Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский
реклама
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравохранения Российской Федерации На правах рукописи НАРИМАНОВА МЕТАНАТ РАФИГОВНА ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЫВОРОТОЧНОГО АМИЛОИДА А 1 В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ОПУХОЛЕЙ ЯИЧНИКОВ. 14.01.01 – «Акушерство и гинекология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководитель -д.м.н., проф. О.В. Макаров Москва – 2014 1 СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2 ВВЕДЕНИЕ 6 Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ СКРИНИНГА И РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ ЯИЧНИКОВ И ПУТИ ЕЕ РЕШЕНИЯ ( ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) . 1.1. Статистические показатели проблемы 13 1.2. Современные представления об этиологии и патогенезе опухолей яичников 14 1.3. Современные методы скрининга и диагностики опухолей яичников 19 1.4. Использование новейших технологий в поиске биомаркеров, ассоциированных с опухолями яичников 26 1.5. Характеристика сывороточного амилоида А 35 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Принципы сбора и объем материала исследования 39 39 2.2. Измерение концентрации CA 125 и сывороточного амилоида А методом иммуноферментного анализа 42 2.3. Профилирование сывороток с применением SELDI-TOF 43 2.4. Анализ масс-спектров 43 2.5. Многофакторный анализ полученных данных 43 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Клиническая характеристика 47 47 3.2. Определение концентрации белка A-SAA и CA125 в сыворотках крови методом иммуноферментного анализа 55 3.3. Идентификация белка A-SAA в сыворотке крови методом масс-спектрометрии SELDI-TOF 60 3.4. Результаты классификации масс-спектров SELDI-TOF методом пар с наибольшим счетом (TSP) 68 2 3.5. Результаты многофакторного анализа протеомных данных 69 3.6. Кластерный анализ данных масс-спектров SELDI-TOF 76 3.7. Дискриминаторные пики, отобранные различными 82 классификаторами ЗАКЛЮЧЕНИЕ 86 ВЫВОДЫ 96 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 97 УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ 98 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ AIC (Akaike's information criterion) – информационный критерий Акаике A-SAA (acute-phase serum amyloid A) - сывороточный амилоид А острой фазы DIGE (2-D Difference Gel Electrophoresis) – дифференциальный электрофорез в геле FGF-2 – (fibroblast growth factor 2) - фактор роста фибробластов 2 FPRL1(formyl peptide receptor-like 1) – белок, подобный формилпептидному рецептору 1 HDL (high-density lipoprotein) - липопротеид высокой плотности IGF-II (Insulin-Like Growth Factor 2) – инсулиноподобный фактор роста II IL (interleukin) – интерлейкин IPI (international protein index) - международный индекс белков ITHC4 (inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain) – тяжелая цепь интер-альфатрипсинового ингибитора LR (logistic regression) - логистическая регрессия MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) – опосредованная матрицей времяпролетная лазерная десорбция/ионизация M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor) - макрофагальный колониистимулирующий фактор MMP (matrix metalloproteinase) - матриксная металлопротеиназа NAGK (N-acetylglucosamine kinase) - N-ацетилглюкозаминкиназа NF-kB (nuclear factor kappa B) - ядерный фактор каппа В OPN –остеопонтин PPV (positive predictive value) - положительная оценка предсказания RFE (Recursive Feature Elimination algorithm) - алгоритм рекурсивного исключения признаков SELDI-TOF (Surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight ) – усиленная поверхностью времяпролетная лазерная десорбция/ионизация SVM (Support vector machine) - метод опорных векторов 4 TNFα (tumor necrosis factor alpha) - фактор некроза опухолей альфа TSP (top scoring pairs) - метод пар с наибольшим счетом TTR-транстиретин СА125 (cancer antigen 125) - раковый антиген 125 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы В конце ХХ века злокачественные опухоли женской репродуктивной системы во всем мире стали одним из главных факторов отрицательных демографических тенденций. Наиболее фатальной из них является рак яичников. В структуре умерших от злокачественных новообразований рак яичников занимает 6-е место. Ежегодно в мире регистрируется 165 тысяч новых случаев злокачественных новообразований яичников и 101 тысяча случаев смертей от него. В России в 2000 году от рака яичника умерло 7,3 тысячи больных (5,5% от всех злокачественных новообразований у женщин). Пик смертности (6,7%) пришелся на возраст 40-59 лет [Аксель Е.М., 2012]. Пятилетняя выживаемость больных варьирует в зависимости от стадии заболевания: около 70% при I стадии, 45% при II стадии, 17% при III стадии, около 5% при IV стадии. При этом практически у 70-80% больных рак яичников впервые диагностируются в III-IV стадиях. В среднем пятилетняя выживаемость больных составляет 35-40% [Petricoin et al, 2002, Jacobs et al, 2004, Аксель Е.М.,2012]. Основными причинами столь неутешительных статистических тенденций является бессимптомное течение рака яичников на ранних стадиях и, как следствие, крайне низкий уровень его ранней диагностики, малоэффективное лечение, особенно при рецидивах заболевания [Жорданиа К.И., 2005, Винокуров В.И., 2004] . Стратегия яичников повышения предполагает эффективности проведение ранней скрининга диагностики женского рака населения - массового и селективного (обследование групп риска). Для осуществления таких мероприятий требуются простые, надежные и дешевые скрининговые методы, которые, к сожалению, пока отсутствуют [Акуленко Л.В., 2005, 6 Жорданиа К.И., 2005, Имянитов Е.Н., 2008, Kurman RT,2010]. Большие надежды в 90-х годах прошлого века возлагались на маркер рака яичников СА125. Однако, как оказалось, чувствительность этого биомаркера составляет не более 65%. Известно большое количество и других сывороточных маркеров рака яичников, однако, ни один из них сам по себе не обладает высокой точностью, что, по-видимому, связано с гетерогенной этиологией рака яичников и сложным составом сыворотки крови [Zhang et al, 2004]. Интенсивное развитие протеомных технологий в начале ХXI века открыло новые перспективы для поиска биомаркеров заболеваний. Одной из наиболее перспективных технологий, используемых в этих целях, является масс-спектрометрия белковых чипов SELDI-TOF-MS (surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry - усиленная поверхностью времяпролетная лазерная десорбция/ионизация масс-спектрометрия) - экспрессный и высокоселективный метод для анализа белков и пептидов, который обладает высокой воспроизводимостью результатов и имеет фемтомолярный диапазон измерений. В настоящее время масс-спектрометрия находит все более широкое применение в медицине. Благодаря этому методу возникло новое направление - клиническая протеомика, которая занимается инвентаризацией белков человека, кодируемых его генами, дополняя, таким образом, геномные исследования. Именно состав белков определяет функциональное назначение каждой клетки, в том числе и опухолевой, а также отражает реализацию возможностей проявления имеющихся наследственных или приобретенных генетических дефектов. Изменение концентрации отдельных белков указывает на появление патологии и может быть использовано в диагностических целях. В настоящее время основной идеологией поиска новых малоинвазивных способов диагностики онкологических заболеваний, в том числе и рака яичников, является разработка диагностических систем на основе протеомного профилирования 7 сыворотки крови для идентификации опухолевых маркеров [Toropygin I., Serebryakova M.V. et al, 2007]. Особый интерес вызывает сывороточный амилоид А острой фазы (ASAA). Несмотря на то, что этот белок давно известен как маркер воспаления, он обладает рядом уникальных свойств. Во-первых, его концентрация в сыворотке крови в норме в 10-100 раз ниже, чем концентрация других опухолевых маркеров. Во-вторых, при воспалении его концентрация увеличивается в 100 раз и более, тогда как концентрация большинства других маркеров меняется сравнительно слабо. В-третьих, известно, что A-SAA синтезируется в тканях некоторых злокачественных опухолей [Gutfeld et al, 2006; Kovacevic et al, 2006]. Кроме того, была показана способность амилоида A индуцировать экспрессию транскрипционного фактора NFκB [He et al, 2003], играющего ведущую роль в блокировании апоптоза и матриксных металлопротеиназ MMP1, MMP3 и MMP9, вызывающих деградацию межклеточного матрикса и тем самым способствующих ангиогенезу и метастазированию [O'Hara et al, 2000; Lee et al, 2005, Белушкина Н.Н. 2008] . Вышеизложенные научные факты побудили нас предпринять клиникоэкспериментальное исследование, направленное на поиск новых маркеров рака яичников с использованием, как традиционных (ИФА), так и новейших протеомных (масс-спектрометрия SELDI-TOF) технологий. Следует отметить, что проведение настоящего исследования было поддержано Государственным контрактом от 28 февраля 2006 года №02.442.11.7426 в рамках Федеральной целевой научно-технической программы: «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы» - «Белок сывороточный амилоид А как потенциальный маркер для ранней протеомной диагностики рака яичника». Цель исследования 8 Изучить возможности повышения эффективности дифференциальной диагностики опухолей гениталий и своевременной диагностики рака яичников на основе использования комбинации сывороточных белков A-SAA и СА125. Задачи исследования 1. Проанализировать и сформировать исследуемую выборку пациенток, отвечающую требованиям разработки адекватного диагностического метода и банк образцов их сывороток крови. 2. Методом иммуноферментного анализа определить концентрации СА125 и А-SAA в сыворотке крови пациенток исследуемой выборки. 3. Провести сывороток масс-спектрометрическое крови пациенток профилирование исследуемой выборки (SELDI-TOF) в условиях, оптимизированных для измерения уровня А-SAA. 4. Определить чувствительность масс-спектрометрической детекции АSAA в сыворотке крови пациенток исследуемой выборки. 5. На основе многофакторного анализа оценить возможность использования в качестве сывороточного маркера рака яичников А-SAA, определяемого методом масс-спектрометрии отдельно и в комбинации со значениями концентраций А-SAA и СА125, измеряемых методом иммуноферментного анализа. Научная новизна исследования 9 Показана распознавания применимость сывороток масс-спектрометрического крови больных метода раком для яичников, доброкачественными опухолями яичников, миомой матки и здоровых женщин. Определена чувствительность масс-спектрометрии SELDI-TOF для определения белка А-SAA в составе сыворотки крови. На основе многофакторного анализа комбинации данных массспектрометрической детекции А-SAA и значений концентраций А-SAA и СА125, измеренных методом иммуноферментного анализа, впервые разработана экспериментальная система диагностики рака яичника, точность которой составляет 95,2%. Научно-практическая значимость исследования Разработанная экспериментальная система протеомной диагностики опухолей яичника является научно обоснованной предпосылкой для создания и внедрения в практику аппаратно-программного комплекса, который целесообразно использовать для скрининга и ранней диагностики рака яичников. Рассчитанные пороговые значения диагностически значимых маркеров способствуют повышению точности дифференциальной диагностики овариальных образований. Положения диссертации, выносимые на защиту 1. Точность распознавания сывороток крови больных раком яичников, доброкачественными опухолями яичников, миомой матки и здоровых женщин методом масс-спектрометрии SELDI-TOF составляет 89,5%. 2. Сывороточный А-SAA, определяемый методом масс-спектрометрии SELDI-TOF, является маркером рака яичника при критическом значении 10 его концентрации 0,3 г/л (2,6×10-5 М), обладая чувствительностью 50% и специфичностью 96,4%. 3. Добавление к данным масс-спектрометрической детекции A-SAA данных о концентрациях A-SAA и СА125, измеряемых методом иммуноферментного анализа, повышает точность диагностики рака яичников до 95,2%. Внедрение результатов исследования в практику 1. Материалы диссертации доложены на 4-м Ежегодном Всемирном Конгрессе международной организации «Протеом человека» (HUPO 4-th Annual World Congress), Мюнхен, Германия, 28 августа-1 сентября 2005 года; Результаты исследвания используются на семинарских занятиях для студентов, ординаторов и аспирантов на кафедре акушерства и гинекологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Пирогова Н.И. Личное участие автора в разработке проблемы Автором самостоятельно сформирована исследуемая выборка пациенток и банк образцов сывороток крови. Автор принимала участие в проведении статистической обработки материала исследования, обсуждении результатов, подготовке и оформлении публикаций. Оформление диссертации и автореферата выполнены автором самостоятельно. Объём и структура диссертации Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения , обзора литературы, описания материалов и методов, описания 11 результатов практических исследования, рекомендаций, их обсуждения, списка заключения, использованной выводов, литературы и приложений. Иллюстративный материал включает 11 таблиц, 9 рисунков и диаграмм. Список использованной литературы содержит 119 источников; из них 15 отечественных и 104 зарубежных. Апробация диссертации Апробация диссертации состоялась на заседании кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета ГБОУ ВПО ПНИУ им. Пирогова Н.И. № от октября 2014г. 12 Глава 1 СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ ЯИЧНИКОВ И ПУТИ ЕЕ РЕШЕНИЯ ( ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ). 1.1. Статистические показатели проблемы Опухоли яичников занимают третье место среди новообразований женских половых органов. Подавляющее большинство больных (около 85%) страдают эпителиальными формами этих новообразований. Среди них превалируют доброкачественные формы (около 80%), злокачественные опухоли составляют около 20-30%. Согласно международной классификации онкологических болезней ( МКБ -10,Женева,1995), выделяют следующие гистологические типы эпителиальных опухолей: серозные, муцинозные , эндометриодные, светлоклеточные (мезонефроидные) опухоли Бренера и смешанные. При этом каждый из вариантов по степени зрелости подразделяется на доброкачественные, пограничные и злокачественные [Карселадзе А.И.,1989]. Ежегодно в мире регистрируется 225500 новых случаев злокачественных новообразований яичников и более 140 000 смертей от него. Во многих странах, включая Россию, рак яичников занимает 8-е ранговое место среди злокачественных новообразований у женщин всех возрастных групп, начиная с младенчества. В 2012 году в России доля рака яичников среди всех злокачественных новообразований колебалась от 3,2% женщин в возрасте 70 лет и старше, до 7,0% в возрасте 40-54 года и 7,4% в 15-39 лет. Показатель заболеваемости составлял 37,8 на 100000 в возрастной когорте женщин 70-74 года [Аксель Е. М., 2005,2012]. В 2012 году в России от рака яичника умерло 7,3 тысячи больных (5,5% от всех злокачественных новообразований у женщин). В возрасте до 30 лет рак яичников является причиной смерти 40-70% больных опухолями 13 гениталий. В России вероятность заболеть раком яичников для новорожденной девочки составляет 1,0%, а вероятность умереть от него 0,6%. Для 30-летней женщины, больной раком яичников, вероятность умереть от этого заболевания в 17 раз выше, чем от другой причины. С увеличением возраста женщин различия сокращаются: в 50-54 года - до 8,5 раз, в 60-64 - до 3,7 раз, а в 75-летнем возрасте существует большая вероятность умереть от другой причины [Аксель Е. М., 2012 ]. Весьма печальной остается и выживаемость больных раком яичников. Уже на первом году после установления диагноза погибает каждая третья пациентка. Обобщенные данные популяционных раковых регистров стран Европы свидетельствуют, что 1-летняя выживаемость больных раком яичников в целом составляет 63%, 3-летняя – 41%, 5-летняя – 35% [Аксель Е. М.2012]. Основными причинами столь низкой выживаемости больных раком яичников являются: бессимптомное течение заболевания на ранних стадиях, отсутствие достоверной диагностики, малоэффективное лечение, особенно при рецидивах заболевания [Жорданиа К.И., 2005, Kathleen R.Cho., 2009]. 1.2. Современные представления об этиопатогенезе злокачественных новообразований яичников Рак яичников – гетерогенное заболевание, как с точки зрения этиологии, так и с точки зрения клинических проявлений. В основе происхождения всех опухолей этой локализации лежат повреждения (мутации) генетического аппарата клеток, которые формируют повышенную чувствительность этих клеток к воздействиям экзогенных и эндогенных канцерогенных факторов. Такими факторами может быть вирус эпидемического паротита, асбест, тальк, гормональный дисбаланс, иммунный дефицит и другие [Макаров О.В., Борисенко С.А., 1996, Lingeman C.H, 1983, Макаров О.В. Хашукоева А.З., Никола14 ев Н.Н., 1982, Cramer D.W., William R., et al., 1983, Cramer D.W., Welch W.R.,1983]. Механизм происхождения опухолей был предсказан A.Knudson в 1971 году. Автор предложил гипотезу, известную в настоящее время как классическая теория двойного удара или двойной мутации, объясняющую механизм возникновения наследственных и спорадических форм злокачественных новообразований. Суть гипотезы заключалась в том, что для возникновения опухоли требуется два события: мутации в клетках зародышевой линии (герминальная мутация) и мутация в соматической клетке (соматическая мутация). локализации могут В свете этой гипотезы опухоли одной и той же быть наследственными и спорадическими. При наследственной форме первое событие - герминальная мутация, происходит в половой клетке одного из родителей, которая формирует предрасположенность будущего организма к возникновению опухоли. Однако для инициации малигнизации этого события еще недостаточно. Требуется вторая мутация в том же аллеле гомологичной хромосомы, но уже в соматической клетке (зиготе и т.