Клеточная нанобиотехнология Показатель Женщин ы Мужчин ы Концентрация гемоглобина (Hb), г/л крови 120-160 140-180 Гематокрит (фракция) 0,37-0,47 0,40-0,54 Число эритроцитов, 1012/л крови = 106/мкл крови 4,2-5,4 4,6-5,9 Средняя концентрация Hb в эритроцитах, г/л эритроцитов 320-360 Средняя Hb-масса одного эритроцита, пг=10-12г 27-32 Средний объем 1 эритроцита (MCV), фл=10-15л 80-100 Доля ретикулоцитов, % 0,5-2 Membrane proteins Regulation of RBC volume, shape and pH Na+/H+-exchanger; Na+/K+/Cl--co-transporter Ca2+-ATPase HCO-3/Cl--exchanger Na+ Na+ K+ Cl- Plasma membrane Erythrocyte pathology as a cellular level of hypoxia Lipids: membrane fluidity RBC deformation provides their orientation to the streamlines in veins and arteries RBC flowing in an arteriole. Picture from: SchmidSchönbein, H., et al., 1980 RBC deformation provides their squeezing through capillaries RBC in a capillary H+ ATP ClCa2+ HCO3- : Hemoglobin Alterations of Hb conformation and its affinity to O2 Genetic modifications Effect of external modulators (2,3-DPG, nitric oxide NO, pH) Что является причиной клеточной гипоксии в норме и при патологии? • • Нарушения гемодинамики: Дисфункция сердца Изменения сосудов Клеточная патология – • • • • нарушения переносаr O2 эритроцитами: Снижение проницаемости плазматической мембраны эритроцита для O2 Изменение сродства гемоглобина к O2 Изменение проницаемости плазматической мембраны эритроцита для ионов натрия, калия, кальция и протонов Изменение активности антиокислительной системы Цель оценка состояния эритроцитов при различных сердечнососудистых заболеваниях и гипоксии Основные направления исследования: • оценка вязкости плазматической мембраны эритроцита; • оценка способности гемоглобина связывать и отдавать O2 • оценка содержания комплексов гемоглобина (Hb) с оксидом азота (N0) • оценка проницаемости плазматической мембраны эритроцита для ионов Ca, K, and H • оценка изменений формы и объема эритроцитов • оценка антиокислительного статуса крови Исследуемые группы • больные ишемической болезнью сердца • больные гипертонией • больные с недостаточностью кровообращения • доноры в условиях высокогорной гипоксии •космонавты Методы исследования • Метод электронного парамагнитного резонанса(ЭПР): для оценки вязкости плазматической мембраны с помощью зондов (5-doxylstearinic (5-DS) and 16doxylstearinic acids (16-DS)) • Спектроскопия комбинационного рассеяния (КР): для регистрации изменений конфирмации порфирина и содержания комплексов гемоглобина (d-Hb, ox-Hb и HbNO) Электронная и интерференционная микроскопия: исследование объема и формы эритроцита Селективная потенциометрия: регистрация изменений содержания ионов K, Ca и pH Спектральные биохимические методы регистрации активности супеорокиддисмутазы, гемоксидазы, каталазы, уровня церулоплазмина и тиолов • • • Вязкость мембраны эритроцита при различной сердечнососудистой патологии A ** сердечно-сосудистая патология увеличивает вязкость плазматической мембраны эритроцита (O.V. Rodnenkov, et.al. International Journal Pathophysiology,v.11./4,2005) B Зависимость между вязкостью мембраны эритроцита и содержанием холестерина в плазме крови человека при ИБС и гипертонии 9 8 Chol (mmol/l) 7 6 5 Spearman rank 0.55 p<0.01 4 Контроль 3 0.650 0.666 0.657 * 0.688 0.680 0.710 0.700 S ИБС ЭГ 0.730 0.718 Увеличение содержания холестерина сопровождается увеличением вязкости мембраны в областях близких к ее поверхности Вязкость мембраны эритроцита людей , проживающих в условиях высокогорья A