На правах рукописи ЗУБКОВ Евгений Андреевич ЭФФЕКТ

На правах рукописи
ЗУБКОВ
Евгений Андреевич
ЭФФЕКТ ХРОНИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ ТИРОКСИНА НА
ПОВЕДЕНИЕ, 5-НТ1А и 5-НТ2А РЕЦЕПТОРЫ МОЗГА У МЫШЕЙ,
РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ГЕНЕТИЧЕСКИ ДЕТЕРМИНИРОВАННОЙ
ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К КАТАЛЕПСИИ
03.00.13 ФИЗИОЛОГИЯ
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Новосибирск 2009
00348Э244
Работа выполнена в Лаборатории нейрогеномики поведения Института
цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
Куликов Александр Викторович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
Шишкина Галина Трифоновна
Институт цитологии и генетики СО РАН
г. Новосибирск
доктор биологических наук,
Дубровина Нина Ивановна
Институт физиологии СО РАМН
г. Новосибирск
Ведущее учреждение - Институт систематики и экологии животных СО
РАН
Защита состоится
2009 г. на заседании
диссертационного совета Д 001.014.01
01 при Институте физиологии СО
РАМН
(630017, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии
СО РАМН
Автореферат разослан / р J,-£Qc$ vp>S&
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Y
fl (
2009 г.
БузуеваИ.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Тиреоидные гормоны (ТГ) играют ключевую роль в онтогенезе
центральной нервной системы и поведении. Имеются многочисленные
клинические наблюдения о связи нарушений тиреоидной функции с
психическими расстройствами. Однако данные об участии ТГ в регуляции
поведения и психики противоречивы и мало изучены. Одни авторы
связывают риск депрессии с гипертиреоидизмом (Joffe, Levitt, 1993;
Musselman, Nemeroff, 1996), в то же время другие - с гипотиреоидизмом
(Baumgathner et al., 1994; Bauer et al., 2002). В ряде случаев ТГ
используются для лечения некоторых форм депрессивных расстройств и
для усиления действия трициклических антидепрессантов (Joffe, Levitt,
1993; Musselman, Nemeroff, 1996; Kelly, Lieberman, 2009). Более того,
тироксин (Т4) широко используется для лечения различных форм
нарушения тиреоидной функции. Однако эффекты хронического
употребления ТГ на нервную систему и психику не изучены. Более того,
не выяснены механизмы индивидуальной чувствительности к ТГ (Bauer et
al., 2003).
Согласно наиболее распространенной гипотезе, ТГ осуществляют
регуляцию поведения через изменение функции серотониновой системы
мозга (Kirkegaard, Faber, 1998; Bauer et al., 2002). Действительно, было
установлено участие ТГ в регуляции 5-НТ2А рецепторов в головном мозге:
тиреоидэктомия уменьшает плотность (Kulikov et al., 1999) и уровень
мРНК (Куликов и др., 2002) 5-НТ2А рецепторов в коре мозга крыс Wistar, a
высокие дозы Т4 увеличивают плотность (Mason et al., 1987) и
функциональную активность 5-НТ2А рецепторов у крыс (Tikhonova et al.,
2005).
Показана ассоциация между реакцией замирания (каталепсией), 5-НТ,А,
5-НТ2д рецепторами и ТГ (Kulikov, Popova, 2007). У крыс каталепсия
сопровождается снижением Т4 в крови (Barykina et al., 2002; Tikhonova et
al., 2005), в то время как хроническое введение Т4 оказывает
антикаталептическое действие (Kulikov et al., 2002). С другой стороны,
каталепсия связана с серотониновой системой мозга (Ророѵа, 1999): крысы
каталептической линии ГК имеют сниженную плотность 5-НТ2А
рецепторов в стриатуме по сравнению с животными устойчивой к
каталепсии линии Wistar (Kulikov et al, 1995). Агонист 5-НТ|А рецепторов
8-OH-DPAT ингибирует каталепсию (Kulikov et al., 1994; Попова и др.,
1994; Prinssen et al., 2002).
Другой разновидностью наследственной каталепсии является
«щипковая каталепсия» (pinch-induced catalepsy) мышей (Ornstein, Amir,
1981). В настоящее время изучен генетический контроль наследственной
каталепсии мышей и показана локализация главного гена каталепсии в
п
терминальном фрагменте хромосомы. 13 (Куликов и др., 2003; Kondaurova
et al., 2006; Kulikov et al., 2008). Выявлена связь наследственной
каталепсии с 5-НТіА и 5-HT2A рецепторами (Попова и др., 1994; Kulikov et
al., 1995) и ее сцепление с геном 5-НТ1А рецептора (Kondaurova et al.,
2006). Наследственная каталепсия мышей СВА была значительно усилена
длительной селекцией и получена линия мышей ASC (Antidepressant
Sensitive Catalepsy), в которой доля каталептиков достигала 85%. Мыши
этой линии характеризуются депрессивно-подобными чертами поведения
(Базовкина и др., 2005). Ассоциация между поведением, ТГ и
серотониновыми рецепторами у мышей исследована не была.
Целью данной работы было сравнение хронического воздействия Т4 на
поведение и серотониновые рецепторы головного мозга половозрелых
мышей,
различающихся
по
генетически
детерминированной
предрасположенности к каталепсии.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Сравнение эффектов хронического введения Т4 на каталепсию,
поведение в тестах открытого поля, свет/темнота, принудительного
плавания, а также на активность и экспрессию 5-НТ,А и 5-НТ2А
рецепторов в структурах головного мозга у мышей каталептической
линии ASC и устойчивой к каталепсии мышей линии AKR.
