На правах рукописи КЕЛЛЭТ ЕЛЕНА ПАВЛОВНА

Реклама
На правах рукописи
КЕЛЛЭТ
ЕЛЕНА ПАВЛОВНА
ОСОБЕННОСТИ КЛИНИКИ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
НАРУШЕНИЯ У СУПРУЖЕСКИХ ПАР С БЕСПЛОДИЕМ НЕЯСНОГО
ГЕНЕЗА
14.01.01. - акушерство и гинекология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2011
Работа выполнена в 1-ом гинекологическом отделении
клинической
иммунологии
ФГУ
«Научный
и лаборатории
центр
акушерства,
гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Минздравсоцразвития
России».
Научные руководители:
доктор медицинских наук
Ирина Евгеньевна Корнеева
доктор медицинских наук
Анна Владимировна Шуршалина
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор
Клара Георгиевна Серебренникова
доктор медицинских наук,
профессор
Ольга Федоровна Серова
Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский Университет Дружбы
Народов
Защита диссертации состоится «___»____________ 20___ года на заседании
диссертационного совета Д208.125.01 при ФГБУ «Научный центр акушерства,
гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздразсоцразвития
России.
Адрес: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр
акушерства,
гинекологии
и
перинатологии
им.
В.И.
Кулакова»
Минздравсоцразвития России.
Автореферат разослан «___»____________ 20__ года.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук
Е.А. Калинина
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Среди множества форм бесплодия, согласно классификации ВОЗ,
выделено бесплодие неясного генеза или идиопатическое, когда супружеская
пара неспособна к зачатию, однако, современные методы обследования не
выявляют причины нарушения фертильности. В структуре бесплодного брака
его частота колеблется от 10 до 30%.
Критериями диагностики бесплодия неясного генеза являются фертильная
сперма мужа, овуляторная концентрация прогестерона в середине лютеиновой
фазы, подтвержденная проходимость маточных труб, нормальный уровень ФСГ
в сыворотке крови и отсутствие патологии со стороны органов малого таза
[Кулакова В.И., 2002, Bhattacharya S., 2007, Nakagawa K., 2007].
Этиология
БНГ до конца не изучена. Основными направлениями в
исследовании причин БНГ за последние несколько лет явились - изучение роли
иммунологических, генетических факторов, состояние овариального резерва.
Особое внимание уделяют морфофункциональным изменениям в эндометрии
как возможной причине нарушения процесса имплантации у данной группы
больных [Luborsky J., 2000, Bockos M., 2002, Balasch J., 2002, Putowski L.,
2004, Carp H., 2007].
Изучается влияние иммунологических факторов на репродуктивный
процесс.
Исследователи отмечают, что иммунные нарушения могут быть
вовлечены в патогенез бесплодия неясного генеза и вызывать нарушения
имплантации эмбриона [Luborsky J., 2000, Balasch J., 2002]. Обсуждается
необходимость комплексной оценки состояния иммунной системы у пациенток.
В последние полтора десятилетия было установлено, что в некоторых
случаях бесплодие связано с повышенной степенью гистосовместимости
супругов по антигенам HLA [Серова Л.Д., 1997, Хаитов Р.М., 2001, Болдырева
М.Н., 2010]. Накопилось много фактов о роли
имеющих
непосредственную
связь
с
аутоиммунных процессов,
системой
HLA
в
нарушении
репродуктивной функции. Не вызывает сомнения, что дальнейшее изучение
3
этой проблемы позволит более точно определить значимость и роль
совместимости супругов по системе НLA не только при невынашивании
беременности, но и у пар с бесплодием неясного генеза.
В настоящее время требуют детального описания и анализа механизмы,
связанные
генеза.
с дефектами
имплантации у пациенток с бесплодием неясного
На данном этапе развития медицины интерес исследователей
сконцентрирован
на
изучении
оптимальную восприимчивость
окна,
отдельных
факторов,
обеспечивающих
эндометрия в период «имплантационного»
нарушение которой может явиться причиной
Изучается роль местных регуляторных факторов
бесплодия у женщин.
в процессе
созревания
эндометрия на протяжении менструального цикла и имплантации [Glasser S.R.
et al., 2002, Klentzeris L.D. et al., 2007].
Таким
образом,
на
современном
этапе
развития
репродуктивных
технологий актуальным является дальнейший поиск новых подходов к
выяснению этиопатогенеза бесплодия неясного генеза.
Вышеизложенное определило цель настоящего исследования:
оптимизация реализации репродуктивной функции у супружеских пар с
бесплодием
неясного
генеза
на
основании
совершенствования
диагностического алгоритма.
Для достижения поставленной цели были сформулированные следующие
задачи исследования:
1.
Определить
частоту
бесплодия
неясного
генеза.
Дать
клинико-
лабораторную характеристику женщин с бесплодием неясного генеза.
2.
Изучить состояние системного иммунитета у пациенток с бесплодием
неясного генеза и проанализировать особенности аутоиммунных нарушений
путем выявления частоты встречаемости антител к фосфолипидам клеточных
мембран и щитовидной железе.
3.
Провести оценку совместимости супругов по антигенам системы HLA I
и II классов.
4
Оценить иммуноморфологические параметры эндометрия по изучению
4.
содержания экспрессии маркеров рецептивности, воспаления, ангиогенеза и
апоптоза клеток в ткани эндометрия.
