использование атомной силовой микросокпии для измерения

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТОМНОЙ СИЛОВОЙ МИКРОСОКПИИ ДЛЯ
ИЗМЕРЕНИЯ ПОПЕРЕЧНОЙ ЖЕСТКОСТИ ОДИНОЧНЫХ МЫШЕЧНЫХ
ВОЛОКОН
И.В. Огнева
Учреждение Российской Академии Наук Государственный Научный Центр Российской
Федерации – Институт медико-биологических проблем Российской Академии Наук
123007, Россия, Москва, Хорошевское шоссе, д. 76-а, iogneva@yandex.ru
АННОТАЦИЯ
В методическом обзоре рассмотрен один из наиболее перспективных методов
исследования механических характеристик живых объектов на клеточно-молекулярном
уровне – атомная силовая микроскопия. Приведены данные по поперечной жесткости как
одиночных миофибрилл, так и нативных волокон различных мышц.
АТОМНАЯ СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ
В настоящее время, одним из основных методов определения жесткости клеток, в том
числе и поперечной жесткости мышечных волокон, является атомная силовая микроскопия
[1]. Атомная силовая микроскопия представляет собой одну из разновидностей методики
сканирующей зондовой микроскопии. Данный метод позволяет получать информацию как о
рельефе поверхности, так и о ее механических свойствах.
Принцип работы атомного силового микроскопа
В основе работы атомного силового микроскопа (АСМ) лежит силовое взаимодействие
между зондом и поверхностью, для регистрации которого используются специальные
зондовые датчики, представляющие собой упругую консоль с острым зондом на конце.
Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли: зонд
испытывает притяжение со стороны образца на больших расстояниях и отталкивание на
1
малых. Регистрируя величину изгиба, можно контролировать силу взаимодействия зонда с
поверхностью [2].
Существует несколько методов работы с АСМ для исследования структуры и свойств
изучаемых образцов. Их можно разделить на две большие группы: бесконтактные
колебательные и контактные квазистатические. Для анализа механических характеристик
чаще всего применяются модификации контактного метода.
В контактных методиках острие зонда (кантилевера) находится в непосредственном
соприкосновении с поверхностью, при этом силы притяжения и отталкивания, действующие
со стороны образца, уравновешиваются силой упругости консоли. При работе АСМ в таких
режимах используются кантилеверы с относительно малыми коэффициентами жесткости,
что
позволяет обеспечить
высокую
чувствительность
и избежать
нежелательного
чрезмерного воздействия зонда на образец [2].
В квазистатическом режиме возможны две модификации работы АСМ.
Для непосредственного исследования рельефа поверхности задается постоянной сила
взаимодействия зонда с поверхностью, при этом система обратной связи поддерживает
постоянной величину изгиба кантилевера, при этом управляющее напряжение будет
пропорционально рельефу поверхности образца.
Возможен и другой вариант сканирования образца. Система обратной связи
поддерживает
постоянной
расстояние
z между основанием
зондового
датчика
и
поверхностью образца, а управляющее напряжение в этом случае будет пропорционально
силе взаимодействия зонда и поверхности образца. Полученное таким образом АСМизображение характеризует пространственное распределение силы взаимодействия зонда и
образца.
Обычно механические характеристики образца изучают не в плоскости, а в какой-то
интересующей точке. Для этого снимаются так называемые кривые подвода зонда к
поверхности и кривые отвода. Фактически это зависимости величины изгиба кантилевера (а,
следовательно, и силы взаимодействия зонда с поверхностью) от координаты z при
сближении зондового датчика и образца. Аналогичные измерения проводят и при удалении
зонда от поверхности.
Вычисление поперечной жесткости и модуля Юнга образца по силовым кривым
Вычисление параметров жесткости образца по данным атомной силовой микроскопии
относится к области решения пространственных контактных задач. Контактная жесткость,
которую необходимо вычислить, определяется как отношение силы к вертикальному
перемещению.
2
В условиях, когда острие кантилевера представляет собой конус, довольно просто
определить вертикальное перемещение, а силу рассчитать, зная отклонение кантилевера.
Решение такой контактной задачи, представляющей собой всевозможные модификации
(например, модификация Снеддона [3] контактной задачи Герца [4], дает возможность
вычислить модуль Юнга материала.
Следует отметить, что сечение острия кантилевера чаще всего имеет не строго
коническую форму, а нескольку скругленную на конце. Поэтому определение площади
контакта кантилевера и образца является принципиальным вопросом.
