Структурно-функциональная организация гладкой мышечной
реклама
На правах рукописи Корепанова Юлия Борисовна СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЛАДКОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ГРУДНОГО ПРОТОКА КРЫСЫ 03.03.01 – физиология 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Архангельск – 2012 Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном «Северный учреждении высшего профессионального образования государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Научный руководитель: доцент кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Северного государственного медицинского университета (г.Архангельск), доктор медицинских наук, доцент Болдуев Владимир Афанасьевич Официальные оппоненты: заведующая кафедрой нормальной физиологии и восстановительной медицины Северного государственного медицинского университета (г. Архангельск), доктор медицинских наук, профессор Совершаева Светлана Леонидовна заведующая кафедрой гистологии с курсом эмбриологии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова Министерства обороны РФ (г. Санкт-Петербург), доктор медицинских наук, профессор Одинцова Ирина Алексеевна Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России (г. Томск) Защита диссертации состоится «____»___________ 2012 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.004.01 при ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России по адресу: 163000, г.Архангельск, пр. Троицкий, 51. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Северного государственного медицинского университета по адресу: 163000, г. Архангельск, пр. Троицкий, 51. Автореферат разослан «___» ______________ 2012 г. Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук, профессор Вилова Татьяна Владимировна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. В последние десятилетия проводятся многочисленные исследования структуры лимфатических сосудов и грудного протока в частности (Борисов А. В., 2005; Mebius R. E. et al., 2006; Boccardo F. et al., 2009). При этом усилия физиологов, морфологов и клиницистов сконцентрированы над решением проблемы управления процессами эвакуации и транспорта лимфы (Борисов А.В., 1997, 2005; Бородин Ю.И., 2005; Ерофеев Н.П. с соавт., 2008; Петренко В.М., 2009; Misuno R. et al., 1999; Zawieja D. C. et al., 2005; Von der Weid P.Y. et al., 2010). Одним из ключевых путей в решении поставленной задачи видится дальнейшая разработка проблемы факторов лимфотока, которые влияют на функционирование лимфатической системы. Создание и развитие положений теории лимфангиона – выделенного в физиолого-структурную единицу лимфатического сосуда (Орлов Р.С. с соавт., 1983; Mislin H., 1961), позволяет констатировать, что процессы перемещения лимфы являются результатом сложной совокупности внешних движущих сил и механизмов внутренней регуляции автоматических сокращений лимфангионов (Петунов С.Г. с соавт., 2010; Gashev A., 2002; Zawieja D.C. et. al., 2009). Важнейшая роль в обеспечении процессов движения лимфы отводится гладкой мышечной ткани (ГМТ), инкорпорированной в составе стенки лимфатических сосудов. Грудной проток крысы по ряду физиологических параметров (БорисоваР.П., 1989), топографии (Петренко В.М., 2009) близок к грудному протоку человека и является одним из наиболее удобных объектов для изучения лимфатической системы. Лимфатический коллектор представляет собой цепочки лимфангионов – камерных микронасосов, имеющих в своем составе все необходимое для активного транспорта лимфы – мышечные манжетки и клапаны. Компенсаторно-приспособительные процессы гладкой мышечной ткани грудного протока представляются малоизученными (Петунов С.Г. с соавт., 2010), в то время как их вовлеченность в протекание патологических процессов является несомненной. Так, исследования последних лет свидетельствуют о широком распространении обтурационных поражений желчных путей (СулимаД.Л., 2010; Воротынцев А.С. 2012), которые сопровождаются накоплением в лимфе токсических продуктов метаболизма (Стюрева Г.М., 2001; Кадырбаев Р. В., 2006; Dumont A.Е., 1972; Stelios F.A. et. al., 2005), повышением эндолимфатического давления в грудном протоке (Кашаева М.Д. с соавт., 2005). В этих условиях грудной проток компенсирует желчную гипертензию (Поташев А.В. и соавт., 2002; Кадырбаев Р.В., 2006), беря на себя в определенной степени функцию, связанную с удалением не только продуктов метаболизма, но и компонентов застойной желчи. В последние годы в лечении билиарной патологии активно применяются методы лимфодренирования и лимфосорбции, в связи с чем весьма актуальным следует считать проведение экспериментальных исследований с целью физиологического обоснования эффективности существующих методов 4 лечения (Линченко А.М., 1995; Еникеев Д.А. с соавт., 2007). Полученные рядом авторов данные об изменения лимфодинамики и состава лимфы при билиарной окклюзии (Кашаева М.Д. с соавт., 2005 Стюрева Г.М., 2001) к сожалению не позволяют оценить адаптивную реакцию гладкой мышечной ткани лимфангионов грудного протока к изменяющимся условиям функционирования лимфатической системы. Таким образом, представляется актуальным проведение комплексного сравнительного анализа гладкой мышечной ткани грудного протока лабораторных животных в норме и в процессе развития компенсаторноприспособительных реакций. Цель исследования – выявление особенностей структурнофункциональной организации и реактивной трансформации гладкой мышечной ткани грудного протока крысы. Задачи исследования: 1. Изучить структурно-функциональную организацию грудного протока крысы с позиции реализации возможностей активного транспорта лимфы. 2. Установить цитофизиологические особенности функционирования гладкой мышечной ткани лимфангионов грудного протока крысы. 