Научная новизна
В результате проведенного исследования определены и проанализированы
особенности
состояния
репродуктивной
системы
у
женщин
с
Проанализирована активность аутоиммунных системных процессов.
результате проведенных исследований
БНГ.
В
установлено, что показатели
иммунного статуса оцененного на основании фенотипической характеристики
субпопуляций лимфоцитов в периферической крови и количественного
определения иммуноглобулинов не демонстрируют каких-либо отличительных
особенностей от популяционных данных, в то время как системные
аутоиммунные нарушения сопровождают БНГ более чем у 40% женщин.
Проведен анализ встречаемости антигенов системы HLA I и II классов у
супружеских пар обследуемой группы. Выявлены маркеры, ассоциированные с
аутоиммунными процессами: в I классе - антиген А2; во II классе - аллели 01 и
04 локуса DRB1 и аллели 0201 и 0602-8 локуса DQB1. Установлена высокая
частота (60%) совместимости по 3 и более антигенам системы HLA у супругов с
БНГ.
Произведена оценка функционального состояния эндометрия в период
«имплантационного окна». Впервые
у женщин с БНГ изучена экспрессия
маркеров LIF, IL-1, VEGF, CAS, принимающих ключевое участие в процессе
имплантации. Выявлено, что морфологически неизмененный эндометрий не
обладает полноценной функциональной активностью, способной в полной мере
обеспечить имплантацию за счет нарушения процессов рецептивности,
ангиогенеза, апоптоза.
5
Практическая значимость работы
В ходе работы определены особенности состояния репродуктивной
системы и диагностические критерии бесплодия неясного генеза у женщин.
Это позволило предложить
расширенный алгоритм обследования для
супружеских пар с бесплодием неясного генеза на этапе подготовки к
проведению программы ЭКО и ПЭ.
Предложен скрининг маркеров аутоиммунных нарушений, обосновано
включение в алгоритм обследования выявление гистосовместимости супругов
по системе HLA и необходимость оценки функциональной полноценности
эндометрия
в
период
«имплантационного
окна»
по
результатам
иммуногистохимического исследования экспрессии маркеров рецептивности,
воспаления, ангиогенеза, апоптоза.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
1.
Женщины
сохраненной
с
бесплодием
функциональной
неясного
активностью
генеза
характеризуются
гипоталамо-гипофизарно-
яичниковой системы, нормальными параметрами овариального резерва и
отсутствием патологических изменений со стороны органов малого таза на
фоне неизмененных пролиферативно-секреторных процессов в эндометрии.
2.
Бесплодие неясного генеза ассоциировано с
аллоиммунными и
аутоиммунными нарушениями. Факторами, оказывающими негативное влияние
на
функциональное
состояние
репродуктивной
системы,
являются
совместимость по антигенам системы HLA у 60% супружеских пар, а также
повышенный уровень антител к щитовидной железе у 47,5% женщин, антител
к фосфолипидам клеточных мембран - у 42,5% пациенток.
3.
Особенности морфофункционального состояния эндометрия у женщин
с бесплодием неясного генеза заключаются в изменении его рецептивности в
период «имплантационного окна», что проявляется нарушением экспрессии
маркеров имплантации - LIF, IL-1, VEGF, CAS
на фоне
полноценных
пролиферативно-секреторных процессов.
6
Апробация работы
Основные положения диссертации и результаты работы доложены на
межклинической конференции 1-го гинекологического отделения ФГУ «НЦ
АГ и П им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России 31 марта 2011г.
Работа обсуждена на заседании апробационной комиссии ФГУ «НЦ АГ и П им.
В.И. Кулакова» Минздрасоцразвития России 16 мая 2011г.
Внедрение результатов исследования в практику
Полученные
результаты
внедрены
в
практику
работы
1-го
гинекологического отделения ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии
и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России. По теме
диссертации опубликовано 4 печатные работы, в т.ч. 3 статьи в ведущих
рецензируемых научных журналах, определенных ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста, состоит из
введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы.
Работа содержит 26 таблиц, 12 рисунков. Библиографический указатель
включает в себя 143 источника, из них 35 отечественных и 108 иностранных
авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Основу
работы
составили
результаты
комплексного
клинико-
лабораторного и эндоскопического обследования 940 женщин с бесплодием,
обратившихся в 1-ое гинекологическое отделение
ФГУ «НЦ АГ и П им.
В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России для лечения.
На первом этапе исследования проведен ретроспективный анализ 900
историй
болезни,
результаты
которого
позволили
определить
частоту
бесплодия неясного генеза по данным обращаемости в специализированный
гинекологический стационар.
7
На втором, проспективном этапе в соответствии с поставленными задачами
было обследовано 40 пациенток с бесплодием неясного генеза, составивших
основную группу исследования.
Критериями включения в исследование являлись: возраст женщин до 35
лет, овуляторный менструальный цикл, отсутствие патологических изменений
органов малого таза по данным эндоскопического обследования у женщин
(кроме: НГЭ 1 степени, спаечного процесса в малом тазу 1 степени
распространения, миомы матки малых размеров - до 2 см субсерозной
локализации), нормальная морфологическая картина эндометрия, фертильная
сперма мужа.
Контрольную группу
для иммуногистохимического исследования
эндометрия составили 10 здоровых фертильных женщин репродуктивного
возраста, которые не имели гинекологических заболеваний, а также не
использовали внутриматочные и гормональные методы контрацепции.
Для диагностики причин бесплодия проведены следующие методы
исследования:
1.
