список сокращений - Биологический факультет МГУ
реклама
На правах рукописи МУЧКАЕВА Ирина Алексеевна РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ КЛЕТОК ДЕРМАЛЬНОЙ ПАПИЛЛЫ ВОЛОСЯНОГО ФОЛЛИКУЛА ЧЕЛОВЕКА ДО ПЛЮРИПОТЕНТНОГО СОСТОЯНИЯ Специальность 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в лаборатории проблем клеточной пролиферации ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук Научный руководитель: доктор биологических наук, ВАСИЛЬЕВ Андрей Валентинович ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН Официальные оппоненты: доктор биологических наук ЛАГАРЬКОВА Мария Андреевна ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, зав. лабораторией генетических основ клеточных технологий кандидат биологических наук РУБИНА Ксения Андреевна МГУ им. М.В. Ломоносова, ст.н.с. лаборатории адаптационной медицины Ведущая организация: ФГБУ Научно-исследовательский институт морфологии человека Российской академии медицинских наук Защита состоится «17» декабря 2013 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, г. Москва, ул. Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет МГУ, ауд. М-1. Факс: 8(495)939-17-46; e-mail: [email protected] С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Автореферат разослан «15» ноября 2013 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук 2 Е.Н. Калистратова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) является актуальным направлением исследований в области клеточной биологии и регенеративной медицины. Проблема плюрипотентных клеток тесно связана с пониманием механизмов индивидуального развития и регенерации тканей. Получение новых линий иПСК из разных источников открывает широкие возможности использования их в фундаментальных и прикладных медико-биологических исследованиях. Линии иПСК могут быть использованы при моделировании многих заболеваний и тестировании новых лекарственных средств. Эффективность образования иПСК очень низка, поэтому в настоящее время идет поиск таких типов клеток, которые могут быть репрограммированы более эффективно, а полученные иПСК будут обладать способностью дифференцироваться в заданном направлении. Опубликовано большое количество работ, посвященных поиску новых типов клеток, которые можно использовать для репрограммирования. К моменту начала нашего исследования, нам не были известны опубликованные работы по репрограммированию клеток дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула человека. Клетки ДП являются уникальным объектом исследований. Они играют ведущую роль в формировании волосяного фолликула и регуляции цикла его роста, а также являются резервуаром мультипотентных стволовых клеток. Мы посчитали интересным использовать клетки ДП в качестве альтернативного источника иПСК. Принимая во внимание мультипотентный статус клеток ДП, мы предположили, что эффективность репрограммирования клеток ДП, в одних и тех же условиях, будет выше, чем эффективность репрограммирования классического объекта – дермальных фибробластов. Для увеличения эффективности репрограммирования мы культивировали клетки в присутствии ингибитора гистоновых деацетилаз – вальпроевой кислоты (Medvedev et al ., 2011) в условиях физиологического уровня (5%) содержания кислорода (Warren et al ., 2010). Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в получении иПСК из клеток ДП фолосяного фолликула человека. В связи с этим были поставлены следующие задачи: Репрограммировать клетки ДП человека посредством трансфекции генами транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Выделить репрограммированные до плюрипотентного состояния клоны иПСК – ДП. Исследовать недифференцированный статус полученных иПСК – ДП. Проверить плюрипотентный статус иПСК – ДП in vitro и подобрать условия для направленной дифференцировки иПСК – ДП. Проверить плюрипотентный статус полученных иПСК – ДП в экспериментах in vivo. 3 Научная новизна и практическая значимость работы. В работе впервые показана возможность получения иПСК из клеток дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула человека при использовании лентивирусной доставки транскрипционных факторов – Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc в присутствии ингибитора гистоновых деацетилаз – вальпроевой кислоты при инкубации в условиях физиологического содержания кислорода (5%). Было определено, что эффективность репрограммирования при использовании данного подхода для клеток ДП