Атомно - силовой микроскопии для

ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА
АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ
ИССЛЕДОВАНИЯ ХЛОРОПЛАСТОВ, МИТОХОНДРИЙ
И ВЕЗИКУЛ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН
КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
Т.А. Гончарова, В.А. Воденеев, Ю.Ю. Гущина,
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского,
Н. Новгород, факс (8312) 65-79-23, e-mail: [email protected]
В последнее время метод сканирующей зондовой микроскопии, в частности атомно-силовой (АСМ), вследствие высокой разрешающей способности достаточно широко применяется в биологии с целью изучения
структурного состояния мембран клеток и отдельных биомолекул, дополняя традиционные методы исследования [1]. Одним из преимуществ
метода является возможность изучения биологических препаратов в
физиологических условиях (жидкости). Вместе с тем, целый ряд методических проблем все еще затрудняет использование АСМ в качестве
рутинного метода визуализации биологических структур [1].
В представленной работе проведена оценка возможности применения метода АСМ для изучения структурного состояния препаратов
плазматической мембраны (везикул плазматических мембран), а также
мембран хлоропластов и митохондрий.
Фракцию везикул плазматических мембран получали из клеток
стеблей 10–12-дневных проростков тыквы по методу [2] с последующей
очисткой в двухфазной системе декстран-полиэтиленгликоль. Препараты митохондрий и хлоропластов гороха выделяли методом дифференциального центрифугирования по Саламатовой [3] и Arnon [4]. АСМизмерения проводили в контактном режиме на воздухе на атомносиловом микроскопе Accurex 2100 (TopoMetrix). Использовали кантилеверы из нитрида кремния с радиусом кривизны около 50 нм. Для АСМизмерений препараты мембран фиксировали на покровных стеклах рас82
твором глутаральдегида до конечной концентрации 1%. Структурные
особенности хлоропластов и митохондрий исследовали в норме, а также
после воздействия in vivo гербицида параквата и теплового шока.
С помощью атомно-силовой микроскопии получены трехмерные
изображения везикул плазматических мембран, митохондрий и отдельных хлоропластов.
Везикулы представлены замкнутыми образованиями, латеральные
размеры которых 0.5–1.5 мкм. Размеры везикул сравнимы с таковыми,
полученными на электронном микроскопе. Незначительное увеличение
размеров может быть связано с особенностями приготовления препаратов для атомно-силовой микроскопии, а также с эффектом уширения,
вызванным конечным радиусом кривизны зонда. Помимо оценки формы, метод АСМ позволил охарактеризовать структуру поверхности отдельной везикулы.
Известно, что при стандартном выделении митохондрий в растворе
сахарозы происходит полная деградация межмитохондриальных контактов. В связи с этим митохондрии представлены отдельными везикулами, размер которых 0.86–1.18 мкм в диаметре и 0.3–0.4 мкм в высоту.
Тепловой шок не оказывал видимых воздействий на структуру митохондрий.
Метод АСМ позволил оценить форму и размеры хлоропластов, гетерогенность полученной фракции. Размеры крупных хлоропластов составили 5–7 мкм. При исследовании топографии поверхности отдельного хлоропласта обнаружена складчатость поверхности со множеством
локальных выпячиваний мембран. Аналогичные результаты были получены в работе [5] на электронном микроскопе путем реконструкции
серийных срезов для получения трехмерного изображения. Таким образом, метод АСМ позволяет детально судить о структурированности поверхности, не требуя длительного приготовления образцов. При воздействии параквата методом АСМ не обнаружено достоверных изменений
размеров органелл и существенных структурных изменений наружной
мембраны.
Таким образом, методом АСМ впервые получены трехмерные изображения хлоропластов, митохондрий и везикул плазматических мембран высших растений. Не отмечено существенных изменений структуры органелл после воздействия на растения внешних факторов. В процессе изучения структурных изменений мембран органелл в ответ на
внешние воздействия (особенно in vitro) методом атомно-силовой мик-
83
роскопии более перспективным кажется исследование препаратов мембран в физиологических условиях, т.е. в растворе.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы "Фундаментальные исследования и высшее образования" и НОЦ СЗМ ННГУ.
Литература
1. Яминский И.В., Бондаренко В.М. Липополисахариды, клеточные стенки,
живые бактериальные клетки // В сб.: Сканирующая зондовая микроскопия
биополимеров / Под ред. И.В. Яминского. М.: Научный мир, 1997. 88 с.
2. Hodges T.K., Leonard R.T. Purification of a plasma membrane-bound adenosine
triphosphatase from plant roots // Methods Enzymol. 1974. V. 32. P. 392–406.
3. Саламатова Т.С. Выделение митохондрий из мезокотилей этиолированных
проростков кукурузы // В сб.: Методы изучения мембран растительных клеток / Под ред. В.В. Полевой. Л., 1986. 192 с.
4. Arnon D.L., Allen M.B., Whatly Z.B. Photosynthesis by isolated chloroplasts.
Genetic concept and comparison of frie photochemical reaction // Biochim.
Biophys. Acta, 1956. V. 20. № 2. P. 449.
5. Силаева А.М., Ширяев А.И. Глобулярные образования растительной клетки // В сб.: Хлоропласты и митохондрии / Под ред. А.А. Шахов. М.: Наука,
1969. 344 с.
84