д.). При спорадической (ненаследственной) форме должны возникнуть сразу две мутации в одной и той же соматической клетке. [Knudson A.G., 1976-1977]. Дальнейшие исследования полностью подтвердили гипотезу Кнудсона [Knudson AG., 1995]. В настоящее время концепция о генетической природе рака является общепризнанной. Доказано, что злокачественные новообразования развиваются из одной опухолевой клетки (то есть имеют моноклональное происхождение) вследствие накопления мутаций в специфических участках клеточной ДНК, приводящих к образованию дефектных белков [Maslov A.Y, Ganapa-thi S, Westerhof M, et al. 2013; Vijg J, Suh Y.,2013]. Прямым доказательством мутационной природы рака можно считать открытие протоонкогенов и генов-супрессоров, изменение структуры и 15 экспрессии которых за счет различных мутационных событий, в том числе и точковых мутаций, приводит к злокачественной трансформации. Открытие клеточных протоонкогенов впервые было осуществлено с помощью высокоонкогенных РНК-содержащих вирусов (ретровирусов), несущих в составе своего генома трансформирующие гены. С помощью молекулярнобиологических методов установлено, что ДНК нормальных клеток различных видов эукариот содержит последовательности, гомологичные вирусным онкогенам, которые получили название протоонкогенов. Превращение протоонкогенов в онкогены может происходить в результате мутации, кодирующей последовательности протоонкогена, что приводит к образованию измененного белкового продукта, или в результате повышения уровня экспрессии протоонкогена, вследствие чего в клетке увеличивается количество белка. Протоонкогены, являясь нормальными клеточными генами, обладают высокой эволюционной консервативностью, что указывает на их участие в жизненно важных клеточных функциях [Huang S., 2013]. Антионкогены, или гены-супрессоры опухолей - это гены, наличие продукта которых препятствует образованию опухоли. Утрата функции этих генов вызывает неконтролируемую клеточную пролиферацию. Благодаря своему противоположному по отношению к онкогенам функциональному назначению они были названы антионкогенами или генами-супрессорами опухолевого роста. В отличие от онкогенов, мутантные аллели геновсупрессоров рецессивны. Отсутствие одного из них, при условии, что второй нормален, не приводит к снятию ингибирования образования опухоли. Опухоль развивается в результате мутации в обоих аллелях гена-супрессора. Таким образом, протоонкогены и гены-супрессоры образуют сложную систему позитивно-негативного контроля над клеточной пролиферацией и дифференцировкой, а злокачественная трансформация реализуется через нарушение этой системы. В основе наследственной предрасположенности к раку лежат нарушения структуры и функциональной активности генов16 супрессоров, так как мутация одного из двух аллелей гомологичных генов может происходить в герминальной клетке. Онкогены и антионкогены являются мишенью ошибочного процесса репарации ДНК, а следствием герминальных аберраций этого класса генов является предрасположенность к опухолевым заболеваниям [Lee E, Iskow R, Yang L. et al., 2012; Stevens JB, Horne SD, Abdallah BY, Ye CJ, Heng HH. , 2013; Wolters S, Schumacher B. 2013]. Одним из значительных достижений молекулярно-генетических исследований ХХ века явилось открытие генов BRCA1-2 (Breast Сancer Associated gene), обусловливающих наследственное предрасположение к раку яичников и раку молочной железы. Ген BRCA1 был выделен в 1994 г. в области хромосомы 17q21. Спустя 2 года был клонирован второй ген - BRCA2 в области хромосомы 13q12. К настоящему времени получена существенная информация о структуре и функции этих генов. Установлено, что в норме они участвуют в контроле целостности генома. Потеря такой роли вследствие мутаций может быть ключевым событием, приводящим к хромосомной нестабильности и злокачественной трансформации клетки [Narod S.A. et al, 1991 Miki Y.A.,1994, Wooster R., 1995, Tavtigian S. V., Simard J., Rommens J. et al., 1996]. В настоящее время идентифицировано более 800 мутаций, обнаруживаемых во всех участках генов BRCA1 и BRCA 2. Выявлены популяционные особенности распространенности определенных мутаций. Большинство авторов пришли к заключению, что герминальные мутации в генах BRCA1 и BRCA2 обусловливают предрасположенность к раку молочной железы и яичников при двух наследственных синдромах: синдроме семейного рака молочной железы и синдроме семейного рака молочной железы и яичников [Акуленко,2005]. Кроме генов BRCA1 и BRCA2 существуют и другие гены, мутации в которых также участвуют в генезе этих новообразований. Выявлен ряд 17 мутаций в генах, связанных с синдромом Lynch (hMLH1 и hMLH2), которые в норме исправляют поломки ДНК. Определена группа мутаций в генесупрессоре р53, играющих значительную роль при переходе аденомы в аденокарциному в тканях толстой кишки, яичников, молочной железы и легких. Этому гену в настоящее время отводится важная роль в индукции и прогрессии опухолевого роста рака этих локализаций. В норме ген-супрессор р53 участвует в регуляции клеточного апоптоза. Мутация в гене р53 регистрируются практически во всех видах опухолей [Welsh P.L., King M.C., 2001, Акуленко, 2005, Thompson D., 2001, Thompson D., Easton D., 2002]. Получены интересные данные о полиморфизме гена, кодирующего фермент цитохрома Р450с17α. Этот фермент в норме потенциирует действие ключевых катализаторов стероидогенеза, в частности, 17α-гидроксилазы и 17,20-лиазы. Он имеет два аллеля, один из которых обусловливает повышенную скорость процессов транскрипции. Гомозиготное носительство данного аллеля связано с более ранним наступлением менархе, усилением метаболизма стероидов и увеличением риска возникновения рака яичников и молочной железы. Вместе с тем, действие генов предрасположенности к раку в значительной мере находится под влиянием других генов – геновмодификаторов, поскольку взаимодействия многих генов, канцерогенез является результатом в котором онкогенам и генам-супрессорам отводится главная роль. Другие гены играют роль модификаторов функций главных генов [Акуленко Л.В., 2005]. 1.3. Современные методы скрининга и диагностики опухолей яичников 18 Главная роль ранней диагностики рака яичников в выживаемости больных не вызывает сомнений. По приблизительным оценкам, если бы 75% случаев рака яичников были бы обнаружены на первой или второй стадии, то смертность снизилась бы на 50 % (Siegel R, Ward E, Branty MD., 2011, Ueland FR, DePriest P, Desimone C, et al. 2005). В настоящее время в целях повышения эффективности ранней диагностики рака яичников применяют комплексный подход, который включает ряд клинических, лабораторных и инструментальных методов исследования, включая УЗИ, компьютерную и магнитнорезонансную томографию, радиоизотопное исследование, лапароскопию, определение ассоциированных с опухолью маркеров. При обнаружении объемного образования в области малого таза необходимо исключать часто встречающиеся заболевания – дивертикулиты, внематочную беременность, кисты яичника, миому матки и эндометриоз. Такие злокачественные новообразования, как рак желудочно-кишечного тракта или рак молочной железы могут метастазировать в яичники. Исключить наличие первичной опухоли в желудке, толстой кишке или молочной железе позволяют гастроскопия, колоноскопия и маммография. Рентгенография грудной клетки является обязательным компонентом обследования при подозрении на опухоль яичников, т.к. позволяет диагностировать возможное метастазирование в легкие и плеврит [Жорданиа К.И., 2005]. Достоинством ультразвукового яичников является специфичность и безвредность, документирования его высокая точность метода в информативность достигают безболезненность, и диагностике многократного 80-90%), проведения. (чувствительность, простота, возможность опухолей быстрота, объективного [Hanahan D.,2000] Ультразвуковое исследование малого таза стало рутинным методом при подозрении на опухоль яичника. Для более углубленной диагностики при наличии опухолей яичников в настоящее время применяются такие 19 высокоинформативные методы, как компьютерная и магнитнорезонансная томография. Все эти исследования дают основание с большей или меньшей долей вероятности заподозрить опухоль яичников. Однако только гистологическая верификация диагноза может дать точный и окончательный ответ. У некоторых больных с наличием асцита о характере заболевания можно судить по данным цитологического исследования асцитической жидкости. Иногда для постановки диагноза требуется выполнение лапароскопии или лапаротомии и получение материала для гистологического исследования [Жорданиа К.И., 2005] . Одним из подходов к ранней диагностике рака яичников является скрининговый мониторинг за женщинами, относящимися к группам риска. Под скринингом подразумевается использование тестов для ранней диагностики рака яичников. Наибольший риск развития рака яичников, достигающий 100%, имеют женщины с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. (Акуленко Л.В., 2005, Havrilesky L J, Sanders GD, Kulasingam S, et al. 2011). Недавно было сделано предположение о существовании двух типов эпителиального рака яичников. I тип развивается в результате малигнизации серозных и эндометриальных кист и имеет значительную доклиническую стадию, во время которой может быть диагностирован. II тип, представляет собой агрессивную низкодифферинцированную опухоль с короткой доклинической стадией. Высказывается предположение, что II тип рака яичников развивается из эпителиальной карциномы маточных труб. Кроме того, женщины с генетической предрасположенностью к развитию рака яичников (особенно с мутацией в генах BRCA1 и BRCA2) имеют высокую частоту развития карциномы маточных труб in situ. Таким женщинам следует проводить более частый скрининг [Finch A, Shaw P, Rosen B., 2006, Crum CR, Drapkin R, Miron A, et al. 2007; Callahan MJ, Crum CP, Medeiros F, et al. 2007, Kurman RT, 2010]. 20 Одним из наиболее перспективных направлений в диагностике злокачественных опухолей яичников является определение опухолевых маркеров. Изучение этих белков представляет большой интерес не только с практической, но и с теоретической точки зрения. Исследования, проводимые в этом направлении, позволяют глубже проникнуть в проблемы этиопатогенеза злокачественного роста. К настоящему времени для рака яичника идентифицирован целый ряд маркеров. Однако из них широко используют в клинической диагностике единственный маркер – СА125. Этот маркер был обнаружен как антиген к одному из моноклональных антител, образующихся при иммунизации животных раковыми клетками человека. СА125 представляет собой высокомолекулярный гликопротеид. Концентрацию СА125 в крови обычно измеряют с помощью иммунного анализа. Однако уровень СА125 в крови может повышаться не только при раке яичника, но и при некоторых других видах рака - доброкачественных опухолях, а также при нормальных физиологических состояниях: менструации или беременности [Jacobs & Bast, 1989; Jacobs & Menon, 2004]. К существенным недостаткам этого маркера можно отнести повышение его концентрации при доброкачественных опухолях яичника. В этом случае их нельзя отличить от рака, даже совмещая использование СА125 с ультразвуковым исследованием. Кроме того, концентрация СА125 нередко возрастает только на поздних стадиях рака яичника. Если при раке в поздней стадии концентрация СА125 повышена у 80% больных, то среди пациентов с первой стадией только у 50-60% [Petricoin et al, 2002]. Перечисленные свойства объясняют невысокие чувствительность и специфичность СА125: при чувствительности 83% он обладает специфичностью 52%, а при чувствительности 65% - специфичностью 97% [Zhang et al, 2004]. Были проведены исследования по измерению концентрации СА125 в коллекции сывороток, собранных за 5 лет до постановки диагноза рака 21 яичника. Оказалось, что концентрация этого маркера была повышена только у 25% исследованных сывороток. Это указывает на невозможность использования СА125 для ранней диагностики рака яичников [Jacobs et al, 2004]. Вместе с тем, при II, III и IV стадиях рака яичников уровни СА125 повышаются и могут использоваться для мониторинга заболевания. Наблюдаемое повышение уровней СА125 при рецидивах заболевания свидетельствует о необходимости мониторинга всех больных, находящихся в ремиссии, т.к. лишь у 1-й из 10-ти больных результат исследования бывает ложноотрицательным. Более того, даже если при первичном обследовании у нелеченных больных показатели СА125 не превышали норму, то в процессе ремиссии анализ на содержание маркеров в крови необходим в связи с возможным вторичным повышением маркеров при рецидиве. В этом плане, безусловно, перспективным является определение СА125 в период ремиссии и при рецидиве заболевания. Повышение уровня маркера от нуля (либо от базального уровня) до 35 ед/мл, т.е. в пределах нормы, может быть доклиническим проявлением рецидива [Жорданиа К.И., 2005]. . Было показано, что у всех пациенток с уровнем СА125 менее 1/2 ДК (ДК дискриминационная концентрация маркера, равная 35 ед/мл) и ежемесячным приростом менее 20% от предыдущего значения маркера, рецидив в ближайшие 6 месяцев не наблюдался. Если прирост превышал 20%, то рецидив был диагностирован через 46 мес. У пациенток со значением СА125 от 0,5 до 1 ДК и приростом свыше 20% в месяц рецидив регистрировался через 24 месяца. Если же значение маркера превышало ДК, а его прирост был свыше 20%, то рецидив можно было обнаружить спустя 13 месяцев [Порханова Н.В., 1999, Жорданиа, 2005]. Использование СА125 позволяет не только диагностировать наличие рецидива с достаточно высокой точностью, но и с большей вероятностью прогнозировать его развитие. Чувствительность СА125 при рецидиве 22 заболевания составляет 97%. При полной ремиссии в отсутствие опухоли уровень СА125 должен быть близким к нулю. Однако, несмотря на перечисленные недостатки, из-за отсутствия лучшего метода клинической диагностики, СА125 широко используют в диагностической практике в сочетании с ультразвуковым исследованием [Порханова Н.В.,1999]. Рак яичников хорошо поддается лечению до того как появляются его первые клинические симптомы. Важнейшей задачей является оценить преимущества и недостатки существующих методов скрининга рака яичников, модифицировать их. Необходимо оптимизировать критерии для выявления женщин, находящихся в группе риска по развитию рака яичников, и сделать их обследование максимально углубленным. Не вызывает сомнений тот факт, что женщины в постменопаузальном периоде находятся в группе риска по сравнению с более молодыми женщинами. Лица с мутациями генов BRCA1 и BRCA2 значительно чаще болеют II типом эпителиального рака яичников. Следовательно, они нуждаются в более частом обследовании. Стоит отметить, что рутинный гинекологический осмотр не может считаться методом скрининга рака яичников. В исследовании PLCO за 5 лет не было обнаружено ни одного случая рака яичников, используя исключительно гинекологический осмотр. Рак яичников пальпируется менее чем в 30% случаев под анестезией (Ueland FR, DePriest P, Desimone C, et al. 2005). Важнейшим недостатком определения СА-125 является низкая чувствительность на ранних этапах развития рака яичников. Уровень СА-125 был повышен только у 10 из 31 женщины с раком яичников I или II стадии, диагностированных методом трансвагинального УЗИ (van Nagell JR, Miller RW, DeSimone CP, et al.,). При прогрессирующем раке яичников уровень СА-125 повышается более чем у 80% больных. В исследовании PLCO 74% пациенток с повышенным уровнем СА-125 имели III или IV стадию заболевания. В связи с этим в алгоритм скрининга рака яичников включено не только абсолютное 23 значение СА-125, но также и скорость прироста концентрации СА-125. В свою очередь трансвагинальное УЗИ является наиболее эффективным методом скрининга ранних стадий рака яичников. В исследовании PLCO 72% случаев ранних стадий рака яичников были обнаружены исключительно методом трансвагинального УЗИ. Более того, около двух третей всех случае рака яичников выявляется недостатком УЗИ методом является трансвагинального его низкая УЗИ. Важнейшим прогностическая ценность. Трансвагинальное УЗИ точно указывает на изменение объема и морфологии яичников, но не указывает на доброкачественный или злокачественный характер опухоли. трансвагинального В исследовании УЗИ составила PLCO прогностическая <3%. Другим ценность недостатком трансвагинального УЗИ является отсутствие изменения объема яичника при некоторых видах рака. Тем самым на УЗИ яичник визуализируется нормальным, в то время как рак уже развивается (ложноотрицательный результат скрининга). В случае подозрения на рак яичника женщина должна быть тщательно обследована перед оперативным вмешательством [Partridge E, Kreimer AR, Greenlee RT, et.al. 2009]. Идея использования диагностических скрининговых тестов у женщин без клинических симптомов, находящихся в группе высоко риска по развитию рака яичников, является фундаментально важной для снижения смертности от рака яичников. Появление клинических симптомов рака яичников свидетельствует о том, что болезнь уже достаточно развита. Хотя комбинация СА-125 и трансвагинального УЗИ теоретически повышает диагностическую ценность, следует признать, что чувствительность, специфичность и полезная прогностическая ценность этих методов не являются оптимальными. Пока не появятся более точные скрининговые тесты в диагностике рака яичников, приходится использовать комбинацию СА-125 и трансвагинальное УЗИ. Обязательным требованием к трансвагинальному УЗИ является исследование маточных труб, эпителий которых является предшественником II типа рака 24 яичников. Уровень биомаркеров должен включать не только абсолютное значение, но также и скорость прироста концентрации. Для повышения эффективности хирургического лечения следует унифицировать диагностический и лечебный алгоритмы [Partridge E, Kreimer AR, Greenlee RT, etal. 2009]. 