Морфобиохимическая характеристика скелетных мышц кур в

О Р И Г И Н А Л Ь Н Ы Е С ТАТ Ь И
Эмбриология УДК 636: 612.64
Морфобиохимическая характеристика
скелетных мышц кур в эмбриогенезе
на примере линий Б-56 и Б-79
Е.Н. Борхунова1, доктор биологических наук ([email protected]), Г.В. Кондратов1, соискатель,
В.Ю Титов2, доктор биологических наук ([email protected])
1
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная
академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (Москва).
2
ГНУ Всероссийский научно+исследовательский и технологический институт птицеводства (МО, Сергиев Посад).
На основании гистологических, морфометрических и биохимических методов изучены общие закономерности
и особенности гистогенеза скелетных мышц (грудные мышцы и четырехглавая мышца бедра) у эмбрионов линий
Б-79 (мясо-яичная) и Б-56 (мясная). Выявлены структурные и морфометрические различия развивающихся мышц
у изучаемых линий кур, а также определены корреляции между структурным состоянием и биохимическими
показателями, отражающими особенности их дифференцировки.
Ключевые слова: скелетные мышцы, эмбриональный
метаболизм оксида азота, эмбрионы кур
Сокращения: ДНКЖ — динитрозильные комплексы
железа
Введение
Птицеводство — одна из важных отраслей сельского хозяйства, обеспечивающая население продовольствием. В этой связи поиск способов повышения продуктивности, в частности, кур мясного направления, остается одной из актуальных проблем
сельскохозяйственного производства. Этой цели, несомненно, служит селекционно-племенная работа, которая базируется на оценке продуктивности птицы,
поддержании чистоты пород, линий и кроссов. Как
известно, большинство методов оценки реализуют
после вылупления птицы и в убойном возрасте [2, 11].
В настоящее время показано, что интенсивность метаболизма оксида азота в эмбрионе прямо коррелирует с мясной продуктивностью взрослых особей и может служить очень чувствительным критерием при
определении направления продуктивности: у эмбрионов мясных и яичных форм содержание метаболитов оксида азота в амнионе и аллантоисе различается на два порядка [17]. Очевидно, что интенсивность
эмбрионального метаболизма оксида азота — генетически обусловленный признак, поскольку внутри линии и кросса различия составляют не более 10 %. Указанный метод может найти применение в птицеводстве, так как позволяет в эмбриональном периоде развития, не причиняя ущерба зародышу, определить
направление его продуктивных качеств [16]. Вместе с
тем, для обоснования метода необходимо выявить взаимосвязь между биохимическими показателями, особенностями гистогенеза мышц эмбриона и мясной
продуктивностью взрослых особей. Можно полагать,
что эти различия связаны со спецификой развития
скелетных мышц у кур различного направления продуктивности. Однако работы, посвященные изучению
гистогенеза мышц кур единичны, а исследования
в сравнительном аспекте не проводились [1, 3, 5, 8, 10,
12, 13].
22
Цель исследования
Выявить морфобиохимическую корреляцию между особенностями эмбриогенеза скелетных мышц кур мясного и яичного направлений продуктивности и интенсивностью эмбрионального метаболизма оксида азота посредством комплексных микроскопических и биохимических исследований.
Материалы и методы
Объектами исследования служили 6-, 12- и 19-дневные
эмбрионы кур породы Плимутрок линия Б-79 (мясояичная) и Корниш Б-56 (мясная).
Для гистологических исследований материал фиксировали в 10%-м растворе формалина, заливали
в парафин по общепринятой методике, готовили срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином
и пикрофуксин-фукселином. Изучение гистологической картины, микрофотосъемку и микроскопическую
морфометрию со статистической обработкой выполняли с помощью микроскопа Jenamed, совмещенного с
программой анализа микроскопического изображения
ImageScope.
Содержание продуктов окисления NO определяли с
помощью ферментного сенсора, основанного на свойстве нитрита (NO2-), S-нитрозотиолов (RSNO), ДНКЖ и
нитропроизводных органических соединений (RNO2)
ингибировать фермент каталазу в присутствии галоидионов, и на утрате ими этого свойства под действием определенных факторов, различных для каждой
группы соединений. Содержание нитрата (NO3-) определяли посредством его восстановления до нитрита
хлоридом ванадия с последующим определением как
нитрита. Данный метод позволяет с высокой степенью
чувствительности (до 50 нМ) определить весь спектр
продуктов окисления NO без предварительной подготовки и очистки образца [18, 19, 24, 25]. Параллельно
применяли классический метод Грисса для определения содержания нитрита [18].
В экспериментах использовали оплодотворенные
яйца ряда пород, линий и кроссов кур, полученные
в ООО «Генофонд». Было исследовано от 20 до 40 эмбрионов каждой породы, линии и кросса. Гомогенаты
РВЖ • СХЖ • № 3/2014
Морфобиохимическая характеристика скелетных мышц кур в эмбриогенезе
на примере линий Б-56 и Б-79
Б
А
2
1
1
3
2
А
Рис. 1. Линия Б,79.
Почка тазовой конечности
6,дневного эмбриона. Гематоксилин и эозин.
А — общий вид, продольный срез:
1 — хрящевой зачаток кости,
2 — закладка мышц, об. 10, ок. 10;
Б — в закладке мышцы видны мышечные
волокна (1), мышечные трубочки (2),
кровеносные сосуды (3), об. 40, ок. 10
Б
2
1
2
Рис. 2. Линия Б,56.
