На правах рукописи КЕЛЛЭТ ЕЛЕНА ПАВЛОВНА
advertisement
На правах рукописи КЕЛЛЭТ ЕЛЕНА ПАВЛОВНА ОСОБЕННОСТИ КЛИНИКИ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ У СУПРУЖЕСКИХ ПАР С БЕСПЛОДИЕМ НЕЯСНОГО ГЕНЕЗА 14.01.01. - акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2011 Работа выполнена в 1-ом гинекологическом отделении клинической иммунологии ФГУ «Научный и лаборатории центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России». Научные руководители: доктор медицинских наук Ирина Евгеньевна Корнеева доктор медицинских наук Анна Владимировна Шуршалина Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Клара Георгиевна Серебренникова доктор медицинских наук, профессор Ольга Федоровна Серова Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский Университет Дружбы Народов Защита диссертации состоится «___»____________ 20___ года на заседании диссертационного совета Д208.125.01 при ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздразсоцразвития России. Адрес: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России. Автореферат разослан «___»____________ 20__ года. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Е.А. Калинина 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Среди множества форм бесплодия, согласно классификации ВОЗ, выделено бесплодие неясного генеза или идиопатическое, когда супружеская пара неспособна к зачатию, однако, современные методы обследования не выявляют причины нарушения фертильности. В структуре бесплодного брака его частота колеблется от 10 до 30%. Критериями диагностики бесплодия неясного генеза являются фертильная сперма мужа, овуляторная концентрация прогестерона в середине лютеиновой фазы, подтвержденная проходимость маточных труб, нормальный уровень ФСГ в сыворотке крови и отсутствие патологии со стороны органов малого таза [Кулакова В.И., 2002, Bhattacharya S., 2007, Nakagawa K., 2007]. Этиология БНГ до конца не изучена. Основными направлениями в исследовании причин БНГ за последние несколько лет явились - изучение роли иммунологических, генетических факторов, состояние овариального резерва. Особое внимание уделяют морфофункциональным изменениям в эндометрии как возможной причине нарушения процесса имплантации у данной группы больных [Luborsky J., 2000, Bockos M., 2002, Balasch J., 2002, Putowski L., 2004, Carp H., 2007]. Изучается влияние иммунологических факторов на репродуктивный процесс. Исследователи отмечают, что иммунные нарушения могут быть вовлечены в патогенез бесплодия неясного генеза и вызывать нарушения имплантации эмбриона [Luborsky J., 2000, Balasch J., 2002]. Обсуждается необходимость комплексной оценки состояния иммунной системы у пациенток. В последние полтора десятилетия было установлено, что в некоторых случаях бесплодие связано с повышенной степенью гистосовместимости супругов по антигенам HLA [Серова Л.Д., 1997, Хаитов Р.М., 2001, Болдырева М.Н., 2010]. Накопилось много фактов о роли имеющих непосредственную связь с аутоиммунных процессов, системой HLA в нарушении репродуктивной функции. Не вызывает сомнения, что дальнейшее изучение 3 этой проблемы позволит более точно определить значимость и роль совместимости супругов по системе НLA не только при невынашивании беременности, но и у пар с бесплодием неясного генеза. В настоящее время требуют детального описания и анализа механизмы, связанные генеза. с дефектами имплантации у пациенток с бесплодием неясного На данном этапе развития медицины интерес исследователей сконцентрирован на изучении оптимальную восприимчивость окна, отдельных факторов, обеспечивающих эндометрия в период «имплантационного» нарушение которой может явиться причиной Изучается роль местных регуляторных факторов бесплодия у женщин. в процессе созревания эндометрия на протяжении менструального цикла и имплантации [Glasser S.R. et al., 2002, Klentzeris L.D. et al., 2007]. Таким образом, на современном этапе развития репродуктивных технологий актуальным является дальнейший поиск новых подходов к выяснению этиопатогенеза бесплодия неясного генеза. Вышеизложенное определило цель настоящего исследования: оптимизация реализации репродуктивной функции у супружеских пар с бесплодием неясного генеза на основании совершенствования диагностического алгоритма. Для достижения поставленной цели были сформулированные следующие задачи исследования: 1. Определить частоту бесплодия неясного генеза. Дать клинико- лабораторную характеристику женщин с бесплодием неясного генеза. 2. Изучить состояние системного иммунитета у пациенток с бесплодием неясного генеза и проанализировать особенности аутоиммунных нарушений путем выявления частоты встречаемости антител к фосфолипидам клеточных мембран и щитовидной железе. 3. Провести оценку совместимости супругов по антигенам системы HLA I и II классов. 