ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО ПРОТОКОЛА СТИМУЛЯЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ В ПРОГРАММЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО

На правах рукописи
БЕРЕЗИКОВА
МАРИНА ВЛАДИМИРОВНА
ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО
ПРОТОКОЛА СТИМУЛЯЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ В
ПРОГРАММЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО
ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ
В ПОЛОСТЬ МАТКИ
14.01.01 – акушерство и гинекология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2011
Работа выполнена в отделении вспомогательных технологий в лечении
бесплодия Федерального государственного учреждения «Научный центр
акушерства,
гинекологии
и
перинатологии
имени
В.И.
Кулакова»
Минздравсоцразвития России
Научный руководитель:
доктор медицинских наук
Елена Анатольевна КАЛИНИНА
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
доктор медицинских наук, профессор
Татьяна Алексеевна Назаренко
Клара Георгиевна Серебренникова
Ведущая организация:
ГОУ ВПО Российский Университет Дружбы Народов
Защита состоится «_____» ____________2011г. в _______ч. на заседании
диссертационного совета при ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и
перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России по адресу:
117997, Москва, ул. Академика Опарина, д.4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр
акушерства,
гинекологии
и
перинатологии
им.
В.И.
Кулакова»
Минздравсоцразвития России.
Автореферат разослан «____» __________2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук
2
Елена Анатольевна КАЛИНИНА
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Частота бесплодных браков в России превышает 15%, что, по данным ВОЗ,
является критическим уровнем (Казанцева Т.А.,2007).
Успехи в области синтеза новых препаратов, колоссальные достижения
эмбриологии, а также значительные финансовые затраты на лечение синдрома
гиперстимуляции яичников (СГЯ) потребовали пересмотра протоколов стимуляции
функции яичников, тем более, что первый ребенок в мире с помощью ЭКО был
получен в естественном цикле Steptoe P.C. и Edvards R.G. в Великобритании.
В настоящее время актуальным является вопрос разработки
более
безопасных и приемлемых для пациента протоколов стимуляции яичников,
которые позволили бы при минимальном риске терапии увеличить вероятность
рождения живого здорового ребенка при одноплодной беременности (Verberg MF,
2009).
В 1996г. Edwards и соавт. первыми выразили озабоченность этой проблемой
и призвали к использованию более умеренных протоколов стимуляции.
Сейчас все большее число исследователей предпочитает модифицированные
протоколы стимуляции, в том числе и так называемые «мягкие» протоколы (Heijnen
ЕМ, 2007, Назаренко Т.А., 2008). Особое значение выбор оптимального протокола
стимуляции суперовуляции и стартовой дозы рекомбинантного ФСГ имеет у
пациенток с высоким риском развития СГЯ (Olivennes F.,2010, Sterrenburg
MD.,2011). Учитывая тенденции сегодняшнего дня, заключающиеся в снижении
медикаментозной нагрузки и осложнений, возникающих в процессе стимуляции
функции
яичников,
является
чрезвычайно
важным
проведение
анализа
эффективности и безопасности применения данных протоколов стимуляции.
Цикл терапии ЭКО при применении «мягкого» протокола стимуляции
суперовуляции начинается с 5 дня менструального цикла, когда уже произошел
выбор когорты антральных фолликулов. Этот подход позволяет использовать
эндогенный межциклический подъем уровня ФСГ вместо того, чтобы подавлять
его. Это, в свою очередь, приводит к уменьшению количества требуемых
3
препаратов и количества дней терапии (Verberg MF, 2008, Fauser BC, 2010), что
представляет особый интерес.
Благодаря
отсрочке
начала
стимуляции
яичников
до
середины
фолликулярной фазы, экзогенный ФСГ может стимулировать только наиболее
зрелые фолликулы к дальнейшему развитию до стадии Граафова пузырька,
благодаря чему могут развиваться ооциты наилучшего качества, и большая доля
эуплоидных эмбрионов после «мягкого» ЭКО по сравнению с традиционным
протоколом стимуляции суперовуляции (Baart EB, 2007).
В последние годы интерес исследователей сконцентрирован на поиске
прогностических критериев лечения бесплодия в программах ЭКО путем анализа
состава фолликулярной жидкости (ФЖ) каждого из аспирируемых фолликулов и
поиске корреляций между концентрацией содержащихся в ней цитокинов,
качеством полученных ооцитов, эмбрионов и частотой наступления беременности,
а
также
путем
определения
молекулярно
-
биологических
маркеров,
ассоциированных с исходом программ ВРТ.
Все вышеизложенное определило цель настоящего исследования:
оптимизация программы ЭКО и ПЭ у пациенток с высоким риском развития
синдрома гиперстимуляции яичников путем использования модифицированного
«мягкого» протокола стимуляции суперовуляции.
Задачи исследования
1.Оценить показатели овариального резерва у исследуемой группы пациенток
для выявления степени риска развития СГЯ.
2.Провести сравнительную характеристику модифицированного «мягкого» и
стандартного «короткого» протоколов стимуляции суперовуляции у пациенток с
высоким риском развития СГЯ по параметрам фолликуло-, стероидо- и
эмбриогенеза.
3.Определить профиль экспрессии мРНК генов иммунной системы в клетках
фолликулярной жидкости и в эндометрии для возможного прогнозирования исхода
программы ЭКО и ПЭ у данного контингента больных.