Почка тазовой конечности
6,дневного эмбриона. Гематоксилин и эозин.
А — общий вид, продольный срез:
1 — хрящевой зачаток кости,
2 — закладка мышц, об. 10, ок. 10;
Б — в закладке мышцы видны мышечные
волокна (1) и кровеносные сосуды (2),
об. 20, ок. 10
1
1
2
А
Б
1
3
1
2
А
Б
1
2
1
1
Рис. 3. Линия Б,79.
Зачаток грудных мышц.
Продольный срез.
Гематоксилин и эозин.
А — в зачатке грудной мышцы видны
мышечные трубочки (1), кровеносные
сосуды (2), нервный стволик (3),
об. 20, ок. 10;
Б — область зачатка мышцы
с разрозненными мышечными
волокнами (1), об. 40, ок. 10;
1
2
2
1
эмбрионов на разных стадиях развития получали путем
гомогенизации в стеклянном гомогенизаторе в течение
8 мин с частотой 40 фрикций/мин при температуре
6 °С. Для инкубации использовали инкубаторы
ИПХ-10, температура в которых поддерживалась на
уровне 37,6 °С в инкубационный период, и 37,2 °С в выводной период.
Статистическую обработку результатов проводили
с помощью пакета программ BIOSTAT.
Результаты
Микроскопические исследования. Эмбрионы исследовали на 6-е, 12-е и 19-е сутки инкубации.
На 6-е сутки эмбриогенеза светооптически визуализируются почки тазовой и грудной конечностей. На
Рис. 4. Линия Б,56.
Зачаток грудной мышцы
6,дневного эмбриона. Продольный срез.
Гематоксилин и эозин, об. 10, ок. 10.
А — видны мышечные трубочки (1)
в закладке мышцы и хрящевой зачаток
грудной кости (2);
Б — видны мышечные волокна (1)
в закладке мышцы
и кровеносные сосуды (2)
срезе почки тазовой конечности (рис. 1, 2) определяются зачатки костей и окружающие их зачатки скелетных мышц. В них можно различить миотубулы, содержащие в виде цепочек кубические клетки, а также тонкие мышечные волокна, представляющие собой
эозинофильные тяжи с многочисленными ядрами, располагающиеся вдоль длинной оси закладки конечности. Мышечные трубочки и мышечные волокна вариабельны по длине и располагаются под разными углами друг к другу, что может отражать процесс закладки отдельных мышц.
Зачатки грудных мышц развиты еще слабые и образуют тонкий слой, в котором выделяются мышечные
трубочки и мышечные волокна (рис. 3, 4). Между мышечными волокнами видны соединительнотканные
РВЖ • СХЖ • № 3/2014
23
Е.Н. Борхунова, Г.В. Кондратов, В.Ю. Титов
А
1
Б
В
1
1
2
2
2
3
2
Г
Д
1
Рис. 5. Линия Б,79.
Область бедра 12,дневного эмбриона.
Продольный срез.
2
3
А — общий вид: 1 — модель бедренной
3
кости с признаками оссификации,
2 — скелетные мышцы.
1
2
Гематоксилин и эозин, об. 4, ок. 10.
Б — модель бедренной кости с признаками
оссификации (1), мышечные волокна (2)
2
имеют четкое структурное оформление,
2
располагаются в виде пучков;
заметны кровеносные сосуды (3) в эмбриональной соединительной ткани. Гематоксилин и эозин, об. 20, ок. 10;
В — мышечная (1) и соединительная (2) ткани эмбриона еще не имеют типичных тинкториальных свойств и окрашиваются в коричневатый цвет.
Пикрофуксин,фукселин, об. 40, ок. 10;
Г — область скелетной мышцы с рыхлой упаковкой мышечных волокон: между мышечными волокнами (1) разной толщины видны широкие
прослойки соединительной ткани (2). Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10;
Д — область скелетной мышцы с плотной упаковкой мышечных волокон: между мономорфными мышечными волокнами (1) видны тонкие
прослойки соединительной ткани (2). Гематоксилин и эозин, об.40, ок.10
прослойки с кровеносными сосудами, а также нервными стволиками разного калибра. Кровеносные сосуды
обнаружены не только в местах расположения волокон,
но и в толще зачатка мышцы, где сосредоточены в основном мышечные трубочки. Картина отражает процесс формирования скелетных мышц, топографически
и хронологически сопряженный с процессами их васкуляризации и иннервации. На данном этапе развития мышечная и соединительная ткани не имеют типичных тинкториальных свойств и окрашиваются пик-
рофуксин-фукселином в коричневатый цвет, что соответствует состоянию развития и формирования соматических структур и отражает их морфологическую
незрелость.
При сравнительном изучении зачатков мышц бедра и грудных мышц установлено, что образцы Б-79 превосходят Б-56 по количеству мышечных волокон и их
толщине, а также по количеству кровеносных сосудов (табл. 1). Это свидетельствует о более ранней дифференцировке изучаемых мышц у эмбрионов Б-79.