Существует большое количество работ, посвященных исследованию этих вопросов,
однако в одной из первых публикаций по механических характеристикам мышечных
волокон [5] представлены вполне корректные с механической точки зрения формулы для
определения модуля Юнга для различных типов кантилевера:
E=
1 −ν 2 kd
⋅
,
π
φ(δ )
где k – жесткость кантилевера, d – отклонение кантилевера (deflection), ν – коэффициент
Пуассона,
φ(δ )
–
функция,
характеризующая
зависимость
глубины
вдавливания
кантилевера от его геометрических характеристик.
Определение жесткости кантилевера k, в случае, когда поставляемые производителем
зонды имеют диапазон жесткостей, можно проводить либо калибровкой по кантилеверу с
известной жесткостью путем снятия силовых кривых на заведомо жесткой поверхности
(например, на стекле), либо рассчитывать теоретически, по измерениям резонансной частоты
колебаний кантилевера.
Коэффициент Пуассона ν для каждого материала определяется экспериментально. Для
клеток чаще всего используют его значение 0.5. Так, A.B. Mathur et al. [5], считали, что
потери жидкости в исследуемых ими мышечных волокнах и клетках эндотелия
незначительны и, вслед за целым рядом исследователей [6, 7, 8], полагали клетку
несжимаемой и использовали ν = 0.5 . A.M. Collinsworth et al. [9] использовал такое же
значение для определения жесткости С2С12 миобластов мышей.
Для кантилевера, острие которого имеет форму конуса с осью, параллельной оси z,
функцию φ(δ ) можно определить так [5]:
 2tg ( α ) 
φ (δ ) = δ 2  2  ,
 π 
где δ – глубина вдавливания,
α
– половина угла раствора конуса острия кантилевера.
Тогда модуль упругости имеет вид:
3
π (1 −ν 2 ) kd
E=
⋅
,
2tgα δ 2
Для скругленного кантилевера функция φ(δ ) имеет вид так [5]:
2
a2
φ ( δ ) =  aδ −
π
2tgα
3
b
a 2 − b 2 
π
 b  a
2
2
 ,
+ a − b 
+
 − arcsin   −
3R  
 a   3R
2
 2tgα
где R – радиус скругления острия кантилевера, b = R cos α , а – контактный радиус,
определяемый из уравнения:
δ+
a
R
(
)
a2 − b2 − a −
a π
 b 
 − arcsin   = 0 .
tgα  2
 a 
Следует отметить, что для вычислений чаще всего используют последнюю формулу
или ее модификации, полагая форму вертикального сечения острия кантилевера конической.
Например, E. Defranchi et al. [10] в своих исследованиях пользовались следующей формулой:
E=
π (1 − ν 2 ) S
⋅
,
2
A
где S – поперечная жесткость образца, определяемая как тангенс угла наклона силовой
кривой, A – площадь области контакта.
ПОПЕРЕЧНАЯ ЖЕСТКОСТЬ ОДИНОЧНЫХ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН
Довольно сложный объект для трактовки результатов измерений поперечной жесткости
методом атомной силовой микроскопии представляет мышечное волокно, которое можно
рассматривать как составную, механическую конструкцию, в которой передача усилия
осуществляется не только в продольном, но и в поперечном направлении [11]. Большую
часть объема мышечного волокна, представляющего из себя вытянутую в продольном
направлении клеточную структуру, занимает сократительный аппарат, образованный
миофибриллами. В целом, механические характеристики волокна определяются структурнофункциональным взаимодействием трех его составных частей с принципиально различными
механическими свойствами: миофибриллярный аппарат, внесаркомерный цитоскелет
(костамеры) и сарколемма.
В современной литературе представлено относительно небольшое количество работ,
посвященных исследованию поперечной жесткости как целых мышечных волокон, так и
одиночных миофибрилл.
Большинство результатов получено на интактных мышцах
кроликов и мышей различных линий, а также на культурах клеток и частично
дифференцированных миобластах.
Поперечная жесткость нативных мышечных волокон
4
Так, группой авторов во главе с A.B. Mathur et al. [5] были получены одни из первых
данных о механических характеристиках интактных мышечных волокон скелетных и
сердечной мышц в сравнении с клетками эндотелия с использованием АСМ в жидкости.
Основная рабочая гипотеза исследования заключалась в том, что модуль упругости и
вязкость у этих трех типов клеток будут различными из-за различной структуры и
функциональной роли.