4
4.Сравнить частоту развития СГЯ при применении «мягкого» и стандартного
протоколов, оценить прогностическую роль СЭФР, рецепторов СЭФР-1 и -2 типа в
развитии данного осложнения.
5.Провести анализ эффективности программы ЭКО и ПЭ при применении
«мягкого»,
стандартного
протоколов
стимуляции
и
переноса
эмбрионов,
криоконсервированных в результате отмены переноса в связи с высоким риском
развития СГЯ.
алгоритм
6.Разработать
применения
модифицированного
«мягкого»
протокола стимуляции суперовуляции у пациенток с высоким риском развития
синдрома гиперстимуляции яичников.
Научная новизна
На основании проведенного исследования и углубленного изучения
параметров фолликулогенеза, оогенеза и эмбриогенеза представлена и научно
обоснована
целесообразность
применения
модифицированного
«мягкого»
протокола стимуляции суперовуляции у пациенток с высоким риском развития
СГЯ.
На основании полученных результатов выявлена прогностическая роль
иммунных факторов (HLA-G1 и HLA-G5) в фолликулярной жидкости и (TNF-α,
IL-18, IL-1β) в эндометрии в исходе программы ЭКО и ПЭ.
Определена
целесообразность
исследования
концентрации
сосудисто-
эндотелиального фактора роста и его рецепторов в качестве предикторов развития
синдрома гиперстимуляции яичников у пациенток с высоким риском развития
данного
осложнения
при
применении
«мягкого»
протокола
стимуляции
суперовуляции.
Впервые в данном исследовании определена эффективность лечения при
использовании модифицированного «мягкого» протокола в сравнении с переносом
криоконсервированных эмбрионов, полученных в результате отмены переноса при
применении стандартного протокола стимуляции суперовуляции в связи с высоким
риском развития СГЯ.
5
Практическая значимость
В результате проведенной работы разработан алгоритм применения модифицированной «мягкой» схемы стимуляции суперовуляции в программе ВРТ у
пациенток группы высокого риска по развитию СГЯ.
Определены роль и место модифицированного «мягкого» протокола
стимуляции в процессе восстановления фертильности при применении ВРТ, что
позволит повысить эффективность, безопасность и экономичность лечения
бесплодия методом ЭКО и ПЭ у данных пациенток.
Положения, выносимые на защиту:
1. Для индивидуального подбора оптимального протокола стимуляции, в том
числе, «мягкого», при проведении программы ЭКО и ПЭ у пациенток с высоким
риском развития синдрома гиперстимуляции яичников необходима комплексная
оценка показателей овариального резерва (антимюллеров гормон, объем яичников,
число антральных фолликулов при УЗИ, базальный уровень ФСГ).
2. Применение «мягкой» схемы стимуляции суперовуляции у пациенток с
высоким риском развития СГЯ характеризуется достоверным увеличением числа
зрелых ооцитов, эмбрионов «хорошего» качества, сокращением медикаментозной
нагрузки, длительности лечения, в сравнении со стандартным «коротким»
протоколом.
3. При проведении программы ЭКО и ПЭ у пациенток с высоким риском
развития СГЯ «мягкий» протокол стимуляции представляется оптимальным
выбором, так как при применении «мягкого» и стандартного протоколов
эффективность лечения достоверно не различается, а в сравнении с переносом
криоэмбрионов
отмечено
достоверное
повышение
частоты
наступления
беременности при достоверном снижении частоты развития СГЯ.
Апробация работы
Апробация диссертации была проведена на межклинической конференции 02
июня 2011г и заседании апробационной комиссии ФГУ «Научный Центр
акушерства,
гинекологии
и
перинатологии
Минздравсоцразвития России 17 июня 2011 г.
6
имени
В.И.
Кулакова»
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделения
вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ «НЦ АГ и П им. В.И.
Кулакова» Минздравсоцразвития России. Материалы работы используются для
практических занятий и лекций со слушателями семинаров ФГУ «НЦ АГ и П им.
В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России, аспирантами и клиническими
ординаторами. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в т.ч. 3 статьи
в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК.
Диссертация
Структура и объем диссертации
состоит из введения, 4 глав, выводов,
практических
рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 159 страницах
компьютерного текста, содержит 20 рисунков и 20 таблиц. Библиографический
указатель содержит 179 источников, из них 39 отечественных и 140 зарубежных
авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования
В соответствии с целью исследования и поставленными для ее решения
задачами в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ «НЦ
АГ и П им. академика В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России было
обследовано 146 супружеских пар репродуктивного возраста
Из них І группу (исследуемую) составили 75 пациенток в возрасте до 35 лет,
стимуляция суперовуляции которым была проведена с использованием «мягкой»
схемы с 5 дня менструального цикла.
Группа І поделена на 2 подгруппы:
-54 пациентки – с мультифолликулярными яичниками;
-21 пациентка – с СПКЯ
ІІ группу (группу сравнения) составили 71 пациентка, стимуляция
суперовуляции которым была проведена по стандартному «короткому» протоколу
со 2-3 дня менструального цикла.
Группа IІ поделена на 2 подгруппы:
-46 пациенток – с мультифолликулярными яичниками;
-25 пациенток – с СПКЯ
7
46 пациенткам из группы сравнения был произведен перенос эмбрионов в
цикле стимуляции, у 25 пациенток в связи с высоким риском развития СГЯ
произведена криоконсервация эмбрионов и последующий их перенос в следующем
менструальном цикле.
