Document 2511399
advertisement
На правах рукописи Орлов Алексей Павлович МАГНИТНЫЕ ИЗОТОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ 25Mg И 67Zn В РЕГУЛЯЦИИ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФОСФАТИДИЛТРАНСФЕРАЗ 03.01.04 - Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва - 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители: доктор медицинских наук, академик Российской академии медицинских наук, Чехонин Владимир Павлович доктор биологических наук, профессор Кузнецов Дмитрий Анатольевич Официальные оппоненты: Шишков Александр Владимирович доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук, заведующий отделом Клячко Наталья Львовна доктор химических наук, профессор, Федеральное Государственное образовательное учреждение бюджетное высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова», заместитель заведующего лабораторией Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологически активных веществ Российской академии наук Защита диссертации состоится « 19 » декабря 2013 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.33, стр. 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.33, стр. 1. Автореферат разослан «___» _______________ 2013 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук 2 А.Ф.Орловский ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Данная работа посвящена изучению актуальной проблемы современной биохимии — механизмам и способам практического применения металл-зависимого спинселективного ферментативного катализа. Эта проблема была впервые выявлена и сформулирована благодаря открытию магнитных изотопных эффектов (МИЭ) ряда металлов - магния, кальция, ртути — в реакциях АТФ-синтезирующих киназ различного происхождения [Buchachenko, et al., 2005-2012; Buchachenko, 2009; Kuznetsov, et al., 2011]. Данные эффекты, выражающиеся обычно в гиперактивации фермента в присутствии изотопа с некомпенсированным ядерным спином (25Mg, 43 Ca), привлекли внимание как химиков [Tulub, 2010; Arkhangelsky, et al., 2011], так и фармакологов [Amirshahi, et al., 2007-2009; Rezayat, et al., 2009; Bukhvostov, et al., 2012] тем, что наряду с их фундаментальной ролью в регуляции работы фосфат-переносящих ферментов, эти эффекты могут составить основу нового подхода к управлению катализом. Так, установлено, что проявление МИЭ в таком катализе связано с ион-радикальными, квантово-механическими процессами, что предполагает возможность поиска путей ядерно-магнитного управления этим катализом [Buchachenko, et al., 2012; Bukhvostov, et al., 2012; Shatalov, et al., 2013]. Фармакологический и биотехнологический потенциалы такой возможности еще только предстоит оценить. Говоря о биологических системах транспорта фосфата, большинство которых (киназы, АТФ-синтазы) являются Mg2+-зависимыми, следует также указать и на семейство ДНК-полимераз, активность которых также требует присутствия магния и связана с переносом фосфатной группы. Несомненный интерес представляют в этой связи ферменты из группы ДНК-полимераз β, ответственные за синтез фрагментов, предназаначенных для репарации дефектов ДНК. Ферменты этой группы Mg-зависимы и гиперэкспрессированы во многих злокачественных опухолях, что делает их, по мнению фармакологов, «легитимными мишенями» для воздействия цитостатиков. Попытка исследования возможных проявлений МИЭ в реакциях ферментов этой группы, могла бы не только помочь дополнить современные представления о природе и механизме МИЭ, но и позволить получить данные о роли МИЭ в контроле за динамикой клеточных популяций — при проведении экспериментов на чистых ферментах и на культурах клеток. В последнем случае удобной моделью могла бы служить линия клеток острого 3 миелобластного лейкоза человека HL60, то есть клетки агрессивно растущей злокачественной опухоли, структурно-функциональные особенности ДНК-полимераз β которых до сих пор специально не исследовались [Bukhvostov, et al., 2013]. Таким радикального) образом, исследования механизма параметров проявления МИЭ квантово-механического в реакциях (ион- ферментативного фосфорилирования представляет собой актуальную научную проблему вследствие сочетания следующих фактов: высокая эффективность ядерно-магнитного управления скоростью металлзависимого ферментативного катализа; возможность такого управления для ферментов транспорта фосфата, к числу которых относятся ключевые ферменты энергетического обмена, репликации и репарации ДНК в клетках эукариот (АТФ-синтазы, киназы, ДНК-полимеразы); гиперэкспрессия ДНК-полимераз β в клетках многих злокачественных опухолей, делающая ферменты этой группы «легитимной мишенью» для новых цитостатиков. Цель исследования. Целью настоящего исследования является поиск и оценка возможностей ядерномагнитного управления металл-зависимыми процессами репликации ДНК и киназного синтеза АТФ in vitro с помощью магнитных изотопов магния и цинка, и, связанного с этим, фармакологического потенциала их магнитных изотопных эффектов. Задачи исследования 1. Изучение влияния магнитных и немагнитных изотопов цинка на каталитическую активность креатинкиназы яда V. xanthia и пируваткиназы ретикулоцитов кролика. 