B Гипоксия высокогорья сопровождается увеличением вязкости мембраны в областях близких к ее поверхности (O.V. Rodnenkov, et.al. International Journal Pathophysiology,v.11./4,2005) Состояние вязкости мембраны эритроцита человека при длительном космическом полете C. Correlation between cholesterol amount in blood plasma and fluidity of erythrocyte plasma membrane in the surface regions. Spearman A. Fluidity of erythrocyte plasma membrane in the surface regions is decreased after SF. Cholesterol in blood plasma, mM *p<0.05 A B, D. The relative content of cholesterol and sphingomyelin in plasma membrane of erythrocytes is increased after SF. ** p<0.01 B 9 C rank 0.55 p< 0.01 8 7 6 5 4 3 0.65 0.66 0.67 0.68 0.69 S D 0.70 0.71 0.72 0.73 Изменения активности Na+ /H+- обмена (1), Ca2+ -ATPазы (2) и Ca2+ зависимых K+ каналов (3) при первичной (EH) гипертонии, вторичной гипертонии (SH) и ИБС 300 250 control EH SH ischemia 200 150 100 50 0 1 2 3 Гипертония и ИБС увеличивает активность Na+/H+обмена и проницаемости Ca2+зависимых K+ -каналов и снижает активность Ca2+ -ATPазы (Maksimova et.el.,Cardiology,vol.5pp.45-45, 1999) Зависимость между активностью Na+/H+-обмена, Са2+-ATФазы эритроцитов и содержанием холестерина в плазме крови больных 8.0 7.5 Spearman rank p<0.001 0.85 6.5 6.0 8.0 5.5 7.5 Spearman rank p<0.001 -0.78 7.0 5.0 4.5 180.8 248.8 224.4 282.8 268.8 314.2 294.8 µM H+/ l cells min увеличение холестерина в плазме при ИБС сопровождается активацией Na+/H+-обмена и инактивацией Са2+ - ATФазы Chol (mmol/l) Chol (mmol/l) 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 105 110 115 120 125 130 2+ 135 µM Ca / l cells min 140 145 150 155 Воздействие длительного космического полета на транспорт ионов и морфологию эритроцитов человека Activity of Na+/H+-exchanger (A) and Kca-channel (B) is increased after SF. ** p<0.01. E. Correlations between cholesterol content and activity of Na+/H+exchanger. 8.0 Spearman rank E 0.85, p<0.05 A Cholesterol, mM 7.5 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 160 B C 7.0 180 200 220 240 260 280 M H (l cells) min + D -1 300 -1 Amount of discocytes (C) is decreased and amount of echinocytes is increased (D) after SF. Grey bars – before SF, blue bars – after SF. # p<0.02 320 Строение гемоглобина В состав гемоглобина входит: 1. ГЛОБИН - 2 пары полипептидных цепей (α, β, γ, δ) Строение гемоглобина В состав гемоглобина входит: 2. ГЕМ - комплекс железа c протопорфирином Спектроскопия комбинационного рассеяния: исследование изменений конформации гемопорфирина гемоглобина I O2 Hb A B Fe2+ III II NO IV V VI I1355/I1564 – свидетельствует о способности d-Hb связывать O2 и NO; I1375/I1580 – свидетельствует о способности ox-Hb отдавать O2 A: Гемопорфирин гемоглобина и лиганды: O2 and NO. B: Спектр комбинационного рассеяния гемопорфирина в крови Полосы I, III (1355 and1564 sm-1) соответствуют связям d-Hb; Полосы II, IV (1375 and 1580 sm-1) – ox-Hb; Полосы V, VI (1626 and 1668 sm-1) соответствуют комплексам Hb-NO Спектроскопия комбинационного рассеяния: исследование содержания комплексов «гемопорфиринлиганд» I Содержание комплекса ox-Hb определяют по соотношению полос I1375/I1355 Комплекс с оксидом азота без нарушения связи между белком и гемопорфирином (I1626/I1580) Комплексы гемоглобина с O2 и NO: 1 – глобин, 2 – порфириновый макроцикл, 3-7 – связи между атомом Fe и глобином, порфирин, O2 и NO в комплексах I и II Комплекс Hb с оксидом азота при разрушении связи между белком и гемопорфирином, регулирует