4 Оценить иммуноморфологические параметры эндометрия по изучению 4. содержания экспрессии маркеров рецептивности, воспаления, ангиогенеза и апоптоза клеток в ткани эндометрия. Научная новизна В результате проведенного исследования определены и проанализированы особенности состояния репродуктивной системы у женщин с Проанализирована активность аутоиммунных системных процессов. результате проведенных исследований БНГ. В установлено, что показатели иммунного статуса оцененного на основании фенотипической характеристики субпопуляций лимфоцитов в периферической крови и количественного определения иммуноглобулинов не демонстрируют каких-либо отличительных особенностей от популяционных данных, в то время как системные аутоиммунные нарушения сопровождают БНГ более чем у 40% женщин. Проведен анализ встречаемости антигенов системы HLA I и II классов у супружеских пар обследуемой группы. Выявлены маркеры, ассоциированные с аутоиммунными процессами: в I классе - антиген А2; во II классе - аллели 01 и 04 локуса DRB1 и аллели 0201 и 0602-8 локуса DQB1. Установлена высокая частота (60%) совместимости по 3 и более антигенам системы HLA у супругов с БНГ. Произведена оценка функционального состояния эндометрия в период «имплантационного окна». Впервые у женщин с БНГ изучена экспрессия маркеров LIF, IL-1, VEGF, CAS, принимающих ключевое участие в процессе имплантации. Выявлено, что морфологически неизмененный эндометрий не обладает полноценной функциональной активностью, способной в полной мере обеспечить имплантацию за счет нарушения процессов рецептивности, ангиогенеза, апоптоза. 5 Практическая значимость работы В ходе работы определены особенности состояния репродуктивной системы и диагностические критерии бесплодия неясного генеза у женщин. Это позволило предложить расширенный алгоритм обследования для супружеских пар с бесплодием неясного генеза на этапе подготовки к проведению программы ЭКО и ПЭ. Предложен скрининг маркеров аутоиммунных нарушений, обосновано включение в алгоритм обследования выявление гистосовместимости супругов по системе HLA и необходимость оценки функциональной полноценности эндометрия в период «имплантационного окна» по результатам иммуногистохимического исследования экспрессии маркеров рецептивности, воспаления, ангиогенеза, апоптоза. Положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Женщины сохраненной с бесплодием функциональной неясного активностью генеза характеризуются гипоталамо-гипофизарно- яичниковой системы, нормальными параметрами овариального резерва и отсутствием патологических изменений со стороны органов малого таза на фоне неизмененных пролиферативно-секреторных процессов в эндометрии. 2. Бесплодие неясного генеза ассоциировано с аллоиммунными и аутоиммунными нарушениями. Факторами, оказывающими негативное влияние на функциональное состояние репродуктивной системы, являются совместимость по антигенам системы HLA у 60% супружеских пар, а также повышенный уровень антител к щитовидной железе у 47,5% женщин, антител к фосфолипидам клеточных мембран - у 42,5% пациенток. 3. Особенности морфофункционального состояния эндометрия у женщин с бесплодием неясного генеза заключаются в изменении его рецептивности в период «имплантационного окна», что проявляется нарушением экспрессии маркеров имплантации - LIF, IL-1, VEGF, CAS на фоне полноценных пролиферативно-секреторных процессов. 6 Апробация работы Основные положения диссертации и результаты работы доложены на межклинической конференции 1-го гинекологического отделения ФГУ «НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России 31 марта 2011г. Работа обсуждена на заседании апробационной комиссии ФГУ «НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова» Минздрасоцразвития России 16 мая 2011г. Внедрение результатов исследования в практику Полученные результаты внедрены в практику работы 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, в т.ч. 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа содержит 26 таблиц, 12 рисунков. Библиографический указатель включает в себя 143 источника, из них 35 отечественных и 108 иностранных авторов. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Основу работы составили результаты комплексного клинико- лабораторного и эндоскопического обследования 940 женщин с бесплодием, обратившихся в 1-ое гинекологическое отделение ФГУ «НЦ АГ и П им. В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России для лечения. На первом этапе исследования проведен ретроспективный анализ 900 историй болезни, результаты которого позволили определить частоту бесплодия неясного генеза по данным обращаемости в специализированный гинекологический стационар. 