составила 0,03%, тогда как в работе Higgins и сотр. (Higgins et. al., 2012) по данной тематике эффективность составляла 0,02%. В работе впервые применен метод селекции репрограммированных клеток из культуры ДП человека, основанный на прижизненном иммуномечении против поверхностного антигена ПСК – Tra-1-60. С помощью различных методов охарактеризован плюрипотентный статус полученных иПСК – ДП. Впервые разработаны протоколы направленной дифференцировки иПСК – ДП. Показано, что полученные нами иПСК – ДП обладают способностью дифференцироваться in vitro в нейро–, остео– и гепатоцитарном направлении. Было выяснено, что полученная нами культура иПСК – ДП обладает большим потенциалом к дифференцировке в гепатоцитарном направлении, чем иПСК, полученные из фибробластов. Полученные данные свидетельствуют о преспективности использования иПСК – ДП для решения возможных медицинских задач, в том числе для тестирования лекарственных средств. Результаты, полученные в данном исследовании, могут быть полезны для оптимизации протоколов дифференцировки плюрипотентных клеток и для понимания механизмов, работающих в раннем развитии. Апробация рботы. Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2010, 2011, 2012 гг.); на международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 24 мая 2012); на международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2013» (Москва, 8-13 апреля 2013). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 1 патент на изобретение, статей в журналах, соответствующих перечню ВАК – 3, тезисов докладов и материалов конференций – 6. Личное участие автора. Работа выполнена непосредственно автором. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных результатов. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 118 страницах, содержит 18 рисунков, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: ведения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 141 цитируемый источник. 4 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клеточные культуры. В работе были использованы следующие культуры клеток: линия фибробластов кожи взрослого человека, иммортализовнная с помощью лентивирусной конструкции, содержащей ген каталитического компонента теломеразы человека hTERT (pLA-CMV-hTERT) – 1608hT была любезно предоставлены Е.Е. Егоровым (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда РАН); первичные культуры клеток ДП волосяного фолликула человека; эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека линии hESM05, любезно предоставленные С.Л. Киселевым (Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН); первичная культура эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ). Получение клонов иПСК - ДП и иПСК - 1608hT и их культивирование. 0,5 млн. клеток ДП на третьем пассаже или 1608hT в чашке Петри диаметром 60 мм инфицировали ночь лентивирусными векторами, кодирующими гены плюрипотентного состояния клеток OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC при MOI = 5 в среде для культивирования клеток ДП и 1608hT соответственно при 37ºС в атмосфере 5% CO2 и 5%O2. Смену среды производили через день при добавлении к ней химических соединений, увеличивающих эффективность репрограммирования, 2мМ вальпроевой (Sigma) и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma). Через 7 дней среду заменяли на среду для плюрипотентных стволовых клеток mTeSR™ 1 (STEMCELL Technologies). Среду меняли каждый день. Пересевы клеток на первых пассажах производили механически на митотически неактивные МЭФ до начала контактирования между собой колоний, а затем на пластик, покрытый матригелем (BD Biosciences). Первый пересев клеток производили на чашку Петри диаметром 100 мм и отменяли упомянутые выше добавки. Через 2-3 недели после пассирования, селектировали клоны иПСК по поверхностному маркеру плюрипотентных клеток (ПСК) – Tra-1-60 с помощью прижизненного иммуномечения и механическим отбором положительных клонов. Полученные иПСК растили в среде mTeSR™ 1 (STEMCELL Technologies) при 37ºС в атмосфере 5% CO2 и 5%O2. Криоконсервацию производили в среде mFreSR® (STEMCELL Technologies), хранение осуществляли в парах жидкого азота при температуре – 196ºС. Проверку наличия теломеразы в клетках проводили с помощью TRAPEZE® XL Telomerase Detection Kit (Millipore). Для иммуноцитохимического анализа окрашенные флуоресцентной меткой препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus IX51 (Olympus). Проточную цитофлуориметрию осуществляли с помощью проточного цитофлуориметра Cell Lab Quanta™ SC (Beckman Coulter). Выявление активности щелочной фосфатазы проводили с помощью набора NBT/BCID (Roche). Тотальную РНК выделяли с помощью Quick-RNA™ MiniPrep (Zymo Research). ОТ-ПЦР-реакция проводилась с помощью амплификатора фирмы Bio-Rad. Для проведения ПЦР в реальном времени амплификация проводилась согласно следующей программе: 95°С – 10 мин, далее 40 циклов, состоящих из двух этапов 95°С – 15 сек, 60°С – 1 5 мин. с помощью прибора «7500 Real-Time PCR System» (Applied Biosystems). Эмбриоидные тельца получали в висячей капле и растили в суспензии без прикрепления клеток к пластику в Ultra Low Adhesion Plates (Corning). Иммуногистохимические препараты исследовали с помощью Keyence BZ-9000E (Keyence). Для теста на тератомообразование использовали иммунодифицитных мышей линии Nude. Направленная дифференцировка иПСК in vitro. Для диффренцировки использовали как кусочки эмбриоидных телец, так и недифференцированные клетки (кластеры, занимающие 10 – 20% от площади культуральной чашки). Подлинность дифференцировок подтверждалась иммуноцитохимически. Для индукции остеогенной дифференцировки клекти культивировали в среде DMEM/F12 с пониженным содержанием глюкозы (ПанЭко) с добавлением 10% FBS (Gibco), 2мМ глутамина (ПанЭко), 0,1 µM дексаметазона (Sigma-Aldrich), 10 mM β-глицерофосфата (Sigma-Aldrich), 50 µM аскорбат-2-фосфата 50ЕД/мл пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко). Остеогенез детектировали выявлением остеонектина и остеопонтина. Дифференцировку клеток в гепатоцитарном направлении проводили в индукционной среде, содержащей DMEM/F12 (Gibco), 10% FBS (Gibco), 2мМ глутамин (ПанЭко), 10 нг/мл HGF (Invitrogen), 10 нг/мл EGF (PeproTech), 20 нг/мл BMP2 (R&D), 0,03mM никотинамид. В первые 2–3 дня для индукции развития энтодермальной программы при дифференцировки из клеток (а не из ЭТ) в среду был добавлен активин А (R&D) в концентрации 100 нг/мл. После отмены активина А в среду добавляли 30 нг/мл FGF4 (Invitrogen). По достижении клетками 80% от площади поверхности культуральной чашки отменяли FGF4 и BMP2 и на 5-7 дней культивировали с 10 нг/мл онкостатином М (R&D) и 0,1 µM дексаметазоном (Sigma-Aldrich). После пассирования в среду добавляли добавку 1X B27 (Gibco) еще на 7-10 дней. Подлинность гепатоцитарной дифференцировки определяли по экспрессии Foxa2, HNF4α, α-фетопротеина (АФП), цитокератина18 (CK18), альбумина. Для индукции нейральной дифференцировки в среду DMEM/F12 (Gibco), 3% FBS (Gibco), 1X NEAA (Gibco), 1X GlutaMAX (Gibco), 50ЕД/мл пенициллин/ 50 мкг/мл стрептомицин (ПанЭко) на 7 дней был добавлен 20 нг/мл Noggin и 20 нг/мл FGF2. Затем клетки культивировали в присутствии 1X B27 (Gibco), после 7 дней добавляли 10 нг/мл BDNF и 10 нг/мл NGFβ и продолжали культивировать еще 7-14 дней. С помощью ИЦХ определяли экспрессию маркеров глии (GFAP, CNPase) и клеток нейронального ряда (Prox1, нестин, даблкортин, β III тубулин, NSE, TH). Статистическая обработка данных. Статистическая обработка результатов проводилась в программе MS Excel. При обработке результатов оценивали значение средней величины, стандартное отклонение. При оценке достоверности различий показателей использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически достоверными, если уровень значимости был р<0.05. 6 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ По многим морфологическим и метаболитическим критериям иПСК подобны ЭСК. В работе мы сравнивали полученные иПСК с эталоном плюрипотентности – линией ЭСК. Инфицирование, выделение и культивирование иПСК. Репрограммирование связано с изменением судьбы клеток, которое на начальных этапах сопровождается изменениями размера, формы, организации цитоскелета и рецепторов. Определением того, что в трансфицированных клетках начался процесс репрограммирования, может служить появление клеток, визуально отличающихся от исходной культуры. На 8-е сутки после лентивирусной трансфекции культуры клеток ДП мы наблюдали появление первых колоний клеток с измененной морфологией (Рис. 1), что говорит о мезенхимоэпителиальном переходе, который является одной из характеристик репрограммирования (Li et al., 2010). Со временем колонии увеличивались в размерах и образовывались новые. Практически все колонии имели ЭСКподобную морфологию и четкие очертания. По морфологическим характеристикам полученные нами клоны практически