Экспериментальными объектами служили волокна сердечной
мышцы кролика, С2С12 миобласты взрослых мышей линии С3Н, и клетки эндотелия
пупочной вены человека (HUVEC). Авторы показали, что модуль упругости эндотелиальных
клеток составлял E=6.8±0.4 кПа в районе ядра, E=3.3±0.2 кПа на теле клетки и E=1.4±0.1 кПа
на краю клетки. В отличие от эндотелия, в сердечной и скелетной мышце систематических
изменений модуля упругости в зависимости от локализации точки контакта кантилевера с
поверхностью обнаружить не удалось. Для клеток сердечной мышцы модуль Юнга составил
E=100.3±10.7 кПа, а для клеток скелетных мышц E=24.7±3.5 кПа. Таким образом, наиболее
жесткими, а, следовательно, устойчивыми к деформации являются волокна сердечной
мышцы, что, по мнению авторов, обусловлено ее постоянной ритмической активностью.
Группа исследователей под руководством C. Reggiani [10] провела эксперименты по
изучению структуры и поперечной жесткости сарколеммы полностью дифференцированных
мышечных волокон в различных условиях. Эксперименты проводили
на мышечных
волокнах скелетных мышц мышей линии CD1 как в культуре, так и высушенных на воздухе.
Для получения информации о структуре сарколеммы авторы использовали полуконтактный
режим, что позволило получить более информативные изображения ввиду отсутствия
повреждающего действия кантилевера на сарколемму. Авторы показали, что на АСМизображениях присутствуют выпуклости сарколеммы и предположили, что они обусловлены
наличием костамера в районе Z-диска. Для доказательства с одним из белков костамера,
альфа-актинином-2, связали флуоресцентные антитела, которые представляют собой сферы
диаметром 500 нм, что позволяет регистрировать их с помощью АСМ. Сопоставив
оптическое и структурное изображение E. Defranchi et al. [10] подтвердили правильность
своей гипотезы. Кроме того, им удалось увидеть открытые Т-трубочки, вытянутые вдоль Zдисков. Измерения механических характеристик осуществляли в контактном режиме,
причем максимальная приложенная сила к мембране волокна составляла 1 нН, а глубина
продавливания варьировала от нескольких сотен до тысячи нм. Значение модуля упругости,
представленное в работе, составляло E=61±5 кПа.
Таким образом, данные группы C. Reggiani [10] о модуле упругости почти в 2.5 раза
превосходят результаты, представленные A.B. Mathur et al [5]. Возможно, это обусловлено
тем, что E. Defranchi et al. [10] использовали в своих исследованиях полностью
5
дифференцированные клетки, а A.B. Mathur et al. [5] – миобласты. Такое различие в
механических характеристиках мышечных волокон на различных стадиях дифференцировки
может свидетельствовать о том, что онтогенетическая динамика экспрессии белков,
формирующих структурную основу поперечной жесткости, неравномерна. Первое, и пока
наиболее представительное исследование этого вопроса провели A.M. Collinsworth et al. [9].
Они изучали механические характеристики мышечных клеток на различных стадиях: от
миоцитов до мышечных волокон и обнаружили существенное увеличение модуля Юнга на
8-ой день после начала дифференцировки. Так, для недифференцированных миобластов
модуль упругости составляет E=11.5±1.3 кПа, а на 8-10-ый день дифференцировки –
E=45.3±4.0 кПа. При этом вязкость, которую оценивали по гистерезису, формируемому при
прямом и обратном ходе кантилевера при снятии силовых кривых, не менялась в ходе
дифференцировки. Предположение авторов о связи изменения модуля упругости и
формированием тубулиновых микротрубочек не нашло подтверждения в экспериментах,
поскольку после обработки колхицином (в концентрации 0.4 мкг/мл в течение 2-х часов) или
таксолом (10 мкМ в течение 2-х часов) модуль Юнга и вязкость мышечных клеток не
изменились. Однако обработка цитохалазином D (в концентрации 3 мкМ в течение 5 – 30
минут) или блеббистатином (в концентрации 50 мМ в течение 5 – 30 минут) приводила к
существенному снижению модуля упругости, не изменяя при этом вязкостные свойства. В
связи с чем, авторы связывают изменение упругих характеристик мышечных клеток в ходе
дифференцировки с развитием актин-миозиновой системы. Следует отметить, что A.M.
