К-антиген

Антигены.
Содержание:



Антигены и их свойства
Антигены микроорганизмов
Антигены организма человека
АНТИГЕНЫ И ИХ СВОЙСТВА
Первоначально термин антиген (от англ. Antibodi generator) применяли для
обозначения любой молекулы, индуцирующей образование В-клетками
специфических антител. Однако теперь этот термин имеет более широкий
смысл, обозначая любую молекулу, которую могут специфически распознавать
элементы системы приобретенного иммунитета, т.е. В-клетки или Т-клетки,
либо и те и другие.
Антиген - это инициатор и движущая сила всех реакций приобретенного
иммунитета. Иммунная система возникла для распознавания и разрушения
чужеродных агентов, а также устранения источника их образования - бактерий,
инфицированных вирусом клеток и т.п. Когда антиген элиминирован,
иммунный ответ прекращается.
Антигены - вещества различного происхождения, несущие признаки
генетической чужеродности и вызывающие развитие иммунных реакций
(гуморальных, клеточных, состояние иммунной толерантности,
индуцирование иммунной памяти).
Свойства антигена определяются комплексом признаков: иммуногенность,
антигенность, специфичность.
Иммуногенность - способность антигена индуцировать в организме иммунный
ответ.
Антигенность - способность антигена взаимодействовать только с
гомологичными антителами и лимфоцитами определенного клона.
Специфичность - структурные особенности, отличающие один антиген от
другого.
Способность вызывать развитие иммунного ответа и определять его
специфичность обладает фрагмент молекулы антигена - антигенная
детерминанта (эпитоп), избирательно реагирующая с
антигенраспознающими рецепторами и антителами. Молекула антигена может
иметь несколько эпитопов, то есть быть поливалентной. Чем сложнее молекула
антигена и чем больше у нее эпитопов, тем больше вероятность развития
иммунной ответа.
Иммуногены или полные антигены - это вещества, вызывающие полноценный
иммунный ответ и обладающие свойствами: иммуногенностью, антигенностью
и специфичностью. Иммуногенами являются биополимеры - белки, их
комплексы с углеводами (гликопротеиды), а также сложные полисахариды,
липополисахариды с высокой молекулярной массой. Чем дальше от человека в
эволюционном отношении отстоят организмы, тем бoльшую иммуногенность
проявляют их белки.
Гаптены - неполные антигены, относительно простые вещества, способные
участвовать в иммунологических взаимодействиях, но не способные
самостоятельно индуцировать иммунный ответ. Гаптены обладают свойствами
антигенностью и специфичностью, но не обладают иммуногенностью.
Гаптены после присоединения к крупным, обычно белковым молекулам
(носителям), могут приобретать свойства полного антигена.
Толерогены - антигены, способные подавлять иммунные реакции с
развитием специфической неспособности отвечать на них.
АНТИГЕНЫ МИКРООРГАНИЗМОВ
Большинство возбудителей инфекционных заболеваний человека, их структуры
и токсины - полноценные антигены, вызывающие развитие иммунных реакций.
Антигены бактерий.
По расположению в бактериальной клетке выделяют антигены:
Капсульный антиген - К Ag
Жгутиковый антиген - H Ag
Соматический антиген - O Ag
О-Аг большинства бактерий представлены термостабильным
липополисахаридно-полипептидным комплексом; у грамотрицательных
бактерий О-Аг представляет эндотоксин.
Н-Аг представлен термолабильным белком флагеллином.
К-Аг большинства бактерий имеют полисахаридную природу. По
чувствительности к температуре К-Аг подразделяются на А-, В- и L-антигены.
Наиболее термостабильными являются А-Аг, выдерживающие кипячение более
2 часов. В-Аг выдерживают нагревание при температуре 60°С в течение часа, а
L-Аг разрушаются при нагревании до 60°С.
Для идентификации выделенных микроорганизмов в лаборатории применяют
внутривидовую или внутриродовую дифференциацию микроорганизмов,
основанную на различиях в антигенной структуре. При этом символически
отображают антигенную структуру бактерий в виде антигенной формулы.
Например, антигенную формулу одного из сероваров E. coli, вызывающую
колиэнтериты у детей раннего возраста обозначают как О55:К5:Н21 (серовар,
относящийся к серогруппе О55).
Рис. 1. Антигены бактерий: О-антиген (3 - клеточная стенка); Нантиген (7 - жгутик); К-антиген (2 - капсула).
Антигены вирусов
В каждом вирионе любого вируса содержатся различные антигены. Одни из них
являются вирусспецифическими. В состав других антигенов входят компоненты
клетки хозяина (липиды, углеводы), которые включаются в его внешнюю
оболочку. Антигены простых вирионов связаны с их нуклеокапсидами. По
своему химическому составу они принадлежат к рибонуклеопротеидам или
дезоксирибонуклеопротеидам, которые являются растворимыми соединениями
и поэтому обозначаются как S-антигены (solutio - раствор). У
сложноорганизованных вирионов одни антигенные компоненты связаны с
нуклеокапсидами, другие - с гликопротеидами внешней оболочки. Многие
простые и сложные вирионы содержат особые поверхностные V-антигены гемагглютинин и фермент нейраминидазу.
Рис. 2. Антигены вирусов гриппа (слева) и гепатита В (справа)
поверхностные (V-антигены) и серцевинные (S-антигены).
АНТИГЕНЫ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
Все ткани и клетки организма человека обладают антигенными свойствами.
Одни антигены специфичны для всех млекопитающих, другие видоспецифичны
для человека, третьи - для отдельных групп, их
называют изоантигенами (например, антигены групп крови). К антигенам,
свойственным только данному организму относятся антигены тканевой
совместимости
Изоантигены
Изоантигены или групповые антигены - это антигены, по которым отдельные
индивидуумы или группы особей одного вида различаются между собой.
В эритроцитах, лейкоцитах, тромбоцитах, а также в плазме крови людей
открыто несколько десятков изоантигенов.
Изоантигены, генетически связаны, объединены в группы, получившие
название: система АВО, резуси др. В основе деления людей на группы по
системе АВО лежит наличие или отсутствие на эритроцитах антигенов,
обозначенных А и В. В соответствии с этим все люди подразделены на 4
группы. Группа I (О) - антигены отсутствуют, группа II (А) - в эритроцитах
содержится антиген А,группа III (В) - эритроциты обладают антигеном
В, группа IV (АВ) - эритроциты обладают обоими антигенами. Поскольку в
окружающей среде имеются микроорганизмы, обладающие такими же
антигенами (их называют перекресно-реагирующими), у человека имеются
антитела к этим антигенам, но только к тем, которые у него отсутствуют. К
собственным антигенам организм толерантен. При переливании крови или
эритроцитов реципиенту, в крови которых содержатся антитела к
соответствующему антигену, в сосудах происходит агглютинация перелитых
несовместимых эритроцитов, что может вызвать шок и гибель реципиента.
У части людей эритроциты содержат еще особый антиген, получивший
название резус-антигена (Rh). По наличию или отсутствию Rh-антигена люди
разделяются на две группы - резус (Rh)-положительных и резус (Rh)отрицательных. При переливании крови Rh-отрицательному реципиенту, если
эритроциты донора содержат Rh-антиген, может развиваться гемолитическая
желтуха.
Рис. 3. Рецепторы, встроенные в мембрану эритроцита, являются
антигенами организма (изоантигены) в том числе антигены А и В
системы АВО и резус фактор.
Антигены главного комплекса тканевой (гисто) совместимости.
Помимо антигенов, свойственных всем людям и групповых антигенов, каждый
организм обладает уникальным набором антигенов, свойственных только ему
самому. Эти антигены кодируются группой генов, находящихся у человека на 6
хромосоме, и называются антигенами главного комплексатканевой
совместимости и обозначаются МНСантигены (англ. Major histocompatibility complex). МНС-антигены человека
впервые были обнаружены на лейкоцитах и поэтому имеют другое название HLA (Human leucocyte antigens). МНС-антигены относятся к гликопротеинам и
содержатся на мембранах клеток организма, определяя его индивидуальные
свойства и индуцируют трансплантационные реакции, за что они получили
третье название - трансплантационные антигены. Кроме того, МНС-антигены
играют обязательную роль в индукции иммунного ответа на любой антиген.
Белки I класса находятся на поверхности практически всех клеток организма.
Антигены I класса обеспечивают представление антигенов цитотоксическим
CD8+-лимфоцитам, а распознавание этого антигена антигенпредставляющим
клеткам другого организма при трансплантации приводит к развитию
трансплантационного иммунитета.
МНС-антигены II класса находятся преимущественно на
антигенпредставляющих клетках - дендритных, макрофагах, В-лимфоцитах.
Основная роль в иммуногенезе антигенов II класса - участие в представлении
чужеродных антигенов Т-хелперным лимфоцитам.
Рис. 4. Антигены главного комплекса гистосовместимости I класса
представляют антиген (темно-синий круг)Т-киллерам, антигены II
класса представляют антиген Т-хелперам.
Реакции агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные
клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются
антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента:
1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и
3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат
1. Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА) на стекле с
целью идентификации бактерий кишечной группы.
Рис. 2. РА на
стекле.
На предметное стекло наносят каплями:
1-ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям дизентерии;
2-ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа;
3-ья капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий.
Перемешивают.
Примечание: положительный результат - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного
тифа.
2. Учет результатов РНГА, поставленной с целью
обнаружения ботулотоксина.
Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи
сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В,
Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть
дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками. Для этой
цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с
сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и
эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических
противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит
нормальная сыворотка.
Рис. 3. Постановка и результат РНГА.
Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде
ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем
(перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в видепуговки или
колечка.
Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.
Реакция преципитации – это формирование и осаждение комплекса
растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения,
называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и
антител в эквивалентных количествах. Реакцию преципитации ставят в
пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.
3. Постановка и учет реакции кольцепреципитации для определения видовой
принадлежности кровяного пятна.
Постановка. В узкую пробирку №1 диаметром 0,5 см с неразведенной
преципитирующейсывороткой против белков крови человека в количестве
0,3-0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно
по стенке наслаивается такой же объем антигена (экстракт кровяного пятна).
В пробирку №2 приливают преципитационную сыворотку против белков
барана, в пробирку №3 - физиологический раствор (контроль) и добавляют
также, как в первую пробирку антиген. Пробирки осторожно, чтобы не смешать
жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на
сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости.
Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и
антигена.
Учет. Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и
антител через 5-10 мин, 1-2 ч или через 20-24 ч. В
случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и
исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.
Рис. 4. Реакция кольцепреципитации.
4. Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции
преципитации в агаре.
Эта издавна используемая реакция преципитации, предложенная для
определения токсичности коринебактерий дифтерии, ставится на фосфатнопептонном агаре в чашке Петри. Вдоль ее посередине помещают полоску
стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой.
После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром
10 мм подсевают выделенные культуры. В одной чашке можно сеять от 3 до
10 культур, одна из которых,контрольная, должна быть
заведомо токсигенной. Посевы помещают в термостат.
Учет реакций проводят через 24-48-72 ч. Если культура токсигенная, на
некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата,
совпадающие с линиями преципитата контрольной культуры. Они имеют вид
«стрел-усиков», которые хорошо видны в проходящем свете.
Рис. 5. Реакция преципитации в агаре.
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ
АНТИТЕЛ
5. Постановка непрямой реакции гемагглютинации (РНГА) выявления титра
специфических антител у больного.
В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют
эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии
специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок.
Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА
как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител
(серодиагностика).
Постановка. В лунках полистироловых планшетов готовят ряд
последовательных разведенийсыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5
мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл
физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл
разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в
термостат на 2 ч.
Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде
ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем
(перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в видепуговки или
колечка.
Рис. 6. Результат РНГА. Титр антител - 1:100.
6. Постановка развернутой реакции агглютинации с целью выявления титра
специфических антител у больного.
Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее
разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или
1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные
агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом
(диагностический титр). В качестве антигена в этой реакции
используютдиагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых
бактерий, с которыми безопасно работать.
Ставят реакцию следующим образом. В агглютинационные пробирки
предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В
первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл
переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные
разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси
бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и
помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при
комнатной температуре.
Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая
последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном
встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть.
Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной
жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей
жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость
слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень
мутная, хлопья в ней плохо различимы; — - отсутствие агглютинации
(жидкость равномерно мутная).
За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором
интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)
Рис. 7. Развернутая реакция агглютинации.
РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ
Реакции нейтрализации (РН) основаны на способности АТ связывать различные
возбудители или их метаболиты, лишая тем самым их возможности реализовать
свои биологические свойства (иными словами, АТ нейтрализуют возбудителей).
На практике РН применяют для выявления вирусов и различных токсинов. В
определенной степени к ним же относят реакции торможения
вирусиндуцированной гемагглютинации и иммобилизации.
Реакция нейтрализации вирусов
В сыворотки крови переболевших лиц циркулируют антитела, нейтрализующие
вирусы. Их наличие выявляют смешиванием культуры возбудителей с
сывороткой с последующим введение лабораторному животному или
заражением культуры клеток. На эффективность нейтрализации указывает
выживание животного либо отсутствие гибели клеток в культурах.
7. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА).
Рис. 8. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) (схема).
Принцип реакции основан на способности АТ связывать различные вирусы и
нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты.
Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА
применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических
антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их
гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.
Типирование вируса проводят в реакции РТГА с набором типоспецифических
сывороток.Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации.
Подтипы вируса типа А с антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и другие могут
быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических
сывороток
Рис. 9. Результаты РТГА при типировании вируса гриппа
Условные обозначения:
(зонтик).
Выводы:
- торможение гемагглютинации (пуговка) ;
- гемагглютинация
Исследуемый материал содержит вирус гриппа тип А с
антигеном H3N2
Определение титра антител крови больного по РТГА
Развернутая РТГА проводится в лунках пластмассовых пластин. В лунках
готовят 2-х кратные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,25 мл,
добавляют по 0,25 взвеси вируса в рабочем разведении и инкубируют 2 ч при
температуре 37°С. Затем добавляют по 0,5 мл 1% взвеси куриных эритроцитов,
инкубируют еще 2 ч и оценивают результат по феномену гемагглютинации.
При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов на дне
лунки в виде диска или кольца с ровными краями. Титр антител определяют
по последней лунке с положительной РТГА.
Рис. 10. Определение титра антител по РТГА.
Выводы: титр антител равен 1:40.
8. Результаты реакции нейтрализации выделенных от больных вирусов с
моновалентными иммунными сыворотками к вирусам полиомиелита I-III
типов.
Выделение энтеровирусов из исследуемого материала осуществляют путем
заражения клеточных культур. Индикацию вирусов проводят по
цитопатогеному действию (ЦПД): на 2-3-й день инкубации при 35°С
наблюдается полная или частичная дегенерация клеток. Основным методом
идентификации выделенного вируса является серотипирование в реакции
нейтрализации. С этой целью материал из чистой культуры выделенного вируса
обрабатывают смесью диагностических моновалентных сывороток к различным
серотипам энтеровирусов. При этом в начале определяют тип вируса, затем его
принадлежность к определенному серотипу.
Рис. 11. Реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток: А - цитопатогенный эффект (ЦПЭ) или
цитопатогенное действие (ЦПД) в результате размножения вирусов; Б - ЦПЭ отсутствует в результате
предварительной нейтрализации вирусов антителами.
Рис. 12. Постановка и учет реакции нейтрализации вирусов в культкре клеток. Условные
обозначения: + - ЦПД; – - отсутствие ЦПД.
Выводы: В исследуемом материале определен вирус
полиомиелита серотип I.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУПП КРОВИ АВО
9. Реакция гемагглютинации (РГА)
Аг (эритроциты крови) + АТ (стандартная сыворотка)
+ электролит = гемагглютинат
На плоскость (тарелку, планшет) наносят глазной пипеткой, индивидуальной
для каждой ампулы, по 2 кап. (0,1 мл) стандартной сыворотки двух различных
серий каждой группы слева направо: Оab(I), Аb(II), Вa(III). Итого 6 капель на
расстоянии 3-4 см друг от друга. Рядом со стандартными сыворотками наносят
по 1 кап. исследуемой крови величиной с булавочную головку - 0,01 мл 20%
взвеси исследуемых эритроцитов.
Встряхиванием перемешивают сыворотку с кровью, периодически покачивают
и смотрят результат через 5 минут. В те капли, где наступила агглютинация,
вносят по 1 кап. физиологического раствора.
Оценка результатов




