На правах рукописи СТАНКОВИЧ ЕЛЕНА БОРИСЛАВОВНА
реклама
На правах рукописи СТАНКОВИЧ ЕЛЕНА БОРИСЛАВОВНА РОЛЬ НАРУШЕНИЙ ФУНКЦИИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ РЕАЛИЗАЦИИ ПРОГРАММ ЭКО У ПАЦИЕНТОК С БЕСПЛОДИЕМ 14.00.01. - акушерство и гинекология 14.00.36. - аллергология и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2009 Работа выполнена на кафедре акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова и в отделении сохранения и восстановления репродуктивной функции, лаборатории клинической иммунологии и отделении вспомогательных технологии в лечении бесплодия ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Татьяна Алексеевна Назаренко доктор медицинских наук Анна Владимировна Шуршалина Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Елена Сергеевна Ляшко доктор медицинских наук, профессор Александр Александрович Ярилин Ведущая организация: ГУЗ областной «Московский научно- исследовательский институт акушерства и гинекологии» Защита диссертации состоится «24» ноября 2009 года, в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.125.01 при ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» Адрес: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» Автореферат разослан «___»____________ 2009 года. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Елена Анатольевна Калинина 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы За последнее десятилетие значительно возросло внимание исследователей к аутоиммунной патологии щитовидной железы, которая наиболее распространена среди женщин репродуктивного возраста [Фадеев В.В. 2003; Speroff L. 2005; Klecha A.J. 2008] и является важным фактором в развитии нарушений репродуктивной функции. Совершенствование программ ВРТ позволило увеличить частоту наступления беременности от 30 до 80 % при бесплодии различного генеза [Назаренко Т.А. 2004; Кулаков В.И. 2004]. Однако наступление беременности в программах ВРТ не является гарантией ее успешного развития. Как известно для этого необходимы три фактора: полноценный эмбрион, рецептивный эндометрий и их эффективное взаимодействие в период «окна имплантации» под влиянием гормональных и иммунных изменений. По мнению большинства авторов неудачи реализации репродуктивной функции связаны не столько с наличием аутоантител к щитовидной железе, а являются cледствием генерализованного аутоиммунного дисбаланса, приводящего к снижению фертильности, нарушению имплантации и развития беременности [Glinoer D. 1997; Rushworth F.H. 2000; Abalovich M. 2000; Matalon S.T. 2001; Gleicher N. 2002; Мельниченко Г.А. 2003; Prummel M.F. 2004; Сидельникова В.М. 2005; Bellver J. 2008]. В литературе активно обсуждается роль RAFS-синдрома: Reproductive Autoimmune Failure Syndrome; «синдром репродуктивных аутоиммунных потерь» при котором описаны многочисленные иммунологические нарушения. Предполагается, что антитиреоидные антитела могут служить маркером генерализованной иммунной дисфункции и сочетаться с другими неорганоспецифическими и органоспецифическими аутоиммунными процессами, влияющим на репродуктивную функцию [Gleicher N. 1998, 2002]. Многими авторами подчеркивается роль антитиреоидных антител как независимого фактора, неблагоприятно влияющего на исход программ ВРТ и на ранние репродуктивные потери [Kim C.H. 1998; Poppe K. 2003]. Обсуждается необходимость комплексной оценки состояния иммунной системы у пациенток с бесплодием и аутоиммунной патологией щитовидной железы на этапе 2 подготовки к ЭКО. В настоящее время требуют детального описания и анализа механизмы влияния антитиреоидных антител на состояние органов репродуктивной системы и реализацию репродуктивной функции в программах ВРТ. Требуют уточнения иммунологические и молекуларно-биологические нарушения, лежащие в основе дефектов рецептивности эндометрия и нарушении механизмов имплантации при аутоиммунной патологии щитовидной железы. Несмотря на достижения современной репродуктологии, в настоящее время нет единого мнения о необходимости проведения патогенетической терапии у пациенток с антитиреоидными антителами перед программой ВРТ, не определены параметры мониторинга и скрининга. Вышеизложенное определило цель настоящего исследования: оценка эффективности программ ЭКО у женщин с бесплодием при аутоиммунной патологии щитовидной железы. Для достижения поставленной цели были сформулированные следующие задачи исследования: 1. Оценить характер репродуктивных нарушений у пациенток программы ЭКО с аутоиммунной патологией щитовидной железы, провести анализ результатов лечения бесплодия и определить возможные причины неудачных исходов программы ЭКО. 2. Оценить особенности состояния иммунной системы у бесплодных женщин с аутоиммунными тиреопатиями путем исследования иммунного статуса и активности аутоиммунных системных процессов. 3. Оценить параметры рецептивности эндометрия в период «окна имплантации» у пациенток программы ЭКО с аутоиммунной патологией щитовидной железы. 4. Провести анализ особенностей фолликулогенеза, оогенеза, раннего эмбриогенеза и эффективности программы ЭКО у пациенток с аутоиммунной патологией щитовидной железы. 5. Выявить факторы, определяющие неудачипрограмм ВРТ у женщин с аутоиммунной патологией щитовидной железы и усовершенствовать алгоритм обследования этих пациенток. 