3. Оценить процессы физиологической регенерации, структурнометаболические параметры и миоархитектонику гладких мышечных клеток грудного протока крысы с учетом влияния внутри- и внеорганных факторов лимфотока. 4. Определить общие закономерности протекания компенсаторноприспособительных реакций гладкой мышечной ткани грудного протока крысы в условиях моделирования механической обструкции желчевыводящих путей. Положения, выносимые на защиту. 1. Грудной проток крысы представляет собой полилимфангионную систему, морфофункциональные характеристики которой ориентированы на активное перемещение лимфы. Стенка межклапанных участков грудного протока, в отличие от кровеносных сосудов, имеет структурно-гетерогенную конструкцию. Контрактильная функция лимфангионов реализуется во взаимодействии гладких миоцитов, нервных окончаний и клеток с морфологическими характеристиками пейсмейкеров. Локальные особенности функционирования грудного протока модулируются внеорганными факторами лимфотока. 2. Цитофизиологические особенности функционирования гладкой мышечной ткани грудного потока крысы в значительной мере определяются структурно-метаболическими параметрами гладких миоцитов. Протекание процессов физиологической регенерации, структура популяции и метаболические характеристики гладких мышечных клеток изменяются в соответствии с функциональными особенностями перемещения лимфы в условиях воздействия интра- и внеорганных факторов влияния на лимфоток. 3. Морфофункциональные проявления реактивной перестройки гладкой мышечной ткани грудного протока крысы зависят от продолжительности стрессорного экспериментального воздействия. Адаптивная трансформация 5 гладкой мышечной ткани мышечной манжетки межклапанных участков обусловливает коррекцию насосной функции лимфангионов. Характер компенсаторно-приспособительного ответа реализуется в изменении ориентации и количества гладких миоцитов, трансформации структуры популяции и характера ядерного синтеза ДНК гладких мышечных клеток грудного протока крысы. Научная новизна исследования. Впервые с помощью комплекса морфометрических и цитохимических методик проведен анализ цитофизиологических особенностей функционирования ГМТ грудного протока крысы. Впервые показано, что в соответствии с функциональными особенностями перемещения лимфы в условиях интра- и внеорганных факторов влияния на лимфоток происходит трансформация миоархитектоники лимфангионов, последовательное изменение структуры популяции гладких мышечных клеток (ГМК), которое реализуется в интегративном взаимодействии клеток гладкомышечного дифферона и их пролиферативной активности. Впервые на основе комплексного анализа дана сравнительная оценка тканевых и клеточных механизмов реактивной перестройки гладкой мышечной ткани грудного протока при моделировании механической желтухи. Впервые с помощью анализа изолированных гладких мышечных клеток лимфангионов грудного протока установлено, что одним из основных механизмов компенсаторно-приспособительных реакций гладкой мышечной ткани лимфатического сосуда является динамичная трансформация структуры клеточной популяции. Показано, что изменения в структуре популяции и пролиферативных возможностях ткани, определяются длительностью воздействия повреждающих факторов. Легитимность исследования подтверждена решением комитета по этике Северного государственного медицинского университета (СГМУ, протокол № 03/02 от 12.02.10). Теоретическая, практическая значимость исследования, внедрение результатов. Полученные в работе данные об особенностях миоархитектоники мышечных манжеток лимфангионов грудного протока крысы, структурнометаболических параметрах гладких мышечных клеток лимфатического коллектора в условиях нормального функционирования и при изменении их функциональной нагрузки имеют существенное значение для расшифровки клеточных механизмов реактивности и адаптационных реакций гладкой мышечной ткани лимфатического сосуда. Практическое значение имеет положение о том, что длительное течение патологического процесса, предопределяет нарушение насосной функции лимфангионов. Эти данные позволили дополнить теоретическое представление о возможностях управления транспортной функцией грудного протока, уточнить сроки и целесообразность использования лимфодренирующих операций на грудном протоке. Полученные результаты внедрены в лечебно-диагностический процесс государственного бюджетного учреждения здравоохранения Архангельской области «Первая городская клиническая больница им. Е.Е.Волосевич» (Архангельск, акт внедрения от 14.09.2012). Результаты исследования 6 используются в учебном процессе на кафедрах физиологии и морфологии СурГУ (Сургут, акт внедрения от 14.06.12), на педиатрическом факультете и факультете фармации и медицинской биологии СГМУ (Архангельск, акт внедрения от 03.09.12). Личный вклад автора в проведенное исследование заключается в самостоятельной разработке программы исследования, участии в его осуществлении. Результаты комплексного исследования структурнофункциональной организации ГМТ грудного протока крысы, ее компенсаторно-приспособительных реакций получены при непосредственном участии автора. Интерпретация полученных данных, разработка практических рекомендаций осуществлялась автором самостоятельно. Диссертационная работа соответствует паспортам специальностей: 03.03.01 – физиология – по областям исследований: 3. Исследование закономерностей функционирования основных систем организма. 