1. Характеристика мышц бедра и грудных мышц у эмбрионов кур Плимутрок линия Б79 и Корниш линия Б56
Плимутрок линия Б79
Показатель
Зачатки мышц почки тазовой
конечности
Корниш линия Б56
Зачатки мышц почки тазовой
конечности
Зачатки грудных мышц
68±2
+
5,76±0,71
72,8±8
9±1
70±1
+
5,26±0,64
84,4±5,5
11,5±1,5
67±2
+, единичные
4,1±1,1
–
8,5±0,5
Мышцы бедра
Грудные мышцы
Мышцы бедра
Грудные мышцы
6,65±1,06 и 11,0±1,4
8,2±1,5 и 11,7±2,4
7,25±1,6
134±25 и 78±12
77,3±9,5
135±38,8
7,5±0,5
75±19
6±1
54,7±11,4
4,5±0,5
84,8±8
7,5±1,4
Рыхло расположены
154±20,7 и 70,4±12,9
8,5±0,5
64,3±8,8
6,4±1,05
Появляется поперечная
исчерченность
6,24±1,14
4,8±0,87 и 6,9±1,1
7,6±0,78
60±11,7
50±10,5
4,5±0,5
5,7±2,4
16,7±3,5
106±17,5
Рыхло расположены
60,6±11,5
4,5±0,5
21,2±3,2
38,7±12,8
32±9
103±19,4
5±0,5
5,8±1,5
24,7±7,5 и 56,8±5,2
224±8,7
Зачатки грудных мышц
6е сутки
Число миобластов в поле зрения*
Наличие мышечных волокон
Толщина мышечных волокон, мкм
Толщина пучков мышечных волокон, мкм
Число кровеносных сосудов в поле зрения**
67±2
+
5,89±1,27
116±5,4
13±1
12е сутки
Показатель
Толщина мышечных волокон, мкм
Толщина пучков мышечных волокон, мкм
Число кровеносных сосудов в поле зрения**
Толщина прослоек соединительной ткани, мкм
19е сутки
Толщина мышечных волокон, мкм
Толщина пучков мышечных волокон, мкм
Число кровеносных сосудов в поле зрения**
Толщина эндомизия, мкм
Толщина перимизия, мкм
Толщина эпимизия, мкм
24
РВЖ • СХЖ • № 3/2014
5±1,0
21,4±4,6
52,7±11
30±3,2
Морфобиохимическая характеристика скелетных мышц кур в эмбриогенезе
на примере линий Б-56 и Б-79
А
1
Б
В
2
2
1
3
1
2
1
Рис. 6. Линия Б,56. Область бедра 12,дневного эмбриона. Продольный срез. Гематоксилин и эозин.
А — общий вид: 1 — модель бедренной кости с признаками оссификации, 2 — скелетные мышцы, об. 4, ок. 10;
Б — продольный срез: мышечные волокна скелетной мышцы (1) тонкие, разделены прослойками рыхлой соединительной ткани (2), заметны
кровеносные капилляры (3), об. 40, ок. 10;
В — поперечный срез: 1 — мышечные волокна, клетки,сателлиты (показаны красными стрелками), 2 — соединительная ткань, 3 — кровеносные
капилляры, об. 40, ок. 10
А
Б
В
2
1
2
1
1
2
3
2
2
3
1
4
5
Рис. 7. Линия Б,79. Область грудины 12,дневного эмбриона. Продольный срез. Гематоксилин и эозин.
А — общий вид: 1 — хрящевая модель грудной кости с признаками оссификации, 2 — скелетные мышцы, об. 4, ок. 10;
Б — видны тонкие, многоядерные мышечные волокна (1); по периферии заметны клетки,сателлиты (показаны стрелками), соединительная ткань
(2) между пучками мышечных волокон, об. 40, ок. 10;
В — поперечный срез. Мышечные волокна (1) окружены клетками,сателлитами (2), образуют пучки, между которыми расположена соединительная
ткань (3), заметны нервный стволик (4), кровеносный капилляр (5), об.40, ок.10
На 12-е сутки эмбриогенеза на срезе тазовой конечности можно видеть хрящевую модель кости со сформированной диафизарной костной манжетой (рис. 5),
окруженную скелетными мышцами. В их структуре отчетливо дифференцированы волокна, объединенные
в пучки и разделенные прослойками тонковолокнистой
соединительной ткани, в которой обнаружена и белая жировая ткань (рис. 6, 7). Мышечные волокна толще, чем в предыдущий срок (см. табл. 1). По периферии
волокон отмечены многочисленные округлые клетки,
которые, как известно, могут дифференцироваться
в направлении миосимпластов или миосателлитов. Плотность упаковки мышечных волокон неодинакова. В одних регионах они неоднородны по толщине, расположены рыхло и разделены широкими прослойками
соединительной ткани (см. рис. 6), в других — плотно
упакованы, практически одинаковой толщины, а соединительнотканный компонент здесь представлен тонкими прослойками (см. рис. 7). Мозаичная картина с
сочетанием в пределах мышцы регионов с разным структурным оформлением может отражать асинхронное
формирование мышцы, что совпадает с данными литературы [9].
При сравнительной оценке структурного состояния
четырехглавой мышцы бедра выявлено, что в образцах Б-79 волокна в пределах одного пучка неоднородны
по толщине: более толстые характеризуются эксцент-
ричным расположением ядер, другие вдвое тоньше, с
центральным расположением ядер. Волокна объединены
в пучки вариабельной толщины (см. табл. 1). В образцах
Б-56, напротив, мышечные волокна одной толщины
(меньше, чем у образцов Б-79) и формируют практически одинаковые по толщине пучки. При этом более мощные соединительнотканные прослойки выявлены в образцах Б-56. В то же время по количеству кровеносных
капилляров они уступают образцам Б-79 (см. табл. 1).
В грудных мышцах мышечные волокна толще, чем
в предыдущий период, в обеих изучаемых сериях. При
этом структурная организация грудных мышц отличается от таковой мышц бедра меньшей толщиной мышечных волокон, которые формируют тонкие, рыхло
упакованные пучки с хорошо развитыми прослойками
соединительной ткани (см. табл. 1, рис. 8).