25 1.4. Использование новейших технологий в поиске биомаркеров, ассоциированных с опухолями яичников Основными характеристиками чувствительность, специфичность биомаркеров и положительная являются: оценка предсказания (positive predictive value, PPV). Чувствительность – это процент пациентов, классифицированных с использованием данного маркера как «больные раком», от общего числа действительно больных пациентов. Специфичность – это процент пациентов, классифицированных с использованием маркера, как «здоровые», от общего числа действительно здоровых пациентов. Положительная оценка предсказания – это процент правильно диагностированного рака от общего числа диагнозов «рак» [Adam et al, 2002]. Для того чтобы маркер можно было использовать в практике, должны быть достаточно велики показатели его чувствительности и специфичности. Удобно использовать для характеристики биомаркеров понятие точности диагностики, под которой подразумевается процент правильных диагнозов [Jacobs et al, 2004]. Распространенным подходом к увеличению чувствительности и специфичности метода диагностики является совместное использование нескольких маркеров. Для создания системы диагностики на основе набора биомаркеров необходимо использовать методы многомерной статистики и вырабатывать более сложный алгоритм классификации [Skates et al, 2004]. Из методов логистической биоинформатики регрессии, чаще построения всего применяют классификационного методы древа и дискриминантный анализ. Метод логистической регрессии позволяет на основе экспериментальных данных вывести формулу, включающую в качестве переменных концентрации биомаркеров. Метод дискриминантного анализа позволяет аппроксимировать на основе экспериментальных данных 26 многомерную плотность вероятности для распределения здоровых и больных. Модель, построенная с помощью дискриминантного анализа, возвращает вероятность признака «рак» на основе отношения плотностей вероятности для признаков «рак» и «отсутствие рака». Построение классификационного древа основано на поэтапном включении в классификацию нескольких биомаркеров. Сначала экспериментальные данные делятся на две группы на основе уровня одного из маркеров, затем каждая из ветвей расщепляется на две на основе концентраций других биомаркеров и так продолжается до тех пор, пока каждой конечной точке не будет сопоставлен диагноз («рак», «отсутствие рака» или «доброкачественная опухоль») [Skates et al, 2004]. Предпринимались многочисленные попытки использовать в комбинации с СА125 для диагностики рака яичника белки, известные как биомаркеры различных видов рака: СА15-3 (маркер рака молочной железы) [Jacobs et al, 1993; Woolas et al, 1995; Zhang et al, 1999; Li et al, 2002; Skates et al, 2004], СА72-4 (маркер рака поджелудочной железы) и M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor - макрофагальный колонии-стимулирующий фактор) – цитокин, стимулирующий пролиферацию лимфоцитов, липид- ассоциированную сиаловую кислоту (LASA), известную как маркер рака мозга [Katopodis et al, 2001] и рака молочной железы [Brower et al,1995] и некоторых других видов рака, OVX1 – маркер рака эндометрия [Xu et al, 1994], CA9 – маркер рака почек, а также CA54/61, являющийся маркером рака яичника [Nozawa et al,1992]. Однако все упомянутые маркеры обладают низкой специфичностью для конкретного вида рака, и их концентрация во многих случаях изменяется по сравнению с нормой и при раке яичника. Использование панелей из 4-5 указанных белков позволило улучшить специфичность и чувствительность метода, по сравнению с одним СА125: для ранней стадии рака яичников удалось повысить чувствительность от 45% до 70% при неизменной специфичности [Skates et al, 2004], для отличия доброкачественных и злокачественных опухолей яичников - с 78,1% и 76,8% 27 соответственно, до 90,6% и 93,2%, соответственно [Woolas et al, 1995]. Таким образом, было четко показано, использование не одного, а набора биомаркеров является перспективным подходом к диагностике. Поиск панелей биомаркеров, а также комбинирование биомаркеров, обнаруженных большинства разными методами, современных является исследований основной идеологией области разработки в биохимических диагностических методов. Существует множество различных подходов к поиску биомаркеров злокачественных опухолей. Часть из них основаны на анализе непосредственно опухолевой ткани и выявлении опухоль-специфических биомаркеров в биотехнологические продуктов, крови. методы другие направлены Современные позволяют на выявление высокопроизводительные проводить транскриптомное и протеомное профилирование биологического материала, что позволяет получать информацию одновременно о большом количестве генов или белков. Транскриптомное профилирование (ДНК-микрочипы) позволяют сравнивать профиль экспрессии генов в клетках больных и здоровых. Анализ профиля экспрессии генов в основном используют для исследования молекулярных механизмов развития рака [Wamunyokoli et al, 2006], определения молекулярных различий между гистологическими подтипами рака [Baranova et al, 2006; Skubitz et al, 2006]. Достаточно широко транскриптомное профилирование используют в исследованиях устойчивости опухолей к тем или иным видам терапии, при этом ставится цель разработки персонализированного подхода к лечению злокачественных опухолей [Agarwal et al, 2006]. Однако использование транскриптомного профилирования для разработки новых диагностических методов достаточно ограничено, так как путь от выявления отличий на уровне транскриптома до выявления биомаркера, доступного для измерения малоинвазивными методами, достаточно сложен. Примером успешного обнаружения биомаркера путем транскриптомного профилирования является работа Le Page с соавторами. 28 Обнаружив повышение экспрессии генов IL-18 и FGF-2 в тканях рака яичника, авторы измерили методом иммуноферментного анализа концентрацию соответствующих белков и обнаружили достоверное повышение их уровня, как в ткани яичника, так и в крови [Le Page et al, 2006]. С развитием протеомных технологий открылись совершенно новые перспективы по выявлению белковых маркеров рака. Протеомные технологии позволяют получать информацию сразу о больших совокупностях белков и сравнивать наборы белков у больных и здоровых людей, что дает возможность выявлять не один, а сразу несколько маркеров. В применении протеомных технологий к выявлению биомаркеров можно условно выделить два разных подхода. Первый подход использует новые технические возможности только для поиска новых маркеров с лучшими характеристиками и их дальнейшей идентификации. После этого можно использовать найденные маркеры иммунными или аффинными методами. Другой подход основан на сравнении протеомного профиля в целом для больных и здоровых людей с привлечением статистических методов для выявления значимых различий, не выявляя их причин [Petricoin et al, 2002]. При этом диагностическим признаком является сам состав протеомного профиля, то есть исследования и непосредственная диагностика могут проводиться одним и тем же методом [Xiao et al, 2005]. Среди протеомных методов, используемых для непосредственного обнаружения и идентификации биомаркеров, существенную роль играет двумерный электрофорез идентификацией осуществлять белков. разделение с Метод последующей двумерного белков в масс-спектрометрической электрофореза одном позволяет направлении путем изоэлектрофокусирования, а в другом направлении – по массе [Говорун В.М., Арчаков А.И., 2002]. 29 В качестве материала для двумерного электрофореза часто используют не кровь, а непосредственно опухолевые и нормальные ткани исследуемого органа. Однако как здоровые, так и опухолевые ткани представлены различными типами клеток, что усложняет воспроизводимость и интерпретацию результатов. Решить эту проблему в значительной степени позволило изобретение метода лазерной микродиссекции, с помощью которого можно отделить интересующую клеточную популяцию от окружающих тканей [Craven et al, 2002; Wulfkuhle et al, 2003]. Помимо классического двумерного электрофореза для обнаружения маркеров заболеваний используют также его усовершенствованные варианты, например, дифференциальный электрофорез в геле (DIGE). Белковые экстракты из больной и здоровой тканей метят двумя различными флуоресцентными зондами и смешивают. Затем проводят двумерный электрофорез, после чего для каждого пятна измеряют интенсивность флуоресценции и определяют различие в интенсивности между двумя флуоресцентными метками. Такой подход позволяет достичь полной идентичности условий проведения электрофореза и за счет этого повысить воспроизводимость результатов [Unlu, Morgan & Minden, 1997; Zhou et al, 2002]. Двумерный электрофорез также применяют для скрининга сыворотки больных раком с целью выявления белков, связывающихся с аутоантителами к белкам раковых клеток [Wulfkuhle, Liotta and Petricoin, 2003]. Большие перспективы имеет технология микрочипов на основе антител, которая представляет собой одновременный анализ сотен белков в пробе на микрочипах с иммобилизованными антителами. Примером успешного поиска биомаркеров рака яичника с использованием микрочипов на основе антител представляет собой работа Mor с соавторами. С их помощью были проанализированы уровни 169 белков у 28 здоровых женщин, 18 женщин с впервые диагностированным раком яичника и 40 женщин с рецидивом рака яичника. Были обнаружены достоверные отличия между сыворотками 30 больных раком и сыворотками здоровых женщин в концентрациях 35 из 169 исследованных белков. Затем концентрации белков с наиболее выраженными различиями между раком и нормой, а также с достаточно ясной потенциальной ролью в процессе злокачественного перерождения были определены с помощью иммуноферментного анализа. В результате в качестве биомаркеров были отобраны лептин, пролактин, остеопонтин (OPN) и инсулиноподобный фактор роста II (IGF-II). Уровень пролактина и OPN существенно повышен у больных раком яичника, в то время как уровень лептина и IGF-II понижен. Совместное использование четырех перечисленных биомаркеров позволило достичь чувствительности и специфичности диагностики 95%. Недостатком использования микрочипов на основе антител относится высокая стоимость расходных материалов и необходимость иметь антитела ко всем анализируемым белкам. Кроме того, использование антител в большинстве случаев не позволяет различить между собой различные посттрансляционные модификации белков, а также фрагменты белков [Mor et al, 2005]. Этими недостатками не обладают масс-спектрометрические методы, которые очень активно развиваются и с успехом применяются для поиска биомаркеров злокачественных опухолей, в том числе, рака яичника. Массспектрометрические методы позволяют получать спектры распределения белков в смеси по массе. При этом каждому белку соответствует определенный пик, положение которого определяется соотношением массы и заряда белка, а интенсивность неявным образом отражает количество белка. Во всех масс-спектрометрических методах белки должны быть предварительно ионизованы. В случае так называемой MALDI-TOF (matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight, опосредованная матрицей времяпролетная лазерная десорбция/ионизация) это достигается добавлением к белкам органической матрицы, являющейся донором протонов. Матрица взаимодействует с белками и формирует кристаллоидную структуру. При 31 облучении этой структуры лазером ионизованные индивидуальные молекулы белков отрываются от поверхности и движутся к катоду. Чем меньше по массе и чем сильнее заряжен белок, тем быстрее он достигает противоположно заряженного электрода, по времени движения иона до электрода определяют соотношение массы и заряда белка. При облучении лазером образуются преимущественно однозарядные ионы, и для них соотношение массы и заряда примерно совпадает с массой [Говорун В.М. и Арчаков А.Н., 2002]. Методы масс-спектрометрии позволяют очень быстро анализировать большое количество образцов, требуют сравнительно небольшого количества биологического материала, обладают высокой чувствительностью и хорошим разрешением для низкомолекулярных белков и пептидов, что делает особенно перспективным их использование для поиска биомаркеров [Petricoin & Liotta, 2003]. Из прямых масс-спектрометрических методов для обнаружения биомаркеров заболеваний лучше всего приспособлена технология SELDI-TOF, совмещающая в себе масс-спектрометрическую детекцию белков с использованием белковых чипов. Белковый чип представляет собой пластинку с 8-ю пятнами хроматографической поверхности, на которую наносят образцы исследуемой жидкости перед анализом. Используются чипы с различной хроматографической поверхностью: гидрофильной (нормально-фазовые), гидрофобной (обращенно-фазовые), анионообменные, катионообменные или металлоаффинные. Кроме того, существуют чипы с активированной поверхностью для связывания любого аффинного сорбента. В зависимости от типа чипа и используемого буфера с активной поверхностью связывается разный набор белков, а не связавшиеся белки отмываются. После отмывки чип со связавшимися белками высушивают и наносят на матрицу, помещают в вакуумную камеру, а пятна облучают лазером. Ионизованные за счет энергии лазера белки отрываются от поверхности чипа, по вакуумной трубке летят к противоположно заряженному электроду и там детектируются [Говорун В.М. 32 и Арчаков А.Н., 2002]. Использование чипов позволяет проводить упрощенное хроматографическое фракционирование биологической жидкости перед массспектрометрическим анализом. В результате полученные спектры содержат более или менее хорошо разрешенные пики. Применение масс-спекрометрии SELDI-TOF началось с разработки компьютерных методов классификации спектров, рассматриваемых как «черные ящики», то есть без идентификации биомаркеров, и в первых же работах были достигнуты высокие значения чувствительности и специфичности диагностики [Petricoin et al, 2002; Kozak et al, 2003]. В других работах некоторые дискриминаторные пики были идентифицированы [Rai et al, 2002; Zhang et al, 2004; Moshkovskii et al, 2005; Kozak et al, 2005]. Метод SELDI-TOF имеет очень высокую производительность. В течение дня могут быть проанализированы десятки образцов. Кроме того, процедура может быть автоматизирована, и тогда производительность повышается еще во много раз. В качестве биологического материала для исследования с помощью SELDI-TOF могут быть использованы, как биологические жидкости (плазма крови, моча), так и белковые экстракты из тканей. Технологию SELDI-TOF можно использовать как альтернативу двумерному электрофорезу для поиска биомаркеров и их дальнейшей идентификации [Petricoin & Liotta, 2004]. Возможен также другой подход. Так как процедура получения спектров достаточно проста, при использовании плазмы или сыворотки крови спектры можно применять не только в качестве объекта исследования, но и как диагностический признак [Rodland, 2004]. Несмотря на множество преимуществ технологии SELDI-TOF, реальные ее возможности являются предметом ожесточенных дискуссий в научном сообществе. Одной из основных проблем является присутствие в сыворотке больших концентраций мажорных белков (например, альбумина). По 33 сравнению с ними концентрации большинства кандидатных маркеров, вероятнее всего, ничтожны. К сожалению, реальные пределы чувствительности метода при работе не с изолированными белками, а со сложной смесью, такой как сыворотка, еще не определены. На данном этапе технология SELDI-TOF широко применяется для разработки диагностики различных видов рака, оставаясь при этом в значительной степени эмпирическим методом [Diamandis, 2003; Diamandis, 2004]. Для разработки адекватного диагностического метода большое значение имеет правильный подбор выборок. Достоверность и универсальность результатов во многом определяется именно этим. Прежде всего, не должно быть статистически значимых отличий между сравниваемыми выборками по другим признакам, кроме наличия или отсутствия болезни [White et al, 2005]. Для этого во всех исследованиях используют сыворотки крови пациентов с впервые диагностированным раком, еще не проходивших никаких курсов лечения, так как результаты лечения сами по себе могут существенно отразиться на структуре белка. Исследуемые группы не должны заметно различаться по среднему возрасту, иначе найденные отличия могут быть следствием не болезни, а возрастных изменений. Другим источником систематических отличий могут быть различия в методиках получения или хранении образцов сыворотки вследствие того, что контрольные сыворотки получены из другого источника, чем сыворотки больных раком [White et al, 2005]. 1.5. Характеристика сывороточного амилоида А Из всех биомаркеров, идентифицированных с использованием массспектрометрических методов, наибольший интерес вызывает сывороточный амилоид А, так как, по последним данным, он может оказывать 34 непосредственное влияние на развитие опухоли. Сывороточный амилоид А острой фазы (A-SAA) впервые был обнаружен как растворимый предшественник амилоида А – белка, образующего амилоидные накопления при хроническом воспалении [Rosenthal et al, 1976, Skogen et al, 1980]. Концентрация A-SAA в крови при воспалении повышается до 1 мг/мл и более при норме 1–10 мкг/мл [Uhlar and Whitehead, 1999]. Известно, что концентрация A-SAA повышается при инфекционных заболеваниях бактериальной и вирусной природы [Nakayama et al, 1993], остром панкреатите [Rau et al, 2000; Mayer et al, 2002], инфаркте миокарда [Casl et al, 1995], после ожогов [Casl et al, 1996]. В большинстве случаев повышенный уровень сывороточного амилоида А коррелирует с тяжестью протекания и неблагоприятным исходом заболевания [Casl et al, 1995; Casl et al, 1996; Mayer et al, 2002]. Семейство сывороточных амилоидов А (SAA) включает в себя несколько гомологичных белков с молекулярной массой 11–12 кДа. У человека существует два почти идентичных гена, кодирующих A-SAA: SAA1 и SAA2. Гены SAA1, так и SAA2 представлены несколькими аллельными вариантами [Uhlar and Whitehead, 1999]. Еще один ген, относящийся к семейству сывороточного амилоида острой фазы, SAA3, у человека содержит инсерцию, приводящую к сдвигу рамки считывания и появлению стоп-кодона. Тем не менее, было показано, что в ответ на стимуляцию пролактином или индуктором воспаления LPS наблюдается транскрипция SAA3 в эпителиальных клетках молочной железы. Однако появления продукта трансляции этой мРНК не было обнаружено [Larson et al, 2003]. Помимо белков острой фазы, к семейству сывороточных амилоидов А относятся также конститутивные белки (C-SAA). У человека семейство CSAA включает один белок SAA4, уровень экспрессии которого более или менее постоянен. SAA4 обладает идентичностью аминокислотной последовательности около 50% с белками острой фазы A-SAA [Uhlar and 35 Whitehead, 1999]. Уже несколько десятилетий назад было замечено повышение уровня ASAA в крови у больных раком яичника [Rosenthal and Sullivan, 1979; Biran et al, 1986], раком простаты [Kaneti et al, 1984] и раком толстой кишки [Glojnaric et al, 2001]. Более того, уровень A-SAA коррелирует со стадией заболевания и достигает наибольших значений на стадии образования метастазов [Biran et al, 1986; Kaneti et al, 1984]. Недавно было проведено исследование уровня A-SAA при раке желудка, и обнаружена тенденция к увеличению концентрации A-SAA в сыворотке при увеличении размера и стадии опухоли. Через месяц после операции концентрация A-SAA достигала уровня, характерного для здоровых индивидуумов (0,0034±0,0028 г/л). Позже повышение концентрации A-SAA (0,17±0,6 г/л) свидетельствовало о наличии рецидива, при этом новым очагом опухоли могли служить различные органы: печень, лимфоидная ткань, кость [Chan et al, 2007]. Неоднократно исследовали влияние повышенной концентрации A-SAA на прогноз заболевания. Было показано, что для больных раком на поздней стадии при концентрации A-SAA выше 0,01 г/л средняя продолжительность жизни существенно меньше, чем при концентрации A-SAA ниже 0,01 г/л [Biran et al, 1986]. По данным Chan и соавторы, у пациентов с концентрацией A-SAA более 0,097 г/л риск летального исхода увеличивался почти в 4 раза. Эти наблюдения свидетельствует в пользу того, что повышенный уровень A-SAA может оказывать влияние на прогрессию злокачественной опухоли [Chan et al, 2007]. При использовании протеомных методов поиска биомаркеров A-SAA был выявлен как один из потенциальных биомаркеров рака яичника [Moshkovskii, 2005], легких [Gao et al, 2005; Liu et al, 2007], почки [Tolson et al, 2004; Engwegen et al, 2007], носоглотки [Cho et al, 2004]. 