Общеклиническое и гинекологическое обследование;
2.
Клинико-психологическое обследование;
3.
Инфекционный скрининг: микроскопия вагинального мазка, окрашенного
по Грамму, исследование мазков-отпечатков клеток цилиндрического эпителия
цервикального канала для выявления ДНК урогенитальных хламидий,
микоплазм, вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ- 2), цитомегаловируса (ЦМВ)
с использованием наборов реагентов «ДНК-технологии» (Москва);
4.
Гормональный скрининг: определение концентрации ПРЛ, ФСГ, ЛГ, Е2,
тестостерона, ДГЭА-сульфата, прогестерона, ТТГ, Т4св в плазме крови
производили радиоиммуннологическими методами;
5.
Оценка сперматогенеза супруга проводилась врачом-андрологом на
основании результатов расширенной спермограммы, MAR-теста.
6.
УЗИ органов малого таза проводили на аппарате «Siemens Sonoline-Siena»
(Германия) с использованием вагинального датчика 6,5 мгц
на 5-7 дни
8
менструального цикла. УЗИ щитовидной железы проводилось при помощи
аппарата «Hitachi EUB-405 plus» с линейным датчиком 7,5 МГц.
7.
Овуляторный характер менструального цикла подтверждали с помощью
эхографии органов малого таза и определения концентрации прогестерона в
плазме крови на 5-7 дни после овуляции;
8.
Иммунологические методы:
-
определение уровней аутоантител к ткани щитовидной железы - к
тиреопероксидазе
(АТ-ТПО) и тиреоглобулину (АТ-ТГ). Исследование
осуществляли иммуноферментными методами, набором «Roche diagnostics»
(Германия);
-
определение уровней антител к кардиолипину, фосфатидилсерину,
кофакторам: β2-гликопротеину, протромбину, аннексину V производилась
методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческих
наборов
фирмы
ORGENTEC
Diagnostika
GmbH
(Германия)
для
количественного определения уровней антител классов IgG, IgM;
-
фенотипическая характеристика клеток иммунной системы проводилась
методом проточной цитофлуометрии с применением моноклональных антител к
кластерам дифференцировки CD3, CD4, CD8, CD19, CD19CD5, CD56,
CD16CD56 на анализаторе Collibur (Германия);
-
концентрацию иммуноглобулинов трех основных классов (G,M,A)
определяли в периферической крови методом радиальной иммунодиффузии по
Манчини;
9. Иммуногенетические методы:
-
исследование антигенов HLA I класса (А, В, С)
проводилось на
лимфоцитах периферической крови путем использования стандартного метода
«комплементзависимой цитотоксичности», разработанного П. Терасаки (1991).
Определение антигенов HLA II класса проводилось методом ПЦР –
типирование локусов DRB1, DQB1, DQA1.
11. Эндоскопические:
лапаро- и
гистероскопию с использованием
оборудования фирмы «K.Storz» (Германия)
выполняли на 7- 11 день
менструального цикла;
9
12. Морфологическое исследование соскобов полости матки и цервикального
канала производили на 7-11 день менструального цикла путем раздельного
диагностического выскабливания;
13. Иммуногистохимическое исследование ткани эндометрия проводили в
секреторную фазу менструального цикла на 6-8 день после овуляции.
Исследовали экспрессию маркеров рецептивности (LIF), воспаления (IL-1),
ангиогенеза (VEGF), апоптоза (CAS). Материал для исследования забирали
путем
аспирационной биопсии эндометрия с помощью кюретки Pipelle de
Cornie.
14. Статистическая обработка данных
выполнена на индивидуальном
компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета
прикладных программ «Statistica for Windows» v. 7.0,
StatSoft Inc. Для
непараметрических данных применяли попарное сравнение
с помощью
критерия Манна-Уитни (для 2-х групп) для несвязанных совокупностей.
Статистически
значимыми считали отличия при
р<0,05 (95%-й уровень
значимости).
Исследования
одобрены
комитетом
по
этике
биомедицинских
исследований при ФГУ «НЦ АГ и П им.В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития
России.
Результаты исследования и их обсуждения
В соответствии с поставленной целью и задачами исследования
определения
частоты
БНГ
на
первом
этапе
работы
мы
для
провели
ретроспективный анализ историй болезни 900 женщин с бесплодием. Диагноз
«бесплодие неясного генеза» был установлен у 127 женщин. Таким образом,
частота
данной
формы
бесплодия
по
данным
обращаемости
в
специализированный гинекологический стационар составила 14,1%.
Возраст пациенток колебался от 24 до 35 лет и составил в среднем
29,7±4,14 лет.
Анамнез женщин с бесплодием неясного генеза, касающийся перенесенных
хронических соматических заболеваний не отличался от пациенток с другими
10
формами
бесплодия,
подробно
охарактеризованными
в
различных
исследованиях [Шуршалина А.В., 2007, Перминова С.Г., 2010]. Однако обращал
внимание тот факт, что 20% из них указали на ранее перенесенные травмы
головы, а 15% - на прием наркотических препаратов в подростковом возрасте.
Характерными особенностями анамнестических данных женщин с БНГ
являлись частые ИППП и воспалительные заболевания половых органов. В
структуре ИППП преобладал хламидиоз (50%), почти в 2 раза реже встречался
рецидивирующий генитальный герпес (22,5%), в 3 раза реже – трихомониаз
(17,5%).