2. Изучение влияния терминального фрагмента 13й хромосомы линии
мышей СВА, перенесенного в геном мышей AKR, на эффекты
хронического введения Т4 в тестах открытого поля, свет/темнота,
принудительного плавания, социального интереса, а также на
экспрессию 5-НТ1А и 5-HT2A рецепторов в структурах головного мозга
у мышей каталептической линии AKR.CBA-D13Mit76 и устойчивой к
каталепсии мышей линии AKR.
Научная новизна работы
В настоящей работе впервые:
• показан каталептогенный эффект Т4 у мышей линии AKR;
• установлено, что Т4 оказывает антидепрессантный эффект на мышей
линии ASC, и это не связано с его влиянием на общую двигательную
активность;
• показано, что хроническое введение Т4 увеличивает у мышей AKR
активность и экспрессию мРНК 5-НТ2А рецепторов во фронтальной
коре головного мозга;
• показано, что эффекты хронического введения Т4 на выраженность
каталепсии, двигательную активность в тесте «открытое поле»,
неподвижность в тесте принудительного плавания, агрессию в тесте
социального интереса и функцию 5-НТ1А и 5-НТ2А рецепторов мозга
зависят от генетически детерминированной предрасположенности к
каталепсии у мышей;
4
• установлено, что перенос терминального фрагмента хромосомы 13 от
мышей линии СВА в геном мышей AKR подавляет вызванное Т4
увеличение двигательной активности и уровня мРНК 5-НТ2А
рецепторов у мышей конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76.
Теоретическая и научно-практическая ценность работы
Результаты настоящего исследования позволяют глубже понять
физиологические и молекулярные механизмы воздействия ТГ на
поведение, а также подтверждают предположение о связи между
серотониновой системой мозга, нарушениями поведения и ТГ.
Мыши, различающиеся
по генетически
детерминированной
предрасположенности к каталепсии, могут быть предложены в качестве
моделей для изучения механизмов чувствительности к изменениям
тиреоидного статуса: мыши линии AKR - для изучения нарушений
поведения, вызванных ТГ; мыши линии ASC могут быть предложены как
модель антидепрессантного действия ТГ; линия мышей AKR.CBAD13Mit76 - моделью изучения взаимодействия цитокиновой и тиреоиднои
систем.
Результаты работы используются при чтении курса лекций
«Молекулярные механизмы регуляции поведения» для студентов 4го курса
факультета естественных наук Новосибирского государственного
университета.
Положения, выносимые на защиту
1. Генетическая
предрасположенность
к
каталепсии
является
биологическим предиктором эффектов хронического действия Т4.
2. Изменения в поведении, 5-НТ|А и 5-НТ2А рецепторах мозга,
наблюдаемые у животных AKR и ASC в первой экспериментальной
серии, скорее всего являются следствием отсроченного действия Т4.
3. Хроническое действие Т4 вызывает у мышей линии AKR
каталептогенный эффект, повышение горизонтальной двигательной
активности, усиление агрессии на ювенильного самца, активацию и
повышение экспрессии гена 5-НТ2А рецептора во фронтальной коре
головного мозга.
4. Хроническое действие Т4 вызывает у мышей линии ASC:
антикаталептический и антидепрессантный эффект, а также
десенситизацию 5-НТІА рецепторов мозга.
5. Концевой фрагмент 13й хромосомы от мышей линии СВА,
перенесенный в геном мышей AKR, блокирует эффекты хронического
введения Т4, наблюдаемые у мышей линии AKR.
5
Апробация результатов
Полученные результаты были представлены и обсуждены на XLIII и
XLIV международных научных студенческих конференциях "Студент и
научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2005, 2006) и на III Съезде
фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них три статьи в
рецензируемых отечественных (2) и международных (1) журналах и трое
тезисов на конференциях.
Структура и объем работы
Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и
методы, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы
(191 наименований) и приложение. Работа изложена на 101 страницах,
содержит 7 рисунков и 13 таблиц (из них 4 в приложении).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные. Эксперименты проводились на половозрелых самцах
мышей линии AKR/J, ASC/Icg и AKR.CBA-Dl3Mit76. Линия AKR/J
поддерживается в Институте Цитологии и Генетики (Новосибирск,
Россия) в течение 40 лет братско - сестринским инбридингом и не
проявляет каталепсии. Линия ASC/lcg (Antidepressant Sensitive Catalepsy)
была получена в лаборатории нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН,
селекцией бэккроссов между каталептической линией CBA/LacJ и AKR/J
на высокую предрасположенность к каталепсии (Kulikov et al., 2008).
Первые четыре поколения селекцию проводили без инбридинга, и еще
четыре поколения с инбридингом, затем селекцию прекратили, но
инбридинг продолжали (Базовкина и др., 2005; Kondaurova et al., 2006).
Животные
этой
линии
характеризовались
выраженными
депрессивноподобными чертами (Базовкина и др., 2005). Линия
AKR.CBA-D13Mit76 была получена в лаборатории нейрогеномики
поведения ИЦиГ СО РАН путём переноса фрагмента 13й хромосомы,
помеченного маркёром D13Mit76, с CBA/LacJ в геном AKR/J. Полученные
гибриды первого поколения от скрещивания AKR/J и CBA/LacJ затем
бэккроссировались 9 раз на линию AKR7J. Перенос фрагмента
контролировался с использованием маркера D13Mit76 (Kulikov et al.,
2008).
