ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Естественные науки
УДК 579.61; 579.25
Попова Л.П., Уткина Т.М., Карташова О.Л.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения
Росскийской академии наук, Оренбург
Email:[email protected]
ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА STAPHYLOCCOCUS AUREUS, ВЫДЕЛЕННЫХ
ОТ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ РАЗНЫХ ТИПОВ
Изучены биологические свойства Staphylococcus aureus, выделенных от бактерионосителей
разных типов – антикарнозиновая активность, способность формировать биопленки, чувстви7
тельность к антибиотикам. Определены генетические детерминанты патогенности у «носительс7
ких» штаммов золотистых стафилококков – гены lukS и lukF, sec 3, clfA, clfB, agr и mecA. Установ7
лено что штаммы S.aureus, выделенные от резидентных бактерионосителей, чаще обладали ан7
тикарнозиновой активностью и способностью образовывать биопленки с более высокими зна7
чениями признаков, чем штаммы, выделенные от транзиторных. Данные признаки могут быть
использованы как эпидемиологические маркеры «носительских» штаммов стафилококков. Об7
наруженные детерминанты патогенности, вероятно, могут обуславливать возникновение эндо7
генных инфекций.
Ключевые слова: бактерионосители, Staphylococcus aureus, факторы персистенции, анти7
биотикорезистентность, генетические детерминанты патогенности.
Введение
Установлено, что стафилококковые бактери
оносители являются источниками эпидемиологи
ческой опасности. Условия формирования рези
дентного бактерионосительства связаны с нали
чием у стафилококковой микрофлоры особых
свойств, обеспечивающих ее адаптацию к услови
ям, складывающимся на слизистой оболочке пе
редних отделов носовых ходов, и таким образом,
ответственных за длительное сохранение микро
организма в данной экологической нише. Показа
но, что антилактоферриновая и sIgAпротеазная
активности, а также их комбинация, могут быть
использованы как эпидемиологические маркеры
«носительских» штаммов стафилококков [1]. Вме
сте с тем, ведущим свойством золотистых стафи
лококков, определяющим формирование бакте
рионосительства, является их антикарнозиновая
активность [2]. Кроме того установлено, что дли
тельное существование стафилококков в организ
ме хозяина обеспечивается их способностью фор
мировать биопленки [3]. Однако данные свойства
ранее не определялись в совокупности у штаммов
стафилококков, выделенных от бактерионосите
лей разных типов. Интерес представляет также
изучение антибиотикорезистентности и распро
страненности генетических детерминант патоген
ности среди штаммов стафилококков, вегетиру
ющих на слизистой оболочке переднего отдела
носа, как потенциальных возбудителей эндоген
ных инфекций.
В этой связи целью работы явилось изуче
ние биологических свойств стафилококков, выде
82
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
ленных от бактерионосителей разных типов, и
выявление у них генов – маркёров патогенности.
Материалы и методы
Трехкратно на наличие S.aureus исследова
но слизистое отделяемое переднего отдела носа
105 детей (912 лет), проживающих в с. Шар
лык Оренбургской области. Выделенные куль
туры идентифицировали по биохимическим
признакам с использованием тестсистем
«StaphyTest» («Lachema», Чехия). Персистент
ный потенциал культур оценивали по антикар
нозиновой активности (АКрА) [4] и способнос
ти к образованию биопленок (БО) [5]. Значе
ния биопленкообразования стафилококков вы
ражали в условных единицах (ед.), которые рас
считывали как отношение оптической плотно
сти изучаемой культуры (опыт) к оптической
плотности раствора в контроле. Устойчивость
к следующим антибиотикам: тетрациклину,
ципрофлоксацину, ванкомицину, оксациллину,
имипинему, левофлоксацину, амоксациллину,
цефалоспоринам 1, 3 и 4 поколения, гентами
цину и фузидину определяли по [6]. У 24 штам
мов S.aureus, выделенных от бактерионосителей
разных типов, дополнительно исследовали ге
нетические детерминанты патогенности (lukS
и lukF, sec 3, clfA, clfB, agr и mecA).