7 На втором, проспективном этапе в соответствии с поставленными задачами было обследовано 40 пациенток с бесплодием неясного генеза, составивших основную группу исследования. Критериями включения в исследование являлись: возраст женщин до 35 лет, овуляторный менструальный цикл, отсутствие патологических изменений органов малого таза по данным эндоскопического обследования у женщин (кроме: НГЭ 1 степени, спаечного процесса в малом тазу 1 степени распространения, миомы матки малых размеров - до 2 см субсерозной локализации), нормальная морфологическая картина эндометрия, фертильная сперма мужа. Контрольную группу для иммуногистохимического исследования эндометрия составили 10 здоровых фертильных женщин репродуктивного возраста, которые не имели гинекологических заболеваний, а также не использовали внутриматочные и гормональные методы контрацепции. Для диагностики причин бесплодия проведены следующие методы исследования: 1. Общеклиническое и гинекологическое обследование; 2. Клинико-психологическое обследование; 3. Инфекционный скрининг: микроскопия вагинального мазка, окрашенного по Грамму, исследование мазков-отпечатков клеток цилиндрического эпителия цервикального канала для выявления ДНК урогенитальных хламидий, микоплазм, вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ- 2), цитомегаловируса (ЦМВ) с использованием наборов реагентов «ДНК-технологии» (Москва); 4. Гормональный скрининг: определение концентрации ПРЛ, ФСГ, ЛГ, Е2, тестостерона, ДГЭА-сульфата, прогестерона, ТТГ, Т4св в плазме крови производили радиоиммуннологическими методами; 5. Оценка сперматогенеза супруга проводилась врачом-андрологом на основании результатов расширенной спермограммы, MAR-теста. 6. УЗИ органов малого таза проводили на аппарате «Siemens Sonoline-Siena» (Германия) с использованием вагинального датчика 6,5 мгц на 5-7 дни 8 менструального цикла. УЗИ щитовидной железы проводилось при помощи аппарата «Hitachi EUB-405 plus» с линейным датчиком 7,5 МГц. 7. Овуляторный характер менструального цикла подтверждали с помощью эхографии органов малого таза и определения концентрации прогестерона в плазме крови на 5-7 дни после овуляции; 8. Иммунологические методы: - определение уровней аутоантител к ткани щитовидной железы - к тиреопероксидазе (АТ-ТПО) и тиреоглобулину (АТ-ТГ). Исследование осуществляли иммуноферментными методами, набором «Roche diagnostics» (Германия); - определение уровней антител к кардиолипину, фосфатидилсерину, кофакторам: β2-гликопротеину, протромбину, аннексину V производилась методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческих наборов фирмы ORGENTEC Diagnostika GmbH (Германия) для количественного определения уровней антител классов IgG, IgM; - фенотипическая характеристика клеток иммунной системы проводилась методом проточной цитофлуометрии с применением моноклональных антител к кластерам дифференцировки CD3, CD4, CD8, CD19, CD19CD5, CD56, CD16CD56 на анализаторе Collibur (Германия); - концентрацию иммуноглобулинов трех основных классов (G,M,A) определяли в периферической крови методом радиальной иммунодиффузии по Манчини; 9. Иммуногенетические методы: - исследование антигенов HLA I класса (А, В, С) проводилось на лимфоцитах периферической крови путем использования стандартного метода «комплементзависимой цитотоксичности», разработанного П. Терасаки (1991). Определение антигенов HLA II класса проводилось методом ПЦР – типирование локусов DRB1, DQB1, DQA1. 11. Эндоскопические: лапаро- и гистероскопию с использованием оборудования фирмы «K.Storz» (Германия) выполняли на 7- 11 день менструального цикла; 9 12. Морфологическое исследование соскобов полости матки и цервикального канала производили на 7-11 день менструального цикла путем раздельного диагностического выскабливания; 13. Иммуногистохимическое исследование ткани эндометрия проводили в секреторную фазу менструального цикла на 6-8 день после овуляции. Исследовали экспрессию маркеров рецептивности (LIF), воспаления (IL-1), ангиогенеза (VEGF), апоптоза (CAS). Материал для исследования забирали путем аспирационной биопсии эндометрия с помощью кюретки Pipelle de Cornie. 14. Статистическая обработка данных выполнена на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ «Statistica for Windows» v. 7.0, StatSoft Inc. Для непараметрических данных применяли попарное сравнение с помощью критерия Манна-Уитни (для 2-х групп) для несвязанных совокупностей. Статистически значимыми считали отличия при р<0,05 (95%-й уровень значимости). Исследования одобрены комитетом по этике биомедицинских исследований при ФГУ «НЦ АГ и П им.В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России. Результаты исследования и их обсуждения В соответствии с поставленной целью и задачами исследования определения частоты БНГ на первом этапе работы мы для провели ретроспективный анализ историй болезни 900 женщин с бесплодием. Диагноз «бесплодие неясного генеза» был установлен у 127 женщин. Таким образом, частота данной формы бесплодия по данным обращаемости в специализированный гинекологический стационар составила 14,1%. Возраст пациенток колебался от 24 до 35 лет и составил в среднем 29,7±4,14 лет. Анамнез женщин с бесплодием неясного генеза, касающийся перенесенных хронических соматических заболеваний не отличался от пациенток с другими 10 формами бесплодия, подробно охарактеризованными в различных исследованиях [Шуршалина А.В., 2007, Перминова С.