2. Изучение влияния магнитных и немагнитных изотопов магния и цинка на каталитическую активность термофильной ДНК-полимеразы в ПЦР и ДНК-полимеразы бета из хроматина клеток миелоидного лейкоза человека HL-60. 3. Оценка влияния магнитных и немагнитных изотопов магния и цинка на пролиферацию и апоптоз клеток HL-60. 4. Создание модели ион-радикального механизма участия магнитных изотопов в ферментативных реакциях транспорта фосфата при синтезе АТФ и ДНК. 4 Научная новизна. 1. Обнаружено проявление магнитного изотопного эффекта (МИЭ) 67 Zn в регуляции каталитической активности креатинкиназы и пируваткиназы. 2. Обнаружена роль магнитных изотопных эффектов 25 Mg и 67 Zn в регуляции активности ДНК-полимераз 3. Выделена, очищена и охарактеризована уникальная β-подобная ДНК-полимераза из хроматина клеток HL-60 4. Предложена схема ион-радикального механизма переноса фосфата в синтезе ДНК Научно-практическая значимость: 1. Представленная работа вносит вклад в развитие современных представлений о механизмах МИЭ и, следовательно, о перспективах его возможного применения в биохимии и медицине. 2. Обнаруженная и изученная способность магнитных изотопов магния и цинка влиять на ферментативный синтез АТФ и ДНК позволяет использовать эти изотопы в управлении данными процессами. 3. Предложенная в работе методика выделения и очистки ДНК-полимеразы β из клеток острого миелоидного лейкоза человека HL-60 может быть использована в экспериментах на этих и других лейкемических клетках. Основные положения выносимые на защиту. 1. Синтез АТФ с участием киназ возможен не только при участии ионов магния, но и ионов цинка, находящихся в активном центре фермента. При этом скорость реакции сильно зависит от магнитной изотопии этих ионов. 2. Синтез ДНК в полимеразной цепной реакции, а также с помощью ДНКполимеразы β из клеток линии HL-60 подавляется в присутствии магнитных изотопов магния и цинка. Этот эффект зависит от концентрации ионов металлов. 3. Снижение эффективности работы ДНК-полимераз в присутствии магнитных изотопов обусловлено магнитным изотопным эффектом, включающим спинселективный (ион-радикальный) канал переноса фосфатной группы. Этот механизм работает наряду с «классическим» нуклеофильным механизмом и включается при повышении концентрации «классическим». 5 ионов, доминируя над 4. Включение ион-радикального канала переноса фосфата влияет на пролиферацию и апоптоз клеток. Адресная доставка магнитных и немагнитных изотопов магния и цинка в клетки миелоидного лейкоза человека с помощью порфирин-фуллереновых катионообменных наночастиц PMC16 позволяет влиять на динамику популяций этих клеток. Апробация диссертации. Результаты работы доложены и обсуждены на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых медицинских ВУЗов в РНИМУ им. Н.И. Пирогова (Москва, 2011, 2012); на объединенном семинаре кафедры и отдела медицинских нанобиотехнологий РНИМУ им. Н.И. Пирогова и отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ГНЦ ССП им. В.П. Сербского (Москва, 2012, 2013); на объединенном семинаре кафедры и отдела медицинских нанобиотехнологий РНИМУ им. Н.И. Пирогова, кафедры химической кинетики химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева (Москва, 2013); на 3-ем международном симпозиуме по металломике (Мюнстер, Германия, 2011); на ежегодной конференции Европейской Организации Молекулярных Биологов (Вена, Австрия, 2011); на 7-ой международной конференции по химии и биологии изотопных эффектов (Изотопы-2011) в виде пленарного доклада (Гро-ле-Бэйн, Франция, 2011); на 2-ом международном конгрессе по изучению и терапии рака (Сан-Антонио, США, 2012). Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 101 страницах, включая иллюстрации: 7 таблиц, 38 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 200 ссылок на отечественных (49) и зарубежных (151) авторов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Активность креатинкиназы и пируваткиназы. Для проведения экспериментов с креатинкиназой (Е.С.2.7.3.2) использовался фермент, выделенный из яда Vipera Xanthia и очищенный по методу, предложенному в [Kuznetsov, et al., 2004]. Пируваткиназа из ретикулоцитов кролика (Е.С.2.6.9.17) была 6 произведена Wortthington Inc., Durham. Активность ферментов определяли с помощью ранее описанных в [Buchachenko, et al., 2010] методик. 