Collinsworth et al. [9] не анализировали вклад белков внесаркомерного цитоскелета в
поперечную жесткость мышечных волокон, хотя обработка цитохалазином D могла привести
и к разрушению кортикального слоя актиновых филаментов.
Поперечная жесткость сократительного аппарата мышечных волокон
Сократительный
аппарат
мышечного
волокна
имеет
принципиально
другие
механические свойства, чем сарколемма, соединенная с костамерами, что обусловлено его
иной структурной организацией. Хотя, например, A.M. Collinsworth et al. [9] предполагали,
что основной вклад в поперечную жесткость всего волокна вносят поперечные мостики
между
актиновыми
нитями
и
миозиновыми
филаментами.
Анализ
механических
характеристик миофибриллярных пучков и отдельных миофибрилл в различных условиях
(активное и пассивное сокращение, расслабление) позволяет несколько прояснить этот
вопрос.
Для получения демембранизированных волокон применяют сильные детергенты типа
Triton-X100, которые разрушают не только сарколемму, но и саркоплазматический
6
ретикулум. Отдельные миофибриллы получают из демембранизированных волокон путем
гомогенизации.
L.R. Nyland и D.W. Maughan [12] изучали пучки миофибрилл летательной мышцы
Drosophila в ригорном растворе (без АТФ), активирующем растворе (рСа 4.5) и
в
расслабляющем растворе (рСа 8.0). В качестве метода исследования механических свойств
была выбрана АСМ в контактном режиме с глубиной продавливания 10 нм. Авторы
получили следующие результаты: в ригорном растворе – поперечная жесткость 10.3±5.0
пН/нм, модуль Юнга 94±41 кПа; в активирующем растворе – поперечная жесткость 5.9±3.1
пН/нм, модуль Юнга 55±29 кПа; в расслабляющем растворе – поперечная жесткость 4.4±2.0
пН/нм, модуль Юнга 40±17 кПа. L.R. Nyland и D.W. Maughan [12] связывают такое различие
в жесткости с поперечной «гибкостью» молекулы миозина, подразумевая то, что миозиновые
головки могут находиться под разным углом к актиновой нити, что, следовательно, приведет
к различной поперечной жесткости. Однако следует отметить, что авторы не приводят
информацию о достоверности отличий между полученными значениями поперечной
жесткости и модуля Юнга в различных условиях, но указывают, что в представлении
результатов приведено не стандартное отклонение, а ошибка среднего.
В отличие от L.R. Nyland и D.W. Maughan [12], N. Akiyama et al. [13] изучали структуру
и поперечную жесткость отдельных миофибрилл, выделенных из мышечных волокон
сердечной и скелетной мышц молодых кроликов и новорожденных крыс, а не пучков
миофибрилл. Методика измерения поперечной жесткости была стандартной, глубина
продавливания составляла 25 – 30 нм. Исследования структуры отдельных миофибрилл
показали, что они имеют примерно 1 мкм в диаметре, а длина саркомера составляет около 2
мкм. Измерения поперечной жесткости авторы проводили в расслабляющем и ригорном
растворах, а также исследовали динамику изменения жесткости после обработки
миофибрилл кальпаином и трипсином. Z-линия миофибрилл скелетных мышц в ригорном
растворе составляла 100 нм в ширину и имела жесткость 7.7 пН/нм, а сердечной мышцы –
320 нм и 25.8 пН/нм, соответственно. Жесткость миофибриллы сердечной мышцы в
ригорном растворе в районе М-линии, ширина которой составляла около 200 нм, была
11 пН/нм. В работе не представлены данные о жесткости миофибрилл скелетных мышц в
районе М-линии, поскольку не удалось ее идентифицировать по АСМ-изображению рельефа
поверхности. В расслабляющем растворе жесткость миофибрилл скелетных мышц была
достаточно однородной и составляла в среднем 3 пН/нм, в отличие от миофибрилл
сердечной мышцы, где жесткость менялась в диапазоне 4 – 11 пН/нм. Используя решение
контактной задачи Герца, авторы рассчитали модуль Юнга одиночных миофибрилл, который
составил в состоянии ригора 61 кПа для скелетных мышц и 145 кПа для сердечной мышцы, а
7
в состоянии расслабления – 5 кПа для миофибрилл скелетных мышц и 61 кПа – для
сердечной мышцы. С целью выявления механизмов, обуславливающих такие значения
поперечной жесткости, авторы обработали миофибриллы в состоянии ригора сначала