В работе были использованы следующие схемы стимуляции суперовуляции:
-стимуляция
суперовуляции
по
стандартному
«короткому»
протоколу проводилась со 2-3 дня МЦ. В качестве индуктора овуляции
применялся препарат рекомбинантного ФСГ. Стартовая доза была 150 МЕ.
Введение антагониста ГнРГ (ант-ГнРГ) осуществлялось при достижении
максимальным фолликулом диаметра 16 мм. Препарат в дозе 0,25 мг
вводился в одно и то же время суток по день введения триггера овуляции
включительно.
-стимуляция суперовуляции по «мягкому» протоколу начиналась с 5
дня МЦ путем ежедневного п/к введения рекомбинантного ФСГ. Стартовая
доза препарата была 75 МЕ с последующим введением ант-ГнРГ подкожно.
Критерием назначения триггера овуляции в обеих группах считали наличие
в яичниках, по крайней мере, трех фолликулов диаметром более 17 мм по данным
УЗИ. Триггером финального созревания ооцитов являлся препарат хорионического
гонадотропина (ХГ), доза которого составляла 8000- 10000 МЕ. Через 35- 36 часов
после введения ХГ проводили трансвагинальную пункцию яичников с целью
аспирации преовуляторных ооцитов.
Процедура ЭКО и переноса эмбрионов были аналогичны.
Все 146 супружеские пары отвечали основным критериям включения в
исследование: возраст женщин до 35 лет, высокий овариальный резерв,
мультифолликулярные
яичники,
отсутствие
оперативных
вмешательств
на
яичниках у пациенток без СПКЯ, патологии эндометрия по данным УЗисследования, тяжелых соматических заболеваний, представляющих угрозу
течению беременности и родов, субфертильная сперма супруга.
У женщин, вошедших в исследование, применяли следующие методы
обследования:
Общеклинические: сбор анамнеза, общий и гинекологический осмотры.
8
Стандартный
спектр
лабораторных
исследований
выполняли
перед
программой ЭКО и ПЭ: клинический анализ крови, биохимический анализ крови
исследование системы гемостаза.
Гормональное обследование (АМГ, ФСГ, ЛГ, ПРЛ, Е2, Т, К, ТТГ, Т3, Т4,
СТГ, ДЭА в периферической крови на 2-3 дни менструального цикла).
Сывороточную концентрацию П определяли на 21-23 дни менструального цикла.
Инфекционный статус оценивали путем исследования эпителиальных
клеток цервикального канала на наличие Chlamidia trachomatis, Ureaplasma
urealyticum, Micoplasma hominis, ДНК ВПГ II типа, ЦМВ методом ПЦР.
Комплексное микробиологическое исследование включало оценку микробиоценоза
влагалища.
Инструментальные методы исследования (эхография органов малого таза
перед началом введения гонадотропинов с определением объема яичников и
количества антральных фолликулов диаметром до 10мм, на 6-й день введения
гонадотропинов, далее ежедневно до введения овуляторной дозы ХГ).
Специальные методы исследования:
1. Определение уровней сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР) и
рецепторов СЭФР-1 и СЭФР -2 методом ИФА в сыворотке крови в день
введения препарата ХГ и в день переноса эмбрионов с целью прогнозирования
риска развития синдрома гиперстимуляции яичников.
2. Пайпель - биопсия эндометрия была проведена на этапе подготовки к
программе ЭКО и ПЭ на 7-8 день менструального цикла и в период
«имплантационного окна» с оценкой профиля экспрессии мРНК генов
цитокинов в 34 образцах эндометрия, биоценоза влагалища и степени
контаминации эндометрия условно -патогенной флорой. Уровень экспрессии
мРНК генов цитокинов измерялся методом ПЦР. При количественной оценке
биоценоза влагалища учитывалась общая бактериальная масса, масса
Lactobacillus spp. и 14 основных групп микроорганизмов, представляющих
условно-патогенную флору.
3.
Оценка
87
трансвагинальной
образцов
пункции
фолликулярной
яичников
9
жидкости,
по
полученных
при
молекулярно-генетическим
параметрам осуществлена с использованием метода ПЦР в режиме реального
времени с определением спектра генов: TNF-a, IL-2, IL-10, LIF, LIFR, IL-6, IL1b, TGF-b1, VEGFA121, VEGFA189, VEGFA165, HLA-G5 и HLA-G1.
Статистический анализ результатов проводился с использованием пакета
прикладных программ «Statistica for Windows» v. 7.0, StatSoft Inc (США).
Статистически
значимыми
считали
отличия
при
р<0,05
(95%-й
уровень
значимости) и при р<0,01 (99%-й уровень значимости). Связь между изучаемыми
показателями оценивалась по результатам корреляционного анализа с вычислением
коэффициента корреляции Спирмена (R) и последующим установлением его
значимости по критерию t.
Работа выполнена в отделении вспомогательных технологий в лечении
бесплодия (руководитель – профессор Кузьмичев Л.Н., далее д.м.н. Калинина Е.А.),
в лаборатории клинической иммунологии (руководитель – академик РАМН,
профессор Сухих Г.Т.) и в лаборатории молекулярно-генетических методов
(руководитель – д.б.н. Трофимов Д.Ю.).