Выделение ДНК осуществляли из бактери
альной суспензии (107 КОЕ/мл) суточной ага
ровой культуры сорбционным методом с ис
пользованием набора «Рибосорб» («Интер
ЛабСервис», Россия) согласно рекомендации
Попова Л.П. и др.
Фенотипическая и генетическая характеристика...
производителя. Амплификацию проводили с
применением подобранных праймеров (табл.)
на термоциклере МС–16 «Терцик» («ДНКтех
нология», Россия). Продукты амплификации
генов анализировали путем электрофоретичес
кого разделения в 1,5% агарозном геле с исполь
зованием стандартных наборов «ЭФ» вариант
300 («ИнтерЛабСервис», Россия) в соответ
ствии с рекомендациями производителя. Амп
ликоны визуализировали бромистым этидием
при помощи фотодокументационной системы
Gel Camera System (UVP, Inc. США). Размер
амплифицируемых фрагментов определяли в
сравнении с маркерными последовательностя
ми (13 фрагментов от 0,25 до 10 Kb, «Сибэн
зим», Россия).
Статистическую обработку осуществляли
с использованием параметрических методов.
Достоверность различий оценивали по крите
рию Стьюдента [7].
Результаты
В работе нами изучены биологические свой
ства золотистых стафилококков, выделенных от
резидентных и транзиторных бактерионосителей.
При изучении распространенности АКрА
стафилококков было установлено, что штаммы,
выделенные от резидентных бактерионосителей,
чаще обладали способностью к инактивации кар
нозина по сравнению со штаммами, выделенны
ми от транзиторных (100% и 63%, соответствен
но). Причем среди стафилококков, выделенных
от резидентных бактерионосителей, 56% обла
дало максимальным уровнем признака, равным
3 мг/мл, 28% – в диапазоне от 1,5 до 2,9 мг/мл и
16% – 0,71,4 мг/мл. Среди стафилококков, вы
деленных от транзиторных бактерионосителей,
35% обладали максимальным уровнем призна
ка, 28% в диапазоне 1,52,9 мг/мл и 37% штаммов
не обладали изученной активностью.
При изучении выраженности АКрА было
показано, что среднее значение признака у ста
филококков, выделенных от резидентных бак
терионосителей, было в 1,4 раза выше по срав
нению со средними значениями признака у ста
филококков, выделенных от транзиторных
бактерионосителей (1,8 и 1,3 мг/мл, соответ
ственно, p<0,05).
Далее нами была изучена способность зо
лотистых стафилококков образовывать био
пленки. Штаммы золотистых стафилококков,
выделенных от резидентных бактерионосите
лей, в 49% случаев характеризовались способ
ностью к биопленкообразованию, тогда как для
стафилококков, выделенных от транзиторных
бактерионосителей, БО было характерно в
28,6% случаев. При этом выраженность призна
ка у штаммов, выделенных от резидентных бак
терионосителей, была равна 1,5 ед., а у штам
мов от транзиторных – 1,1 ед. (p<0,05).
При изучении чувствительности к 12 ан
тибиотикам разных групп было показано, что
штаммы S.aureus, выделенные как от резидент
ных, так и транзиторных бактерионосителей,
были высоко чувствительны к фторхинолонам
(ципрофлоксацин 95,3% и 93%, левофлоксацин
90,8% и 85,7%, соответственно), оксациллину
(100% и 100%), амоксациллину (58,6% и 57%);
цефалоспоринам 1 поколения (97,7% и 100%);
цефалоспоринам 3 поколения (100% и 93%);
цефалоспоринам 4 поколения (86,2% и 85,7%);
имипинему (100% и 100%); ванкомицину (95,4%
и 100%); гентамицину (95,4% и 100%); тетра
циклину (79,3% и 72%); фузидину (97,7% и
100%). Кроме того установлено, что штаммы
S.aureus от резидентных бактерионосителей
были резистентны к 8 изученным антибиоти
кам, тогда как штаммы, выделенные от транзи
торных бактерионосителей – к 7 антибиотикам.