кальпаином, а затем трипсином. При действии кальпаина поперечная жесткость миофибрилл
сердечной мышцы в районе Z-линии очень быстро (2 – 3 мин) падала с 21 пН/нм до 11
пН/нм, а для скелетной мышцы – до 2 пН/нм и в дальнейшем не менялась. Через несколько
минут после обработки трипсином, поперечная жесткость Z-линии миофибрилл скелетной
мышцы составляла 3 пН/нм, а сердечной мышцы – 12 пН/нм, но затем продолжала падать и
достигала значения 5 пН/нм. Авторы связывают такую динамику изменения поперечной
жесткости с тем, что кальпаин достаточно быстро разрушает два основных структурных
белка Z-диска – альфа-актинин-2 и титин, причем для скелетных миофибрилл это
происходит существенно быстрее, чем для сердечных. В отличие от кальпаина, трипсин
сначала расщепляет титин, а альфа-актинин-2 подвергается деградации значительно
медленнее.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В целом, проблема измерения поперечной жесткости одиночных мышечных волокон
представляет интерес, поскольку рассматриваемые в современной литературе методические
подходы, в частности, атомная силовая микроскопия, позволяют вычленить вклад этого
параметра в жесткость волокна в целом. Рассмотренный метод измерения дает возможность
получить данные о механике только поперечных структур, практически исключив вклад
продольной жесткости. Для полного представления о механических характеристиках
трехмерного волокна необходимо знать, вообще говоря, три составляющих жесткости,
однако
трансверсальная
изотропность
позволяет
ограничиться
двумя
для
полной
характеристики механических возможностей волокна. Подобный подход позволяет
приблизиться к механизмам формирования структурной основы жесткости мышечных
волокон и ее регуляции.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Carl Ph., Schillers H. Elasticity measurement of living cells with atomic force microscope:
data acquisition and processing. Pflugers Arch. 2008. Vol. 457. P. 551 – 559.
2.
Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Нижний Новгород,
Техносфера, 2004. – 143 с.
8
3.
Sneddon I.N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq
problem for a punch of arbitrary profile. Int. J. Eng. Sci. 1965. Vol. 3. P. 47 – 57.
4.
Hertz H. Ueber die Beruhrung fester alastischer Korper. J. Reine Angew Mathematik. 1882.
Vol. 92. P. 156 – 171.
5.
Mathur A.B., Collinsworth A.M., Reichert W.M., Kraus W.E., Truskey G.A. Endothelial,
cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as
determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 2001. Vol. 34. Р. 1545 –
1553.
6.
Weisenhorn A.L., Khorsandi M., Kasas S., Gotzos V., Butt H.J. Deformation and height
anomaly of soft surfaces studied with an AFM. Nanotechnology. 1993. Vol. 4. P. 106 – 113.
7.
Radmacher M., Fritz M., Kacher C.M., Cleveland J.P., Hansma
P.K. Measuring the
viscoelastic properties of human platelets with atomic force microscope. Biophysical Journal.
1996. Vol. 70. P. 556 – 557.
8.
Shin D., Athanasiou K. Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties. Journal
of Orthopaedic Research. 1999. Vol. 17. P. 880 – 890.
9.
Collinsworth A.M., Zhang S., Kraus W.E., Truskey G.A. Apparent elastic modulus and
hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. Am J. Physiol Cell Physiology.
2002. Vol. 283. P. 1219 – 1227.
10.
Defranchi E., Bonaccurso E., Tedesco M., Canato M., Pavan E., Raiteri R., Reggiani C.
Imaging and elasticity measurements of the sarcolemma of fully differentiated skeletal muscle
fibres. Microscopy Research and Technique. 2005. Vol. 67. P. 27 – 35.
11.
Bloch R.J., Gonzalez-Serratos H. Lateral force transmission across costameres in skeletal
muscle. Exercise and sport sciences reviews. 2003. Vol. 31. P. 73 – 78.
12.
Nyland L.R., Maughan D.W. Morphology and transverse stiffness of Drosophila myofibrils
measured by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 2000. Vol. 78. P. 1490 – 1497.
13.
Akiyama N., Ohnuki Y., Kunioka Y., Saeki Y., Yamada T. Transverse stiffness of myofibrils
of skeletal and cardiac muscles studied by atomic force microscopy. J. Physiol. Sci. 2006.
Vol. 56. P. 145 – 151.
9