36 A-SAA был идентифицирован в качестве маркера метастазирования аденокарциномы простаты в костную ткань [Le et al, 2005]. Для рака легкого показано прогрессирующее увеличение концентрации A-SAA с прогрессированием рака. При этом показано, что после операции или химиотерапии уровень A-SAA снижается [Liu et al, 2007]. Сначала считалось, что A-SAA у пациентов со злокачественными опухолями синтезируется в печени, и повышение его концентрации в крови является следствием системного ответа организма на сопутствующее злокачественной опухоли воспаление. Однако для рака толстой кишки было показано, что повышенная экспрессия A-SAA наблюдается в опухолевой ткани [Gutfeld et al, 2006]. Повышенная экспрессия A-SAA была также обнаружена в клетках хориокарциномы и в трофобласте первого триместра беременности [Kovacevic et al, 2006]. В то же время для рака желудка иммуногистохимическое окрашивание показало наличие A-SAA в основном в кровеносных сосудах, а не непосредственно в опухолевых клетках [Chan et al, 2007]. Связь A-SAA c разнообразными заболеваниями человека, включая ревматоидный артрит, атеросклероз и злокачественные опухоли, привлекла к нему внимание специалистов. Данные о свойствах A-SAA, накопленные в последние годы, позволяют предположить, что этот белок может играть активную роль в патогенезе упомянутых заболеваний. К настоящему времени накоплено большое количество разносторонней информации о взаимодействиях белка A-SAA с различными белками-партнерами и их последствиях. A-SAA оказывает влияние на воспалительный процесс, индуцирует экспрессию ряда матриксных металлопротеиназ, изменяет липидный метаболизм, взаимодействует с межклеточным матриксом. Наибольший интерес вызывает способность A-SAA активировать экспрессию транскрипционного фактора NF-kB и матриксных металлопротеиназ [Vallon et al, 2001, He et al, 2003, O'hara et al, 2004, Jijon et al, 2005, Lee et al, 2005, 37 Mullan et al, 2006, Lee et al, 2006]. Способность A-SAA стимулировать пролиферацию клеток, ингибировать апоптоз, а также стимулировать ангиогенез была напрямую продемонстрирована на синовиоцитах больных ревматоидным артритом. Доказано, что за реализацию этих свойств отвечает рецептор FPRL1. Следует отметить, что патологические процессы, характерные для ревматоидного артрита, имеют много общего с развитием злокачественной опухоли [Lee, 2006]. На основании вышесказанного можно предположить, что A-SAA при злокачественных опухолях не является просто маркером воспаления, а тесно взаимосвязан с процессом опухолевой трансформации. Кроме того, A-SAA имеет еще ряд важных для потенциального маркера преимуществ. Во-первых, его концентрация в сыворотке в норме в 10-100 раз ниже, чем у других кандидатных маркеров. Во-вторых, при болезни концентрация A-SAA увеличивается в 100 и более раз, тогда как концентрация других маркеров, выявленных масс-спектрометрическими методами, меняется сравнительно слабо [Gutfeld et al, 2006; Kovacevic et al, 2006]. 38 Глава 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование выполнено на кафедре акушерства и гинекологии № 1 лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова (клиническая база ГКБ № 55 и РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН ) совместно с лабораторией диагностической протеомики Государственного учреждения «Научно- исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» РАМН. 2.1. Принципы сбора и объем материала исследования Материалом исследования явились клинические и морфологические данные 256 пациенток, находившихся на стационарном обследовании и лечении в гинекологических отделениях ГКБ № 55 и РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и их сыворотки крови. При поступлении в стационар все пациентки были обследованы по стандартному плану, включая: 1. Сбор анамнеза постоянного с учетом места паспортных жительства, данных, национальности, профессиональных и бытовых вредностей, вредных привычек, особенностей питания, семейного анамнеза, репродуктивного анамнеза, перенесенных заболеваний. При изучении анемнестических данных учитывали детальный анализ перенесенных и гинекологических сопутствующих заболеваний. экстрагенитальных Тщательному анализу и подвергнут характер менструального циклас учетом таких показателей, как возраст менархе,особенности длительности и становления обьема кровопотери. менструальной Репродуктивная функции, функция 39 оценивалась по возрасту начало половой жизни, количеству беременностей, их течению и исходу. 2. Физикальное исследование органов малого таза и молочных железы. 3. Лабораторные исследования (общий и биохимический анализ крови, общий анализ мочи, определение уровня СА125). 4. Инструментальные исследования: УЗ-томография органов малого таза и брюшной полости, маммография, рентгенография органов грудной клетки. 5. Эндоскопическое исследование органов желудочно-кишечного тракта, включая ирригоскопию и эзофагогастроскопию проводилось у всех пациенток с новообразованиями яичников для исключения патологии желудочно-кишечного тракта (при рентгенологические методы невозможности исследования применяли желудка и двенадцатиперстной кишки). 6. Далее обследование пациенток расширялось в пределах, необходимых для постановки диагноза( компьютерная томография и магнитнорезонансная томография распространенным выполснялась опухолевым процессом у для пациенток с верификации метастазирования. Специальные лабораторные биохимические методы исследования проводились по следующим схемам. У всех обследуемых пациенток производилось взятие венозной крови натощак до начала любого вида лечения. Затем производили отделение сыворотки от форменных элементов крови. Образцы инкубировались при комнатной температуре (18-20 С) в течение 30-40 минут до полного образования сгустка. После ретракции сгустка пробы центрифугировали в течение 10-15 минут, затем сыворотку сливали во вторичные пробирки и маркировали. Полученные пробы замораживали и хранили при температуре 70 С до получения гистологического заключения. 40 Как уже упоминалось в главе 1, выборки, используемые для разработки адекватного метода протеомной диагностики рака, должны соответствовать строгим требованиям [White et al, 2005]: 1. Отсутствие статистически значимых отличий между сравниваемыми группами, кроме признака наличие или отсутствие болезни. 2. Контрольная выборка должна включать в себя не только здоровых лиц, но и лиц, страдающих доброкачественными опухолями и неонкологическими заболеваниями. 3. Отсутствие различий в среднем возрасте, иначе найденные отличия могут быть следствием не болезни, а возрастных изменений. 4. Отсутствие различий в методиках получения и хранения образцов сывороток крови между сравниваемыми группами. Сообразуясь с указанными требованиями, в наше исследование были отобраны 4 группы пациенток: 1. Больные раком яичников – основная группа 2. Больные доброкачественной опухолью яичника – контроль. 3. Больные миомой матки – контроль. 4. Здоровые женщины – контроль. Критериями отбора пациенток в исследуемую выборку явились: 1. Единообразие этнической принадлежности. 2. Гистологически верифицированный диагноз. 3. Возраст – по типу «случай-контроль» После верификации диагноза из 256 пациенток была сформирована исследуемая выборка, включившая 91 пациентку с учетом критериев отбора (таблица № 1). Таблица № 1 41 Исследуемая выборка пациенток № группы I Диагноз Рак яичников Количество пациенток 34 Средний возраст (минимальный - максимальный) 47 (26-70) лет II Доброкачественная опухоль яичника 14 44 (19-73) года III Миома матки 17 44 (22-56) года IV Здоровые 26 41 (21-59) год Как видно в таблице № 1, основную группу составили 34 пациентки, страдавшие раком яичников, отобранные в гинекологическом отделении РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Вторую группу доброкачественными составили 14 новообразованиями пациенток, яичников, страдавших отобранные в гинекологическом отделении ГКБ № 55. Третью группу составили 17 пациенток, страдавших миомой матки, отобранные в гинекологическом отделении ГКБ № 55. Четвертую группу составили 26 пациенток без гинекологической патологии («здоровые»), отобранные при очередном плановом гинекологическом обследовании в гинекологическом отделении ГКБ № 55. Средний возраст пациенток в исследуемых группах был примерно одинаков – 41-47 лет. 2.2. Измерение концентрации амилоида А и CA125 методом иммуноферментного анализа Для определения концентрации амилоида А и CA125 и использовали спектрофотометр Labsystems Multiscan PLUS, Финляндия. Для определения концентрации CA125 использовали набор для иммуноферментного анализа СА125 EIA (CanAg, Канада). Для определения концентрации A-SAA использовали набор для 42 иммуноферментного анализа Human SAA (Biosource, США). Анализ проводили в соответствии с протоколами производителя. Для всех сывороток концентрацию A-SAA измеряли, как минимум, в двух повторах, а для высоких концентраций – в разных разведениях. 2.3. Профилирование сывороток с применением SELDI-TOF Для профилирования сывороток использовали масс-спектрометр SELDITOF Protein Biology System II (PBS II) (Ciphergen, США). Для оптимизации условий профилирования были использованы различные типы белковых чипов: NP20 (нормальнофазовые), SAX2 (сильные анионообменники), WCX (слабые катионообменники), H4 (обращеннофазовые) (Ciphergen Biosystems, США). Наилучшие спектры были получены при использовании чипов NP20. 2.4. Анализ масс-спектров Анализ пиков масс-спектров проводили в пределах 5500 – 17500 Да. С этой целью была использована программа Biomarker Wizard™ (Ciphergen Biosystems) со следующими настройками: соотношение сигнал/шум (первая ступень) 10, соотношение сигнал/шум (вторая ступень) 5, пороговая интенсивность пика 0%, допустимая ошибка в определении массы 0,2%. 2.5. Многофакторный анализ полученных данных С целью статистической обработки материала исследования была сформирована база данных, введенных в таблицу MS Excel, включившая: клинические сведения о пациентках исследуемой выборки, данные о концентрациях СА125 и A-SAA в их сыворотках крови, измеренные методом ИФА и данные масс-спектрометрии - значения интенсивностей 48 пиков, идентифицированных с помощью программы Biomarker Wizard™. 43 Всю статистическую обработку материала проводили с помощью R языка, находящегося в открытом доступе [www.r-project.org]. Для создания диагностического алгоритма были применены два метода классификации: метод опорных векторов (SVM) [Vapnik, V.N.,1998] и метод логистической регрессии (LR) [Skates et al, 2004]. Метод опорных векторов представляет собой метод распознавания образов с учителем [Guyon et al, 2002] и масс-спектров SELDI-TOF [Le et al, 2005; Zhang et al, 2006; Mao et al, 2005]. Основной целью метода опорных векторов является поиск наилучшего способа разделения множества исследованных сывороток на «раковые» и «не раковые». Перед применением метода опорных векторов был проведен отбор информативных признаков. Для этого применили алгоритм рекурсивного исключения признаков (Recursive Feature Elimination algorithm RFE, [Guyon et al, 2002]). Сначала алгоритм применяли на всех данных, затем переменная, получившая наименьший вес, исключалась, и эту операцию повторяли, пока все переменные не были ранжированы в соответствии с порядком их исключения. Затем отбирали тот набор признаков, который позволял добиться наилучшей точности классификации на всей исследуемой выборке. В качестве альтернативы методу опорных векторов применяли метод логистической регрессии, который позволяет оценивать вероятность принадлежности исследуемого образца сыворотки крови больной раком яичников. Как и в методе опорных векторов, для улучшения модели предварительно проводили отбор признаков. Для отбора признаков использовали ступенчатую модель отбора, основанную на информационном критерии Акаике (AIC), который позволяет достигнуть баланса между сложностью модели (количеством входящих в уравнение регрессии переменных) и ее эффективностью для классификации. Для проверки чувствительности и специфичности разработанных диагностических моделей использовали 10-кратную перекрестную проверку 44 достоверности. При этом все имеющиеся образцы разделили на 2 группы. Первую группу использовали в качестве обучающей выборки для разработки диагностического алгоритма, а вторую группу - в качестве экзаменационной выборки для его проверки. 10-кратную перекрестную проверку достоверности проводили по 100 раз для диагностических алгоритмов, полученных как методом опорных векторов, так и методом логистической регрессии. Для каждого диагностического алгоритма была вычислена чувствительность и специфичность с доверительными интервалами. Сравнительно новым, простым и эффективным подходом к классификации является метод пар с наибольшим счетом (TSP) [Tan et al, 2005; Xu et al, 2005]. Этот метод основан на относительных, а не абсолютных интенсивностях пиков и позволяет получать правила классификации, которые легко интерпретировать. Как и метод опорных векторов, этот метод применим в случае, когда число исследуемых признаков очень велико. Реальные значения интенсивностей пиков внутри каждого профиля заменяли рангами. Затем выявляли такие пары пиков, у которых ранги в наибольшей степени различались между исследуемыми классами. Для обработки данных с помощью TSP и проверки эффективности модели путем перекрестной проверки на достоверность с исключением по одной пробе использовали программу, созданную разработчиками метода TSP и доступную на их сайте (http://www.bme.jhu.edu/~actan/KTSP/) с неизмененными настройками. Для анализа взаимосвязи между интенсивностью масс- спектрометричекого сигнала и концентрации амилоида А в сыворотке, измеренной методом иммуноферментного анализа, использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмана, который позволяет выявлять нелинейные взаимосвязи. 45 Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Клиническая характеристика Первично материалом исследования явились клинические и морфологические данные 256 пациенток, находившихся на стационарном обследовании и лечении в гинекологических отделениях ГКБ № 55 и РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Таблица№ 2. Количественный состав первично обследованных пациенток. Клинический Гистологический диагноз Количество диагноз пациенток Рак яичников Серозная цистаденокарцинома I-II стадии Муцинозная цистаденокарцинома 8 Рак яичников III-IV Серозная цистаденокарцинома cтадии 12 92 Муцинозная цистаденокарцинома 21 Доброкачественные Серозная цистаденома 23 опухоли яичников Муцинозная цистаденома 12 Зрелая тератома 31 Лейомиома 28 Миома матки Здоровые 29 Всего 256 Учитывая протеомной строгие критерии отбора выборки для разработки метода диагностики , о которых упоминалось ранеее, была ксформирована исследуемая выборка (91 пациентка), подразделенная на четыре группы сравнения с учетом диагноза (таблица № 3). 46 Таблица № 3 Количественный состав исследуемой выборки пациенток с учетом диагноза № Клинический диагноз Рак яичников I-II стадии Рак яичников III-IV стадии I II Доброкачественная опухоль яичника III Миома матки IV Здоровые Гистологический диагноз Количество пациенток Серозная цистаденокарцинома Муцинозная цистаденокарцинома Серозная цистаденокарцинома 5 2 22 Муцинозная цистаденокарцинома Серозная цистаденома 5 9 Муцинозная цистаденома 2 Зрелая тератома 3 Лейомиома 17 26 Всего Все пациентки исследуемой выборки были 91 русскими по национальности. В первую группу отбирали только тех пациенток, у кого после проведенного хирургического вмешательства был гистологически верифицированный диагноз рака яичников и установлена стадия опухолевого процесса в соответствии с классификацией FIGO, 2009. Из 34 пациенток 27 (79,4%) страдали серозной аденокарциномой и 7 (20,6%) пациенток - муцинозной аденокарциномой. Из 34 пациенток 7 (20,6%) страдали раком яичников I-II стадии (5 серозной и 2 муцинозной аденокарциномой) и 27 47 (79,4%) пациенток - III-IV стадией рака яичников (22 серозной и 5 муцинозной аденокарциномой). Во вторую группу были отобраны пациентки, у которых после хирургического вмешательства был гистологически верифицирован диагноз доброкачественной опухоли яичников. Из 14 пациенток у 9 (64,3%) была серозная цистаденома яичника, у 2 (14,3%) - муцинозная цистаденома и у 3 (21,4%) - зрелая тератома. Третью группа составили 17 пациенток, страдавшие миомой матки, подвергнутые хирургическому лечению по поводу больших размеров миомы матки (более 14 недель условной беременности) или менометроррагии, приводящей к анемиии со снижением гемологлобина до 85 г/л. По гистологическому строению все случаи миомы матки являлись лейомиомой. В четвертую группу были отобраны 26 пациенток, обратившихся по поводу планового гинекологического обследования, которые в результате проведенного обследования были признаны здоровыми со стороны органов репродуктивной системы. В анамнезе всех пациенток исследуемой выборки не было отмечено никаких профессиональных и бытовых вредностей. Из 91 пациентки 76 (83,5 %) являлись служащими, 15 (16,4%) – домохозяйками, 20 (21,9%) Из вредных привычек следует отметить курение (наибольшее количество курящих было в группе пациенток, страдавших раком яичников и миомой матки). 22 (24,1%) отметили в анамнезе аллергию (9 - пищевую и 13- на различные группы антибиотиков), 39 (42,8%) пациенток отметили наличие родственников с онкологическими заболеваниями в семейном анамнезе, причем из 34 пациенток, страдавших раком яичников, онкологически отягощенный анамнез был у 9 (26,3%) пациенток. 