критериев использовали
традиционные показатели описательной статистики. Для сравнения контрольной и
экспериментальных групп использовали однофакторный дисперсионный анализ
ANOVA, а также критерии попарных сравнений групп Стьюдента-НьюменаКейлса и Данна. Из непараметрических критериев использовали критерий
Краскела – Уоллиса для сравнения групп. Для оценки соответствия распределений
54
случайных величин гауссовым применяли критерий нормальности Колмогорова –
Смирнова.
Различия считали статистически значимыми при значении р < 0,05. Для
представления полученных данных использовали такие показатели описательной
статистики, как среднеарифметическое значение и ошибка среднего (О.С.).
55
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Влияние алкоголизации матерей на дофаминовую систему мозга плодов в
пренатальный и в ранний постнатальный периоды
В
первой
серии
дофаминэргической
пренатального
экспериментов
системы
периода,
мозга
было
исследовано
крыс-эмбрионов
полученных
от
и
состояние
крысят
крыс-самок,
раннего
подвергнутых
полунасильственной алкоголизации 15%-ным раствором этанола на протяжении
беременности и кормления. Контрольная группа получала воду. В эксперименте
были использованы 44 беременные крысы, 49 плодов на 13-й и 17-й дни
пренатального развития и 116 крысят на 4-й, 10-й, 17-й дни постнаталного
развития. После рождения детенышей часть, крыс-самок переводили на водный
питьевой режим, другая часть продолжала получать этанол до завершения
эксперимента. У крыс-эмбрионов на 13-й и 17-й дни пренатального развития и у
потомства крыс на 4-й, 10-й, 17-й дни после рождения извлекали мозг, выделяли
структуры переднего мозга и использовали в биохимических тестах. Содержание
ДА и ДОФУК в ткани мозга определяли методом ВЭЖХ.
3.1.1. Влияние алкоголизации матерей на содержание ДА и ДОФУК в мозге
плодов в пренатальный и в ранний постнатальный периоды
Концентрацию ДА и ДОФУК изучали методом ВЭЖХ. В наших
экспериментах при исследовании содержания ДА в структурах переднего мозга
плодов,
было
показано,
что
в
процессе
онтогенеза
концентрация
ДА
увеличивается. В контроле ДА обнаруживался начиная с 17-го дня пренатального
развития в количестве 0,0187±0,0077 нг/мг и достигал 0,4378±0,0208 нг/мг на 17-й
день после рождения (табл. 3, рис. 9). Алкоголизация крыс в период беременности
вызывала снижение активности ДА-системы.
56
Рис. 9. Влияние алкоголизации крыс-самок в период беременности и кормления на
содержание ДА в структурах переднего мозга потомства в пренатальный и ранний
постнатальный периоды (нг/мг ткани)
* р<0,05 по отношению к контрольной группе.
В пренатальном периоде это проявлялось в снижении концентрации ДА на
17-й день внутриутробного развития с 0,0187±0,0077 нг/мг в контроле до
0,0131±0,0027 нг/мг в группе алкоголизированных плодов. В постнатальном
периоде
наблюдалось
дальнейшее
снижение
активности
ДА-системы
до
57
0,3080±0,0932 нг/мг в группе плодов крыс, получавших алкоголь во время
беременности и кормления (табл. 3, рис. 9).
В пренатальный период развития плодов уровень ДОФУК в ткани мозга
крыс-эмбрионов методом ВЭЖХ не определялся во всех исследованных группах
животных (табл. 4). В постнатальный период наблюдалось уменьшение
содержания ДОФУК и отношения ДОФУК/ДА в группе крысят, матери которых
потребляли алкоголь во время беременности, но были переведены на потребление
воды после рождения потомства (группа «отмены алкоголизации»), в сравнении с
контрольной группой на 10-й день постнатального периода, и снижение
содержания ДОФУК и отношение ДОФУК/ДА в группе продолжающих
алкоголизироваться крыс (группа «алкоголизация») на 17-й день постнатального
периода (табл. 4,5; рис. 10, 11). В то же время прекращение приема алкоголя
кормящими самками способствовало восстановлению уровня ДОФУК до
нормальных значений на 17-й день постнатального развития.
В следующей серии экспериментов мы определяли содержание основного
метаболита ДА – ДОФУК в ткани переднего мозга крыс-эмбрионов и крыс 4-го –
17-го дня постнатального развития. Как показали наши исследования, в
пренатальный период метаболит ДА – ДОФУК в ткани мозга крыс-эмбрионов – не
обнаруживается методом ВЭЖХ. Это подтверждают данные о том, что при
нормальном
развитии
плода,
предшественник
ДОФУК
–
ДА
начинает
регистрироваться только в поздние сроки пренатального развития, когда нервная
система крыс-эмбрионов мало отличается от нервной системы взрослых
животных (табл. 3, рис. 10).
В отличие от пренатального периода, нормальное постнатальное развитие
сопровождается услиление метаболизма ДА, о чем свидетельствует рост
содержания ДОФУК в ткани мозга с 0,0067±0,0002 нг/мг ткани до 0,0332±0,0021
нг/мг и 0,0302±0,0007 нг/мг ткани в период с 4-го по 10-17-й дни постнатального
периода. У пренатально-алкоголизированного потомства крыс на 4-й и 17-й день
постнатального развития содержание ДОФУК в ткани мозга не отличается от
нормы, составляя 0,0062±0,0008 нг/мг и 0,0342±0,0027 нг/мг ткани.
58
Рис. 10. Влияние алкоголизации крыс-самок в период беременности и кормления
на содержание ДОФУК в ткани переднего мозга рожденных от них крысят в
ранний постнатальный период (нг/мг ткани)
* р<0,05 по отношению к контрольной группе; # р<0,05 по отношению к группе
крыс, алкоголизировавшихся во время беременности и кормления.
Некоторое снижение уровня ДОФУК у пренатально алкоголизированных
крыс по сравнению с нормой (0,0185±0,0025 нг/мг и 0,0332±0,0021 нг/мг ткани)
наблюдается на 10-й день жизни (таб. 4, рис. 10). Продолжение алкоголизации в
период кормления стимулирует иной тип изменений метаболизма ДА у потомства
(таб. 4, рис. 10). У таких животных содержание ДОФУК в ткани мозга на 4-день
постнатального развития составляет 0,0082±0,0017 нг/мг ткани, по сравнению с
контролем (0,0067±0,0002 нг/мг ткани). На 10-й день постнатального развития
содержание ДОФУК достигает нормы (0,0362±0,0016 нг/мг и 0,0332±0,0021 нг/мг
ткани), а затем, на 17-й день постнатального развития – снижается, по сравнению
с контролем (0,0165±0,0054 нг/мг и 0,0302±0,0007 нг/мг ткани).
Таким образом, в группе пренатально-алкоголизированного потомства крыс
и в группе потомства, матери которого получали алкоголь на протяжении
беременности и кормления – наблюдается падение содержания ДОФУК в ткани
мозга, относительно нормы. В первом случае это снижение наблюдается на 10-й
день жизни, а во второй группе – на 17 день жизни. Примечательно, что в группе
59
пренатально-алкоголизированных крыс содержание ДОФУК восстанавливается до
нормы к 17-му дню жизни (таб. 4, рис. 10).
Рис. 11. Влияние алкоголизации крыс в период беременности на отношение
ДОФУК/ДА в переднем мозге крысят в ранний постнатальный период
* р<0,05 по отношению к контрольной группе; # р<0,05 по отношению к группе
крыс, алкоголизировавшихся во время беременности и кормления.
Можно предположить, что продолжение алкоголизации крыс-матерей
сопровождается более поздней перестройкой нервной системы потомства в
постнатальном периоде, которую мы наблюдали в этих двух группах.
Некоторую информацию о развитии нервной системы алкоголизированного
потомства может дать соотношение ДОФУК/ДА в ткани переднего мозга крысят
(табл. 5). Как видно из рис. 11, нормальное развитие сопровождается усилением
метаболизма ДА, за счет увеличения содержания ДОФУК в ткани мозга в
постнатальном периоде. Пренатальная алкоголизация приводит к уменьшению
соотношения ДОФУК/ДА на 10-й день постнатального развития, тогда как
продолжение алкоголизации в период вскармливания потомства стимулирует
более быстрый расход ДА и увеличение соотношения ДОФУК/ДА (таб. 5, рис. 11).
60
3.1.2. Влияние алкоголизации матерей на экспрессию мРНК дофаминовых
рецепторов и КОМТ в мозге плодов в пренатальный и в ранний
постнатальный периоды
Исследование уровня мРНК дофаминовых рецепторов и КОМТ проводили
методом полуколичественной ОТ-ПЦР. Выделение мРНК проводили методом
фенол-хлороформной экстракции. Затем полученные данные нормализовали по
отношению к уровню экспрессии мРНК β-актина и выражали в у.е.
Экспрессия мРНК Д1-рецептора определялась начиная с 13-го дня
внутриутробного развития и увеличивалась в процессе пренатального и раннего
постнатального онтогенеза (табл. 6). В контрольной группе на 13-й день
внутриутробного развития содержание мРНК Д1-рецептора составляло 14,25±0,10
у.е.,
а
на
17-й
день
после
рождения
достигало
53,75±2,23
у.е.
В
экспериментальных группах крысят, рожденных от матерей, потребляющих
алкоголь во время беременности и во время беременности и кормления,
достоверных различий в уровне экспрессии мРНК Д1-рецептора не выявлено на
всех исследованных сроках пренатального и постнатального развития (табл. 6,
рис. 12).
У интактных животных экспрессия мРНК Д2L-изоформы рецептора
дофамина обнаруживается, начиная с 13-го дня внутриутробного развития, а Д2Sизоформы – начиная с 17-го дня внутриутробного развития (табл. 7, рис. 13).
Содержание изоформ параллельно увеличивается в процессе пренатального и
раннего постнатального онтогенеза (табл. 7, 8; рис. 13, 14).
61
Рис. 12. Влияние алкоголизации крыс-самок во время беременности на
экспрессию мРНК Д1-рецептора в ткани переднего мозга рожденных от них
крысят в пренатальный и ранний постнатальный периоды (у.е.)
62
Рис. 13. Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию
мРНК Д2L-изоформы рецептора в структурах переднего мозга крысят в
пренатальный и ранний постнатальный периоды (у.е.)
* р<0,05 по отношению к контрольной группе.
63
Рис. 14. Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию
мРНК Д2S-изоформы рецептора в структурах переднего мозга крысят в
пренатальный и ранний постнатальный периоды (у.е.)
* р<0,05 по отношению к контрольной группе.
В контрольной группе на 13-й день внутриутробного развития содержание
мРНК Д2L-изоформы рецептора составляло 65,28±0,36 у.е., тогда как экспрессия
Д2S-изоформы рецептора не определялась. В этот срок не наблюдалось
достоверных различий с группой алкоголизированных плодов.
64
На 17-й день внутриутробного развития в группе алкоголизированных
плодов наблюдался рост экспрессии мРНК L- и S-изоформ Д2-рецептора
(65,40±0,67 у.е. и 64,48±0,65 у.е.) по сравнению с контролем (58,23±0,26 у.е. и
57,48±0,33 у.е.).
Однако, начиная с 4-го дня после рождения достоверных различий в
экспрессии мРНК L- и S-изоформ Д2-рецептора в контрольной группе и в группе
алкоголизированных плодов не выявляется. Так, к 17-му дню в контрольной
группе содержание мРНК Д2L- и Д2S-изоформ рецептора составляет 125,2±0,97
у.е. и 83,53±0,69 у.е., соответственно. В то же время в группах детенышей,
рожденных от матерей, потреблявших алкоголь во время беременности и
потреблявших алкоголь во время беременности и кормления экспрессия мРНК
Д2L- и Д2S-изоформ рецептора дофамина в переднем мозге (124,8±1,05 у.е.,
125,9±1,09 у.е. и 83,83±0,70 у.е., 83,98±0,98 у.е.) практически не отличается от
контроля.
В наших экспериментах присутствие мРНК Д4-рецептора в ткани мозга
крыс
регистрировалось
методом
ОТ-ПЦР, только
начиная
с
4-го
дня
постнатального развития и составляла 81,15±0,28 у.е. в норме. К 17-му дню
содержание Д4-рецептора достигало 89,25±1,11 у.е. При этом достоверных
различий в контрольной и алкоголизированных группах не наблюдалось (табл. 9,
рис. 15). Таким образом, экспрессия Д4-рецептора в ткани мозга крысят
проявляется в постнатальном периоде, увеличивался в процессе развития и не
зависит от пренатальной и постнатальной алкоголизации крыс-матерей.
Экспрессия Д5-рецептора определялась, начиная с 4-го дня постнатального
развития и составляла в контрольной группе 98,73±0,84 у.е. К 17-му дню
содержание Д5-рецептора составляло 109,2±1,91 у.е., однако достоверных отличий
в контрольной и опытных группах не удалось выявить (табл. 10, рис. 16).
65
Рисунок 15. Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию
мРНК Д4-рецептора в структурах переднего мозга крысят в пренатальный и
ранний постнатальный период (у.е.)
Рисунок 16. Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию
мРНК Д5-рецептора в структурах переднего мозга крысят в пренатальный и
ранний постнатальный периоды (у.е.)
66
Рисунок 17. Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию
мРНК КОМТ в структурах переднего мозга крысят в пренатальный и ранний
постнатальный периоды (у.е.)
* р<0,05 по отношению к контрольной группе.
Таким образом, в процессе постнатального развития уровень мРНК Д5рецептора в ткани мозга крысят увеличивался и не зависел от потребления
этанола крысами-самками во время беременности и кормления.
Уровень экспрессии мРНК КОМТ увеличивался в процессе пренатального и
раннего постнатального онтогенеза. В контрольной группе мРНК определялась с
67
13-го дня пренатального развития (82,60±0,33 у.е.) и увеличивалось до 103,7±2,66
у.е к 17-му дню после рождения. Алкоголизация крыс в период беременности
приводила к достоверному снижению мРНК КОМТ на 17-й день внутриутробного
развития с 84,85±1,04 у.е. в контроле до 80,65±1,05 у.е. у алкоголизированных
плодов (табл. 11, рис. 17).
На 4-й день после рождения уровень мРНК КОМТ не различался в
контрольной и экспериментальных группах. На 17-й день постнатального
развития наблюдалось достоверное снижение уровня мРНК КОМТ в группе
потомства крыс, чьи матери получали алкоголь во время беременности и
кормления. Так, в норме содержание мРНК КОМТ в мозге крысят составляло
103,7±2,66 у.е., по сравнению с 89,25±0,78 у.е. в экспериментальной группе. Таким
образом, экспрессия КОМТ возрастает на протяжении раннего онтогенеза, тогда
как алкоголизация в период беременности и алкоголизация в период беременности
и кормления стимулируют снижение мРНК КОМТ на 17-й день пренатального
развития и на 17-й день постнатального развития (таб. 11, рис. 17).
68
3.2. Влияние алкоголизации матерей на формирование грелиновой системы в
пренатальный и ранний постнатальный периоды
В этой серии опытов мы исследовали влияние хронической алкоголизации
матерей на грелиновую систему мозга плодов в пренатальный и ранний
постнатальный периоды. В эксперимент были взяты 50 беременных крыс,
которых алкоголизировали 15% раствором алкоголя. В биохимических тестах
использовали мозг 52 плодов 13-го и 17-го дня пренатального развития, а так же
мозг и кровь 120 крысят 4-го, 10-го и 17-го дней после рождения.