Мыши отнимались от матерей в возрасте 1 мес и содержались по 6-8
особей в клетках 40 х 25 х 15 см. К началу эксперимента животные были в
возрасте 2-3 мес и весили 22 ± 3 г. Мышей делили на равные по весу
группы: контроль и опыт, и помещали по 4-5 особей в клетки размером 40
х 25 х 15 см (при постоянной температуре 22°С и естественном
освещении). Содержание мышей и все экспериментальные процедуры
были выполнены в соответствии с международными правилами
6
обращения с животными (Директива 86/309 Европейского сообщества от
24 декабря 1986 г.).
Экспериментальные серии: Были проведены две последовательные
экспериментальные серии по изучению хронического влияния Т4.
Цель первой экспериментальной серии - выяснение отсроченного
действия Т4 на выраженность поведения, активность и экспрессию 5-НТ)А
и 5-НТ2А рецепторов у мышей родственных линий, различающихся по
генетической предрасположенности к каталепсии и выраженности
депрессивноподобного поведения. Для этой серии были взяты 40 мышей
линии AKR и 36 ASC. Половина животных обеих линий в течение 60 дней
получали воду, содержащую Т4 (Берлин-Хеми, Германия) в концентрации
2 мг/л (экспериментальная группа). Воду меняли через два дня. Другая
половина служила контролем и получала обычную воду. На 61" день с
начала эксперимента животным экспериментальной группы перестали
добавлять Т4 в питьевую воду, чтобы у них нормализовался уровень
гормона в крови. На 63" день животных контрольной и экспериментальной
групп изолировали в индивидуальных клетки для снятия группового
эффекта, и содержали так до окончания экспериментального периода.
Измерения поведения начинались на следующий день после изоляции.
Поведенческие тесты проводились в следующем порядке: (1) тест на
каталепсию, (2) тест открытого поля, (3) тест «свет/темнота», (4) тест
принудительного плавания. С интервалами в один - два дня между
тестами. Затем половину животных забивали для определения уровня Т4 в
крови и экспрессии генов 5-НТіА и 5-НТ2А рецепторов, а другую половину
использовали для определения активности 5-НТІА и 5-НТ2А рецепторов
(между фармакологическим экспериментами был перерыв в один день).
Для проверки тиреоидного статуса животных в течение эксперимента 7
самцов AKR и 7 самцов ASC того же возраста и веса получали Т4 в
течение 14 дней, а другие 7 самцов AKR и 7 самцов ASC - воду в течение
этого периода. Этих 28 животных забивали на 15" день для определения
уровня Т4 в плазме крови.
Цель второй экспериментальной серии - выяснить влияние фрагмента
хромосомы 13 от линии СВА, определяющего предрасположенность к
каталепсии, на чувствительность к гипертиреоидному статусу. Для этой
серии были взяты 25 мышей линии AKR и 21 AKR.CBA-D13Mit76. 11
мышей линии AKR и 8 AKR.CBA-D13Mit76 получали воду, содержащую
Т4 в концентрации 2 мг/л, в течение 60 дней и продолжали получать
гормон на протяжении всех поведенческих тестов вплоть до забоя. Воду
меняли через два дня. Оставшиеся мыши (14 AKR и 13 AKR.CBAD13Mit76) получали обычную воду. За два дня до поведенческих тестов
животных изолировали в индивидуальные клетки для снятия группового
эффекта, и содержались так до окончания экспериментального периода.
7
Поведенческие тесты проводились с интервалом в один - два дня.
Поведенческие тесты проводились в следующем порядке: (1) тест
открытого поля, (2) тест «свет/темнота», (3) тест принудительного
плавания, (4) тестирование социального интереса. Затем мышей забивали
для определения уровня тироксина в крови и измерения экспрессии генов
5-НТід рецептора, 5-НТ2А рецептора.
Тестирование каталепсии. Каталепсию вызывали, зажимая в течение
5 с кожу загривка, затем животное помещали на две параллельные,
разновысокие перекладины, расположенные под углом 45 градусов. Тест
считался положительным, если период, в течение которого мышь
сохраняла приданное ей неестественное положение, был не менее 20
секунд. Время теста ограничивали 120 с, после чего животное возвращали
в домашнюю клетку. Каждый из последовательных 10 тестов проводили с
интервалом в 1-2 минуты. Животное, дающее 3 положительных теста из
10, рассматривалось, как каталептик (Куликов и др., 1989; Kulikov et al.,
1993).
Тест «открытое поле». Тест проводился на ярко освещенной белой
арене размером 80x80x20 см.(1 серия) и 40x40x20 см (2 серия). Мышь
помещали у стенки арены и ее перемещение регистрировали с помощью
цифровой видеокамеры. Автоматическую трассировку животного
проводили
с
помощью
оригинальной
программы
EthoStudio
(http://www.ethostudio.com). Двигательную активность оценивали по длине
пути, пройденному мышью (см). Также определяли время нахождения
мыши в центре (диаметром 40 и 20 см в 1 и 2 сериях, соответственно)
(Куликов и др., 2005; Kulikov et al., 2008). Тестирование длилось 5 мин.
Число вертикальных стоек определяли визуально.
Тест «свет/темнота». Тест проводили в аппарате, состоящем из двух
отсеков: открытого и хорошо освещенного и закрытого (темного). Отсеки
соединялись между собой с помощью квадратного отверстия (7x7 см).
Мышь помещали в центр открытого отсека мордой к закрытому, и в
течение 5 мин регистрировали число переходов между отсеками и время,
проведенное в темном отсеке.
Тест принудительного плавания. Мышь помещали в пластиковую
коробку (18x18x23 см.), заполненную на 3Л водой при температуре 25°С.
После 40 с адаптации в течение 3 мин регистрировали время
неподвижности (с), в течение которого мышь сохраняла состояние
относительной неподвижности (Базовкина и др., 2005).