При
анализе
превалирование
особенностей
частоты
репродуктивной
первичного
бесплодия
функции
(77,5%).
отмечено
Длительность
бесплодия составила в среднем 4,13±2,41 года.
Предшествующее
неэффективное
лечение
по
поводу
бесплодия,
включающее проведение КИО и программы ЭКО было ранее проведено у
каждой второй женщины.
Результаты
гормонального
скрининга
продемонстрировали,
что
концентрация ПРЛ, гонадотропных и стероидных гормонов в плазме крови у
женщин с БНГ соответствовала нормативным показателям. Средние значение
уровня прогестерона в середине лютеиновой фазы составили
43,8 ± 35,8
нмоль/л и указывали на сохранение процесса овуляции у всех обследованных
женщин.
По данным УЗИ органом малого таза, проведенного всем 40 пациенткам
изучаемой группы, патологических изменений половых органов ни у кого не
выявлено за исключением
4 пациенток (10%), у которых в миометрии
визуализировалось по одному субсерозному миоматозному узлу диаметром - до
1,5см. Миометрий остальных женщин имел обычную эхо-структуру. Толщина
эндометрия соответствовали дню менструального цикла.
Оценке овариального резерва женщин с БНГ уделяют
все большее
внимание. Для этой цели в настоящем исследовании мы использовали такие
общепринятые критерии как: уровень ФСГ, АМГ, объем яичников и число
11
антральных фолликулов. Многие исследователи считают, что женщины с БНГ
возможно имеют сниженный овариальный резерв, и это может являться первым
признаком недостаточности яичников. Однако, мы не обнаружили изменений
параметров овариального резерва. Объем правого яичника у женщин изучаемой
группы составил 9,2±3,4 см³, объем левого яичника - 8,3±3,1см³. Число
антральных фолликулов в правом и левом яичниках составило 8,8±1,54 и
8,4±1,8 соответственно. Полученные нами данные свидетельствовали о
достаточном репродуктивном потенциале яичников.
Лапароскопия
является
общепринятым
стандартом
диагностики
патологических изменений органов малого таза, способных приводить к
бесплодию. С целью оценки состояния органов малого таза всем 40 пациенткам
обследуемой группы ранее была произведена диагностическая лапароскопия
и гистероскопия с патоморфологическим исследованием эндометрия. Анализ
результатов диагностической лапароскопии показал, что у подавляющей части
женщин - 55% патологии со стороны органов малого таза не было выявлено.
Спаечный процесс в малом тазу I стадии распространения при сохраненной
проходимости
маточных
труб
диагностирован
у
12,5%
пациенток.
Исследователи полагают, что поверхностные формы наружного генитального
эндометриоза без сопутствующих спаек в брюшной полости и миомы матки
малых
размеров
не
являются единственной
причиной
нарушения
репродуктивной функции [Akande U.A. et al., 2004, Nakagawa K. et al., 2007]. В
нашем
исследовании в ходе проведения эндоскопического обследования
наружный генитальный эндометриоз I ст. был обнаружен у 22,5% женщин,
cубсерозная миома матки диаметром до 1,5см у 10%.
Патология полости матки и эндометрия была исключена у всех женщин
обследуемой группы на основании данных гистероскопии и морфологического
исследования эндометрия.
За последние годы накоплено большое число данных, свидетельствующих
об участии психосоциальных факторов в возникновении и развитии бесплодия
[Кочерганов П.Н., 2006]. На фоне патогенетических факторов
нарушения
репродуктивной функции, как правило, выявляют нарушения эмоциональной
12
сферы. Принимая во внимание не только данные литературы, но и указания
20% пациенток на травмы головы различной степени тяжести, а 15% женщин
на
прием
сильнодействующих
препаратов
в
подростковом
возрасте,
проведение данного этапа работы представлялось вполне обоснованным.
Совместно с психотерапевтом нами было выделено четыре синдромальных
типа пограничных расстройств у женщин с бесплодием неясного генеза:
тревожно-депрессивный, выявленный у 7 пациенток (17,5%), фобический - у
10 (25%), истерический – у 8 (20%) и неврастенический - у 15 (37,5%) женщин.
Показатель психосоциального стресса, изученный на основании оценочной
шкалы Л.Ридера, продемострировал, что 22 женщины (62,5%) из 40 с БНГ
имели высокий уровень психосоциального стресса (от 2,18 до 3 баллов).
Огромный интерес представляет роль иммунных и иммуногенетических
нарушений в патофизиологии бесплодия неясного генеза. В связи с этим в
литературе
обсуждается
влияние
иммунологических
факторов
на
репродуктивный процесс [Сhoudhury S.R., 2000; Putowski L., 2004]. Согласно
теории
RAFS (Reproductive Autoimmune Failure Syndrome) «синдрома
системных аутоиммунных репродуктивных потерь», аутоиммунные факторы
могут приводить к дефектам репродуктивного процесса на различных стадиях
[Gleicher N., 1988].
При
изучении
патогенетических
механизмов
БНГ
исследователи
рекомендуют все больше обращать внимание на изучение функции щитовидной
железы у данного контингента женщин. Известно, что аутоиммунные
заболевания щитовидной железы могут сопровождаться аутоиммунным
поражением других систем организма, в том числе и репродуктивной системы
[Роррe K., 2008, Перминова С.Г., 2010]. Чаще всего определяют наличие
антител к тиреглобулину (АТ-ТГ) и тиреоидной пероксидазе (АТ-ТПО),
наиболее информативно определение титра последних,
изолированное
носительство АТ-ТГ наблюдается редко и имеет меньшее диагностическое
значение. Значение ТТГ у обследованных нами пациенток варьировало от 0,5
до 3,7
МЕ/мл, составило в среднем 1,64±0,9
МЕ/мл и не превышало
13
нормативных показателей.