В поверхностной и глубокой грудной мышцах в образцах Б-79 обнаружено чередование толстых и тонких
волокон, тогда как в образцах Б-56 волокна мономорфны. В то же время пучки мышечных волокон в образцах
Б-79 имеют монотонное оформление, а в образцах Б-56
отмечены более тонкие и более толстые пучки. В образцах Б-56 плотность упаковки пучков мышечных волокон уменьшается благодаря более выраженным, по
сравнению с Б-79, прослойкам соединительной ткани.
Кроме того, грудные мышцы образов Б-56 превосходят
Б-79 по уровню кровоснабжения (см. табл. 1).
РВЖ • СХЖ • № 3/2014
25
Е.Н. Борхунова, Г.В. Кондратов, В.Ю. Титов
А
2
Б
В
2
1
2
2
1
2
1
2
1
3
1
2
Рис. 8. Линия Б,56. Область грудины 12,дневного эмбриона. Продольный срез. Гематоксилин и эозин.
А — общий вид: 1 — хрящевая модель грудной кости с признаками оссификации, 2 — скелетные мышцы, 3 — кожный покров, об. 4, ок. 10;
Б — продольный срез: тонкие мышечные волокна (1) окружены клетками,сателлитами (стрелки), разделены широкими прослойками соединительной
ткани, об. 40, ок. 10;
В — поперечный срез: 1 — мышечные волокна, 2 — прослойки соединительной ткани, об. 40, ок. 10
1
1
1
А
2
Б
В
1
2
3
Г
2
Д
1
1
1
1
1
Е
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Ж
З
2
Рис. 9. Линия Б,79.
2
Мышцы бедра 19,дневного эмбриона.
Продольный срез.
2
1
2
А — в скелетной мышце отчетливо
1
1
различимы плотно упакованные пучки
1
мышечных волокон (1)
1
1
и соединительнотканные компоненты:
1
эпимизий (2), перимизий (3).
Пикрофуксин,фукселин, об. 10, ок. 10;
Б — пучки мышечных волокон плотно
упакованы, в них отчетливо видна
поперечная исчерченность. Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10;
В — в структуре скелетной мышцы видны мышечные волокна (1) и перимизий (2). Пикрофуксин,фукселин, об. 40, ок. 10;
Г — поперечный срез: пучки мышечных волокон плотно упакованы, разделены прослойками соединительной ткани (1). Гематоксилин и эозин,
об. 40, ок. 10;
Д — область мышцы с рыхлым расположением пучков мышечных волокон (1). Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10;
Е — область мышцы с рыхлым расположением пучков мышечных волокон (1). Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10;
Ж — поперечный срез: область мышцы с рыхлым расположением пучков мышечных волокон (1). Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10;
З — область мышцы с рыхлым расположением пучков мышечных волокон (1). Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10
26
РВЖ • СХЖ • № 3/2014
Морфобиохимическая характеристика скелетных мышц кур в эмбриогенезе
на примере линий Б-56 и Б-79
Б
А
Рис. 10. Линия Б,56.
Мышцы бедра 19,дневного эмбриона.
Продольный срез.
Гематоксилин и эозин, об. 40, ок. 10.
А — область мышцы с рыхлым
расположением пучков мышечных волокон
и большим количеством клеток,сателлитов;
Б — тонкие мышечные волокна рыхло
упакованы, видны их разветвления
и перераспределения
Б
А
2
1
1
Рис. 11. Линия Б,79.
Грудные мышцы 19,дневного эмбриона.
Поперечный срез.
А — видны рыхло упакованные пучки
мышечных волокон (1) и соединительнотканные
компоненты: эпимизий (2), перимизий (3).
Пикрофуксин,фукселин, об. 4, ок. 10;
Б — видны пучки мышечных волокон (1),
рыхло упакованные и окруженные
соединительной тканью (2).
Гематоксилин и эозин, об. 10, ок. 10
1
1
3
1
1
3
2
1
1
1
А
1
1
2
Б
1
2
1
1
1
1
1
1
На 19-е сутки эмбриогенеза в мышцах бедра
(рис. 9, 10) отчетливо идентифицируются мышечная
и соединительная ткани, которые приобретают характерные тинкториальные свойства при окраске пикрофуксин-фукселином (модификация метода Ван-Гизона): мышечная ткань приобретает коричневато-желтый
цвет, соединительная — красный. Соединительная ткань
по своей структурной организации приближается к дефинитивной, она формирует типичные эндомизий, перимизий и эпимизий. Это свидетельствует о том, что к
19-дневному сроку структура скелетных мышц эмбриона близка к постнатальной. Мышечные волокна и
образуемые ими пучки тоньше, чем в предыдущий срок
исследования (см. табл. 1); в то же время возрастает
плотность их упаковки. Такая картина может отражать
процесс дифференцировки мышечной ткани.
Примечательно, что в образцах Б-79 отчетливо видна
поперечная исчерченность, которая в этот срок не выявляется в образцах Б-56. Можно полагать, что это связано с большей активностью процессов биосинтеза в
мышечных волокнах эмбрионов Б-79, в связи с чем в них
образуется больше миофибрилл, чем в серии Б-56.
При сравнительной оценке выявлено, что в четырехглавой мышце бедра в образцах Б-56 пучки различаются по толщине, тогда как в образцах Б-79 мышечные
волокна однородны. В то же время пучки мышечных
волокон в обеих сериях имеют одинаковую толщину.