Тестирование социального интереса. В домашнюю клетку
экспериментального самца подсаживали беспородного ювенильного самца
(возраст 4 недели). Социальные и агрессивные элементы поведения были
оценены с точки зрения их количества и продолжительности в течение 10
мин. Социальное взаимодействие включает обнюхивание, груминг и
8
следование. Агрессию оценивали по проценту животных, проявляющих
агрессивное поведение (Vishnivetskaya et al., 2007).
Измерение функциональной активности 5-НТ2А рецепторов.
Функциональную активность 5-НТ2А рецепторов определяли по числу
стереотипных встряхиваний головой (head twitches) после введения
агониста 5-НТ2А рецепторов DOI (1 мг/кг, в/б). Тест проводили в
домашней клетке животного, число встряхиваний подсчитывалось
визуально в течение 20 мин.
Измерение функциональной активности 5-НТ)А рецепторов.
Функциональную активность 5-НТ|А рецепторов определяли по
выраженности гипотермической реакции на введение селективного для
рецепторов этого подтипа агониста - 8-OH-DPAT (1 мг/кг, в/б).
Гипотермнческую реакцию оценивали по разности ректальной
температуры до введения и через 20 мин после введения препарата.
Определение общего тироксина в крови. Концентрацию общего
тироксина в плазме крови определяли методом иммуноферментного
анализа набором реагентов "Тироид ИФА-тироксин" ("Алкор-Био", СанктПетербург, Россия) и выражали в нМ (Barykina et al., 2002).
Экспрессию генов определяли при помощи количественного метода
ОТ-ПЦР с использованием известных количеств геномной ДНК в качестве
внешнего экзогенного стандарта и мРНК бета-актина (1 серия) или РНКполимеразы 2 (2 серия) в качестве внутреннего эндогенного стандарта
(Kulikov et al., 2005; Науменко, Куликов, 2006).
Статистическая обработка данных. Влияние Т4 на каталепсию и на
процент агрессивных животных в тесте социального интереса оценивали с
помощью %2 статистики для четырехпольной таблицы. Данные по
результатам всех остальных экспериментов выражали как М ± т и
сравнивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа
(ANOVA) с последующим множественным сравнением по Фишеру.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изучение отсроченного действия хронического введения Т4 на
поведение, 5-НТІА и 5-НТ2А рецепторы в головном мозге у мышей
линий AKR и ASC.
Было показано достоверное увеличение концентрации Т4 в крови у
мышей, получавших Т4 в течение 14 дней (с 45.0 ± 5.6 до 305.8 ± 29.7 нМ у
AKR и с 46.1 ± 5.6 до 255.2 ± 11.4 нМ у ASC, F)>23=190, рО.001).
Следовательно, данная концентрация Т4 в воде достаточна для
поддержания высокого уровня гормона в плазме мышей обеих линий в
течение периода воздействия. Через 13 после прекращения введения Т4
уровень гормона в крови снизился у мышей обеих линий (до 45.6 ± 4.8 нМ
уАКЯидо21.8± 1.5нМуАБС).
9
В тесте на щипковую каталепсию у 20 контрольных мышей линии AKR
не было обнаружено ни одного каталептика (0%), однако 7 из 20 мышей
этой линии, получавших Т4 в течение 60 дней, проявляли каталепсию
(35%) (%2 = 8.5, р<0.01). В контрольной группе мышей ASC 13 из 18
животных были каталептиками (72%), в экспериментальной группе мышей
процент каталептиков снизился до 37% (7 из 18) (%2 = 4.7, р<0.05, Рис.1).
80
5? 70
S"
S
с
0)
С
н
я
*:
60
50
40
30
20-1
**
10 -
AKR
ASC
Рис.І. Процент животных, проявляющих щипковую каталепсию у
контрольных (белые столбики) и получавших Т4 (штрихованные
столбики) мышей линий AKR и ASC.
*р<0,05; **р<0,01 по сравнению с соответствующим контролем.
Хроническое введение Т4 вызвало значительное увеличение
пройденного пути у мышей линии AKR (1520 ± 147 см у контрольных и
2170 ± 184 см у получавших Т4, р<0.01), но не у животных линии ASC
(р>0.05). Гормон увеличил время нахождения в центре у мышей обеих
линий (F| 72=9.65, р<0.01). Но это увеличение скорее всего является
следствием увеличения подвижности, поскольку различие исчезло после
коррекции времени в центре на величину пройденного пути (Fi,7i=2.56,
р>0.05).
Хроническое введение Т4 не повлияло на параметры тревожности в
тесте свет/темнота (F, 72=3.62, р>0.05 для переходов между отсеками и
Fi,72=3.58, p>0.05 для времени в темном отсеке).
Выявлен значительный эффект генотипа (F, т =80.69, рО.001), Т4
(F],m=13.39, р<0.001) и взаимодействия генотип х Т4 (F, П2=35.64,
рО.001) на неподвижность в тесте принудительного плавания (Рис.2).
Хроническое введение Т4 не оказало воздействия на неподвижность у
мышей линии AKR (р>0.05), но значительно снизило её у мышей ASC
(рО.001).
10
& 140 i
н
о 120 о
I
щ
S
100 -
80
ш 60
Ч
о
с 40 ф
I
о;
5
О)
О.
CQ
^
20 -
AKR
ASC
Рис,2. Время неподвижности (с) в тесте принудительного плавания у
контрольных (белые столбики) и получавших Т4 (штрихованные
столбики) мышей линий AKR и ASC.
***р<0.001 против соответствующего контроля; ~р<0.01 против
контрольных мышей линии AKR.