Г., 2010]. Однако обращал внимание тот факт, что 20% из них указали на ранее перенесенные травмы головы, а 15% - на прием наркотических препаратов в подростковом возрасте. Характерными особенностями анамнестических данных женщин с БНГ являлись частые ИППП и воспалительные заболевания половых органов. В структуре ИППП преобладал хламидиоз (50%), почти в 2 раза реже встречался рецидивирующий генитальный герпес (22,5%), в 3 раза реже – трихомониаз (17,5%). При анализе превалирование особенностей частоты репродуктивной первичного бесплодия функции (77,5%). отмечено Длительность бесплодия составила в среднем 4,13±2,41 года. Предшествующее неэффективное лечение по поводу бесплодия, включающее проведение КИО и программы ЭКО было ранее проведено у каждой второй женщины. Результаты гормонального скрининга продемонстрировали, что концентрация ПРЛ, гонадотропных и стероидных гормонов в плазме крови у женщин с БНГ соответствовала нормативным показателям. Средние значение уровня прогестерона в середине лютеиновой фазы составили 43,8 ± 35,8 нмоль/л и указывали на сохранение процесса овуляции у всех обследованных женщин. По данным УЗИ органом малого таза, проведенного всем 40 пациенткам изучаемой группы, патологических изменений половых органов ни у кого не выявлено за исключением 4 пациенток (10%), у которых в миометрии визуализировалось по одному субсерозному миоматозному узлу диаметром - до 1,5см. Миометрий остальных женщин имел обычную эхо-структуру. Толщина эндометрия соответствовали дню менструального цикла. Оценке овариального резерва женщин с БНГ уделяют все большее внимание. Для этой цели в настоящем исследовании мы использовали такие общепринятые критерии как: уровень ФСГ, АМГ, объем яичников и число 11 антральных фолликулов. Многие исследователи считают, что женщины с БНГ возможно имеют сниженный овариальный резерв, и это может являться первым признаком недостаточности яичников. Однако, мы не обнаружили изменений параметров овариального резерва. Объем правого яичника у женщин изучаемой группы составил 9,2±3,4 см³, объем левого яичника - 8,3±3,1см³. Число антральных фолликулов в правом и левом яичниках составило 8,8±1,54 и 8,4±1,8 соответственно. Полученные нами данные свидетельствовали о достаточном репродуктивном потенциале яичников. Лапароскопия является общепринятым стандартом диагностики патологических изменений органов малого таза, способных приводить к бесплодию. С целью оценки состояния органов малого таза всем 40 пациенткам обследуемой группы ранее была произведена диагностическая лапароскопия и гистероскопия с патоморфологическим исследованием эндометрия. Анализ результатов диагностической лапароскопии показал, что у подавляющей части женщин - 55% патологии со стороны органов малого таза не было выявлено. Спаечный процесс в малом тазу I стадии распространения при сохраненной проходимости маточных труб диагностирован у 12,5% пациенток. Исследователи полагают, что поверхностные формы наружного генитального эндометриоза без сопутствующих спаек в брюшной полости и миомы матки малых размеров не являются единственной причиной нарушения репродуктивной функции [Akande U.A. et al., 2004, Nakagawa K. et al., 2007]. В нашем исследовании в ходе проведения эндоскопического обследования наружный генитальный эндометриоз I ст. был обнаружен у 22,5% женщин, cубсерозная миома матки диаметром до 1,5см у 10%. Патология полости матки и эндометрия была исключена у всех женщин обследуемой группы на основании данных гистероскопии и морфологического исследования эндометрия. За последние годы накоплено большое число данных, свидетельствующих об участии психосоциальных факторов в возникновении и развитии бесплодия [Кочерганов П.Н., 2006]. На фоне патогенетических факторов нарушения репродуктивной функции, как правило, выявляют нарушения эмоциональной 12 сферы. Принимая во внимание не только данные литературы, но и указания 20% пациенток на травмы головы различной степени тяжести, а 15% женщин на прием сильнодействующих препаратов в подростковом возрасте, проведение данного этапа работы представлялось вполне обоснованным. Совместно с психотерапевтом нами было выделено четыре синдромальных типа пограничных расстройств у женщин с бесплодием неясного генеза: тревожно-депрессивный, выявленный у 7 пациенток (17,5%), фобический - у 10 (25%), истерический – у 8 (20%) и неврастенический - у 15 (37,5%) женщин. Показатель психосоциального стресса, изученный на основании оценочной шкалы Л.Ридера, продемострировал, что 22 женщины (62,5%) из 40 с БНГ имели высокий уровень психосоциального стресса (от 2,18 до 3 баллов). Огромный интерес представляет роль иммунных и иммуногенетических нарушений в патофизиологии бесплодия неясного генеза. В связи с этим в литературе обсуждается влияние иммунологических факторов на репродуктивный процесс [Сhoudhury S.R., 2000; Putowski L., 2004]. Согласно теории RAFS (Reproductive Autoimmune Failure Syndrome) «синдрома системных аутоиммунных репродуктивных потерь», аутоиммунные факторы могут приводить к дефектам репродуктивного процесса на различных стадиях [Gleicher N., 1988]. При изучении патогенетических механизмов БНГ исследователи рекомендуют все больше обращать внимание на изучение функции щитовидной железы у данного контингента женщин. Известно, что аутоиммунные заболевания щитовидной железы могут сопровождаться аутоиммунным поражением других систем организма, в том числе и репродуктивной системы [Роррe K., 2008, Перминова С.