не отличались между собой. Клетки, образующие колонии, подобно ЭСК, характеризовались высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением (Рис. 1). Рис. 1. Получение первых клонов репрограммированных клеток. Морфология: (а) исходной культуры ДП человека; (б) репрограммированных клеток ДП на 8 сут после инфицирования; (в) репрограммированных клеток ДП на 11 сут после инфицирования; (г) исходной культуры 1608hT; (д) репрограммированных клеток 1608hT на 10 сут после инфицирования; (е) репрограммированных клеток 1608hT на 17 сут после инфицирования. Масштабный отрезок 200 мкм. 7 Следующей задачей было отделение полностью репрограммированных клонов от частично репрограммированных. Для упрощения работы при отделении полностью репрограммированных иПСК на 21-ые сутки после инфицирования мы провели прижизненное иммуномечение против поверхностного антигена Tra-1-60, который является одним из маркеров плюрипотентных клеток (Yehezkel et al., 2011), после чего механически отобрали Tra-1-60 + колонии. Исходя из того, что репрограммирование до плюрипотентного состояния является многоступенчатым процессом, окрашивание по Tra-1-60 было выбрано нами потому, что при приобретении клетками плюрипотентного статуса экспрессия этого маркера появляется на более поздних стадиях репрограммирования. Подтверждение недифференцированного состояния полученных иПСК. Щелочная фосфатаза, маркер плюрипотентных и стволовых клеток, экспрессируется в интактных клетках ДП и является индикатором индукционной способности дермальной папиллы. На 6-ом пассаже (3 пассажа до инфицирования «коктейлем Яманаки» +3 пассажа после инфицирования) мы детектировали в выделенном клоне иПСК – ДП экспрессию щелочной фосфатазы (Рис. 2б, 2г), в то время как в исходной культуре ДП (Рис. 2а) на таком же пассаже этот фермент экспрессировали единичные клетки. В иПСК, полученных из дермальных фибробластов, щелочная фосфатаза также детектировалась (Рис. 2в, 2д). Выделенные колонии были положительны по щелочной фосфатазе и при длительном культивировании (Рис. 2г, Рис. 2д) мы детектировали в иПСК данный фермент. Затем, с помощью иммуноцитохимического окрашивания было выяснено, что исследуемые колонии репрограммированных клеток экспрессировали транскрипционные факторы плюрипотентности: OCT4, SOX2, NANOG (Рис. 3а), а также поверхностные антигены SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81 (Рис. 3б). Для дальнейшей работы мы выбрали по одному клону иПСК, полученному из клеток ДП и 1608hT, обозначив их как иПСК – ДП и иПСК 1608hT соответственно. а б в г Рис. 2. Окрашивание на субстрат щелочной фосфатазы. (а) материнские клетки ДП (пассаж 6), (б) иПСК- ДП (пассаж 6), (в) иПСК - 1608hT (пассаж 6), (г) иПСК ДП (пассаж 12), (д) иПСК- 1608hT (пассаж 12); (г, д) фотографии 3см. чашки Петри. д 8 Рис. 3. Иммунофлуоресцентное окрашивание иПСК- ДП (слева) и иПСК- 1608hT (справа) против (а) Oct4, Sox2, Nanog, и (б) SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, Tra-1-81. Ядра клеток докрашены DAPI (синий). Масштабный отрезок 200 мкм. Рис. 6. Результаты ПЦР в реальном времени уровней экспрессии генов OCT4, SOX2, NANOG, TERT, KLF4, LIN28,DPPA4, DNMT3 для клеток ДП, 1608hT (ФЧ), иПСК – ДП, иПСК- 1608hT (иПСК- ФЧ), ЭСК. 9 нестин десмин АФП иПСК-1608hT иПСК-ДП ЭСК ЭТ Рис. 7. Иммунофлуоресцентное окрашивание криосрезов эмбриоидных телец (ЭТ). В ЭТ из всех трех источников ПСК выявляются маркеры эктодермы (нестин), мезодермы (десмин), энтодермы (АФП).Ядра докрашены DAPI (синий). Масштабный отрезок 200 мкм. Рис. 8. (а, в, д, ж, и) Дифференцировка иПСК- ДП и (б, г, е, з, к) иПСК- 1608hT в гепатоцитарном направлении. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток антителами против (а, б) Foxa2, (в, г) HNF4α, (д, е) АФП, (ж, з) СК18, (и, к) альбумина. Ядра докрашены DAPI (синий). Масштабный отрезок 200 мкм. 10 Рис. 9. Дифференцировка иПСК в остеогенном направлении. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток, дифференциронных из: иПСК- ДП против (а) остеопонтина и (б) остеонектина; иПСК- 1608hT против (в) остеопонтина и (г) остеонектина. Ядра докрашены DAPI (синий). Рис. 10. Дифференцировка иПСК - ДП в нейральном направлении. Ядра докрашены DAPI (синий). Масштабный отрезок 100 мкм. Рис. 11. иПСК – 1608hT после дифференцировки в нейральном направлении. Ядра докрашены DAPI (синий). Масштабный отрезок 200 мкм. 11 Рис. 12. Образование тератом из иПСК – ДП. Фотографии (а) реципиентной мыши спустя 6 нед. после введения иПСК – ДП (стрелкой указана тератома) и (б) вырезанной тератомы. Фотогрфии парафиновых срезов тератом, окрашенных: гематоксилином и эозином (в – г): (в) железистый эпителий, (г, д) нейроэктодерма (нейроэпителиальные трубочки и розетки указаны стрелками), (е) хрящевая ткань; антителами (ж – м) против: (ж) виментина, (з) нестина, (и) пан СК, (к) СК8, (л) СК18, (м) АФП. 12 Однако данные иммуноцитохимического окрашивания не отражают количественной характеристики особенностей полученных нами клонов иПСК. Поэтому, для определения процентного содержания иПСК в культуре, экспрессирующих перечисленные выше поверхностные маркеры плюрипотентности, мы использовали метод проточной цитофлуориметрии. По SSEA4 практически все иПСК - ДП были положительны (99,24%), в то время как для 81,04% популяции иПСК- 1608hT экспрессировали этот антиген. Tra-1-60 экспрессировали 78,36% иПСК- ДП и 84,57% иПСК- 1608hT. Tra-1-81 экспрессировали 67,39% иПСК- ДП и 86,03% иПСК- 1608hT. Больше половины популяции иПСК - ДП (54,72%) и 14,2% иПСК- 1608hT были положительны по SSEA3. Как видно из приведенных данных, при репрограммировании не все клетки клона начинают экспрессировать антиегены плюрипотентного статуса SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, Tra-1-81, однако, доля этих клеток велика (от 53 до 99%ов). Результаты исследования показали, что отобранные нами репрограммированные иПСК экспрессируют SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, Tra-1-81, которые практически не детектируются в материнских культурах ДП и фибробластов 1608hT. Так как исходные клетки не экспрессируют рассматриваемые маркеры плюрипотентности, а полученные нами клоны иПСК положительны по ним, очевидно, что обе культуры иПСК подверглись репрограммированию. Мы определили, что среднее время удвоения популяции клеток иПСК-ДП составило 25 часов, иПСК-1608hT — 20 часов. Таким образом, полученные клоны иПСК показывали сходную с ЭСК кинетику роста (среднее время удвоения популяции ЭСК состовляло 25 часов). Еще одним условием репрограммирования до плюрипотентного состояния является реактивация теломеразы в клетках. Известно, что в соматических клетках теломераза не активна, а при репрограммировании происходит ее реактивация. Теломераза обладает активностью обратной транскриптазы, удлиняющей теломерные участки клетки. С помощью TRAP-ПЦР анализа мы выяснили (Рис. 4), что в полученных нами иПСК теломераза активна. В материнской культуре ДП этот фермент не активен. Следовательно, в иПСК- ДП произошла реактивация теломеразы в процессе репрограммирования, подобно истинным иПСК. В дополнение мы проверили, что в материнской культуре фибробластов1608hT, иммортализованных геном каталитического компонента теломеразы, теломераза работает и в иПСК- 1608hT ее активность также детектируется (Рис. 4). 13 Рис. 4. Реактивация теломеразы в иПСК. Теломераза активна в образцах на дорожках, в которых детектируются дополнительные полосы соответствующие теломерным повторам (1, 3, 6). Дорожкам соответствуют следующие образцы: (1, 5) - 1608hT и ДП исходные культуры, (3, 6) – иПСК- 1608hT и иПСК- ДП соответственно, (2, 4, 7) – 1608hT, иПСК- 1608hT, иПСК- ДП соответственно, прогретые до инактивации теломеразы, выступают в качестве контроля метода. Используя ОТ-ПЦР анализ, мы обнаружили наличие в культурах иПСК транскриптов генов (Nanog, Oct4, Sox2, Tdgf1, Gabrb3, Esg1, Rex1, Fgf4, Dppa4, Gdf3), которые работают в раннем развитии и являются генами – маркерами плюрипотентных клеток (Рис. 5). В исходной культуре ДП транскрипты исследуемых генов не детектировались. В исходной культуре 1608hT они тоже практически не детектировались. Однако мы определили, что исходная культура 1608hT была положительна по Esg1 (Рис. 5), в отличие от исходной культуры ДП, отрицательной по всем исследуемым генам, в том числе и по Esg1. Известно, что Esg1 экспрессируется в предимплантационном эмбрионе, герминальных стволовых клетках и ЭСК. Наличие транскриптов этого гена в клетках 1608hT, скорее всего, указывает на активацию гена Esg1 под действием TERT. Рис. 5. Экспрессия генов раннего развития (названия справа) по данным ОТ-ПЦР. Дорожкам соответствуют следующие образцы: ДП (1), иПСК- ДП (2), 1608hT (3), иПСК- 1608hT (4), ЭСК (5). В качестве контроля количества матрицы был использован ген GAPDH. Для контроля праймеров использовали культуру ЭСК человека. 