3 Научная новизна На основании комплексного клинико-лабораторного обследования проведена оценка структуры репродуктивных нарушений у пациенток программы ЭКО с аутоиммунной патологией щитовидной железы. Впервые у женщин с аутоиммунной патологией щитовидной железы показано резкое изменение факторов, влияющих на рецептивность эндометрия: в фазу пролиферации выявлено наличие воспалительно-подобных изменений с образованием увеличением рассеянной числа лимфоцитарной плазматических клеток, инфильтрации стромы и натуральных киллеров и макрофагов, усиление процессов апоптоза клеток в эпителии и строме эндометрия. В период «окна имплантации» показано 3-х кратное снижение экспрессии ключевого маркера рецептивности эндометрия – LIF, что сочеталось с неэффективностью программ ЭКО у данных пациенток. Выявлено, что уровень экспрессии маркера плазматических клеток CD138 в эндометрии на 30% выше у женщин с эхографическими признаками аутоиммунного тиреоидита по сравнению с женщинами без структурных нарушений щитовидной железы. Отмечено, что уровень В-лимфоцитов CD19+CD5+ в периферической крови у пациенток с аутоиммунной патологией ЩЖ положительно коррелирует с числом неудачных попыток ЭКО. На основании данных иммуноморфологического исследования механизмы ткани, повреждения проведенного эндометрия приводящие к комплексного впервые низкой описаны эффективности программы ЭКО при аутоиммунной патологии щитовидной железы. Практическая значимость работы В ходе работы определены практически значимые факторы, приводящие к неудачным исходам программ ВРТ при аутоиммунной патологии щитовидной железы. Это позволило предложить расширенный алгоритм обследования пациенток с аутоиммунной патологией щитовидной железы на этапе подготовки к проведению ВРТ и мониторинга. Предложен скрининг маркеров аутоиммунного процесса в щитовидной железе с целью прогнозирования исхода ВРТ. Обосновано включение в алгоритм исследования пациенток перед ВРТ детального иммунологического обследования, позволяющего оценить 4 наличие нарушений в иммунной системе при аутоиммунной патологии щитовидной железы. Исследование эндометрия при АТ-ЩЖ позволило выявить ключевые маркеры нарушения рецептивности и ввести в протокол обследования пациенток с повторными неудачными попытками ЭКО иммуногистохимическое исследование эндометрия. Положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Для женщин с бесплодием и сопутствующей аутоиммунной патологией щитовидной железы характерны низкая эффективность лечения бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий и высокая частота невынашивания беременности после программ ЭКО. 2. У женщин с бесплодием и аутоиммунными тиреопатиями наблюдается существенное изменение параметров иммунного статуса с повышением уровня натуральных киллеров, В-лимфоцитов и повышение частоты встречаемости сопутствующих органоспецифических неорганоспецифических антител, что является (антиовариальных) отражением и системных иммунных нарушений, препятствующих успешной реализации репродуктивной функции. 3. В эндометрии женщин с аутоиммунной патологией щитовидной железы выявлены воспалительно-подобные изменения ткани и 3-х кратное снижение экспрессии ключевого маркера рецептивности LIF, что является важной причиной нарушения имплантации и снижения эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий. Апробация работы Материалы диссертации доложены на V Российском форуме «Мать и дитя», (Москва, 2003), на конгрессе «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний», (Москва, 2004), ХIII Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации, (Дубай, ОАЭ, 2008), III Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2009), 13th Congress of Human Reproduction, (Венеция, Италия, 2009), 29th Annual Meeting of American Society of Reproductive Immunology (Орландо, США, 2009.). 5 Основные положения диссертации и результаты работы доложены на межклинической конференции отделения сохранения и восстановления репродуктивной функции и лаборатории клинической иммунологии ФГУ «НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» 18 мая 2009г. Работа обсуждена на совместном заседании апробационной комиссии кафедры акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ММА им. И.М. Сеченова и ФГУ «НЦ АГ и П им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» 27 мая 2009г. Внедрение результатов исследования в практику Полученные результаты внедрены в практику работы отделения сохранения и восстановления репродуктивной функции ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий» и кафедры акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ММА им. И.М. Сеченова. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 141 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа содержит 26 таблиц, 7 рисунков. Библиографический указатель включает в себя 224 источника, из них 19 отечественных и 205 иностранных авторов. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В соответствии с поставленными задачами нами было обследовано 205 женщин репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным бесплодием, обратившихся для лечения методом ЭКО. По результатам определения уровня в плазме крови ТТГ, Т4св и АТ-ЩЖ, женщины были разделены на 2 группы. Первую (основную) группу исследования составили 117 пациенток с АТ-ТПО и/или АТ-ТГ. Во вторую, группу (сравнения) было включено 88 пациенток без патологии щитовидной железы. Критериями включения в исследование являлись: наличие матки, функционально способной к вынашиванию беременности; наличие одного или двух яичников, доступных для аспирации фолликулов в ходе трансвагинальной 6 пункции; отсутствие острой и подострой форм инфекции TORCH комплекса; отсутствие соматических заболеваний, являющихся противопоказанием к вынашиванию беременности и родам; Критерием эндометрия; системы; исключения злокачественные пороки соматические, послужили: новообразования развития эндокринные гиперпластические органов процессы репродуктивной матки, несовместимые с беременностью; и психические заболевания в стадии декомпенсации; маточный фактор бесплодия (синехии, гистологический подтвержденный хронический эндометрит); мужской фактор бесплодия. Пациенткам исследуемых групп проводились следующие методы исследования: I. Общеклинические методы исследования. II. Специальные методы исследования: 1. Оценка гормонального статуса - определение в крови: ФСГ, ЛГ, Е2, Прл, СТГ, Т, К, Т4св, ТТГ, прогестерона. 