Таким образом, результаты оценки тиреоидного
статуса указали на сохранение функции щитовидной железы у всех пациенток
изучаемой группы.
Обращали особое внимание высокие титры АТ-ТГ и АТ-ТПО. Средний
уровень АТ-ТГ находился в пределах 125,7±309,3 МЕ/мл и колебался от 12,6
МЕ/мл до 1000 Ме/мл, а уровень АТ-ТПО составил 107,7±157,2 МЕ/мл и
варьировал от 8,2 МЕ/мл до 542 МЕ/мл. Повышенный уровень АТ- антител
выявлен у 19 (47,5%) из 40 женщин. Носительство АТ-ТПО имели
30%
пациенток, АТ-ТГ - 17,5%. УЗИ щитовидной железы было произведено 19
пациенткам с повышенным уровнем АТ-антител. При этом нормальную
эхографическую характеристику щитовидной железы имели 11 (57,9%) из 19
женщин. УЗ признаки аутоиммунного тиреоидита в виде снижения эхогенности
ткани,
диффузной неоднородности структуры щитовидной железы были
выявлены у 8 женщин (42,1%). Объем щитовидной железы у всех 19 пациенток
составил в среднем 8,3±1,1см³ и не превышал нормативных значений.
Полученные
нами
результаты
корреспондируют
с
аналогичными
исследованиям других авторов о том, что у женщин с БНГ отмечена высокая
распространенность антител к щитовидной железе. Данные антитела являются
маркерами дефекта иммунной системы, проявляющегося
на системном
уровне, и могут являться важным прогностическим признаком репродуктивных
потерь.
До настоящего времени остаются нерешенными вопросы о зависимости
между циркуляцией антифосфолипидных антител и ранними репродуктивными
потерями, однако большинство авторов cклоняются к мнению о том, что
повышение уровня последних может быть связано с репродуктивными
нарушениями и быть частью генерализованных аутоиммунных нарушений.
[Сhoudhury S.R., 2001; Bockos M., 2002]. В проведенном нами исследовании у
17 женщин (42,5%) с БНГ
присутствовали антитела к фосфолипидам
клеточных мембран, что существенно превышало популяционные значения,
соответствующие 2-4% [Макаров О.В., 2001]. По полученным нами данным,
14
повышенный уровень антител к фосфатидилсерину класса G и M выявлен у 3
женщин (7,5%) и 7 (17,5%) соответственно. Антитела к кардиолипину класса G
были выявлены у 10 пациенток (25%), к кардиолипину класса M - у 7 (17,5%).
Антитела к протромбину были обнаружены только у 3 пациенток, причем во
всех случаях выявлен повышенный уровень IgG. Уровень IgG к β2гликопротеину был увеличен у 4 (10%) пациенток, IgM у 5 (12,5%) пациенток.
Повышенный уровень антител к аннексину классов G и M отмечался у 2(5%) и
1(2,5%) пациенток соответственно. Волчаночный антикоагулянт не был
выявлен ни у одной пациентки.
Таким образом, анализ данных литературы о частоте встречаемости
антител к щитовидной железе и
фосфолипидов клеточных мембран у
пациенток с БНГ свидетельствует в пользу теории RAFS-синдрома о
существовании системных иммунных нарушений, препятствующих успешной
реализации их репродуктивной функции.
При изучении состояния системного иммунитета у пациенток с бесплодием
неясного генеза, оцененного на основании
фенотипической характеристики
субпопуляций лимфоцитов в периферической крови и количественного
определения
иммуноглобулинов
не
имел
каких
либо
отличительных
особенностей по сравнению с нормативными показателями.
В настоящее время
существуют данные о роли
системы
HLA в
нарушении репродуктивной функции [Болдырева М.Н., 2007]. Установлено,
что 70% причин репродуктивных неудач неустановленного генеза могут быть
ассоциированы с аутоиммунными нарушениями как у мужчин, так и у женщин
[Болдырева М.Н., 2010]. В нашем исследовании мы провели анализ частоты
встречаемости генов системы HLA I и II классов.
Показано, что антигены HLA I класса – А2, А10, В15, В18, В40, В41
могут
рассматриваться
как
иммуногенетические
невынашивания неясного генеза [Салбиева Н.Б.,
маркеры
2002]. Анализ
привычного
антигенов
системы HLA I класса в данном исследовании продемонстрировал высокую
частоту встречаемости антигена А2. Носителями этого антигена являлись 85%
15
женщин и 50% мужчин. Таким образом,
мы можем предположить, что
превалирующая часть супружеских пар имеет «маркерный» антиген иммунных
нарушений.
Одними из главных генов, для которых установлена выраженная связь с
развитием аутоиммунной патологией, являются гены HLA класса II, а именно
генотип DRB1 и его локусы
- 03 и
- 04. Также в
качестве маркеров
предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям следует выделить локусы
генотипа DRB1 - 01,- 08,- 09 и – 10. При анализе частоты встречаемости
аллелей системы HLA II класса мы обнаружили, что по локусу DRB1 наиболее
частыми у 40% женщин явились
аллель 01 и аллель 04.