14 Таким образом, можно заключить, что в полученных нами линиях иПСК (иПСК – ДП и иПСК – 1608hT) произошли изменения работы генома, которые проявляются в появлении транскрипции генов Nanog, Oct4, Sox2, Tdgf1, Gabrb3, Esg1, Rex1, Fgf4, Dppa4, Gdf3, в отличие от материнских культур клеток ДП и 1608hT, в которых мы практически не обнаруживали транскриптов исследуемых генов. Наличие положтельных сигналов в обоих клонах иПСК указывает на активацию перечисленных генов при репрограммировании. Чтобы выявить индивидуальные особенности той или иной культуры, мы использовали метод ПЦР в реальном времени (Рис. 6).Мы сравнили уровни экспрессии исследуемых генов, ассоциированых с ранним развитием (Nanog, Oct4, Sox2, Tert, Klf4, Lin28, Esg1, Dppa4, Dnmt3). Несмотря на то, что нам удалось определить некоторые особенности исследуемых клеточных культур, уровни экспрессии практически всех исследуемых генов в полученных иПСК были сопоставимы с таковыми в ЭСК и отличались от профиля экспрессии по исследуемым генам от материнских клеток. Таким образом, с помощью метода количественного ПЦР мы показали, что полученные иПСК – ДП и иПСК – 1608hT более походят друг на друга и ЭСК, и отличаются от не репрограммированных клеток ДП и 1608hT. Следовательно, полученные нами репрограммированные клетки по проверенным характеристикам отвечают критериям недифференцированного статуса, и в то же время несколько отличаются между собой, но близки по свойствам к ЭСК больше, чем к исходным культурам клеток. Для дальнейшей характеристики нам необходимо было проверить дифференцировочный потенциал полученных иПСК. Исследование дифференцировочного потенциала иПСК. Из иПСК нами были получены эмбриоидные тельца (ЭТ), которые в лабораторных условиях способны воспроизводить первые этапы эмбриогенеза (Рис. 7). Они представляют собой самоорганизующиеся округлые цистические агрегаты. В ЭТ из иПСК - ДП и иПСК - 1608hT, подобно ЭТ, образованным из ЭСК, мы детектировали белки эктодермы (нестин), мезодермы (десмин) и энтодермы (АФП) (Рис. 7). Благодаря способности к дифференировке в лабораторных условиях ПСК могут быть использованы для изучения процессов раннего развития и направленной дифференцировки клеток в те или иные ткани. Мы подобрали условия для того, чтобы полученные иПСК давали начало производным экто - (нейродифференцировка), мезо - (остеогенная дифференцировка) и энтодермы (гепатоцитарная дифференцировка). Клетки культивировали в индукционных средах как описано в разделе «Материалы и методы». Дифференцировку в гепатоциторном направлении (Рис. 8) проводили в течение 3 – 5 нед., после чего в иПСК - ДП появлялась экспрессия ядерных транскрипционных факторов Foxa2 (маркер дефинитивной энтодермы) и HNF4α (маркер экстра эмбрионльной энтодермы), которая не детектировалась после 15 дифференцировки иПСК - 1608hT. Однако мы наблюдали слабую экспрессию АФП, что, скорее всего, указывает на коммитирование в гепатобласт, в гепато – иПСК - 1608hT (Рис. 8е) и более выраженную – в культуре гепато – иПСК – ДП (Рис. 8д). Эпителиальный маркер CK18, характеризующий приобретение дифференцированного статуса, который предполагает гепато- спецификацию клеток, появлялся только в культуре гепато - иПСК – ДП (Рис. 8ж), а в клетках гепато - иПСК - 1608hT (Рис. 8з) экспрессия его не наблюдалась. Экспрессия альбумина, свойственная зрелым гепатоцитам была выражена сильнее в культуре гепато - иПСК – ДП (Рис. 8и), чем в культуре гепато – иПСК - 1608hT (Рис. 8к). Из приведенных данных можно сделать вывод, что культура иПСК - ДП обладает большим потенциалом к гепатоцитарной дифференцировке, чем иПСК - 1608hT. Спустя 2 – 3 нед. после индукции остеогенной дифференцировки (Рис 9) мы детектировали в обеих культурах белки внеклеточного матрикса остеопонтина (Рис. 9а, 9в) и остеонектина (Рис. 9б, 9г). Они являются марекерами остеобластов и принимают участие в минерализации кости. Дифференцировку в нейальном направлении (Рис. 10, 11) проводили в течение 3 – 5 нед. С помощью иммуноцитохимического окрашивания, мы обнаружили, что обе культуры нейро- иПСК экспрессировали Prox1, который, возможно, играет фундаментальную роль в развитии ЦНС, принимая участие в регуляции экспрессии и развития постмитотических недифференцированных предшественников нейронов. Обе культуры были положительны по маркеру НСК нестину, и образовывали сплетения клеток с длинными отростками, положительными по маркерим незрелых нейронов даблкортину (DC) и β III тубулину и окрашивались на