способность Hb отдаватьO2 (I1668/I1580 ) Effect of NO on Hb depends on pO2 in blood Hb-NO (I) Hb-NO (II) Facilitation of O2 release from Hb Изменения содержания комплексов гемоглобина при сердечно-сосудистой патологии При ИБС, гипертонии и недостаточности кровообращения уменьшается содержание комплексов Hb-NO (II), что снижает сброс O2 (O.V. Rodnenkov, et. al. International Journal Pathophysiology,v.11./4,2005) Изменения содержания комплексов гемоглобина эритроцитов людей, проживающих в условиях высокогорья Адаптация, приводящая к насыщению Hb O2 и стимуляции сброса O2 Горная гипоксия увеличивает содержание комплексов ox-Hb и Hb-NO (II), что усиливает обмен O2 . (O.V. Rodnenkov, et.al. International Journal Pathophysiology,v.11./4,2005) Воздействие длительного космического полета на свойства гемоглобина эритроцитов человека A. Amount of Hb-O2 is decreased after SF. Colors indicate results for astronauts from three different ISS. A C. Total amount of Hb is decreased after SF. ** p<0.01 C ** ** ** B. Affinity of Hb to O2 is increased after SF. Colors indicate results for astronauts from three different ISS. B Decreased amount of O2 in tissues Worsening of O2 release from erythrocytes in tissue capillaries Tissue hypoxia Изменения конформации гемопорфирина, рО2 и SATO2 больных ИБС при интервальной гипоксической тренировки 0 - контрольный период; 1 - после 10 процедур ИГТ; 3 - после 20 процедур; 4 - через 30 дней после курса ИГТ. • Интервальная гипоксия меняет связывание и снижает содержание O2 в крови пациента . Антиоксидантная система плазмы крови НОН О2 Доноры электронов е- ОО-* О2 ОО-* Fe3+ Каталаза Супероксиддисмутаза Fe2+ Хелаторы НООН Fe3+ НО* Инициация ПОЛ Антиоксиданты могут предотвращать цепное окисление липидов, реагируя с водорастворимыми радикалами или их предшественниками; мы назовем их антиоксидантами водной фазы (АВФ). Супероксиддисмутаза, каталаза и хелаторы ионов железа, а также карнозин относятся к классу АВФ. Супероксиддисмутаза Супероксиддисмутаза(СОД) - единственный известный в настоящее время фермент, субстратом которого являются свободные радикалы. Она катализирует следующую реакцию: O2*- + 2H+ O2 + H2O2 Фермент, обнаруженный МакКордом и Фридовичем имеет молекулярную массу 32 кД и состоит из двух субъединиц, каждая из которых содержит по одному атому Сu и одному атому Zn: Сu2+ Сu2+ Zn2+ Zn2+ Дисмутация О2*- супероксиддисмутазой Реакция катализируемая СОД состоит из двух стадий и заключается в переносе электрона с одного супероксидного радикала на другой. Промежуточным акцептором этого электрона служит атом меди, входящий в активный центр СОД: 1. СОД-Сu2+ + O2*2. СОД-Сu+ + O2 + 2H+ СОД-Сu+ + O2 СОД-Сu2+ + Н2О2 Zn2+ не учавствует в каталитическом цикле, хотя и входит в активный центр. Ионы металлов защищают молекулу СОД от воздействий различных протеаз. Деактивация перекиси водорода Перекись водорода (Н2О2) - основной источник самых токсичных радикалов в живых системах - НО* радикалов. Следовательно, снижение уровня Н2О2 приведет к снижению концентрации НО* радикалов. Удаление Н2О2 осуществляют два класса ферментов: каталаза 2Н2О2 каталаза пероксидазы Н2О2 + АН2 2Н2О + О2 пероксидаза 2Н2О + А Антиоксидантный статус крови у больных с ишемической болезнью сердца (ИБС) 150 ** % от нормы 125 100 ** * 75 50 25 0 ЦП СОД Норма НБТ Каталаза ИБС Супероксиддисмутаза и церулоплазмин ответственны как за утилизацию супероксид анион-радикала,так и регулируют содержание металлов переменной валентности (меди и железа), каталаза