2. Полимеразная цепная реакция. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) был использован набор реагентов для амплификации фирмы СИНТОЛ, Россия (R-441), содержащий интеркалирующий краситель Eva-Green. В качестве действующего фермента в наборе использовалась термостабильная Taq-ДНК-полимераза c удельной активностью 5 E/мл. Магнитные изотопы 25Mg и 67Zn co степенью обогащения 86,6% и 97,8%, соответственно, были предоставлены компанией Gamma Lab AG, Alicante, Spain, в виде оксидов MgO и ZnO. Использовали растворы хлоридов магнитных и немагнитных изотопов магния и цинка, приготовленные с помощью HCl (Sigma Aldrich). Итоговые концентрации стоковых растворов солей юстировали с помощью атомно-адсорбционной спектрофотометрии на приборе AAA 610 (Carl Zeiss Jena). Реакцию проводили на амплификаторе BioRad IQ-5, для обработки данных использовалось стандартное программное обеспечение IQ-5. В качестве амплифицируемой матрицы применяли плазмиду P28A с клонированной вставкой гена мышиного NGF (nerve growth factor). Нуклеотидные последовательности для праймеров были взяты из электронной базы данных PrimerBank и синтезированы фирмой Синтол, Россия. Реакция включала в себя 30 циклов амплификации. Для подтверждения отсутствия контаминации, в каждом эксперименте присутствовал образец нулевого контроля, без плазмиды. 3. Выделение ДНК-полимеразы β Клеточная линия острого миелоидного лейкоза HL-60 получена из Венгерского Банка Клеток (Венгерский Институт Пастера, Сегед NCBI код C427). Клетки находились в виде суспензии при температуре +370C и 5% CO2 в среде RPMI 1640 (Gibco, Великобритания) с 10% FCS и антибиотиками - 100 E/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Процедура пассажей и мониторинга жизнеспособности клеток осуществлялась по методу, предложенному в [Bukhvostov et al., 2013; Бухвостов и соавт., 2013]. Выделение хроматина проводили по модифицированной методике [Haratian, et al., 2007]. Для гель-фильтрации использовали колонку 1,8 x 70 см, заполненную гелем TOYOPEARL HW 55F и уравновешенную 15 мМ калий-фосфатным буфером (pH 6,30) / 7 5,0 мМ MgCl2 / 0,0001% азида натрия. Скорость элюции составляла 0,8 мл/мин (при комнатной температуре). Использовали УФ - детектор для регистрации поглощения при 280 нм. В каждой из последовательно элюированных фракций объемом 2,0 мл измеряли удельную каталитическую активность ДНК-полимеразы бета. Для этого оценивали скорость включения [3H]ТТФ в растущие цепи однотяжевых ДНК при оптимальных условиях, отнесенную на 1 мг чистого фермента. Количество белка определяли с помощью колориметрического метода Бредфорда. Электрофорез фермента, ДНК и изоэлектрическое фокусирование белков проводили по рутинным методикам [Laemmli, 1970; Reichman, et al., 1957; Walker, 1994]. Активность ДНК-полимеразы определяли в соответствие с работой [T.Mikami et al., 2004] в модификации, описанной в работе [K.Haratian et al., 2007]. ДНК - содержащие экстракты использовали для электрофоретического определения размеров цепей однотяжевых ДНК, синтезированных очищенным ферментом. Для определения величин суммарной [3H]-радиоактивности этих ДНК использовали стандартную диоксановую сцинтилляционную систему (Wallac 2200LX LS Counter, Wallac OY,Финляндия). Величину удельной каталитической активности ДНК-полимеразы β выражали как количество [3H]dТТФ, включенного в растущие цепи однотяжевых ДНК в течение 1 мин при оптимальных условиях инкубации, отнесенное на 1 мг чистого фермента, т. е. ([3H]dТТФ имп/мин)/мг белка [Bukhvostov, et al., 2013]. Равновесное состояние достигалось к 60-ой минуте инкубации реакционной смеси. Основные кинетические константы, KМ (мМ) and Kcat ([мкмоль dТТФ/мин]/мг фермента), определяли по величине скорости истощения пула свободного dТТФ, для мониторинга за которым применяли ЖХВД в обращенной фазе на ODS-S5CN [Kuznetsov, et. al., 1986]. Для характеристики выделенного фермента использовали стандартные версии метода сканирующей УФ - спектрофотомерии (Lambda 1050 Scanning Spectrophotometer, Perkin Elmer, Inc., США) и метода спектрометрии кругового дихроизма (J815 CD Spectrometer, JASCO, Inc., США). Для обработки данных использовали пакет программного обеспечения Spectra Manager 2А (JASCO, Inc., США). 