Некоторые
исследователи рассматривают генотип DQB1, в частности аллели 0201 и 0602-8,
ассоциированные с развитием системной красной волчанки и с высоким
генетическим
риском
невынашивания
беременности
как
маркеры
аутоиммунных нарушений, ведущих к развитию этих заболеваний [Болдырева
М.Н., 2007].
В нашей работе, в локусе DQB1 самым частым как у женщин, так и у
мужчин являлся аллель 0602-8 –
половины женщин
62,5% и 50%
встречался аллель 0201.
соответственно. Также у
Представленные данные
показывают, что в генотипе DRB1 и DQB1 у супружеских пар с БНГ
присутствуют антигены, ответственные за развитие аутоиммунных процессов.
Таким образом, связь определенных «маркерных» вариантов генов системы
HLA с развитием аутоиммунных процессов, очевидно, играет определенную
роль в нарушении репродуктивной функции у супружеских пар с БНГ.
Согласно данным литературы последних лет причиной иммунного
бесплодия может являться низкий иммунный ответ на аллоантигены партнера
из-за сходства по отдельным HLA-локусам. По данным многочисленных
исследований, полное несовпадение НLA-генотипов у супругов благоприятно
для развития беременности. Совместимость по HLA регистрируется довольно
часто, но лишь сходство более 25% расценивается как неблагоприятный фактор
в плане наступления беременности [Серова Л.Д., 1997]. Мы также выявили у
16
супружеских пар совместимости по I и II классам. Согласно полученным в ходе
нашей работы данным у 24 супружеских пар (60%) отмечена совместимость по
обоим классам системы HLA. Общее количество супружеских пар, имеющих 2
совпадения по двум классам – 16 (40%). Из них в I классе системы HLA 2
совпадения имели 8 супружеских пар (20%), столько же пар имело 2 совпадения
и во II классе. Общее количество пар, имеющих 3 и более совпадений по двум
классам системы HLA – 24 (60%). Их них в I классе 3 и более совпадений имели
4 супружеские пары (10%), во II классе – 12 (30%). Таким образом, исходя из
представленных данных, сходство по 3 и более HLA-локусам у супружеских
пар можно расценивать как неблагоприятный фактор для наступления
беременности при БНГ.
Крайне важным являлась оценка состояния эндометрия у пациенток с
бесплодием неясного генеза с целью выявления возможных механизмов
нарушения имплантации. Нами было проведено морфологическое
иммуногистохимическое исследование эндометрия женщин
и
в период «окна
имплантации». При световой микроскопии срезов эндометрия, окрашенных
гематоксилином эозином, ни в одном из случаев не было выявлено признаков
хронического эндометрита. Иммуногистохимическое исследование эндометрия
проведено в период «окна имплантации» на 6-8 день после овуляции
с
использованием маркеров рецептивности, воспаления, апоптоза, ангиогенеза.
С целью оценки рецептивности эндометрия в исследовании применяли
маркер
рецептивности
–
LIF
(лейкемия-ингибирующий
фактор).
Этот
важнейший модулятор имплантации, оказывая прямое воздействие на
трофобластную дифференцировку, опосредует установление «диалога» между
эндометрием и эмбрионом.
Установлено, что максимальная экспрессия LIF
в эпителии эндометрия отмечается в период «окна имплантации» [Simon C. et
al., 2001], что позволяет
отнести этот фактор к биохимическому маркеру
рецептивности эндометрия [Lapre-Delage G. et al., 2002].
В данном исследовании у женщин с БНГ экспрессия LIF в эпителии была
снижена и составила
2,5 ± 1,0 баллов, что достоверно отличалась от
17
показателей в группе
контроля 3,5±1,07 баллов (p<0,05). В пиноподиях
экспрессия маркера также была со статистически значимой разницей
относительно группы контроля и составила 2,0±1,8 баллов и 5,2±0,8 баллов
(p<0,05) соответственно. В строме эндометрия
достоверной
разницы в
экспрессии LIF между группами не было, но при этом в основной группе
экспрессия маркера была ниже показателей группы контроля и составляла
3,13±0,8 баллов и 3,8±1,0 баллов соответственно (рис.1).
6
4
основная группа
2
контроль
0
эпителий
р<0,05
пиноподии
р<0,05
строма
Рис.1 Экспрессия маркера LIF в эндометрии (в баллах)
Таким образом, сниженная экспрессия LIF в эндометрии у женщин с БНГ
может свидетельствовать о нарушении рецептивности ткани эндометрия и
являться
важным
прогностическим
маркером
нарушений
процессов
имплантации на этапе «диалога» между эндометрием и эмбрионом.
Рецептивность эндометрия при иммуногистохимическом исследовании
также оценивали по экспрессии маркера воспаления - провоспалительного
цитокина IL-1 (интерлейкин-1). Это ключевой регулятор воспалительного
ответа. Он является паракринным фактором, который также опосредует связь
между эндометрием и эмбрионом в период имплантации [Boucher A., et al.,
2001; Castro-Rendon W.A., et al., 2006].