Нет агглютинации во всех сыворотках
- это Оab(I) группа
крови
Агглютинация в сыворотках Оab(I) и Вa(III)
- это Аb(II) группа
крови
Агглютинация в сыворотках Оab(I) и Аb(II)
- это Вa(III) группа
крови
Агглютинация во всех сыворотках
- это АВ0(IV) группа
крови
Рис. 13. Результат РГА при определении группы крови АВО: а) - отрицательная РГА (нет
гемагглютинации); б) - положительная РГА (гемагглютинация).
Если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию, то для
исключения неспецифической агглютинации необходимо провести
дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой АВ0(IV)
группы. Для этого на плоскость наносят большую (0,1 мл) каплю сыворотки
АВ0(IV) и к ней добавляют маленькую (0,01 мл) каплю исследуемой крови и
смотрят результат через 5 минут. Лишь отсутствие агглютинации в этой капле
при наличии ее в каплях со стандартными сыворотками групп Оab(I), Аb(II) и
Вa(III) позволяет считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь
к группе АВ0(IV).
Лабораторная работа 6 Гемагглютинация, ее разновидности и аспекты применения
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6
ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ, РАЗНОВИДНОСТИ И АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ
Феномен агглютинации заключается в том, что антитела, взаимодействуя с
корпускулярными антигенами вызывают их склеивание с образованием
агрегатов, хлопьев, зерен, комочков, различаемых невооруженным глазом или с
помощью лупы.
Антитела, принимаемые участие в реакции агглютинации, называются
агглютининами, а антигены – агглютиногенами, образующийся при этом осадок
– агглютинатом. Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три
компонента:
АГ (агглютиноген)+ АТ (агглютинин)+
электролит (изотонический раствор хлорида натрия) = агглютинат
Рис.1 Схема РА
Различают реакции прямой и непрямой агглютинации. При реакции прямой
агглютинации антитела агглютинируют корпускулы непосредственно, а при
реакции непрямой (пассивной) агглютинации ей повергаются растворимые
антигены, предварительно адсорбированные на корпускулярном носителе,
которым могут быть инертные частицы (латекс, оксид бария, бентонит) или
клетки (эритроциты барана, I(0)-группы крови человека). Если в качество
носителя применяются эритроциты, то реакция называется реакциейпассивной
гемагглютинации (РПГА).
Рис.2 Схема РПГА
Эритроциты при их использовании в качестве носителя взаимодействуют
с антигеном, склеиваются в присутствии специфических антител к данному
антигену и выпадают в осадок.
Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как
эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика).
Если нагрузить эритроциты антителами (эритроцитарный антительный
диагностикум), то можно применять для выявления антигенов.
Реакция гемагглютинации (РГА) представляет собой реакцию
АГ (эритроциты крови) + АТ (стандартная сыворотка) + электролит = гемагглютинат
Применяется для обнаружения групп крови АВО
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА,
РПГА) ставится следующим образом: в лунках полистироловых планшетов
готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку
вносят − 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл
физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл
разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в
термостат на 2 ч.
Рис. 3 Результат РНГА
В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя
клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в
отрицательном − оседают в виде пуговки или колечка.
РПГА применяют для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий
и других высокодисперсных веществ, риккетсий и вирусов, комплексы которых
с агглютининами в обычных РА увидеть не удается; для выявления в
сыворотках больных антител к этим высокодисперсным веществам и
микроорганизмам.
Рис. 4 Результат РНГА при диагностике штаммов гриппа
Учет результатов РНГА, поставленной с целью обнаружения ботулотоксина
Возбудитель ботулизма − Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи
сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В,
Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть
дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками. Для этой
цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с
сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и
эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических
противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит
нормальная сыворотка.
Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде
ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый
зонтик), в отрицательном − оседают в виде пуговки или колечка.
Правила забора крови для иммунологического исследования
Для серологического исследования у человека натощак берут кровь в количестве
5-6мл из локтевой вены при соблюдении правил асептики. Кровь ставят в
термостат на 30-60 мин. Образовавшийся кровяной сгусток отделяют от стенки
стерильной стеклянной палочкой и оставляют в холодильнике на 18-20 ч.
Отстоявшуюся сыворотку осторожно сливают в стерильную пробирку, в случае
примеси эритроцитов ее центрифугируют. Сыворотка может храниться в
стерильных условиях в холодильнике до 1 месяца. Для более длительного
хранения ее замораживают при температуре от -20° до
- 70°С.
Ход работы:
1.Изучить порядок постановки и учет реакций гемагглютинации.
2. Зарисовать схемы реакций прямой и непрямой гемагглютинации.
2.Изучить правила забора крови для серологических исследований.
3.Ответить на вопросы:
1) В чем заключается феномен агглютинации?
2) В чем особенности непрямой реакции агглютинации?
3) Какие компоненты применяются в реакции гемагглютинации?
4) Для каких целей используют реакцию прямой гемагглютинации?
5) В чем различия прямой и непрямой реакций гемагглютинации?
4.Провести определение групп крови (компьютерная программа).
Реакции связывания комплемента.
РИФ и ИФА.
Содержание:



Реакция связывания комплемента.
Иммунофлюоресцентный метод.
Иммуноферментный анализ.
РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие антигена и
антител при обязательном участии комплемента. Вторая - выявление
результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы
(эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов
гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения
комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался
ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает.
Результат опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех
пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза,
когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно,
отрицательной - при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно
окрашена («лаковая» кровь). Степень задержки гемолиза оценивают в
зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка
эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).
Рис. 1. Схема реакции связывания комплемента.
Рис. 2. Постановка и результат РСК.
Выводы: В исследуемой сыворотке выявлены антитела.
РСК позволяет выявить антитела к любому штамму одного и того же серотипа
вируса. Диагностическое значение имеет четырехкратное увеличение титра
антител в парных сыворотках (в период эпидемии гриппа) и двукратное
нарастание в сыворотках крови больных при характерной клинической
картине.
Рис. 3. Серодиагностика с парными сыворотками.
Выводы: В парных сыворотках больного выявлено четырехкратное
увеличение титра антител к вирусу гриппа А.
МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА) или
РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ)
Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого
выявления и идентификации неизвестного микроорганизма в
исследуемом материале.
Аг
+
АТ
+ электролит = светящийся в УФ - лучах
комплекс
Микроб
сыворотка, меченная флюорохромом
Часто используют краситель изотиоционат флюоресциина - ФИТЦ
При исследовании этим методом используют люминесцентный микроскоп.
Постановка Р И Ф




На мазок наносят 30 мкл раствора ФИТЦ-меченных антител.
Помещают стекло во влажную камеру и выдерживают при комнатной
температуре в течение 20-25 мин, или в термостате при 37° С в течение 15
мин.
Промывают стекло в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают
дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
На высушенный мазок наносят каплю монтирующей жидкости, мазок
накрывают покровным стеклом и микроскопируют с использованием
люминесцентного микроскопа или люминесцентной насадки к обычному
оптическому микроскопу.
Рис. 4. Пневмококки, выявленные РИФ (люминесцентная микроскопия).
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)
Иммуноферментный анализ или метод – выявление антигенов с помощью
соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой. После
соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь
добавляют субстрат-хромоген. Субстрат расщепляется ферментом иизменяется
цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорциональна
количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для
диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности
для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения
гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически
активных веществ, содержащихся в исследуемом материале.
Рис. 5. Иммуноферментный анализ (ИФА) (схема).
Рис. 6. Результат ИФА. Желтый цвет раствора в лунке яляется положительным результатом.
Использование ИФА в диагностике инфекционных болезней.
ИФА эффективно применяется для лабораторной диагностики сравнительно большого круга
инфекционных болезней. При этом, используя различные модификации метода, можно
одновременно проводить обнаружение антигенов и антител, что значительно повышает
результативность исследования.
В литературе накопились многочисленные данные, свидетельствующие о широком применении
ИФА при выявлении антител и антигенов в отношении почти всех из известных групп вирусов и
бактерий, вызывающих заболевания животных: инфекционный бурсит кур (Джавадов Э., и
другие,1993), инфекционный ринотрахеит крупого рогатого скота (Кузнецов В. и др.,1991),
вирусная диарея (Красочко П. и др., 1991), болезнь Ауески (Мищенко В. и др.,1994), бешенство
(Сазонова Э. и др.,1991), болезнь Ньюкасла (Cилаева Н. и др., 1991), инфекционный
ларинготрахеит (Atiduk C. et al.,1989) и многих других.
В настоящее время ИФА разработан при бруцеллезе, столбняке, сальмонеллезе, паратуберкулезе,
лептоспирозе и практически при всех, имеющих эпизоотологическое и экономическое значение,
вирусных болезнях сельскохозяйственных животных.
Достаточно много работ опубликовано по обнаружению специфических антител в сыворотке
крови при микоплазменных инфекциях сельскохозяйственных животных.
Большинство авторов отмечают простоту постановки, экономичность и быстроту получения ответа
при использовании ИФА, результаты которого коррелируют со многими общепринятыми
серологическими методами (РНГА, РДП, РА, ВИЭОФ), но превосходят их по чувствительности,
сохраняя при этом высокую специфичность.
Компоненты реакции, условия их приготовления и применения
^ Буферные растворы