Г., 2010]. Чаще всего определяют наличие антител к тиреглобулину (АТ-ТГ) и тиреоидной пероксидазе (АТ-ТПО), наиболее информативно определение титра последних, изолированное носительство АТ-ТГ наблюдается редко и имеет меньшее диагностическое значение. Значение ТТГ у обследованных нами пациенток варьировало от 0,5 до 3,7 МЕ/мл, составило в среднем 1,64±0,9 МЕ/мл и не превышало 13 нормативных показателей. Таким образом, результаты оценки тиреоидного статуса указали на сохранение функции щитовидной железы у всех пациенток изучаемой группы. Обращали особое внимание высокие титры АТ-ТГ и АТ-ТПО. Средний уровень АТ-ТГ находился в пределах 125,7±309,3 МЕ/мл и колебался от 12,6 МЕ/мл до 1000 Ме/мл, а уровень АТ-ТПО составил 107,7±157,2 МЕ/мл и варьировал от 8,2 МЕ/мл до 542 МЕ/мл. Повышенный уровень АТ- антител выявлен у 19 (47,5%) из 40 женщин. Носительство АТ-ТПО имели 30% пациенток, АТ-ТГ - 17,5%. УЗИ щитовидной железы было произведено 19 пациенткам с повышенным уровнем АТ-антител. При этом нормальную эхографическую характеристику щитовидной железы имели 11 (57,9%) из 19 женщин. УЗ признаки аутоиммунного тиреоидита в виде снижения эхогенности ткани, диффузной неоднородности структуры щитовидной железы были выявлены у 8 женщин (42,1%). Объем щитовидной железы у всех 19 пациенток составил в среднем 8,3±1,1см³ и не превышал нормативных значений. Полученные нами результаты корреспондируют с аналогичными исследованиям других авторов о том, что у женщин с БНГ отмечена высокая распространенность антител к щитовидной железе. Данные антитела являются маркерами дефекта иммунной системы, проявляющегося на системном уровне, и могут являться важным прогностическим признаком репродуктивных потерь. До настоящего времени остаются нерешенными вопросы о зависимости между циркуляцией антифосфолипидных антител и ранними репродуктивными потерями, однако большинство авторов cклоняются к мнению о том, что повышение уровня последних может быть связано с репродуктивными нарушениями и быть частью генерализованных аутоиммунных нарушений. [Сhoudhury S.R., 2001; Bockos M., 2002]. В проведенном нами исследовании у 17 женщин (42,5%) с БНГ присутствовали антитела к фосфолипидам клеточных мембран, что существенно превышало популяционные значения, соответствующие 2-4% [Макаров О.В., 2001]. По полученным нами данным, 14 повышенный уровень антител к фосфатидилсерину класса G и M выявлен у 3 женщин (7,5%) и 7 (17,5%) соответственно. Антитела к кардиолипину класса G были выявлены у 10 пациенток (25%), к кардиолипину класса M - у 7 (17,5%). Антитела к протромбину были обнаружены только у 3 пациенток, причем во всех случаях выявлен повышенный уровень IgG. Уровень IgG к β2гликопротеину был увеличен у 4 (10%) пациенток, IgM у 5 (12,5%) пациенток. Повышенный уровень антител к аннексину классов G и M отмечался у 2(5%) и 1(2,5%) пациенток соответственно. Волчаночный антикоагулянт не был выявлен ни у одной пациентки. Таким образом, анализ данных литературы о частоте встречаемости антител к щитовидной железе и фосфолипидов клеточных мембран у пациенток с БНГ свидетельствует в пользу теории RAFS-синдрома о существовании системных иммунных нарушений, препятствующих успешной реализации их репродуктивной функции. При изучении состояния системного иммунитета у пациенток с бесплодием неясного генеза, оцененного на основании фенотипической характеристики субпопуляций лимфоцитов в периферической крови и количественного определения иммуноглобулинов не имел каких либо отличительных особенностей по сравнению с нормативными показателями. В настоящее время существуют данные о роли системы HLA в нарушении репродуктивной функции [Болдырева М.Н., 2007]. Установлено, что 70% причин репродуктивных неудач неустановленного генеза могут быть ассоциированы с аутоиммунными нарушениями как у мужчин, так и у женщин [Болдырева М.Н., 2010]. В нашем исследовании мы провели анализ частоты встречаемости генов системы HLA I и II классов. Показано, что антигены HLA I класса – А2, А10, В15, В18, В40, В41 могут рассматриваться как иммуногенетические невынашивания неясного генеза [Салбиева Н.