и небелковые тиолы принимают участие в утилизации перекиси водорода Продукты окисления липидов в плазме крови больных с ишемической болезнью сердца (ИБС) и нарушением кровообращения (НК) 250 * * 200 % от нормы ** * 150 100 50 0 ГП ТБК-АП Норма ИБС НК Уровни ТБК-активных продуктов и гидроперекисей липидов являются маркерами наличия окислительного стресса. Акцепторы радикалов В качестве системы защиты организма от повреждающего действия радикалов кислорода могут выступать низкомолекулярные вещества, имеющие высокую константу скорости взаимодействия с этими радикалами: •Аскорбиновая кислота (витамин С) •Сульфгидрильные соединения (глутатион, цистеин) •Одно- и многоатомные спирты (этанол, рибоза, глюкоза) •Мочевая кислота •a -токоферол Хелаторы ионов металлов Основной механизм образования НО* радикалов - это восстановление Н2О2 ионами Fe2+. Поэтому связывание железа комплексообразователями должно привести к снижению концентрации этих радикалов. Среди таких соединений наиболее известны: •ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) •Десферал •Карнозин “Заиливание” крови ОТДЕЛЬНЫЕ ЭРИТРОЦИТЫ АГРЕГАЦИЯ "BLOOD SLUDGE“ = “заиливание крови” феномен Агрегация эритроцитов в потоке Кожа человека. P.-I.Branemark. Rheological aspects of low flow states (1968). Microcirculation as Related to Shock. D.Shepro and G.P.Fulton, eds., Academic Press, Inc., New York. Типичные формы эритроцита e h y n o c y t e discocyte spherocyte s t o m a t o c y t e Исследование структуры цитоплазмы эритроцита с помощью интерференционной микроскопии Оптическое изображение, интерференционное изображение, фазовый профиль дискоцита (A) и сфероцита (B) A B 5 mkm 5 mkm дискоцит стоматоцит ∆H, µm Интерферометрия эритроцита при ИБС µm Фазовый профиль 20 µm Фазовое изображение 20 µm 3D-изображение Реальное оптическое изображение Различные формы эритроцита при ИБС дискоцит стоматоцит эхиноцит Оптическое изображение Фазовое изображение Erythrocyte shape Control, % CHD, % Discocyte 91 78 Echinocyte 6 9 Stomatocyte 3 13 При ИБС обнаружено снижение числа дискоцитов и увеличение стоматоцитов и эхиноцитов Распределение цитоплазмы в эритроците в норме (А) и при недостаточности кровообращения (Б) А Б Гистограмма распределения высоты, площади и объема эритроцитов при ИБС control CHD Дополнительные пики на гистограмме соответствуют увеличению уровня агрегации клеток mean height, µm Увеличение площади эритроцита area, µm2 volume, µm3 Возможные механизмы регуляции состояния эритроцита Ca2+ Na+ o- + E m Hb ? + в од а Cl- Клеточные механизмы гипоксии Выводы • Гипоксия при сердечно-сосудистой патологии сопровождается увеличением вязкости плазматической мембраны, активности Na+/H+- обмена, Ca2+ зависимых K+ -каналов, а также снижением активности Ca 2+-ATPазы и числа комплексов Hb-NO, регулирующих сброс O2 • Гипоксия в условия высокогорья сопровождается увеличением вязкости плазматической мембраны и увеличением числа комплексов Hb-NO, регулирующих сброс O2 Нейродегенерация и модели экспериментального исследования патологических процессов в нейрональных клетках Модели нейродегенерации: •Глутаматная эксайтотоксичность •Окислительный стресс •Депривация трофических факторов •Аксотомия и микротравмы Механизмы аксональной дегенерации Волны кальция могут проводить сигнал к ядру нейрона, приводящий к изменению экспрессии генов Объект исследования Органотипичная культура спинномозговых ганглиев эмбрионов курицы, желатиновая подложка Нейроны диссоциированной культуры спинномозговых ганглиев