48 Анализ перенесенных соматических заболеваний у пациенток исследуемой выборки представлен в таблице № 4. Таблица № 4 Перенесенные заболевания в анамнезе пациенток исследуемой выборки Нозология I группа II группа III группа IV группа n =34 n =14 n =17 n = 26 Детские инфекционные заболевания 21 (61,7%) 10 (71,4%)* 12 (70,5 %)* 7 (26%) Острые респираторные вирусные заболевания 28 (82,3%) 7 (50%) 11 (64,7%) 8 (30%) Гипертоническая болезнь 15 (44%) 6 (42,8%)* 5 (29,4%) 3 (11,5%) Сахарный диабет 5 (14,7%)* 1 (7,1%) 2 (11,7%) 1 (3,84%) 1 (2,9%) 4 (28,5%) 12 (70,5%)* 2 (7,69%) 15 (44,1%) 8 (57,1%)* 4 (23,5%)* 3 (11,5%) 3 (8,8%) 2 (14,2%) 9 (52,9%)* 2(7,6%) Ожирение Заболевания желудочно-кишечного тракта Варикозная болезнь нижних конечностей *р<0,05 достоверные различия между контрольной группой и грeпами исследования. Как можно видеть в таблице № 4, из детских инфекций наиболее часто в анамнезе пациенток в каждой группе отмечались перенесенные инфекционные заболевания, в частности, ветряная оспа и краснуха. Частота детских инфекционных и острых респираторных вирусных заболеваний была выше в группе пациенток, страдавших раком яичников. Патология желудочно-кишечного тракта и гипертоническая болезнь также превалировала (44,0% и 44,1%, соответственно) в анамнезе пациенток, 49 страдавших раком яичников по сравнению с другими группами. У всех пациенток гипертоническая болезнь была медикаментозно компенсированная, без поражения органов мишеней. У пациенток, отметивших сахарный диабет в анамнезе, при обследовании был подтвержден диагноз инсулиннезависимого сахарного диабета второго типа. Уровень глюкозы натощак не превышали 6,0 ммоль/л. Степень ожирения оценивали по индексу массы тела (отношение веса в килограммах к росту в метрах, возведенное в квадрат) – таблица № 5. Таблица № 5 Средний индекс массы тела у пациенток исследуемой выборки Рак яичников Доброкачественные опухоли яичников Миома матки Здоровые 18-25 (21,5) 20-28 (24)* 25-30 22-26 (24) Индекс массы тела (27,5)* *р<0,003 Из таблицы № 5 следует, что наиболее высокий индекс массы тела наблюдался в группе пациенток с миомой матки. В группе пациенток, страдавших раком яичников, доброкачественными опухолями яичников и здоровых индекс массы тела варьировал в пределах референсных значений (20–25). В этой же группе была отмечена высокая частота (52,9%) варикозной болезни нижних конечностей. В таблице № 6 представлены данные репродуктивного анамнеза пациенток исследуемой выборки. Таблица № 6 50 Данные репродуктивного анамнеза пациенток исследуемой выборки Данные анамнеза пациенток исследуемой выборки Средний Средний Количество Среднее Среднее Среднее возраст возраст беременностей количество количество количество Группа начала менархе абортов родов выкидышей половой (годы) жизни (годы) I 23,5 12 1,5 2 1 1 II III IV (19-28) (11-13) (0-3) (0-4) (0-2) (0-2) 19 14 4 2 2,5 2 (16-22) (13-15) (2-6) (0-4) (2-3) (1-3) 19,5 13,5 5 3 2 3 (15-24) (12-15) (3-7) (0-6) (1-3) (2-4) 18,5 13 3,5 2 2 2,5 (15-22) (12-14) (1-6) (0-4) (1-3) (2-3) 51 Как видно в таблице № 6, группы пациенток в исследуемой выборке практически не различаются по указанным признакам. Что касается патологии органов малого таза (таблица № 7), то чаще всего в анамнезе пациенток исследуемой выборки отмечались хронические заболевания придатков дисфункция яичников, большего количества матки, фоновые невынашивание пациенток, заболевания беременности. страдавших раком шейки У матки, значительно яичников и доброкачественными новообразованиями яичников, в анамнезе наблюдалось хроническое воспаление придатков матки по сравнению с пациентками, страдавшими миомой матки и здоровыми женщинами. В то же время, в группе пациенток, страдавших раком яичников, реже, по сравнению с другими группами, отмечались фоновые заболевания шейки матки. Таблица № 7 Гинекологические заболевания в анамнезе пациентов исследуемой выборки Количество пациенток Нозология I группа II группа III группа IV группа n =34 n =14 n =17 n = 26 Хронические воспалительные заболевания придатков Фоновые заболевания шейки матки 21 (61,0%)* 8 (57,0%)* 3 (17,0%) 3 (11,0%) 10 (29,4%) 7 (50,0%)* 10 (58,0%) 16 (61,0%) Дисфункция яичников 23 (67,6%)* 9 (64,2%)* 11 (64,0%) 5 (9,2%) Невынашивание беременности 3 (8,8%) 5 (35,7%)* 2 (11,7%) 2 (7,6%) *р<0,005 Дисфункция яичников намного чаще имела место в группах пациенток с гинекологической патологией по сравнению с группой здоровых женщин, как 52 этого и следовало ожидать. А в группе пациенток, страдавших доброкачественными новообразованиями яичников чаще, по сравнению с другими группами, наблюдалось невынашивание беременности. Гинекологических операций в анамнезе не имели 58 пациенток ( 63,7 %) . 33 пациентки ( 36,2 %)перенесли в анамнезе гинекологические оперативные вмешательства. Причем 21( 23 %) пациентка епернесла раздельное диагностическое выскабливание по поводу дисфункции яичников . У 12(13,1 %) проводились различные операции- в 5 случаях- резекция яичников , в 7 – внемачтоная беременность. На момент обращения 68 % пациенток предъявляли жалобы различного характера, однако у 32% пациенток субъективные ощущения отсутствовали . В группе пациенток, страдающих раком яичников , не предъявляли жалоб 18 пациенток (52,9%), в группе с доброкачественными опухолями яичников - 8 пациенток ( 57,1%), в группе пациенток с миомой матки – 3 (17,6 %) . Наиболее распространенными жалобы , с которыми обращались пациентки являлись слабость, потеря веса, болевой синдром, увеличение живота в обьеме. Жалобы на слабость в группе пациенток с миомой матки составила 4,8%, у пациенток с доброкачественными опухолями яичников в 12,3% случаев, в то время как в группе пациенток больных раком яичников эта жалоба встречалась в 33,4% случаев. Болевой синдром отмечался у пациенток с миомой матки в 24% случаев, у пациенток с доброкачественными опухолями в 13,5%, у больных раком яичников 26,5 % . Увеличение живота в обьеме и потеря веса наблюдалась чаще у пациенток , страдающих раком яичников 33% и 22% соответственно. У пациенток же с доброкачественными опухолями яичников это цифра была значительно ниже и составила 5,4 %. Все отмеченные различия между группами не являются значимыми. Таким образом, сформированная нами выборка пациенток и банк их образцов 53 крови полностью отвечали требованиям, необходимым для разработки адекватного метода протеомной диагностики злокачественных новообразований, в частности, рака яичников. 3.2. Определение концентрации белка A-SAA и CA125 в сыворотках крови методом иммуноферментного анализа Значения концентраций A-SAA и CA125 в сыворотках крови пациенток исследуемой выборки, измеренные методом иммуноферментного анализа (ИФА), представлены в таблице № 7 и на рисунках 1, 2, 3. Как можно видеть в таблице № 7 и на рисунках 1 и 2, у большинства больных раком яичников наблюдались значительно повышенные уровни ASAA в сыворотке крови, вплоть до 3-4 г/л (в норме концентрация A-SAA составляет 0,01-0,03 г/л [Uhlar & Whitehead, 1999]), не связанные со стадией заболевания. Из 7-ми пациенток, страдавших раком яичников ранних стадий, у 4-х уровень A-SAA был чрезвычайно высоким (рис.2). На рисунке 2 пунктирной линией показано примерное критическое значение A-SAA, идентифицирующее сыворотки крови больных раком яичников. Конкретные значения концентраций выше 1 г/л не показаны. Столбики, соответствующие ранней стадии рака яичников, выделены черным цветом. Таблица №8 54 Данные о концентрациях A-SAA и CA125 в сыворотках крови пациенток исследуемой выборки, измеренные методом ИФА Исследуемая выборка Количество пациенток Больные раком яичника 1-2 стадии 7 Больные раком яичников 3-4 стадии 27 Всего больных раком яичников 34 Больные с доброкачественными опухолями яичника Больные миомой матки 14 Здоровые женщины 26 Всего без рака яичников 56 17 A-SAA (г/л) Среднее ± среднее квадратичное отклонение/ Медиана (Max-Min) CA125 (МЕ/мл) Среднее ± среднее квадратичное отклонение / Медиана (Max-Min) Норма = 0,01-0,03 Норма = 0-30 0,748 ± 0,688 0,708 (0,01-1,760) 1,080 ± 1,489 0,247 (0,005-4,465) 0,981 ± 1,376 0,333 (0,005-4,465) 0,565 ± 1,393 0,031 (0,002-4,767) 0,013 ± 0,008 0,011 (0,004-0,038) 0,044 ± 0,053 0,026 (0,003-0,184) 0,163 ± 0,717 0,017 (0,002-4,767) 230 ± 251 139 (33-826) 780 ± 1021 466 (2-4177) 667 ± 957 257 [2-4177] 33 ± 30 21 (2-106) 56 ± 35 45 (14-140) 15 ± 7 14 (5-41) 32 ± 30 20 (2-140) Рисунок 1. 55 г/л 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 РЯ 1-­‐2 стадии РЯ 3-­‐4 стадии ЦА яичника A-­‐SAA у пациенток Миома матки Здоровые A-­‐SAA в норме Рисунок 1. Cредние значения концентрации A-SAA в сыворотках крови пациенток исследуемой выборки в сравнении с верхней границей нормы. *р<0,005 56 Рисунок 2. Концентрации A-SAA в исследованных сыворотках. Буквами по горизонтальной оси обозначены группы пациенток (субъектов): C - здоровые женщины, U - миома матки, B - доброкачественная опухоль яичника, O - рак яичника Следует отметить, что у некоторых пациенток, не страдавших раком яичников, концентрация A-SAA в сыворотке крови также была существенно выше по сравнению с принятой в литературе нормой, достигая значения 0,180 мг/мл. Так, у 2-х из 14 пациенток с доброкачественными опухолями яичника уровень A-SAA в сыворотке крови достигал 3–4 г/л. Обе пациентки страдали серозной цистаденомой яичника. 57 Полученные результаты показали, что A-SAA, как маркер рака яичника, обладает чувствительностью 50% (из 34 в 17 ) и специфичностью 96,4% (из 56 в 54 ) определенных случаях) при критическом значении его концентрации 0,3 г/л (2,6×10-5 М). Что же касается концентраций CA125 (рис. 3), то у больных раком яичников она была значительно выше референсных значений (0-30 МЕ/мл), а у больных цистаденомой яичников и здоровых женщин не превышала норму. У больных миомой матки значения концентраций CA125 незначительно превышали референсные значения. В то же время, концентрация A-SAA во всех исследованных случаях миомы была очень низкая. МЕ/мл 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 РЯ 1-­‐2 стадии РЯ 3-­‐4 стадии CA125 у пациенток ЦА яичника Миома матки Здоровые СА125 в норме Рисунок 3. Средние значения концентраций СА125 в сыворотках крови пациенток исследуемой выборки в сравнении со значениями верхней границы нормы 3.3. Идентификация белка A-SAA в сыворотке крови 58 методом масс-спектрометрии SELDI-TOF Для наилучшего определения пика, соответствующего A-SAA, был проведен подбор условий профилирования с использованием сывороток крови с известными концентрациями A-SAA (таблица № 7). С этой целью были апробированы различные типы чипов (анионообменный, катионообменный, обращеннофазовый, нормальнофазовый). Наилучших результатов удалось добиться при применении нормальнофазовых чипов NP20 и предельно простой и быстрой процедуры профилирования. Было проведено профилирование всех сывороток крови на NP20 чипах с помощью протокола снятия спектров, сфокусированное на массах 11,52-11,68 кДа. Примеры масс-спектров, полученные с использованием нормальнофазовых чипов NP20, приведены на рисунке 4. Все пики в спектрах определяли автоматически с помощью программы Ciphergen Protein с базовыми настройками. При этом пик массой 11,68 кДа был определен во всех сыворотках с концентрацией A-SAA 0,333 г/л и более (по данным иммуноферментного анализа). Другими словами, все 19 сывороток с концентрацией A-SAA выше 0,3 г/л имели хорошо выраженный пик в интересующем нас интервале значений m/z (рисунок 5). Среди исследованных образцов сывороток крови не было таковых с концентрацией A-SAA в пределах от 0,333 до 0,184 г/л. Это обстоятельство позволяет утверждать, что чувствительность масс-спектрометрического определения A-SAA в сыворотке крови лежит в пределах концентраций 0,20,3 г/л (1,7-2,6×10-5 М), что показано пунктирной линией на рисунке 2. На рисунке 6 показана тенденция к увеличению интенсивности массспектрометрического сигнала, соответствующего сывороточному амилоиду А1α, с увеличением концентрации последнего, однако это увеличение не является монотонным. концентрацией A-SAA Коэффициент в сыворотке корреляции и Спирмана между интенсивностью масс59 спектрометрического сигнала составил 0,55, что соответствует умеренной корреляции. Невысокое значение коэффициента корреляции обусловлено тем, что в 72 из 91 пробы сывороточный амилоид А содержался в концентрации ниже 0,180 г/л, что является ниже предела чувствительности определения ASAA в сыворотке крови. При концентрациях A-SAA выше 1 г/л наступает насыщение и величина масс-спектрометрического сигнала не увеличивается. Кроме того, следует учитывать, что во многих сыворотках крови присутствует несколько пиков разных форм сывороточного амилоида, но иммуноферментный анализ позволяет измерить только его суммарное содержание. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что массспектрометрическая детекция A-SAA не является количественной, однако она позволяет определять A-SAA в сыворотке крови при его концентрациях 0,3 г/л и выше. Критический уровень 0,2-0,3 г/л соответствует 1,7-2,6×10-5 M. Следует отметить, что критический уровень A-SAA, определяемый с помощью масс-спектрометрии SELDI-TOF, очень близок критическому уровню этого белка для ряда воспалительных заболеваний [Casl et al, 1995; Casl et al, 1996] и, поэтому, дает возможность использовать прямое массспектрометрическое профилирование для быстрого определения повышенного уровня A-SAA в сыворотке крови. Масс-спектрометрическое определение масс методом SELDI-TOF-MS обладает невысокой точностью. Тем не менее, поскольку спектры были откалиброваны с использованием в качестве внешних стандартов белков, близких по массе к A-SAA, погрешность в определении массы A-SAA не превышала 3-5 Да, что позволяет различить различные формы A-SAA в сыворотках с содержанием A-SAA более 0,3 г/л. Возможность наблюдать различные формы одних и тех же белков является важным преимуществом масс-спектрометрических методов по сравнению с иммунологическими методами детекции белков. 60 В 13 случаев, наряду с пиком 11683 Да, присутствует также пик равной или несколько меньшей интенсивности с m/z 11526 Да, соответствующий форме A-SAA с отщепленным аргинином на N-конце (рис. 7А). В одном случае присутствует также небольшой пик с m/z 11439, который, по-видимому, соответствует SAA1α с отщепленными 2-мя Nконцевыми аминокислотами аргинином и серином. В 11 спектрах наблюдается пик более низкой, по сравнению с пиком SAA1α, интенсивности с m/z примерно 11628 Да, который, по-видимому, соответствует SAA2α. В 8 из 11 спектров вместе с этим пиком наблюдается пик с m/z 11472, соответствующий форме SAA2α с отщепленным N-концевым аргинином (рис. 7А). На трех масс-спектрах присутствует пик 11649 Да, соответствующий, предположительно, SAA2β. На одном масс-спектре присутствуют одновременно пики 11645 Да (SAA2β), 11490 Да (SAA2β с отщепленным аргинином), 11404 Да (SAA2β с отщепленными аргинином и серином (рис. 7В). Примеры различных форм сывороточного амилоида, детектированных на масс-спектрах, приведены на рисунке 7. Как можно видеть на рисунке 7, в 16 из 18 спектров присутствует пик массой 11683 Да, соответствующий сывороточному амилоиду 1 альфа. 61 Рисунок 4. Примеры масс-спектров сывороток, полученных с использованием нормальнофазовых чипов NP20 62 Рисунок 5. Чувствительность определения A-SAA в сыворотке крови с помощью масс-спектрометрии SELDI-TOF. Для каждого спектра показаны значения концентрации A-SAA, измеренные методом иммуноферментного анализа. Стрелками показаны пики A-SAA на спектрах. 63 14.000 12.000 10.000 8.000 6.000 4.000 2.000 0.000 1 6 11 16 21 26 31 36 Концентрация A-SAA, г/л 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 Интенсивность пика с m/z 11680 Да Рисунок 6. Для каждой из 91 пробы приведены значения концентрации сывороточного амилоида А (г/л) и значения интенсивностей пика с m/z 1681, соответствующего основной форме сывороточного амилоида - SAA1α. 64 Рисунок 7. На рисунке представлены примеры масс-спектров сывороток, содержащих различные формы сывороточного амилоида А1 и 2. А: пики SAA1α (11682,7 Да), SAA1α с отщепленным N-концевым аргинином (11526,5 Да), SAA2α (11628,7 Да), SAA2α с отщепленным N-концевым аргинином (11472,5 Да); Б: SAA1γ (11654,7Да) и SAA1γ с отщепленным N-концевым аргинином (11498,5 Да); В: SAA2β (11647,8 Да), SAA2β с отщепленным N-концевым аргинином (11491,6 Да), SAA2β с отщепленными аргинином и серином (11404,5 Да). Пик с m/z 11698 Да, предположительно, соответствует окисленной форме SAA1α. 65 На нескольких масс-спектрах присутствует также пик 11728-11740 Да, соответствующий, по-видимому, SAA1β, однако на большинстве спектров он плохо разрешен из-за высокой интенсивности соседнего пика SAA1α с m/z 11683 Да. В одном случае мажорный пик группы сывороточного амилоида имеет m/z 11656 Да и соответствует, по-видимому, SAA1γ. Вместе с ним на этом спектре присутствует пик 11495 Да, соответствующий форме SAA1γ с отщепленным аргинином (рис. 7Б). На одном спектре присутствует пик высокой интенсивности с m/z 11698, который отличается примерно на 16 Да от пика 11683 и может представлять собой окисленную форму последнего. Полученные нами данные свидетельствуют, что основными аллелями АSAA в исследуемой выборке являются SAA1α и SAA2α, что соответствует данным других авторов, проанализировавших иммуноаффинными методами с масс-спектрометрической детекцией 96 сывороток крови здоровых людей с целью определения различных модификаций преобладающих в ней белков, в том числе А-SAA. SAA1α и его фрагменты с отщепленными N-концевыми аминокислотами аргинином и серином были определены в 90 из 96 исследованных сывороток крови здоровых людей, а SAA2α и его фрагменты только в 35 из 96 образцов. В 18 образцах сыворотки крови определялся SAA1γ и его модификации [Nedelkov et al, 2005]. В отличие от исследования Nedelkov и соавт., мы определяли А-SAA в цельной сыворотке и только в образцах с резко повышенным уровнем А-SAA, поэтому сведения, полученные нами, имеют оценочный характер. Преобладание пика SAA1 в спектрах больных раком яичника позволяет предположить, что при раке яичника в большей степени повышается экспрессия SAA1, а не SAA2. Следует отметить, что различия в массе между некоторыми аллельными вариантами (например, 11628 Да, 11645 Да и 11655 66 Да) не превышает 0,2%, поэтому, при дальнейшей статистической обработке они идентифицировались как один пик. Всего нами было определено 48 пиков в интервале m/z 5500-17500 Да, каждый из которых имеет высокую интенсивность (соотношение сигнал/шум > 5) по крайней мере в одной исследованной пробе. Мы пытались убедиться таким образом, что каждый из рассматриваемых пиков на масс-спектре соответствует реальному белковому продукту, а не является физическим артефактом или производным матрицы. Список интенсивностей полученных пиков для всех сывороток, разделенных на два класса («рак» и «отсутствие рака»), был использован в качестве исходных данных для разработки диагностических алгоритмов с использованием различных статистических методов. 