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В начале исследования у всех пациенток были детально проанализированы
наследственность,
перенесенные
и
имеющиеся
заболевания,
становление
менструальной функции, акушерский и гинекологический анамнез.
При анализе данных анамнеза было выявлено, что пациентки обеих групп
достоверно не различались по возрасту, частоте экстрагенитальной патологии,
перенесенных гинекологических операций, невынашиванию беременности.
Частота первичного бесплодия составила 57,3% и 45,1%, вторичного – 42,7%
и 52,1% в I и II группах соответственно. Среди пациенток обеих групп выделена
подгруппа с диагнозом СПКЯ (n=46), подтвержденным при ранее проведенной
лапароскопии. При гормональном исследовании выявлен повышенный уровень ЛГ
у 29 (63%) пациенток, повышение соотношения ЛГ/ФСГ более 2,0 – у 17 (36,9%).
Концентрация свободного тестостерона более 4,0 пг/мл отмечена у 11 (23,9%)
больных. ИМТ более 25кг/м³ был у 8 (17,3%) пациенток.
10
При сравнении клинико - анамнестических характеристик у обследованных
пациенток, выявлен ряд статистически значимых различий между подгруппами.
Пациентки с СПКЯ в обеих группах имели большую длительность бесплодия,
достоверно больший объем яичников, большее число антральных фолликулов,
значения ЛГ и АМГ практически в 2 раза превышали те же показатели в сравнении
с подгруппами пациенток без СПКЯ (табл.1).
При сравнении ультразвуковых параметров овариального резерва в обеих
группах при наличии СПКЯ средний объем яичников и число антральных
фолликулов в 1,4 раза превысили аналогичные показатели у пациенток без СПКЯ в
обеих группах.
Таблица 1.
Сравнительный анализ овариального резерва в группах обследуемых
пациенток
Параметр
Возраст, лет
Длительность бесплодия, лет
I группа
с «мягким» протоколом
С СПКЯ
Без СПКЯ
(n=21)
(n=54)
28,7±0,5
29,6±0,5
5,7±0,1
4,5±0,01*
II группа
со стандартным протоколом
С СПКЯ
Без СПКЯ
(n=25)
(n=46)
27±1,5
31±0,5**
5,1±0,3
4,2±0,01**
ЛГ, МЕ/л
ФСГ, МЕ/л
ЛГ/ФСГ
Е2, пмоль/л
АМГ, нг/мл
Средний объем яичников, см/³
Число антральных фолликулов
12,5±0,9
5,2±0,5
2,4
127,1±18,6
7,9±0,3
12,7±0,8
12,9±0,2
11,8±1,4
4,8±0,4
2,5
113,2±39,3
6,5±1,7
11,6±1,1
12,3±0,9
5,6±0,2*
5,3±0,2
1,1
109,9±12,9
4,3 ±0,2*
10,9±0,4*
11,3±0,2*
5,7±0,2**
4,1±0,3
1,4
104,7±11
3,7±0,2**
10,4±0,2
10,8±0,2**
*-различия между выделенными параметрами в I и во II группах достоверны (р ≤ 0,05)
**-различия между выделенными параметрами в подгруппах II группы статистически достоверны
(р ≤ 0,05)
Корреляционный анализ методом подсчета коэффициента корреляции
Спирмена позволил выявить умеренную положительную связь концентрации АМГ
со средним объемом яичников, числом полученных ооцитов и числом зрелых
ооцитов (rS= 0,3-0,4, р≤0,01). Кроме того, отмечена обратная корреляция между
возрастом и числом антральных фолликулов в обеих группах (rS= -0,3, р ≤0,05).
11
Эти
данные
подтвердили
тот
факт,
что
АМГ
является
наиболее
информативным показателем, отражающим овариальный резерв. Полученные
результаты согласуются с данными ряда авторов (Nelson SM.,2009, Streuli I., 2009).
В соответствии с поставленными задачами далее были проанализированы
основные показатели стимуляции суперовуляции при применении «мягкого» и
стандартного «короткого» протоколов (табл.2).
Во II группе больных с применением короткого протокола средняя
суммарная дозировка препарата рФСГ достоверно превысила в 1,4 раза тот же
показатель в группе с «мягким» протоколом стимуляции.
Таблица 2.
Основные показатели стимуляции суперовуляции у пациенток исследуемых
групп
Параметр
I группа
с «мягким» протоколом
Наличие
Отсутствие
СПКЯ
СПКЯ
(n=21)
(n=54)
9,3±0,3
9,1±0,2
II группа
со стандартным протоколом
Наличие
Отсутствие
СПКЯ
СПКЯ
(n=25)
(n=46)
9,2±0,8
12,3±0,3**
75
75
150*
150**
Средняя суммарная доза
препарата рФСГ (МЕ)
1135,1±41,2
1274,8±29,5
1346,0±30,5
1615,9±34,2**
Овуляторная доза ХГ (МЕ)
8550±175
8440±167
8380±164
8675±135
Толщина эндометрия в день
введения ХГ (мм)
11,1±0,2
11,0±0,3
10,8±0,2
10,6±0,2
Длительность введения
препарата рФСГ (дни)
Средняя стартовая доза
препарата рФСГ (МЕ)
*-различия между выделенными параметрами в подгруппах с СПКЯ обеих групп статистически
достоверны (р ≤ 0,05)
**-различия между выделенными параметрами у пациенток без СПКЯ в обеих группах статистически
достоверны (р ≤ 0,05)
При сравнительном анализе фолликуло- и оогенеза были выявлены
статистически значимые различия в подгруппах с наличием СПКЯ (таблица 3).