2. Эхография щитовидной железы. 3. Консультация эндокринолога. С целью уточнения патологии щитовидной железы все пациентки были консультированы д.м.н., профессором кафедры эндокринологии ММА им. И.М. Сеченова Фадеевым В.В. 4. Эхография органов малого таза. 5. Оценка инфекционного статуса. 6. Иммунологические методы исследования: определение уровней тиреопероксидазе аутоантител к ткани щитовидной железы: к (АТ-ТПО) и тиреоглобулину (АТ-ТГ). Исследование осуществляли иммуноферментными методами, набором «Roche diagnostics» (Германия); - определение антиовариальных антител производили методом ИФА с помощью наборов фирмы ORGENTEC Diagnostika GmbH (Германия) для качественного определения суммарных уровней антител (IgM, IgG); - определение уровней антител к кардиолипину, фосфатидилсерину, кофакторам: β2-гликопротеину, протромбину, анексину V производилась методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческих 7 наборов фирмы ORGENTEC Diagnostika GmbH (Германия) для количественного определения уровней антител классов IgG, IgM; - определение уровней антинуклеарных антител (антинуклеарного фактора) производили методом ИФА с помощью наборов фирмы ORGENTEC Diagnostika GmbH (Германия) для качественного определения суммарных уровней антител (IgM, IgG); -определение уровней антител к двуспиральной (нативной), к односпиральной (рекомбинантной) ДНК производили методом ИФА с помощью наборов фирмы ORGENTEC Diagnostika GmbH (Германия) для количественного определения уровней антител классов IgG; -определение антител к хорионическому гонадотропину (ХГЧ) и прогестерону (П) производили методами ИФА по методикам, разработанным в лаборатории клинической иммунологии; - фенотипическая характеристика клеток иммунной системы проводилась методом проточной цитофлуометрии с применением моноклональных антител к кластерам дифференцировки CD3, CD4, CD8, CD19, CD19CD5, CD56, CD16CD56 на анализаторе Collibur (Германия); - интерфероновый статус определяли в соответствии с методическими рекомендациями Минздрава РФ «Определение интерферонового статуса в цельной крови у людей при массовых обследованиях»; - концентрацию иммуноглобулинов трех основных классов (G,M,A) определяли в периферической крови методом радиальной иммунодиффузии по Манчини; 7. Аспирационная биопсия эндометрия с помощью кюретки Pipelle de Cornie проводилась дважды: в пролиферативную фазу менструального цикла и в секреторную фазу, в период «окна имплантации». 8. Морфологическое исследование биоптата эндометрия. 9. Иммуногистохимическое исследование ткани эндометрия фазы пролиферации с исследованием экспрессии маркеров: Кi-67, CD68, CD138, CD56, Apaf-1 и фазы секреции, «окно имплантации» с исследованием экспрессии ключевого маркера рецептивности – LIF (R&D Systems). Контрольную группу для иммуногистохимического исследования составили 10 8 здоровых, фертильных женщин репродуктивного возраста без антитиреоидных или других видов аутоантител. 10. Программа ЭКО - стимуляция суперовуляции, трансвагинальная пункция яичников, идентификация и оценка качества ооцитов, оплодотворение in vitro, культивирование эмбрионов, перенос эмбрионов в полость матки, ведение пострансферного периода, диагностика беременности. 11. Статистическая обработка данных выполнена на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ «Statistica for Windows» v. 6.0, определения корреляционных зависимостей StatSoft Inc. Для между показателями использовались методы Спирмена (R) и Пирсона (r) с последующим установлением значимости коэффициента корреляции по критерию t. Для сравнения частот применяли метод χ2. Статистически достоверными считались отличия при р<0,05 (95%-й уровень значимости) и при р<0,01 (99%-й уровень значимости). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Возраст пациенток основной группы в среднем составил 33,9±4,7 лет, а пациенток группы сравнения 32,3±4,1 лет (p>0,05). При изучении анамнеза пациенток в основной группе заболевания щитовидной железы были выявлены в семейном анамнезе у 13 пациенток (11,1%), тогда как в группе сравнения они не были отмечены ни у одной пациентки (p<0,05). Характерно, что у всех женщин основной группы исследования заболевания ЩЖ были у родственников по материнской линии. По данным литературы, аутоиммунные нарушения ЩЖ в 5-10 раз чаще выявляются у женщин, чем у мужчин [Фадеев В.