эмбрионов курицы, полиорнитин –ламининовая подложка Локальная аппликация глутамата к соме вызывает ретракцию нейритов. Со временем длина отростка восстанавливается Распространение медленной кальциевой волны в нейрите Структура миелинового нервного волокна перехват Ранвье межперехватный сегмент миелин Миелин содержит до 200 мембранных слоев Шванновская клетка аксон насечка Шмидта-Лантермана сома Шванновской клетки паранодальные петли микровилли миелин аксон межперехватный сегмент перехват Ранвье Визуализация нервного волокна. Флуоресцентная микроскопия. (а) М (б) А нШ-Л 10 мкм нШ-Л 10 мкм Рис. 1 Миелиновые нервные волокна. (а) - световая микроскопия, (б) – флуоресцентная микроскопия, нервные волокна окрашены ХТЦ. На рис.: А – аксон, М – миелин, нШ-Л – насечка Шмидта-Лантермана. Визуализация нервного волокна. Лазерная интерференционная микроскопия. ПР 210 210 180 180 150 120 90 60 2 30 3 (б) нШ-Л ПР (г) 0 5 10 210 150 120 90 60 20 25 30 (д) 35 150 120 90 3 60 1 4 0 0 15 2 180 30 30 1 0 240 ОРХ, нм нШ-Л Ш-Л 240 ОРХ, нм ПР ОРХ, нм 240 (a) 270 270 270 0 5 10 15 20 25 30 35 -5 (е) 5 10 15 20 25 30 35 Скан-линия, мкм Скагн-линия, мкм Скан-линия, мкм 0 вдоль нервного волокна 300 ОРХ, нм насечка 250 4 1 (в) ПР 200 150 10 мкм 2 3 100 (ж) 50 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Скан-линия, мкм Рис. 15. Характерное изображение миелинового нервного волокна. Световое изображение (а), 3D- и 2D-фазовое изображение (б и в, соответственно). На в: 1 - скан-линия, проведенная через перехват Ранвье (1), насечку ШмидтаЛантермана (2), межперехватный сегмент (3) и вдоль нервного волокна (4). Профиль ОРХ вдоль скан-линии 1, 2, 3 и 4 (г, д, е, ж, соответственно). Таблица 1а. Параметры миелинового нервного волокна, определенные методом ЛИМ Parameter ПР Интернодаль нШ-Л (n=12) (n=12) (n=9) Диаметр нервного волокна, мкм 6±0,6 9±0,4 9±0,5 Диаметр аксона, мкм 4±0,5 7±0,3 6±0,7 ОРХ структуры, окружающей аксон, нм 47±6 (микровилли) 166±9 (миелин) 181±16 (миелин) ОРХ аксона под миелином (и/или ШК), нм 12±2 113±14 82±14 Данные представлены в виде “среднее ± стандартная ошибка среднего” Визуализация нервного волокна. КР-микроскопия. в) б) г) 1170 а) Интенсивность, отн. ед. 80 Ranvier node internode 2920 70 60 1350 50 1530 40 30 20 10 0 -10 д) 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 Частотный сдвиг, см -1 Распределение каротиноидов в миелиновом нервном волокне. а - Фотография миелиновых нервных волокон. Белым квадратом выделена область (б) 38×38 мкм, в которой проводилась регистрация сигнала КР от молекул каротиноидов (в). 2D- и 3D- распределение интенсивности пика 1170 см-1, присущего молекулам каротиноидов, в миелиновом нервном волокне (в и г). Поле 38×38 мкм. д – спектр комбинационного рассеяния нерва в перехвате Ранвье (красный) и в межперехватном сегменте (черный). Отмечены пики: 1170 и 1530 см-1 – характерны для молекул каротиноидов, 2920 – характерен для молекул липидов, 1350 см-1 характерен для молекул воды. Изменение спектров КР миелинового нерва при изменении температуры 1350 nerve 24oC nerve 30oC nerve 35oC nerve 40oC 700 1530 1170 Интенсивность, отн. ед. 600 2920 1530 500 400 300 200 100 0 -100 0 1000 2000 3000 4000 5000 Частотный сдвиг, см-1 Интенсивность, отн. ед. 500 400 300 200 100 nerve 24oC nerve 30oC nerve 35oC nerve 40oC 2920 500 Интенсивность, отн. ед. nerve 24oC nerve 30oC nerve 35oC nerve 40oC 1530 1170 400 300 200 100 0 0 -100 600 800 1000 1200 1400 1600 Частотный сдвиг, см -1 1800 2000 2200 -100 2200 2400 