0,02М фосфатный буферный раствор (ФБР), рН 7,2 (5,155 г Na2HPO4*12H2O и 0,761 г KH2PO4
растворяют в 1 литре дистиллированной воды);

0,05М карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,6 (0,795 г Na2CO3 и 1,465 г NaHCO3 в 500 мл
дистиллированной воды);

МФБР рН 7,4 с 0,5 % твина 20 (8,0 г NaCl, 0,2 г KH2PO4 и 2,9 г Na2HPO4 и 0,8 мл твина 20
растворяют в 1 литре дистиллированной воды);

Физиологический раствор рН 7,3 с 0,05% твина 20 (на 1 литр физиологического раствора
добавляют 0,8 мл твина 20);

Барбиталовый буфер рН 7,4
(125,5 г NaCl, 15,3 г Na 5,5 диэтилбарбитурата, 51,9 мл 1H раствора HCl, 1,53 г MgCl2*6H2O и
0,492 г CaCl2*6H2O растворяют в 3 литрах дистиллированной воды)

0,001М ацетатный буфер рН 4,3 – 4,4 (0,136 г CH3COONa*3H2O растворяют в 1 литре
дистиллированной воды и подкисляют ледяной уксусной кислотой до указанного
значения рН).
Реактивы.

Субстрат: 5-аминосалициловая кислота (5-АС). 5-АС растворяют в горячей
дистиллированной воде (70°C) в концентрации 0,8 мг/мл, охлаждают до 20-22°С и доводят
рН до 6 0,1N раствором едкого натра (NaOH);

30%-ный раствор перекиси водорода (Н2О2): хранят при +4°С в склянке из темного стекла;

Субстратная смесь: готовят непосредственно перед добавлением в лунки пластин
смешиванием растворов 5-АС и 30%-ного раствора Н2О2 (к 20 мл 5-АС добавляют 0,020 мл
30 %-ного Н2О2);

1N раствор едкого натра (NaOH): 10г NaOH растворяют в 250 мл дистиллированной воды;

1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА): 1г БСА растворяют в 100 мл
0,02М ФБР, рН 7,2;

0,1М раствор периодата натрия (NаIO4): 53,5 мг NаIO4 растворяют непосредственно перед
применением в 2,5 мл дистиллированной воды;

Раствор борогидрида натрия (NaBH4): 20 мг NaBH4 растворяют в 5 мл дистиллированной
воды.
Оборудование.
Для приготовления необходимых ингредиентов и постановки ИФА используется следующее
основное оборудование:

автоматические пипетки с регулируемым объемом модели Р-20, Р-200, Р-1000 и Р-5000
(фирма Gilson, Франция);

автоматические пипетки с постоянным объемом модели F-10 – F-100 (фирма Gilson,
Франция);

4-8-12 канальные автоматические пипетки с постоянным и регулируемым объемом
модели 50 – 200 (фирма Flow Laboratories, Англия);

спектрофотометр типа Titertek Multiskan (фирма Flow Laboratories, Англия);

система для жидкостной хроматографии (фирма Pharmacia-LKB, Швеция);

прибор для электрофореза модель GS-411 (фирма, Pharmacia-LKB, Швеция);

холодильник, термостат, рН-метр (Россия);