6. Изучение механизмов функционирования клеток, тканей, органов, принципов их системной организации; 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология – по областям исследований: 2. Изучение закономерностей дифференцировки клеток и тканей, их физиологической регенерации и регуляции этих процессов, а также дифференцировки и жизнедеятельности недифференцированных клеток; 5. Исследование адаптации тканевых элементов к действию различных биологических, физических, химических и других факторов. Апробация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: международных медицинских научных конференциях молодых ученых и студентов (Архангельск, 2009, 2010, 2011); на международной конференции «Фундаментальные и клинические аспекты охраны здоровья человека на Севере» (Сургут 2010), на Х Конгрессе международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010), на ХХХIХ, ХХХХ Ломоносовских чтениях (Архангельск, 2010, 2011), III Эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов и эмбриологов «Югра-Эмбрио – 2011 «Закономерности эмбриофетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных»» (ХантыМансийск, 2011), совместном заседании проблемной комиссии СГМУ по физиологии и восстановительной медицине и проблемной комиссии СГМУ по морфологии (Архангельск, 20.09.2012). Публикации. По результатам исследования опубликовано 12 печатных работ, в том числе 5 в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации представлены на 195 страницах и включают введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические рекомендации и список литературы. Диссертация содержит 26 таблиц, 66 рисунков, включающих микрофотографии. Список литературы содержит 212 источников, из них 110 работ отечественных авторов и 102 иностранных. 7 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Изучение структурно-метаболических характеристик гладкой мышечной ткани грудного протока проводили на материале лабораторных белых беспородных крыс-самцов массой 300-350грамм. Экспериментальные исследования выполняли в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 1996). Представительность выборки определялась поэтапно с учетом вариабельности признака. Реактивность гладкой мышечной ткани грудного протока изучалась на материале, полученном в результате развития экспериментальной обтурации желчевыводящих путей. Исследовались фрагменты гладкой мышечной ткани различных отделов грудного протока крыс взятые на 3, 5, 7, 10, 14-е сутки эксперимента (50 животных). Всего в работе проанализирован материал от 70 объектов исследования. Изолированные гладкие мышечные клетки изучены по 11 параметрам: линейные и объемные размеры клеток и их ядер, ядерно-цитоплазматическое отношение, оптическая плотность ДНК ядер и суммарного белка цитоплазмы. Проанализировано более 100 электронограмм. Характеристика исследованного материала приведена в таблице 1. Таблица 1 Характеристика исследованного материала Объект Крысы: грудной проток Крысы: грудной проток Серия исследования, экспериментальная модель Гладкая мышечная ткань контрольная группа Гладкая мышечная ткань при обтурации желчевыводящих путей, материал взят на 3, 5, 7, 10, 14 сутки эксперимента Методы исследования Число объектов Общая гистология, тотальный препарат, морфометрия изолированных ГМК, цитоспектрофотометрия ДНК и суммарного белка цитоплазмы, электронная микроскопия, иммуноцитохимия Общая гистология, тотальный препарат, морфометрия изолированных ГМК, цитоспектрофотометрия ДНК и суммарного белка цитоплазмы, электронная микроскопия, иммуноцитохимия 20 особей 50 особей Биомикроскопия и гистологические методы проводились по стандартной методике (окраска парафиновых срезов гематоксилин-эозином, орсеином). Для выделения лимфатических сосудов применялись инъекционная (голубая масса Герота) и безиньекционная методики (Петренко В.М. с соавт., 2004). Тотальные препараты докрашивали галлоцианин-хромовыми квасцами. Количество миоцитов (ядер) (Кауфман О.Я., 1979; Борисов А.В., 1984) подсчитывали в сетке Стефанова (об.40, ок.7). 8 Прицельная щелочная диссоциация. Для количественных цитологических исследований тканей использован метод щелочной диссоциации (Бродский В.Я. с соавт., 1983, Данилов Р.К. с соавт., 1989, Ямщиков Н.В. 1991). Для получения однородной взвеси изолированных гладких миоцитов и изучения фрагментов стенки лимфангиона (мышечной манжетки) использовался оригинальный метод прицельной клеточной диссоциации (Зашихин А.Л., Агафонов Ю.А., Лисишников Л.В, патент РФ на изобретение № 2104524 от 23.05.94.), позволяющий избирательно выделять из стенки органов тканевые компоненты определенного типа и проводить их последующую диссоциацию. Выделенные микрофрагменты диссоциировали в 50% водном растворе КОН в течение 2,5-3 часов. Разделение клеток достигали с помощью гидроудара струи воды из микропипетки с последующим пассажем содержимого пробирки, что позволяло получить однородную взвесь клеток, из которой изготовляли мазки. Мазки изолированных ГМК окрашивали комбинированным способом, выявляющим ДНК ядер и суммарный белок цитоплазмы. Выявление ДНК в ядрах проводили в строго идентичных условиях по методу Фёльгена, контролем служили мазки не подвергшиеся гидролизу в растворе соляной кислоты. Суммарный белок цитоплазмы выявляли амидочерным 10Б (Брумберг В.А., Певзнер Л.