В исследуемой группе число фолликулов, число полученных ооцитов и
общее число полученных эмбрионов были достоверно ниже, чем в группе
сравнения. Однако, количество зрелых ооцитов и эмбрионов «хорошего» качества в
исследуемой группе достоверно превысило те же показатели в группе сравнения и
составило: 76,1% и 4,9 против 56,5% и 3,2, соответственно. Полученные данные
12
согласуются с мнением Verberg MF. (2009), что несмотря на небольшое количество
полученных ооцитов при применении «мягкого» протокола стимуляции, они
представляют более гомогенную группу ооцитов хорошего качества, а не
патологическое снижение ответа яичников на стимуляцию.
Таблица 3.
Особенности фолликулогенеза, оогенеза и эмбриогенеза
у обследованных пациенток
Оцениваемые
параметры
Группа I
с
«мягкой»
схемой
(n=75)
13,5±0,2
Группа II со
стандартным
протоколом
(n=71)
Подгруппа с СПКЯ
По
По
«мягкой» стандартному
схеме
протоколу
(n=21)
(n=54)
14,2±1,1
19,2±2,1**
Подгруппа без СПКЯ
По
По
«мягкой» стандартному
схеме
протоколу
(n=25)
(n=46)
10,8±0,2
14,6±0,3***
Среднее число
19,2±0,2*
фолликулов в
день введения ХГ
Среднее число
8,8
13,8*
9,6±1,0
13,8±0,1**
8,1±0,5
12,8±0,2***
ооцитов
Зрелые ооциты,
6,7±0,5
7,8±0,5
7,3±0,9
7,2±1,7
7,2±0,5
7,9±0,
абс.числа, (%)
(76,1%)
(56,5%)*
(76%)
(52,2%)**
(88,9%)
(61,7%)***
Незрелые ооциты, 17,3
22,1
15,4
20,6
4,9
21,4
(%)
Дегенеративные
6,6
21,4
8,6
27,2
6,2
17,9
ооциты (%)
Число бластоцист 1,8±0,3
1,8±0,2
2,4±0,6
1,4±0,1
1,6±0,2
1,9±0,3
Среднее
6,8±0,3
10,4±0,6*
5,9±0,1
8,2±0,2**
5,2±0,3
9,4±0,2***
количество
эмбрионов
Число эмбрионов 4,9±0,6
3,2±0,5*
4,9±0,6
3,2±0,7**
3,9±0,3
3,5±0,3
«хорошего»
качества
*-различия между выделенными параметрами в I и во II группах статистически достоверны (р ≤ 0,05)
**-различия между выделенными параметрами в подгруппе пациенток с СПКЯ в I и во II группах
статистически достоверны (р ≤ 0,05)
***-различия между выделенными параметрами в подгруппе пациенток без СПКЯ в I и во II группах
статистически достоверны (р ≤ 0,05)
Принимая во внимание существующее представление о том, что этапы
созревания
яйцеклетки,
имплантации
и
развития
эмбриона
являются
цитокинзависимыми процессами и контролируются иммунной системой, поиск
молекулярно - биологических маркеров, ассоциированных с исходом программ
ВРТ в настоящее время представляется актуальной проблемой.
В связи с этим, на следующем этапе работы был проведен сравнительный
анализ результатов молекулярно-генетического исследования фолликулярной
жидкости и анализ экспрессии мРНК генов ряда цитокинов в эндометрии в период
предполагаемого «окна имплантации» у обследованных пациенток.
13
Было исследовано 87 образцов фолликулярной жидкости, полученных при
трансвагинальной пункции яичников и 34 образца эндометрия, взятых путем
проведения пайпель-биопсии эндометрия на этапе подготовки к программе ЭКО и
ПЭ на 7 день менструального цикла и в период «имплантационного окна».
Результаты исследования профиля экспрессии мРНК генов цитокинов в
клетках ФЖ у пациенток с высоким риском развития СГЯ показали, что при
применении «мягкой» схемы стимуляции, в период «имплантационного окна»
достоверно повышается уровень экспрессии мРНК HLA-G1 в 3,4 раза, мРНК HLAG5 - в 2,5 раза по сравнению со стандартным протоколом (рис.1).
медиана (1 и 3 квартили) *р=0,03
**р=0,003
Рисунок 1. Уровень экпрессии мРНК генов цитокинов в фолликулярной жидкости в
группах пациенток с применением «мягкого» и стандартного протоколов
Полученные данные подтверждают тот факт, что повышение уровня
экспрессии мРНК HLA-G играет ключевую роль в процессе имплантации и
поддерживает
локальное
иммуносупрессивное
состояние,
и
может
быть
ассоциировано с благоприятным исходом программы ЭКО и ПЭ (Rizzo R., 2009,
Vercammen M., 2009)
Оценив профиль экспрессии мРНК генов цитокинов в ткани эндометрия,
было выявлено, что у пациенток в программе ЭКО и ПЭ при неудачах имплантации
в эндометрии в период «имплантационного окна» отмечено повышение экспрессии
мРНК генов провоспалительных цитокинов: TNF-α в 5 раз, IL-18 – в 3,2 раза, IL-1βв 6,2 раза в цикле, предшествующем стимуляции (рис.2). Это, в свою очередь,
может явиться неблагоприятным прогностическим признаком для наступления
беременности. В связи с этим, остается актуальным и требующим дальнейших
14
исследований вопрос комплексного обследования и подготовки пациенток к
программе ЭКО и ПЭ.