3.2.1. Влияние алкоголизации матерей на экспрессию мРНК грелинового
рецептора мозге плодов в пренатальный и ранний постнатальный периоды
В этом эксперименте мРНК выделяли с использованием тризолового
реагента, а экспрессию генов рецептора грелина исследовали методом реал-тайм
ПЦР. При изучении уровня экспрессии мРНК рецептора грелина в структурах
переднего мозга плодов, было показано, что в процессе онтогенеза содержание
мРНК увеличивается. В контроле мРНК рецептора грелина обнаруживалась,
начиная с 13-го дня пренатального развития, и составляла 1,03±0,09 у.е. (табл. 12,
рис. 18), а на 17-й день после рождения уровень достигает 1,32±0,10 у.е. В группе
плодов крыс, рожденных от матерей, упоребляющих алкоголь, отмечалась
аналогичная тенденция, однако на 17-й день после рождения у них выявлялось
достоверное увеличение уровня экспрессии мРНК грелинового рецептора в мозге
по сравнению с контролем, которое составляло 1,97±0,25 у.е. при алкоголизации
во время беременности и кормления, и 2,16±0,32 у.е. при отмене алкоголя после
рождения детенышей (табл. 12, рис. 18).
69
Рисунок 18. Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию
мРНК рецептора грелина в структурах переднего мозга крысят в пренатальный ия
ранний постнатальный периоды (у.е.)
* − р<0,05 по отношению к группе интактных животных.
70
3.2.2. Влияние алкоголизации матерей на уровень дезацилгрелина в сыворотке
плодов в пренатальный и ранний постнатальный периоды
Концентрацию дезацилгрелина сыворотки определяли иммуноферментным
анализом. В связи с малым количеством биологического материала, в наших
условиях исследовать сыворотку эмбрионов на 13-й и 17-й день беременности в
полном объеме не представлялось возможным. Однако пилотные эксперименты
показали тенденцию к увеличению уровня грелина в сыворотке крови плодов в
процессе пренатального развития. Далее приводятся данные, о содержании
дезацилгрелина, начиная с постнатального периода (табл. 13, рис. 19).
Рисунок 19. Влияния алкоголизации матерей на содержание дезацилгрелина в
сыворотке крови рожденных от них крысят в ранний постнатальный период
(нг/мл)
* р<0,05 по отношению к группе интактных животных.
При исследовании количества дезацилгрелина в сыворотке плодов,
отмечалось его увеличение в раннем постнатальном периоде (таб. 13. рис. 19). На
4-й день после рождения в контрольной группе содержание грелина в сыворотке
составляет 5,49±0,09 нг/мл и на 17-й день достигает 9,50±2,29 нг/мл. В группе
плодов крыс, рожденных от матерей, употребляющих алкоголь, отмечалась
71
аналогичная тенденция, однако на 17-й день после рождения у них выявлялось
достоверное снижение уровня сывороточного грелина по сравнению с контролем.
Так,
содержание грелина в
контроле составляло
9,50±2,29 нг/мл, при
алкоголизации во время беременности и кормления – соответственно 5,36±0,05
нг/мг и 5,69±0,19 нг/мг при отмене алкоголя после рождения детенышей.
3.3. Влияние хронической алкоголизации и последующей отмены алкоголя на
грелиновую систему взрослых крыс
В этой серии экспериментов мы исследовали влияние длительной
алкоголизации и последующей отмены алкоголя на грелиновую систему у
взрослых крыс. В эксперименте использовали 40 взрослых крыс-самцов, которых
алкоголизировали 15% раствором алкоголя как единственного источника
жидкости в течение 6-ти месяцев. Контролем служили 10 крыс, которые
содержались на обычном водном режиме. Мозг и кровь забрали на 6-й месяц
алкоголизации, а так же на 1-й и 7-й день абстиненции. Из мозга взрослых крыс
выделяли
следующие
структуры:
фронтальная
кора,
прилежащее
ядро,
гипоталамус, миндалина, гиппокамп, вентральная тегментальная область.
3.3.1. Влияние хронической алкоголизации и последующей отмены алкоголя на
экспрессию мРНК грелинового рецептора в структурах мозга взрослых
крыс
Для выделения тотальной мРНК использовали тризоловый реагент.
Экспрессию гена грелинового рецептора определяли методом реал-тайм ПЦР.
Алкоголизация крыс 15% раствором этанола в течение 6-ти месяцев не вызывала
достоверных изменений экспрессии мРНК грелинового рецептора во всех
исследованных структурах мозга (табл. 14, рис. 20).
72
Рис. 20. Влияние алкоголизации и отмены алкоголя на уровень экспрессии
грелинового рецептора в структурах мозга крыс
* р<0,05 по отношению к группе интактных животных;#р<0,05 по отношению к
группе алкоголизированных крыс; ^ р<0,05 по отношению к группе животных с
отменой алкоголя в течение 7-ми дней.
Однако в прилежащем ядре и гипоталамусе наблюдалась тенденция к
увеличению мРНК грелинового рецептора, хотя и статистически не значимая.
Через сутки после отмены алкоголя отмечалось увеличение экспрессии
мРНК во фронтальной коре, как по отношению к интактным, так и
алкоголизированным животным (табл. 14, рис. 20). К 7-му дню абстиненции
уровень мРНК грелинового рецептора во фронтальной коре нормализовался,
однако было отмечено его увеличение в вентральной тегментальной области и
прилежащем ядре (табл. 14, рис. 20).
73
3.3.2. Влияние хронической алкоголизации и последующей отмены алкоголя на
содержание дезацилгрелина в сыворотке крови взрослых крыс
Уровень дезацилгрелина в сыворотке крови определяли иммуноферментным
анализом. В ходе хронической алкоголизации концентрация дезацилгрелина в
сыворотках крыс достоверно снижена по сравнению с контрольной группой (табл.
15. рис. 21). В процессе хронической алкоголизации в течение 6-ти месяцев
отмечалось достоверное снижение концентрации дезацилгрелна в сыворотке
крови по сравнению с контролем соответственно 0,956±0,108 нг/мл у интактных и
0,476±0,0734 нг/мл при хронической алкоголизации.
Рис. 21. Влияние алкоголизации и отмены алкоголя на содержание дезацилгрелина
в сыворотке крови крыс (нг/мл)
* р<0,05 по отношению к группе интактных животных;#р<0,05 по отношению к
группе алкоголизированных крыс; ^ р<0,05 по отношению к группе животных с
отменой алкоголя в течение 7-ми дней.
При прекращении добавки в рацион алкоголя в ходе реагирования
животных на отмену можно наблюдать монотонное повышение концентрации
дезацилгрелина. Показатели у исследованной группы после первых суток отмены
не имели значимых отличий от показателей в ходе алкоголизации. Таким образом,
концентрация дезацилгрелина в сыворотке крови составляла соответственно
74
0,476±0,0734 нг/мл при хронической алкоголизации и 0,552±0,0695 нг/мл на 1-й
день после отмены алкоголя. После 7-ми суток отмены алкоголя наблюдали
значимое повышение концентрации дезацилгрелина в сыворотке крови как по
сравнению с группой с хронической алкоголизацией, так и по сравнению с
группой отмены алкоголя на 1-й день, соответственно до 0,669±0,0777 нг/мл (таб.
15, рис. 21).
75
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Приступая к обсуждению полученных данных, необходимо отметить что
потребление алкоголя во время беременности может вызывать серьезные
негативные последствия у потомства (Schneider et al, 2011). Алкоголь свободно
проходит через плаценту и попадает в кровоток плода. Из-за низкой активности
алкогольдегидрогеназы, плод не способен метаболизировать алкоголь, который
может сохраняться в амниотической жидкости (Schneider et al, 2011).
Фетальный алкогольный синдром (ФАС) является наиболее известным
результатом потребления алкоголя во время беременности. Диагностические
критерии ФАС включают симптомы в трех областях: различные черепно-лицевые
дисморфизмы (рис. 22), пренатальное и / или постнатальное отставание в росте и
дисфункцию ЦНС, в том числе когнитивный и поведенческий дефицит (Rivera et
al., 2005; Schneider et al, 2011).
Cозревание моноаминергических систем мозга происходит, начиная с
третьего
триместра
беременности,
и
охватывает
первые
три
недели
постнатального периода (Rathbun, 1985; Druse, 1990; Шабанов П.Д., 2010).
Чувствительность системы дофамина к действию этанола в этот период
различается по срокам наблюдений (Cooper, 1988; Druse, 1990; Gillespie, 1997). В
целом, потребление этанола беременными крысами (пренатальная нагрузка
этанолом) вызывает снижение активности моноаминергических систем мозга у
потомства (Rathbun, 1985; Cooper, 1988; Mao et al., 2013). Это проявляется
уменьшением содержания дофамина в стриатуме и числа участков связывания
дофаминовых рецепторов Д1-типа в коре головного мозга (Druse, 1990; Naseer et
al., 2014), снижением активности транспортера ДА в стриатуме (Barbier, 2009),
значительным уменьшением числа Д1- и Д2-рецепторов в мозге у крыс на разных
сроках постнатального развития (Carneiro, 2005; Uban et al., 2013). Пренатальное
воздействие
этанола
приводит
к
постоянной
аномальной
синаптической
пластичности в дорсолатеральном стриатуме из за нарушенного баланса Д1- / Д2рецепторов (Zhou et al., 2012).
76
В то же время, результаты изменения активности ДА-ергической системы
мозга и поведения у крысят, рожденных от матерей, алкоголизированных в период
беременности, могут зависеть от линии экспериментальных животных и
величины алкогольной нагрузки. Так, потомство крыс линии ТНА (Tokai High
Avoider) в большей степени реагировало на пренатальную алкогольную нагрузку в
сравнении с крысами линии Вистар (Furuya, 1996). В данной работе показано, что
уровень алкогольной нагрузки может разнонаправлено влиять на обмен дофамина
в мозге. В частности, потребление матерями питьевого раствора с 10%-ным и
20%-ным содержанием алкоголя увеличивало концентрацию ДА и снижало
уровень метаболита ДА – диоксифенилуксусной кислоты в структурах мозга
новорожденных крысят. В тоже время потребление 5%-ного раствора алкоголя
вызывало
противоположные
изменения
в
содержании
дофамина
и
его
метаболитов в мозге потомства (Furuya, 1996). Сходные результаты по влиянию
величины алкогольной нагрузки на обмен ДА у потомства были получены в
экспериментах на приматах. Так, низкая концентрация этанола в плазме крови
самок-макак в период беременности (от 0 до 249 мг/дл) увеличивала содержание
ДА в стриатуме у потомства, тогда как более высокие концентрации этанола в
крови (в диапазоне от 260 до 540 мг/дл) снижали уровень ДА в стриатуме (Clarren,
1990).
В нашем исследовании показано, что алкоголизация крыс в период
беременности вызывает снижение активности ДА-ергической системы мозга.
Отмечалась тенденция к снижению уровня ДА – с 0,0187±0,0077 нг/мг ткани в
контроле до 0,0131±0,0027 нг/мг ткани у алкоголизированных плодов, а также
мРНК фермента метаболизма катехоламинов КОМТ с 84,85±1,04 у.е. в контроле
до 80,65±1,05 у.е. у алкоголизированных плодов в структурах переднего мозга на
17-й день пренатального развития.
На 13-й день пренатального периода достоверных отличий в этих
показателях не отмечали. В ответ на снижение активности пресинаптического
отдела системы ДА отмечали развитие компенсаторной реакции со стороны
рецепторного аппарата, что выражалось достоверным увеличением содержания
77
мРНК
длинного
(с
58,23±0,26
у.е.
в
контроле
до
65,40±0,67
у.е.
у
алкоголизированных плодов) и короткого (с 57,48±0,33 у.е. в контроле до
64,48±0,65 у.е. у алкоголизированных плодов) сплайс-вариантов дофаминового
рецептора Д2-типа. Как и в случае с содержанием ДА, на 13-й день пренатального
периода достоверных отличий этих показателей у алкоголизированных и не
алкоголизированных плодов не наблюдали. Это, по-видимому, позволяет
сохранять активность системы ДА мозга плода на физиологическом уровне.
В постнатальный период отмечали дальнейшее снижение активности
системы ДА, в частности, уменьшение содержания ДОФУК и отношения
ДОФУК/ДА в группе крысят, матери которых потребляли алкоголь во время
беременности, но были переведены на потребление воды после рождения
потомства (группа «отмена алкоголизации»), в сравнении с контрольной группой
на 10-й день постнатального периода, и снижением содержания ДОФУК и
отношения ДОФУК/ДА в группе продолжающихся алкоголизироваться крыс
(группа «алкоголизация») на 17-й день постнатального периода. Несмотря на
снижение
активности
пресинаптического
отдела
ДА
системы
мозга
в
постнатальный период, компенсаторной реакции со стороны рецепторного
аппарата системы ДА на этих сроках не наблюдали. В тоже время прекращение
приема алкоголя кормящими самками способствовало восстановлению уровня
ДОФУК до нормальных значений на 17-й день постнатального развития, что
свидетельствует о возможной нормализации активности системы ДА после
прекращения алкоголизации.
Интересно отметить разную выраженность изменений со стороны системы
ДА на разных сроках постнатального развития. Угнетение активности системы
ДА было более выражено в более поздние сроки, в частности, на 10-й день
постнатального периода.
При
сравнении
групп
животных,
алкоголизированных
в
период
беременности и кормления (пре- и постнатальный период) и только в период
беременности (отмена этанола после рождения детенышей), следует отметить
тенденцию к нормализации функционирования дофаминергической системы
78
мозга, в большей степени выраженную в случае отмены алкоголя в постнатальном
периоде. Так, восстановление уровня до нормальных значений ДОФУК и мРНК
фермента метаболизма катехоламинов КОМТ в структурах переднего мозга
отмечали
лишь
на
17-й
день
постнатального
периода
(поздние
сроки
постнатального периода). Это хорошо согласуется с полученными ранее данными,
что введение нейротоксина 6-гидроксидофамина, избирательно нарушающего
дофаминергическую нейромедиацию, крысам в пренатальный (13-й и 17-й дни
беременности) и ранний постнатальный период (4-10-17-й дни жизни) по-разному
влияет на эмоциональное поведение и обмен моноаминов в головном мозге
(Шабанов П.Д. и др., 2002). Показано, что последствия пренатального введения 6гидроксидофамина крысам были значительно более выражены и сохранялись до
17-го дня постнатального периода (Шабанов П.Д. и др., 2002).
Исследования на грызунах показали, что нарушения ДА-ергической
системы, вызванные пренатальным воздействием алкоголя могут лежать в основе
некоторых
поведенческих
изменений,
связанных
с
ФАС.
Например,
гиперактивность во время раннего периода развития могут быть получены путем
химического
истощения
ДА-ергических
нейронов
среднего
мозга
у
новорожденных крыс или путем введения алкоголя внутриутробно (Schneider et
al., 2011). У грызунов были зафиксированы и другие неврологические нарушения
воздействия алкоголя на плод, в том числе изменения в гиппокампе, мозжечке,
соматосенсорной коре, и обонятельной луковице (Uban et al., 2013). Тем не менее,
нарушения
ДА-ергической
системы
подчеркнуты
из-за
ее
важности
в
исполнительном и тормозном контроле в областях, в которыех у детей с ФАС
наблюдается дефицит.
Данные
опыты
вместе
с
нашим
исследованием
подтверждают
предположение, что система ДА значима для эмоционального поведения,
сопряженного с потреблением этанола (Лебедев А.А. и др., 2008; Шабанов П.Д. и
др., 2008; Guerri, 2009; Schneider et al, 2011). Эта система реагирует даже на
низкие дозы алкоголя (Chotro, 2006). Вместе с тем, последствия алкоголизации,
даже непродолжительной, сказываются на системе ДА (Lee, 2008). ДА-ергическая
79
система ответственна за эмоционально-мотивационные ответы нервной системы,
она обеспечивает гедонистический компонент поведения, его метаболические и
эндокринные
составляющие,
наконец,
она
контролирует
готовность
к
употреблению алкоголя и психостимуляторов (Brady et. al., 2012). Действительно,
в наших опытах продемонстрировано, что алкоголизация крыс в период гестации
и кормления негативно и продолжительно сказывается на ДА-ергической системе
мозга.
Грелиновая система принимает участие в ряде физиологических функций, в
частности, в регуляции пищевого поведения и веса тела, перистальтики желудка и
кишечника, эндокринной функции (стимуляция секреции гормона роста),
регуляции метаболизма липидов и глюкозы, а так же вовлечена в формирование
лекарственной, наркотической и алкогольной зависимости (Tschop et al., 2000;
Wren et al., 2000; Lall et al., 2001).