Б., маркеры 2002]. Анализ привычного антигенов системы HLA I класса в данном исследовании продемонстрировал высокую частоту встречаемости антигена А2. Носителями этого антигена являлись 85% 15 женщин и 50% мужчин. Таким образом, мы можем предположить, что превалирующая часть супружеских пар имеет «маркерный» антиген иммунных нарушений. Одними из главных генов, для которых установлена выраженная связь с развитием аутоиммунной патологией, являются гены HLA класса II, а именно генотип DRB1 и его локусы - 03 и - 04. Также в качестве маркеров предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям следует выделить локусы генотипа DRB1 - 01,- 08,- 09 и – 10. При анализе частоты встречаемости аллелей системы HLA II класса мы обнаружили, что по локусу DRB1 наиболее частыми у 40% женщин явились аллель 01 и аллель 04. Некоторые исследователи рассматривают генотип DQB1, в частности аллели 0201 и 0602-8, ассоциированные с развитием системной красной волчанки и с высоким генетическим риском невынашивания беременности как маркеры аутоиммунных нарушений, ведущих к развитию этих заболеваний [Болдырева М.Н., 2007]. В нашей работе, в локусе DQB1 самым частым как у женщин, так и у мужчин являлся аллель 0602-8 – половины женщин 62,5% и 50% встречался аллель 0201. соответственно. Также у Представленные данные показывают, что в генотипе DRB1 и DQB1 у супружеских пар с БНГ присутствуют антигены, ответственные за развитие аутоиммунных процессов. Таким образом, связь определенных «маркерных» вариантов генов системы HLA с развитием аутоиммунных процессов, очевидно, играет определенную роль в нарушении репродуктивной функции у супружеских пар с БНГ. Согласно данным литературы последних лет причиной иммунного бесплодия может являться низкий иммунный ответ на аллоантигены партнера из-за сходства по отдельным HLA-локусам. По данным многочисленных исследований, полное несовпадение НLA-генотипов у супругов благоприятно для развития беременности. Совместимость по HLA регистрируется довольно часто, но лишь сходство более 25% расценивается как неблагоприятный фактор в плане наступления беременности [Серова Л.Д., 1997]. Мы также выявили у 16 супружеских пар совместимости по I и II классам. Согласно полученным в ходе нашей работы данным у 24 супружеских пар (60%) отмечена совместимость по обоим классам системы HLA. Общее количество супружеских пар, имеющих 2 совпадения по двум классам – 16 (40%). Из них в I классе системы HLA 2 совпадения имели 8 супружеских пар (20%), столько же пар имело 2 совпадения и во II классе. Общее количество пар, имеющих 3 и более совпадений по двум классам системы HLA – 24 (60%). Их них в I классе 3 и более совпадений имели 4 супружеские пары (10%), во II классе – 12 (30%). Таким образом, исходя из представленных данных, сходство по 3 и более HLA-локусам у супружеских пар можно расценивать как неблагоприятный фактор для наступления беременности при БНГ. Крайне важным являлась оценка состояния эндометрия у пациенток с бесплодием неясного генеза с целью выявления возможных механизмов нарушения имплантации. Нами было проведено морфологическое иммуногистохимическое исследование эндометрия женщин и в период «окна имплантации». При световой микроскопии срезов эндометрия, окрашенных гематоксилином эозином, ни в одном из случаев не было выявлено признаков хронического эндометрита. Иммуногистохимическое исследование эндометрия проведено в период «окна имплантации» на 6-8 день после овуляции с использованием маркеров рецептивности, воспаления, апоптоза, ангиогенеза. С целью оценки рецептивности эндометрия в исследовании применяли маркер рецептивности – LIF (лейкемия-ингибирующий фактор). Этот важнейший модулятор имплантации, оказывая прямое воздействие на трофобластную дифференцировку, опосредует установление «диалога» между эндометрием и эмбрионом. Установлено, что максимальная экспрессия LIF в эпителии эндометрия отмечается в период «окна имплантации» [Simon C. et al., 2001], что позволяет отнести этот фактор к биохимическому маркеру рецептивности эндометрия [Lapre-Delage G. et al., 2002]. В данном исследовании у женщин с БНГ экспрессия LIF в эпителии была снижена и составила 2,5 ± 1,0 баллов, что достоверно отличалась от 17 показателей в группе контроля 3,5±1,07 баллов (p<0,05). В пиноподиях экспрессия маркера также была со статистически значимой разницей относительно группы контроля и составила 2,0±1,8 баллов и 5,2±0,8 баллов (p<0,05) соответственно. В строме эндометрия достоверной разницы в экспрессии LIF между группами не было, но при этом в основной группе экспрессия маркера была ниже показателей группы контроля и составляла 3,13±0,8 баллов и 3,8±1,0 баллов соответственно (рис.1). 6 4 основная группа 2 контроль 0 эпителий р<0,05 пиноподии р<0,05 строма Рис.1 Экспрессия маркера LIF в эндометрии (в баллах) Таким образом, сниженная экспрессия LIF в эндометрии у женщин с БНГ может свидетельствовать о нарушении рецептивности ткани эндометрия и являться важным прогностическим маркером нарушений процессов имплантации на этапе «диалога» между эндометрием и эмбрионом. Рецептивность эндометрия при иммуногистохимическом исследовании также оценивали по экспрессии маркера воспаления - провоспалительного цитокина IL-1 (интерлейкин-1). Это ключевой регулятор воспалительного ответа. Он является паракринным фактором, который также опосредует связь между эндометрием и эмбрионом в период имплантации [Boucher A., et al., 2001; Castro-Rendon W.A., et al., 2006]. Анализ полученных нами данных выявил статистические различия по сравнению с группой контроля. Так, экспрессия IL-1 в эпителии эндометрия женщин основной группы была существенно ниже, чем в группе контроля и составила 1,59±0,9 баллов и 4,9±0,9 баллов (р<0,05) соответственно. В пиноподиях экспрессия IL-1 в основной группе была также достоверно снижена по сравнению с контрольной и составила 1,2±1,3 баллов и 5,7±0,9 баллов соответственно (р<0,05). В строме эндометрия отмечено статистически 18 значимое снижение экспрессии маркера IL-1 до 2,4±1,7 баллов относительно группы контроля (3,7±0,9 баллов, р<0,05) (рис.2). 