З., 1972). Для определения содержания ДНК и белка в ГМК проводили цитофотометрическое исследование. Морфометрия и цитоспектрофотометрия. Цитоспектрофотометрию проводили одноволновым методом на сканирующем спектрофотометре МФТХ2М, оборудованным монохроматором и позволяющем строго выдерживать параметры длины волны. Определение ДНК ядер и суммарного белка в цитоплазме проводили методом сканирования. ДНК фотометрировали при длине волны – 546нм, а суммарный белок цитоплазмы – при 580нм, зондом диаметром 0,5мкм. Одновременно измеряли линейные размеры миоцитов и их ядер при помощи окуляр-микрометра МОВ-1-15х в двух взаимно перпендикулярных плоскостях. Объемы гладких миоцитов и их ядер вычисляли по формуле эллипсоида вращения. Электронно-микроскопический метод. Материал фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) в течение 2 часов и последующей постфиксацией в течение 1 часа в 2% растворе тетраоксида осмия при температуре 5С. Кусочки промывали в буфере, затем проводили обезвоживание в ацетоне возрастающей концентрации (50%, 70%, 90%, 100%), контрастировали в 70 спирте и 1% уранилацетате в течение 12 прицельного часов. Заливали в смесь эпон-аралдита. Для обеспечения электронно-микроскопического анализа со всех блоков получали серийные полутонкие срезы толщиной 1-2мкм, которые окрашивали 1% раствором метиленового синего. После идентификации необходимых объектов блоки затачивали и прицельные ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-5 (Bromma, Sweden), подвергали двойному контрастированию в 2,5% растворе уранилацетата и 0,3% растворе цитрата свинца. В последующем данные объекты 9 просматривали и фотографировали в электронных микроскопах JEM-100 CX, ПЭМ-100 при увеличениях 4000-40000. Иммуноцитохимическое исследование. Экспериментальный материал исследуемых объектов лабораторных животных (крыс) фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (PBS, phosphate buffer solution, Sigma, Immunochemicals, USA) в виде блоков в течение 2 дней, затем готовили парафиновые срезы (5-7мкм в толщину). Перед инкубацией в растворе первичных антител парафиновые срезы на стеклах подвергали депарафинизации в ксилоле, спиртах возрастающей концентрации. Затем обрабатывали 3% водным раствором перекиси водорода в течение 10 минут, и преадсорбировали с 5% лошадиной сывороткой (фирма Sigma Immunochemicals, США) 30 минут при комнатной температуре. После каждой операции срезы отмывали стандартным раствором фосфатно-солевого буфера (фирма Sigma Immunochemicals, США). В качестве первичных антител использовали фактор некроза опухоли TNF-R1 (Santa Crus, США), PCNA (Santa Cruz, США), поликлональный кроличий иммуноглобулин (c-19) c-kit. Экспозицию с первичными антителами к гладкой мышечной ткани осуществляли в течение 12 часов при 4°С. Визуализация реакции проводилась с помощью вторичных биотинилированных антител с применением диаминобензидина для выявления реакции апоптоза. Препараты подкрашивали квасцовым гемтоксилином (с подсинением в щелочной воде). Статистическая обработка. Статистический анализ проводился на персональном компьютере с использованием пакета прикладных статистических программ STATISTICA v 6.0 для «WINDOWS-ХР». Результаты тестов считались статистически значимыми при р<0,05. Определяли числовые характеристики переменных, оценку соответствия вида распределения признака закону нормального распределения, оценку значимости различных количественных показателей в независимых выборках с использованием t- критерия Стьюдента. В результате вычисляли средние значения, стандартные отклонения, ошибки средней арифметической, определяли коэффициенты вариации, асимметрии и эксцесса. Нормальность распределения определялась по критерию ХолмогороваСмирнова с поправкой Лиллиефорса. Для сравнения двух независимых совокупностей по одному признаку при нормальном распределении количественных переменных использовали t- критерий для независимых совокупностей (t- критерий Стьюдента, T-test for Independent Simples). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Структурно-функциональная организация интактной гладкой мышечной ткани грудного протока крысы Главным лимфатическим коллектором крысы является грудной лимфатический проток, который имеет значительную протяженность и активно функционирует в условиях воздействия на транспорт лимфы большого количества внеорганных факторов. В отличие от кровеносных сосудов стенка грудного потока имеет гетерогенную конструкцию. В зависимости от представительства ГМК, эластических и коллагеновых волокон в стенке 10-12 10 межклапанных сегментов (лимфангионов) грудного протока различают три части: мышечную манжетку, стенку клапанного синуса и область прикрепления клапана. При этом общая конструкция полилимфангионной системы грудного протока выглядит следующим образом. В средней части лимфангиона (мышечной манжетке) миоцитов больше, чем в клапанном участке. Гладкие мышечные клетки стенки клапанного синуса не образуют сплошного мышечного слоя. Клапанный аппарат лимфангионов грудного протока состоит из истонченной безмышечной створки и клапанного валика, содержащего короткие кластеры лейомиоцитов. Мышечные манжетки лимфангионов грудного протока имеют не менее двух слоев ГМК – поверхностного и глубокого. ГМК интегрированы друг с другом в основном в пределах мышечного слоя. Преобладающей формой следует считать простые мио-миоцитарные контакты. Наиболее часто встречающимся видом взаимодействий являются контакты между отростками миоцитов и между отростком и боковой поверхностью ГМК. Коммуникационные контакты по типу нексусов не являлись доминирующей формой взаимодействия. Анализ данных литературы и собственные результаты исследования позволяют предположить наличие межорганных и межвидовых различий в организации функционирования лимфососудов. Так Mislin Н. (1980), сообщал о крайней насыщенности нервными окончаниями стенки лимфангионов брыжейки тонкого кишечника крысы, соответствующей multi-unit форме их организации. В нашем исследовании нервно-мышечные контакты представлены относительно небольшим количеством нервных окончаний. Весьма многочисленные в лимфангионах человека мио-эндотелиальные контакты (Болдуев В.А., 2006), не были идентифицированы в стенке грудного протока крысы. Триггерным механизмом индуцирующим запуск сокращения лимфангиона может служить спонтанная деполяризация в клетках пейсмекерах лимфангионов, особые свойства мембран которых не требуют обязательного предварительного растяжения (Гашев А.