Анализ полученных нами данных выявил статистические различия по
сравнению с группой контроля. Так, экспрессия IL-1 в эпителии эндометрия
женщин основной группы была существенно ниже, чем в группе контроля и
составила 1,59±0,9 баллов и 4,9±0,9 баллов (р<0,05)
соответственно. В
пиноподиях экспрессия IL-1 в основной группе была также
достоверно
снижена по сравнению с контрольной и составила 1,2±1,3 баллов и 5,7±0,9
баллов соответственно (р<0,05). В строме эндометрия отмечено статистически
18
значимое снижение экспрессии маркера IL-1 до 2,4±1,7 баллов относительно
группы контроля (3,7±0,9 баллов, р<0,05) (рис.2).
6
4
2
основная группа
0
контроль
эпителий
р<0,05
пиноподии
р<005
строма
р<0,05
Рис.2 Экспрессия маркера IL-1 в эндометрии (в баллах)
Таким образом, экспрессия провоспалительного цитокина IL-1,
была
значительно снижена в эпителии эндометрия, пиноподиях и строме у женщин с
БНГ, что также может явиться одним из факторов, приводящим к нарушению
эндометриальной рецепции, и как следствие - нарушение имплантации.
Процесс ангиогенеза в эндометрии оценивали по экспрессии маркера VEGF
(сосудисто-эндотелиальный фактор роста).
Ангиогенез - важный процесс
физиологического моделирования, необходимый для создания состояния
рецептивности. Изменение процессов ангиогенеза в эндометрии может
привести к неадекватной циклической трансформации эндометрия, нарушению
имплантации [Torry D.S., 2007].
Результаты оценки процесса ангиогенеза на основании маркера VEGF в
проведенном
нами
исследовании
экспрессии в основной группе
свидетельствовали
о
его
сниженной
относительно группы контроля. В эпителии
эндометрия женщин с БНГ отмечены статистически значимые различия по
сравнению с группой контроля – 0,14±0,3 баллов и 0,56±0,4 баллов
соответственно (р<0,05). В пиноподиях основной группы экспрессия VEGF
также была достоверно снижена и составляла 0,18±0,3 баллов по сравнению с
контрольной группой – 0,88±0,4 баллов (р<0,05). В строме эндометрия
статистически значимых различий в экспрессии маркера не выявлено, но
следует отметить, что в основной группе экспрессия VEGF оказалась
значительно ниже группы контроля и составляла 0,32±0,3 баллов и 0,56±0,4
баллов соответственно. Обращало внимание достоверно сниженная экспрессия
19
VEGF в эндотелии сосудов основной группы относительно группы контроля –
0,59±0,2 баллов и 0,94±0,2 баллов соответственно (р<0,05) (рис.3).
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
основная группа
контроль
эпителий пиноподии
р<0,05
р<0,05
строма
эндотелий
сосудов
р<0,05
Рис.3 Экспрессия маркера VEGF в эндометрии (в баллах)
Анализируя эти данные, мы предположили, что у женщин с БНГ
наблюдается неадекватная сосудистая перфузия в тканях, которая, повидимому, не обеспечивает циклическую трансформацию эндометрия и
инвазию трофобласта, что в конечном итоге приводит к нарушению процессов
имплантации.
Интенсивность процесса апоптоза при иммуногистохимической реакции
оценивали по экспрессии маркера CAS. Апоптоз необходим для нормального
протекания стадий адгезии бластоцисты и инвазии трофобласта в ходе
физиологической имплантации
[Vaskivuo T.E. et al., 2001].
Апоптоз
эпителиальных клеток эндометрия индуцируется эмбрионом и является важным
механизмом, позволяющим эмбриону преодолеть эпителий эндометрия, в
результате чего достигается непосредственный контакт трофэктодермы с
базальной мембраной и становиться возможна стромальная инвазия [Simon
C.,2001].
В настоящем исследовании экспрессия CAS в строме эндометрия у
женщин основной группы была достоверно выше показателей контроля – в 1,4
раза (p<0,05). В эпителии эндометрия экспрессия СAS в основной группе
также превышала группу контроля в 1,3 раза (рис.4).
20
200
150
100
50
0
основная группа
контроль
эпителий
строма р<0,05
Рис.4 Экспрессия маркера CAS в эндометрии ( в процентах,%)
Полученные нами данные
демонстрировали увеличение экспрессии
маркера CAS в эндометрии основной группы,
что свидетельствовало об
интенсивности процесса апоптоза и отсутствии
нормальных условий для
протекания стадий адгезии бластоцисты и инвазии трофобласта в ходе
физиологической имплантации.
Результаты исследования позволили нам сделать вывод о том, что в
патогенезе
БНГ
огромная
роль
принадлежит
генерализованному,
многоуровневому аутоиммунному процессу, который вносит свой вклад в
развитие репродуктивных нарушений и процесса имплантации. Полученные
данные позволяют по-новому оценить состояние репродуктивной системы
пациенток с БНГ и взаимосвязь с аутоиммунной патологией на системном
уровне и в эндометрии. Несмотря на то, что у всех женщин, включенных в
настоящее исследование, эндометрий соответствовал средней стадии секреции,
экспрессия маркеров (LIF, IL-1, VEGF), принимающих участие в имплантации
оказалась сниженной. Наряду с этим, экспрессия маркера
тканях эндометрия была повышена.
апоптоза CAS в
Полученные данные позволили нам
продемонстрировать очевидность вклада нарушений процессов рецептивности,
ангиогенеза и апоптоза в патогенез БНГ.