В состав грелиновой системы включают три пептида, биосинтез которых
контролируется одним геном. Гены грелина у мыши и человека имеют в своем
составе по пять экзонов (Chen Ch.-Y., 2009). Продуктами экспрессии грелинового
гена являются три формы пептидов, а именно ацилированный грелин, дезацилгрелин, и, наконец, обестатин. Кроме того, к сигнальной системе грелинов
относят грелиновые рецепторы.
Онтогенез грелиновой системы еще недостаточно изучен, а влияние
алкоголя на ее развитие вообще не освещено в литературе. У грызунов грелин и
мРНК рецептора грелина обнаруживаются в эмбрионах уже на стадии морулы и
продолжают
быть
выраженными
в
процессе
внутриутробного
развития
(Kawamura et al., 2003). У крыс высокий уровень экспрессии мРНК грелина
обнаруживается на 12-й день гестации, а на 17-й день плод содержит уже
значительные уровни ацилированного и деацилированного грелина в крови
(Torsello et al., 2003; Nakahara et al., 2006).
В перинатальном периоде поджелудочная железа является основным
источником грелина, в отличие от взрослого (Wierup et al., 2002; Chanoine, Wong,
2004). В течение перинатального развития мРНК грелина также экспрессируется в
80
гипофизе, легких, половых железах и кишечнике (Tena-Sempere et al., 2002;
Torsello et al., 2003; Chanoine, Wong, 2004; Santos et al., 2006).
Анализ ПЦР также показывает, что мРНК грелинового рецептора
экспрессируется на высоком уровне в центральной нервной системе в
пренатальном и раннем постнатальном развитии. МРНК рецептора грелина
обнаруживается в головном и спинном мозге уже на 12-й день гестации и
продолжает быть выраженным в течение постнатальной жизни (Nakahara et al.,
2006; Inoue et al., 2010). К сожалению, подробное распределение экспрессии
мРНК грелинового рецептора в неонатальном мозге до сих пор не описано.
В нашем эксперименте раннем постнатальном развитии в физиологических
условиях отмечается рост концентрации сывороточного грелина. На 4-й день
после рождения в контрольной группе содержание грелина в сыворотке
составляет 5,49±0,09 нг/мл и на 17-й день достигает 9,50±2,29 нг/мл.
Алкоголизация матерей приводит к снижению уровня дезацилгрелина в
сыворотке в ранний постнатальный период у плодов. На 17-й день после
рождения у них выявлялось достоверное снижение уровня сывороточного
дезацилгрелина по сравнению с контролем соответственно до 5,36±0,05 нг/мг при
алкоголизации во время беременности и кормления и 5,69±0,19 нг/мг при отмене
алкоголя после рождения детенышей. Однако экспрессия мРНК грелина в мозге
компенсаторно увеличивается. На 17-й день после рождения у них выявлялось
достоверное увеличение уровня экспрессии мРНК грелинового рецептора в мозге
по сравнению с контролем соответственно до 1,97±0,25 у.е. при алкоголизации во
время беременности и кормления, и до 2,16±0,32 у.е. при отмене алкоголя после
рождения
детенышей.
Это
свидетельствует
о
нарушении
формирования
грелиновой системы и ее дисрегуляции.
Таким образом, в раннем постнатальном периоде при алкоголизации
происходит
дисрегуляция
характеризуется
снижение
формирования
уровня
грелиновой
дезацилгрелина
системы,
сыворотки
увеличением экспрессии мРНК рецептора в структурах мозга.
крови
что
и
81
Исследование грелиновой сигнальной системы в головном мозге показало
ее участие в процессах подкрепления к наркотикам и пище (Wellman et al., 2005;
Tessari et al., 2007; Jerlhag et al., 2009; Kaur, Ryabinin, 2010; Egecioglu et al., 2010;
Perello et al., 2010).
Мезолимбический дофаминовый путь из вентральной области покрышки в
прилежащее ядро, роль которого в подкреплении хорошо описана (Berridge,
Robinson, 2003), является важным компонентом грелиновой сигнальной системы в
головном мозге. Рецепторы к грелину есть в вентральной области покрышки
(Guan et al., 1997; Zigman et al., 2006), включая субпопуляцию дофаминовых
клеток в этой области (Abizaid et al., 2006).
Алкоголизация взрослых крыс 15% раствором алкоголя в течение 6-ти
месяцев не влияла на уровень экспрессии мРНК грелинового рецептора в
исследованных структурах мозга. Однако в прилежащем ядре и гипоталамусе
наблюдалась тенденция к увеличению мРНК грелинового рецептора хотя и
статистически
не
значимая,
что
можно
рассматривать,
как
развитие
компенсаторных процессов в этих структурах мозга в ответ на снижение
содержания ацилированного грелина в крови, развивающееся в процессе
хронической алкоголизации (Kim et al., 2005; Calissendorff et al., 2006; Leggio,
2009; Dickson et al., 2011).
Через сутки после отмены алкоголя отмечалось увеличение экспрессии
мРНК во фронтальной коре, как по отношению к интактным, так и
алкоголизированным животным. К 7-му дню абстиненции уровень мРНК
грелинового рецептора во фронтальной коре нормализовался, однако было
отмечено его увеличение в ВТО и прилежащем ядре. Эти структуры мозга тесно
связаны с ДА-ергической нейротрансмиссией и формированием психической
алкогольной зависимости. Показано, что введение грелина в вентральную
тегментальную область увеличивает выделения дофамина в прилежащем ядре и
локомоторную активность у крыс (Jerlhag et al., 2006a,b, 2007). Таким образом,
увеличение уровня экспрессии мРНК грелинового рецептора в первые сутки
после отмены алкоголя во фронтальной коре и на седьмые сутки в вентральной
82
тегментальной области и прилежащем ядре может быть направлено на активацию
ДА-ергических механизмов и свидетельствовать о поддержании поискового
поведения у животных направленного на возобновления потребления алкоголя. В
тоже время уровень мРНК грелинового рецептора в гипоталамусе был достоверно
снижен в сравнение с ее экспрессией у хронически алкоголизированных
животных. Это возможно связано с нормализацией уровня грелина в крови после
отмены алкоголя и развитием компенсационных процессов в грелиновой системе
(Kim et al., 2005; Calissendorff et al., 2006; Leggio, 2009).
Интересно отметить, что отдельные компоненты грелиновой системы мозга
реагируют разнонаправлено на отмену алкоголя. Экспрессия мРНК грелинового
рецептора увеличивается в прилежащем ядре и вентральной тегментальной
области, ответственной за подкрепляющие эффекты алкоголя и снижается в
гипоталамусе,
энергетического
ответственном
обмена.
за
регуляцию
Полученные
данные
пищевого
указывают
поведения
на
и
сложность
организации грелиновой системы в мозге и ее важную роль в регуляции
различных функций организма.
Грелиновая система, по всей видимости, играет важную роль в процессах
положительного подкрепления и формировании алкогольной зависимости.
Внутримозговое
введение
грелина
повышает
потребление
алкоголя
у
экспериментальных животных, у нокаутных мышей по гену грелина снижена
способность алкоголя стимулировать двигательную активность и высвобождение
дофамина в прилежащем ядре (Jerlhag et al., 2009). Центральное или
периферическое введение антагонистов рецептора грелина снижает потребление
алкоголя у мышей (Jerlhag et al., 2009, Kaur, Ryabinin, 2010). Экспрессия гена
грелинового рецептора у крыс с высоким уровнем потребления алкоголя
увеличена в прилежащем ядре, вентральной тегментальной области, миндалине,
префронтальной коре и гиппокампе по сравнению с животными с низким уровнем
потребления алкоголя (Landgren et al., 2010).
Клинические данные также подтверждают роль рецептора грелина в
развитии зависимости к наркотическим веществам. Так, было обнаружено, что у
83
алкогользависимых людей имеется связь между одним однонуклеотидным
полиморфизмом в гене, кодирующем рецептор грелина, потреблением алкоголя,
избыточным весом, а также курением (Landgren et al., 2008, 2010).
Данные о связи содержания грелинов в кровеносном русле с потреблением
алкоголя немногочисленные и касаются главным образом ацилированной формы,
которая во всех отношениях наиболее исследована. Отмечено снижение
содержания ацилированного грелина как при острой, так и хронической
алкоголизации в эксперименте (Kim, 2005; Calissendorff, 2006; Leggio, 2009;
Dickson et al., 2011). Клинические исследования продемонстрировали снижение
уровня грелина у пациентов с выраженной алкогольной зависимостью, и
возрастание уровня грелинов в период отмены алкоголя (Kim, 2005; Leggio ,
2009). Одни авторы указывают на отсутствие связи между уровнем грелинов и
пристрастием к алкоголю, другие констатируют подобную связь (Leggio, 2009). В
целом различные исследователи склонны считать, что повышенная секреция
грелинов может принимать участие в развитии механизмов пристрастия к
повышенному потреблению пищи, алкоголя и психостимуляторов. Существуют
также данные о том, что в эксперименте голодание способствует повышению
уровня пептида, тогда как состояние сытости связано, наоборот, со снижением
(Inhoff, 2008).
В нашем исследовании содержания дезацилгрелина на системном уровне в
условиях
контролируемого
эксперимента
по
хронической
алкоголизации
продемонстрировало закономерную динамику концентрации пептида. Оценка
первичных количественных данных с помощью статистических показателей
позволяет говорить о значимом снижении концентрации пептида в сыворотке
крови и последующем росте в ходе отмены алкоголя. Важным фактом также
является доказательство возможности определения дезацилгрелина в образцах
сывороток при традиционных физиологических приемах получения образцов,
несмотря на относительную нестабильность грелинов в сыворотке и плазме крови
(Hosoda, 2004; Rauh 2007). Можно также говорить о том, что концентрация
84
дезацилгрелина в сыворотке экспериментальных животных адекватно отражает
уровень алкоголизации.
Таким образом, грелин и его рецептор могут регулировать потребление и
поиск веществ подкрепления, из чего следует, что лечение пациентов с
алкогольной
зависимостью
с
помощью
фармакологических
веществ,
взаимодействующих с грелиновой системой головного мозга, может быть
перспективным направлением.
85
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В диссертационной работе представлены результаты экспериментальных
исследований, доказывающие, что пренатальное действие алкоголя негативно
влияет на созревание ДА-ергической и грелиновой систем мозга, а так же
вовлечение грелиновой системы в механизмы алкогольной зависимости.
Показано, что пренатальная алкоголизация сопровождается снижением
уровня дофамина, мРНК КОМТ, и увеличением содержания мРНК длинного и
короткого сплайс-вариантов дофаминового рецептора Д2-типа в структурах
переднего мозга крыс-эмбрионов 17-го дня развития. В ранний постнатальный
период отмечается дальнейшее снижение активности ДА-системы, в частности,
уменьшение содержания ДОФУК и отношения ДОФУК/ДА в группе крысят,
матери которых потребляли алкоголь во время беременности, но были переведены
на потребление воды после рождения потомства. В группе потомства
продолжающих алкоголизироваться крыс содержание ДОФУК и отношение
ДОФУК/ДА было еще более сниженным. Выраженность изменений ДА-системы
на разных сроках постнатального развития была различной. Максимальное
угнетение активности ДА-системы отмечалось в более поздние сроки, в
частности,
на
10-й
функционирования
день
постнатального
дофаминергической
системы
периода.
мозга
Нормализация
(по
показателям
содержания ДОФУК и мРНК фермента катаболизма катехоламинов КОМТ в
структурах переднего мозга) в случае отмены алкоголя в постнатальном периоде
отмечалась в сроки не ранее 17-го дня постнатального развития.
Алкоголизация
крыс
в
период
беременности
снижает
уровень
дезацилгрелина в сыворотке в ранний постнатальный период у плодов. При этом
экспрессия мРНК рецептора грелина в головном мозге увеличивается.
Полунасильственная алкоголизация взрослых крыс в течение 6-ти месяцев
существенно не влияла на уровень экспрессии мРНК грелинового рецептора в
большинстве эмоциогенных структур мозга, за исключением прилежащего ядра и
гипоталамуса,
где
отмечалось
умеренное
увеличение
экспрессии
мРНК
86
грелинового рецептора. У хронически алкоголизированных крыс через сутки
после отмены алкоголя увеличивается экспрессия мРНК грелинового рецептора во
фронтальной коре, вентральной тегментальной области и прилежащем ядре с
нормализацией к 7-му дню абстиненции только во фронтальной коре. В
гипоталамусе экспрессия мРНК грелинового рецептора остается сниженной,
несмотря на отмену этанола. Отдельные компоненты грелиновой системы мозга
реагируют разнонаправлено на отмену алкоголя после его хронического
потребления в течение 6-ти месяцев. Экспрессия мРНК грелинового рецептора,
как правило, увеличивается в структурах, ответственных за подкрепляющие
эффекты алкоголя (прилежащее ядро и вентральная тегментальная область) и
снижается в структурах, ответственных за регуляцию пищевого поведения и
энергетического обмена (гипоталамус).
Таким
образом,
представления
полученные
о механизмах
данные
алкогольной
расширяют
зависимости,
существующие
в частности
во
взаимодействии дофаминовой и грелиновой систем. Участие грелиновой системы
в механизмах алкогольной зависимости открывает возможность создания
антагонистов рецепторов грелина или иных антигрелиновых агентов для
коррекции
(подавления)
алкогольной
мотивации
подкрепляющих свойств наркогенов, включая этанол.
либо
уменьшения
87
ВЫВОДЫ
1.
Пренатальная
алкоголизация
сопровождается
снижением
уровня
дофамина, мРНК КОМТ, и увеличением содержания мРНК длинного и короткого
сплайс-вариантов дофаминового рецептора Д2-типа в структурах переднего мозга
крыс-эмбрионов 17-го дня развития.
2. В ранний постнатальный период отмечается дальнейшее снижение
активности ДА-системы, в частности, уменьшение содержания ДОФУК и
отношения ДОФУК/ДА в группе крысят, матери которых потребляли алкоголь во
время беременности, но были переведены на потребление воды после рождения
потомства. В группе потомства продолжающих алкоголизироваться крыс
содержание ДОФУК и отношение ДОФУК/ДА было еще более сниженным.
3. Выраженность изменений ДА-системы на разных сроках постнатального
развития была различной. Максимальное угнетение активности ДА-системы
отмечалось в более поздние сроки, в частности, на 10-й день постнатального
периода.
4. Нормализация функционирования дофаминергической системы мозга (по
показателям содержания ДОФУК и мРНК фермента катаболизма катехоламинов
КОМТ в структурах переднего мозга) в случае отмены алкоголя в постнатальном
периоде отмечалась в сроки не ранее 17-го дня постнатального развития.
5.
Алкоголизация
крыс
в
период
беременности
снижает
уровень
дезацилгрелина в сыворотке в ранний постнатальный период у плодов. При этом
экспрессия мРНК рецептора грелина в головном мозге увеличивается.
6. Длительная полунасильственная алкоголизация взрослых крыс в течение
6-ти месяцев существенно не влияла на уровень экспрессии мРНК грелинового
рецептора в большинстве эмоциогенных структур мозга, за исключением
прилежащего ядра и гипоталамуса, где отмечалось умеренное увеличение
экспрессии мРНК грелинового рецептора.
7. У хронически алкоголизированных крыс через сутки после отмены
алкоголя увеличивается экспрессия мРНК грелинового рецептора во фронтальной
88
коре, вентральной тегментальной области и прилежащем ядре с нормализацией к
7-му дню абстиненции только во фронтальной коре. В гипоталамусе экспрессия
мРНК грелинового рецептора остается сниженной, несмотря на отмену этанола.
8.
Отдельные
компоненты
грелиновой
системы
мозга
реагируют
разнонаправлено на отмену алкоголя после его хронического потребления в
течение 6-ти месяцев. Экспрессия мРНК грелинового рецептора, как правило,
увеличивается в структурах, ответственных за подкрепляющие эффекты алкоголя
(прилежащее ядро и вентральная тегментальная область) и снижается в
структурах, ответственных за регуляцию пищевого поведения и энергетического
обмена (гипоталамус).