Рис. 12. Линия Б,56.
Мышцы бедра 19,дневного эмбриона.
Продольный срез. Пучки мышечных волокон
(1) плотно упакованы, разделены
прослойками эндо, и перимизия (2).
А — поперечный срез,
пикрофуксин,фукселин, об. 40, ок. 10;
Б — продольный срез, гематоксилин
и эозин, об. 40, ок. 10
По показателю толщины соединительнотканных прослоек образцы Б-56 несколько превосходят образцы Б79. Различия по количеству кровеносных капилляров в
образцах Б-79 и Б-56 нами не выявлены (см. табл. 1).
Грудные мышцы в этот срок имеют выраженное
структурное оформление (рис. 11, 12). Мышечные волокна здесь существенно тоньше, чем в мышцах бедра (см. табл. 1), и формируют рыхло упакованные пучки с хорошо развитыми прослойками соединительной
ткани.
В грудных мышцах в образцах Б-79 волокна более тонкие и формируют пучки, которые почти вдвое тоньше,
чем таковые в образцах Б-56. Образцы Б-56 существенно превосходят образцы Б-79 по толщине эндо- и перимизия, в них же отмечено и большее количество кровеносных капилляров (см. табл. 1).
Исследование метаболизма эмбрионального оксида
азота. При изучении эмбрионального метаболизма
(рис. 13…15) оксида азота установлено, что в гомогенате неоплодотворенного куриного яйца содержатся различные нитро- и нитрозосоединения в концентрации
до нескольких мкМоль. С 1-е по 3-и сутки развития
их общая концентрация увеличивается до 150 мкМоль.
В эмбрионах линий Б-56 и Б-79 пул соединений, накопившихся к 3-м суткам, представлен, главным образом,
донорами NO: RSNO, ДНКЖ и RNO2, которые опосредуют физиологические эффекты NO [21…23]. Содер-
РВЖ • СХЖ • № 3/2014
27
Е.Н. Борхунова, Г.В. Кондратов, В.Ю. Титов
Рис. 13. Зависимость общего содержания доноров NO в эмбрионах кур
линий Б,56 и Б,79 на разных сроках эмбриогенеза
жание доноров в гомогенате эмбриона у эмбрионов
Б-56 и Б-79 на 3-и сутки одинаковое; на 4…5-е сутки
в эмбрионах Б-56 оно резко снижается при пропорциональном увеличении содержания нитрата. В эмбрионах Б-79 такая трансформация не выявлена. Суммарное содержание нитро- и нитрозосоединений с 4-х по
11-е сутки оставалось стабильным. Это может свидетельствовать о практически одинаковой интенсивности синтеза NO в сравниваемых группах, а также о различной интенсивности его трансформации, показателем которой служит интенсивность трансформации доноров NO.
После 11-х суток содержание нитро- и нитрозосоединений в эмбрионе резко возрастает, что может быть
связано с активизацией процессов роста и дифференцировки, которые сопровождаются активацией NO-синтетаз [20].
Содержание доноров NO в амниотической жидкости оставалось постоянным с 7-х по 14-е сутки, содержание нитрата за пределами амниона также остается
стабильным с 7-х по 11-е сутки и увеличивается после 12-х суток, причем между сравниваемыми нами
образцами Б-56 и Б-79 выявлены существенные различия (табл. 2).
2. Содержание метаболитов NO, мкМоль, в амнионе
и в аллантоисе эмбрионов кур Плимутрок линия Б79
и Корниш линия Б56 на 11е и 14е сутки инкубации
Породы, линии
Амнион
Аллантоис
Доноры NO
NO3"
35±15
10±5
152±15
5250±250
10±6
4±2
25±10
8,5±1,5
410±30
5100±270
25±6
16±4
Доноры NO
Рис. 14. Зависимость общего содержания нитрата NO3, в эмбрионах кур
линий Б,56 и Б,79 на разных сроках эмбриогенеза
Рис.15. Зависимость общего содержания всех метаболитов NO
в эмбрионах кур линий Б,56 и Б,79 на разных сроках эмбриогенеза
3. Содержание нитро и нитрозосоединений, нМ/г,
в тканях эмбрионов кур Плимутрок линия Б79
и Корниш линия Б56*
Линия
Туловище
Доноры NO
NO3"
Голова
Доноры NO
Конечности
NO3"
Доноры NO
NO3"
6е сутки
Б79
30±15
0,2±0,1
10±5
2±1
–
–
Б56
30±10
370±15
7±3
2±1
–
–
10е сутки
Б79
5,0±2,0
3,6±1,5
12±5
6±4
25±1,5
30±10
Б56
5,0±2,5
68±7,5
10±7
3±1
23±2,0
870±30
Б79
4,5±2,0
5,8±1,5
3±1
13±5
19±8
13е сутки
50±15
Б56
7,5±2,5
58±8
40±15
5±2
11±4
880±25
Примечание. * В зародыше состав доноров NO следующий: RSNO — 20…40 %,
ДНКЖ — 60…80 %, RNO2 — следы.
11е сутки
Корниш линия Б"56
Плимутрок линия Б"79
14е сутки
Корниш линия Б"56
Плимутрок линия Б"79
Содержание доноров NO в тканях зародыша Б-79
и Б-56 на 6-е сутки инкубации было примерно одинаковым (табл. 3). В то же время содержание нитрата
существенно различалась: в туловище образцов Б-56 нитрат обнаружен в значительном количестве, в то время
как в образцах Б-79 отмечены его следы. На 10…13-е
сутки нитрат концентрировался в конечностях, при
этом по данному показателю образцы Б-56 достоверно превосходят образцы Б-79.