меркер зрелых нейронов нейрон-специфическую енолазу (NSE). Полученные после дифференцировки нейро – иПСК – ДП хоть и были положительны по маркеру дофаминергических нейронов TH, однако, окрашивание было не столь специфическим, как в культуре нейро – иПСК – 1608hT (окрашивание клеток с длинными отростками). Спустя месяц после индукции дифференцировки мы также детектировали маркеры глиальных клеток CNPase и GFAP в нейро – иПСК – ДП и GFAP в культуре нейро – иПСК – 1608hT. В двух исследуемых культурах нами было замечено, что количество клеток, положительных по маркерам глии значительно меньше, чем по нейрональным маркерам, что, скорее всего, говорит о том, что используемый нами протокол дифференцировки в большей степени подходит для нейрональной дифференцировки, чем для глиальной. Таким образом, изменяя состав среды, можно исследовать процессы дифференцировки клеток. Дифференцировка полученных иПСК in vivo. Одним из достоверных тестов, доказывающих плюрипотентность клеток является их способность образовывать тератому после введения бестимусным мышам. Тератома представляет собой опухоль, состоящую из нескольких типов тканей, производного обычно трех основных зародышевых листков, присутствие которых 16 не свойственно тем органам или анатомическим областям организма, в которых развивается опухоль. Спустя 4-6 нед. на месте инъекции недифференцированных иПСК-ДП, как и иПСК-1608hT, мы наблюдали образование тератом (Рис. 12а, 12б). В каждой группе было по 4 бестимусных мыши. От каждого животного была получена опухоль. В полученных тератомах обнаруживались структуры экто-, мезо- и энтодермального происхождения. На гистологических препаратах выделялись обширные участки железистого эпителия (Рис. 12в). Железистые структуры занимали большую часть объема опухоли. Также на препаратах местами определяли хрящевую ткань (Рис. 12е), кроме того, обнаруживали примитивные нейроэктодермальные розетки и трубочки (Рис. 12в). Выявлялись участки незрелой нервной ткани, состоящие из мелких гиперхромных клеток с узким ободком цитоплазмы. С помощью иммуногистохимического окрашивания мы подтвердили подлинность получения тератом из иПСК – ДП, в препаратах выявлялись виментин-богатые участки, располагающиеся в тканях между протоками (Рис. 12ж). Нестин обнаруживался в структурах, напоминающих нейроэктодермальные розетки и трубочки (Рис. 12з). Мы наблюдали большое количество железистых структур, в которых определяли пан цитокератин, цитокератин 8, цитокератин 18 и альфафетопротеин (Рис. 12 и – м). ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной работе мы получили и охарактеризовали иПСК из клеток дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула человека. Так как к моменту начала нашего исследования, опубликованных работ по репрограммированию клеток ДП человека не было, нам показалось интересным и перспективным для дальнейших исследований репрограммировать эти клетки до плюрипотентного состояния. Мы исследовали репрограммирование клеток ДП человека в сравнении с другим компонентом кожи – дермальными фибробластами, которые являются хорошо известным источником иПСК. В связи с экспрессией клетками ДП ряда транскрипционных факторов, необходимых для репрограммирования, мы предположили большую эффективность клеток ДП по сравнению с фибробластами. Таким образом, инфицируя дифференцированные клетки взрослого человека стандартным набором лентивирусных конструкций, кодирующих гены Oct4, Sox2, Klf4 и с-Myc, при добавлении химического соединения – вальпроевой кислоты в условиях физиологичного уровня кислорода (5%) нам удалось изменить судьбу этих клеток. После селекции, используя различные подходы, описанные в разделе «Материалы и матоды», мы подтвердили плюрипотентный статус полученных клеток. Мы определили, что эффективность репрограммирования клеток ДП была ≈ 0,03%, а фибробластов линии 1608hT ≈ 0,01%. Таким образом, мы подтвердили наше предположение о предпочтительности использования клеток ДП в отличие от дермальных фибробластов для получения иПСК ввиду большей эффективности их 17 репрограммирования. В приоритетной работе Higgins и сотр. (Higgins et. al., 2012) эффективность репрограммирования клеток ДП человека составила ≈ 0,02%. Возможно, разница в 0,01% связана с тем, что мы репрограммировали клетки в условиях 5% содержания кислорода и при добавлении на ранних этапах вальпроевой кислоты, тогда как Higgins и сотр. (Higgins et. al., 2012) - нет. Так как в