Влияние Т4 на число вызванных DOI встряхиваний головы и на
концентрацию мРНК 5-НТ2А рецептора во фронтальной коре мышей AKR
и ASC показано на рисунке 3. Обнаружено влияние генотипа (F|37=4.5,
р<0.05), Т4 (F, 37=11.7, р<0.01), но не взаимодействия генотип х Т4
(F, 37=0.15, р>0.05) на число вызванных DOI встряхиваний головой.
Хроническое введение Т4 значительно увеличило число встряхиваний
головой (60.0 ± 7.6 у получавших Т4 по сравнению с 40.0 ± 2.2 у контроля,
р<0.01) у мышей AKR, но гормон не влиял на число встряхиваний головой
(69 ± 5.5 у получавших Т4 и 53 ± 3.8, р>0.05 у контроля) у животных
линии ASC.
Сходная закономерность обнаружена при изучении эффекта Т4 на
уровень мРНК 5-НТ2А рецептора в коре мозга. Выявлено влияние генотипа
(Fi,24=4.2, р=0.05), Т4 (F|24=18.4, рО.001) и взаимодействие генотип х Т4
(Fі.24= 14.2, р<0.001) на уровень мРНК рецепторов. Хроническое введение
Т4 значительно увеличило экспрессию мРНК 5-НТ2А рецептора во
фронтальной коре (58.7 + 4.0 у получавших Т4 по сравнению с 31.9 + 3.6 у
контроля, р<0.001) у мышей AKR, но гормон не влиял этот показатель
(37.6 ± 2.3 у получавших Т4 и 39.3 ± 2.3 у контроля, р>0.05) у животных
линии ASC.
11
AKR
(3-актин
—•——.-
ASC
?^-m&<:m»wm
5-HT 2 A
~
Контроль
Т4
Контроль
Т4
Рис.3. Функциональная активность и уровень мРНК 5-НТ2А рецепторов
во фронтальной коре мозга мышей AKR и ASC, получавших воду (белые
столбики) и Т4 (штрихованные столбики).
А - число вызванных введением DO/ (I мг/кг, в/бр), встряхиваний
головой; Б - уровень мРНК S-HT^A рецепторов, рассчитанный на 100
копий мРНК {3-актина.
*р<0.05; ***р<0.001 по сравнению с соответствующим контролем.
Установлено достоверное влияние генотипа (Fi 38=38.7, рО.001) и
взаимодействия генотип х Т4 (Fpg-5.7, р<0.05) на величину
гипотермического эффекта. Агонист 5-НТ,А рецепторов 8-OH-DPAT
вызывал гипотермию у контрольных мышей ASC (-3.5 ± 0.4°С), но не у
12
AKR (-0.4 ± 0.4°C). Хроническое введение Т4 не изменило реакцию на 8OH-DPAT у мышей AKR (до -0.5 ± 0.2, р>0.05), но значительно ослабило
гипотермический эффект у ASC (до -2.0 ± 0.3°С, р<0.01).
Во фронтальной коре мозга показан эффект Т4 уровень мРНК 5-НТ(А
рецепторов (F]?22=6, p<0.05). В среднем мозге и гиппокампе не выявлено
эффекта Т4 (F,j2g=0.04, p>0.05 для среднего мозга; Fli25=0.4, p>0.05 для
гиппокампа) и взаимодействия генотип х Т4 для всех трех исследованных
структур (Fi,28=0.0017, p>0.05 для среднего мозга; Fi25=2.4, p>0.05 для
гиппокампа; FI22=0.05, р>0.05 для передней коры мозга) на уровень мРНК
5-НТ|А рецепторов, но показан эффект генотипа: Fi>28=15.6, p<0.001 для
среднего мозга; Fl23=17, р<0.001 для гиппокампа; Fli22=15.6, p<0.001 для
передней коры мозга.
Изучение влияния терминального фрагмента хромосомы 13 на
чувствительность к гипертиреоидизму у мышей линий AKR и
AKR.CBA-D13Mit76.
Хроническое введение Т4 значительно повышало уровень гормона в
крови мышей AKR (с 71.8 ±3.4 до 495.7 ±81.3 нМ) и AKR.CBA-D13Mit76
(с 61.5 ± 3.8 до 588.4 ± 36.4 нМ) (F,,36 = П8.6, р<0.001). Следовательно, в
момент измерения поведения и экспрессии генов рецепторов животные
обеих линий были гипертиреоидные.
Хроническое введение Т4 вызвало значительное увеличение
пройденного пути у мышей линии AKR (756 ± 51,6 см у контрольных и
1160 ± 61,8 см у получавших Т4, рО.001), но не у животных линии
AKR.CBA-D13Mit76 (р>0.05).
Хроническое введение Т4 не повлияло на время нахождения в темном
отсеке (F,42=0.2, р>0.05).
В тесте принудительного плавания не было выявлено влияния генотипа
(Fj 42=0.08, р>0.05), Т4 (F142=l-3, р>0.05) и взаимодействия генотип х Т4
(Fi,42=2.3, p>0.05) на время неподвижности.
Не показано достоверного влияния генотипа на общее число (F| 42 = 3.8,
р>0.05) и суммарное время (Fi 42 = l-7, р>0.05) социальных контактов. Т4
снижал число (33.7 ± 3.2 против 21.5 ± 3 у экспериментальной группы,
р<0.05), но не продолжительность социальных контактов у мышей
AKR.CBA-D13Mit76, но не у животных линии AKR. Хроническое
введение Т4 достоверно увеличило процент агрессивных животных у
мышей линии AKR (2 из 14 у контроля против 8 из 11 у
экспериментальной группы; %2 ~ 8.7, р<0.01), но не изменил эту форму
поведения у AKR.CBA-D13Mit76 (13 из 14 у контроля против 7 из 8 у
экспериментальной группы; %2 = 0.18, р>0.05; Рис.4).