В. 2003; Speroff L. 2005; Klecha A.J.2008]. Существуют также непрямые доказательства того, что Х-хромосомные аномалии могут быть также причиной повышенной частоты аутоиммунных заболеваний ЩЖ у женщин [Bjoro T., 2000; Hollowell J.G. 2002; Poppe K. 2008]. Нами была отмечена достоверно более высокая частота заболеваемости бронхиальной астмой у родственников пациенток основной группы 8 (6,8%) по сравнению с группой сравнения – 1 (1,1%), (p<0,05). Различные виды аллергических реакций имели место у 47 пациенток (40,2%) основной группы, что было в 4,4 раза выше, чем в группе 9 сравнения - 8 (9,1%) (p<0,05). Ряд исследователей также выявили высокую частоту аллергических реакций у женщин с аутоиммунной патологией щитовидной железы [Verneuil L. 2004; Сebeci F. 2006; Aamir I.S. 2008;]. Фиброзно-кистозная мастопатия выявлена в прошлом у 23 (19,7%) пациенток основной группы, что было достоверно выше, чем в группе сравнения – 6 (6,8%), (p<0,01). Многими авторами также показана связь аутоиммунной патологии ЩЖ и патологии молочной железы [Smyth P.A. 1998; Tunbridge M.W. 2000; Giustarini E. 2006]. У всех пациенток, включенных в исследование, ведущим был трубноперитонеальный фактор бесплодия, однако в обеих группах исследования были выявлены и дополнительные факторы, способствующие бесплодию. Так, в основной группе у 45 пациенток (38,5%) трубно-перитонеальный фактор бесплодия сочетался с малыми формами НГЭ, в группе сравнения – у 21 пациентки (23,9%) (p<0,05). При анализе особенностей репродуктивной функции отмечено превалирование вторичного бесплодия в обеих группах исследования – 58,1% и 64,8% соответственно, (p>0,05). В структуре репродуктивных исходов пациенток основной группы преобладало невынашивание беременности. Самопроизвольные выкидыши на ранних сроках беременности отмечены в 2,4 раза чаще в основной группе (45,6% и 19,3%) (p<0,01), привычное невынашивание в 8 раз чаще (8,8% и 0%) (p<0,05). Преждевременные роды отмечены у 13,2% и 1,8% пациенток основной и группы сравнения соответственно (p<0,05). В литературе также описана взаимосвязь между наличием антитиреоидных антител и риском самопроизвольного выкидыша на ранних сроках беременности [Glinoer D. 1991; Bussen S. 1995; Glinoer D. 2000; Roberts C.P. 2000; Bagis T. 2001; Marx A. 2003; Stagnaro-Green A. 2004; Prummel M.F. 2004; Baker V.L. 2006; Pratt D. 2007; Poppe K. 2007]. В ряде исследований было выявлено 2-3х кратное повышение риска самопроизвольного выкидыша после ВРТ у женщин с антитиреоидными антителами по сравнению с пациентками без антител, также описано повышение риска преждевременных родов и отслойки плаценты у пациенток с АТ-ЩЖ [Singh A. 1995; Kim C.H. 1998; Poppe K. 2003; Negro R. 2005; Casey B.M. 2005]. 10 Длительность бесплодия у пациенток основной группы составила в среднем 7,0±4,5 года, в группе сравнения - 6,5±4,1 года (p>0,05). При изучении характера ранее проведенного лечения бесплодия было выявлено, что пациентки основной группы характеризовались достоверно большим числом повторных неудачных исходов программы ЭКО по отношению к группе сравнения. Так, неэффективные попытки ЭКО в анамнезе отмечены у 33,3% основной группы, что было в 1,7 раза выше, чем в группе сравнения - 19,3%, (p<0,05). Количество неэффективных попыток ЭКО в основной группе исследования составило в среднем 2,9±0,3 попытки на пациентку, что было достоверно выше, чем в группе сравнения - 2,1±0,2 (p<0,05). Таким образом, наши результаты подтверждают, что для женщин с аутоиммунной патологией щитовидной железы характерна низкая эффективность лечения бесплодия, о чем свидетельствуют достоверно более высокое число повторных неэффективных циклов ЭКО по сравнению с женщинами без патологии щитовидной железы. При оценке гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы нами не было выявлено достоверной разницы в средних значениях ЛГ, ФСГ, Е2, К, Т, СТГ, Прл, П в сыворотке крови между исследуемыми группами (p>0,05). Это обусловлено тем, что в обеих группах были пациентки с трубно- перитонеальным бесплодием и подтвержденным овуляторным циклом. Важно отметить, что включенные в исследование женщины были сопоставимы по параметрам овариального резерва. У женщин программы ЭКО с аутоиммунными нарушениями ЩЖ высок риск развития гипотиреоза, даже при изначально не нарушенной функции железы [Glinoer D. 2006; Poppe К. 2008]. Нормальный уровень тиреоидных гормонов необходим для адекватного фолликулогенеза, раннего эмбриогенеза. Значительная гормональная нагрузка при использовании индукторов овуляции может привести к возникновению или усугублению гипотиреоза. Поэтому мы особое внимание уделяли оценке состояния функции ЩЖ (таблица 1). Среднее значение ТТГ в основной группе исследования не превышало нормативных показателей для женщин вне беременности - 3,1±1,9 мМЕ/л, но было 11 достоверно выше, чем в группе сравнения -1,9±0,9 мМЕ/л (p<0,01). Достоверно более высокий уровень ТТГ у пациенток с аутоиммунной патологией ЩЖ можно объяснить тем, что ЩЖ, пораженная аутоиммунным процессом, функционирует за пределом своих резервных возможностей. Все пациентки группы сравнения имели нормальную функцию щитовидной железы. Уровень Т4св в основной группе составил в среднем 16,0±4,5 мМЕ/л, в группе сравнения - 17,0±3,1 мМЕ/л (р>0,05). В структуре тиреоидной патологии у женщин с антитиреоидными антителами преобладал гипотиреоз в исходе АИТ - у 26,5% женщин. субклинический У 39 (33,3%) случаев носительство АТ-ТПО и/или АТ-ТГ без нарушения функции ЩЖ сочеталось с УЗИ признаками АИТ. У каждой четвертой женщины с АТ-ЩЖ (25,6%) диагностирован зоб. Таблица 1. Структура тиреоидной исследования патологии у пациенток Характер патологии ЩЖ Манифестный гипотиреоз в исходе АИТ Субклинический гипотиреоз в исходе АИТ Гипотиреоз в исходе АИТ в стадии медикаментозной компенсации Послеоперационный гипотиреоз в стадии медикаментозной компенсации Субклинический тиреотоксикоз Тиреотоксикоз в стадии медикаментозной компенсации (БГ) Носительство АТ-ТРО и/или АТ-ТГ без нарушения функции щитовидной железы + УЗИ-признаки АИТ Изолированное носительство АТ-ТПО и/или АТ-ТГ основной группы Основная группа (n=117) Абс. число % 2 