89
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Полученные данные расширяют существующие представления о
механизмах
дофаминовой
алкогольной
и
зависимости,
грелиновой
систем,
в
что
частности
может
во
быть
взаимодействии
использовано
в
соответствующих учебных программах.
2. Участие грелиновой системы в механизмах алкогольной зависимости
открывает возможность создания антагонистов рецепторов грелина или иных
антигрелиновых агентов для коррекции (подавления) алкогольной мотивации либо
уменьшения подкрепляющих свойств наркогенов, включая этанол.
3. В качестве дополнительного биохимического маркера зависимости от
алкоголя возможно использование тестов на экспрессию мРНК рецептора грелина
и конценрацию дезацилгрелина в сыворотке крови, что повышает доказательность
лабораторных наркологических исследований.
90
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
L-ДОФА – L-3,4-диоксифенилаланин
GHSR – growth hormone secretagogue receptor (рецептор грелина)
НМДА – N-метил-D-аспартат
АЦ – аденилатциклаза
ВМАТ – везикулярный моноаминовый транспортер
ВОП – вентральная область покрышки
ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография
ГГНС – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система
ГОАТ – грелин-О-ацилтрансфераза
ДА – дофамин
ДАТ – дофаминовый транспортер
ДАТ дофаминовый транспортер
ДОФУК – 3,4-диоксифенилуксусная кислота
ИФА – иммуноферментный анализ
КОМТ – катехол-О-метилтрансфераза
МПК – медиальная префонтальна кора
мПЦР – мультиплексная полимеразная цепная реакция
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота
НК – нуклеиновые кислоты
НК – нуклеиновые кислоты
О.С. - ошибка среднего
ОТ – обратная транскрипция
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ФАС – фетальный алкогольный синдром
цАМФ – циклический аденозинмонофосфат
ЦНС – центральная нервная система
91
ПРИЛОЖЕНИЕ
Таблица 1.
Структура праймеров и зондов, используемых для оценки уровня экспрессии генов рецепторов
дофамина, КОМТ и бета-актина
Праймеры
Ген
Прямой
Длина
Обратный
ампликон
а
225
Д2L -404
Д1
5'-CAGTCCATGCCAAGAATTGC-3'
5'-AATCGATGCAGAATGGCTGG-3'
Д2
5'-ACTGTGACACAAGGTTGAGC-3'
5'-TACAGTCCTTGGAGATGGAG-3'
Д4
Д5
КОМТ
β-
5'-CTACTCAGGGTCCCCTCTTC-3'
5'-GATCTTGGCGCCTCTCTTTC-3'
5'-AGTCGTGGAGCCTATGAACC-3'
5'-GCGTCGTTGGAGAGATTTGA-3'
5'-TGCGCTACGTGCAGCAGA-3'
5'-ACTGTCCCCTTGCGCAGC-3'
Д2S -317
189
517
466
5'-GAAGATCCTGACCGAGCGTG-3'
5'-AGCACTGTGTTGGCATAGAG-3'
327
актин
Таблица 2
Структура праймеров и зондов для оценки уровня экспрессии генов рецептора
грелина и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
Название
Ген
Рецептор грелина
Глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназа
праймера,
пробы
прямой
обратный
зонд
прямой
обратный
зонд
Нуклеотидная последовательность
5'-CCTGGTGTCCTTTGTCCTCTTCTAC-3'
5'-GTTCTGCCTCCTCCCAAGTCCC-3'
JOE 5'-CTCCGCCATCGCTCATTGCTCTACACCC-3' BHQ-1
5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'
5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3'
FAM 5'-ATCACGCCACAGCTTTCCAGAGGG-3' BHQ-1
92
Таблица 3
Влияние алкоголизации крыс-самок в период беременности и кормления на
содержание ДА в структурах переднего мозга потомства в пренатальный и ранний
постнатальный периоды (нг/мг ткани)
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности
Группа крыс
Контроль (потребляли
Пренатальный период
13-й день
17-й день
0,0±0,0
0,0187±0,0077
0,0±0,0
0,0131±0,0027*
Постнатальный период
10-й день
4-й день жизни
жизни
17-й день жизни
0,0945±0,0033
0,0982±0,0075
0,4378±0,0208
0,0789±0,0105
0,2900±0,0331
0,3080±0,0932
0,0982±0,0075
0,2340±0,0152
рождения детенышей
Примечание. * р<0,05 по отношению к контрольной группе.
0,4955±0,0205
воду)
Алкоголизация во время
беременности и кормления
Отмена алкоголя после
93
Таблица 4
Влияние алкоголизации крыс-самок в период беременности и кормения на
содержание ДОФУК в ткани переднего мозга крысят в пренатальный и ранний
постнатальный периоды (нг/мг ткани)
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности и кормления
Отмена алкоголя после
Пренатальный период
13-й день
17-й день
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
Постнатальный период
10-й день
4-й день жизни
жизни
17-й день жизни
0,0067±0,0002
0,0332±0,0021
0,0302±0,0007
0,0082±0,0017
0,0362±0,0016
0,0165±0,0054*
0,0062±0,0008
0,0185±0,0025*#
0,0342±0,0027#
рождения детенышей
Примечание. * р<0,05 по отношению к контрольной группе;
#
р<0,05 по
отношению к группе крыс, алкоголизировавшихся во время беременности и
кормления.
94
Таблица 5
Влияние алкоголизации крыс в период беременности на отношение ДОФУК/ДА в
переднем мозге рожденных от них крысят в пренатальный и ранний постнатальный
периоды
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности и кормления
Отмена алкоголя после
Пренатальный период
13-й день
17-й день
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
Постнатальный период
10-й день
4-й день жизни
жизни
17-й день жизни
0,0711±0,0043
0,1071±0,0113
0,0698±0,0028
0,1048±0,0197
0,1293±0,0131
0,0527±0,0046*
0,0632±0,0041
0,0780±0,0073*#
0,0689±0,0052
рождения детенышей
Примечание. * р<0,05 по отношению к контрольной группе; # р<0,05 по
отношению к группе крыс, алкоголизировавшихся во время беременности и
кормления.
95
Таблица 6
Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию мРНК Д1рецептора в структурах переднего мозга рожденных от них крысят в пренатальный и
ранний постнатальный периоды (у.е.)
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности и кормления
Отмена алкоголя после
рождения детенышей
Пренатальный период
13-й день
17-й день
14,25±0,10
24,48±0,13
14,50±0,20
24,65±0,23
Постнатальный период
10-й день
4-й день жизни
жизни
17-й день
жизни
42,08±0,13
53,55±2,15
53,75±2,23
44,18±0,95
52,88±2,31
50,80±3,63
44,33±1,01
53,43±1,37
48,68±1,75
96
Таблица 7
Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию мРНК Д2Lизоформы рецептора в структурах переднего мозга рожденных от них крысят в
пренатальный и ранний постнатальный периоды (у.е.)
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности
Группа крыс
Контроль (потребляли
Пренатальный период
13-й день
17-й день
65,28±0,36
58,23±0,26
65,23±0,24
65,40±0,67*
Постнатальный период
10-й день
4-й день жизни
жизни
17-й день
жизни
75,52±0,29
110,8±0,83
125,2±0,97
75,08±0,52
111,2±1,06
124,8±1,05
75,83±0,40
111,1±1,41
рождения детенышей
Примечание. * р<0,05 по отношению к контрольной группе.
125,9±1,09
воду)
Алкоголизация во время
беременности и кормления
Отмена алкоголя после
97
Таблица 8
Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию мРНК Д2Sизоформы рецептора в структурах переднего мозга рожденных от них крысят в
пренатальный и ранний постнатальный периоды (у.е.)
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности
Группа крыс
Контроль (потребляли
Пренатальный период
13-й день
17-й день
0,0±0,0
57,48±0,33
0,0±0,0
64,48±0,65*
Постнатальный период
10-й день
4-й день жизни
жизни
17-й день
жизни
59,88±0,29
73,93±0,91
83,53±0,69
59,55±0,36
74,10±1,14
83,83±0,70
60,28±0,34
74,28±1,68
рождения детенышей
Примечание. * р<0,05 по отношению к контрольной группе.
83,98±0,98
воду)
Алкоголизация во время
беременности и кормления
Отмена алкоголя после
98
Таблица 9
Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию мРНК Д4рецептора в структурах переднего мозга рожденных от них крысят в пренатальный и
ранний постнатальный период (у.е.)
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности и кормления
Отмена алкоголя после
рождения детенышей
Пренатальный период
13-й день
17-й день
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
Постнатальный период
10-й день
4-й день жизни
жизни
17-й день жизни
81,15±0,28
84,05±0,52
89,25±1,11
80,43±0,37
85,35±0,43
87,98±0,91
81,95±1,24
85,00±1,08
88,70±0,59
99
Таблица 10
Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию мРНК Д5рецептора в структурах переднего мозга рожденных от них крысят в пренатальный и
ранний постнатальный периоды (у.е.)
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности и кормления
Отмена алкоголя после
рождения детенышей
Пренатальный период
13-й день
17-й день
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
Постнатальный период
10-й день
4-й день жизни
жизни
17-й день
жизни
98,73±0,84
109,4±0,47
109,2±1,91
109,2±1,91
110,2±1,21
107,1±1,64
99,15±0,18
108,2±0,99
107,3±1,84
100
Таблица 11
Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию мРНК КОМТ
в структурах переднего мозга рожденных от них крысят в пренатальный и ранний
постнатальный периоды (у.е.)
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности
Группа крыс
Контроль (потребляли
Пренатальный период
13-й день
17-й день
82,60±0,33
84,85±1,04
82,88±0,27
80,65±1,05*
Постнатальный период
10-й день
4-й день жизни
жизни
17-й день
жизни
97,20±0,16
107,6±1,65
103,7±2,66
96,08±0,55
108,0±1,74
89,25±0,78*
97,63±0,92
107,8±1,39
рождения детенышей
Примечание: * р<0,05 по отношению к контрольной группе.
104,2±2,80
воду)
Алкоголизация во время
беременности и кормления
Отмена алкоголя после
101
Таблица 12
Влияние алкоголизации крыс в период беременности на экспрессию мРНК
рецептора грелина в структурах переднего мозга рожденных от них крысят в
пренатальный ия ранний постнатальный периоды (у.е.)
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности
Группа крыс
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности и кормления
Отмена алкоголя после
Пренатальный период
13-й день
17-й день
1,03±0,09
0,99±0,09
1,32±0,20
1,12±0,19
Постнатальный период
10-й день
4-й день жизни
жизни
17-й день
жизни
1,18±0,22
1,01±0,09
1,32±0,10
1,14±0,09
1,36±0,19
1,97±0,25*
1,32±0,40
1,18±0,22
2,16±0,32*
рождения детенышей
Примечание. * − р<0,05 по отношению к группе интактных животных.
102
Таблица 13
Влияния алкоголизации беременных крыс на содержание дезацилгрелина в сыворотке
крови рожденных от них крысят в ранний постнатальный период (нг/мл)
Группа крыс
10-й день
17-й день
жизни
жизни
5,49±0,09
5,77±0,33
9,50±2,29
5,41±0,06
5,41±0,06
5,36±0,05*
4-й день жизни
Контроль (потребляли
воду)
Алкоголизация во время
беременности и кормления
Отмена алкоголя после
5,44±0,04
5,50±0,13
5,69±0,19*
рождения детенышей
Примечание. * р<0,05 по отношению к группе интактных животных.
Таблица 14
Влияние алкоголизации и отмены алкоголя на экспрессию грелинового рецептора
в структурах мозга взрослых крыс
Структура мозга
Интактные
Фронтальная кора 1,33±0,45
Алкоголь
1,53±0,59
1-й день
7-й день
абстиненции
абстиненции
5,80±1,05*#^
1,98±0,59
Прилежащее ядро 1,01±0,09
1,36±0,19
1,22±0,28
1,97±0,25*
Гипоталамус
1,32±0,40
1,99±0,23
1,53±0,25
0,64±0,33#
Миндалина
1,02±0,09
0,76±0,10
0,87±0,18
0,70±0,13
Гиппокамп
1,01±0,09
1,18±0,22
1,37±0,30
1,37±0,18
Вентральная
тегментальная
1,18±0,219
1,42±0,39
2,16±0,62
3,42±0,59*#
область
Примечание. * р<0,05 по отношению к группе интактных животных; # р<0,05 по
отношению к группе алкоголизированных крыс; ^ р<0,05 по отношению к группе
животных с отменой алкоголя в течение 7-ми дней.
103
Таблица 15
Влияние алкоголизации и отмены алкоголя на содержание дезацилгрелина в
сыворотке крови крыс (нг/мл)
Интактные
Алкоголь
0,956±0,108
0,476±0,0734*
1-й день
7-й день
абстиненции
абстиненции
0,552±0,0695*#^
0,669±0,0777*#
Примечание. * р<0,05 по отношению к группе интактных животных;
#
р<0,05 по
отношению к группе алкоголизированных крыс; ^ р<0,05 по отношению к группе
животных с отменой алкоголя в течение 7-ми дней.
104
ЛИТЕРАТУРА
1. Айрапетов, М.И. Влияние хронической алкоголизации и отмены этанола
на уровень экспрессии мРНК грелинового рецептора в мозге крыс. / М.И.
Айрапетов, Э.А. Сексте, П.П. Хохлов и др. // Наркология. – 2013. – №9 (141). –
С.61-65.
2. Западнюк, И.П. Лабораторные животные, их разведение, содержание и
использование в эксперименте / И.П. Западнюк, В.И. Западнюк, Е.А. Захария. –
Киев: Медгиз УССР, 1962. – 350 с.
3. Лебедев,
А.А.
Нейробиологические
механизмы
и
фармакология
подкрепляющих систем мозга: дис. … д-ра биол. наук: 14.00.25 / Лебедев Андрей
Андреевич. – С-Пб., 2002. – 300 с.
4. Лебедев, A.A. Структурные изменения в мезокортиколимбической
дофаминергической системе мозга при длительной алкоголизации крыс / A.A.
Лебедев, A.B. Дробленков, П.Д. Шабанов // Бюл. эксперим. биол. и мед. — 2008.
— T. 146, №12. — С. 698 –700.
5. Новоселов, И.А. Изучение роли Д1, Д2 и Д4 подтипов дофаминовых
рецепторов в механизмах действия психомоторных стимуляторов: дисс. … канд.
биол. наук: 14.00.25 / Новоселов Илья Александрович. – М., 2003. – 186 с.
6. Раевский,
К.С.
Дофаминергические
системы
мозга:
рецепторная
гетерогенность, функциональная роль, фармакологическая регуляция. / К.С.
Раевский, Т.Д. Сотникова и др. // Успехи физиол. Наук. — 1996. — № 4. — С. 3–
30.
7. Шабанов, П.Д. Пcихoнeйpoэндoкpинoлorия. / П.Д. Шaбaнoв, H.C.
Сапронов. – СПб.: Инфopм–Навигатор, 2010. – 984 c.
8. Шабанов,
нейрохимическая
П.
Д.
Подкрепляющие
организация,
системы
мозга:
локализация,
участие в формировании зависимости
от
психостимуляторов. / П. Д. Шабанов, А. А Лебедев // Психофармакол. и биол.
наркол. — 2001. — Т.1. №1. — С. 13–27.
9. Шабанов, П.Д. Гормональньные механизмы подкрепления. / П.Д.
105
Шабанов, A.A. Лебедев, В.Ф. Стрeльцов. — СПб.: Элби-СПб., 2008 – 272 с.
10.
Шабанов, П.Д. Последствия внyтриамниoтического введения 6–
гидpoкcидoфaминa
беременным
крысам,
оцененные
по
поведенческим
показателям y взрослого потомства. / П.Д. Шабанов, A.A. Лебедев, Ш.K. Мещеров
// Психофармакол. и биол. наркол. — 2002. — Т. 2, №1–2. — C. 265–271.