13
100
90
80 70 60
50 H
40
30
20 10 О
**
AKR
AKR.CBA-D13Mit76
Рис.4. Процент агрессивных животных у мышей AKR и AKR.CBAD13Mit76, получавших воду (белые столбики) и Т4 (штрихованные
столбики).
**р<0,01 по сравнению с соответствующим контролем.
14
Показано влияние взаимодействия факторов генотип х Т4 на уровень
мРНК 5-НТ2А рецепторов (Fi26=92, рО.ОІ). Хроническое действие Т4
увеличило уровень мРНК 5-НТ2А рецепторов у мышей линии AKR (56.8 +
10.6 у контрольных против 136 ± 27.4 у экспериментальной группы,
р<0.05), но не оказало влияния на этот параметр у линии AKR.CBAD13Mit76 (111.2 ± 16.4 у контрольных против 84.4 ± 13.3 у
экспериментальной группы, р>0.05; Рис.5).
180 і
: 160
X
140
5 120
л 100
х
80
Q.
ш 60 •
о
а 40 >
20 0
AKR
AKR.CBA-D13Mit76
Рис.5. Уровень мРНК 5-НТ2д рецепторов, рассчитанный на 100 копий
мРНК РНК-полимеразы-2, во фронтачьной коре мозга мышей AKR и
AKR.CBA-D13Mit76, получавших воду (белые столбики) и Т4
(штрихованные столбики).
* р<0.05 по сравнению с соответствующим контролем.
В среднем мозге выявлено влияние генотипа (F, 28=16.8, рО.001) и Т4
(Fi,28=5.5, р<0.05), но не взаимодействия генотип х Т4 (Fi28=0.3, p>0.05) на
уровень мРНК 5-НТ1А рецепторов. В гиппокампе показано влияние
генотипа (Fi_28=5.8, р<0.05), но не выявлено эффектов Т4 (Fj 28=0.7, р>0.05)
и взаимодействия генотип х Т4 (F12s=3.1, p>0.05) на исследуемый
параметр. Во фронтальной коре мозга не обнаружено воздействия
генотипа (F1>26=1.4, р>0.05), Т4 (F|>26=2.6, p>0.05) и взаимодействия
генотип х Т4 (Fl26=1.6, p>0.05) на уровень мРНК 5-НТ|А рецепторов.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В экспериментах были использованы две разные модели хронического
введения Т4: первая модель создана для исследования отсроченных
эффектов гормона (сохраняющихся после прекращения введения и
возвращении уровня Т4 в крови к норме), вторая модель направлена на
15
изучение эффектов хронического гипертиреоидизма. Животные линии
AKR были изучены в обеих экспериментальных сериях. Сравнение
изменений в поведении и в серотониновой системе мозга у мышей этой
линии в двух сериях экспериментов позволяет выделить отсроченные
эффекты и учесть возможное влияние резкого прекращения введения
экзогенного гормона.
Двигательная активность мышей AKR в тесте открытого поля в первой
экспериментальной серии оказалась примерно в два раза больше, чем во
второй. Наиболее вероятной причиной такой разницы в двигательной
активности между двумя экспериментальным сериями является различие в
площади арен, которые использовались в тестах. Арена в первой серии в
пять раз больше по площади, чем во второй, следовательно, животным
надо было пройти большее расстояние, чтобы исследовать её. Несмотря на
это, закономерности изменения поведения в обеих сериях одинаковы:
двигательная активность значительно выше у мышей линии AKR,
хронически получавших Т4, по сравнению с животными контрольной
группы. Поскольку в первой серии вызванное хроническим введением Т4
увеличение двигательной активности в тесте «открытое поле»
наблюдается после прекращения воздействия и нормализации уровня
гормона в крови, можно сделать важный вывод о том, что наблюдаемое
увеличение двигательной активности скорее всего опосредовано
изменениями в центральной нервной системе, которые сохраняются
долгое время после прекращения введения Т4.
Ранее было показано, что недостаток ТГ, вызванный тиреоидэктомией
(Barykina et al, 2002) или блокадой синтеза ТГ (Куликов и др., 2004;
Tikhonova et al., 2005) вызывает развитие каталепсии у крыс линии Wistar.
Крысы линии ГК, селекционированные на высокую предрасположенность
к каталепсии, являются гипотиреоидными (Barykina et al., 2002). В данном
эксперименте мы обнаружили животных - каталептиков среди мышей
AKR получавших Т4 в течение 60 дней. Поскольку мыши линии AKR в
норме никогда не проявляют каталепсии (Kulikov et al., 1993; Kulikov et al.,
2008), можно заключить, что у мышей линии AKR механизм участия ТГ в
регуляции каталепсии отличается от такового у крыс. Ранее было
показано, что наследственная каталепсия у крыс (Kulikov et al., 2006) и
мышей (Kulikov, Popova, 2008) сопровождается снижением двигательной
активности в тесте «открытое поле». Вызванная хроническим введением
Т4 каталепсия у мышей линии AKR, в отличие от наследственной
каталепсии у мышей СВА и ASC (Базовкина и др., 2005), сопровождается
резким увеличением двигательной активности.
Хронический гипертиреоидизм значительно усилил долю самцов AKR,
проявляющих агрессию на ювенильного самца. Известно, что взрослые
самцы редко проявляют агрессию на ювенильного самца. В нашем
16
эксперименте только 14% контрольных самцов нападали на ювенильного
самца. Поэтому можно предположить, что такое резкое (до 72%)
увеличение процента агрессивных животных среди гипертиреоидных
самцов AKR свидетельствует о патологическом характере этой агрессии.