1,7 31 26,5 22 18,8 4 3,4 1 1,7 2 0,9 39 33,3 16 13,7 УЗИ признаки АИТ (снижение эхогенности ткани, диффузная неоднородность структуры ЩЖ) были выявлены у 97 женщин (82,9%) основной группы. При оценке состояния иммунной системы выявлен ряд особенностей. При аутоиммунной патологии щитовидной железы в основной группе выявлено достоверное повышение в периферической крови уровня В-лимфоцитов (CD19+, CD19+CD5+). При этом уровень CD19+CD5+ в периферической крови положительно умеренно коррелировал с числом неудачных попыток ЭКО 12 (r=0,52; p<0,05). Относительное содержание натуральных киллеров в периферической крови (CD56+, CD16+56+) в основной группе также достоверно превышало аналогичные показатели в группе сравнения. При появлении аутоантител действие активированных CD19+CD5+ приводит к нарушениям ранних этапов имплантации, способствуют снижению кровообращения в матке в период «имплантационного окна», в программах ЭКО отмечается медленное деление и фрагментация эмбрионов, медленный прирост уровня ХГ, субхориальные гематомы [Сидельникова B.M. 2005]. Антитиреоидные антитела также могут влиять на развитие трофобласта [Bussen S. 2000]. При исследовании гуморального звена иммунитета достоверных отличий в сывороточных уровнях IgM, IgG и IgA в основной группе и в группе сравнения выявлено не было. При изучении частоты встречаемости антител к фосфолипидам и их кофакторам выявлено, что в основной группе достоверно более часто выявляются антитела к кардиолипину, фосфатидилсерину, ß2гликопротеину. Повышенный уровень антител к кардиолипину класса М отмечен у 12,3% пациенток основной группы и не выявлен в группе сравнения (р<0,05). Повышенный уровень антител класса M к ß2-гликопротеину диагностирован у 17,5% пациенток основной группы, в группе сравнения – у 4,0% (р<0,05). Уровень IgG к фосфатидилсерину был увеличен у 10,5% пациенток основной группы, и не выявлен в группе сравнения (р<0,05). Показатели средних уровней антител к фосфолипидам и их кофакторам были в пределах нормы в обеих группах, однако выявлено статистически значимое различие в средних значениях уровней IgM к кардиолипину (2,3±0,4 и 1,7±0,6 p<0,05) и IgМ к ß2-гликопротеину (3,1±0,7 и 2,2±0,8 p<0,05). Подавляющее большинство авторов указывают, что повышение антифосфолипидных антител может быть связано с неудачами программ ВРТ [Geva E. 1996; Coulam C.B. 1997; Stern C. 1999; Stern C. 2006; Carp H.J. 2007; Bellver J. 2008; Meroni P.L. 2008]. У многих авторов антиовариальные антитела ассоциируются с идиопатическим бесплодием [Shatavi S.V. 2006] и неблагоприятными исходами ВРТ [Luborsky J.L. 2000]. Abalovich M. и Cervera R. обнаружили взаимосвязь 13 преждевременной недостаточности яичников и антитиреоидных антител как следствие общего аутоиммунного механизма [2007; 2008]. В нашем исследовании уровень антиовариальных антител был выше нормы у 10,5% пациенток основной группы, в группе сравнения данный показатель оставался в норме у всех пациенток (р<0,05). Развитию сенсибилизации к ХГЧ могут способствовать инфекционные заболевания, аллергические реакции, искусственные и самопроизвольные аборты, использование гонадотропных препаратов с целью стимуляции суперовуляции. В нашей работе повышенный уровень антител к ХГЧ класса IgM выявлен у 20% пациенток основной группы, что было достоверно выше, чем в группе сравнения – 7,5% (р<0,05). Повышенный уровень IgG к ХГЧ выявлен у 13,3% и 10,0% пациенток двух групп исследования соответственно (p>0,05). Повышенный уровень иммуноглобулинов обоих классов выявлен у 10% пациенток основной и 7,5% женщин группы сравнения (p>0,05). Средние уровни IgM и IgG для АТ-ХГЧ в обеих группах исследования соответствовали норме, достоверной разницы не выявлено (р>0,05). В исследованиях ряда авторов отмечено, что антинуклеарные антитела могут ассоциироваться с неудачами ВРТ [Stern C. 1999; Kikuchi К. 2003]. В нашем исследовании антинуклеарные антитела были выявлены у 1 пациентки основной группы. Антитела к односпиральной (рекомбинантной ДНК) были выше нормы у 7% пациенток основной группы и 8% в группе сравнения (p>0,05). У 1 пациентки основной группы с первичным бесплодием был увеличен титр антител к односпиральной и к двухспиральной ДНК. Крайне важным являлась оценка состояния эндометрия при наличии АТЩЖ с целью выявления возможных механизмов нарушения имплантации. Нами было проведено морфологическое и иммуногистохимическое исследование эндометрия женщин исследуемых групп. В фазу пролиферации при световой микроскопии срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, у пациенток основной группы исследования в эндометрии отмечено наличие слабо выраженной рассеянной лимфогистиоцитарной инфильтраций стромы. Инфильтраты располагались преимущественно в строме около желез и спиральных артерий. Воспалительные инфильтраты были представлены 14 лимфоцитами, макрофагами и единичными плазматическими клетками. В группе пациенток с АТ-ЩЖ отмечено увеличение числа макрофагов и клеток моноцитарного ряда в железах и строме эндометрия. При этом ни в одном из случаев не было выявлено классических признаков хронического эндометрита. Наличие в эндометрии плазматических клеток, макрофагов, лимфоцитов свидетельствует о присутствии иммунных механизмов повреждения эндометрия и воспалительно-подобной реакции в ткани. С целью детального иммуногистохимическое исследования исследование с эндометрия оценкой было проведено экспрессии маркеров макрофагов (CD 68), плазматических клеток (CD 138), «натуральных киллеров» (CD 56), пролиферации клеток (Ki-67), апоптоза клеток (Apaf-1), (рисунок 