Полученные результаты соответствует приведенным
выше морфологическим данным, согласно которым, на
28
12-е сутки отмечены выраженные признаки дифференцировки скелетных мышц, существенное утолщение
мышечных волокон и их пучков, развитие соединительнотканного каркаса. В этот срок прогрессивное развитие мышц особенно заметно у эмбрионов Б-56.
Можно полагать, что синтез доноров NO протекает в системе «амнион–зародыш», и в ней же доноры
трансформируются до нитрата, который удаляется за
пределы амниона. Вместе с тем, вопрос о продукции доноров NO в амнионе остается открытым. Но их трансформация в нитрат, по-видимому, происходит в зародыше, поскольку только через него осуществляется выход
из системы амнион–зародыш, в то время как в амниотической жидкости нитрат, как и нитрит, отсутствует (см. табл. 3, 4).
Таким образом, после 4…5-х суток NO-зависимые
процессы в зародыше продолжаются, но уже исключи-
РВЖ • СХЖ • № 3/2014
Морфобиохимическая характеристика скелетных мышц кур в эмбриогенезе
на примере линий Б-56 и Б-79
тельно за счет внутризародышевых источников оксида
азота, интенсивность которых, судя по данным табл. 3,
пропорциональна интенсивности метаболизма NO.
Имеют ли эти процессы ту же природу, что и процессы на 1…4-е сутки, или иную, пока не известно. Однако их взаимосвязь очевидна — содержание нитрата
в мышцах на 18-е сутки прямо коррелирует с его содержанием в аллантоисе (r=0,81). Как видно из данных
табл. 4, в образцах мясной линии Б-56 содержание нитрата в мышцах бедра и грудных мышцах, а также в аллантоисе существенно превышает таковые у яичной
линии Б-79.
4. Содержание нитро и нитрозосоединений, нМ/г,
в мышцах 18суточных зародышей у эмбрионов кур
Плимутрок линия Б79 и Корниш линия Б56 в сравнении
с содержанием этих соединений, мкМоль/л, в амнионе
и аллантоисе эмбрионов на 12е сутки*
Мышцы грудные Мышцы бедра и голени Аллантоис Амнион
Линия
Б"56
NO3"
NO3"
NO3"
RNO+
RNO2
1300±72
860±44
135±18
12±5
Б"79
190±14
170±15
<0,1
5200±270
*Коэффициент корреляции между содержанием нитрата в амнионе
и в мышцах, исходя из данных таблицы, равен 0,79.
Обсуждение
В результате проведенных исследований установлены
как общие закономерности, так и особенности гистогенеза скелетных мышц у изучаемых линий кур, а также определены корреляции между структурным состоянием и биохимическими показателями, отражающими характер их дифференцировки и направление
морфологических преобразований.
Так, у эмбрионов сравниваемых линий Б-56 и
Б-79 темпы развития четырехглавой мышцы бедра
опережают таковые грудных мышц, что подтверждается более ранней дифференцировкой в их структуре
мышечных волокон и их пучков. По нашим данным,
по показателям толщины мышечных волокон и их
пучков мышцы бедра опережают грудные мышцы,
а по показателям толщины соединительнотканных
прослоек отстают от них. Эти закономерности ростовых процессов противоположны таковым в постнатальном онтогенезе [1, 3, 4, 8, 12, 13], в ходе которого грудные мышцы по темпам утолщения мышечных
волокон и их пучков превосходят мышцы бедра, а
по развитию соединительной ткани уступают им. Морфогенез мышечных волокон проявляется, в частности, их утолщением и истончением или формированием волокон разной толщины в пределах одного пучка, что соответствует известной закономерности формирования мышц [9].
При сравнительной оценке изучаемых линий выявлено, что у яичной линии Б-79 к 6-м суткам зачатки
мышц бедра и грудных мышц дифференцированы лучше, чем у мясной линии Б-56. Это проявляется формированием мышечных волокон и их пучков. У Б-56
процесс миогенеза, по-видимому, менее активен, при
этом в зачатке мышц бедра мышечные волокна единичны, а в грудных мышцах они не визуализируются. Данной морфологической картине соответствует
определенный биохимический статус, а именно близкие значения содержания доноров NO в тканях зародышей Б-79 и Б-56 при наличии нитрата в туловище
Б-56.
На 12-е сутки эмбриогенеза наблюдали утолщение
мышечных волокон по сравнению с предыдущим сроком. На этом фоне у яичной линии, в отличие от мясной, отмечена дифференцировка мышечных волокон
на толстые и тонкие. Мышечные волокна при этом
образуют пучки, которые неоднородны в грудных
мышцах и мышцах бедра. Так, у яичной линии Б-79
в мышцах бедра отчетливо видны более толстые и более тонкие пучки, тогда как грудные мышцы сформированы пучками, однородными по толщине. В образцах Б-56 наблюдали обратную картину: мышцы
бедра сформированы пучками, однородными по толщине, в то время как в грудных мышцах пучки подразделяются на тонкие и толстые. Соединительная
ткань в образцах обеих линий лучшего развития достигает в мышцах бедра. При этом более мощные соединительнотканные прослойки наблюдают у мясной линии Б-56. Морфологическая картина прогрессирующей дифференцировки мышечной ткани
коррелирует с биохимическими данными, согласно
которым, в период с 7-х по 11-е сутки содержание
нитрата за пределами амниона также остается стабильным, существенно возрастая после 12-х суток.