Патогенез БНГ интенсивно изучается и сегодня
становится все более
очевидным, что под маской «бесплодия неясного генеза» скрывается
патологический процесс, в основе которого лежит множественная патология
репродуктивной системы. Эффективность преодоления этой формы бесплодия
взаимосвязана с более углубленным обследованием супружеской пары,
позволяющим оценить особенности иммунной системы, аутоиммунных
21
нарушений,
гистосовместимости
супругов
по
системе
HLA,
а
также
«готовности» эндометрия к полноценной имплантации.
Выводы
1.
Частота бесплодия неясного генеза по данным комплексного клинико-
лабораторного
и эндоскопического обследования в специализированном
стационаре составляет 14,1%. Особенностями преморбидного фона женщин с
бесплодием неясного генеза являются перенесенные травмы головы (20%),
прием наркотических препаратов (15%), осложненный репродуктивный
анамнез (22,5%), ИППП (80%).
2.
Иммунологический статус женщин с бесплодием неясного генеза,
оцененный на основании
фенотипической характеристики субпопуляций
лимфоцитов в периферической
крови
и
количественного
определения
иммуноглобулинов не имеет отличительных особенностей при сравнении с
аналогичными показателями фертильных женщин. Системные аутоиммунные
нарушения проявляются повышенным уровнем антител к щитовидной железе у
47,5% женщин, антител к фосфолипидам клеточных мембран - у 42,5%, что
превышает популяционные показатели в 5 и 10 раз соответственно.
3.
В системе HLA выявлены маркеры, ассоциированные с аутоиммунными
процессами: в I классе - антиген А2 (у 85% женщин и 50% мужчин); во II
классе - антигены DRB1(аллели 01 и 04) – у 40% женщин и DQB1 (аллели
0602-8 и 0201) – у 62,5% женщин и 50% мужчин. Совместимость по 3 и более
локусам системы HLA имеют 60% супружеских пар.
4.
Эндометрий женщин с бесплодием неясного генеза характеризуется
нормальной морфологической картиной и нарушением экспрессии маркеров,
принимающих ключевое участие в процессе имплантации. Отражением этих
процессов выступает
статистически значимое снижение экспрессии LIF
в
эпителии – в 1,4 раза, пиноподиях – в 2,6 раз, а также снижение экспрессии IL-1
в эпителии – в 3 раза, пиноподиях – в 4,7 раз, строме – в 1,5 раза. Нарушение
ангиогенеза проявляется снижением экспрессии VEGF в эпителии – в 4 раза,
22
пиноподиях – в 4,8 раз, эндотелии – в 1,6 раз. В тоже время достоверное
увеличение экспрессии маркера CAS в строме в 1,4 раза указывает на
интенсивность процесса апоптоза клеток.
Практические рекомендации
Диагностическими критериями
«бесплодия неясного генеза» являются:
фертильная сперма мужа, овуляторный менструальный цикл, сохраненный
овариальный резерв, отсутствие патологических изменений органов малого
таза, морфологически неизменный эндометрий по данным комплексного
клинико-лабораторного и эндоскопического обследования. Бесплодие неясного
генеза также может быть
ассоциировано с наружным генитальным
эндометриозом I ст. распространения и спаечным процессом в малом тазу I ст.
распространения
без
нарушения
проходимости
маточных
труб.
При
установлении диагноза «бесплодие неясного генеза» целесообразно расширить
алгоритм обследования для выявления:
- гистосовместимости супругов по системе HLA I и II классов;
- аутоиммунных нарушений - антител к щитовидной железе и фосфолипидам
клеточных мембран;
- морфофункциональной
полноценности
эндометрия
в
период
«имплантационного окна» на основании экспрессии LIF, IL-1, VEGF, CAS.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1.
Receptivity of endometrium: new aspects in immunology of reproduction /
G.T.Sukhikh, A.V. Shurshalina, E.A. Kogan, L.S. Ezhova, Е.Р. Kellet
// VI
European Congress of Reproductive Immunology, Moscow.-2008.- p.37
2.
Келлэт Е.П., Корнеева И.Е., Шуршалина А.В. Бесплодие неясного
генеза:
фокус
современных
научных
исследований
//
Проблемы
репродукции.- 2010.- №1.- С. 32-35
23
3.
Келлэт Е.П., Шуршалина А.В., Корнеева И.Е. Роль эндометрия в
неудачах реализации репродуктивной функции // Проблемы репродукции.2010.- №2.- С. 16-20
4.
Морфофункциональная характеристика эндометрия у женщин с
бесплодием неясного генеза / Е.П. Келлэт, А.В. Шуршалина, И.Е. Корнеева,
Т.А. Демура, Л.С. Ежова // Проблемы репродукции.- 2011.- №3.- С. 26-30.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АМГ – антимюллеров гормон
АТ-ТГ – антитела к тиреоглобулину
АТ-ТПО – антитела к тиреопероксидазе
БНГ- бесплодие неясного генеза
Е2 - эстрадиол
К - кортизол
ЛГ – лютеинизирующий гормон
НГЭ - наружный генитальный эндометриоз
П – прогестерон
ПРЛ - пролактин
ПЭ - перенос эмбрионов
Т – тестостерон
Т4св. – тироксин свободный
ТТГ – тиреотропный гормон
УЗИ – ультразвуковое исследование
ФСГ – фолликулостимулирующий гормон
ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение
LIF – лейкемия ингибирующий фактор
VEGF – сосудисто-эндотелиальный фактор роста
IL-1 – интерлейкин-1
RAFS - синдром системных аутоиммунных репродуктивных потерь
24
Скачать
Похожие карточки
Создать карточки