медиана (1 и 3 квартили )*р=0,044 ** р=0,0092
Рисунок 2. Уровень экпрессии мРНК генов цитокинов в ткани эндометрия
в период «окна имплантации»
Очевидно, что пациентки с высоким овариальным резервом имеют больше
шансов на наступление беременности, чем пациентки с бедным ответом. С другой
стороны, при одновременном росте слишком большого числа фолликулов
существенно повышается риск развития серьезного осложнения стимуляции
суперовуляции - СГЯ. Учитывая то обстоятельство, что у пациенток обследованных
групп в прошлом цикле стимуляции имелись случаи развития СГЯ (в исследуемой
группе- у 14,7%, в группе сравнения- у 12,2% пациенток), был проведен анализ
частоты развития СГЯ в группах обследованных пациенток. Частота развития СГЯ
в исследуемой группе была в 1,8 раз достоверно ниже, чем в группе сравнения и
составила 12% и 22%,соответственно (рис.3).
25%
22%
20%
15%
12%*
10%
5%
0%
Группа с
Группа с
коротким
"мягким"
протоколом протоколом
*-различия между выделенными параметрами статистически значимы (р≤0,05)
Рисунок 3. Частота развития синдрома гиперстимуляции яичников в группах
обследованных пациенток
15
Рассматривая патогенез СГЯ, многие ученые делают акцент на ключевой
роли системы СЭФР в повышении сосудистой проницаемости. В связи с тем, что в
группах обследованных пациенток в предыдущих циклах стимуляции были случаи
развития СГЯ, представляется актуальным изучение возможных предикторов
данного осложнения. В настоящем исследовании были определены уровни СЭФР и
рецепторов СЭФР 1- и 2-типа в день введения ХГ и в день переноса эмбрионов в
полость матки 83 из 146 пациенток, включенных в исследование.
В день переноса эмбрионов уровень СЭФР в группе сравнения в 1,2 раза
превысил тот же показатель в исследуемой группе и составил 431,8± 52,4 и
351,6±53,1 пг/мл соответственно. В день введения овуляторной дозы ХГ уровни
рецепторов СЭФР-1 составили 96,8 ±2,3 и 81,4 ±2,7, а рецептора СЭФР-2 типа 15742,2 ±482,3 и 13197,9±486,2 пг/мл в группе сравнения и в исследуемой группе,
соответственно. Установлена умеренная корреляционная связь между рецептором
СЭФР -2 типа и развитием СГЯ в группе сравнения (rS =0,4,р =0,04). В то время как
в исследуемой группе корреляции не выявлено. Так как в группе сравнения частота
развития СГЯ достоверно выше, чем в исследуемой группе, повышение уровней
СЭФР и рецепторов СЭФР -1 и -2 типа может подтверждать их прогностическую
роль в развитии данного синдрома, что согласуется с данными Peitsidis P.,(2010).
В связи с этим, на следующем этапе исследования была проведена
сравнительная
оценка
эффективности
реализации
программы
ЭКО
у
обследованных пациенток при применении «мягкого» и стандартного протоколов
стимуляции суперовуляции, что является чрезвычайно актуальным. Частота
наступления беременности на перенос эмбриона при применении «мягкой» схемы
стимуляции составила 36,5%, в группе с применением стандартного протокола –
32,7%, однако различия были статистически незначимы (p≥0,05) (рис.4). Различия в
частоте наступления беременности могут быть обусловлены значительной долей
циклов с переносом эмбрионов в полость матки в исследуемой группе, в отличие от
группы сравнения, где частота отмены переноса в связи с риском развития СГЯ
была выше.
16
37%
36,5%
36%
35%
Мягкая схема
34%
32,7%
33%
Стандартный "короткий"
протокол
32%
31%
30%
Частота наступления беременности
Рисунок 4. Эффективность применяемых протоколов стимуляции суперовуляции у
обследованных пациенток
При развитии данного осложнения, осуществление переноса эмбрионов в
полость матки в том же менструальном цикле не представляется возможным.
В рамках профилактики СГЯ широкое применение получил метод
криоконсервации эмбрионов и переноса их в полость матки в следующем
менструальном цикле с предварительной гормональной подготовкой эндометрия.
Данный
метод
позволяет
избежать
яичников
(Yanaihara
гиперстимуляции
развития
A.,2008).
тяжелых
Его
форм
применение
синдрома
явилось
логической стратегией в качестве превентивной меры развития СГЯ и вошло в
рутинную практику.
В связи с этим, представилось важным провести оценку частоты наступления
беременности в расчете на 1 цикл переноса эмбрионов при применении «мягкой»
схемы
стимуляции
и
в
качестве
альтернативы,
при
переносе
криоконсервированных эмбрионов у пациенток с высоким риском развития СГЯ.