А., 2001; Van Helden D.F., 1993). Пейсмекерную функцию могут выполнять так называемые интерстициальные клетки Кахаля (ИКК) (Зашихин А.Л. с соавт., 1999; Daniel E. E., 2001). В настоящее время для идентификации ИКК используется иммуногистохимическая техника с использованием антител к c-kit, электронная микроскопия и анализ изолированных ГМК (Зашихин А.Л. с соавт., 2012). Мы использовали все методики для обнаружения подобных клеток в стенке грудного протока крысы. Так, положительная иммуноцитохимическая реакция была зарегистрирована в клетках субэндотелиальной локализации и адвентиции в области клапанного участка лимфангиона. При изучении электронограмм нам также удалось выявить в ГМТ лимфатического коллектора клетки с характеристиками ИКК. Они тесно взаимодействовали с окружающими ГМК, но отличались от них отсутствием компонентов контрактильного аппарата, базальной мембраны и кавеол. В цитоплазме содержался умеренно развитая гладкая эндоплазматическая сеть, митохондрии 11 и филаменты промежуточного типа. Среди изолированных ГМК, полученных из стенки грудного протока, также удалось обнаружить клетки с морфологическими характеристиками пейсмейкеров. Эластические структуры в стенке лимфангиона неравномерно рассредоточены в различных его отделах. В области мышечной манжетки они формируют внутреннюю эластическую мембрану. Наружная эластическая мембрана в стенке лимфангионов грудного протока не определяется, в связи с чем выделение традиционных для сосудистой стенки внутренней, средней и наружной оболочек не представляется возможным. Локальные особенности функционирования грудного протока модулируются внеорганными факторами лимфотока. В брюшной части грудного протока кластеры ГМК пологой ориентации проникают в соседние лимфангионы, формируют транзитные пучки, связывающие мышечные манжетки соседних лимфангионов, являясь таким образом структурной основой для их группового сокращения. По-видимому, значительное интравазальное и экстравазальное ускорение лимфотока за счет сокращения мощных мышц диафрагмы, пульсация аорты определяет форму сокращения задних отделов грудного протока как групповое сокращение нескольких соседних лимфангионов (Mislin H., 1983), создающее единый транспортный канал лимфотока (Петренко В.М., 1999). В краниальном направлении происходят существенные изменения миоархитектоники, которые обусловлены преобладанием крутоспиральных пучков миоцитов, обеспечивающих фазную ритмическую активность (Борисов А.В., 2005), и свидетельствующую об ослаблении влияния внеорганных факторов лимфотока. Таким образом, грудной проток крысы представляет собой полилимфангионную систему, функционирование которой регулируется во взаимодействии интра- и экстравазальных факторов. В каждом межклапанном сегменте имеются элементы, необходимые для активного транспорта лимфы – мышечная манжетка и клапаны. При этом кластеры ГМК мышечных манжеток в разных отделах грудного протока имеют меняющуюся конфигурацию, с доминирующей ориентацией по пологой или крутой спирали, что допускает различные типы сокращений лимфангионов. Запуск контрактации лимфангиона может осуществляться без предварительного обязательного растяжения его стенки. Отсутствие сведений о структурно-метаболической организации ГМТ грудного протока не позволяет составить системного представления об особенностях ее функционирования в норме и при компенсаторноприспособительных реакциях. К настоящему времени накопилось значительное количество публикаций, свидетельствующих о неоднородности клеточной популяции ГМТ (Зашихин А.Л., 2001; Ishida M. et al., 2001). Известно, что одним из важных показателей, характеризующих гетероморфию является размер клеток (Катинас Г.С. с соавт., 1985; Зашихин А.Л. с соавт., 2001-2003). Распределение ГМК стенки лимфангионов грудного протока экспериментальных животных по объемам свидетельствует о том, что данный показатель характеризуется наиболее высоким коэффициентом вариации 12 (59,57%) среди других изученных параметров. На неоднородность популяции также указывали значения асимметрии и эксцесса, выходящие за пределы, установленные законом нормального распределения. Объективность линейных параметров миоцитов, которые были изучены на препаратах изолированных ГМК, и отсутствие значимой корреляционной связи между объемом цитоплазмы миоцитов и другими изучаемыми характеристиками, позволяет использовать объем клетки в качестве основного классифицирующего признака для оценки популяции. Анализ гистограмм распределения, характеризующих показатели объема миоцитов, показал, что в составе ГМТ грудного протока имеется три субпопуляции клеток (малые, средние и большие). Все выделенные группы имеют показатели коэффициента вариации, асимметрии и эксцесса, значения которых соответствуют параметрам нормального распределения. Ошибка репрезентативности в каждом случае не превышает 5%, что свидетельствует о представительности выборок. Доминирующей субпопуляцией в гладкой мускулатуре стенки грудного протока являются средние миоциты (70,33%). Исследование ДНК в ядрах гладких миоцитов целесообразно, в первую очередь, с целью выяснения механизмов физиологической регенерации гладкой мышечной ткани грудного протока. Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что основная масса миоцитов стенки грудного протока представлена диплоидными клетками (91,83%). Анализ распределения ГМК с учетом класса плоидности ядер показал, что наибольший процент гипердиплоидных миоцитов наблюдается в группе малых клеток (21,43%), а все большие ГМК относятся к диплоидному классу. В соответствии с функциональными особенностями перемещения лимфы в условиях воздействия интра- и внеорганных факторов влияния на лимфоток, нами зафиксированы изменения структурно-метаболических параметров ГМТ различных отделов грудного протока. Анализ основных морфометрических параметров ГМК интактной гладкой мышечной ткани грудного протока у лабораторных животных показал, что среднее значение объемов ГМК снижается от 2055,974±89,036 мкм3 в брюшной части до 1656,113101,564 мкм3 в лимфангионах шейной части (р=0,003). Уменьшение среднего объема ГМК сопровождалось изменениями в структуре популяции, которые проявлялись в последовательном увеличении доли малых ГМК от 12,00% в брюшной части до 26,00% в шейной части грудного протока крысы, и уменьшении доли больших клеток с 16,00% до 8,67% соответственно. Параллельно с уменьшением объемов ГМК повышалось содержание гипердиплоидных клеток с 5,33% в брюшной части до 10,67% в шейной части грудного протока и отмечалось последовательное уменьшение показателя оптической плотности суммарного белка цитоплазмы от 0,468±0,005 отн.ед. в брюшной части до 0,448±0,003 отн.ед. в шейной части грудного протока (р=0,001). Таким образом, популяция ГМТ грудного протока лабораторных животных имеет общий принцип структурно-функциональной организации. Выделение трех типов миоцитов, тесно интегрированных в ГМТ грудного протока, 13 различающихся по морфометрическим параметрам и уровню пролиферативного статуса, позволяет сформулировать принципиально новый подход к исследованию особенностей функционирования гладкой мускулатуры в составе лимфатического коллектора. Очевидно, локальные различия моторной функции межклапанных сегментов различных отделов грудного протока крысы в сочетании с влиянием экстравазальных факторов приводят к адаптивной перестройке ГМТ, которая проявляется изменениями характера синтеза ДНК и экспрессии общих белков в цитоплазме ГМК. Механизм тканевой адаптации гладкой мускулатуры реализуется изменением структуры популяции ГМТ различных отделов грудного протока крысы. Трансформация гладкой мышечной ткани грудного протока крысы при экспериментальной обструкции желчевыводящих путей Реактивная трансформация гладкой мышечной ткани грудного протока крысы изучали в динамике формирования экспериментальной механической желтухи. Исследовали брюшную часть, заднегрудной и переднегрудной отдел грудной части грудного лимфатического протока на 3, 5, 7, 10, 14-е сутки после перевязки общего желчного протока. Шейная часть грудного протока крысы вследствие сложной топографии и оперативного доступа при проведении эксперимента не изучалась (Петренко В.М., 2010). Анализ структуры популяции гладких миоцитов свидетельствует о том, что при развитии механической желтухи происходит изменение соотношения различных фенотипов ГМК по сравнению с контролем. Изучение среднего показателя объема миоцитов грудного протока крысы на начальных этапах эксперимента выявило его уменьшение. Выявленные изменения отражают структурную перестройку в популяции ГМК при развитии экспериментальной обструкции желчевыводящих путей. Это проявляется в значительном увеличении доли малых миоцитов на 5-е сутки эксперимента с параллельным уменьшением доли больших ГМК (рис.1). Структурная перестройка сопровождалась увеличением содержания гипердиплоидных миоцитов во всех исследуемых отделах грудного протока (рис.2). Эти результаты также подтверждаются при иммуногистохимическом исследовании. На ранних этапах эксперимента в составе гладкой мышечной ткани грудного протока выявлены иммунопозитивные клетки при постановке реакции на ядерный антиген пролиферирующих клеток PCNA (Santa Cruz, USA). При изучении тотальных препаратов нам также удалось зафиксировать статистически достоверное увеличение ГМК по сравнению с группой контроля (р<0,001). При этом увеличение ГМК касалось, главным образом, миоцитов пологоспиральной ориентации, которые в силу своего субэндотелиального расположения, могут подвергаться митогенному воздействию в результате повреждения эндотелия грудного протока (Гангсбургский А.Н., Павлов А.В., 1998; McNeil P.L. et al., 1987; Stenmark K.R., Mecham R.P., 1997). Мышца манжетки лимфангионов грудного протока действует в условиях более высокого эндолимфатического давления (Кашаева М.Д. с соавт., 2005; Кадырбаев Р.В., 2006). Устойчивое повышение эндолимфатического давления приводит к более значительному, чем 14 в норме, растяжению ГМК лимфангионов (в основном ориентированных по крутой спирали) и более выраженной деполяризации их мембран. Возрастают частота и сила сокращений лимфангионов, что постепенно вызывает гипертрофию мышечного слоя в межклапанных сегментах (Поташов Л.В. с соавт., 1999). 16,00% 12,00% 72,00% контроль 6,67% 15,24% 5,88% 6,09% 19,61% 74,51% 74,78% 3 сутки эксперимента 5 сутки эксперимента 17,76% 11,64% 19,13% 8,65% 7 сутки эксперимента 7 сутки эксперимента Брюшная часть 10 сутки эксперимента 14 сутки эксперимента Заднегрудной отдел 4,00% 23,33% 6,25% 27,00% контроль 24,04% 68,27% 7 сутки эксперимента 3 сутки эксперимента 35,64% 31,25% 62,50% 69,00% 68,67% 7,69% 60,34% 62,38% 14 сутки эксперимента 8,00% 36,21% 73,08% 73,83% 10 сутки эксперимента 3,45% 33,66% 35,11% 59,57% 78,10% 5 сутки эксперимента 3,96% 18,27% 21,05% 72,81% 3 сутки эксперимента контроль 6,14% 17,82% 75,25% 74,66% 5,32% 8,41% 6,93% 13,70% 5 сутки эксперимента 7,00% 14,85% 41,00% 49,50% 10 сутки эксперимента 52,00% 14 сутки эксперимента Переднегрудной отдел Pис.1. Структура популяции ГМК мышечной манжетки лимфангионов различных отделов грудного протока крысы в норме и на разных сроках эксперимента. Примечание: -малые ГМК; - средние ГМК; - большие ГМК. Как известно, рост и гипертрофия ткани сопровождаются изменением ядерно-цитоплазматического отношения (ЯЦО) в клетках этой ткани (Хесин Я.Е., 1967; Алов И.