6 4 2 основная группа 0 контроль эпителий р<0,05 пиноподии р<005 строма р<0,05 Рис.2 Экспрессия маркера IL-1 в эндометрии (в баллах) Таким образом, экспрессия провоспалительного цитокина IL-1, была значительно снижена в эпителии эндометрия, пиноподиях и строме у женщин с БНГ, что также может явиться одним из факторов, приводящим к нарушению эндометриальной рецепции, и как следствие - нарушение имплантации. Процесс ангиогенеза в эндометрии оценивали по экспрессии маркера VEGF (сосудисто-эндотелиальный фактор роста). Ангиогенез - важный процесс физиологического моделирования, необходимый для создания состояния рецептивности. Изменение процессов ангиогенеза в эндометрии может привести к неадекватной циклической трансформации эндометрия, нарушению имплантации [Torry D.S., 2007]. Результаты оценки процесса ангиогенеза на основании маркера VEGF в проведенном нами исследовании экспрессии в основной группе свидетельствовали о его сниженной относительно группы контроля. В эпителии эндометрия женщин с БНГ отмечены статистически значимые различия по сравнению с группой контроля – 0,14±0,3 баллов и 0,56±0,4 баллов соответственно (р<0,05). В пиноподиях основной группы экспрессия VEGF также была достоверно снижена и составляла 0,18±0,3 баллов по сравнению с контрольной группой – 0,88±0,4 баллов (р<0,05). В строме эндометрия статистически значимых различий в экспрессии маркера не выявлено, но следует отметить, что в основной группе экспрессия VEGF оказалась значительно ниже группы контроля и составляла 0,32±0,3 баллов и 0,56±0,4 баллов соответственно. Обращало внимание достоверно сниженная экспрессия 19 VEGF в эндотелии сосудов основной группы относительно группы контроля – 0,59±0,2 баллов и 0,94±0,2 баллов соответственно (р<0,05) (рис.3). 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 основная группа контроль эпителий пиноподии р<0,05 р<0,05 строма эндотелий сосудов р<0,05 Рис.3 Экспрессия маркера VEGF в эндометрии (в баллах) Анализируя эти данные, мы предположили, что у женщин с БНГ наблюдается неадекватная сосудистая перфузия в тканях, которая, повидимому, не обеспечивает циклическую трансформацию эндометрия и инвазию трофобласта, что в конечном итоге приводит к нарушению процессов имплантации. Интенсивность процесса апоптоза при иммуногистохимической реакции оценивали по экспрессии маркера CAS. Апоптоз необходим для нормального протекания стадий адгезии бластоцисты и инвазии трофобласта в ходе физиологической имплантации [Vaskivuo T.E. et al., 2001]. Апоптоз эпителиальных клеток эндометрия индуцируется эмбрионом и является важным механизмом, позволяющим эмбриону преодолеть эпителий эндометрия, в результате чего достигается непосредственный контакт трофэктодермы с базальной мембраной и становиться возможна стромальная инвазия [Simon C.,2001]. В настоящем исследовании экспрессия CAS в строме эндометрия у женщин основной группы была достоверно выше показателей контроля – в 1,4 раза (p<0,05). В эпителии эндометрия экспрессия СAS в основной группе также превышала группу контроля в 1,3 раза (рис.4). 20 200 150 100 50 0 основная группа контроль эпителий строма р<0,05 Рис.4 Экспрессия маркера CAS в эндометрии ( в процентах,%) Полученные нами данные демонстрировали увеличение экспрессии маркера CAS в эндометрии основной группы, что свидетельствовало об интенсивности процесса апоптоза и отсутствии нормальных условий для протекания стадий адгезии бластоцисты и инвазии трофобласта в ходе физиологической имплантации. Результаты исследования позволили нам сделать вывод о том, что в патогенезе БНГ огромная роль принадлежит генерализованному, многоуровневому аутоиммунному процессу, который вносит свой вклад в развитие репродуктивных нарушений и процесса имплантации. Полученные данные позволяют по-новому оценить состояние репродуктивной системы пациенток с БНГ и взаимосвязь с аутоиммунной патологией на системном уровне и в эндометрии. Несмотря на то, что у всех женщин, включенных в настоящее исследование, эндометрий соответствовал средней стадии секреции, экспрессия маркеров (LIF, IL-1, VEGF), принимающих участие в имплантации оказалась сниженной. Наряду с этим, экспрессия маркера тканях эндометрия была повышена. апоптоза CAS в Полученные данные позволили нам продемонстрировать очевидность вклада нарушений