лабораторная посуда.
Твердая фаза.
Для твердофазного ИФА используется множество различных носителей, к которым сорбционно
или, реже, ковалентно присоединяются соответствующие антигены и антитела. В ранних работах
носителями служили частицы сефарозы, целлюлозы, биогель, латекс, пористое стекло, силохромы
и другие.
Наиболее широкое распространение получил метод физической адсорбции на поверхности
полистирольных пластин с 96 лунками. Количество адсорбированного вещества при этом зависит
от многих факторов: природы и дозы сенситина, рН, времени сенсибилизации, температуры
инкубации. Удобно заранее заготовить панели с адсорбированным на них белком и хранить их в
холодильнике до употребления. Можно также длительно сохранять сенсибилизированные
панели при – 70°С.
На сегодняшний день широко используются полистироловые пластины зарубежных фирм (Cooke,
Dynateck; Linbro; Flow и другие), ленин-градского завода «Медполимер» и производства ВНИИ
медтехники.
При получении новой партии пластин необходимо проверять их сорбционную емкость. Для этого
отбирают несколько и в каждую лунку вносят по 0,2 мл 5-кратных разведений нормальных бычьих
иммуноглобулинов (от 10 до 1000 мкг/мл). После инкубации в течении 16 часов при температуре
20-22°С и последующего отмывания в лунки на 20 минут вносят по 0,2 мл 1%-ного раствора
овальбумина. Затем пластины отмывают и добавляют рабочее разведение антивидового
(антибычьего) пероксидазного конъюгата на 50 минут при 37°С. Если при данных
сенсибилизирующих дозах иммуноглобулинов оптическая плотность после добавления субстрата
составляет примерно 1,0, то считают, что сорбционная емкость этих пластин удовлетворительная.
При этом разброс показателей параллельных образцов не должен превышать 10 %.
Фермент.
Ферменты представляют собой очень удобные метки потому, что их каталитические свойства
позволяют действовать им в качестве усилителей, т. к. одна молекула фермента может
способствовать образованию более 1·105 молекул продукта каталитической реакции в минуту
(Johuson K. et al., 1980). Выбор фермента-метки диктуется не только свойствами самого фермента
и условиями опыта, но также склонностью автора, выбирающего наиболее доступный и
подходящий для себя фермент.
Фермент, выбираемый для метки антител, должен соответствовать следующим нескольким
требованиям:
быть относительно дешевым;
хорошо растворяться в воде;
сохранять стабильную активность;
иметь свободные реакционно-способные группы (например, –NH2, COOH, или –SH) для
связывания с иммунологически активной молекулой.
Для постановки ИФА различными авторами наиболее часто использовались такие ферменты как
пероксидаза, щелочная фосфатаза, ацетилхолинэстераза, галактозидаза, глюкозооксидаза и
другие.
Нельзя рекомендовать какой-либо один фермент; у каждого есть свои недостатки и достоинства,
поэтому выбор фермента зависит не только от перечисленных выше качеств, но и конкретных
целей и способов исследования.
Наиболее часто используют в ИФА пероксидазу, которая широко дос-тупна и не так дорога, как
другие ферменты, стабильна при хранении. Пе-роксидаза является гликопротеидом (Мол. масса
40000), содержит 18% углеводов. Углеводная часть ее не проявляет энзиматической активности и
поэтому может служить местом для прикрепления к ней белков (8 точек).
Препараты пероксидазы производят ряд зарубежных фирм (Serva, ФРГ; Fluka, Швейцария),
налажен также выпуск отечественной пероксида-зы. Ферменты этих фирм, как и препарат
отечественного производства, являются высокоочищенными, высокоактивными и их можно
непосредственно использовать в работе.
Субстрат.
Выбор субстрата для выявления активности связанного фермента в системе «антиген-антитело»
зависит от вида фермента-метки, так как реакция фермента с субстратом весьма специфична.
Кроме того, желательно использовать субстраты, позволяющие проводить визуальный и
инструментальный учет реакции. С этой точки зрения, наиболее подходящи, так называемые,
хромогенные субстраты, растворы которых, изначально бесцветные, в процессе ферментативной
реакции приобретают окраску, интенсивность которой пропорциональна количеству фермента.
Для выявления активности пероксидазы в твердофазном ИФА в качестве субстрата чаще всего
используют 5-аминосалициловую кислоту, образующую интенсивное коричневое окрашивание,
орто-фенилендиамин, дающий оранжево-желтое окрашивание, и ABTS, дающий окраску цвета
морской волны. Для выявления активности щелочной фосфатазы и (b-галактозидазы используется
исключительно нитрофенил-фосфаты и нитрофенил-галактозиды, соответственно.
Для повышения чувствительности ИФА предложен субстрат, дающий при расщеплении продукт,
обладающий способностью к флюоресценции (Prouovost E et al.,1981). В этом случае, даже
минимальная степень преобразования субстрата может быть зарегистрирована
высокочувствительным прибором – флюориметром.
Выделение иммуноглобулинов и методы контроля их чистоты, активности и специфичности
Сыворотка, полученная от животных, помимо широкого набора антител содержит и «балластные»
белки, способные адсорбироваться на твердом носителе, мешать связыванию антител и
значительно снижать чувствительность и специфичность реакции. Во избежании этого исходную
антисыворотку очищают с помощью 2 – 3-кратного осаждения сульфатом аммония,
полиэтиленгликолем (Berqquist N. et al., 1970) или каприловой кислотой (Steiubuch W. et al.,1969) с
последующим фракционированием белков гельфильтрацией (Остерман Л.,1985).
В своей повседневной работе для получения иммуноглобулинов из сыворотки кролика и крупного
рогатого скота предварительно выделяли гамма-глобулиновую фракцию белка: из кроличьей
антивидовой сыворотки 3-х кратным высаливанием сульфатом аммония при 35 % -ном
насыщении, а из сыворотки крупного рогатого скота – 2-х кратным высаливанием при 45 %-ном
насыщении.
15 – 20 мл раствора высаленных глобулинов (30-40 мг/мл) вносили в колонку (диаметр 2,6 см,
длина 100 см) с Ультрогелем АсА-34 для выделения иммуноглобулинов класса G методом
двукратной гельфильтрации. В качестве элюирующего раствора использовали 0,25 М раствор NaCl
на 0,01М ФБР, рН 8,0, при скорости элюции 30 мл/час. Выход белка их колонки регистрировали на
проточном спектрофотометре (иммуноглобулины G содержатся во фракциях второго пика,
которые объединяют: концентрируют высаливанием и вновь подвергают гельфильтрации). После
второго цикла гельфильтрации получали один пик белка. Полученый материал концентрировали
сульфатом аммония при 50 % насыщении и диализовали против дистиллированной воды в
течение 2-х суток, сменяя воду не менее 4-6 раз. Степень освобождения от ионов сульфата
контролировали 10 % -ным раствором BaCl2. Активность препаратов иммуноглобулинов из
кроличьей антисыворотки проверяли в РДП (не ниже 1:64), а из специфической сыворотки
крупного рогатого скота – в непрямом методе ИФА (не ниже 1:1600) чистоту фракций
контролировали при помощи иммуноэлектрофореза (ИЭФ).
Техника постановки распространенных вариантов ИФА
Известно значительное число модификаций постановки ИФА в зависимости от природы
определяемых веществ и целей исследования. Все методы ИФА подразделяются на две основные
группы: гомогенные и гетерогенные методы ИФА. Первые характеризуются тем, что вся
совокупность иммунологических и ферментативных реакций происходит в единой смеси всех
используемых компонентов реакции без их разделения и удаления промежуточных продуктов и
не прореагировавших компонентов. Для вторых характерно проведение анализа на твердой фазе
в виде последовательных стадий, причем после каждой стадии происходит отмывка твердой фазы
и, соответственно, удаление промежуточных продуктов и избытка не прореагировавших
компонентов. Необходимо отметить, что гомогенные методы анализа очень сложны в отработке
оптимальных условий их проведения и используются практически только для определения
низкомолекулярных гормонов, метаболитов и лекарственных веществ. Гетерогенные же методы
ИФА более просты и воспроизводимы и поэтому стали широко использоваться для качественного
и количественного выявления высокомолекулярных веществ и получили широкое
распространение в диагностике инфекционных болезней человека и животных.
Наиболее простыми и часто употребляемыми в диагностике вариантами твердофазного ИФА для
определения антител и антигенов являются: непрямой метод и метод ингибирования – для
выявления антител; метод «двойных» антител (сандвич) для выявления антигенов.
Рис 1.^ Непрямой метом/span>
Непрямой метод.
Данный вариант ИФА проводят с использованием антивидовых конъюгатов. Наиболее
распространенными антивидовыми коньюгатами являются меченые ферментом антитела
кролика, иммунизированного глобулинами других видов млекопитающих (например, крупного
рогатого скота), меченые антитела осла, иммунизированного иммуноглобулинами кролика и т. д.
Данный подход позволяет решить проблемы серодиагностики заболеваний животных, используя
ограниченный набор антивидовых иммуноферментных конъюгатов, что значительно облегчает
задачу производства реагентов для ИФА.
Непрямой твердофазный метод ИФА ставили по следующей схеме (рис.1):
пластины сенсибилизировали в течение 16 – 18 часов при 20 – 22°С специфическим
антигеном в концентрации 15-20 мкг/мл в 0,05М карбонатном буфере рН 9,6;
не связанные адсорбционно активные центры на полистироле пластин блокировали 1%
раствором БСА на 0,02М ФБР рН 7,2 с 0,05 % твина 20 при инкубировании в течении 45
минут при 37°С;
исследуемые сыворотки в последовательных разведениях на ФБР-твин вносили в лунки,
сенсибилизированные антигеном;
антивидовой конъюгат вносили в лунки в рабочем разведении 1:1000 – 1:2000 в ФБР рН
7,4 с 0,05 твина 20, инкубировали в течение 45 минут при 37°С;
вносили субстратную смесь и выдерживали пластины при 20-22°С в течение 30 минут для
визуального или инструментального учета.
Все компоненты реакции вносили в объеме 0,2
мл. После каждого этапа (внесения реактантов в лунки) пластины отмывали физиологическим
раствором рН 7,3 с 0,05 % твина 20. Для этого лунки заполняли этим раствором, встряхивали и
содержимое выливали, повторяли отмывание до 3-х раз.
При постановке реакции использовали контроли:
контроль субстрата: в I-й ряд сенсибилизированной пластины вносили только субстратную смесь,
в промежуточные этапы – ФБР рН с 0,05% твина 20. Субстратный контроль использовали в
качестве нулевого в показаниях спектрофотометра;
контроль коньюгата: во 2-й ряд сенсибилизированной пластины вместо сыворотки вносили ФБР
рН 7,4 с 0,05 % твина 20. Контроль коньюгата выявляет неспецифическое связывание коньюгата с
антигеном;
положительный контроль: положительную сыворотку крови крупного рогатого скота в разведении
1:400 в ФБР рН с 0,05 % твина 20 вносили в 2 лунки 3-го ряда сенсибилизированной пластины;
отрицательный контроль: нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота в разведении
1:400 в ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина 20 вносили в 2 лунки 3-го ряда сенсибилизированной пластины
(Барышников П.,1995).
^ Твердофазный «сандвич»–вариант ИФА.
Этот вариант ИФА является крайне распространенным для определения антигенов, обладающих
более чем одной распознаваемой антителами детерминантой. В процессе анализа антиген как бы
«зажат» между молекулами антител, что и обусловило название метода «сандвич». Это название
теперь используется практически во всей литературе на правах официального термина.
Данный вариант ИФА ставили по следующей схеме (рис.2):
полистироловые пластины сенсибилизируют в течении 16-18 часов при 20-22°С
иммуноглобулинами в концентрации 5-10 мкг/лунку в 0,05-0,1 М карбонатном буфере рН
9,0-9,5;
наслаивают 1% раствор БСА на 0,02М ФБР рН7,2 выдерживают в течение 45 минут при
37°С;
исследуемые пробы антигенов наслаивают в ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина-20, выдерживают
45 минут при 37°С;
наслаивают конъюгат в рабочем разведении 1:400 в ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20,
выдерживают 45 минут при 37°С;
вносят субстратную смесь и пластины выдерживают при 20-22°С в течение 15-20 минут для
визуального и инструментального учета.
Все компоненты реакции вносят в объеме 0,2 мл. После каждого этапа пластины отмывают
физиологическим раствором рН 7,3 с 0,05% твина 20. Для этого лунки заполняют этим раствором,
встряхивают и выливают содержимое, затем вновь повторяют отмывание до 3-х раз.
При постановке реакции использовали контроли:
контроль субстрата: в 1-й ряд сенсибилизированной пластины вносят только субстратную
смесь, в промежуточные этапы ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20.Субстратный контроль
используется в качестве нулевого в показаниях спектрофотометра;
контроль конъюгата: во 2-й ряд сенсибилизированной пластины вместо антигена, вносят
ФБР рН 7,4 с 0,05 % твина 20. Контроль конъюгата выявляет неспецифическое связывание
конъюгата с сенсибилизированной пластиной;
положительный контроль: специфический антиген в ФБР рН 7,4 с 0,05% твина 20 вносят в 2
лунки 3-го ряда сенсибилизированной пластины.
Основным достоинством «сандвич» – варианта является высокая чувствительность,
превышающая возможности других схем твердофазного ИФА. Эффективность
образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы
связывания реакции антиген-антитело и концентрации компонентов. При данной
величине константы связывания и крайне низких концентрациях антигена
рассматриваемый метод дает возможность сдвигать равновесие в сторону образования
специфических комплексов за счет использования избытка иммобилизированных и
меченых
ферментом
антител.
Ограничением применения «сандвич»варианта ИФА является невозможность определения моновалентных антигенов –
стероидных
гормонов,
лекарств,
пестицидов
и
т.д.
(Дзантиев
Б.,1985).
Рис.
2
^
Твердофазный
«сандвич»–вариант
ИФА.
Полимеразная
цепная
реакция
Спортивным
мужчинам Только оригинальные бренды. Кроссовки
и кеды. lamoda.kz Финальная распродажа Теперь
iPh-8 -50% только 3 дня! coolshoping.net 37 400
тенге
Коллекция
осень-зима
Стильная
и
качественная женская обувь. Доставка с примеркой.
lamoda.kz Новинки осени -30% Не сомневайтесь заказывайте прямо сейчас! lamoda.kz Скидка 30%
Кроссовки и кеды Актуальные модели. lamoda.kz от
2 799 тенге "Полимеразная цепная реакция"
Содержание 1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2. Принцип метода полимеразной цепной реакции
2.1 Наличие в реакционной смеси ряда компонентов
2.2 Циклический температурный режим 2.3
Основные принципы подбора праймеров 2.4 Эффект
"плато" 3. Cтадии постановки ПЦР 3.1 Подготовка
пробы биологического материала 3.2 Амплификация
3.3 Оценка результатов реакции 3.3.1 Метод
горизонтального
электрофореза
3.3.2
Метод
вертикального электрофореза 3.4 Контроль за
прохождением
реакции
амплификации
3.4.1
Положительные
контроли
3.4.2
Внутренние
контроли 4. Методы, основанные на полимеразной
цепной реакции 4.1 Качественный анализ 4.1.1
Способ постановки ПЦР с использованием “горячего
старта" 4.1.2 Детекция молекул РНК 5. Организация
технологического
процесса
постановки
ПЦР
Заключение 1. Полимеразная цепная реакция
(ПЦР) Полимеразная цепная реакция - это метод,
имитирующий естественную репликацию ДНК и
позволяющий
обнаружить
единственную
специфическую молекулу ДНК в присутствии
миллионов других молекул. Открытие метода
полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало одним
из наиболее выдающихся событий в области
молекулярной биологии за последнее десятилетие.
Это позволило поднять медицинскую диагностику
на качественно новый уровень. Впервые состав
ингредиентов, входящих в реакционную смесь для
постановки полимеразной цепной реакции, и
основные принципы использования праймеров
(коротких искусственно синтезированных молекул
ДНК) для получения копий ДНК были описаны
Kleppe с соавт. в 1971 году. Однако тогда еще не
была продемонстрирована основная черта ПЦР экспоненциальное увеличение количества копий
фрагмента исходной ДНК как результат реакции. В
1983 году Kary Mullis предложил метод, ставший в
дальнейшем известным как полимеразная цепная
реакция. Суть метода заключается в многократном
копировании
(амплификации)
в
пробирке
определенных
участков
ДНК
в
процессе
повторяющихся температурных циклов. На каждом
цикле амплификации синтезированные ранее
фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой.
Благодаря
этому
происходит
многократное
увеличение количества специфических фрагментов
ДНК в миллиарды раз, что значительно упрощает
дальнейший анализ. В этот период были
обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие
в гейзерах. Их ферментная система, в частности
ДНК-полимераза,
выдерживает
высокие
температуры горячих источников и сохраняет свою
биологическую активность вплоть до 95° С, что
является необходимым условием для проведения
полимеразной
цепной
реакции.
Результатом
открытия
ПЦР
стало
почти
немедленное
практическое применение метода. Перспективы
практического использования ПЦР-диагностики В
настоящее время наиболее быстро развиваются
пять основных направлений генодиагностики:
диагностика
инфекционных
заболеваний;
диагностика
онкологических
заболеваний;
диагностика лейкемий и лимфом; диагностика рака
груди;
диагностика
других
злокачественных
заболеваний;
диагностика
генетических
заболеваний; идентификация личности; судебная
медицина,
криминалистика;
трансплантация
органов и тканей; определение отцовства;
диагностика патогенов в пище. 2. Принцип метода
полимеразной цепной реакции Полимеразная
цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК
in vitro, с помощью которого в течение нескольких
часов можно выделить и размножить определённую
последовательность ДНК в миллиарды раз.
Возможность получения огромного количества
копий одного строго определённого участка генома
значительно упрощает исследование имеющегося
образца ДНК. Для проведения полимеразной
цепной реакции необходимо соблюдение ряда
условий. 2.1 Наличие в реакционной смеси ряда
компонентов
Праймеры - пара искусственно
синтезированных олигонуклеотидов, имеющих, как
правило, размер от 15 до 30 п. н., идентичные
соответствующим участкам ДНК-мишени. Они
играют ключевую роль в образовании продуктов
реакции амплификации. Правильно подобранные
праймеры
обеспечивают
специфичность
и
чувствительность тест-системы. Taq-полимераза термостабильный
фермент,
обеспечивающий
достраивание 3’-конца второй цепи ДНК согласно
принципу
комплементарности.
Смесь
дезоксинуклеотидтрифосфатов
(дНТФ)
дезоксиаденозинтрифосфат
(дАТФ),
дезоксигуанозинтрифосфат
(дГТФ),
дезоксицитозинтрифосфат
(дЦТФ)
и
дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) - "строительный
материал", используемый Taq-полимеразой для
синтеза второй цепи ДНК; Буфер - смесь катионов и
анионов
в
определенной
концентрации,
обеспечивающих
оптимальные
условия
для
реакции, а также стабильное значение рН;
Анализируемый образец - подготовленный к
внесению в реакционную смесь препарат, который
может содержать искомую ДНК, служащую
мишенью
для
последующего
многократного
копирования (например, ДНК микроорганизмов).
При
отсутствии
ДНК-мишени
специфический
продукт амплификации не образуется.
2.2
Циклический температурный режим Если в
анализируемом образце присутствует искомая ДНК,
то в процессе реакции амплификации с ней
происходит
ряд
событий,
обеспечиваемых
определенными температурными циклами. Каждый
цикл амплификации состоит из трех этапов. 1.
Денатурация. На первом этапе необходимо
денатурировать ДНК, находящуюся в образце. Для
этого реакционную смесь нагревают до 92-95° С, в
результате чего двухцепочечные молекулы ДНК
расплетаются с образованием двух одноцепочечных
молекул. Этот процесс длится не менее 1 минуты. 2.
Отжиг. На втором этапе температуру смеси
понижают до 55°С праймеры присоединяются к
одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры выбирают
так, что они ограничивают искомый фрагмент и
комплементарны противоположным цепям ДНК.
Отжиг происходит в соответствии с правилом
комплементарности Чаргаффа. После отжига
праймеров Taq-полимераза начинает достраивание
второй цепи ДНК, начиная с 3’-конца праймера. 3.
Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в
реакционной смеси доводят до оптимума работы
Taq-полимеразы - 75°С, и начинается синтез
комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3’гидроксильной группой праймера, с максимальной