4. Действие магнитных ядер магния, введенных в наночастицы на основе порфиринфуллерена, на раковые клетки HL-60 и мононуклеарные клетки, выделенные из крови больных ОЛЛ. 8 Использовали катионитные наночастицы, предложенные в работе [Amirshahi, et al., 2008, 2009] и произведенные фирмой Sintech, Китай: бакминстер фуллерен (С60) -2(бутадиен-1-ил)-тетра-(о-аминобутирил-о-фталил)порфирин – которые загружали ионами металлов с известной изотопией. Выделение мононуклеарных клеток нелеченых больных ОЛЛ и здоровых доноров (контроль) осуществляли с помощью препаративного сортинга [Орлов, и соавт., 2013]. Жизнеспособность клеток оценивали методом МТТ-теста. Статистическая обработка полученных результатов. По результатам МТТ-теста проводили статистический анализ значений LC50. Было выявлено, что распределение этих величин в исследуемом поле не соответствует критериям параметрического анализа и для оценки средних значений использовались величины медиан. Для определения достоверности различий между группами применяли непараметрический критерий Манна-Уитни [Waugh, et al., 1998]. Для определения достоверности различий между эффективностью препаратов применяли непараметрический критерий для сравнения нескольких групп – критерий Крускала-Уоллиса [Berthault, 2002]. Для оценки степени индукции апоптоза применяли критерий Уилкоксона при сравнении двух выборок парных измерений [Schramm, 2007]. Статистическая компьютерная обработка полученного материала проводилась в программах Microsoft Excel, Statistica 6.0. Различия считались статистически значимыми при р<0.05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 1. Цинк-зависимый магнитный изотопный эффект в ферментативном синтезе АТФ На скорость ферментативного синтеза АТФ, являющегося магний-зависимым процессом, влияет также и изотопия ионов, находящихся в каталитических сайтах ферментов. Ранее было показано [Buchachenko, et al., 2005-2012], что активность АТФсинтазы и АТФ-производящих киназ, имеющих в своем составе изотоп 25Mg, обладающий магнитным ядром, была в 2-3 раза выше, чем у тех же ферментов, содержащих немагнитные изотопы 24 Mg и 26 Mg. Аналогичные результаты получены и для ионов кальция [Arkhangelsky, et al., 2010]. 9 Так как ферментативный синтез АТФ, катализируемый Mg- и Ca-содержащими ферментами, показывал очень схожую динамику зависимости, как от концентрации ионов металлов, так и от их изотопии, то нами было выдвинуто предположение о том, что ионрадикальный механизм является универсальным явлением и может быть обнаружен и для других ионов металлов. Для проверки были подготовлены две серии образцов креатинкиназы, пируваткиназы и митохондриальной креатинкиназы с различными изотопами Zn. (а) (б) Рис. 1. Зависимость скорости производства АТФ креатинкиназой (а) и пируваткиназой (б) от концентрации 64ZnCl2 (1) и 67ZnCl2 (2) (300С, 40 мин., pH 8.0). На рис. 1 представлена зависимость величин выхода АТФ, произведенного креатинкиназой и пируваткиназой, от концентрации ZnCl2. Наличие МИЭ в синтезе АТФ ферментами, несущими цинк, согласуются с гипотезой о том, что ион-радикальный механизм в ферментативном синтезе АТФ является универсальным явлением. На рис.2 представлена наша схема образования ион-радикальных пар и их синглет-триплетная конверсия в механизме магнитного изотопного эффекта биологического фосфорилирования в реакциях креатинкиназы. 10 67 Zn, регулирующего скорость нуклеотидилкиназ на примере Рис. 2. Схема образования ион-радикальных пар и их синглет-триплетная конверсия в синтезе АТФ на примере креатинкиназы. 2. Магнитный изотопный эффект в ПЦР. ДНК-полимеразы известны, как ферменты, осуществляющие процесс репликации ДНК путем встраивания нуклеотидов в растущую цепь и использующие механизм, вовлекающий в катализ два иона магния, входящие в состав фермента. Также имеются сведения и об участии в этом процессе ионов цинка [Lavrik, et al., 2000, 2004; Pilot, et al., 2007]. Нами было изучено влияния магнитных изотопов магния и цинка на активность Taq-полимеразы в ПЦР. С помощью этого метода невозможно определить абсолютную активность фермента, однако он вполне пригоден для сравнения уровней ферментативной активности в различных условиях. На рис.3 представлены зависимости величин активности Тaq-полимеразы, загруженной магнитными и немагнитными изотопами магния и цинка, от концентрации 11 ионов этих металлов. Как видно из полученных результатов, активность фермента падала в присутствии магнитных изотопов, причем магнитный изотопный эффект проявлялся лишь при концентрациях > 0.5 мМ. 1200 1000 1000 800 800 600 tgα-25Mg tgα-*Mg 400 tgα-67Zn 600 tgα-*Zn 400 200 200 0 0 1 2 3 4 5 0 [MgCl2], mM 0 1 2 3 4 5 [ZnCl2], mM Рис. 3. Зависимость эффективности синтеза ДНК в ПЦР от концентрации и изотопии магния и цинка. По оси ординат отложен обратный тангенс угла наклона кривой в ПЦР реального времени в точке перегиба графика. Таким образом, впервые обнаружен сам факт наличия магнитного изотопного эффекта в реакции ферментативного синтеза ДНК. Это явление оказалось универсальным для различных ионов металлов, при этом ПЦР катализируется ДНК-полимеразой, загруженной, как ионами магния, так и ионами цинка. В последнем случае максимум активности оказывается выше. Этот факт заслуживает особого внимания, поскольку ДНКполимеразы всегда считались ферментами, более зависимыми от ионов магния [Lavrik, et al., 2010]. 