А.,1972). Достоверное увеличение ЯЦО (р<0,05) удалось зафиксировать в гладких миоцитах стенки лимфангионов крысы на 5 сутки эксперимента, что свидетельствовало об увеличении функциональной нагрузки на стенку лимфангиона, в результате возрастания эндолимфатического давления. Подобные выраженные увеличения значений ЯЦО были выявлены на 3 сутки в результате возрастания тангенциальной нагрузки на заднюю полую вену крысы (Кауфман О.Я., 1979). Изучение среднего показателя оптической плотности цитоплазмы ГМК, отражающего содержание суммарного клеточного белка, в динамике эксперимента выявило увеличение содержания протеинов (р<0,05) в ГМК всех исследуемых отделов грудного протока на ранних этапах опыта по сравнению с 15 интактным лимфатическим коллектором. Уровень содержания цитоплазматических белков, вероятно, отражает характер перестройки внутриклеточных обменных процессов в разных классах миоцитов в ответ на патологические стимулы (Зашихин А.Л., Селин Я., 2001; Stenmark K.R., McHam R.P., 1997). Повышение в популяции доли клеток с высоким уровнем белков может быть обусловлено трансформацией ГМК в синтетический тип. При этом пиковое увеличение содержания белка в миоцитах совпадало с аналогичным усилением синтеза ДНК. Эти процессы можно рассматривать как проявление срочного этапа адаптационной реакции, направленной на компенсацию нарушенной функции гладкой мышечной ткани грудного протока. 5,33% 94,67% контроль 6,67% 93,33% 7 сутки эксперимента 10,78% 7,53% 13,91% 86,09% 89,22% 3 сутки эксперимента 5 сутки эксперимента 2,80% 4,26% 97,20% 95,74% 10 сутки эксперимента 14 сутки эксперимента 16,83% 17,54% 82,46% 83,17% 92,47% контроль 3 сутки эксперимента 5 сутки эксперимента 2,97% 3,45% 97,03% 96,55% 10 сутки эксперимента 14 сутки эксперимента 4,81% 95,19% 7 сутки эксперимента Брюшная часть Заднегрудной отдел 8,67% 16,67% 21,00% 79,00% 91,33% контроль 9,62% 90,38% 7 сутки эксперимента 83,33% 3 сутки эксперимента 5 сутки эксперимента 1,98% 2,00% 98,02% 98,00% 10 сутки эксперимента 14 сутки эксперимента Переднегрудной отдел Рис. 2. Структура плоидности гладких мышечных клеток различных отделов грудного протока крыс в динамике эксперимента. Примечание: - диплоидные клетки, - гипердиплоидные клетки Таким образом, начальный этап механической обструкции желчевыводящих путей характеризуется мобилизацией адаптационных возможностей ГМТ грудного протока крысы. Повышение эндолимфатического давления на стенку сосуда действует как фактор повышенной функциональной нагрузки, и активизирует синтез ДНК и пролиферацию миоцитов, приводит к увеличению доли малых ГМК в структуре популяции. 16 Длительное течение патологического процесса проявляется резким снижением адаптационных возможностей ГМТ грудного протока. С десятого дня эксперимента в структуре популяции ГМТ отмечено уменьшение представительства малых и средних клеток, увеличение доли больших ГМК (рис.1). Изменение структуры популяции ГМТ сопровождалось увеличением объемов ГМК (р<0,01). Цитоспектрофотометрический анализ свидетельствовал об угнетении пролиферативной активности миоцитов. Количество гипердиплоидных клеток по сравнению с контролем снизилось во всех исследуемых отделах грудного протока крысы (рис.2). Подсчет миоцитов на тотальных препаратах позволил выявить снижение количества ГМК мышечной манжетки лимфангионов (р<0,01). При этом изменение миоархитектоники проявлялось в перестройке организации ГМК ориентированных по крутой спирали. Миоциты были представлены отдельными клетками, либо кластерами хаотичной направленности. Уменьшение количества кластеров миоцитов крутоспиральной ориентации и их замена на отдельные клетки хаотичной направленности может свидетельствовать о снижении фазной сократительной активности лимфангионов и затруднении процессов активного транспорта лимфы (Поташов Л.В. с соавт., 1999). По данным электронной микроскопии на поздних этапах эксперимента часть гладких миоцитов подвергалась апоптотическим процессам. В клетках наблюдались резкое расширение каналов эндоплазматической сети, наличие многочисленных вакуолей, фрагментация ядер с расширением перинуклеарного пространства. Эти результаты также подтверждаются при иммуногистохимическом исследовании. На поздних этапах эксперимента в составе гладкой мышечной ткани грудного протока крысы выявлены иммунопозитивные клетки при постановке реакции на TNF-R1 (Santa Crus, USA) маркер апоптотически измененных клеток. Таким образом, анализ структурно-метаболических параметров ГМК лимфангионов грудного протока в условиях длительного протекания механической желтухи показывает, что продолжительное течение патологического процесса сопровождается резко выраженными нарушениями миоархитектоники лимфангионов грудного протока крысы, уменьшением количества средних и малых клеток, увеличением доли больших ГМК, как терминального звена миобластического дифферона, снижением количества ДНК-синтезирующих миоцитов. ВЫВОДЫ 1. Грудной проток крысы представляет собой полилимфангионную систему, состоящую из 10-12 камерных микронасосов. Функциональная организация мышечной манжетки и клапанного участка лимфангионов определяется соотношением и ориентацией гладких миоцитов, геометрией укладки коллагеновых и эластических волокон. Кластеры лейомиоцитов мышечных манжеток отличает двуслойная меняющаяся конфигурация и ориентация по пологой и крутой спирали. Внутренняя эластическая мембрана имеет дискретную диспозицию. 17 2. Функциональная подвижность лимфангионов грудного протока крысы реализуется в межклеточных взаимодействиях гладких миоцитов мышечной манжетки и относительно небольшого количества нервных окончаний. Система мио-миоцитарных контактов представлена простыми и коммуникационными соединениями. Триггерный механизм запуска контрактации лимфангионов может осуществляться с помощью обнаруженных клеток с морфологическими характеристиками пейсмейкеров. 