1). Рисунок 1. Экспрессия маркеров в эндометрии в фазу пролиферации баллы 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 *,** основная группа *,** группа сравнения *p<0,05 по отношению к контролю **p<0,05 по отношению к группе сравнения * * * CD68 контроль CD 138 KI 67 Apaf-1 *,** CD 56 Для исследования интенсивности воспалительного процесса в эндометрии был выбран маркёр CD68, выявляющийся в мембране клеток макрофагального ряда в виде коричневого окрашивания. Было показано, что число макрофагов CD68 в основной группе достоверно превышало аналогичные показатели в группе сравнения - 48 баллов и 36 баллов (р<0,05) соответственно и в контроле - 30 баллов. В основной группе исследования экспрессия маркера плазматических клеток CD138 в среднем составила 25 баллов и достоверно превышала показатели в группе сравнения – 4 балла и в контроле, где плазматические клетки вообще не были выявлены – 0 (p<0,05). Важно отметить, что уровень экспрессии маркера плазматических клеток CD138 в эндометрии был на 30% 15 выше у женщин с эхографическими признаками АИТ по сравнению с женщинами без структурных нарушений щитовидной железы, что доказывает общность и взаимосвязь реакции в эндометрии и аутоиммунных процессов в ЩЖ. Уровень пролиферации клеток в эндометрии оценивался по экспрессии маркера Ki-67. В основной группе экспрессия Ki-67 в клетках железистого и покровного эпителия была незначительно выше показателей в группе сравнения – 24 балла и 21,2 балл (p>0,05) и достоверно не отличалась от показателей в контроле – 20,8 балл (p>0,05). В строме эндометрия экспрессия маркера пролиферации в основной группе была достоверно выше контрольных значений и составила 6 баллов, однако не отличалась от показателей в группе сравнения 8 баллов. Интенсивность процесса апоптоза клеток оценивали по экспрессии маркера Apaf-1. В основной группе экспрессия Apaf-1 в клетках железистого и покровного эпителия была достоверно выше показателей в контроле - 4,3 балла и 2,8 балла (p<0,05) соответственно и незначительно превышала показатели в группе сравнения – 3 балла (p>0,05). В строме эндометрия экспрессия Apaf-1 была сопоставима во всех группах. При аутоиммунной патологии щитовидной железы в основной группе исследования выявлено достоверное повышение экспрессии в эндометрии маркера NK-клеток CD56 до 3,7 баллов, что превышало аналогичные показатели в группе сравнения - 0,9 баллов и в контроле - 0,08 баллов (p<0,05). NK-клетки CD56+16-, Th-1 цитокины индуцируют апоптоз клеток эндометрия и трофобласта и следовательно, резко снижает рецептивность эндометрия и адекватность имплантации [Quack K.C. 2001; Сухих Г.Т. 2003; Kwak-Kim J. 2008]. Известно, что гликопротеин LIF необходим для имплантации бластоцисты, раннего эмбриогенеза (стимулирование образования бластоцисты и пролиферации трофоэктодермы), а также дифференцировки и децидуализации эндометрия [Chen J.R. 2000; Castro-Rendon W.A. 2006]. По данным ряда исследований, LIF является ключевым маркером рецептивности 16 эндометрия [Ledee-Bataille N. 2002; Aghajanova L. 2008;] и маркером успеха ВРТ [Serafini P. 2008]. С целью оценки рецептивности эндометрия нами было проведено иммуногистохимическое исследование ткани секреторного эндометрия на 20-24 день менструального цикла, т.е. в период «окна имплантации» для выявления экспрессии ключевого маркера рецептивности LIF (рисунок 2). Рисунок 2. Экспрессия LIF в эндометрии секреторной фазы – «окна имплантации» (Иммунопероксидазная реакция) а-основная группа ГЭ х 250 б–группа сравнения в–контрольная группа ГЭ х 150 ГЭ х 200 В основной группе с антитиреоидными антителами экспрессия LIF практически отсутствовала и составила – 1,0 балл, что достоверно отличалось от показателей в группе сравнения - 1,4 балла (p<0,05) и в контроле – 3,8 балла (p<0,05). Важно отметить, что наличие аутоиммунного процесса в виде антитиреоидных антител сопровождалось более чем 3-х кратным снижением экспрессии LIF в эндометрии, что свидетельствует о резком нарушении рецептивности ткани и является прогностическим маркером нарушений процессов имплантации и неудач программ ВРТ. Корреляции между уровнем экспрессии всех иммунологических маркеров в эндометрии и титром антитиреоидных антител в сыворотке крови обнаружено не было, что подтверждает не прямой повреждающий эффект антител, а свидетельствует в пользу теории RAFS-синдрома, при котором аутоантитела расцениваются как маркеры системных иммунных нарушений с развитием репродуктивных потерь [Gleicher N. 2002]. 17 В литературе обсуждаются данные о предполагаемой негативной роли АТЩЖ на эффективность программ ЭКО, вследствие их влияния на процессы роста и созревания фолликулов, а также оплодотворение и дробление эмбрионов. Поэтому на заключительном этапе исследования нами были изучены особенности реализации репродуктивной функции у пациенток с АТЩЖ в программе ЭКО. Всем пациенткам в обеих группах исследования была проведена программа ЭКО по так называемому «длинному протоколу» с использованием а-ГнРГ и р-ФСГ. При сравнении длительности стимуляции суперовуляции препаратом р-ФСГ и общей дозы ФСГ, нами не выявлены статистически значимые различия между изучаемыми группами пациенток (p>0,05). Таблица 2. Параметры оогенеза исследуемых групп и раннего эмбриогенеза у пациенток Основная группа (n=71) 6,7±1,5 Группа сравнения (n=42) 7,7±1,6 p>0,05 5,0±0,9 6,4±0,4 р<0,05 Доля зрелых ооцитов, % 74,6 88,3 p<0,05 Частота оплодотворения, % 73,4 80,1 p<0,05 Среднее число эмбрионов 2,4±0,2 3,1±0,3 p<0,05 Среднее число бластоцист 1,8±0,5 2,2±0,5 p<0,05 Параметры Среднее количество полученных ооцитов Среднее число зрелых ооцитов p Среднее количество полученных ооцитов при трансвагинальной пункции достоверно не различались у пациенток групп исследования, но среднее количество зрелых ооцитов и их доля были достоверно ниже в основной группе, чем в группе сравнения - 5,0±0,4 и 74,6% по сравнению с 6,4±0,4 и 88,3% соответственно (p<0,05). Выявлена достоверно более низкая частота оплодотворения в основной группе, чем в группе сравнения (73,4% и 80,1%), (p<0,05). Среднее количество эмбрионов в основной группе было достоверно ниже, чем в группе сравнения (2,4±0,2 и 3,1±0,3), (p<0,05). Количество бластоцист, т.