3.4. Результаты классификации масс-спектров SELDI-TOF методом пар с наибольшим счетом Классификатор метода пар с наибольшим счетом (TSP) был предложен для обработки данных ДНК-микрочипов и идентификации генов-маркеров [Xu et al, 2005]. Этот алгоритм классифицирует образцы на основе разностей интенсивностей пиков, а не абсолютных значений интенсивностей, отбирая одну или несколько (k-TSP) пар биомаркеров с наибольшей разницей интенсивностей. Так как данные масс-спектрометрии в целом аналогичны данным ДНК-микрочипов, мы применили TSP-классификацию к спектрам исследуемой выборки, что позволило выявить только одну пару с наибольшим счетом, состоящую из интенсивностей пиков 11681 Да и 13769 Да. В случае, если разность интенсивностей указанных пиков положительна, исследуемый образец классифицировали как «рак», если отрицательна, то как «отсутствие рака». 67 Оба пика выбранной пары соответствовали известным маркерам рака яичника. Так, пик с m/z 11681 Да соответствует основной форме A-SAA [Moshkovskii et al, 2005], концентрация которого при раке яичника повышается, а пик с m/z около 13769 Да, соответствует нативной форме транстиретина, концентрация которого понижается при раке яичника [Gericke et al, 2005]. Пара маркеров, отобранная в нашем исследовании - А-SAA-TTR, представляет собой новую бинарную переменную (разность интенсивностей, принимающую положительные или отрицательные значения), которую можно комбинировать с данными иммуноферментного анализа для улучшения классификации. 3.5. Результаты многофакторного анализа протеомных данных С целью определения оптимального набора протеомных данных, которые могли бы использоваться для диагностики рака яичников, нами был предпринят многофакторный анализ методами опорных векторов (SVM) и логистической регрессии (LR). В качестве исходных данных были апробированы различные варианты комбинаций протеомных данных, в частности: 1. Концентрации Са125, измеренные методом ИФА. 2. Концентрации CA125 и А-SAA, измеренные методом ИФА. 3. Значения интенсивностей 48 SELDI-MS m/z пиков, определенные методом масс-спектрометрии. 4. Концентрации CA125 и А-SAA, измеренные методом ИФА и данные масс-спектрометрии; 68 5. Концентрации CA125 и А-SAA, измеренные методом ИФА и формализованные данные масс-спектрометрии (две переменные, отобранные методом пар с наибольшим счетом). Эффективность диагностических алгоритмов, полученных на основе указанных комбинаций с помощью классификаторов SVM и LR, проверяли путем перекрестной проверки на достоверность. Доверительный интервал вычисляли для доверительной вероятности, равной 0,05. Значения точности, чувствительности и специфичности полученных диагностических алгоритмов представлены в таблицах № 8 и 9 из которых явствует, что добавление значений концентраций А-SAA к значениям концентраций CA125 не приводит к повышению точности классификации, несмотря на то, что у некоторых больных раком яичников уровень А-SAA был существенно повышен на фоне нормального уровня CA125. Многофакторный анализ данных масс-спектрометрии методом опорных векторов (таблица № 9) дал лучшие результаты, чем метод логистической регрессии (таблица № 10): точность метода опорных векторов (SVM) для данных масс-спектрометрии использовании только оказалась концентрации значительно CA125 (89,5% выше, чем против при 86,1%, соответственно). LR-классификатор, напротив, дал существенно лучшие результаты, чем SVM при обработке бинарных данных методом пар с наибольшим счетом (TSP) в комбинации с данными ИФА, причем данные TSP существенно повысили точность классификации (90,7% по сравнению с 8586% только для CA125). Наилучшей точности распознавания рака яичников и его отсутствия, составившей 95,2%, удалось достичь при использовании метода опорных векторов для анализа комбинированных данных ИФА и масс-спектрометрии. Для методов классификации, построенных с использованием метода опорных векторов на основе только масс-спектрометрических данных и на основе комбинации масс-спектрометрических данных с данными ИФА, был 69 проведен подробный анализ результатов перекрестной проверки достоверности. Таблица № 9 Результаты применения метода опорных векторов для классификации сывороток крови пациенток исследуемой выборки Метод Точность Специфич- Чувствитель- опорных векторов (в %) ность ность (в %) (в %) SVM (CA125)* 86,2±0,7 98,8±0,3 64,7±1,7 SVM (ИФА)** 86,4±0,7 96,5±0,5 70,3±1,8 SVM RFE (MS)*** 89,5±0,7 93,3±0,7 83,6±1,6 86,7±0,7 92,8±0,8 77,5±1,6 95,2±0,4 98,1±0,4 90,8±1,1 SVM (TSP(MS)+ИФА)**** SVM RFE (ИФА+MS)***** * ** В качестве единственной переменной применяли уровень CA125. В качестве переменных использовали концентрации CA125 и A-SAA, измеренные методом иммуноферментного анализа. *** В качестве переменных использовали 48 значений интенсивности пиков SELDI- спектров. **** Два значения концентраций, измеренных с помощью ИФА, совместили с бинарной переменной, полученной путем применения TSP к масс-спектрометрическим данным. ***** 48 переменных масс-спектров SELDI-TOF комбинировали с двумя переменными ИФА. 70 Таблица № 10 Результаты применения метода логистической регрессии для классификации сывороток крови пациенток исследуемой выборки Метод Точность Специфич- Чувствитель- логистической (в %) ность ность (в %) регрессии (в %) LR (CA125) 85,1±0,7 95,6±0,5 67,5±1,7 LR (ИФА) 86,6±0,7 94,3±0,6 74,2±1,7 LR (MS) 86,0±0,7 87,5±1,3 83,7±1,5 90,7±0,6 96,9± 0,5 81,2±1,4 91,9±0,6 92,7±0,7 90,7±1,1 LR AIC (TSP(MS)+ИФА) LR AIC (ИФА+MS) В таблице № 11 приведен полный список исследованных сывороток крови, которые хотя бы один из 100 раз были неправильно распознаны. Для каждой сыворотки указан процент ошибок при проверке двух указанных выше методов классификации. Сыворотки, не указанные в таблице, были распознаны правильно все 100 раз. Как можно видеть в таблице № 11, диагностический метод, разработанный на основе комбинации масс-спектрометрических данных с данными иммуноферментного анализа, имеет наибольшую точность диагностики по сравнению с диагностическим методом, разработанным на основе только масс-спектрометрических данных. 71 На примере сывороток 12 и 341 виден решающий вклад концентрации СА125 в постановку диагноза. В обоих случаях концентрация СА125 превышает более чем на порядок критический уровень, и если при использовании масс-спектрометрического профиля сыворотки эти случаи почти всегда ошибочно относили к контрольной группе, то добавление данных о концентрации СА125 свело процент ошибочного распознавания к нулю. Практически в 100% случаев была неправильно распознана сыворотка 337, соответствующая серозной цистаденоме. Это объясняется тем, что в этой сыворотке наблюдался очень высокий уровень А-SAA – около 5 г/л. В таблице № 12 приведен усредненный процент ошибочных диагнозов для каждой исследованной группы. Как можно видеть, наибольшим этот процент оказался в группе сывороток больных доброкачественными опухолями яичника. Следует отметить, что согласно полученным нами данным, рак яичников на ранних стадиях диагностируется не хуже, чем рак на более поздних стадиях. Из семи исследованных сывороток больных раком на ранней стадии 4 были правильно диагностированы все 100 раз. Что же касается сывороток крови больных миомой матки, то все они были распознаны правильно, так что средний процент ошибок в группе больных миомой матки оказался ниже такового для группы здоровых женщин. Таблица № 11 Процент неправильных распознаваний 72 при перекрестной проверке достоверности Номер сыворотки 18 Частота ошибочных распознаваний (в %) SVM SVM (MS) (ИФА+MS) 11 2 Диагноз СА125 (ед/мл) A-SAA (г/л) Рак яичника, 2 стадия 33 1,361 16 4 0 Рак яичника, 2 стадия 199 0,015 19 0 10 Рак яичника, 2 стадия 96 0,708 303 0 1 Рак яичника, 3 стадия 2 0,448 2 23 2 Рак яичника, 3 стадия 883 0,006 12 96 1 Рак яичника, 3 стадия 539 0,031 15 83 80 Рак яичника, 3 стадия 76 0,161 24 12 1 Рак яичника, 3 стадия 234 0,083 25 0 12 Рак яичника, 3 стадия 14 0,009 304 29 0 Рак яичника, 3 стадия 809 0,333 341 99 0 Рак яичника, 3 стадия 800 0,037 403 41 5 Рак яичника, 3 стадия 805 0,429 1 0 31 Рак яичника, 4 стадия 48 3,161 424 49 1 Серозная цистаденома 11 0,017 347 2 0 Серозная цистаденома 12 0,153 337 100 91 Серозная цистаденома 22 4,767 338 93 0 Муцинозная цистаденома 12 0,038 420 9 0 Миома матки 29 0,017 427 2 0 Миома матки 42 0,013 413 15 12 Миома матки 65 0,010 416 9 0 Миома матки 14 0,011 Продолжение таблицы № 12 Номер сыворотки Частота ошибочных распознаваний (в %) SVM SVM (MS) (ИФА+MS) Диагноз СА125 (ед/мл) A-SAA (г/л) 73 406 3 9 Миома матки 52 0,023 33 3 0 Здоровые 21 0,079 35 16 17 Здоровые 12 0,061 28 94 13 Здоровые 16 0,003 38 1 0 Здоровые 7 0,034 309 12 0 Здоровые 5 0,029 307 0 1 Здоровые 22 0,014 340 2 0 Здоровые 41 0,004 27 0 1 Здоровые 13 0,014 345 2 0 Здоровые 12 0,184 Таблица № 13 Усредненные значения ошибочных распознаваний каждой группы исследуемых образцов Группа образцов Рак яичника (ранняя стадия) Средние значения ошибочных распознаваний (в %) SVM (ИФА+MS) SVM (MS) 2,1 1,7 Рак яичника (поздняя стадия) 14,5 7 Доброкачественные опухоли яичника 17,4 6,6 Миома матки 2,2 0,5 5 1,2 10,2 4,2 Здоровые Всего 3.6. Кластерный анализ данных масс-спектров SELDI-TOF 74 Конечным этапом нашего исследования явилась попытка сопоставления наблюдаемых масс-спектрометрических пиков с известными компонентами сыворотки. Для этого был проведен кластерный анализ данных с целью выявления групп взаимосвязанных белков. В качестве исходных данных для проведения кластерного анализа использовали интенсивности 48 пиков на масс-спектрах 91 пациентки. Результаты кластерного анализа приведены на рисунке 8, на котором видно, что все пики на масс-спектрах разделяются на несколько групп белков. Пики, объединенные в один кластер, соответствуют взаимосвязанным белкам или модификациям одного и того же белка. Примеры масс-спектров пяти исследованных сывороток приведены на рисунках 9-11. Отмечены значения m/z пиков, которым предположительно можно сопоставить конкретный белок. Пики с m/z 6441 Да и 6635 Да, объединенные в тесный кластер, с высокой вероятностью соответствуют аполипопротеину С1 (рассчетная масса 6630,6 Да) и его фрагменту с отщепленными N-концевыми треонином и пролином (расчетная масса 6432,4). Пики с m/z 8604 и 8934 Да предположительно представляют собой фрагменты комплемента С4а (теоретическая масса 8607,88 Да) и С3а (теоретическая масса 8938,46 Да), соответственно. Примеры масс-спектров в интервале масс 6000-9000 Да приведены на рисунке 9. Все формы сывороточного амилоида А объединены в один кластер. Так как в качестве допустимой погрешности определения массы методом SELDI-TOF принята погрешность 0,3%, то близкие по массе аллельные варианты белков SAA1 и SAA2 - SAA 2α (11628 Да), SAA 2β (11645 Да) и SAA1γ (11655 Да) объединены при обработке масс-спектров в один пик с m/z 11649 Да. В состав кластера сывороточного амилоида входят три неизвестные пика с m/z 11304 Да, 11344 Да и 11370 Да. По-видимому, они представляют собой какие-то модификации белков семейства SAA или их мутантные формы. Пик с m/z 5675, по-видимому, представляет собой двузарядный ион белка 75 11344 Да. Примеры масс-спектров в интервале масс 11000-13000 Да приведены на рисунке 10. Другими хорошо охарактеризованными компонентами масс-спектра являются разные модификации транстиретина, также объединенные в один кластер. Пик с m/z 13769 Да соответствует немодифицированной форме транстиретина, пик 13871 Да соответствует S-цистеинилированной форме TTR, 14040 Да – глутатионилированной форме транстиретина. Примеры массспектров в интервале масс 12500-16000 Да приведены на рисунке 11. Пики с m/z 15128 Да и 15867 Да, по-видимому, соответствуют альфа- и бета-субъединицам гемоглобина (расчетные массы 15126,4 Да и 15867,2 Да). В пользу того, что пик 15128 Да соответствует альфа-субъединице гемоглобина говорит то, что два пика объединены в один тесный кластер. 76 Рисунок 8. Результаты кластерного анализа масс-спектрометрических данных 77 Рисунок 9. Примеры масс-спектров пяти сывоторок в интервале масс 6000 – 9000 Да. А-Д: на масс-спектре хорошо видны пики аполипопротеина С I (6635 Да), фрагмента аполипопротеина С I с отщепленными N-концевыми треонином и пролином (6437-6441 Да), пик фрагмента комплемента С3а (8931-8935 Да) и пик фрагмента комплемента С4а (8601-8605 Да). 78 Рисунок 10. Примеры масс-спектров пяти сывороток в интервале масс 11000 – 13000 Да. А, В, Г: масс-спектрометрические пики, соответствующие сывороточному амилоиду А, не детектированы; Б: На масс-спектре видны пики SAA1α (11677 Да) и SAA2α (11629 Да); Д: на масс-спектре видны пики SAA1α (11682 Да), SAA1α с отщепленным N-концевым аргинином (11526 Да) и SAA2β с отщепленным N-концевым аргинином (11491 Да). 79 Рисунок 11. Примеры масс-спектров пяти сывороток в интервале масс 12500 – 16000 Да. Б: на масс-спектре хорошо видны пики немодифицированного TTR (13769 Да) и цистеинилированной формы TTR (13840 Да). Пик 13997 Да, по-видимому, представляет собой также модификацию TTR; В, Г: Пик 14042 Да соответствует глутатионилированной форме TTR, 15125 Да – альфа-субъединице гемоглобина, 15868 Да - бета-субъединице гемоглобина; Д: на масс-спектре виден пик глутатионилированной формы TTR (14036 Да). 80 Примеры масс-спектрометрических пиков альфа- и бета-субъединиц гемоглобина приведены на рисунке 11, В, Г. Таким образом, представленные результаты свидетельствуют, что массспектрометрический анализ сыворотки крови постепенно перестает быть эмпирическим методом. Идентификация новых компонентов масс-спектров превращает их из «черных ящиков» в панели известных белков, измеряемых полуколичественно экспресс-методом. 3.7. Дискриминаторные пики, отобранные различными классификаторами В таблице №11 приведен список пиков, отобранных различными классификаторами. Приведены данные, получены на основе только массспектрометрических профилей и путем комбинирования масс- спектрометрических профилей с данными иммуноферментного анализа концентраций A-SAA и СА125. Среди дискриминаторных пиков несколько пиков соответствуют разным формам сывороточного амилоида. Так, дискриминаторный пик 11681 Да, соответствующий мажорной форме сывороточного амилоида А, SAA1α, присутствует среди дискриминаторных пиков, полученных как методом логистической регрессии, так и методом опорных векторов при использовании масс-спектрометических данных и отсутствует при добавлении к ним данных ИФА. Это объясняется тем, что интенсивность масс-спектрометрического сигнала коррелирует с концентрацией А-SAA в сыворотке, и при добавлении данных ИФА масс-спектрометрические данные об уровне данного маркера в крови оказываются избыточными. При использовании комбинированных данных иммуноферментного анализа и масс-спектрометрии в качестве 81 биомаркеров отбраны другие формы A-SAA (например, форма с m/z 11728 Да). Таблица №13 Дискриминаторные пики, отобранные методами опорных векторов, логистической регрессии и пар с наибольшим счетом при применении этих методов на масс-спектрометических данных и комбинации масс-спектрометических и данных ИФА № 1 m/z, Да 5675 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 6441 6454 7566 7651 7769 8208 8766 8829 10265 11304 11370 13 11649 14 11681 15 16 17 11728 12168 13769 18 19 20 21 13870 14685 15310 17017 Название белка Аполипопротеин СI с отщепленными Nконцевыми треонином и пролином SVM RFE SVM RFE (MS) (MS+ИФА) + + + + + + LR AIC (MS) + LR AIC (MS+ИФА) + + + + + + + Сывороточный амилоид А 2 бета Сывороточный амилоид А1 альфа Сывороточный амилоид А1 бета Транстиретин Цистеинилированный транстиретин + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 82 Среди дискриминаторных пиков присутствуют пики, соответствующие нативной и цистеинилированной формам транстиретина, причем пик цистеинилированной формы был отобран всеми четырьмя классификаторами. Эти результаты хорошо согласуются с литературными данными, согласно которым обе упомянутые формы TTR имеют при раке яичника пониженную концентрацию [Kozak et al, 2005]. Пик 17017 Да, согласно результатам кластерного анализа, объединен в один кластер с немодифицированной и цистеинилированной формами транстиретина, поэтому, по-видимому, тоже соответствует форме TTR. Одним из маркерных пиков, отобранных методом опорных векторов, является пик 6441 Да, соответствующий аполипопротеину СI с отщепленными N-концевыми треонином и пролином. Природа двух маркерных пиков, 10265 и 12168 Да, выявленных одновременно всеми четырьмя использованными методами, осталась невыясненной. В то же время то обстоятельство, что они были выявлены несколькими независимыми методами, говорит о том, что они имеют биологический смысл и не являются артефактами. Хотя, как было рассмотрено выше, комбинирование значений концентраций А-SAA и СА125, измеренных методом ИФА не привело к повышению точности диагностики рака яичников, среди дискриминаторных масс-спектрометрических пиков присутствуют несколько форм А-SAA. Повидимому, наличие данных о соотношении различных модификаций биомаркеров вносит вклад в повышение эффективности диагностики. Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что 83 используя масс-спектрометрическую технологию SELDI-TOF можно с достаточно высокой эффективностью определения сыворотки крови больных раком яичников, здоровых женщин и больных доброкачественными опухолями яичников и миомой матки. Основой разработанной экспериментальной диагностической системы являются масс-спектрометрические данные, использование которых в отдельности позволило получить точность диагностики около 90%. Добавление к масс-спектрометрическим данным данных иммуноферментного анализа о концентрациях A-SAA и СА125 привело к повышению точности диагностики до 95,2%. Наилучшие результаты были достигнуты при применении метода опорных векторов. Преимуществом предложенного нами метода профилирования является его простота. Отсутствие стадий префракционирования сыворотки приводит к повышению воспроизводимости результатов и увеличивает шансы на внедрение методики в практическую диагностику. На основе результатов кластерного анализа масс-спектрометрических данных показано, что несколько дискриминаторных масс-спектрометрических пиков соответствуют сывороточному амилоиду А острой фазы, транстиретину и их модификациям. Полученные результаты могут служить предпосылками для разработки специального аппаратно-программного комплекса. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 84 Проблема рака яичников, сегодня состоит не столько в лечении, сколько в своевременной диагностике и профилактике. В онкологии понятие профилактика рассматривается в трех аспектах: первичная профилактика (комплекс мероприятий, направленных на ликвидацию факторов, способствующих развитию рака), вторичная профилактика (комплекс мероприятий, направленных на снижение риска и выявление рака в начальных стадиях), третичная профилактика (комплекс мероприятий, направленных на стабилизацию опухолевого процесса у радикально леченных больных). Наиболее реальной в настоящее время является вторичная профилактика рака яичников. Ее стратегия строится на применении специфических мероприятий, в частности, соблюдении специальной «противораковой» диеты, способствующей уменьшению риска, коррекции гормонального дисбаланса, реализации репродуктивной функции, санации очагов воспаления, хирургическом устранении доброкачественных опухолей и предраковых состояний. Все эти мероприятия могут играть свою роль на доклинической стадии рака яичников и целиком находятся в компетенции акушеров-гинекологов. Что касается своевременной диагностики рака яичников, то это одна из главных проблем гинекологии. Несмотря на улучшение диагностических методов, около 80% больных поступают в онкологические учреждения с далеко зашедшими стадиями опухолевого процесса. Основные причины хорошо известны - прежде всего, бессимптомное развитие опухоли и, как следствие, позднее обращение к врачу. При этом практически все больные c III и IV стадией рака яичников не переживают 5-летний период, в то время, как при истинно ранних стадиях рака яичников, выживаемость больных достигает в среднем 50-60%. Немаловажную роль в высокой смертности от рака яичников играет отмеченная в последнее время тенденция к резкому омоложению больных и проявление нетипичных форм злокачественных опухолей. В настоящее время в целях повышения эффективности ранней диагностики рака яичников применяют комплексный подход, который включает ряд 85 клинических, лабораторных и инструментальных методов исследования, среди которых наиболее часто применяется ультразвуковая и рентгеновская компьютерная томография, радиоизотопное исследование, лапароскопия, определение ассоциированных с опухолью маркеров. Идентификация специфических для каждой опухоли маркерных белков является одним из наиболее перспективных направлений в их диагностике, представляющая большой интерес не только с практической, но и теоретической точки зрения. Для диагностики злокачественных опухолей яичников были предложены и апробированы в клинических условиях многочисленные ассоциированные с опухолью маркеры, однако, к настоящему времени оказались пригодными к применению лишь некоторые из них. Циркулирующие опухолевые маркеры принято считать обычными протеинами, которые секретируются опухолевыми клетками в кровоток. При этом опухолевый маркер должен быть доступным, относительно простым и недорогим, достаточно специфичным для изучаемой опухоли. Кроме того, маркер должен давать четкое соотношение между уровнем и весом (количеством) опухолевых клеток, повышаться при ранних стадиях и рецидивах заболевания. Данные, полученные за последнее время, свидетельствуют о высокой степени корреляции показателей маркеров и распространенностью опухолевого процесса, что позволяет их использовать для мониторинга и прогноза течения опухолевого процесса. Вместе с тем, несмотря на кажущееся обилие опухолевых маркеров, единственным тестом при раке яичников, отвечающим хотя бы в какой-то степени требованиям клиницистов, остается СА-125. Этот маркер в настоящее время широко используется в диагностике и мониторинге эпителиальных форм новообразований яичников. Отсутствие клинических симптомов рака яичника на ранних стадиях диктует необходимость проведения специализированного клинического мониторинга «групп риска», к которым, прежде всего, относятся носительницы BRCA-1, BRCA-2, hMLH1, hMLH2 и других генных мутаций, риск развития 86 рака яичников для которых может достигать 100%. В настоящее время молекулярно-генетические методы существенно увеличили шансы предиктивного тестирования на наличие предрасположенности к раку яичников. Для этих целей уже разработаны, как относительно дешевые методы ДНК-диагностики, так и более сложные и дорогие методы уточняющей ДНК-диагностики (тест прямого секвенирования всех кодирующих последовательностей BRCA-1 и BRCA-2 в сочетании с методом детекции мутаций по аномальному белковому продукту гена). Весьма перспективным является метод биочипов, позволяющий в течение нескольких минут провести тестирование всех известных мутаций в этих генах. Однако для осуществления, как специализированного клинического мониторинг «групп риска», так и массового обследования женского населения необходимо наличие простого, дешевого и надежного диагностического метода. Задачи, связанные с разработкой новых технологий своевременной диагностики и профилактики рака яичников, сегодня приобретают первостепенное значение во всем мире. В настоящее время определены четыре главных стратегических направлений: 1. Разработка скрининговых программ с использованием молекулярногенетических и протеомных методов; 2. Разработка показаний к выполнению профилактических хирургических вмешательств (оофорэктомия); 3. Разработка показаний для использования лекарственных препаратов, в частности, оральных контрацептивов, агонистов гонадных релизинггормонов, антиоксидантов и др. 4. Разработка методов генной терапии . Что же касается нынешнего состояния проблемы, то, к сожалению, приходится констатировать, что с помощью клинического обследования органов женской репродуктивной системы рак яичников удается выявить только в 15% случаев. Такие методы, как КТ, ЯМР, позитронно-эмиссионная томогра87 фия позволяют с высокой точностью определить объем и распространенность опухолевого процесса, оценить эффективность проводимой терапии и выявить рецидив опухоли, однако эти методы неприемлемы для проведения скрининга из-за своей дороговизны. Наиболее приемлемым методом является лишь сонография, однако и данный метод, являясь высоко чувствительным и специфичным, позволяет установить наличие рака яичников 1-й стадии только в 1,5 - 2% всех наблюдений [Hanaham D., 2000]. Хирургические методы профилактики рака яичников у носительниц патологических генов также не обеспечивают надежной гарантии. Так, Tobacman J.K. еще в 1982 г сообщил, что у 11% женщин, относящихся к группе наследственного риска развития рака яичников, в среднем через 5 лет после выполненной профилактической оофорэктомии развивается канцероматоз брюшины, не отличающийся по морфологической структуре от рака яичников [Tobacman JK, Green MH, Tucker MA et al. 1982]. До сих пор не существует единого мнения, кому и в каком возрасте следует выполнять профилактическую оофорэктомию, поскольку рак яичников редко развивается в возрасте до 45 лет (11 на 100000 женщин в группе риска), а риск развития осложнений, связанных с посткастрационным синдромом, может превышать риск развития рака [ Акуленко Л.В., 2005, Жорданиа К.И. , 2005 ]. Интенсивное развитие протеомных технологий открыло новые перспективы для поиска маркеров опухолевых заболеваний. Применение массспектрометрии SELDI-TOF в этих целях началось около десяти лет назад и сразу дало многообещающие результаты [Petricoin et al, 2002; Kozak et al, 2003]. Некоторые исследователи продемонстрировали точность диагностики с помощью этого метода, близкую к 100% [Zhu et al, 2003]. Однако плохая воспроизводимость результатов в разных лабораториях вызывает сомнения в возможности внедрения этого метода в практическую медицину. Среди белков-кандидатов на маркер рака яичников особое место занимает сывороточный амилоид А острой фазы (A-SAA), идентифицированный в 88 лаборатории диагностической протеомики ГУ НИИ БМХ РАМН в 2004 [Власова М.А., Макаров О.В., и др., 2005 ]. Способность A-SAA стимулировать пролиферацию клеток, ингибировать апоптоз, а также стимулировать ангиогенез была четко продемонстрирована у больных ревматоидным артритом [Lee et al, 2006]. Именно эти свойства A-SAA явились теоретической предпосылкой для выбора именно этого белка в качестве маркера-кандидата рака яичников в сочетании с классическим маркером СА125 в нашем исследовании. По результатам нашего исследования A-SAA действительно оказался маркером рака яичников при критической его концентрации в сыворотке крови 0,3 г/л (что соответствует 2,6x10-5 М). Такие концентрации были определены у 17 из 34 больных раком яичников в нашей выборке, т.е. чувствительность A-SAA, как маркера рака яичников самого по себе, составила 50%. У 54 из 56 женщин, не страдавших раком яичников, концентрации A-SAA не достигали критического значения. Эти данные означают, что специфичность A-SAA, как маркера рака яичников, составляет 96,4%. Таким образом, полученные нами данные позволяют утверждать, что чувствительность масс- спектрометрического определения A-SAA в сыворотке лежит в пределах концентраций 0,2-0,3 г/л (1,7-2,6x10-5 М). Нам удалось установить, что увеличение на два-три порядка концентрации A-SAA при раке яичников не связано со стадией опухолевого процесса. Вместе с тем, у 2 из 14 пациенток с доброкачественными опухолями яичника концентрации A-SAA в сыворотке крови достигали критического значения (34 г/л). Обе эти пациентки страдали серозной цистаденомой. Полученные данные не исключают констатацию начальных стадий канцерогенеза у этих пациенток с помощью масс-спектрометрической детекции A-SAA. Кроме того, в наше исследование были включены пациентки с миомой матки. Как известно, концентрация СА125 у пациенток, страдающих миомой матки, часто немного превышает критический уровень (38-40 единиц). Нам же удалось продемонстрировать, что концентрация A-SAA в сыворотке крови у 89 всех пациенток с миомой матки является очень низкой, что позволяет предположить о возможности использования этого маркера для дифференциальной диагностики патологии органов малого таза у женщин. Следует отметить, что критический уровень A-SAA, определяемый с помощью масс-спектрометрии SELDI-TOF, очень близок критическому уровню этого белка для ряда воспалительных заболеваний [Casl et al, 1995; Casl et al, 1996], что дает основания для использования прямого масс- спектрометрического профилирования для быстрого определения повышенного уровня A-SAA в сыворотке крови. Хотя масс-спектрометрическое определение масс методом SELDI-TOFMS обладает невысокой точностью, тем не менее, погрешность в определении массы A-SAA в нашем исследовании не превышала 3-5 Да, что позволило различить различные формы A-SAA в сыворотках крови с содержанием A-SAA более 0,3 г/л. Возможность наблюдать различные формы одних и тех же белков является важным преимуществом масс-спектрометрических методов по сравнению с иммунологическими методами детекции белков. Судя по полученным данным, основными аллелями А-SAA в исследуемой нами выборке являются SAA1α и SAA2α. Поскольку мы определяли АSAA в цельных сыворотках крови и только в сыворотках с резко повышенным уровнем А-SAA, полученные нами данные носят оценочный характер. Для математической обработки полученных данных мы использовали классификатор TSP, который был предложен для обработки данных ДНКмикрочипов и идентификации генов-маркеров [Xu et al, 2005]. Этот алгоритм классифицирует образцы на основе разностей интенсивностей пиков, а не абсолютных значений интенсивностей, отбирая одну или несколько (k-TSP) пар маркеров с наибольшей разницей интенсивностей. Применение TSPклассификатора позволило выявить только одну пару с наибольшим счетом, состоящую из интенсивностей пиков 11681Да и 13769Да. В случае если разность интенсивностей указанных пиков положительна, исследуемый образец 90 классифицировался как «рак яичников», если отрицательна, то как «отсутствие рака яичников». Несмотря на то, что процент правильной классификации с применением TSP составила всего 79,9%, биологический смысл полученных результатов легко интерпретировать. Оба пика выбранной пары соответствовали известным маркерам рака яичника. Пик с m/z 11681Да соответствовал основной форме A-SAA [Moshkovskii et al, 2005], концентрация которого при раке яичника повышается, а пик с m/z около 13769Да соответствовал нативной форме транстиретина, концентрация которого при раке яичника понижается [Gericke et al, 2005]. Таким образом, (k-)TSP классификатор заслуживает внимания как один из способов обработки данных протеомных исследований с целью выявления биомаркеров. Пара биомаркеров, отобранная в нашем исследовании (АSAA-TTR), представляет собой новую бинарную переменную (разность интенсивностей, принимающую положительные или отрицательные значения), которую оказалось возможным комбинировать с данными иммуноферментного анализа для улучшения классификации. В нашем исследовании для разработки диагностических алгоритмов с применением методов SVM и LR были использованы различные комбинации данных. Цель проверки различных комбинаций данных заключалась в определении оптимального набора признаков для распознавания рака яичников. Диагностический алгоритм разрабатывали на основе: 1) значений концентраций только классического маркера рака яичников CA125, измеренных методом ИФА; 2) комбинации значений концентраций CA125 и А-SAA, измеренных методом ИФА; 3) данных только масс-спектрометрии (значений интенсивностей 48 SELDI-MS m/z пиков); 91 4) комбинации значений концентраций CA125 и А-SAA, измеренных методом ИФА и масс-спектрометрических данных (значений интенсивностей 48 SELDI-MS m/z пиков); 5) значений концентраций CA125 и А-SAA, измеренных методом ИФА в комбинации с бинарной переменной, полученной после применения TSP анализа и представляющей собой формализованные данные массспектрометрии. Эффективность диагностических алгоритмов, полученных на основе тестируемых 5 вариантов данных с помощью SVM и LR-классификаторов, была оценена путем перекрестной проверки на достоверность. Оказалось, что добавление значений концентраций А-SAA к значениям концентраций CA125, измеренных методом ИФА, не приводит к повышению точности классификации. При работе с данными только масс-спектрометрии, метод SVM дал лучшие результаты, чем метод LR и точность SVM для данных массспектрометрии была значительно выше, чем при использовании только значений концентрации CA125 (89,5% против 86,1%). LR-классификатор, напротив, дал существенно лучшие результаты, чем SVM при обработке бинарных данных TSP в комбинации с данными ИФА, причем данные TSP существенно повысили точность классификации (90,7% против 85-86% только для CA125). Наилучшей точности распознавания (95,2%) рака яичников, доброкачественных опухолей яичников, миомы матки и отсутствия патологии органов малого таза удалось достичь путем SVM обработки комбинированных данных ИФА и масс-спектрометрии. Так, рак яичников был правильно распознан на любой стадии опухолевого процесса. А рак яичников I-II стадии был правильно распознан у 57,1% больных. Практически все сыворотки крови больных миомой матки были распознаны правильно. Средний процент ошибок в группе больных миомой матки оказался даже ниже такового в группе здоровых женщин. 92 До настоящего времени масс-спектрометрический анализ с применением технологии SELDI-TOF считался эмпирическим методом. Систематические исследования по аннотированию масс-спектрометрических профилей сыворотки крови не проводились. Мы впервые предприняли попытку сопоставления наблюдаемых масс-спектрометрических пиков с известными компонентами сыворотки крови. С этой целью нами был проведен кластерный анализ данных с целью выявления групп взаимосвязанных белков. Благодаря полученным нами данным, масс-спектрометрический анализ сыворотки крови получил перспективу развиваться, как полуколичественный экспресс-метод. Нами установлено, что несколько из дискриминаторных пиков соответствуют разным формам сывороточного амилоида. Так, дискриминаторный пик 11681 Да, соответствующий мажорной форме сывороточного амилоида А (SAA1α), присутствовал среди дискриминаторных пиков, полученных как методом логистической регрессии, так и SVM при использовании массспектрометических данных и отсутствовал при добавлении к ним данных ИФА. Это объясняется тем, что интенсивность масс-спектрометрического сигнала коррелирует с концентрацией А-SAA в сыворотке, а при добавлении данных ИФА масс-спектрометрические данные об уровне данного маркера в крови оказываются избыточными. При использовании комбинированных данных иммуноферментного анализа и масс-спектрометрии в качестве маркеров-кандидатов рака яичников были отобраны другие формы A-SAA (например, форма с m/z 11728 Да). Среди дискриминаторных пиков присутствовали пики, соответствующие нативной и цистеинилированной формам транстиретина, причем пик цистеинилированной формы был отобран всеми четырьмя классификаторами. Хотя комбинация значений концентраций А-SAA и СА125, измеренных методом ИФА, не привела к повышению точности диагностики, среди дискриминаторных масс-спектрометрических пиков присутствовали несколько форм А-SAA. Эти данные свидетельствуют о том, что соотношение различных модифика93 ций маркеров вносит вклад в повышение эффективности диагностики рака яичников . Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что используя масс-спектрометрическую технологию SELDI-TOF можно с достаточно высокой эффективностью распознавать сыворотки крови больных раком яичников, здоровых женщин и больных доброкачественными опухолями яичников и миомой матки. 94 ВЫВОДЫ 1. Сформированная выборка пациенток позволила доказать применимость метода масс-спектрометрии SELDI-TOF для идентификации сывороток крови больных раком яичников, доброкачественными опухолями яичников, миомой матки и здоровых женщин с точностью 89,5%. 2. А-SAA определяется методом масс-спектрометрии SELDI-TOF в сыворотке крови при критическом значении его концентрации 0,3 г/л и выше, измеряемой методом иммуноферментного анализа, что соответствует 1,7-2,6×10-5 M. 3. Как самостоятельный маркер рака яичников А-SAA, определяемый методом масс-спектрометрии SELDI-TOF, обладает чувствительностью 50% и специфичностью 96,4%. 