эффективностью. Иногда, в случае близкого
значения температуры отжига праймеров к
температуре
оптимума
работы
фермента,
становится возможным использовать двухстадийный
цикл ПЦР, совместив две стадии - отжиг и
элонгацию - в одной. В дальнейшем этапы
денатурации, отжига и элонгации многократно
повторяются (30 и более раз). На каждом цикле
количество синтезированных копий фрагмента ДНК
удваивается. Фактически значение эффективности
отдельных циклов амплификации составляет, по
некоторым данным, 78-97%. В случае присутствия в
пробе ингибиторов реакции это значение может
быть намного меньше. Все реакции проводят в
пробирках, погруженных в термостат. Смена
температурного режима и его поддержание
осуществляется автоматически. Каждый цикл
обычно длится 3 - 5 минут. Первый цикл. ДНКмишень
фланкирована
определенными
последовательностями. К образцу ДНК добавляют
праймеры (Р1 и Р2), ДНК-полимеразу Tag и четыре
дНТФ. Здесь каждая из новосинтезированных цепей
имеет гораздо большую длину, чем расстояние от
3’-гидроксильной группы "её" праймера до
концевого
нуклеотида
последовательности,
комплементарной второму праймеру. Такие цепи
называют "длинными матрецами", именно на них
будет идти дальнейший синтез. Эти цепи служат
матрицами во втором раунде ПЦР. Во втором цикле
двухцепочечную ДНК, состоящую из исходной и
новосинтезированной ("длинная матрица") цепей,
вновь денатурируют, а затем отжигают с
праймерами. При отжиге праймеры гобридизуются с
комплементарными им участками как исходных
цепей, так и "длинных матриц", синтезированных в
первом цикле. В результате ферментативного
синтеза на исходных цепях синтезируются "длинные
матрицы", а на "длинных матрицах" - "короткие", с
праймером
на
одном
конце
и
с
последовательностью, комплементарной второму
праймер, на другом. В третьем цикле все
гетеродуплуксы,
образовавшиеся
ранее,
одновременно подвергаются денатурации и отжигу
с праймерами, а затем реплецируются. При отжиге
праймеры гибридизуются с комплементарными
участками исходных цепей, а также "длинных" и
"коротких" матриц. При ферментативном синтезе in
vitro на исходных цепях синтезируются "длинные
матрицы", а на "длинных" и "коротких" матрицах только "короткие матрицы". В послудующих циклах
число "коротких матриц" становится все больше.
Таким
образом,
специфические
фрагменты,
ограниченные на концах праймерами, впервые
появляются в конце второго цикла, накапливаются
в геометрической прогрессии и очень скоро
начинают
доминировать
среди
продуктов
амплификации. 2.3 Основные принципы подбора
праймеров При создании ПЦР-тест-системы одной
из основных задач является правильный подбор
праймеров, которые должны отвечать ряду
критериев: 1. Праймеры должны быть специфичны.
Особое внимание уделяют 3’-концам праймеров, т.к
именно
с
них
начинает
достраивать
комплементарную цепь ДНК Taq-полимераза. Если
их специфичность недостаточна, то, вероятно, что в
пробирке с реакционной смесью будут происходить
нежелательные процессы, а именно, синтез
неспецифической ДНК (коротких или длинных
фрагментов). Она видна на электрофорезе в виде
тяжелых или легких дополнительных полос. Это
мешает оценке результатов реакции, т.к легко
перепутать специфический продукт амплификации
с синтезированной посторонней ДНК. Часть
праймеров и дНТФ расходуется на синтез
неспецифической
ДНК,
что
приводит
к
значительной
потере
чувствительности.
2.
Праймеры не должны образовывать димеры и
петли, т.е. не должно образовываться устойчивых
двойных цепей в результате отжига праймеров
самих на себя или друг с другом.
2.4 Эффект
"плато" Следует заметить, что процесс накопления
специфических
продуктов
амплификации
по
геометрической
прогрессии
идет
лишь
ограниченное время, а затем его эффективность
критически падает. Это связано с так называемым
эффектом "плато". Термин эффект “плато”
используют для описания процесса накопления
продуктов ПЦР на последних циклах амплификации.
В зависимости от условий и количества циклов
реакции амплификации, на момент достижения
эффекта “плато” влияют утилизация субстратов
(дНТФ и праймеров), стабильность реактантов
(дНТФ и фермента), количество ингибиторов,
включая
пирофосфаты
и
ДНК-дуплексы,
конкуренция за реактанты неспецифическими
продуктами или праймер-димерами, концентрация
специфического продукта и неполная денатурация
при
высокой
концентрации
продуктов
амплификации.
Чем
меньше
начальная
концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода
реакции на “плато". Этот момент может наступить
до того, как количество специфических продуктов
амплификации будет достаточно, чтобы их можно
было проанализировать. Избежать этого позволяют
лишь хорошо оптимизированные тест-системы. 3.
Cтадии постановки ПЦР 3.1 Подготовка пробы
биологического материала Для выделения ДНК
используют различные методики в зависимости от
поставленных задач. Их суть заключается в
экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и
удалении или нейтрализации посторонних примесей
для получения препарата ДНК с чистотой,
пригодной для постановки ПЦР. Стандартной и
ставшей уже классической считается методика
получения чистого препарата ДНК, описанная
Мармуром. Она включает в себя ферментативный
протеолиз с последующей депротеинизацией и
переосаждением ДНК спиртом. Этот метод
позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако
он довольно трудоемок и предполагает работу с
такими агрессивными и имеющими резкий запах
веществами, как фенол и хлороформ. Одним из
популярных в настоящее время является метод
выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами.
Этот метод основан на использовании для лизиса
клеток сильного хаотропного агента - гуанидина
тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК
на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля,
стеклянное "молоко" и. т.д.). После отмывок в
пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с
которого она легко снимается с помощью
элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен
и
пригоден
для
подготовки
образца
к
амплификации. Однако возможны потери ДНК
вследствие необратимой сорбции на носителе, а
также в процессе многочисленных отмывок.
Особенно большое значение это имеет при работе с
небольшими количествами ДНК в образце. Кроме
того, даже следовые количества GuSCN могут
ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании
этого метода очень важен правильный выбор
сорбента
и
тщательное
соблюдение
технологических нюансов. Другая группа методов
пробоподготовки основана на использовании
ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от
стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси,
мешающие реакции. Как правило, эта технология
включает две стадии: кипячение образца и сорбция
примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно
привлекателен
простотой
исполнения.
В
большинстве случаев он пригоден для работы с
клиническим материалом. К сожалению, иногда
встречаются образцы с такими примесями, которые
невозможно удалить с помощью ионообменников.
Кроме того, некоторые микроорганизмы не
поддаются разрушению простым кипячением. В
этих случаях необходимо введение дополнительных
стадий обработки образца. Таким образом, к выбору
метода пробоподготовки следует относиться с
пониманием целей проведения предполагаемых
анализов. 3.2 Амплификация Для проведения
реакции амплификации необходимо приготовить
реакционную смесь и внести в нее анализируемый
образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые
особенности отжига праймеров. Дело в том, что,
как правило, в анализируемом биологическом
образце присутствуют разнообразные молекулы
ДНК, к которым используемые в реакции праймеры
имеют частичную, а в некоторых случаях
значительную, гомологию. Кроме того, праймеры
могут отжигаться друг с другом, образуя праймердимеры. И то, и другое приводит к значительному
расходу
праймеров
на
синтез
побочных
(неспецифических) продуктов реакции и, как
следствие,
значительно
уменьшает
чувствительность системы. Это затрудняет или
делает невозможным чтение результатов реакции
при проведении электрофореза. 3.3 Оценка
результатов реакции Для правильной оценки
результатов ПЦР важно понимать, что данный
метод не является количественным. Теоретически
продукты амплификации единичных молекул ДНКмишени могут быть обнаружены с помощью
электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на
практике это выполняется лишь в случаях, когда
реакция проходит в условиях, близких к идеальным,
что в жизни встречается не часто. Особенно
большое влияние на эффективность амплификации
оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е.
наличие в реакционной смеси тех или иных
ингибиторов, от которых избавиться в некоторых
случаях бывает крайне сложно. Иногда, из-за их
присутствия не удается амплифицировать даже
десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким
образом,
прямая
связь
между
исходным
количеством ДНК-мишени и конечным количеством
продуктов амплификации часто отсутствует. 3.3.1
Метод
горизонтального
электрофореза
Для
визуализации
результатов
амплификации
используют
различные
методы.
Наиболее
распространенным на сегодняшний день является
метод электрофореза, основанный на разделении
молекул ДНК по размеру. Для этого готовят
пластину агарозного геля, представляющего собой
застывшую после расплавления в электрофорезном
буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с
добавлением
специального
красителя
ДНК,
например, бромистого этидия. Застывшая агароза
образует пространственную решетку. При заливке с
помощью гребенок в геле формируют специальные
лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты
амплификации. Пластину геля помещают в аппарат
для
горизонтального
гель-электрофореза
и
подключают источник постоянного напряжения.
Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться
в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие
молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На
скорость движения ДНК в геле влияет концентрация
агарозы, напряженность электрического поля,
температура, состав электрофорезного буфера и, в
меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы
одного размера движутся с одинаковой скоростью.