3. Выделение и очистка ДНК-полимеразы β из клеток миелоидного лейкоза человека После экспериментов с прокариотической Taq-полимеразой в ПЦР следовало выяснить, будет ли наблюдаться такой же эффект и в случае эукариотических полимераз. Для этого был выбран фермент ДНК-полимераза β из клеток миелоидного лейкоза человека линии HL-60. Этот выбор обусловлен особой ролью фермента в репарации ДНК и тем, что он подвержен гиперэкспрессии в многих лейкемических клетках [Telashima, et. al., 2011]. 12 Для выделения чистого фермента из хроматина опухолевых клеток нами была предложена оригинальная экстракционно - хроматографическая методика выделения и очистки мономерной ДНК-полимеразы бета. Рис. 4. Разделение белков хроматина из клеток HL-60 на колонке TOYOPEARL HW 55F и последующая оценка физико-химических свойств и каталитической активности выделенной бета-подобной ДНК полимеразы. А – Электрофорез ДНК в агарозном геле: 1, 3 – коммерческие маркеры однотяжевой ДНК, 2 – фрагменты ДНК, процессированные выделенной из хроматина клеток HL-60 бетаподобной ДНК-полимеразой. В, С – ИЭФ очищенного фермента (бета – подобной ДНК-полимеразы) и коммерческих маркеров. D – SDS – PAGE анализ: 1 – коммерческие маркеры, 2 – 5 – очищенный фермент (5,0, 1,0, 0,5 и 0,1 мкг/гель). Е – ИЭФ продуктов фракционирования ядер клеток HL-60 и миелобластов/премиелоцитов здоровых доноров: 1 – маркер, кислый гликопротеин плазматической мембраны клеток HeLa, 2 – маркер, гистон Н1А клеток HeLa, 3 - бета – подобная ДНК-полимераза из хроматина ядер клеток HL-60, 4, 6, 7 – суммарный белок хроматина ядер миелобластов/премиелоцитов здоровых доноров, 5 – суммарный белок ядер клеток HL-60, 8, 9 – суммарный белок хроматина ядер клеток HL-60, 10 – суммарный белок нуклеоплазмы ядер клеток HL-60. 13 Как видно из данных, представленных на рис.4 и табл.1, процедура позволяет выделить высокоочищенный 66,5 кДа - мономерный белок (рис.4D), обладающий выраженной каталитической ДНК-полимеразной активностью и способный синтезировать отрезки однотяжевых ДНК с итоговыми размерами 200n - 250n (рис. 4A). Степень очистки выделенного фермента по отношению к общему белку клетки составила 122000. Выделенный фермент обладает следующими свойствами: ИЭТ = 8,45 (рис.4 B,C,E), pH-оптимум 8.0, 15 мМ MgCl2 - оптимальная концентрация драйвер-иона (см. Материалы и Методы). Кинетические константы, определённые по скорости утилизации dТТФ, равны KM = 0,016 мМ и Kcat = 0,622 (мкмоль dТТФ/мин)/мг ферментного белка. Обе измеренные кинетические константы говорят о медленно протекающем катализе, означающем высокую точность считывания информации с матриц, необходимую для эффективной репарации ДНК, т.е. для обеспечения единственной функции ДНКполимераз β. Таблица 1. Этапы очистки фермента. Этапы очистки фермента ДНК-пол β – каталитическая активность, 3 ([ H]ДНК имп/мин)/мг белка (5,9 ± 0,63) x 102 (18,64 ± 0,87) x 102 (2,476 ± 0,2) x 103 (6,1 ± 0,2) x 103 (1,01 ± 0,02) x 104 Суммарный клеточный гомогенат «грубые» ядра (P 0.8) «грубый» хроматин Фенол-хлороформная экстракция Градиентное высаливание (NH4)2SO4 ультрафильтрация TOYOPEARL HW 55F гель-фильтрация Многие специфические (1,94 ± 0,03) x 104 (3,27 ± 0,03) x 104 признаки ДНК-полимеразы β (“таксономические критерии”) – такие, как способность к гиперактивации в присутствии 200 мМ KCl, высокая устойчивость к амфидиколину и N-этилмалеимиду, сравнительно небольшой размер синтезируемых фрагментов ДНК (до 300n), полное отсутствие 3’,5’- экзонуклеазной активности, медленный темп роста синтезируемой цепи ДНК (низкая 14 процессивность) ясно показывают, что выделенный нами фермент принадлежит именно к группе ДНК-полимераз β (рис.4, табл.2). Таблица 2. Каталитическая активность бета-подобной ДНК-полимеразы, выделенной из хроматина клеток HL-60: воздействие ингибиторов и KCl. Активность ДНК-полимеразы β, ([3H]ДНК имп/мин)/мг белка Испытываемые реагенты n = 6 (M± m) 30789 ± 398 27632 ± 437 1370 ± 186 207 ± 16 74613 ± 441 29838 ± 322 Амфидиколин, 5.0 мкг/мл N-этилмалеимид, 0.5 мМ ddТТФ, 2.5 мкM Трипсин, 20 мкг/мл KCl, 200 мМ Без добавления реагентов (оптимальная инкубационная среда) 4. Магнитные изотопные эффекты в регуляции активности ДНК-полимеразы β После выделения, очистки и описания физико-химических свойств бета-подобной ДНКполимеразы из клеток миелоидного лейкоза человека HL-60 проводили изучение влияния магнитного изотопного эффекта на активность фермента. В первой серии экспериментов измерялась активность ДНК-полимеразы β в присутствии ионов *Mg2+ с естественным изотопным составом (79% (содержание 25 24 Mg, 10% 25 Mg, 11% 26 Mg) и ионов 25 Mg2+ Mg составляло 86.8%). Рис.5 показывает выход ДНК, меченной тритием, т.