11. Abizaid, A. Ghrelin modulates the activity and synaptic input organization of
midbrain dopamine neurons while promoting appetite / A. Abizaid, Z.W. Liu, Z.B.
Andrews et al. // Journal of Clinical Investigation. – 2006. – № 116 (12). – Р. 3229–
3239.
12.
Accili, D. A targeted mutation of the D3 dopamine receptor gene is
associated with hyperactivity in mice / D. Accili, C.S. Fishboume, J. Drago et al. // Proc.
Nat. Acad. Sci. – 1996. – vol. 93. – P. 1945–1949.
13.
Addolorato, G. Relationship between ghrelin levels, nutritional status and
craving in current alcoholics / G. Addolorato, E. Capristo, L. Leggio, et al. //
Alcoholism. Clinical and Experimental Research – 2006. – № 30 (11). – P. 1933–1937.
14.
Alcaro, A. Behavioral Functions of the Mesolimbic Dopaminergic System:
an Affective Neuroethological Perspective / A. Alcaro, R. Huber, J. Panksepp // Brain
Res. Rev. – 2007. – № 56(2). – P. 283–321.
15.
Antonopoulos, J. Postnatal development of the dopaminergic system of the
striatum in the rat / J. Antonopoulos, I. Dori, A. Dinopoulos, et al. // Neuroscience. –
2002. – Vol. 110, Issue 2. – P. 245–256.
16.
Arbuthnott, G.W. Dopamine release and metabolism in the rat striatum: An
analysis by the in vivo brain microdialysis / G.W. Arbuthnott, I.S. Fairbrother, S.P.
Butcher // Pharmacol. Therap. – 1990. – vol. 48. – P. 281–293.
17.
Arnt, J. Dopamine D–1 receptor agonists combined with the selective D–2
agonist quinpirole facilitate the expression of oral stereotyped behaviour in rats / J. Arnt,
J. Hyttel, J. Perregaard // Eur. J. Pharmacol. – 1987. – vol. 133, №2. – P. 137–145.
18.
Asakawa, A. Ghrelin is an appetite–stimulatory signal from stomach with
structural resemblance to motilin / A. Asakawa, A. Inui, T. Kaga et al. //
Gastroenterology. – 2001. – № 120 (2). – Р. 337–345.
106
19.
Badaoui, A. Alcohol dependence is associated with reduced plasma and
fundic ghrelin levels / A. Badaoui, C. De Saeger, J. Duchemin et al. // European Journal
of Clinical Investigation –2008. – № 38 (6). – P. 397–403.
20.
Baik, J.–H. Parkinsonian–like locomotor impairment in mice lacking
dopamine D2 receptors / J.–H. Balk, R. Picetti, A. Salardi, et al. // Nature. –1995. –
vol.377. – P. 424–428.
21.
Bain, G. Naloxone attenuation of the effect cocaine on rewarding brain
stimulation / G. Bain, C. Kornetsky // Life Sci. – 1987. –Vol. 40. – P. 1119–1125.
22.
Barbier, E. Effects of prenatal and postnatal maternal ethanol on offspring
response to alcohol and psychostimulants in Long Evans rats / E. Barbier, H. Houchi, V.
Warnault, et al. // Neuroscience. – 2009. – Vol. 161, №2. – P. 427–440.
23.
Bauco, P. Lack of sensitization or tolerance to the facilitating effect of
ventral tegmental area morphine on lateral hypothalamic brain stimulation reward / P.
Bauco, Y. Wang, R.A. Wise // Brain Res. – 1993. – Vol. 617. № 2. – P. 303–308.
24.
Beaulieu, J. M. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine
receptors / J.M. Beaulieu, R.R. Gainetdinov // Pharmacol Rev. – 2011 – № 63(1). – Р.
182–217.
25.
Bednarek, M.A. Structure–function studies on the new growth hormone–
releasing peptide, ghrelin: minimal sequence of ghrelin necessary for activation of
growth hormone secretagogue receptor 1a / M.A. Bednarek, S.D. Feighner, S.S. Pong et
al. // J. Med. Chem. – 2000. – № 43. – Р. 4370–4376.
26.
Bergson, C. Regional, cellular, and subcellular variations in the
distribution of Dl and D5 dopamine receptors in primate brain / C. Bergson, L. Mrzljak,
J.F. Smiley et al. // Neurosci. – 1995. – vol. 15. – P. 7821–7836.
27.
Berke, J.D. Addiction, dopamine, and the molecular mechanisms of
memory / J.D. Berke, S.E. Hyman // Neuron. – 2000. – vol. 25. – P. 515–532.
28.
Berridge, K.C. Parsing reward / K.C. Berridge, T.E. Robinson // Trends in.
Neurosciences. – 2003. – № 26 (9). – P. 507–513.
29.
Bjorklund, A. Dopamine neuron systems in the brain: an update / A.
Bjorklund, S.B. Dunnett // Trends Neurosci. – 2007 – № 30(5). – P. 194–202.
107
30.
Bordi, F. Enhanced behavioral stereotypies elicited by intrastriatal
injection of Dl and D2 dopamine agonists in intact rats / F. Bordi, E. Meller // Brain
Res. – 1989. – vol. 504. – P. 276– 283.
31.
Bouthenet, M.L. Localization of dopamine D3 receptor mRNA in the rat
brain using in situ hybridization histochemistry: comparison with dopamine D2 receptor
mRNA / M.L. Bouthenet, E. Souil, M.P. Martres et al. // Brain Res. – 1991. – vol. 564. –
P. 203–219.
32.
Bowers, C.Y. On the in vitro and in vivo activity of a new synthetic
hexapeptide that acts on the pituitary to specifically release growth hormone / C.Y.
Bowers, F.A. Momany, G.A. Reynolds et al. // Endocrinology. – 1984. – № 114 (5). – P.
1537–1545.
33.
Brady, S. Basic Neurochemistry Principles of Molecular, Cellular, and
Medical Neurobiology / S. Brady, G. Siegel, R. Wayne Albers et al. // Eighth Edition. –
Oxford, 2012.
34.
Broaddus, W.C. Postnatal development of striatal dopamine function. 1.
An examination of D1 and D2 receptors, adenylate cyclase regulation and presynaptic
dopamine marcers / W.C. Broaddus, J.P.Jr. Bennett // Dev. Brain Res. – 1990. – № 52. –
P. 265–271.
35.
Caine, S.B. Modulation of cocaine self–administration in the rat through
D–3 dopamine receptors / S.B. Caine, G.F. Koob // Science. – 1993. – vol. 260, №5115.
– P.1814–1816.
36.
Calissendorff, J. Alcohol ingestion does not affect serum levels of peptide
YY but decreases both total and octanoylated ghrelin levels in healthy subjects / J.
Calissendorff, O. Danielsson, K. Brismar et al. // Clinical and Experimental
Metabolism. – 2006. – № 55 (12). – P. 1625–1629.
37.
Carneiro, L.M. Behavioral and neurochemical effects on rat offspring after
prenatal exposure to ethanol / L.M. Carneiro, J.P. Diogenes, S.M. Vasconcelos et al. //
Neurotoxicol. Teratol. – 2005. – Vol. 27, №4. – P. 585–592.
108
38.
Carroll, M.E. Food–deprivation increases oral and intravenous drug intake
in rats / M.E. Carroll, C.P. France, R.A. Meisch // Science. – 1979. – № 205 (4403). – P.
319–321.
39.
Chanoine, J.–P. Ghrelin gene expression is markedly higher in fetal
pancreas compared with fetal stomach: effect of maternal fasting / J.–P. Chanoine,
A.C.K. Wong // Endocrinology. –2004. – № 145. – P. 3813–20.
40.
Chen, Ch.–Y. Ghrelin Gene Products and the Regulation of Food Intake
and Gut Motility / Ch.–Y. Chen, A. Asakawa, M. Fujimiya et al. // Pharmacol. Rev. –
2009. – V. 61. – P. 430–481.
41.
Choi, W.S. Distribution of dopamine Dl, D2 and D5 mRNAs in the
monkey brain: ribonuclease protection assay analysis / W.S. Choi, C. Machida, O.K.
Ronnenkleiv // Mol. Brain Res. –1995. – vol. 31. – P. 86–94.
42.
Chotro, M.G. Exposure to low and moderate doses of alcohol on late
gestation modifies infantile response to and preference for alcohol in rats / M.G. Chotro,
C. Arias // Ann. Ist. Super. Sanita. – 2006. – Vol. 42, №1. – P. 22–30.
43.
Clark, D. Dl dopamine receptor – the search for the function: a critical
evaluation of the D1/D2 dopamine classification and its functional implications. / D.
Clark, F.J. White // Synapse. – 1997. – vol. 1. – P. 347–388.
44.
Clarren, S.K. Neuroanatomic and neurochemical abnormalities in
nonhuman primate infants exposed to weekly doses of ethanol during gestation / S.K.
Clarren, S.J. Astley, D.M. Bowden et al. // Alcohol Clin. Exp. Res. – 1990. – Vol. 14,
№5. – P. 674–683.
45.
Clifford, J.J. Topographical evaluation of behavioural phenotype in a line
of mice with targeted gene deletion of the D2 dopamine receptor / J.J. Clifford, A.
Usiello, D. Vallone et al. // Neuropharmacology. – 2000. – vol. 39, №3. – P. 382–90.
46.
Cooper, J.D. Alterations in regional catecholamine content and turnover in
the male rat brain in response to in utero ethanol exposure / J.D. Cooper, P.K. Rudeen //
Alcohol Clin. Exp. Res. – 1988. – Vol. 12, №2. – P. 282–285.
47.
Cooper, J.R. The biochemical basis of neuropharmacology / J.R. Cooper,
F.E. Bloom, R.H. Roth – 6th ed. – New York, Oxford. – University Press, 1991.
109
48.
Corbett, D. Chronic morphine fails to enhance the reward value of
prefrontal cortex self–stimulation / D. Corbett // Pharmacol. Biochem. Behav. – 1992. –
Vol. 42. № 3. – P. 451–455.
49.
Cowley, M.A. The distribution and mechanism of action of ghrelin in the
CNS demonstrates a novel hypothalamic circuit regulating energy homeostasis / M.A.
Cowley, R.G. Smith, S. Diano et al. // Neuron. – 2003. – № 37. – P. 649–661.
50.
Cummings, D.E. A preprandial rise in plasma ghrelin levels suggests a role
in meal initiation in humans / D.E. Cummings, J.Q. Purnell, R.S. Frayo et al. //
Diabetes. – 2001. – № 50 (8). – P. 1714–1719.
51.
Cummings, D.E. Plasma ghrelin levels and hunger scores in humans
initiating meals voluntarily without time– and food–related cues / D.E. Cummings, R.S.
Frayo, C. Marmonier et al. // American Journal of Physiology – Endocrinology and
Metabolism. – 2004. – № 287 (2). – P. E297–E304.
52.
Daly, S.A. Two directions of dopamine D1/D2 receptor interaction in
studies of behavioural regulation: a finding generic to four new, selective dopamine Dl
receptor antagonists / S.A. Daly, J.L. Waddington // Eur. J. Pharmacol. – 1992. – vol.
213, №2. – P. 251– 258.
53.
Daly, S.A. Behavioural effects of the putative D–3 dopamine receptor
agonist 7–OH–DPAT in relation to other "D–2–like" agonists / S.A. Daly, J.L.
Waddington // Neuropharmacology. – 1993. – vol. 32. – P. 509–510.
54.
Davis, C. Sensitivity to the rewarding effects of food and exercise in the
eating disorders / C. Davis, D.B. Woodside // Comprehensive Psychiatry. – 2002. – №
43 (3). – P. 189–194.
55.
Davis, K.W. Augmented cocaine conditioned place preference in rats
pretreated with systemic ghrelin / K.W. Davis, P.J. Wellman, P.S. Clifford // Regulatory
Peptides. – 2007. – № 140 (3). – P. 148–152.
56.
Dawson, T.M. The Dl dopamine receptor in the rat brain: quantitative
autoradiographic localization using and iodinated ligand / T.M. Dawson, P. Barone, A.
Sidhu et al. // Neuroscience. – 1988. – vol. 26. – P. 83–100.
110
57.
Dearry, A. Molecular cloning and expression of the gene for a human Dl
dopamine receptor / A. Dearry, J.A. Gingrich, P. Falardeau et al. // Nature. – 1990. –
vol.347. – P. 72–76.
58.
Demontes–Mainard, J. Postnatal ontogeny of dopamine D3 receptors in
the mouse brain: autoradiographic evidence for a transient cortical expression / J.
Demontes–Mainard, C. Henry, Y. Jeantet et al. // Dev. Brain. Res. – 1996. – № 94. – P.
166–174.
59.
Di Giovanni, G. Birth, Life and Death of Dopaminergic Neurons in the
Substantia Nigra / G. Di Giovanni, V. Di Matteo, E. Esposito. – New York, 2009.
60.
Dickson, S.L. Blockade of central nicotine acetylcholine receptor
signaling attenuate ghrelin–induced food intake in rodents / S.L. Dickson, E.
Hrabovszky, C. Hansson et al. // Neuroscience. – 2010. – № 171 (4). – P. 1180–1186.
61.
Dickson, S.L. The role of the central ghrelin system in reward from food
and chemical drugs / S.L. Dickson, E. Egecioglu, S. Landgren et al. // Molecular and
Cellular Endocrinology. – 2011. – V.340. – P. 80–87.
62.
Dornonville de la Cour, C. Ghrelin treatment reverses the reduction in
weight gain and body fat in gastrectomised mice / C. Dornonville de la Cour, A.
Lindqvist, E. Egecioglu et al. // Gut. – 2005. – № 54 (7). – P. 907–913.
63.
Drago, J. Altered striatal function in a mutant mouse lacking D1a
dopamine receptors / J. Drago, C.R. Gerfen, J.E. Lachowicz et al. // Proc. Natl. Acad.
Sci. – 1994. – vol. 91. – P. 12564–12568.
64.
Drago, J. Dl dopamine receptor–deficient mouse: cocaine–induced
regulation of immediate–early gene and substance P expression in the striatum / J.
Drago, C.R. Gerfen, H. Westphal et al. // Neuroscience. – 1996. – vol. 74, №3. – P. 813–
23.
65.
Druce, M.R. Subcutaneous administration of ghrelin stimulates energy
intake in healthy lean human volunteers / M.R. Druce, N.M. Neary, C.J. Small et al. //
International Journal of Obesity. – 2006. – № 30 (2). – P. 293–296.
66.
Druse, M.J. Effects of in utero ethanol exposure on the developing
dopaminergic system in rats / M.J. Druse, N. Tajuddin, A. Kuo et al. // J. Neurosci. Res.
111
1990. – Vol. 27, №2. – P. 233–240.
67.
Dyr, W. Effects of D1 and D2 dopamine receptor agents on ethanol–
consumption in the high–alcoholdrinking (Had) line of rats / W. Dyr, W.J. Mcbride, L.
Lumeng et al. // Alcohol. – 1993. – № 10 (3). – P. 207–212.
68.
Egecioglu, E. Ghrelin increases intake of rewarding food in rodents / E.
Egecioglu, E. Jerlhag, N. Salome et al. // Addiction Biology. – 2010. – № 15 (3). – P.
304–311.
69.
Eilam, D. Dopaminergic control of locomotion, mouthing, snout contact,
and grooming: opposing roles of Dl and D2 receptors / D. Eilam, H. Talangbayan, G.
Canaran et al. // Psychopharmacol. – 1992. – vol. 106, №4. – P. 447–54.
70.
El–Ghundi, M. Disruption of dopamine D–1 receptor gene expression
attenuates alcohol–seeking behavior / M. El–Ghundi, S.R. George, J. Drago et al. //
European Journal of Pharmacology. – 1998. – № 353 (2–3). – P. 149–158.
71.
Elsworth, J.D. Dopamine autoreceptor pharmacology and function. In: The
dopamine receptors / J.D. Elsworth, R.H. Roth. – Totowa: Humana Press Inc., 1996.
72.