Причем, в 4,6% случаев золотистые стафилокок
ки, выделенные от резидентных бактерионоси
телей, были резистентны к ванкомицину, тогда
как среди штаммов, выделенных от транзитор
ных бактериносителей, таких штаммов не заре
гистрировано. 93% штаммов, выделенных от
резидентных, и 100% – от транзиторных бакте
рионосителей оказались резистентными к ам
пициллину.
Далее нами проведено выявление фрагмен
тов ДНК S.aureus, специфичным соответствую
щим детерминантам факторов патогенности у
стафилококков, выделенных от резидентных и
транзиторных бактерионосителей.
Полученные результаты показали наличие
геноврегуляторов agr у всех штаммов стафи
лококков, выделенных от бактерионосителей
обоих типов. Все выделенные штаммы характе
ризовались наличием генов clfA и clfB.
У одного штамма, выделенного от транзи
торного бактерионосителя, определен ген па
тогенности lukS, у двух штаммов (по одному от
бактерионосителей обоих типов) – ген lukF, ко
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014
83
Естественные науки
дирующий синтез экзопротеина F цитолитичес
кого токсина PantonValentine лейкоцидина. Ген
sec 3, кодирующий синтез стафилококкового
энтеротоксина, определен у трех штаммов, вы
деленных от резидентных (2 штамма) и тран
зиторных (1 штамм) бактерионосителей. Вмес
те с тем, ни у одного из выделенных штаммов не
выявлены гены mecA.
Таким образом, в работе показано, что
штаммы S.aureus, выделенные от резидентных
бактерионосителей, чаще обладали АКрА и спо
собностью образовывать биопленки с более
высокими значениями признаков, чем штаммы,
выделенные от транзиторных. Данные призна
ки могут быть использованы как эпидемиоло
гические маркеры «носительских» штаммов
стафилококков. Кроме того важным моментом
является факт обнаружения детерминант пато
генности у штаммов золотистых стафилокок
ков, выделенных от бактерионосителей обоих
типов, что, вероятно, может обуславливать воз
никновение эндогенных инфекций.
8.10.2014
Работа выполнена при поддержке гранта 144НП121 «Научные проекты молодых ученых УрО РАН»
«Исследование механизмов генетического контроля персистенции S.аureus»
Список литературы:
1. Карташова О.Л., Норкина А.С., Чайникова И.Н., Смолягин А.И. Фенотипическая характеристика стафилококков и
местный иммунитет при бактерионосительстве // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. –
№4. – С. 99 – 103.
2. Карташова О.Л., Киргизова С.Б., Потехина Л.П., Бухарин О.В. Диагностическое значение персистентных характеристик
стафилококков при бактерионосительстве // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2007. – №5. –
С. 13 – 16.
3. Маянский А.Н., Чеботарь И.В. Стафилококковые биопленки: структура, регуляция, отторжение // Журнал микробиоло
гии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2011. – №1. – С. 101 – 108.
4. Бухарин О.В., Чернова О.Л., Матюшина С.Б. Способность стафилококков к инактивации карнозина // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. – 1999. – №5. – С. 545 – 546.
5. O'Toole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. – 2000. – №54. – P. 49 – 79.
6. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК
4.2.189004). Клиническая микробиология и антимикробная терапия. – 2004. – №6(4). – С. 306 – 359.
7. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., Медгиз. – 1962.
Сведения об авторах:
Попова Лидия Петровна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов
и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза
Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат медицинских наук
Уткина Татьяна Михайловна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов
и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза
Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат биологических наук
Карташова Ольга Львовна, заведующий лабораторией по изучению механизмов и регуляции
персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза
Уральского отделения Росскийской академии наук, доктор биологических наук
460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, email: [email protected]
84
ВЕСТНИК ОГУ №13 (174)/декабрь`2014