е. количество меченных тритием нуклеотидов dTTP, включенных в растущую цепь ДНК за 1 минуту при оптимальных условиях (скорость синтеза ДНК), как функцию концентрации ионов магния. Следует отметить две примечательные особенности. Вопервых, в концентрационной зависимости присутствуют два максимума: первый в районе концентраций 0.5-1.0 мМ, и второй, гораздо более высокий, в области 10-20 мМ. Вовторых, виден значительный магнитный изотопный эффект в синтезе ДНК: ионы 25 Mg2+ подавляют включение нуклеотидов в растущую цепь ДНК при концентрациях ≥0.5 мМ. 15 Рис. 5. Скорость синтеза ДНК в зависимости от концентрации ионов *Mg2+ и 25Mg2+. A — ([3H]ДНК имп./мин)/мг фермента (370С, 60 мин., pH 8.0). В диапазоне концентраций 0.5-1.0 мМ величина магнитного изотопного эффекта составляла около 2, а в области концентраций ≥ 2 мМ - колебалась от 3 до 5. Эти концентрации превышают физиологические, однако, как чисто химическое явление, такой огромный изотопный эффект выглядит интригующе. Стоит также обратить внимание на то, что при малых концентрациях (меньше 0.5 мМ) никакого эффекта не было, хотя синтез ДНК происходил. Вслед за экспериментами с различными изотопами магния, было проведено и изучение влияния изотопии цинка на синтез ДНК, т.к. при исследовании ПЦР магнитные изотопные эффекты наблюдались, как в присутствии ионов магния, так и в присутствии ионов цинка. В этой серии экспериментов ДНК-полимеразу β загружали ионами природного *Zn2+ (содержание единственного магнитного изотопа 67Zn составляет 4,1 %) и ионами 67Zn2+ (изотопное обогащение 97,8%). Далее для простоты 64Zn и 67Zn. На рис.6 показана зависимость активности исследуемого фермента от концентрации ионов Zn2+ с 16 различной изотопией. Несмотря на замену магния на цинк, наблюдалась картина, очень похожая на предыдущие эксперименты. Полимераза, загруженная ионами цинка, показала сопоставимую с экспериментами с магнием, величину активности. Значение активности фермента с 64 Zn сильно уступает величине активности фермента с 67 Zn. Это говорит о том, что магнитный изотоп цинка подавляет активность полимеразы в исследованных диапазонах концентраций. Рис.6. Скорость синтеза ДНК в зависимости от концентрации ионов 64Zn2+ и 67Zn2+. A — ([3H]ДНК имп./мин)/мг фермента (370С, 60 мин., pH 8.0). Кроме того, как и в случае магния, концентрационная зависимость имеет два максимума активности фермента, и наблюдается большая величина изотопного эффекта. Более того, значение концентраций, при которых имели место максимумы в случае магния, были теми же и для фермента, несущего ионы цинка. Таким образом, было получено подтверждение наличия магнитного изотопного эффекта в синтезе ДНК, как на прокариотической Taq-полимеразе в ПЦР, так и на эукариотической ДНК-полимеразе β, после чего величины эффектов можно было сравнивать (Табл. 3). 17 Таблица 3. Сравнение величин магнитного изотопного эффекта для taq-полимеразы и ДНК-полимеразы β. MgCl2, A(*Mg)/A(25Mg) мМ ПЦР pol * 0.6 1.0 0.2 1.1 0.1 1.0 2.3 0.2 2.5 0.3 2.0 2.3 0.5 2.2 0.3 4.0 5.0 2.0 5.3 1.0 Оказалось, что и ДНК-полимераза β, и Taq-полимераза, осуществляющая синтез ДНК в ПЦР, показали общий эффект: их работа подавляется 25Mg примерно в одинаковой степени, что зависит от концентрации ионов металла. При низких концентрациях эффект ничтожно мал, а при увеличении концентрации величина эффекта растет. Следовательно, можно полагать, что МИЭ является универсальным для синтеза ДНК, проявляясь на двух совершенно разных типах ДНК-полимераз. 5. Влияние магнитного поля на синтез ДНК Так как в основе МИЭ лежат магнитные взаимодействия, было важно проверить, как поведет себя фермент при наведении внешнего магнитного поля. Кроме того, эти данные, возможно, могут помочь в понимании механизма происходящих процессов. 3 3 12 A10 20 24 Mg 10 A10 25 Mg 18 16 8 14 12 6 10 8 4 6 4 2 2 0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,5 3,0 24 1,0 1,5 2,0 3,0 25 [ MgCl2], mM [ MgCl2], mM Рис. 7. Влияние магнитного поля на синтез ДНК ферментом ДНК-полимераза β, загруженным ионами 24Mg2+ (слева) и 25Mg2+ (справа). А - ([3H]ДНК имп./мин)/мг фермента. █ - эксперименты в магнитном поле Земли, █ - эксперименты в наведенном внешнем магнитном поле величиной 160 мТл. 18 Как видно из рис.7, магнитное поле незначительно подавляет активность ДНКполимеразы β, если в ее активном центре находится немагнитный изотоп 24 Mg; эффект воспроизводим, но практически не выходит за рамки экспериментальной погрешности. Однако в случае, когда в каталитическом сайте фермента находится магнитный изотоп 25 Mg, скорость работы полимеразы в присутствии внешнего магнитного поля увеличивается в 2-5 раз в диапазоне