литературе рассматривается спонтанная дифференцировка иПСК-ДП, нам показалось интересным разработать некоторые протоколы дифференцировки полученных клеток в заданном направлении, которые могут быть полезны для понимания механизмов развития и оптимизации протоколов дифференцировок ПСК. Оказалось, что полученная нами культура иПСК из ДП (иПСК – ДП) обладает более выраженным потенциалом к дифференцировке в гепатоцитарном направлении, чем иПСК, полученные из фибробластов. Таким образом, данный опыт может быть полезным при моделировании болезней печени. Из работы очевидно, что для возможных медицинских целей предпочтительнее использовать иПСК – ДП, чем иПСК – 1608hT. В заключение мы показали, что полученные нами иПСК – ДП обладают способностью к дифференцировке в клетки трех зародышевых листков in vivo и образуют тератому в бестимусном животномреципиенте, в которой преобладают энтодермальные структуры железистого эпителия. Выводы 1. При помощи трансфекции лентивирусными конструкциями, кодирующими гены репрограммирующих факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус из культуры клеток дермальной папиллы (ДП) человека была получена культура индуцированных плюрипотентных стволовых клеток иПСК-ДП. 2. Впервые показано, что при добавлении вальпроевой кислоты в условиях физиологического уровня кислорода (5%) эффективность репрограммирования клеток ДП составила ≈ 0,03%. 3. Полученные иПСК – ДП отвечают критериям плюрипотентности по морфофункциональным характеристикам. Фенотип иПСК – ДП схож с фенотипом ЭСК и существенно отличается от фенотипа материнских клеток ДП. 4. Полученная культура иПСК-ДП обладает способностью к направленной дифференцировке в клетки трех зародышевых листков in vitro в остеогенном, гепатоцитарном и нейральном направлениях. 5. иПСК-ДП способны дифференцироваться in vivo, давая начало тератоме, в которой преобладают структуры железистого эпителия. Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи: 1. Дашинимаев Э.Б., Мучкаева И.А., Файзуллин Р.Р., Егоров Е.Е., Акимов С.С., Терских В.В., Васильев А.В., Кирпичников М.П. 2012. Индукция теломеразной активности увеличивает эффективность репрограммирования 18 фибробластов кожи человека. // Вестник Московского университета, серия 16: Биология.. №1. С. 8 - 14. 2. Мучкаева И.А., Дашинимаев Э.Б., Терских В.В., Суханов Ю.В., Васильев А.В. 2012. Молекулярные механизмы индуцированной плюрипотентности. // Акта Натура. Т. 4. № 1. С. 12–23. 3. Дашинимаев Э.Б., Чжан Мэн, Файзуллин Р.Р., Мучкаева И.А., Терских В.В., Суханов Ю.В., Васильев А.В., 2012. Индукция теломеразной активности вызванная введением синтезированной in vitro модифицированной мРНК гена hTERT. // Молекулярная медицина. №6. С.46 – 51. Патент на изобретение № 2492233, заявка № 2012142244/10 от 04.10.2013. Дашинимаев Э.Б., Мучкаева И.А., Васильев А.В., Терских В.В., Вишнякова Х.С. Способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с синдромом Дауна. Тезисы конференций: 1. Мучкаева И.А. Экспериментальные подходы к репрограммированию соматических клеток в условиях in vitro. VI Конференция молодых ученых ИБР РАН, Москва. 16 – 17 декабря 2010. Онтогенез. 2011. Т. 42. № 5. С. 327 – 328. 2. Мучкаева И.А. Репрограммирование стволовых клеток амниотической жидкости человека до плюрипотентного состояния. VII Конференция молодых ученых ИБР РАН, Москва. 12 – 13 декабря 2011. Онтогенез. 2012. Т. 43. №. 4. С. 241. 3. Мучкаева И.А., Дашинимаев Э.Б., Давыдова Д.А., Терских В.В., Васильев А.В. Получение иПСК из клеток амниотической жидкости человека. Международная конференция «Биология – наука XXI века», Москва. 24 мая 2012. Сборник тезисов конференции. С. 619. 4. Артюхов А.С., Мучкаева И.А., Дашинимаев Э.Б. Дифференцированные в нейральном направлении ИПС клетки с синдромом Дауна как модель болезни Альцгеймера. 55-ая Научная конференция МФТИ, Долгопрудный. 19 – 25 ноября 2012. Сборник тезисов конференции. С. 98 – 99. 5. Мучкаева И.А., Дашинимаев Э.Б., Артюхов А.С., Васильев А.В. Репрограммирование клеток дермальной папиллы человека до плюрипотентного состояния. VIII Школа-конференция молодых ученых, Москва. 29 – 30 ноября 2012. Онтогенез. 2013. Т. 44. № 4. С. 231 – 232. 6. Мучкаева И.А., Артюхов А.С., Дашинимаев Э.Б., Васильев А.В. Получение иПСК из клеток дермальной папиллы волосяного фолликула человека. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2013», Москва. 8-13 апреля 2013. Сборник тезисов конференции. С. 15. 19