Это увеличение не является следствием увеличения общей двигательной
активности у гипертиреоидных животных, поскольку не выявлено влияния
гипертиреоидизма на общее число и продолжительность социальных
контактов (включая и агрессивные).
Ранее было показаны антагонистические отношения между
выраженностью агрессии и каталепсии у мышей (Kulikov et al., 1995;
Кондаурова и др., 2007). У самцов AKR, получавших Т4, возникает
парадоксальное увеличение двигательной активности, каталепсии и
агрессии на ювенильного самца, что можно рассматривать, как
свидетельство о патологическом характере вызванных хроническим
введением гормона изменений поведения у животных данной линии.
Возможным молекулярным механизмом опосредующим эффекты Т4 на
поведение являются изменения в серотониновой системе мозга (Bauer et.
al., 2002; Popova, Kulikov, 2007). Ранее было показано, что недостаток Т4
вызывает снижение плотности (Kulikov et al., 1999; Куликов, Жонингро,
2000) и уровня мРНК (Куликов и др., 2002) 5-НТ2д рецепторов в коре
головного мозга крыс. У крыс линии ГК с врожденной
предрасположенностью к каталепсии и врожденным гипотиреоидизмом
(Barykina et al., 2002) показано снижение плотности этих рецепторов в
стриатуме (Kulikov et al., 1995; Popova, Kulikov, 1995). Хотя в двух
экспериментах в качестве внутреннего стандарта использовались разные
гены (бета-актин и РНК полимераза 2), было выявлено увеличение уровня
мРНК 5-НТ2А рецептора в коре мозга у животных линии AKR, получавших
Т4, по сравнению с контрольными мышами. Важно отметить, что это
увеличение наблюдалось у нормотиреоидных самцов AKR через 13 дней
после прекращения введения гормона. Кроме того, это увеличение
сопровождалось активацией 5-НТ2А рецепторов у мышей AKR в первой
экспериментальной серии. Такой эффект хронического введения Т4 на
мышей AKR показан впервые. Этот результат согласуется с увеличением
плотности центров связывания [3Н] кетансерина (Mason et al., 1987) и
индуцированных DOI встряхиваний головой (Tikhonova et al., 2005) у
получавших Т4 крыс и со снижением плотности (Kulikov et al., 1999) и
уровня мРНК 5-НТ2А рецепторов (Куликов и др., 2002а) у
тиреоидэктомированных
крыс.
Взятые
вместе,
эти
данные
свидетельствуют об участии тиреоидных гормонов в тонической
регуляции 5-НТ2А рецепторов коры мозга мышей и крыс: их дефицит
подавляет, а избыток активирует рецепторы.
17
Совместное увеличения уровня мРНК в коре мозга и функциональной
активности 5-НТ2А рецепторов с увеличением двигательной активности в
тесте «открытое поле» можно рассматривать как доказательства причинноследственной связи между этими показателями. Связь между
тиреоидными гормонами, 5-НТ2А рецептором и каталепсией еще не ясна.
Хотя показана ассоциация наследственной каталепсии у мышей и крыс со
сниженной плотностью 5-НТ2А рецепторов в стриатуме (Kulikov et al.,
1995а; Popova, Kulikov, 1995), в данной работе была показана связь
каталепсии, вызванной введением Т4, с увеличением активности и мРНК
5-НТ2А рецепторов в мозге у самцов AKR.
Второй и основной задачей исследования было выяснение связи
эффектов Т4 на поведение и серотониновые рецепторы мозга с
наследственной предрасположенностью мышей к каталепсии. В первом
эксперименте были сравнены эффекты хронического введения Т4 на
поведение и серотониновые рецепторы мышей линий AKR и ASC. Линия
ASC отличается от AKR высокой предрасположенностью к каталепсии и
выраженностью депрессивно-подобных черт (Базовкина и др., 2005).
В отличие от животных линии AKR, хроническое введение Т4 мышам
линии ASC не изменило их двигательную активность в тесте «открытое
поле». В то же время, хроническое введение Т4 оказало
антикаталептический эффект на мышей ASC аналогично таковому у линии
ГК (Kulikov et al., 2002). Более того, хроническое введение Т4 достоверно
понижало время неподвижности в тесте принудительного плавания у
мышей ASC, то есть оказывало антидепрессантный эффект. Это хорошо
согласуется
с
антидепрессантный
эффектом
гормона
у
тиреоидэктомированных крыс Wistar (Kulikov et al., 1997).
Важно отметить, что антикаталептический и антидепрессантный
эффекты Т4 наблюдались даже на фоне некоторого понижения уровня
гормона в крови мышей ASC. Ранее было показано, что высокая
предрасположенность к каталепсии (Barykina et al., 2002) и повышенной
неподвижности в тесте принудительного плавания (Kulikov et al., 1997)
ассоциированы с гипотиреоидизмом. Поэтому маловероятно, что
наблюдаемые у мышей ASC антикаталептический и антидепрессантный
эффекты Т4 обусловлены снижением уровня гормона. Скорее всего, они
обусловлены долговременными изменениями в мозге, вызванными
хроническим действием Т4.
Хроническое введение Т4 снижало активность 5-НТід рецепторов у
мышей ASC. Можно предположить, что хроническое введение Т4
осуществляет антикаталептический и антидепрессантаный эффект через
модификацию 5-НТ|А рецепторов. Это предположение согласуется с
общепринятыми гипотезами о ключевой роли десенситизации 5-HT)A
рецепторов в эффектах антидепрессантов (Blier, de Montigny, 1994;
18
Pineyro, Blier, 1999) и в регуляции каталепсии (Broekkamp et al., 1988;
Invernizzi et al., 1988; Wadenberg, 1996; Wadenberg et al., 1994).