е. эмбрионов хорошего качества на 5 сутки культивирования 18 составило в среднем 1,8±0,7 в основной группе, что было достоверно ниже, чем в группе сравнения 2,2±0,5 (p<0,05). Эффективность программы ЭКО оценивали на основании частоты имплантировавшихся эмбрионов и частоты наступления беременности из расчета на 1 попытку (таблица 3). В основной группе проведен 71 цикл стимуляции суперовуляции и переноса эмбрионов, в группе сравнения - 42. Таблица 3. Эффективность программы ЭКО у исследуемых пациенток Параметры Количество циклов стимуляции и переносов эмбрионов Перенесено эмбрионов Частота имплантации Количество полученных беременности Основная Группа группа сравнения (n=71) (n=42) 71 42 101 84 15,8%* 28,6% 16 14 Частота наступления беременности на цикл 22,5%* 33,3% стимуляции *(p<0,05) статистически достоверно по отношению к группе сравнения Частота имплантации оценивалась нами как число имплантированных эмбрионов из общего числа перенесенных эмбрионов. В основной группе исследования частота имплантации составила 15,8%, т.е. из 101 перенесенного эмбриона жизнеспособным оказались 16. Частота имплантации в группе сравнения была достоверно выше таковой у пациенток основной группы исследования и составила 28,6%, так как из 84 перенесенных эмбрионов имплантировалось 24 (p<0,05). Частота наступления беременности составила 22,5% в основной группе, что было достоверно ниже, чем в группе сравнения – 33,3% (p<0,05). Результаты исследования позволили нам сделать вывод о том, что АТЩЖ являются маркерами генерализованного, многоуровневого аутоиммунного процесса, который вносит свой вклад в развитие бесплодия, нарушений процессов имплантации. На основании данных проведенного комплексного иммуноморфологического исследования эндометрия впервые описаны механизмы повреждения ткани, приводящие к нарушению имплантации. Нами 19 выявлено, что при реализации репродуктивной функции в программах ВРТ у женщин с аутоиммунными нарушениями ЩЖ эффективность программ ЭКО снижена за счет получения меньшего числа зрелых ооцитов, снижения частоты оплодотворения, меньшего количества полученных эмбрионов и количества бластоцист по сравнению с женщинами без патологии ЩЖ при прочих равных условиях. Полученные данные позволяют по-новому оценить взаимосвязь аутоиммунной патологии ЩЖ и состояния репродуктивной системы, а также определить роль аутоиммунной патологии ЩЖ в реализации репродуктивной функции в программах ВРТ. Вышеизложенное указывает на необходимость расширения алгоритма обследования женщин с бесплодием и аутоиммунными заболеваниями ЩЖ и проведения комплексной оценки иммунной системы и рецептивности эндометрия, особенно у пациенток с повторными безуспешными попытками ЭКО. ВЫВОДЫ 1. У женщин с аутоиммунной патологией щитовидной железы в структуре репродуктивных нарушений в 2,4 раза чаще происходят самопроизвольные выкидыши, достоверно более часто отмечаются преждевременные роды по сравнению с женщинами без аутоиммунной патологии щитовидной железы. 2. У женщин с аутоиммунной патологией щитовидной железы при прочих равных условиях почти в 2 раза снижается эффективность программ ЭКО (19% по сравнению с 33% в группе сравнения) и в 1,4 раза повышено число повторных безуспешных попыток ЭКО по сравнению с женщинами без патологии щитовидной железы. 3. При проведении программ ЭКО у пациенток с аутоиммунной патологией щитовидной железы отмечено снижение эмбриологических показателей: достоверно меньшее число зрелых ооцитов, достоверно снижена частота оплодотворения, среднее число полученных эмбрионов и среднее число бластоцист. Частота имплантации снижается в 1,8 раза, частота наступления беременности в 1,5 раза по сравнению с женщинами без патологии щитовидной железы при прочих равных условиях. 20 4. При аутоиммунной патологии щитовидной железы имеется ряд иммунологических особенностей: повышение уровня в периферической крови В-лимфоцитов (CD19+, CD19+CD5+) и натуральных киллеров (CD56+, CD16+56+), при этом уровень CD19+CD5+ положительно коррелирует с числом неудачных попыток ЭКО (r=0,52; p<0,05). 5. У пациенток с аутоиммунной патологией щитовидной железы достоверно более часто выявляются антифосфолипидые антитела (к кардиолипину, фосфатидилсерину, ß2- гликопротеину), антиовариальные антитела, антитела к ХГЧ по сравнению с женщинами без аутоиммунной патологии щитовидной железы, что подтверждает наличие RAFS-синдрома, при котором аутоантитела являются маркерами системных иммунных нарушений. 6. Эхографические признаки аутоиммунного тиреоидита отмечаются у 82,9% больных с носительством антитиреоидных антител. Уровень экспрессии маркера плазматических клеток CD138 в эндометрии на 30% выше у женщин с эхографическими признаками аутоиммунного тиреоидита по сравнению с женщинами без структурных нарушений щитовидной железы. 