По этому показателю образцы Б-56 достоверно превосходят Б-79.
К 19-м суткам мышечная ткань приобретает характерные тинкториальные свойства. При этом в образцах Б-79 в мышцах бедра появляется поперечная исчерченность, что свидетельствует об опережающих
темпах формирования миофибрилл по сравнению с
мышцами Б-56. Примечательно, что у Б-79 мышечные
волокна становятся однородными по толщине независимо от топических особенностей. Образуемые ими
пучки также однородны по толщине, но в бедренных
мышцах они мощнее, чем в грудных. У эмбрионов
Б-56 в мышцах бедра мышечные волокна дифференцированы на тонкие и толстые, что не выражено в грудных мышцах. Вместе с тем, пучки мышечных волокон
толще почти вдвое в грудных мышцах, чем в бедренных и в изучаемых мышцах Б-79. Соединительнотканные прослойки также мощнее в мышцах мясной линии Б-56. Такая дифференцировка хорошо коррелирует с метаболическим статусом. Так, установлено, что
содержание нитрата в мышцах на 18-е сутки находится в прямой зависимости от его содержания в аллантоисе и имеет специфические показатели для Б-79 и
Б-56. При этом содержание нитрата в мышцах бедра
и грудных мышцах Б-56 значительно выше, чем в аналогичных структурах Б-79.
Выводы
На основании полученных данных можно заключить,
что на ранних этапах развития эмбрионы яичной линии Б-79 опережают аналогов мясной линии Б-56 по
темпам дифференцировки зачатков мышц, а на финальных этапах пренатального развития — по появлению
феномена поперечной исчерченности. Однако эмбрионы Б-56 не уступают возрастным аналогам Б-79 к
12-м суткам по показателям толщины мышечных волокон и их пучков, а к 19-м суткам эмбриогенеза превосходят их по этому показателю (грудные мышцы) и
по развитию соединительнотканного каркаса (грудные
и бедренные мышцы).
РВЖ • СХЖ • № 3/2014
29
Е.Н. Борхунова, Г.В. Кондратов, В.Ю. Титов
Установлено, что существует взаимосвязь между морфологическими характеристиками развивающейся
мышцы и показателями эмбрионального метаболизма оксида азота. Так, на ранних этапах дифференцировки скелетных мышц, несмотря на некоторые их морфологические отличия (зачатки мышц лучше дифференцированы у Б-79) содержание оксида азота и его доноров в сравниваемых группах практически одинаково.
К 12-м суткам содержание оксида азота вне амниона
существенно увеличивается, а на 18-е сутки концентрация этого соединения в мышцах и аллантоисе имеет прямую корреляционную связь.
Очевидно, что морфологические признаки, отражающие процессы дифференцировки и роста скелетных
мышц, у мясной линии Б-56 выражены не столь ярко,
как у яичной Б-79. Можно полагать, что миогенез у
Б-56 активизируется несколько позже, чем у Б-79.
Результаты проведенных комплексных морфологических исследований не только вносят дополнения в
сведения об эмбриогенезе скелетных мышц птиц, но
и являются базовыми для использования в практическом птицеводстве, поскольку служат научным обоснованием внедрения перспективного метода экспрессоценки принадлежности эмбриона к мясному или яичному направлению по содержанию метаболитов оксида азота.
Библиография
1. Баданина, А.В. Возрастные изменения мышц кур кросса «Смена-4» при напольном
содержании: дис. ... кандидата биологических наук: защищена 16.00.02. / А.В. Баданина — Иваново, 2006. - 126 с.: ил. РГБ ОД, 61 06-3/983
2. Боголюбский, С. И. Селекция сельскохозяйственной птицы / С.И. Боголюбский. —
М.: Агропромиздат, 1991. — 285 с.
3. Бусева, Л.В. Возрастная морфология скелета и мышц плечевого пояса кур кросса «Хайсекс-браун»: автореф. дис. … канд. биол. наук / Л.В. Бусева — Брянск: Новозыбковская городская типография 2011. — 18 с.
4. Вракин, В.Ф. Анатомия и гистология домашней птицы / В.Ф. Вракин, М.В. Сидорова.
— М.: КолосС, 2001. — 426 с.
5. Данилов, Р.К. Пролиферация и дифференцировка изолированных клеток и симпластов скелетной мышечной ткани куриных эмбрионов / Р.К. Данилов, З.Б. Ишмеева //
Архив анатомии, гистологии и эмбриологии, — 1988. — Т. 94. — № 1. — С. 79–83.
6. Данилов, Р.К. Миосателлитоциты как источник регенерации скелетной мышечной
ткани / Р.К. Данилов, Х.Х. Мурзабаев, И.А. Одинцова, Э.А. Елагина // Успехи современной биологии. — 2002. — Т. 122. — № 3. — С. 272–280.
7. Данилов, Р.К. Раневой процесс: гистогенетические основы / Р.К. Данилов. — СПб.: ВМедА им. С.М.Кирова, 2008. — 380 с.
8. Жемухова, М.Ч. Мускулатура крыла домашних кур в постнатальном онтогенезе:
автореф. дисс. канд. биол. наук, 2000 / М.Ч. Жемухова. — Ставрополь.,
1999. — 20 с.
9. Клишов, A.A. Гистогенез соматической мускулатуры и ее нервных элементов: автореф.
дис. … канд. мед. наук / A.A. Клишов. — Л., 1960.
10. Клишов, A.A. Гистогенез и регенерация тканей / A.A. Клишов. — Л.: Медицина,
1984. — 232 с.