процессов рецептивности, ангиогенеза и апоптоза в патогенез БНГ. Патогенез БНГ интенсивно изучается и сегодня становится все более очевидным, что под маской «бесплодия неясного генеза» скрывается патологический процесс, в основе которого лежит множественная патология репродуктивной системы. Эффективность преодоления этой формы бесплодия взаимосвязана с более углубленным обследованием супружеской пары, позволяющим оценить особенности иммунной системы, аутоиммунных 21 нарушений, гистосовместимости супругов по системе HLA, а также «готовности» эндометрия к полноценной имплантации. Выводы 1. Частота бесплодия неясного генеза по данным комплексного клинико- лабораторного и эндоскопического обследования в специализированном стационаре составляет 14,1%. Особенностями преморбидного фона женщин с бесплодием неясного генеза являются перенесенные травмы головы (20%), прием наркотических препаратов (15%), осложненный репродуктивный анамнез (22,5%), ИППП (80%). 2. Иммунологический статус женщин с бесплодием неясного генеза, оцененный на основании фенотипической характеристики субпопуляций лимфоцитов в периферической крови и количественного определения иммуноглобулинов не имеет отличительных особенностей при сравнении с аналогичными показателями фертильных женщин. Системные аутоиммунные нарушения проявляются повышенным уровнем антител к щитовидной железе у 47,5% женщин, антител к фосфолипидам клеточных мембран - у 42,5%, что превышает популяционные показатели в 5 и 10 раз соответственно. 3. В системе HLA выявлены маркеры, ассоциированные с аутоиммунными процессами: в I классе - антиген А2 (у 85% женщин и 50% мужчин); во II классе - антигены DRB1(аллели 01 и 04) – у 40% женщин и DQB1 (аллели 0602-8 и 0201) – у 62,5% женщин и 50% мужчин. Совместимость по 3 и более локусам системы HLA имеют 60% супружеских пар. 4. Эндометрий женщин с бесплодием неясного генеза характеризуется нормальной морфологической картиной и нарушением экспрессии маркеров, принимающих ключевое участие в процессе имплантации. Отражением этих процессов выступает статистически значимое снижение экспрессии LIF в эпителии – в 1,4 раза, пиноподиях – в 2,6 раз, а также снижение экспрессии IL-1 в эпителии – в 3 раза, пиноподиях – в 4,7 раз, строме – в 1,5 раза. Нарушение ангиогенеза проявляется снижением экспрессии VEGF в эпителии – в 4 раза, 22 пиноподиях – в 4,8 раз, эндотелии – в 1,6 раз. В тоже время достоверное увеличение экспрессии маркера CAS в строме в 1,4 раза указывает на интенсивность процесса апоптоза клеток. Практические рекомендации Диагностическими критериями «бесплодия неясного генеза» являются: фертильная сперма мужа, овуляторный менструальный цикл, сохраненный овариальный резерв, отсутствие патологических изменений органов малого таза, морфологически неизменный эндометрий по данным комплексного клинико-лабораторного и эндоскопического обследования. Бесплодие неясного генеза также может быть ассоциировано с наружным генитальным эндометриозом I ст. распространения и спаечным процессом в малом тазу I ст. распространения без нарушения проходимости маточных труб. При установлении диагноза «бесплодие неясного генеза» целесообразно расширить алгоритм обследования для выявления: - гистосовместимости супругов по системе HLA I и II классов; - аутоиммунных нарушений - антител к щитовидной железе и фосфолипидам клеточных мембран; - морфофункциональной полноценности эндометрия в период «имплантационного окна» на основании экспрессии LIF, IL-1, VEGF, CAS. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Receptivity of endometrium: new aspects in immunology of reproduction / G.T.Sukhikh, A.V. Shurshalina, E.A. Kogan, L.S. Ezhova, Е.Р. Kellet // VI European Congress of Reproductive Immunology, Moscow.-2008.- p.37 2. Келлэт Е.П., Корнеева И.Е., Шуршалина А.В. Бесплодие неясного генеза: фокус современных научных исследований // Проблемы репродукции.- 2010.- №1.- С. 32-35 23 3. Келлэт Е.П., Шуршалина А.В., Корнеева И.Е. Роль эндометрия в неудачах реализации репродуктивной функции // Проблемы репродукции.2010.- №2.- С. 16-20 4. Морфофункциональная характеристика эндометрия у женщин с бесплодием неясного генеза / Е.П. Келлэт, А.В. Шуршалина, И.Е. Корнеева, Т.А. Демура, Л.С. Ежова // Проблемы репродукции.- 2011.- №3.- С. 26-30. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АМГ – антимюллеров гормон АТ-ТГ – антитела к тиреоглобулину АТ-ТПО – антитела к тиреопероксидазе БНГ- бесплодие неясного генеза Е2 - эстрадиол К - кортизол ЛГ – лютеинизирующий гормон НГЭ - наружный генитальный эндометриоз П – прогестерон ПРЛ - пролактин ПЭ - перенос эмбрионов Т – тестостерон Т4св. – тироксин свободный ТТГ – тиреотропный гормон УЗИ – ультразвуковое исследование ФСГ – фолликулостимулирующий гормон ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение LIF – лейкемия ингибирующий фактор VEGF – сосудисто-эндотелиальный фактор роста IL-1 – интерлейкин-1 RAFS - синдром системных аутоиммунных репродуктивных потерь 24