Следующей задачей исследования было выяснение участия главного
гена каталепсии в механизме регуляции поведения и серотониноых
рецепторов тиреоидными гормонами. Для этого было проведено сравнение
эффектов гипертиреоидизма на поведение и серотониновые рецепторы у
мышей AKR и конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76, которые
различаются фрагментом хромосомы 13, содержащим главный ген
каталепсии (Kulikov et al., 2008). В настоящем исследовании было
установлено, что наличие данного фрагмента хромосомы подавляет
активирующий эффект хронического введения Т4 на двигательную
активность в открытом поле и на 5-НТ2А рецепторы. Логично
предположить, что устойчивость к Т4 у мышей линии AKR.CBA-D13Mit76
обусловлена находящимися в этом участке генами. Одним из геновкандидатов является ген, кодирующий белок gpl30. Этот белок является
субъединицей рецепторов некоторых цитокинов, участвующих в
механизмах клеточной дифференцировки, иммунитета и эндокринной
регуляции (Chesnokova, Melmed, 2002). Полученный результат позволят
предполагать участие цитокиновой системы в молекулярном механизме
хронического эффекта Т4 на серотониновые рецепторы и поведение
мышей.
Таким образом, результаты данного исследования могут частично
объяснить и предположить существование биологических предикторов
вариации в чувствительности к ТГ, которая наблюдается в клинике.
Хроническое
введение Т4 оказывает антикаталептический
и
антидепрессантный эффект на крыс линии ГК и мышей ASC. Напротив, у
линий устойчивых к каталепсии: крыс Wistar и мышей AKR гормон не
эффективен или вызывает каталептогенный эффект. Таким образом,
генетическая предрасположенность к каталепсии является биологическим
предиктором антикаталептического и антидепрессантного эффектов ТГ у
мышей и крыс. Результаты данного исследования проводят связь между
экспериментальными
и
клиническими
наблюдениями:
можно
предположить, что Т4 будет улучшать состояние депрессивных больных,
но вызовет противоположный эффекту относительно здоровых пациентов.
Тиреоидные гормоны широко используются для коррекции дисфункций
щитовидной железы. Результаты данной работы предостерегают о
возможных нарушениях поведения и функции нервной системы у особо
чувствительных к ТГ пациентов.
19
выводы
1. Хроническое введение Т4 увеличивает двигательную активность,
агрессию на ювенильного самца и предрасполагает к каталепсии у
самцов мышей линии AKR.
2. Длительное введение Т4 самцам AKR вызывает увеличение уровня
мРНК в коре головного мозга и функциональной активности 5-НТ2А
рецепторов. В то же время, гормон не изменяет ни уровня мРНК в
структурах мозга, ни функциональной активности 5-НТ(А рецепторов.
3. У самцов мышей линии ASC хроническое введение Т4 снижает
выраженность
каталепсии,
время
неподвижности
в тесте
принудительного плавания, а также снижает функциональную
активность 5-НТ1А рецепторов. В то же время, гормон не влияет на
уровень мРНК 5-НТ|А и 5-НТ2А рецепторов в мозге.
4. Перенос терминального фрагмента хромосомы 13 от мышей линии
СВА в геном мышей AKR подавляет вызванное Т4 увеличение
двигательной активности и уровня мРНК 5-НТ2А рецепторов у
конгенной линии мышей AKR.CBA-D13MU76.
5. Хроническое введение Т4 не влияет на индексы тревожного поведения
в тестах «открытое поле» и «свет/темнота» у мышей AKR, ASC и
AKR.CBA-D13Mit76.
СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Зубков Е.А., Куликов А.В. Влияние тироксина на поведение мышей с
наследственными различиями в предрасположенности к каталепсии //
Бюлл. Экспер. Биол. Мед., 2009. т.147. №2. С. 177-180.
2. Зубков Е.А., Куликов А.В., Науменко B.C., Попова Н.К. Хроническое
действие тироксина на поведение и серотониновые рецепторы у
контрастных по предрасположенности к каталепсии линий мышей //
Журн. Высш. Нервн. Деят., 2008. т.58. №4. С. 483-490.
3. Kulikov A.V., Zubkov E.A. Chronic thyroxine treatment activates the 5HT2A serotonin receptor in the mouse brain // Neurosci. Lett., 2007. V.416.
P. 307-309.
4. Зубков Е.А. Влияние хронического введения тироксина на поведение и
5-НТіА и 5-НТ2А рецепторы у мышей, различающихся по
предрасположенности
к
каталепсии
//
Материалы
XLIII
международной научной студенческой конференции "Студент и
научно-технический прогресс", Новосибирск, 2005. ч. «Биология». С.
55-56.
5. Зубков Е.А. Влияние хронического введения тироксина на поведением
5-НТ2А рецепторы у мышей, различающихся по предрасположенности
к каталепсии // Материалы XLIV международной научной
20
студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс",
Новосибирск, 2006. ч. «Биология». С. 87-88.
Тихонова М.А., Зубков Е.А., Куликов А.В. Чувствительность к
антидепрессантам в норме и патологии: зависимость от генотипа //
Материалы III Съезда фармакологов России «Фармакология практическому
здравоохранению»,
Психофармакология
и
биологическая наркология, 2007. т.7, спецвыпуск, ч.2, С. 1979.
Подписано в печать 5 ноября 2009г.
Формат 60x84 1/16.
Заказ №387
Офсетная печать. Объем 21 п.л.
Тираж 100 экз.
Редакционно-издательский центр НГУ.
630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2.