2600 2800 3000 3200 Частотный сдвиг, см-1 3400 3600 Какие биофизические характеристики можно получить, визуализируя нервное волокно различными методами? Изменение упорядоченности ЖК-остатков при действии проназы проназа Е * 1,10 * 1,02 1,06 1,04 1,02 16-ДС, отн. ед. I1530/I1160 – пропорционально упорядоченности ЖКостатков ФЛ * 1,00 0,98 0,96 4 6 8 10 12 14 0,96 0 б Время, Время, мин мин 6 12 18 Время, мин Время, мин КР-спектроскопия I1270/I1300 – пропорционально колебаниям С-Н связей при двойных С=С связях ЖК-остатков 0,85 H H H H H в 0,80 * 0,75 0,70 0,0 1270/1300 I1445/I1300 – пропорционально отношению ножничных к крутильным колебаниям СН2 групп ЖК-остатков контроль 1445/1300 проназа 8,5 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 г * 8,0 0 Проназа 5 мин 2 0,98 Проназа 5 мин 0 -пропорционально упорядоченности ЖК-остатков ФЛ 1,00 Контроль 1,08 * I1445/I1300, отн. ед. 1,12 контроль 1,04 Контроль а 1,14 ЭПР-спектроскопия контроль проназа Е I1270/I1300, отн. ед. I1530/I1160, отн. ед. КР-спектроскопия 5 мин Исследование морфологии и структуры (распределения ОРХ) миелина и цитоплазмы при действии проназы нШ-Л ПР 200 нм нШ-Л нШ-Л 200 нм 200 нм ОРХ, нм контроль проназа Е, 10 мин проназа Е, 25 мин 0 г Диаметр МНВ в ПР в Диаметр МНВ в МПС 80 * * перехват Ранвье 100 120 ОРХ аксона ОРХ миелина диаметр аксона диаметр нервного волокна * длина перехвата Ранвье 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 ОРХ микровилли Длина ПР Диаметр аксона в МПС Значение параметра, отн. ед. Нервное волокно. Микроскопия в отраженном свете (вверху) и лазерная интерференционная микроскопия (внизу). ПР – перехват Ранвье, нШ-Л – насечка Шмидта-Лантермана, МПС – межперехватный сегмент (или интернодаль) ОРХ – оптическая разность хода лучей 60 Действие проназы Е на профиль ОРХ вдоль сканлинии, проведенной вдоль нервного волокна. ОРХ аксона а 40 Скан-линия, мкм диаметр нервного волокна б 20 * интернодаль Изменение параметров нервного волокна в перехвате Ранвье и межперехватном сегменте при действии проназы. Гипотеза Гидролиз пептидных связей каротиноид мембраносвязанный Са2+ Увеличение упорядоченности ЖК-остатков активированный фермент Изменение взаимодействия ацильных цепей липидов Изменение морфологии и внутренней структуры нерва Изменение амплитуды и скорости проведения ПД проназа Упорядоченность ЖК-остатков ФЛ 1,04 1,02 1,00 0,98 0,96 10 12 14 16 18 20 22 1.2 1.0 Количество мембраносвязанного Са2+ 1,1110 пХМБ пХМБ 105 1,05 1100 0,9595 0,990 0,8585 0,880 0,7575 -5 0 0 5 5 10 Время, мин 10 15 15 20 Время, мин ОРХ аксона 1.4 диаметр аксона Значение параметра, отн. ед. в 1.6 диаметр нервного волокна Время, Время,мин мин 1.8 115 1,15 б длина перехвата Ранвье 8 ОРХ микровилли 6 ОРХ аксона а 4 диаметр нервного волокна 2 ОРХ миелина I1524/I1151, отн. ед. 1,06 Интенивность флуоресценции ХТЦ, отн. ед. контроль пХМБ 1,08 Интенсивность флуоресценции ХТЦ, % Изменение упорядоченности ЖК-остатков (а), количества мембрано-связанного Са2+ (б) и структуры миелина при инкубации нерва с пХМБ 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 перехват Ранвье интернодаль Изменение параметров нервного волокна в перехвате Ранвье и межперехватном сегменте при действии пХМБ. Гипотеза каротиноид мембраносвязанный Са2+ пХМБ Блокирование SH-групп (препятствие образованию S-S мостиков) Уменьшение количества мембраносвязанного Ca2+ Упорядоченность ЖК-остатков не изменяется Нет изменений морфологии и внутренней структуры нерва Изменение амплитуды и скорости проведения ПД