3. Цитофизиологические особенности функционирования гладкой мышечной ткани в составе стенки грудного протока крысы в значительной мере определяются структурно-метаболическими параметрами гладкомышечных клеток. ГМТ лимфангионов инкорпорированная в составе мышечных манжеток имеет единый принцип структурной организации, который реализуется в интегративном взаимодействии в составе популяции малых, средних и больших гладких миоцитов. 4. Морфофункциональные проявления адаптивной перестройки гладкой мышечной ткани стенки грудного протока крысы, которые выражаются различной формой сокращения лимфангионов, обусловлены влиянием экстраорганных факторов лимфотока. Поочередные в противофазе или координированные сокращения нескольких межклапанных сегментов определяют протекание процессов физиологической регенерации, структуру популяции и метаболические характеристики лейомиоцитов. 5. Начальный этап реактивных изменений стенки лимфангионов грудного протока крысы в состоянии стрессорного экспериментального воздействия свидетельствует о мобилизации адаптационных возможностей гладкой мышечной ткани. Рост пролиферативного пула миоцитов и появление признаков рабочей гипертрофии ткани, выражающееся в увеличении количества ГМК и росте ядерно-цитоплазменных отношений, свидетельствует об усилении насосной функции лимфангионов в условиях больших объемов перекачивающейся лимфы. 6. Длительное течение патологического процесса характеризуется снижением адаптационных возможностей ГМТ грудного протока крысы. Уменьшение количества ГМК в стенке межклапанных сегментов, сочетающееся с нарушением системы межклеточных взаимодействий и трансформацией структуры популяции, замена кластеров миоцитов крутоспиральной ориентации на отдельные клетки хаотичной направленности, свидетельствует об утрате фазной сократительной активности лимфангионов и сопровождается ухудшением транспортной функции полилимфангионной системы грудного протока. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Полученные данные о структурно-метаболических характеристиках гладких миоцитов грудного протока рекомендуется использовать в качестве базовых при проведении экспериментов и в научно-практической работе широкого круга специалистов, занимающихся фундаментальными и прикладными проблемами гистофизиологии лимфатических сосудов. 18 2. Полученные результаты исследования о физиолого-структурной организации ГМТ грудного протока концептуально развивают теоретические представления о сбалансированности влияния активных и пассивных факторов лимфотока на перемещение лимфы и целесообразны для воплощения в теорию конструкции лимфангиона. 3. Значительный фактический материал, характеризующий вовлеченность лимфатической системы в патологические процессы при билиарной окклюзии желчевыводящих путей, рекомендуется учитывать при разработке оптимальных сроков проведения лимфодренирующих вмешательств и изучения возможностей для управления транспортной функцией грудного протока. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Корепанова Ю.Б., Болдуев В.А. Некоторые особенности организации гладкой мышечной ткани лимфангионов грудного протока крысы // Бюл. Сев. гос. мед. ун-та. 2009. № 1. С. 179. 2. Корепанова Ю.Б., Болдуев В.А. Организация гладкой мышечной ткани лимфангионов грудного протока крысы (структурно-метаболический анализ) // Бюл. Сев. гос. мед. ун-та. 2009. № 2. С.67-68. 3. Корепанова Ю.Б., Дубовиченко Д.М. Механизмы реактивности гладкой мышечной ткани грудного прока крысы при моделировании механической желтухи // Бюл. Сев. гос. мед. ун-та. 2010. № 1. С.171-172. 4. Реактивная трансформация гладких миоцитов грудного протока крысы в условиях моделирования механической желтухи / Ю.Б. Корепанова, В.А. Болдуев, В.В. Столяров, Л.А. Басова, А.Ф. Усынин // Фундаментальные и клинические аспекты охраны здоровья человека на Севере: материалы междунар. науч.-практ. конф. Сургут, 2010. С. 34-35. 5. Корепанова Ю.Б., Болдуев В.А., Столяров В.В. Структурно-функциональная организация гладкой мышечной ткани грудного протока крысы // Фундаментальные и клинические аспекты охраны здоровья человека на Севере: материалы междунар. науч.-практ. конф. Сургут, 2010. С. 36-39. 6. Корепанова Ю.Б., Болдуев В.А. Особенности структурной организации гладкой мышечной ткани лимфангионов грудного протока крысы // Морфология. 2010. Т.137, № 4. С.98. 7. Морфофункциональная организация гладкой мышечной ткани лимфангионов грудного протока крысы / Ю.Б. Корепанова, В.А. Болдуев, А.Л. Зашихин, Ю.В. Агафонов // Экология человека. 2010. № 8. С. 32-34. 8. Корепанова Ю.Б., Болдуев В.А. Гладкая мышечная ткань лимфангионов грудного протока крысы в норме и при экспериментальной механической желтухе // Морфология. 2011. Т.140, №5. С.93-94. 9. Дубовиченко Д.М., Корепанова Ю.Б. Структурно-функциональная организация гладкомышечного компонента лимфангионов грудного протока крысы // Бюл. Сев. гос. мед. ун-та. 2010. № 1. С. 169-170. 19 10. Дубовиченко Д.М., Корепанова Ю.Б. К вопросу о функции эндотелия лимфатических сосудов // Бюл. Сев. гос. мед. ун-та. 2011. № 1. С. 315-316. 11. К вопросу о факторах, определяющих лимфоток в грудном протоке крысы / Ю.Б. Корепанова, В.А. Болдуев, А.Л. Зашихин, В.В. Столяров // Экология человека. 2012. № 5. С. 58-60. 12. Морфофункциональная организация гладкой мышечной ткани лимфангионов грудного протока крысы в норме и в условиях моделирования механической желтухи / Ю.Б. Корепанова, В.А. Болдуев, А.Л. Зашихин, В.В. Столяров, А.Ф. Усынин, Д.В. Тягунов // Сибирский медицинский журнал. 2012. Т.27, № 2. С.141-145. Подписано в печать 25.10.2012 г. Бумага офсетная. Печать ризография. Уч. -изд.л. 1,0. Заказ № 5146, тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Типография Пресс-Принт» г. Архангельск, ул. Гагарина, 42, оф. 507 Тел./факс: 212-210, 212-616