Engel, J.A. Biochemical and behavioral evidence for an interaction
between ethanol and calcium–channel antagonists / J.A. Engel, C. Fahlke, P. Hulthe et
al. // Alcohol and Alcoholism. – 1988. – № 23 (3). – P. A13–A113.
73.
Ericson, M. The smoking cessation medication varenicline attenuates
alcohol and nicotine interactions in the rat mesolimbic dopamine system / M. Ericson,
E. Lof, R. Stomberg et al. // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. –
2009. – № 329 (1). – P. 225–230.
74.
Esposito, R.U. Cocaine: acute effects on reinforcement thresholds for self–
stimulation behavior to the medial forebrain bundle / R.U. Esposito, A.H. Motola, C.
Kornetsky // Pharmacol. Biochem. Behav. – 1978. – Vol. 8. – P. 437–439.
75.
Faulconbridge,
L.F. Hyperphagic
effects
of
brainstem
ghrelin
administration / L.F. Faulconbridge, D.E. Cummings, J.M. Kaplan et al. // Diabetes. –
2003– № 52 (9). – P. 2260–2265.
112
76.
Ferens, D.M. Functional and in situ hybridization evidence that
preganglionic sympathetic vasoconstrictor neurons express ghrelin receptors / D.M.
Ferens, L. Yin, R. Bron et al. // Neuroscience. – 2010 –Vol. 166. – P. 671-679.
77.
Ferrer, J.M. Neuromedin N decreases self–stimulation of the medial
prefrontal cortex / J.M. Ferrer, R. Sabater, J.A. Saez // Neuroreport. – 1992. – Vol. 3. –
№ 11. – P. 1027–1029.
78.
Fouriezos, G. Apomorphine and electrical self–stimulation of rat brain / G.
Fouriezos, S. Francis // Behav. Brain Res. – 1992. – Vol. 52. № 1. – P. 73–80.
79.
Fremeau, R.J. Localization of Dl dopamine receptor mRNA in brain
supports a role in cognitive, affective and neuroendocrine aspects of dopaminergic
neurotransmission / R.J. Fremeau, G.E. Duncan, M.G. Fomaretto et al. // Proc. Natl.
Acad. Sci. – 1991. – vol. 91. – P. 12564–12568.
80.
Furmidge, L.J. Role of dopamine Dl and D2 receptors in mediating the d–
amphetamine discriminative cue / L.J. Furmidge, M. Exner, D.Eur. Clark // J.
Pharmacol. – 1991. vol.202, №2, 191–199.
81.
Furuya, H. Effects of ethyl alcohol administration to THA rat dams during
their gestationperiod on learning behavior and on levels of monoamines and metabolites
in the brain of pups after birth / H. Furuya, H. Aikawa, T. Yoshida et al. // Alcohol Clin.
Exp. Res. – 1996. – Vol. 20, №9 – P. 305А–310A.
82.
Gainetdinov, R.R.
Monoamine
transporter. In:
Neurotransmitter
transporters: structure, function and regulation / R.R. Gainetdinov, M.G. Caron. – 2th
Ed. – Totowa: Humana Press Inc., 2002.
83.
Gelbard, H.A. Postnatal development of dopamine D1 and D2 receptor
sites in rat striatum / H.A. Gelbard, M.H. Teicher, G. Faedda et al. // Brain Res. – 1989.
– №49. – P.123–130.
84.
Gillespie, R.A. Effects of maternal ethanol consumption and buspirone
treatment on dopamine and norepinephrine reuptake sites and D1 receptors in
offspring / R.A. Gillespie, J. Eriksen, H.L. Hao et al. // Alcohol Clin. Exp. Res. – 1997.
– Vol. 21, №3. P. 452–459.
113
85.
Gingrich, J. A. Recent advances in the molecular biology of dopamine
receptors / J. A. Gingrich, M.G. Caron // Annu. Rev. Neurosci. – 1993. – vol.16. – P.
299–321.
86.
Giorgi, O. Developmental and age–related changes in D1–dopamine
receptors and dopamine content in the rat striatum. / O. Giorgi, G. De Montis, M.L.
Porceddu et al. // Dev. Brain Res. – 1987. – №35. – Р. 283–290.
87.
Goeders, N.E. Neuropharmacological assessment of cocaine self–
administration into the medial prefrontal cortex. / N.E. Goeders, S.F. Dworkin, J.E.
Smith et al. // Pharmacol. Biochem. Behav. – 1986. – Vol.24. – P. 1429–1440.
88.
Grigson, P.S. Like drugs for chocolate: separate rewards modulated by
common mechanisms? / P.S. Grigson // Physiology & Behavior. – 2002. – №76 (3). – Р.
345–346.
89.
Gualillo, O. Effect of food restriction on ghrelin in normal–cycling female
rats and in pregnancy. / O. Gualillo, J.E. Caminos, R. Nogueiras et al. // Obesity
Research. – 2002. – №10 (7). – Р. 682–687.
90.
Guan, X.M. Distribution of mRNA encoding the growth hormone
secretagogue receptor in brain and peripheral tissues. / X.M. Guan, H. Yu, O.C. Palyha
et al. // Molecular Brain Research. – 1997. – №48 (1). – Р. 23–29.
91.
Guerri, C. Foetal alcohol spectrum disorders and alterations in brain and
behavior. / C. Guerri, A. Baziner, E.P. Riley // Alcohol Alcoholism. – 2009. – Vol. 44,
№2. – P. 108–114.
92.
Hansen, S. Mesotelencephalic dopamine system and reproductive behavior
in the female rat: effects of ventral tegmental 6–hydroxydopamine lesions on maternal
and sexual responsiveness. / S. Hansen, C. Harthon, E. Wallin et al. // Behavioral
Neuroscience. – 1991. – №105 (4). – Р. 588–598
93.
Hayashida, T. Ghrelin in neonatal rats: distribution in stomach and its
possible role. / T. Hayashida, K. Nakahara, M.S. Mondal et al. // J. Endocrinol. – 2002.
– №173. – Р. 239–245.
94.
Herberg, L.J. Effect of the 5–HT3 receptor antagonist ondansetron on
hypothalamic self–stimulation in rats and its interaction with the CCK analogue
114
caerulein. / L.J. Herberg, J.S. De Belleroche, I.C. Rose et al. // Neurosci.Lett. – 1992. –
Vol. 140, №1. – P. 16–18.
95.
Herregodts, P. Development of monoamine neurotransmitters in fetal and
postnatal rat brain: analysis by HPLC with electrochemical detection. / P. Herrregodts,
B. Velkeniers, G. Ebinger et al. // J. Neurochem. – 1990. – №55. – Р. 774–779
96.
Hillary, E.S. A Quantum Leap in mRNA Quantitation / E.S. Hillary // The
Scientist. – 2000. — Vol. 14. — P. 22.
97.
Hillemacher, T. Role of appetite–regulating peptides in alcohol craving: an
analysis in respect to subtypes and different consumption patterns in alcoholism. / T.
Hillemacher, T. Kraus, J. Rauh et al. // Alcoholism – Clinical and Experimental
Research. – 2007. – №31 (6). – Р. 950–954.
98.
Hiroi, N. Molecular dissection of dopamine receptor signaling. / N. Hiroi,
A.B. Martin, C. Grande et al. //J Chem Neuroanat. – 2002. – vol.23, №94. – P. 237 –
242.
99.
Holden, C. Compulsive behaviors: behavioral’ addictions: do they exist? /
C. Holden // Science. – 2001. – №294 (5544). – Р. 980–982.
100. Holst, B. Constitutive ghrelin receptor activity as a signaling set–point in
appetite regulation Trends in Pharmacological. / B. Holst, T.W. Schwartz // Sciences. –
2004. – №25 (3). – Р. 113–117.
101. Holst, B. High constitutive signaling of the ghrelin receptor – identification
of a potent inverse agonist. / B. Holst, A. Cygankiewicz, T.H. Jensen et al. // Molecular
Endocrinology. – 2003. – №17 (11). – Р. 2201–2210.
102. Hosoda, H. Optimum Collection and Storage Conditions for Ghrelin
Measurements: Octanoyl Modification of Ghrelin Is Rapidly Hydrolyzed to Desacyl
Ghrelin in Blood Samples. / H. Hosoda, K. Doi, N. Nagaya et al. // Clinical Chemistry.
– 2004. – V. 50. – No. 6. – P. 1077–1080.
103. Howard, A.D. A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in
growth hormone release. / A.D. Howard, S.D. Cully, D.F. Feighner et al. // Science. –
1996. – №273 (5277). – Р. 974–977.
115
104. Inhoff, T. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally
injected ghrelin in rats. / T. Inhoff, H. Monnikes, S. Noetzel et al. // Peptides. – 2008. –
V. 29(12) – P. 2159–2168.
105. Inoue, Y. Transitional change in rat fetal cell proliferation in response to
ghrelin and des–acyl ghrelin during the last stage of pregnancy. / Y. Inoue, K. Nakahara,
K. Kangawa et al. // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2010 –
Vol. 393. – P.455–460.
106. Izenwasser, S. The effect of amfonelic acid or nisoxetine in combination
with morphine on brain–stimulation reward. / S. Izenwasser, C. Kornetsky // Pharmacol.
Biochem. Behav. – 1989. – Vol. 32. – P. 983–986.
107. Jackson, D.M. Westlund–Danielsson A. Dopamine receptors: molecular
biology, biochemistry and behavioral aspects. / D.M. Jackson // Pharmacol. Then. –
1994. – vol.64. – Р. 291–369.
108. Jerlhag,
E. Alpha–conotoxin
MII–sensitive
nicotinic
acetylcholine
receptors are involved in mediating the ghrelin–induced locomotor stimulation and
dopamine overflow in nucleus accumbens. / E. Jerlhag, E. Egecioglu, S.L. Dickson et
al. // European Neuropsychopharmacolology. – 2008. – №18 (7). – Р. 508–518.
109. Jerlhag, E. Ghrelin administration into tegmental areas stimulates
locomotor activity and increases extracellular concentration of dopamine in the nucleus
accumbens. / E. Jerlhag, E. Egecioglu, S.L. Dickson et al. // Addiction Biology. – 2007.
– №12 (1). – Р. 6–16.
110. Jerlhag, E. Ghrelin receptor antagonism attenuates cocaine– and
amphetamine–induced locomotor stimulation, accumbal dopamine release, and
conditioned place preference. / E. Jerlhag, E. Egecioglu, S.L. Dickson et al. //
Psychopharmacology (Berl). – 2010. – №211 (4). – Р. 415–422.
111. Jerlhag, E. Ghrelin stimulates locomotor activity and accumbal dopamine–
overflow via central cholinergic systems in mice: implications for its involvement in
brain reward. / E. Jerlhag, E. Egecioglu, S.L. Dickson et al. // Addiction Biology. –
2006a. – №11 (1). – Р. 45–54.
116
112. Jerlhag, E. Glutamatergic regulation of ghrelin–induced activation of the
mesolimbic dopamine system. / E. Jerlhag, E. Egecioglu, S.L. Dickson, et al. //
Addiction Biology. – 2011. – №16 (1). – Р. 82–91.
113. Jerlhag, E. Requirement of central ghrelin signaling for alcohol reward. / E.
Jerlhag, E. Egecioglu, S. Landgren et al. // Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America – 2009. – №106 (27). – Р. 11318–11323.
114. Jerlhag, E. Role of the subunit composition of central nicotinic
acetylcholine receptors for the stimulatory and dopamine–enhancing effects of ethanol. /
E. Jerlhag, M. Grotli, K. Luthman et al. // Alcohol and Alcoholism – 2006b. – №41 (5).
– Р. 486–493.
115. Jerlhag, E. Systemic administration of ghrelin induces conditioned place
preference and stimulates accumbal dopamine. / E. Jerlhag // Addiction Biology. – 2008.
– №13 (3–4). – Р. 358–363.
116. Jiang, H. Ghrelin amplifies dopamine signaling by cross talk involving
formation of growth hormone secretagogue receptor/ dopamine receptor subtype 1
heterodimers. / H. Jiang, L. Betancourt, R.G. Smith // Molecular Endocrinology. – 2006.
– №20 (8). – Р. 1772–1785.
117. Jones, S.R. Loss of autoreceptor functions in mice lacking the dopamine
transporter. / S.R. Jones, R.R. Gainetdinov, X.T. Hu et al. // Nat Neurosci. – 1999. –
vol.2, №7. – Р. 649–655.
118. Joseph, J.D. Dopamine autoreceptor regulation of release and uptake in
mouse brain slices in the absence of D(3) receptors. / J.D. Joseph, Y.M. Wang, P.R.
Miles et al. // Neuroscience. – 2002. – vol.112, №1. – Р. 39–49.
119. Jung, A.B. Development of striatal dopaminergic function. 1. Pre– and
postnatal development of mRNAs and binding sites for striatal D1 (D1a) and D2 (D2a)
receptors. / A.B. Jung, J.P. Bennett // Dev. Brain Res. – 1996. – №94. – Р. 109–120.
120. Jung, M.Y. Schmauss С Potentiation of the D2 mutant motor phenotype in
mice lacking dopamine D2 and D3 receptors. / M.Y. Jung, B.V. Skryabin, M. Aral et
al. // Neuroscience. – 1999. – vol.91, №3. – Р. 911–24.
117
121. Karasinska, J.M. Modification of dopamine D(1) receptor knockout
phenotype in mice lacking both dopamine D(1) and D(3) receptors. / J.M. Karasinska,
S.R. George, M. El–Ghundi et al. // J. Pharmacol. – 2000. – vol.399, №2–3. – Р. 171–
81.
122. Karlsson, R.–M. Comparison of dopamine D1 and D5 receptor knockout
mice for cocaine locomotor sensitization. / R.–M. Karlsson, K.R. Hefner, D.R. Sibley et
al. // Psychopharmacology (Berl). – 2008. — №200(1). – Р. 117–127.
123. Kaur, S. Ghrelin receptor antagonism decreases alcohol consumption and
activation of perioculomotor urocortin–containing neurons. / S. Kaur, A.E. Ryabinin //
Alcoholism – Clinical and Experimental Research. – 2010. – №34 (9). – Р. 1525–1534.
124. Kawahara, Y. Peripherally administered ghrelin induces bimodal effects on
mesolimbic dopamine system depending on food–consumptive states. / Y. Kawahara, H.
Kawhara, F. Kaneko et al. // Journal of Pharmacological Sciences. – 2009. – №109. –
P.187.
125. Kawamura, K. Ghrelin Inhibits the Development of Mouse Preimplantation
Embryos in Vitro. / K. Kawamura, N. Sato, J. Fukuda et al. // Endocrinology. – 2003. –
Vol. 144. – P. 2623–2633.
126. Kempinski R. Plasma ghrelin concentration in celiac patients / R.
Kempinski, M. Demissie, M. Jasinska et al. // Gastroenterologia Polska. – 2008. – № 15
(6) – P. 375–377.
127. Kennedy, J.L. Association study of dopamine D3 receptor gene and
schizophrenia. / J.L. Kennedy, E.A. Billett, F.M. Macciardi et al. // Am. J. Med. Genet.
– 1995. – vol.60, №6. – Р. 558–562.
128. Kim, D.J. Increased fasting plasma ghrelin levels during alcohol
abstinence. / D.J. Kim, S.J. Yoon, B. Choi et al. // Alcohol and Alcoholism. – 2005. –
№40 (1). – Р. 76–79.
129. Knapp, C. The effects of amfonelic acid alone and in combination with
naloxone on brain–stimulation reward. / C. Knapp, C. Kornetsky // Pharmacol.
Biochem. Behav. – 1989. – Vol. 32. – P. 977–982.
118
130. Kojima, M. Ghrelin is a growth–hormone–releasing acylated peptide from
stomach. / M. Kojima, H. Hosoda, Y. Date et al. // Nature. – 1999. – №402 (6762). – Р.
656–660.
131. Koob, G.F. Neuroanatomical substrates of drug self–administration / G.F.
Koob, N.E. Goeders // The Neuropharmacological Basis of Reward. Ed. by
J.M.Liebman, S.T.Cooper. Oxford: Clarendon. – 1989. – P. 214–263.