концентраций ионов металла от 0.5 мМ до 3 мМ. При увеличении концентрации ионов магния увеличивается и активность фермента, а в случае с магнитным изотопом также растет и различие в скоростях синтеза ДНК в магнитном поле и без него. 6. Ион-радикальный механизм в синтезе ДНК. При наблюдении МИЭ и эффекта магнитного поля в синтезе ДНК мы столкнулись с тем, что данные указывают на присутствие в механизме промежуточных парамагнитных интермедиатов. Это значит, что помимо нуклеофильного механизма существует (или сосуществует) и другой, ион-радикальный механизм, сравнительно недавно открытый для ферментативного синтеза АТФ [Buchachenko, et al., 2005-2013]. Этот механизм, конкурируя с нуклеофильным, предполагает перенос электрона с иона 3´Oна ион Mg(H2O)n2+, как ключевую реакцию, инициирующую синтез ДНК. В результате этой реакции образуется первичная ион-радикальная пара [3´O• Mg+], состоящая из окси- радикала 3´O• на рибозном кольце и гидратированного катион-радикала Mg(H2O)n+. На втором этапе происходит присоединение рибозного окси-радикала к двойной связи PO встраивающегося нуклеотидтрифосфата. Благодаря этому образуется новый оксирадикал, который распадается по трем каналам (рис.8). Но лишь один из них приводит к встраиванию нуклеотида в цепь ДНК, и он является эндоэргическим, а значит малоэффективным. 19 Рис. 8. Схема распада оксирадикала по трем каналам. → - канал, при котором происходит присоединение нуклеотида к цепи ДНК. В том, что один ион металла в каталитическом сайте фермента прочно связан с пирофосфатной группой, нет никаких сомнений. Согласно общепринятой концепции, второй ион металла включает нуклеофильный, зависящий от обоих ионов магния, механизм, приводящий к удлинению цепи ДНК [Варфоломеев, 2009; Kerr, et al., 2010]. Вхождение второго иона в активный центр полимеразы приводит к повышению каталитической активности фермента, а также к проявлению изотопного эффекта. Появляется конкурирующий с нуклеофильным ион-радикальный путь, который в дальнейшем становится доминирующим [Buchachenko, et al., 2013]. Вместе с тем, не стоит забывать, что концентрация ионов магния и цинка в живых организмах невелика, так что главным механизмом синтеза ДНК in vivo является все же нуклеофильный путь. Ион-радикальный механизм включается лишь тогда, когда концентрация ионов металлов составляет не менее 0.5 мМ. Несмотря на это, было важно провести эксперименты на живых клетках, чтобы понять, насколько включение ионрадикального механизма влияет на основные параметры их жизнедеятельности. Помимо этого, с помощью некоторых катионообменных наночастиц можно доставлять ионы металла в клетку против градиента концентрации и, следовательно, создавать внутри клетки условия для доминирования ион-радикального процесса синтеза ДНК. 20 7. Влияние магнитного изотопного эффекта на выживаемость клеток HL-60 Для доставки магнитных изотопов в клетки острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) человека использовали порфирин-фуллереновые наночастицы PMC-16, емкость загрузки которых составляет 4 иона двухвалентного металла на одну частицу. На рис.9 представлена зависимость выживаемости клеток HL-60 и миелобластов здоровых доноров от изотопии ионов магния и цинка, доставленных с помощью PMC-16. Рис. 9. Влияние наночастиц PMC-16, транспортирующих изотопы Mg и Zn, на выживаемость клеток HL-60 и миелобластов здоровых доноров При сравнении эффективных концентраций препаратов порфирин-фуллеренов для определения их цитотоксической активности было установлено, что чувствительность лейкемических клеток выше к препарату PMC16(67Zn). Однако серьезной разницы в эффектах магнитного и немагнитного изотопов Mg не наблюдалось. Все препараты в той или иной степени обладают избирательностью по отношению к клеткам опухоли, оказывая значительно меньший эффект на гомологичные клетки здоровых доноров. Наиболее ярко эта избирательность проявляется для наночастиц, загруженных магнитными изотопами Mg и Zn. Данные этого эксперимента говорят о том, что наибольшим фармакологическим потенциалом обладает препарат PMC16, несущий магнитные изотопы 67 Zn, благодаря не только величине цитостатического эффекта, но и избирательности в отношении раковых клеток. 21 Исследование индукции апоптоза показало, что наиболее перспективным, с точки зрения цитостатического эффекта, являются наночастицы, загруженные различными изотопами цинка. Показана эффективность этих препаратов в отношении лейкемических бластных клеток в случае миелобластных (линия HL60) лейкозов при отсутствии воздействия на здоровые клетки крови Выводы 1) На основании экспериментов по исследованию активности креатинкиназы и пируваткиназы в присутствии магнитных изотопов магния и цинка в реакции синтеза АТФ, было показано, что скорости этих реакций возрастают за счет магнитных изотопных эффектов ионов 25Mg2+ и 67Zn2+. 