11. Кочиш, И.И. Совершенствование и разработка эффективных методов селекции мясной птицы: автореф. дис. …докт. с/х. наук / И.И. Кочиш. — М.,
1992. — 37 с.
12. Пануев, М.С. Анатомо-гистологические изменения мышц у мясных кур с возрастом:
автореф. дис. … канд. биол. наук, 2008 / М.С. Пануев. — Иваново: Ивановская ГСХА им.
Академика Д.К. Беляева, 2007. — 21 с.
13. Перевозчикова, В.Н. Морфометрическая характеристика тушек и химический состав мышц цыплят-бройлеров кросса «Смена-7»: автореф. дис. … канд. биол. наук. / В.Н.
Перевозчикова. — М.: 11-ый формат. — 18 с.
14. Титов, В.Ю. Окись азота в эмбриогенезе / В.Ю. Титов, Э.З. Винникова, В.И. Фисинин, Г.Н. Близнецова, М.И. Рецкий // Доклады РАСХН. — 2008. — Т. 34. — №4. —
С. 44–46.
15. Титов, В.Ю. Метаболизм окиси азота в эмбрионах быстро и медленнорастущих форм
сельскохозяйственной птицы / В.Ю. Титов, Н.С. Акимова, Э.З. Винникова, В.И. Фисинин // Доклады РАСХН. — 2009. — Т. 35. — №4. — С. 47–48.
16. Титов, В.Ю. Метаболизм оксида азота в тканях зародыша птиц / В.Ю. Титов, О.В. Косенко, Н.С. Акимова, В.И. Фисинин // Доклады РАСХН. — 2013. – Т .39. — №4. —
С. 44–47.
17. Титов, В.Ю. Определение нитрита и нитрозосоединений в биосистемах калориметрическим методом / В.Ю. Титов, Ю.М. Петренко, А.Ф. Ванин, И.И. Степуро // Биофизика. — 2010. — Т. 55. — №1. — С. 95–106.
18. Титов, В.Ю. Ферментативный сенсор для определения содержания нитро- и
нитрозосоединений в биообъектах / В.Ю. Титов, Ю.М. Петренко, А.Ф. Ванин
// Клиническая лабораторная диагностика. — 2009. — № 9. — С. 6–14.
19. Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Ванин А.Ф. Способ определения нитрозосоединений и
нитрита в биообъектах. // Патент РФ №2395096, рег. 20 июля 2010 г.
20. Severina, I. Activation of soluble guanylate cyclase by NO donorsnitrosothiols,
and dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing ligands / I. Severina, O. Bussygina, N. Pyatakova, I. Malenkova and A. Vanin // Nitric Oxide. — 2003. — V. 8. —
P. 155–163.
21. Titov, V.Yu. The Enzymatic Technologies Open New Possibilities for Studying Nitric
Oxide (NO) Metabolism in Living Systems / V.Yu. Titov // Current Enzyme Inhibition. —
2011. — V. 7. — N. 1. — P. 56–70.
22. Titov, V. Significance of Nitrogen Oxide and Its Metabolites in the Development of Embryos
/ V. Titov, E. Vinnikova, V. Fisinin, G. Bliznetsova and M. Retsky // Russian Agricultural
Science. — 2008. — V. 34. — P. 264–265.
23. Vanin, A. Dinitrosyl iron complexes with thiolate ligands: physicochemistry, biochemistry and physiology / A. Vanin // Nitric Oxide. — 2009. — V. 21. — P. 1–13.
24. Lee, H. Nitric Oxide as a messenger molecule for myoblast fusion / H. Lee, M. Baek,
K. Moon, W. Song, Ch. Chung, D. Ha, M-S. Kang // J. Biol. Chem. — 1994. — V. 269. —
P. 14371–14374.
25. Ignarro, L. Biological actions and properties of endothelium-derived nitric oxide formed
and released from artery and vein / L. Ignarro // Circulation Research. — 1989. —
V. 65. — P. 1–21.
SUMMARY
E.N. Borkhunova1, G.V. Kondratov1, V.Y. Titov2
1
Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology named after K.I. Skryabin (Moscow).
2
All"Russian Scientific Research and Technological Institute of the Poultry Raising (Sergiev Posad).
Morphobiochemical Characteristic of Skeleton Muscles of Hens in an Embryogenesis on an Example of
Lines Б56 and Б79. On the basis of histological, morphological and biochemical methods the general patterns
and features of a histogenesis of skeleton muscles (pectoral muscles and a hip muscle) in embryos of lines Б"79
(meat"egg) and Б"56 (meat) are studied. Are taped structural and morphological differences of developing muscles
at studied lines of hens, and also correlations between a structural condition and the biochemical indicators reflecting
features of their differentiation are defined transformations.
«Journal of Small Animal Practice/Российское издание» —
первое переводное научно-практическое издание для ветеринарных врачей,
освещающее проблемы лечения и профилактики заболеваний мелких домашних животных.
Оригинальное издание «Journal of Small Animal Practice» —
официальный печатный орган Всемирной ассоциации ветеринарии мелких домашних животных (WSAVA)
и Британской ассоциации ветеринарии мелких домашних животных (BSAVA)
Подписка на журнал осуществляется через редакцию и каталог Почта России.
Издательский дом «Логос Пресс», 127055, Москва, а/я 9.
Http://logospress.ru/, e-mail: [email protected].
Тел/факс: +7 (495) 220-48-16
30
РВЖ • СХЖ • № 3/2014