132. Krasnova, I.N. Intracerebroventricular administration of substance P
increases dopamine content in the brain of 6-hydroxydopamine-lesioned rats / I.N.
Krasnova, E.R. Bychkov, V.I. Lioudyno et al. // Neuroscience. – 2000. – № 95 (1). – P.
113-117.
133. Kraus, T. Ghrelin levels are increased in alcoholism. / T. Kraus, A.
Schanze, K. Bayerlein et al. // Pharmacopsychiatry. – 2005. – №38 (5). – Р. 257–1257.
134. Lajtha, N.S. Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology /
N.S. Lajtha, A. Johnson, A. Dianna – 3rd ed. – vol. 11. – 2007. – New York.
135. Lall, S. Growth hormone (GH)–independent stimulation of adiposity by
GH secretagogues. / S. Lall, L.Y.C. Tung, C. Ohlsson et al. // Biochemical and
Biophysical Research Communications. – 2001. – №280 (1). – Р. 132–138.
136. Landgren, S. Association of nAChR gene haplotypes with heavy alcohol
use and body mass. / S. Landgren, J.A. Engel, M.E. Andersson et al. // 2009. – Brain
Research. – № 1305 (Suppl.). – P. S72–S79.
137. Landgren,
S.
Association
of
Pro–Ghrelin
and
GHSR1A
gene
polymorphisms and haplotypes with heavy alcohol use and body mass. / S. Landgren, E.
Jerlhag, H. Zetterberg et al. // Alcoholism Clinical and Experimental Research. – 2008.
– № 32 (12). – 2054–2061.
138. Landgren, S. Genetic variation of the ghrelin signaling system in females
with severe alcohol dependence. / S. Landgren, E. Jerlhag, J. Hallman et al. //
Alcoholism – Clinical and Experimental Research. – 2010. – №34 (9). – Р. 1519–1524.
139. Larsson, A. Neurochemical and behavioral studies on ethanol and nicotine
interactions. / A. Larsson, J.A. Engel // Neuroscience and Biobehavioral Reviews. —
2004. — №27 (8). – Р. 713–720.
119
140. Larsson, A. Voluntary ethanol intake increases extracellular acetylcholine
levels in the ventral tegmental area in the rat. / A. Larsson, L. Edstrom, L. Svensson et
al. // Alcohol and Alcoholism — 2005. — №40 (5). – Р. 349–358.
141. Lee, S. Role of various neurotransmitters in mediating the long–term
endocrine consequences of prenatal alcohol exposure. / S. Lee, I. Choi, S. Kang et al. //
Ann. NY Acad. Sci. – 2008. – Vol. 1144. – P. 176–188.
142. Leggio, L. ESBRA–nordmann 2008 award lecture. Understanding and
treating
alcohol
craving
and
dependence:
Recent
pharmacological
and
uroendocrinological findings / L. Leggio // Alcohol Alcoholism. – 2009. – V. 44, N 4. –
P. 341–352.
143. Leggio, L. Role of the ghrelin system in alcoholism: acting on the growth
hormone secretagogue receptor to treat alcohol–related diseases. / L. Leggio // Drug
News Perspective — 2010. – №23 (3). – Р. 157–166.
144. Leith, N.J. Effects of apomorphine on self–stimulation responding: does
the drug mimic the current? / N.J. Leith // Brain Res. — 1983. — Vol. 277. — P. 129–
136.
145. Lejeune, F. Activation of dopamine D3 autoreceptors inhibits firing of
ventral tegmental dopaminergic neurones in vivo. / F. Lejeune, M.J. Millan // Eur. J.
Pharmacol. — 1995. — vol.275. — №3. – Р. 7–9.
146. Leslie, C.A. Postnatal development of D1 dopamine receptors in the
medial prefrontal cortex, striatum and nucleus accumbens of normal and neonatal 6–
hydroxydopamine treated rats: a quantitative autoradiographic study. / C.A. Leslie,
M.W. Robertson, A.J. Cutler et al. // 1991. — Dev. Brain. Res. — №62. – Р. 109–114.
147. Leviel, V. Direct observation of dopamine compartmentation in striatal
nerve terminal by "in vivo" measurement of the specific activity of released dopamine. /
V. Leviel, A. Gobert, B.Guibert // Brain Res. — 1989. — vol.499. – Р. 205–213.
148. Levin, E.D. Acute and chronic nicotinic interaction with dopamine systems
and working memory performance. / E.D. Levin, J.E. Rose // Ann. NY Acad.Sci. —
1995. — vol.757. – Р. 245–252.
149. Livak K.J. Analysis of relative gene expression data using real-time
120
quantitative PCR and the 2-[ΔΔCt] method / K.J. Livak, T.D. Schmittgen // Methods. –
2001. – № 25. – P. 402–408.
150. Lof, E. Nicotinic acetylcholine receptors in the ventral tegmental
areamediate the dopamine activating and reinforcing properties of ethanol cues. / E.
Lof, P. Olausson, A. deBejczy et al. // Psychopharmacology (Berl) — 2007. — №195
(3). — Р. 333–343.
151. Lyons, A.M. Effects of food availability and administration of orexigenic
and anorectic agents on elevated ethanol drinking associated with drinking in the dark
procedures. / A.M. Lyons, E.G. Lowery, D.R. Sparta et al. // Alcoholism – Clinical and
Experimental Research. — 2008. — №32 (11). – Р. 1962–1968.
152. Maldonaldo, R. Dl dopamine receptors in the nucleus accumbens modulate
cocaine self administartion in the rat. / R. Maldonaldo, P. Robledo // Pharamacol.
Biochem. Behav. — 1993. — vol.45. – Р. 239–242.
153. Mao, J. Increased levels of monoamine–derived potential neurotoxins in
fetal rat brain exposed to ethanol / J. Mao, H. Ma, Y. Xu et al. // Neurochem Res. –
2013. – № 38 (2). – P. 356–63.
154. Marcus, R. Negative and positive intracranial reinforcement thresholds:
effects of morphine. / R. Marcus, C. Kornetsky // Psychopharmacologia. — 1974. —
Vol. 38. — P. 1–13.
155. Markou, A. Bromocriptine reverses the elevation in intracranial self–
stimulation thresholds observed in a rat model of cocaine withdrawal. / A. Markou, G.F.
Koob // Neuropsychopharmacology. — 1992. — Vol. 7. № 3. — P. 213–224.
156. Matsumoto, M. "Catechol O–methyltransferase mRNA expression in
human and rat brain: Evidence for a role in cortical neuronal function". / M. Matsumoto,
C.S. Weickert, M. Akil et al. // Neuroscience. — 2003. — №116. – Р. 127.
157. McBride, W. J. Localization of brain reinforcement mechanisms:
intracranial self–administration and intracranial place–conditioning studies / W. J.
McBride, J. M. Murphy, S. Ikemoto // Behav. Brain Res. — 1999. — Vol. 101. — P.
129–152.
121
158. McKee, S.A. Varenicline reduces alcohol self–administration in heavy–
drinking smokers. / S.A. McKee, E.L. Harrison, S.S. O’Malley et al. // Biological
Psychiatry. — 2009. — №66 (2). – Р. 185–190.
159. Meador–Woodruff, J.H. Distribution of D5 dopamine receptor mRNA in
rat brain. / J.H. Meador–Woodruff, A. Mansour, D.K. Grandy et al. // Neurosci. Lett.
1992. — vol.145. – Р. 209–212.
160. Meyer, M.E. Locomotor activity following intraaccumbens microinjections
of dopamine D1 agonist SKF 38393 in rats. / M.E. Meyer, C. Van Hartesveldt, T.J.
Potter // Synapse. — 1993. — vol.13. – Р. 3310–314.
161. Millan, M.J. S 14297, a novel selective ligand at cloned human dopamine
D3 receptors, blocks 7–OH–DPAT–induced hypothermia in rats. / M.J. Millan, V.
Audinot, J.M. Rivet et al. / Eur. J. Pharmacol — 1994. — vol.260, №2–3. – Р. 3–5.
162. Miller, G.W. Dopamine transporters and neuronal injury. / G.W. Miller,
R.R. Gainetdinov, A.I. Levey et al. // Trends Pharmacol. Sci. — 1999. — vol.20. – Р.
424–429.
163. Miner, L.L. Retained cocaine conditioned place preference in D1 receptor
deficient mice. / L.L. Miner, J. Drago, P.M. Chamberlain et al. // Neuroreport. — 1995.
— vol.6, №17 – Р. 2314–2316.
164. Missale, C. Dopamine receptors: from structure to function. / C. Missale,
S. R. Nash, S. W. Robinson et al. // Physiol. Rev. — 1998. — vol.78 – Р. 189–225.
165. Missale, C. The neurobiology of dopamine receptors: evolution from the
dual concept to heterodimer complexes. / C. Missale, Ch. Fiorentini, G. Collo et al. // J.
Recept. Signal Transduct. Res. – 2010. — Vol. 30, № 5. – P. 347–354.
166. Missale, C. The neurobiology of dopamine receptors: evolution from the
dual concept to heterodimer complexes. / C. Missale, C. Fiorentini, G. Collo, P. Spano //
J. Recept. Signal. Transduct. Res. – 2010. – №30 (5). – P. 347-354.
167. Moghaddam, B. Characterization of dopamine release in the rat medial
prefrontal cortex as assessed by in vivo microdialysis: comparison to the striatum / B.
Moghaddam, R.H. Roth, B.S. Bunney // Neuroscience. – 1990 — Vol. 36. № 3. — P.
669–676.
122
168. Mokrosinski, J. Modulation of the constitutive activity of the ghrelin
receptor by use of pharmacological tools and mutagenesis. / J. Mokrosinski, B. Holst //
Methods in Enzymology. — 2010. — №484. –Р. 53–73.
169. Monsma, F.J. Multiple D2 dopamine receptors produced by alternative
RNA splicing. / F.J. Monsma, L.D. Mcvittle, C.R. Gerfen et al. // Nature. — 1989. —
vol.342. – Р. 926–929.
170. Morelli, M. Nigral dopamine autoreceptors are exclusively of the D2 type:
quantitative autoradiography of [125I]iodosulpride and [125I]SCH 23982 in adjacent
brain sections. / M. Morelli, T. Mennini, G. Di Chiara // Neuroscience. — 1988. —
vol.27, №3. – Р. 865–870.
171. Moulin, A. Toward potent ghrelin receptor ligands based on trisubstituted 1
2,4–triazole structure. 2. Synthesis and pharmacological in vitro and in vivo evaluations.
/ A. Moulin, L. Demange, G. Berge et al. // Journal of Medicinal Chemistry 2007. —
№50. – Р. 5790–5806.
172. Mrzliak, L. Localization of dopamine D4 receptors in GABAergic neurons
of the primate brain. / L. Mrzliak, C. Bergsson, M. Pappy et al. // Nature. — 1996. —
vol.381. – Р. 245–248.
173. Murrin, L.C. Ontogeny of dopamine D1 receptor in rat forebrain: a
quantitative autoradiographic study. / L.C. Murrin, W.Y. Zeng // Dev. Brain Res. —
1990. — №57. – Р. 7–13.
174. Nair, V.D. Ontogenic development of dopamine D4 receptor in rat brain. /
V.D. Nair, R.K. Mishra. // Brain Res Dev Brain Res. — 1995 — № 90 (1–2). – P. 180–
183
175. Nakahara, K. Maternal ghrelin plays an important role in rat fetal
development during pregnancy. / K. Nakahara, M. Nakagawa, Y. Baba et al. //
Endocrinology. – 2006. — №147. – Р. 1333–1342.
176. Naleid, A.M. Ghrelin induces feeding in the mesolimbic reward pathway
between the ventral tegmental area and the nucleus accumbens. / A.M. Naleid, M.K.
Grace, D.E. Cummings et al. // Peptides. — 2005. — 26 (11). – Р. 2274–2279.
123
177. Naseer, M.I. Downregulation of dopamine D1 receptors and increased
neuronal apoptosis upon ethanol and PTZ exposure in prenatal rat cortical and
hippocampal neurons / M.I. Naseer, I. Ullah, M. Rasool et al. // Neurol. Sci. – 2014. –
№ 35 (11). – P.1681–1688.
178. Nestler, E.J. Learning about addiction from the genome. / E.J. Nestler, D.
Landsman // Nature. – 2001 — vol.409. – Р. 835–835.
179. Neve, K.A. "Dopamine receptor signaling". / K.A. Neve, J.K. Seamans, H.
Trantham–Davidson // J. Recept. Signal Transduct. Res. — 2004. — №24 (3). – Р. 165–
205.
180. Olszewski, P.K. Hypothalamic paraventricular injections of ghrelin: effect
on feeding and c–Fos immunoreactivity. / P.K. Olszewski, M.K. Grace, C.J. Billington
et al. // Peptides // 2003a. — №24 (6). – Р. 919–923.
181. Olszewski, P.K. Neural basis of orexigenic effects of ghrelin acting within
lateral hypothalamus. / P.K. Olszewski, D.H. Li, M.K. Grace et al. // Peptides. —
2003b. — №24 (4). – Р. 597–602.
182. Parsian, A. Possible association between the dopamine D3 receptor gene
and bipolar affective disorder. / A. Parsian, S. Chakraverty, R.D. Todd // Am. J. Med.
Genet. — 1995. — vol.60, №3. – Р. 234–237.
183. Parvez, H. Developmental changes in the activity of catechol–O–methyl
transferase in rat and rabbit fetuses. / H. Parvez, G. Ismahan, S. Parvez et al. // Journal
of Neural Transmission. – 1979. — Volume 44, Issue 1–2. – Р. 65–75.
184. Perello, M. Ghrelin increases the rewarding value of high–fat diet in an
orexin–dependent manner. / M. Perello, I. Sakata, S. Birnbaum et al. // Biological
Psychiatry. — 2010. — №67 (9). – Р. 880–886.
185. Pivonello, R. Novel insights in dopamine receptor physiology. / R.
Pivonello, D. Ferone, G. Lombardi et al. // European Journal of Endocrinology. – 2007.
— №156. – Р. 13–21.
186. Potenza, M.N. Gambling urges in pathological gambling – a functional
magnetic resonance imaging study. / M.N. Potenza, M.A. Steinberg, P. Skudlarski et
al. // Archives of General Psychiatry. — 2003. — №60 (8). Р. — 828–836.
124
187. Quarta, D. Systemic administration of ghrelin increases extracellular
dopamine in the shell but not the core subdivision of the nucleus accumbens. / D.
Quarta, C. Di Francesco, S. Melotto et al. // Neurochemistry International. — 2009. —
№54 (2). – Р. 89–94.
188. Rada, P.V. Acetylcholine release in ventral tegmental area by hypothalamic
self–stimulation, eating, and drinking. / P.V. Rada, G.P. Mark, J.J. Yeomans et al. //
Pharmacology Biochemistry and Behavior. — 2000. — №65 (3). – Р. 375–379.
189. Rao, P.A. Ontogeny of dopamine D1 and D2 receptor subtypes in rat basal
ganglia: a quantitative autoradiographic study. / P.A. Rao, P.B. Molinoff, J.N. Joyce //
Dev. Brain. Res. — 1991. — №60. – Р. 161–177.
190. Rathbun, W. Dopamine, serotonin, and acid metabolites in brain regions
from the developing offspring of ethanol–treated rats / W. Rathbun, M.J. Druse // J.
Neurochem. – 1985. – Vol. 44, №1. – P. 57–62.
191. Rauh, M. Simultaneous quantification of ghrelin and desacyl–ghrelin by
liquid chromatography–tandem mass spectrometry in plasma, serum, and cell
supernatants. / M. Rauh, M. Groschl, W. Rascher // Clinical Chemistry. – 2007. – V. 53.
– №5. – P. 902–910.
192. Rivera, A. Dopamine D4 receptors are heterogeneously distributed in the
striosomes/matrix compartments of the striatum. / A. Rivera, B. Cuellar, F.J. Giron et al.
// Neurochem. — 2002. — vol.80, №2. – Р. 219–229.