2) Выделена, очищена и охарактеризована ДНК-полимераза β из хроматина клеток острого миелоидного лейкоза человека HL-60. Доказан факт гиперэкспрессии ДНК-полимеразы β в клетках данной опухоли. 3) Впервые обнаружен магнитный изотопный эффект в реакциях переноса фосфата при синтезе ДНК на примере полимеразной цепной реакции и ДНК-полимеразы β из клеток HL-60. 4) Предложена модель спин-селективного (ион-радикального) пути переноса фосфата в ферментативном синтезе ДНК, объясняющая природу магнитного изотопного эффекта, проявляющегося в этом синтезе. 22 Список работ, опубликованных по теме диссертации I. Статьи в рецензируемых журналах 1. Buchachenko A. L., Chekhonin V. P., Orlov A. P., Kuznetsov D. A. (2010) Zinc-related magnetic isotope effect in the enzymatic ATP synthesis: a medicinal potential of the nuclear spin selectivity phenomena. International Journal of Molecular Medicine and Advanced Scince, 6 (3): 34-37. 2. Орлов А. П., Кузнецов Д. А., Чехонин В. П., Берсенев И. С., Немер-Гергели Л.Дж., Удварди Ш. (2011) Бета – подобная ДНК-полимераза клеток HL-60. Онкогематология, №2, 47 – 49. 3. Orlova M.A., Orlov A.P. (2011) Role of Zinc in an Organism and Its Influence on Processes Leading to Apoptosis. British Journal of Medicine and Medical Research, 1(4): 239-305. 4. Buchachenko A.L., Breslavskaya N.N., Chekhonin V.P., Arkhangelsky S.E., Orlov A.P., Kuznetsov D. A.(2011) Phosphate transfer enzymes as the nuclear spin selective nanoreactors. International Research Journal of Pure and Applied Chemistry, 1(1):1–16. 5. Бухвостов А. А., Шаталов О. А., Орлов А. П., Кузнецов Д. А. (2013) Об уникальности ДНК-полимеразы бета клеток острого миелоидного лейкоза человека как возможной мишени для действия спин-селективных ингибиторовцитостатиков. Онкогематология, №1, 28 — 36. 6. Bukhvostov A.A., Shatalov O.A., Orlov A.P., Kuznetsov D.A. (2013) An atypical DNA polymerase beta overexpressed in human AML/HL-60 malignant cells. Journal of Cancer Science & Therapy, 5(2): 94 – 99. 7. Orlova M.A., Trofimova T.P., Orlov A.P., Shatalov O.A. (2013) Perspectives of Fullerene derivatives in PDT and radiotherapies of cancers. British Journal of Medicine & Medical Research, 3(4): 1731 - 1756. 8. Buchachenko A.L., Orlov A.P., Kuznetsov D.A., Breslavskaya N.N., (2013) Magnetic isotope and magnetic field effects on the DNA synthesis. Nucleic Acids Research, 41(12): 1-8, DOI: 10.1093/nar/gkt537 9. Buchachenko A.L., Orlov A.P., Kuznetsov D.A., Breslavskaya N.N., (2013) Magnetic control of the DNA synthesis. Chem. Phys. Lett., DOI:org/10.1016/j.cplett.2013.07.056. 23 II. Статьи в рецензируемых сборниках и тезисы конференций 10. Орлов А. П., Кузнецов Д. А., Чехонин В. П., Бучаченко А. Л. (2011) Изотопные эффекты двухвалентных металлов в регуляции активности ферментов транспорта фосфата. Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине (ред. Кудинова А. П. и Крылова Б. В.), том 3, стр. 92 – 100, издательство Политехнического университета, Санкт-Петербург. 11. Orlov A. P., Kuznetsov D. A., Chekhonin V. P., Buchachenko A. L. (2011) Nuclear spin selective biochemistry: magnetic isotope effect of Zinc-67 in the ATP synthesis. Proceedings of the 7th International Conference on Chemistry and Biology of Isotope Effects (ISOTOPES-2011), pp. 27 – 28, University of Nantes Press, Greoux-les-Bains. 12. Kuznetsov D. A., Orlov A. P., Chekhonin V. P., Udvardi S., Niemer-Gergeli, L. J. (2011) An unusual member of the DNA polymerase beta family expressed in HL60 cells. Abstracts of the 3rd International Symposium on Metallomics, R98, Munster University Press, Munster. 13. Kuznetsov D. A., Orlov A. P., Chekhonin V. P., Udvardi S. (2011) Chromatin associated beta-like DNA polymerase from human acute lymphoblast leukemia cells. Abstracts of the Annual EMBO Meeting, S116, Schoenbaum & Klughe Verlag GmbH, Vienna. 14. Orlov A.P. (2011) Magnetic isotopy effect in the enzymatic synthesis of ATP. Abstracts of the 6th International Pirogov Scientific Medical Conference of Students and Young Scientists, Russian National Research Medical University, Moscow 15. Bukhvostov A.A., Orlov A.P. (2012) A unique beta-like DNA polymerase from the human lymphoblast leucosis cells. Abstracts of the 7th International Pirogov Scientific Medical Conference of Students and Young Scientists, Russian National Research Medical University, Moscow 16. Kuznetsov D.A., Shatalov O.A., Orlov A.P., Bukhvostov A.A. (2012) An atypical betalike DNA polymerase in AML cells. A new target for cytostatic attack. OMICS Group Congress on Cancer Science (CANCER SCIENCE - 2012), R92, San Antonio, USA. 24