Краситель
встраивается
(интеркалирует)
плоскостными группами в молекулы ДНК. После
окончания электрофореза, продолжающегося от 10
мин до 1 часа, гель помещают на фильтр
трансиллюминатора,
излучающего
свет
в
ультрафиолетовом диапазоне (254 - 310 нм).
Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в
области 260 нм, передается на краситель, заставляя
его флуоресцировать в оранжево-красной области
видимого спектра (590 нм). Яркость полос
продуктов амплификации может быть различной.
Однако это нельзя связывать с начальным
количеством ДНК-мишени в образце. 3.3.2 Метод
вертикального электрофореза Метод вертикального
электрофореза
принципиально
схож
с
горизонтальным электрофорезом. Их отличие
заключается в том, что в данном случае вместо
агарозы используют полиакриламидные гели. Его
проводят в специальной камере для вертикального
электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном
геле имеет большую разрешающую способность по
сравнению
с
агарозным
электрофорезом
и
позволяет различать молекулы ДНК разных
размеров с точностью до одного нуклеотида.
Приготовление полиакриламидного геля несколько
сложнее агарозного. Кроме того акриламид
является
токсичным
веществом.
Поскольку
необходимость
определить
размер
продукта
амплификации с точностью до 1 нуклеотида
возникает редко, то в обычной работе используют
метод
горизонтального
электрофореза.
3.4
Контроль
за
прохождением
реакции
амплификации 3.4.1 Положительные контроли В
качестве "положительного контроля" используют
препарат
ДНК
искомого
микроорганизма.
Неспецифические
ампликоны
отличаются
по
размеру от ампликонов, образуемых в результате
амплификации с контрольным препаратом ДНК.
Размер неспецифических продуктов может быть как
большего, так и меньшего размера по сравнению с
положительным контролем. В худшем случае эти
размеры
могут
совпадать
и
читаются
в
электрофорезе как положительные. Для контроля
специфичности
образуемого
продукта
амплификации
можно
использовать
гибридизационные
зонды
(участки
ДНК,
расположенные
внутри
амплифицируемой
последовательности),
меченные
ферментными
метками или радиоактивными изотопами и
взаимодействующими с ДНК в соответствии с теми
же принципами, что и праймеры. Это значительно
усложняет и удлиняет анализ, а его стоимость
существенно увеличивается.
3.4.2 Внутренние
контроли
Необходимо
контролировать
ход
амплификации в каждой пробирке с реакционной
смесью.
Для
этой
цели
используют
дополнительный, так называемый "внутренний
контроль". Он представляет собой любой препарат
ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма.
Если внутренний контроль внести в реакционную
смесь, то он станет такой же мишенью для отжига
праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого
возбудителя
инфекции.
Размер
продукта
амплификации внутреннего контроля подбирают
таким образом, чтобы он был в 2 и более раз
больше,
чем
ампликоны,
образуемые
от
амплификации искомой ДНК микроорганизма. В
результате, если внести ДНК внутреннего контроля
в реакционную смесь вместе с испытуемым
образцом,
то
независимо
от
наличия
микроорганизма
в
биологическом
образце,
внутренний контроль станет причиной образования
специфических ампликонов, но значительно более
длинных (тяжелых), чем ампликон микроорганизма.
Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси
будет свидетельством нормального прохождения
реакции амплификации и отсутствия ингибиторов.
Если ампликоны нужного размера не образовались,
но не образовались также и ампликоны внутреннего
контроля, можно сделать вывод о наличии в
анализируемом образце нежелательных примесей,
от которых следует избавиться, но не об отсутствии
искомой ДНК. К сожалению, несмотря на всю
привлекательность такого подхода, у него есть
существенный изъян. Если в реакционной смеси
находится нужная ДНК, то эффективность ее
амплификации резко снижается из-за конкуренции
с внутренним контролем за праймеры. Это особенно
принципиально важно при низких концентрациях
ДНК в испытуемом образце, что может приводить к
ложноотрицательным результатам. Тем не менее,
при условии решения проблемы конкуренции за
праймеры, этот способ контроля эффективности
амплификации безусловно будет весьма полезен. 4.
Методы, основанные на полимеразной цепной
реакции 4.1 Качественный анализ Классический
способ постановки ПЦР, принципы которого были
изложены выше, нашел свое развитие в некоторых
модификациях, направленных на преодоление
ограничений ПЦР и повышение эффективности
прохождения реакции. 4.1.1 Способ постановки ПЦР
с использованием “горячего старта" Чтобы
уменьшить риск образования неспецифических
продуктов реакции амплификации, используют
подход, получивший название “горячий старт"
(“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении
возможности
начала
реакции
до
момента
достижения в пробирке условий, обеспечивающих
специфический отжиг праймеров. Дело в том, что в
зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры
имеют определенную температуру плавления (Tm).
Если температура системы превышает Тm, праймер
не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и
денатурирует. При соблюдении
оптимальных
условий, т.е. температуры отжига, близкой к
температуре
плавления,
праймер
образует
двухцепочечную молекулу только при условии его
полной комплементарности и, таким образом,
обеспечивает специфичность реакции. Существуют
различные варианты реализации "горячего старта":
Внесение в реакционную смесь Taq-полимеразы во
время первого цикла после прогрева пробирки до
температуры
денатурации.
Разделение
ингредиентов реакционной смеси парафиновой
прослойкой на слои (в нижней части - праймеры, в
верхней - Taq-полимераза и ДНК-мишени), которые
смешиваются при расплавлении парафина (~65750С). Использование моноклональных антител к
Taq-полимеразе.
Фермент,
связанный
моноклональными
антителами,
становится
активным лишь после стадии первой денатурации,
когда
моноклональные
антитела
необратимо
денатурируют и освобождают активные центры
Taq-полимеразы. Во всех перечисленных случаях,
даже если неспецифический отжиг произошел до
начала температурного циклирования, элонгации не
происходит, а при нагревании комплексы праймерДНК денатурируют, поэтому неспецифические
продукты
не
образуются.
В
дальнейшем
температура в пробирке не опускается ниже
температуры
плавления,
что
обеспечивает
образование
специфического
продукта
амплификации. 4.1.2 Детекция молекул РНК
Возможность использования РНК в качестве мишени
для
ПЦР
существенно
расширяет
спектр
применения этого метода. Например, геномы
многих вирусов (гепатит С, вирус инфлюэнцы,
пикорнавирусы и т.д.) представлены именно РНК.
При этом в их жизненных циклах отсутствует
промежуточная фаза превращения в ДНК. Для
детекции РНК необходимо в первую очередь
перевести ее в форму ДНК. Для этого используют
обратную транскриптазу, которую выделяют из двух
различных вирусов: avian myeloblastosis virus и
Moloney murine leukemia virus. Использование этих
ферментов связано с некоторыми трудностями.
Прежде всего, они термолабильны и поэтому могут
быть использованы при температуре не выше 42° С.
Так как при такой температуре молекулы РНК легко
образуют вторичные структуры, то эффективность
реакции заметно снижается и по разным оценкам
приблизительно равна 5%. Предпринимаются
попытки обойти этот недостаток используя в
качестве обратной транскриптазы термостабильную
полимеразу,
полученную
из
термофильного
микроорганизма
Thermus
Thermophilus,
проявляющего транскриптазную активность в
присутствии Mn2+. Это единственный известный
фермент, способный проявлять как полимеразную
так и транскриптазную активность. Для проведения
реакции обратной транскрипции в реакционной
смеси также как и в ПЦР должны присутствовать
праймеры в качестве затравки и смесь 4-х дНТФ,
как строительный материал. После проведения
реакции
обратной
транскрипции
полученные
молекулы кДНК могут служить мишенью для
проведения ПЦР 5. Организация технологического
процесса постановки ПЦР Потенциально высокая
чувствительность полимеразной цепной реакции
делает
совершенно
необходимым
особенно
тщательное устройство ПЦР-лаборатории. Это
связано с наиболее острой проблемой метода контаминацией. Контаминация - попадание из
внешней
среды
в
реакционную
смесь
специфических молекул ДНК, способных служить
мишенями в реакции амплификации и давать
ложноположительные
результаты.
Существует
несколько способов борьбы с этим неприятным
явлением. Одним из них является использование
фермента N-урацил-гликозилазы (УГ). В основе
этого метода лежит способность УГ расщеплять
молекулы ДНК со встроенным урацилом. Реакцию
амплификации проводят с использованием смеси
дНТФ, в которой дТТФ заменен на урацил, и после
термоциклирования все образующиеся в пробирке
ампликоны будут содержать урацил. Если до
амплификации в реакционную смесь добавить УГ,
то попавшие в реакционную смесь ампликоны будут
разрушены, тогда как нативная ДНК останется
целой и будет в дальнейшем служить мишенью для
амплификации. Таким образом, этот метод лишь в
некоторой степени позволяет устранить источник
контаминации
и
не
гарантирует
от
ложноположительных результатов. Другой способ
борьбы с результатами контаминации, значительное
уменьшение количества циклов реакции (до 25-30
циклов). Но даже при таком подходе риск
получения
ложноположительных
результатов
велик, т.к и в этом случае при отсутствии
ингибиторов легко получить продукт амплификации
из-за контаминации. Таким образом, несмотря на
пользу
преамплификационных
мероприятий,
направленных на инактивацию молекул ДНК,
служащих
причиной
возникновения
ложноположительных
результатов,
наиболее
радикальным
средством
является
заранее
продуманная
организация
лаборатории.
Заключение Самое широкое распространение метод
ПЦР в настоящее время получил как метод
диагностики
различных
инфекционных
заболеваний. ПЦР позволяет выявить этиологию
инфекции даже если в пробе, взятой на анализ,
содержится
всего
несколько
молекул
ДНК
возбудителя. ПЦР широко используется в ранней
диагностики ВИЧ-инфекций, вирусных гепатитов и
т.д. На сегодняшний день почти нет инфекционного
агента, которого нельзя было бы выявить с
помощью
ПЦР.