Все криоэмбрионы, перенесенные в полость матки, были сходны по всем
параметрам, криоконсервированы методом витрификации. У всех пациенток после
цикла переноса остались криоконсервированные эмбрионы для переноса их в
следующих циклах.
В
итоге
выявлены
достоверные
различия
в
частоте
наступления
беременности на перенос в группе с применением «мягкой» схемы стимуляции
суперовуляции, в сравнении с группой, где переносили криоконсервированные
эмбрионы (36,5% и 25,3%, соответственно, р=0,03), (рис.5).
17
В связи с вышесказанным, с целью снижения риска развития СГЯ без
отсрочки переноса эмбрионов и связанных с этим психологической нагрузки,
дополнительного времени и затрат на проведение криоконсервации эмбрионов и
самой процедуры криопереноса, у пациенток с высоким риском развития СГЯ
представляется целесообразным применение «мягкого» протокола стимуляции.
36,5%*
40%
Группа с переносом
криоконсервированных
эмбрионов
Группа с "мягким"
протоколом
35%
30%
25,3%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
Рис.5. Частота наступления беременности при применении «мягкого» протокола
стимуляции и при переносе криоконсервированных эмбрионов после отмены переноса в
связи с развитием СГЯ
Таким образом, полученные в ходе выполнения настоящего исследования
данные свидетельствуют о несомненной связи между определенными иммунными
факторами в сыворотке крови, фолликулярной жидкости и эндометрии и
эффективностью реализации репродуктивной функции, что диктует необходимость
поиска новых молекулярно-биологических маркеров на этапе подготовки к
программе ЭКО и ПЭ и совершенствования правильного выбора протоколов
стимуляции суперовуляции для различных групп пациенток.
Результаты проведенного исследования позволили нам разработать алгоритм
применения «мягкого» протокола стимуляции суперовуляции в программах ВРТ
(рис.6).
18
Алгоритм применения «мягкой» схемы стимуляции суперовуляции
у пациенток с высоким риском развития СГЯ
Обследование пациенток в программе ЭКО и ПЭ
Оценка овариального резерва
Отбор пациенток с высоким риском развития СГЯ
Возраст до 35 лет
СПКЯ
(возраст до 35 лет)
Астенический тип телосложения
Мультифолликулярные
яичники:
Объем яичников > 11 см³
Число антральных фолликулов >10
АМГ>2,5 нг/мл
ФСГ<8 МЕ/мл
СГЯ в предыдущих циклах
Возраст до35 лет
Нормостенический тип телосложения
Объем яичников < 11 см³
1нг/мл<АМГ<2,5 нг/мл
ФСГ>8 МЕ/мл
Число антральных фолликулов <10
СГЯ в предыдущих циклах стимуляции
стимуляции
Стимуляция суперовуляции по стандартному
«короткому» протоколу
Стимуляция суперовуляции по «мягкому»
протоколу
Развитие синдрома
гиперстимуляции яичников
ВЫВОДЫ:
1. У пациенток с высоким риском развития СГЯ при сравнительной
оценке параметров фолликуло-, оо- и эмбриогенеза при применении «мягкого»
протокола стимуляции суперовуляции выявлено достоверное увеличение
среднего количества зрелых ооцитов в 1,3 раза, эмбрионов «хорошего» качества
в 1,4 раза, несмотря на снижение общего количества полученных ооцитов в 1,6
раза, по сравнению со стандартным «коротким».
2. Достоверное повышение уровня экспрессии мРНК HLA-G1 в клетках
фолликулярной жидкости в 3,4 раза, мРНК HLA-G5 - в 2,5 раза при применении
«мягкого» протокола стимуляции по сравнению со стандартным, ассоциировано
с благоприятным исходом программы ЭКО и ПЭ.
3. У пациенток в программе ЭКО и ПЭ при неудачах имплантации в
эндометрии
в
период
«имплантационного
окна»
отмечено
повышение
экспрессии мРНК генов провоспалительных цитокинов: TNF-α в 5 раз, IL-18 – в
3,2 раза, IL-1β- в 6,2 раза в цикле, предшествующем стимуляции, что является
неблагоприятным прогностическим признаком для наступления беременности.
4.Применение
«мягкого» протокола
стимуляции
суперовуляции
у
пациенток с высоким овариальным резервом позволяет снизить частоту
развития СГЯ в 1,8 раза по сравнению со стандартным.
5. Повышение уровней рецепторов СЭФР- 1 и -2 типа в день введения ХГ
в 1,3 раза, уровня СЭФР в день ПЭ в 1,2 раза при применении стандартного
протокола в сравнении с «мягким» является прогностически значимым в
развитии СГЯ.
6. Частота наступления беременности из расчета на перенос эмбриона при
применении «мягкого» протокола составляет 36,5 %, стандартного -32,7%, что
не является статистически значимым и, очевидно, обусловлено большей
частотой отмены переноса в связи с высоким риском развития СГЯ в группе со
стандартным протоколом. Эффективность применения «мягкого» протокола
достоверно выше в 1,4 раза, чем при переносе криоконсервированных
эмбрионов, полученных в результате отмены переноса при стандартном
протоколе в связи с высоким риском СГЯ.
20
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Модифицированный «мягкий» протокол стимуляции суперовуляции
является вариантом выбора для пациенток с высоким риском развития СГЯ с
учетом параметров овариального резерва.