193. Rivera, A. Fetal alcohol spectrum disorders: An overview with emphasis on
changes in brain and behavior / A. Rivera, E.P. Riley, C.L. McGee // Exp. Biol. Med. –
2005. – Vol. 230. – P. 357–365.
194. Robinson, T.E. The neural basis of drug craving – an incentivesensitization
theory of addiction. / T.E. Robinson, K.C. Berridge // Brain Research Reviews. — 1993.
— №18 (3). – Р. 247–291.
195. Rothmond, D.A. Developmental changes in human dopamine receptors
and terminators / D.A. Rothmond, C. S. Weickert, M.J. Webster // BMC Neurosci. –
2012. – №13 (18). – P. 1–14.
125
196. Rubinstein, M. Mice lacking dopamine D4 receptors are supersensitive to
ethanol, cocaine, and methamphetamine. / M. Rubinstein, T.J. Phillips, J.R. Bunzow et
al. // Cell. — 1997. — vol.90. – Р. 991–1001.
197. Salome, N. Anorexigenic and electrophysiological actions of novel ghrelin
receptor (GHS–R1A) antagonists in rats. / N. Salome, D. Haage, D. Perrissoud et al. //
European Journal of Pharmacology. — 2009a. — №612 (1–3). – Р. 167–173.
198. Salome, N. On the central mechanism underlying ghrelin’s chronic pro–
obesity effects in rats: new insights from studies exploiting a potent ghrelin receptor
antagonist. / N. Salome, C. Hansson, M. Taube et al. / Journal of Neuroendocrinology.
— 2009b. — №21 (9). – Р. 777–785.
199. Santos, M. Ghrelin expression in human and rat fetal lungs and the effect
of ghrelin administration in nitrofen–Induced congenital diaphragmatic hernia. / M.
Santos, P. Bastos, S. Gonzaga et al. // Pediatric Research. – 2006. — №59. – Р. 531–
537.
200. Sato, T. Structure, regulation and function of ghrelin. / T. Sato, Y.
Nakamura, Y. Shiimura et al. // J. Biochem. – 2012. V.151(2). –P.119–128.
201. Schambra, U.B. Ontogeny of D1A and D2 dopamine receptor subtypes in
rat brain using in situ hybridization and receptor binding. / U.B. Schambra, G.E.
Duncan, G.R. Breese et al. // Jr.Neuroscience. — 1994. — №62 (1). – Р. 65–85.
202. Schneider, E.R. Orexin, but not ghrelin, injected in the lateral
hypothalamus increases alcohol intake in alcohol–drinking rats. / E.R. Schneider, R.
Darby, S.F. Leibowitz et al. // Alcoholism – Clinical and Experimental Research. —
2007. — №31 (6). – Р. 1-8.
203. Schneider, L. The effects of prenatal alcohol exposure on behavior: rodent
and primate studies / L. Schneider, F. Moore, M. Adkins // Neuropsychol. Rev. – 2011. –
№ 21 (2). – Р. 186–203.
204. Schultz, W. A neural substrate of prediction and reward. / W. Schultz, P.
Dayan, P.R. Montague // Science. — 1997. — №275 (5306). – Р. 1593–1599.
205. Sealfon, C.S. Dopamine receptors: from sructure to behavior. / C.S.
Sealfon, C.W. Olanow // Trends Neurosci. — 2000. — vol. 23. – Р. 34–40.
126
206. Seeman, P. Dopamine receptor pharmacology. / P. Seeman, H.H.M. Van Tol
// Trends Pharmacol. — 1994. — vol. 15. – Р. 264–270.
207. Shirakawa, T. Neuronal expression of catechol O–methyltransferase
mRNA in neonatal rat suprachiasmatic nucleus. / T. Shirakawa, M. Abe, S. Oshima et al.
// Neuroreport. – 2004. — № 15(8). – Р. 1239–1243.
208. Sibley, D.R. New insights into dopaminergic receptor function using
antisense and genetically altered animals. / Sibley D.R. // Arm. Rev. Pharmacol.
Toxicol. — 1999. — vol.39. – Р. 313–341.
209. Simasko, S.M. Effect of neurotensin, substance P and TRH on the
regulation of dopamine receptors in rat brain / S.M. Simasko, G.A. Weiland // Eur. J.
Pharmacol. — 1984. — Vol. 106. № 3. — P. 653–656.
210. Sokoloff, P. Molecular cloning and characterization of a novel dopamine
receptor (D–3) as a target for neuroleptics. / P. Sokoloff, В. Giros, M.P. Martres et al. //
Nature. — 1990. — vol.347. – Р. 146–151.
211. Srivastava, L.K. Ontogeny of dopamine D2 receptor mRNA in rat brain. /
L.K. Srivastava, M.A. Morency, R.K. Mishra // Eur J Pharmacol. – 1992. —№225(2). –
Р. 143–150.
212. Stable, L. Do autoreceptors mediate dopamine agonist—induced yawning
and suppression of exploration? A critical review. / L. Stable // Psychopharmacol. —
1992. — vol.106, №1. – Р. 1–13.
213. Stanwood, G.D. Ontogenu of dopamine D3 receptors in the nucleus
accumbens of the rat. / G.D. Stanwood, S. McElligot, L.H. Lu et al. // Neurosci. Lett. —
1997. — №223. – Р. 13–16.
214. Starke, K. Modulation of neurotransmitter release by presynaptic
autoreceptors. / K. Starke, M. Gothert, H. Kilbinger // Physiol. Rev. — 1989. — vol.69,
№3. – Р. 864–989.
215. Steensland, P. Varenicline, an alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor
partial agonist, selectively decreases ethanol consumption and seeking. / P. Steensland,
J.A. Simms, J. Holgate et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America. — 2007. — №104 (30). – Р. 12518–12523.
127
216. Stein, E.A. Ventral tegmental self–stimulation selectively induces opioid
peptide release in rat CNS / E.A. Stein // Synapse. — 1993. — Vol. 13. №1. — P. 63–
73.
217. Taber, M.T. Feeding–evoked dopamine release in the nucleus accumbens:
regulation by glutamatergic mechanisms. / M.T. Taber, H.C. Fibiger // Neuroscience. —
1997. — №76 (4). – Р. 1105–1112.
218. Tarazi, F.I. Localization of dopamine receptor subtypes in corpus striatum
and nucleus accumbens septi of rat brain: comparison of D1–, D2–, and D4–like
receptors. / F.I. Tarazi, A. Campbell, S.K. Yeghiayan et al. // Neuroscience. — 1998. —
vol.83, №1. – Р. 169–176.
219. Teicher, M.H. Evidence for dopamine receptor pruning between
adolescence and adulthood in striatum but not nucleus accumbens. / M.H. Teicher, S.L.
Andersen, J.C. Hostetter // Dev. Brain Res. — 1995. — №89. – Р. 167–172.
220. Tena–Sempere, M. Novel expression and functional role of ghrelin in rat
testis. / M. Tena–Sempere, M.L. Barreiro, L.C. Gonzalez et al. // Endocrinology. – 2002.
— №143. – Р. 717–725.
221. Tessari, M. Correlation between serum ghrelin levels and cocaine–seeking
behaviour triggered by cocaine–associated conditioned stimuli in rats. / M. Tessari, A.
Catalano, M. Pellitteri et al. // Addiction Biology. — 2007. — №12 (1). – Р. 22–29.
222. Theander–Carrillo, C. Ghrelin action in the brain controls adipocyte
metabolism. / C. Theander–Carrillo, P. Wiedmer, P. Cettour–Rose et al. // Journal of
Clinical Investigation. — 2006. — №116 (7). – Р. 1983–1993.
223. Torsello, A. Ontogeny and tissuespecific regulation of ghrelin mRNA
expression suggest that ghrelin is primarily involved in the control of extraendocrine
functions in the rat. / A. Torsello, B. Scibona, G. Leo et al. // Neuroendocrinology. –
2003. — №77. – Р. 91–99.
224. Toshinai, K. Des–acyl ghrelin induces food intake by a mechanism
independent of the growth hormone secretagogue receptor. / K. Toshinai //
Endocrinology. – 2006. — №147. – Р. 2306–2314.
128
225. Toshinai, K. Ghrelin–induced food intake is mediated via the orexin
pathway. / K. Toshinai, Y. Date, N. Murakami et al. // Endocrinology. — 2003. — №144
(4). – Р. 1506–1512.
226. Truffinet, P. Papillon–Downey С Placebo–controlled study of the D4/5–
HT2A antagonist fananserin in the treatment of schizophrenia. / P. Truffinet, C.A.
Tamminga, L.F. Fabre et al. // Am. J. Psychiatry. — 1999. — vol.156, №3. – Р. 419–
425.
227. Tschop, M. Ghrelin induces adiposity in rodents. / M. Tschop, D.L. Smiley,
M.L. Heiman // Nature. — 2000. — №407 (6806). – Р. 908–913.
228. Tschop, M. Post–prandial decrease of circulating human ghrelin levels. /
M. Tschop, R. Wawarta, R.L. Riepl et al. // Journal of Endocrinological Investigation.
— 2001. — №24 (6). – Р. 19–21.
229. Uban, A. K. Basal regulation of HPA and dopamine systems is altered
differentially in males and females by prenatal alcohol exposure and chronic variable
stress / A. K. Uban, L. W. Comeau, A. L. Ellis et al. // Psychoneuroendocrinol. – 2013. –
Vol. 38. Issue 10 – P. 1953–1966.
230. Ungerstedt, U. Striatal dopamine release after amphetamine or nerve
degeneration revealed by rotational behaviour. / U. Ungerstedt // Acta Physiol Scand
Suppl. — 1971. — vol. 367. – Р. 49–68.
231. Van Tol, H.H. Cloning of the gene for a human dopamine D4 receptor with
high affinity for the antipsychotic clozapine. / H.H. Van Tol, J.R. Bunzow, H.C. Guan et
al. // Nature. — 1991. — vol.350. – Р. 610–614.
232. Van Wolfswinkel, L. Site of rewarding action of morphine in the
mesolimbic system determined by intracranial electrical self–stimulation / L. Van
Wolfswinkel, J.M. Van Ree // Brain Res. — 1985. — Vol. 358. — P. 349–353.
233. Volkow, N.D. Brain dopamine is associated with eating behaviors in
humans. / N.D. Volkow, G.J. Wang, L. Maynard et al. // International Journal of Eating
Disorders. — 2003b. — №33 (2). – Р. 136–142.
129
234. Volkow, N.D. The addicted human brain: insights from imaging studies. /
N.D. Volkow, J.S. Fowler, G.J. Wang // Journal of Clinical Investigation. — 2003a. —
№111 (10). – Р. 1444–1451.
235. Wachtel, S.R. Parametric and pharmacological analyses of the enhanced
grooming response elicited by the Dl dopamine receptor agonist SKF38393 in the rat. /
S.R. Wachtel, R.J. Brooderson, F.J. White // Psychopharmacology. — 1992. — vol.109.
– Р. 41–48.
236. Waddington, J.L. The psychopharmacology–molecular biology interface:
exploring the behavioural roles of dopamine receptor subtypes using targeted gene
deletion ('knockout'). / J.L. Waddington, J.J. Clifford, F.N. McNamara et al. // Prog
Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry — 2001. — vol.25, №4 – Р. 925–964.
237. Walters, J.R. Dl dopamine receptor activation required for postsynaptic
expression of D2 agonist effects. / J.R. Walters, D.A. Bergstrom, J.H. Carlson et al. //
Science — 1987. — vol.236. – Р. 719–722.
238. Wang, C.I. Emerging opportunities for allosteric modulation of G-protein
coupled receptors. / C.I. Wang, R.J. Lewis // Biochem. Pharmacol. – 2013. – № 85(2). –
P. 153-162.
239. Wanibuchi, F. Synergistic effects between D–1 and D–2 dopamine
antagonists on catalepsy in rats. / F. Wanibuchi, S. Usuda // Psychopharmacol. — 1990.
— vol.102, №3. – Р. 339–342.
240. Weiner, D.M. Dopamine Dl and D2 receptor mRNA expression in rat brain.
/ D.M. Weiner, A.I. Leveya, R.K. Sunahara et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1991. —
vol.88. – Р. 1859–1863.
241. Wellman, P.J. Augmentation of cocaine hyperactivity in rats by systemic
ghrelin. / P.J. Wellman, K.W. Davis, J.R. Nation // Regulatory Peptides. — 2005. —
№125 (1–3). – Р. 151–154.
242. Westerink, B.H. Do nerve terminals and cell bodies of nigrostriatal
dopaminergic neurons of the rat contain similar receptors? / B.H. Westerink, P. de Boer,
M. Santiago et al. // Neurosci. Lett. — 1994. — vol.167, №1–2. – Р. 109–112.
130
243. Wierup, N. The ghrelin cell: a novel developmentally regulated islet cell in
the human pancreas. / N. Wierup, H. Svensson, H. Mulder et al. // Regulatory Peptides.
– 2002. — № 107. – Р. 63–69.
244. Wong, J.Y.F. Neurochemical changes in dopamine D1, D3 and D1/D3
receptor knockout mice. / J.Y.F. Wonga, J.J. Clifford, J.S. Massalas et al. // European
Journal of Pharmacology. – 2003. — Vol. 472, № 1–2. – P. 39–47.
245. Wren, A.M. Ghrelin causes hyperphagia and obesity in rats. / A.M. Wren,
C.J. Small, C.R. Abbott et al. // Diabetes. — 2001b. — №50 (11). – Р. 2540–2547.
246. Wren, A.M. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in
humans. / A.M. Wren, L.J. Seal, M.A. Cohen et al. // Journal of Clinical Endocrinology
and Metabolism — 2001a. — №86 (12). – Р. 5992–5995.
247. Wren, A.M. The novel hypothalamic peptide ghrelin stimulates food intake
and growth hormone secretion. / A.M. Wren, C.J. Small, H.L. Ward et al. //
Endocrinology. — 2000. — №141 (11). – Р. 4325–4328.
248. Wurst, F.M. Gender differences for ghrelin levels in alcohol–dependent
patients and differences between alcoholics and healthy controls. / F.M. Wurst, I. Graf,
H.D. Ehrenthal et al. // Alcoholism – Clinical and Experimental Research. — 2007. —
№31 (12). – Р. 2006–2011.
249. Xu,
M.
Elimination
of
cocaine–induced
hyperactivity
and
dopaminemediated neurophysiological effects in dopamine Dl receptor mutant mice. /
M. Xu, X–T. Hu, D.C. Cooper et al. // Cell. — 1994. — vol.79. – Р. 945–955.
250. Zetterstrom, T. In vivo measurement of spontaneous release and
metabolism of dopamine from intrastriatal nigral grafts using intracerebral dialysis. / T.
Zetterstrom, P. Brundin, F.H. Gage et al. // Brain Res. — 1986. — vol.362, №2. – Р.
344–349.
251. Zhang, S–P Oligodeoxinucleotide antisense to the D1 dopamine receptor
mRNA inhibits Dl receptor–mediated behaviors in normal mice and in mice lesioned
with 6–hydroxydopamine. / S–P Zhang, L–W Zhou, B. J. Weiss // Pharmacol. Exp.
Therap. — 1994. — vol.271. – Р. 1462–1470.
131
252. Zhou, R. Prenatal ethanol exposure alters synaptic plasticity in the
dorsolateral striatum of rat offspring via changing the reactivity of dopamine receptor. /
R. Zhou, S. Wang, X. Zhu // PLoS One. – 2012. – № 7(8). – P. e42443.
253. Zigman, J.M. Expression of ghrelin receptor mRNA in the rat and the
mouse brain. / J.M. Zigman, J.E. Jones, C.E. Lee et al. // Journal of Comparative
Neurology — 2006. — №494 (3). – Р. 528–548.
254. Zimmermann, U.S. Alcohol administration acutely inhibits ghrelin
secretion in an experiment involving psychosocial stress. / U.S. Zimmermann, A.
Buchmann, B. Steffin et al. // Addiction Biology. — 2007. — №12 (1). – Р. 17–21.