7. В эндометрии женщин с аутоиммунной патологией щитовидной железы в фазу пролиферации образованием отмечаются рассеянной воспалительно-подобные лимфоцитарной инфильтрации изменения с стромы и увеличением экспрессии маркеров плазматических клеток CD138, натуральных киллеров CD56 и макрофагов CD68. Одновременно отмечено усиление процессов апоптоза клеток (Apaf-1) в эпителии и строме эндометрия. 8. В период «окна имплантации» в эндометрии у женщин с аутоиммунной патологией щитовидной железы выявлено 3-х кратное снижение экспрессии ключевого маркера рецептивности эндометрия – LIF, что является причиной неудач имплантации и подтверждается клинико-анамнестическими данными о неэффективности программы ЭКО у данных пациенток. 21 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ: 1. Частота аутоиммунной патологии щитовидной железы у женщин репродуктивного возраста достигает 5-10%. Всем пациенткам, планирующим достижение беременности в программе ЭКО, целесообразно проводить детальный скрининг для оценки функции ЩЖ: определение уровня ТТГ, Т4св, АТ-ТПО и АТ-ТГ и эхографию ЩЖ. 2. Скрининг на АТ-ТПО и АТ-ТГ у женщин с бесплодием позволяет определить группу пациенток с низкой эффективностью программ ЭКО, так как изолированное носительство антитиреоидных антител без нарушения функции ЩЖ у женщин с бесплодием может являться предиктором неблагоприятных исходов программ ЭКО или ранних репродуктивных потерь. 3. В алгоритм обследования пациенток с аутоиммунной патологией ЩЖ перед вступлением в программу ЭКО целесообразно включить иммунологическое обследование с оценкой иммунного, интерферонового статуса, определения антифосфолипидных, антиовариальных антител, антител к ХГЧ и провести возможную коррекцию выявленных изменений. 4. У пациенток с аутоиммунной патологией ЩЖ и двумя и более неудачными попытками ЭКО в анамнезе рекомендуется провести иммунногистохимическое исследование эндометрия с оценкой экспрессии маркеров воспаления CD138, CD68, CD56 в фазу пролиферации и содержания LIF в период «окна имплантации». Снижение содержания LIF в эндометрии в период «окна имплантации» в 2-3 раза является прогностический неблагоприятным фактором реализации ЭКО. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Роль нарушений функции щитовидной железы у пациенток, страдающих бесплодием, в реализации программы ЭКО и ПЭ [Текст] / В.И. Кулаков., К.А. Яворовская, Р.Н. Щедрина, Е.Б. Петрович (Станкович) // Мать и дитя: материалы V Рос. науч. форума. – Москва, 2003. - С. 380-381. 2. Роль нарушений функции щитовидной железы у пациенток с бесплодием, в реализации программы ЭКО и ПЭ [Текст] / Е.Б. Петрович (Станкович), В.И. Кулаков, К.А. Яворовская, Р.Н. Щедрина 22 // Материалы конгресса «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» – Москва, 2004. – С.170-171. 3. Аутоантитела (антиовариальные, антифосфолипидные, антинуклеарные, антитела к ДНК и половым гормонам) у женщин с Болезнью Грейвса и аутоиммунным тиреоидитом [Текст] / С.Г. Перминова, И.В. Менжинская, Т.В. Каширова, М.Х. Ибрагимова, Е.Б. Станкович, И.Е. Корнеева, Г.Т. Сухих // Аллергология и иммунология - Том 9, №1. – 2008. - С.86. 4. К.А. Яворовская Роль нарушений функции щитовидной железы в реализации программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов [Текст] / К.А. Яворовская, Р.Н. Щедрина, Петрович (Станкович) Е.Б. // Акушерсво и гинекология - 2004. - №6. - C. 8-10. 5. Особенности иммунного статуса у пациенток программы ЭКО и ПЭ с аутоиммунным тиреоидитом / Е.Б. Станкович, Т.А. Назаренко, А.В. Шуршалина, С.Г. Перминова // Материалы III международного конгресса по репродуктивной медицине «Проблемы репродукции» - Москва, 2009. - C. 293294. 6. Особенности функционирования щитовидной железы в ранние сроки индуцированной беременности / С.Г. Перминова, М.Х. Ибрагимова, Т.А. Назаренко, В.В. Фадеев, Э.Р. Дуринян, Е.Б. Станкович // Вестник РУДН, серия медицина, - № 7. - Москва, 2009. - C. 123-130. 7. Autoimmune thyroiditis and endometrium: the role of thyroid antibodies in supporting of endometrial inflammation [Текст] / A.V. Shurshalina, G.T. Sukhikh, S.G. Perminova, T.A. Demura, E.B. Stankovic // American Journal of Reproductive Immunology -Vol. 61, №6. - 2009. - Р. 410. 8. Autoimmune thyroiditis and infertility: the effect of antithyroid antibodies on endometrial receptivity [Текст] / A.V. Shurshalina, G.T. Sukhikh, S.G. Perminova, T.A. Demura, E.B. Stankovic // American Journal of Reproductive Immunology - Vol. 61, №6. - 2009. - Р. 410- 411. 9. Characteristics of immune status in infertile women in IVF program positive for thyroid autoantibodies / K.A. Yavorovskaya, T.A. Nazarenko, A.V. Shurshalina, S.G. Perminova, E.B. Stankovic // Abstracts Book of 13th World Congress on Human Reproduction. – Venezia, 2009. – Р.13. 23 СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ а-ГнРГ – агонист гонадотропин релизинг гормона АИТ – аутоиммунный тиреоидит АТ-ТГ – антитела к тиреоглобулину АТ-ТПО – антитела к тиреопероксидазе АТ-ЩЖ- антитела к щитовидной железе БГ – Болезнь Грейвса ВРТ – вспомогательные репродуктивные технологии ГЭ - гематоксилин эозин Е2 - эстрадиол К - кортизол ЛГ – лютеинизирующий гормон НГЭ - наружный генитальный эндометриоз П – прогестерон ПЭ - перенос эмбрионов р-ФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон СТГ - соматотропный гормон Т – тестостерон Т4св. – тироксин свободный ТТГ – тиреотропный гормон УЗИ – ультразвуковое исследование ФСГ – фолликулостимулирующий гормон ХГ – хорионический гонадотропин ЩЖ – щитовидная железа ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение LIF – лейкемия ингибирующий фактор NK- натуральные киллеры 24