2. При наличии у пациенток молодого возраста прогностических факторов по
высокому риску развития синдрома гиперстимуляции яичников (число
антральных фолликулов более 10, объем яичников более 11 см³, уровень АМГ
>2,5нг/мл, СПКЯ) рекомендуется проведение стимуляции суперовуляции по
«мягкой» схеме: с 5 дня менструального цикла введение низких доз
рекомбинантного ФСГ (75МЕ) с последующим назначением антагониста ГнРГ
при достижении максимальным фолликулом диаметра 16 мм в ежедневной дозе
0,25 мг подкожно по день введения триггера овуляции включительно. Введение
овуляторной дозы ХГ (8000-10000 МЕ) при наличии в яичниках, по крайней
мере, трех фолликулов диаметром более 17 мм и толщины эндометрия 8-10мм.
Процедура ЭКО и переноса эмбрионов аналогичны таковым при
традиционных протоколах ЭКО.
3. Применение «мягкого» протокола стимуляции суперовуляции у
пациенток с высоким овариальным резервом представляется целесообразным в
связи
с
более
высокой
эффективностью,
снижением
медикаментозной,
психологической и экономической нагрузки в сравнении с переносом эмбрионов,
криоконсервированных в результате отмены переноса из-за высокого риска СГЯ
при применении стандартного протокола.
21
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Современные подходы к стимуляции суперовуляции в программах ВРТ
/М.В.
Эбзеева,
Е.А.
Калинина,
Л.Н.
Кузьмичев
//
Проблемы
репродукции. - Москва, 2009. – № 4. – С. 47- 49.
2. Модифицированные схемы стимуляции суперовуляции: эффективность и
безопасность / Е.А. Калинина, М.В. Эбзеева, О.В. Бурменская, Л.М. Казарян
// Проблемы репродукции. - Москва, 2011. – №1. – С. 67- 72.
3. Опыт применения «мягких» схем стимуляции суперовуляции у пациенток
группы риска развития синдрома гиперстимуляции яичников / Е.А.
Калинина, М.В. Эбзеева, Л.Н. Кузьмичев // Акушерство и гинекология. Москва, 2010. – №6. – С.60- 64.
4. Экспрессия мРНК генов иммунной системы (цитокинов и HLA-G) в клетках
фолликулярной жидкости / М.В. Эбзеева, Е.А. Калинина, О.В. Бурменская,
О.С. Непша, Д.Ю. Трофимов // Тезисы V Международного конгресса по
репродуктивной медицине «Репродуктивное здоровье семьи». - Москва,
2011.- С.119-120.
5. Роль показателей овариального резерва в формировании группы риска
развития СГЯ в программе ВРТ / М.В. Эбзеева, Е.А. Калинина // Тезисы
IV
Международного
конгресса
по
репродуктивной
медицине
«Репродуктивное здоровье семьи». – Москва, 2010. – с.275.
6. Применение модифицированных протоколов стимуляции суперовуляции в
программе ЭКО и ПЭ / М.В. Эбзеева, Е.А. Калинина // Материалы XVII
Российского национального конгресса «Человек и лекарство».
7. Markers associated with success and failure of embryo transfer (ET) during IVF
program / D.Yu. Trophimov, O.V. Burmenskaya, M. V. Ebzeeva, E.A. Kalinina,
S.M. Mullabaeva, L.N.Kuzjmichev, G.T. Sukhikh // Journal of reproductive
immunology. /
7th
European Congress on Reproductive Immunology, September
17-20, 2009, Maratthon, Greece / Vol.81, 2009. - P.157.
22
Список сокращений
А-ГнРГ
-агонист гонадотропин рилизинг-гормона
Ант - ГнРГ
-антагонист гонадотропин рилизинг-гормона
АМГ
-антимюллеров гормон
ВРТ
-вспомогательные репродуктивные технологии
ДЭА
-дегидроэпиандростерон
Е2
-эстрадиол
ИКСИ
-интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида
в ооцит
ИМТ
-индекс массы тела
ИФА
-иммуно-ферментный анализ
К
-кортизол
ЛГ
-лютеинизирующий гормон
МРТ
магнитно-резонансная томография
ОТ
-обратная транскрипция
П
-прогестерон
рФСГ
-рекомбинантный ФСГ
СГЯ
-синдром гиперстимуляции яичников
СПКЯ
-синдром поликистозных яичников
СТГ
-соматотропный синдром
СЭФР(VEGF)
-сосудисто-эндотелиальный фактор
СЭФР-R1 и -R2
-рецептор СЭФР 1 и 2 типов
Т
-тестостерон
Т3
-трийодтиронин
Т4
-тироксин
ТТГ
-тиреотропный гормон
ТВП
-трансвагинальная пункция яичников
ФЖ
-фолликулярная жидкость
ФСГ
-фолликулостимулирующий гормон
ХГ
-хорионический гонадотропин
23
ЧМГ
-человеческий менопаузальный гонадотропин
ЧНБ
-частота наступления беременности
ЭКО и ПЭ
-экстракорпоральное оплодотворение и перенос
эмбрионов в полость матки
17-ОП
-17- оксипрогестерон
HPRT1
-референсный ген ''housekeeping gene”
IL
-интерлейкин
TNFa
-туморнекротизирующий фактор альфа
IFNg
-интерферон гамма
TGFb
-трансформирующий фактор роста бета
VP
-сосудистая проницаемость
24