4. Добавление к данным масс-спектрометрической детекции А-SAA значений концентраций A-SAA и СА125, измеряемых методом иммуноферментного анализа, позволяет повысить точность диагностики рака яичников до 95%. 5. На основе многофакторного анализа комбинированных данных массспектрометрической детекции A-SAA и иммуноферментного анализа концентраций A-SAA и СА125 в сыворотке крови разработана новая экспериментальная система протеомной диагностики рака яичников. 6. Полученные результаты являются научно обоснованной предпосылкой для разработки специального аппаратно-программного комплекса для 95 осуществления, как протеомного скрининга, так и своевременной диагностики рака яичников. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для внедрения в практику разработанного нами экспериментального алгоритма протеомной диагностики рака яичников необходимо создание специального аппаратно-программного комплекса для одновременного определения концентрации A-SAA и CA125 методом иммуноферментного анализа и определения A-SAA методом масс-спектрометрии в сыворотке крови и многофакторной статистической обработки полученных результатов. УКАЗАТЕЛЬ ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований женских половых органов. Клиническая онкогинекология. / под ред.Козаченко В.П. Москва «Медицина» 2005, стр.9-17. 2. Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований женской половой сферы./Аксель Е.М. //Онкогинекология.-2012.-№1.-С. 18-24 3. Акуленко Л.В. Генетические аспекты рака органов женской репродуктивной системы. / Клиническая онкогинекология. Под. ред. Козаченко В.П. //Москва «Медицина» 2005, стр. 18-29. 4. Белушкина Н.Н. Особенности регуляции апоптоза опухолевых клеток/ Белушкина Н.Н.//Вестник Российской АМН.-2008.-№10.-с. 15-20 5. Винокуров В.Л. Рак яичников: закономерности метастазирования и выбор адекватного лечения больных/ Винокуров В.Л. //Санкт-Петербург.Издательство «Фолиант».-2004.-336с. 6. Говорун В.М.,. // Биохимия Арчаков А.И, 2002, 67, ст. 1341-1359. 7. Жорданиа К.И. Опухоли яичников / Жорданиа К.И. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е., Козаченко В.П., Блюменберг А.Г., Никогосян С.О., 96 Губина О.В. // Клиническая онкогинекология. Под. ред. Козаченко В.П. Москва «Медицина» 2005, стр. 220-269. 8. Имянитов Е.Н. Молекулярная диагностика в онкологии/ Имянитов Е.Н. //Мол.Биол.-2008.-том 42№4.-772-785. 9. Карселадзе А.И. Морфология эпителиальных опухолей яичников. Автореф...дисс. докт.мед.наук. /Карселадзе А.И.// М.,1989. 10. Макаров О.В. Профилактика, диагностика, лечение рака яичников./Макаров О.В, Борисенко С.А. // Рос. мед. жури. 1996. - № 3. - С. 3640. 11.Макаров О.В. Иммунологические и гормональные нарушения у больных раком яичников. /Макаров О.В., Хашукоева А.З., Николаев Н.Н. //Труды V съезда акушеров-гинекологов РСФСР. Челябинск. – 1982 – стр. 204205. 12.Порханова Н.В. Рецидивы серозного рака яичников (факторы прогноза и диагностика)./Порханова Н.В. //Автореф. дисс. канд.мед.наук.М.,1999. 13.Прокопенко П.Г. Иммуноферментный анализ овариально- метатстического антигена-8./Прокопенко П.Г. ,Борисенко С.А., Макаров О.В., Фомина М.В //Бюлл.эксперим.биол.-1991.-№5.-с.528-30 14.Прокопенко П.Г. Перспективы диагностики и профилактики опухолей яичников./ Прокопенко П.Г. , Полторанина В.С., Петренко О.Ю., Терентьев А.А. // Успехи современного естествознания .-2011.-№9.-с. 53-62. 15.Стрижаков А.Н. Диагностическое и прогностическое значение определения сывороточных опухолевых маркеров в диффеенциальной диагностике новообразований яичников / Стрижаков А.Н ., Давыдов А.И., Мехдиев В.Э. // Материалы XXII международного конгресса с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний»- М.- 2009.-С. 32. 97 16. Adam B.L., Qu Y., Davis J.W., Ward M.D., Clements M.A., Cazares L.H., Semmes O.J., Schellhammer P.F., Yasui Y., Feng Z., Wright G.L. Jr. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men. // Cancer Res., 2002; 62(13), p. 3609-3614. 17. Agarwal R., Kaye S.B. Expression profiling and individualisation of treatment for ovarian cancer. // Curr. Opin. Pharmacol. 2006; 6(4), p. 345349. Review. 18. Baranova A., Gowder S., Naouar S., King S., Schlauch K., Jarrar M., Ding Y., Cook B., Chandhoke V., Christensen A. Expression profile of ovarian tumors: distinct signature of Sertoli-Leydig cell tumor. // Int. J. Gynecol. Cancer. 2006; 16(6), p.1963-1972. 19. Вast R.C.Jr., Hennessy B., Mill G.B. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation//Nat. Rev.Cancer.-2009.-Vol.9, N.6.-P.415-443 20. Biran, H., Friedman, N., Neumann, L., Pras, M., and Shainkin-Kestenbaum, R. Serum amyloid A (SAA) variations in patients with cancer: correlation with disease activity, stage, primary site, and prognosis. // J. Clin. Pathol., 1986, 39, p. 794-797. 21. Brower S.T., Tartter P., Weiss S., Luderer A.A., Lehrer S. Breast cancer and family history: levels of lipid-associated sialic acid in plasma and absent family history of breast cancer in women who have breast tumors. // Mt. Sinai J. Med., 1995; 62(6), p. 419-421. 22. Callahan MJ, Crum CP, Medeiros F, et al. Primary fallopian tube malignancies in BRCA-positive women undergoing surgery for ovarian cancer risk reduction. J Clin Oncol. 2007;25:3985-3990. 23. Casl M.T., Coen D., Simic D. Serum amyloid A protein in the prediction of postburn complications and fatal outcome in patients with severe burns. // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1996; 34(1), p. 31-35. 98 24. Casl M.T., Surina B., Glojnaric-Spasic I., Pape E., Jagarinec N., Kranjcevic S. Serum amyloid A protein in patients with acute myocardial infarction. // Ann. Clin. Biochem., 1995; 32 ( Pt 2), p.196-200. 25. Chan D.C., Chen C.J., Chu H.C., Chang W.K., Yu J.C., Chen Y.J., Wen L.L., Huang S.C., Ku C.H., Liu Y.C., Chen J.H. Evaluation of serum amyloid A as a biomarker for gastric cancer // Ann. Surg. Oncol. 2007; 14(1), p. 84-93. 26. Cho W.C., Yip T.T., Yip C., Yip V., Thulasiraman V., Ngan R.K., Yip T.T., Lau W.H., Au J.S., Law S.C., Cheng W.W., Ma V.W., Lim C.K. Identification of serum amyloid a protein as a potentially useful biomarker to monitor relapse of nasopharyngeal cancer by serum proteomic profiling. // Clin. Cancer Res., 2004; 10(1 Pt 1), p. 43-52. 27. Cramer D.W., Welch W.R.. Determinant of ovarian cancer risck II. Inferences Regading Pathogenesis. INCI, 1983, 71, 4, p.p. 717-721. 28. Cramer D.W., William R., Cossels B.S. et al. Mamps, menarche, menopause and ovarian cancer. Amer. J. Obstet. Gynecol., 1983, 147, p.p. 1-6. 29. Craven R.A., Totty N., Harnden P., Selby P.J., Banks R.E. Laser capture microdissection and two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis: evaluation of tissue preparation and sample limitations. // Am. J. Pathol., 2002;160(3), p. 815-822. 30. Crum CR, Drapkin R, Miron A, et al. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 2007;19:3-9. 31. Diamandis E.P. Identification of serum amyloid a protein as a potentially useful biomarker for nasopharyngeal carcinoma. // Clin. Cancer Res. 2004 Aug 1;10(15):5293; author reply, p. 5293-5294. 32. Diamandis E.P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. // Mol. Cell. Proteomics, 2004; 3(4), p. 367-378. 99 33. Diamandis E.P. Point: Proteomic patterns in biological fluids: do they represent the future of cancer diagnostics? // Clin. Chem., 2003; 49(8), p.1272-1275. 34. Engwegen J.Y., Mehra N., Haanen J.B., Bonfrer J.M., Schellens J.H., Voest E.E., Beijnen J.H. Validation of SELDI-TOF MS serum protein profiles for renal cell carcinoma in new populations. // Lab. Invest. 2007; 87(2), p.161172. 35. Finch A, Shaw P, Rosen B. Clinical and pathologic findings: Salpingooophorectomies in 159 BRCA1 and BRCA2 carriers. Gynecol Oncol. 2006;100:58-64 36. Gao W.M., Kuick R., Orchekowski R.P., Misek D.E., Qiu J., Greenberg A.K., Rom W.N., Brenner D.E., Omenn G.S., Haab B.B., Hanash S.M. Distinctive serum protein profiles involving abundant proteins in lung cancer patients based upon antibody microarray analysis. // BMC Cancer, 2005; 5: 110. 37. Gericke B., Raila J., Sehouli J., Haebel S., Konsgen D., Mustea A., Schweigert F.J. Microheterogeneity of transthyretin in serum and ascitic fluid of ovarian cancer patients. // BMC Cancer, 2005; 5:133. 38. Glojnaric I., Casl M.T., Simic D., Lukac J. Serum amyloid A protein (SAA) in colorectal carcinoma. // Clin. Chem. Lab. Med., 2001; 39(2), p.129-133. 39. Gutfeld, O., Prus, D., Ackerman, Z., Dishon, S., Linke, R.P., Levin, M., and Urieli-Shoval, S. Expression of serum amyloid A, in normal, dysplastic, and neoplastic human colonic mucosa: implication for a role in colonic tumorigenesis. // J Histochem.Cytochem., 2006, 54, p. 63-73. 40. Guyon, I., Weston, J., Bahnhill, S., Vapnik, V., Machine Learning 2002, 46, p. 389-422. 41. Hanahan W., Weinberg R.The hallmarks of cancer// Cell.-2000.-Vol.100.P.57-70 100 42. Havrilesky L J, Sanders GD, Kulasingam S, et al. Development of an ovarian cancer screening decision model that incorporates disease heterogeneity. Cancer.2011;117:545-553. 43. He R., Sang H., Ye R.D. Serum amyloid A induces IL-8 secretion through a G protein-coupled receptor, FPRL1/LXA4R.//Blood, 2003; 101(4), p. 15721581. 44. Huang S. Genetic and non-genetic instability in tumor progression: link between the fitness landscape and the epigenetic landscape of cancer cells. Cancer Metastasis Rev. 2013 May 3. 45. Jacobs I., Bast R.C. Jr. The CA 125 tumour-associated antigen: a review of the literature. // Hum. Reprod., 1989; 4(1), p. 1-12. Review. 46. Jacobs I.J., Menon U.. Progress and challenges in screening for early detection of ovarian cancer. // Mol. Cell. Proteomics, 2004. 3 № 4, p. 355366. Review. 47. Jacobs I.J., Rivera H., Oram D.H., Bast R.C. Jr. Differential diagnosis of ovarian cancer with tumour markers CA 125, CA 15-3 and TAG 72.3.// Br. J. Obstet. Gynaecol., 1993; 100(12), p.1120-1124. 48. Jijon H.B., Madsen K.L., Walker J.W., Allard B., Jobin C. Serum amyloid A activates NF-kappaB and proinflammatory gene expression in human and murine intestinal epithelial cells. // Eur. J. Immunol. 2005; 35(3), p. 718-26. 49. Kaneti J., Winikoff Y., Zimlichman S., Shainkin-Kestenbaum R. Importance of serum amyloid A (SAA) level in monitoring disease activity and response to therapy in patients with prostate cancer. // Urol. Res.; 1984, 12(5), p. 23941. 50. Katopodis N., Glantz M.J., Kim L., Dafni U., Wu J.K., Perides G. Lipidassociated sialoprotein in the cerebrospinal fluid: association with brain malignancies. // Cancer, 2001; 92(4), p. 856-862. 51. Kathleen R.Cho., Shih le-Ming. Ovarian cancer //Annu. Rev. Pathol.-2009.Vol. 4.-P.287-313 101 52. Knudson A.G. Genetics and etiology of human cancer. Adv.Hum. Genetics, 1977, 8, p. 1-66. 53. Knudson A.G. Hereditary and cancer in man. Inst. Cancer Res. Sci. Rep., 1976-1977, N 22, p.p. 45-47. 54. Knudson AG. Hereditary cancers: from discovery to intervention. // J Natl Cancer Inst Monogr 1995; 17:5-7. 55. Kovacevic, A., Hammer, A., Sundl, M., Pfister, B., Hrzenjak, A., Ray, A., Ray, B.K., Sattler, W., and Malle, E. Expression of serum amyloid A transcripts in human trophoblast and fetal-derived trophoblast-like choriocarcinoma cells. // FEBS Lett., 2006, 580, p. 161-167. 56. Kozak K.R., Amneus M.W., Pusey S.M., Su F., Luong M.N., Luong S.A., Reddy S.T., Farias-Eisner R. Identification of biomarkers for ovarian cancer using strong anion-exchange ProteinChips: potential use in diagnosis and prognosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2003; 100(21), p.12343-12348. 57. Kozak K.R., Su F., Whitelegge J.P., Faull K., Reddy S., Farias-Eisner R. Characterization of serum biomarkers for detection of early stage ovarian cancer. // Proteomics, 2005; 5(17), p. 4589-96. 58. Kurman RT, Shih I. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. Am J Surg Pathol. 2010;34:433-443 59. Larson M.A., Wei S.H., Weber A., Weber A.T., McDonald T.L. Induction of human mammary-associated serum amyloid A3 expression by prolactin or lipopolysaccharide. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003; 301(4), p. 1030-1037. 60. Le L., Chi K., Tyldesley S., Flibotte S., Diamond D.L., Kuzyk M.A., Sadar M.D. Identification of serum amyloid A as a biomarker to distinguish prostate cancer patients with bone lesions. // Clin. Chem., 2005; 51(4), p. 695-707. 61. Le Page C., Ouellet V., Madore J., Hudson T.J., Tonin P.N., Provencher D.M., Mes-Masson A.M. From gene profiling to diagnostic markers: IL-18 102 and FGF-2 complement CA125 as serum-based markers in epithelial ovarian cancer. // Int J Cancer, 2006 Apr 1;118(7), p. 1750-1758. 62. Lee E, Iskow R, Yang L, Gokcumen O, Haseley P, Luquette LJ 3rd, Lohr JG, Harris CC, Ding L, Wilson RK, Wheeler DA, Gibbs RA, Kucherlapati R, Lee C, Kharchenko PV, Park PJ; Landscape of somatic retrotransposition in human cancers.//Cancer Genome Atlas Research Network. Science. 2012 Aug 24;337(6097):967-71. 63. Lee H.Y., Kim M.K., Park K.S., Bae Y.H., Yun J., Park J.I., Kwak J.Y., Bae Y.S. Serum amyloid A stimulates matrix-metalloproteinase-9 upregulation via formyl peptide receptor like-1-mediated signaling in human monocytic cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005; 330(3), p. 989-998. 64. Lee I.N., Chen C.H., Sheu J.C., Lee H.S., Huang G.T., Chen D.S., Yu C.Y., Wen C.L., Lu F.J., Chow L.P. Identification of complement C3a as a candidate biomarker in human chronic hepatitis C and HCV-related hepatocellular carcinoma using a proteomics approach. // Proteomics, 2006; 6(9), p. 2865-2873. 65. Li J., Zhang Z., Rosenzweig J., Wang Y.Y., Chan D.W. Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer. // Clin. Chem. 2002; 48(8), p.1296-1304. 66. Lingeman C.H. Environmental factors in the etiology of human ovary: a review. Progr. Clin. Biol. Res.,1983, 117, p.p.365-379. 67. Liu D.H., Wang X.M., Zhang L.J., Dai S.W., Liu L.Y., Liu J.F., Wu S.S., Yang S.Y., Fu S., Xiao X.Y., He D.C. Serum amyloid A protein: a potential biomarker correlated with clinical stage of lung cancer. // Biomed. Environ. Sci. 2007; 20(1), p. 33-40. 68. Mao Y., Zhou X.B., Pi D.Y., Sun Y.X.. Constructing support vector machine ensembles for cancer classification based on proteomic profiling. // Genomics Proteomics Bioinformatics. 2005; 3(4), p. 238-241 103 69. Maslov AY, Ganapa-thi S, Westerhof M, Quispe-Tintaya W, White RR, Van Houten B, Reiling E, Dollé ME, van Steeg H, Hasty P, Hoeijmakers JH, Vijg J. DNA damage in normally and prematurely aged mice. Aging Cell. 2013 Jun;12(3):467-77. doi: 10.1111/acel.12071. Epub 2013 Apr 24. 70. Mayer J.M., Raraty M., Slavin J., Kemppainen E., Fitzpatrick J., Hietaranta A., Puolakkainen P., Beger H.G., Neoptolemos J.P. Serum amyloid A is a better early predictor of severity than C-reactive protein in acute pancreatitis. // Br. J. Surg. 2002; 89(2), p. 163-171. 71. Miki Y. A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 // Science. — 1994. — Vol. 266. — P. 66. 72. Mor G., Visintin I., Lai Y., Zhao H., Schwartz P., Rutherford T., Yue L., Bray-Ward P., Ward D.C. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2005; 102(21), p. 7677-7682. 73. Moshkovskii S.A., Serebryakova M.V., Kuteykin-Teplyakov K.B., Tikhonova O.V., Goufman E.I., Zgoda V.G., Taranets I.N., Makarov O.V., Archakov A.I. Ovarian cancer marker of 11.7 kDa detected by proteomics is a serum amyloid A1. // Proteomics, 2005; 5(14), p. 3790-3797. 74. Mullan R.H., Bresnihan B., Golden-Mason L., Markham T., O'Hara R., FitzGerald O., Veale D.J., Fearon U. Acute-phase serum amyloid A stimulation of angiogenesis, leukocyte recruitment, and matrix degradation in rheumatoid arthritis through an NF-kappaB-dependent signal transduction pathway. // Arthritis Rheum., 2006; 54(1), p. 105-114. 75. Nakayama T., Sonoda S., Urano T., Yamada T., Okada M. Monitoring both serum amyloid protein A and C-reactive protein as inflammatory markers in infectious diseases. // Clin. Chem., 1993; 39(2), p. 293-297. 76. Narod S.A., Feunten J., Lynch H.T., Watson P. et.al. Familial breast/ovarian cancer locus on chromosome 17q12-q23. Lancet., 1991, 338 (8759), p.p.8283. 104 77. Nedelkov D., Kiernan U.A., Niederkofler E.E., Tubbs K.A., Nelson R.W. Investigating diversity in human plasma proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2005 Aug 2;102(31), p.10852-10857. 78. Nozawa S., Aoki D., Yajima M., Tsukazaki K., Kobayashi T., Kimura E., Terashima Y., Inaba N., Takamizawa H., Negishi Y., et al. CA54/61 as a marker for epithelial ovarian cancer. // Cancer Res. 1992; 52(5), p.1205-1209. 79. O'Hara R., Murphy E.P., Whitehead A.S., FitzGerald O., Bresnihan B. Acutephase serum amyloid A production by rheumatoid arthritis synovial tissue. Arthritis Res., 2000; 2(2), p. 142-144. 80. Partridge E, Kreimer AR, Greenlee RT, etl.Resultsfromfourroundsofovarian cancer screening in a randomized trial. Obstet Gynecol. 2009;113:775–782. 81. Petricoin E.3rd, Liotta L.A. Counterpoint: The vision for a new diagnostic paradigm. // Clin. Chem., 2003; 49(8), p. 1276-1278. 82. Petricoin E.F., Ardekani A.M., Hitt B.A., Levine P.J., Fusaro V.A., Steinberg S.M., Mills G.B., Simone C., Fishman D.A., Kohn E.C., Liotta L.A. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. // Lancet, 2002; 359(9306), p. 572-577. 83. Petricoin E.F., Liotta L.A. SELDI-TOF-based serum proteomic pattern diagnostics for early detection of cancer. // Curr. Opin. Biotechnol., 2004;15(1):24-30. 84. Rai A.J., Zhang Z., Rosenzweig J., Shih IeM., Pham T., Fung E.T., Sokoll L.J., Chan D.W. Proteomic approaches to tumor marker discovery. // Arch Pathol Lab Med., 2002; 126(12), p.1518-1526. 85. Rau B., Steinbach G., Baumgart K., Gansauge F., Grunert A., Beger H.G. Serum amyloid A versus C-reactive protein in acute pancreatitis: clinical value of an alternative acute-phase reactant. // Crit. Care Med., 2000; 28(3), p. 736742. 86. Rodland K.D. Mass spectrometry and biomarker development. // Dis. Markers. 2004; 20(3), p.129-130. 105 87. Rodland K.D. Proteomics and cancer diagnosis: the potential of mass spectrometry. // Clin. Biochem. 2004; 37(7), p. 579-583. 88. Rosenthal C.J., Franklin E.C., Frangione B., Greenspan J. Isolation and partial characterization of SAA-an amyloid-related protein from human serum. // J. Immunol., 1976; 116(5), p.1415-1418. 89. Siegel R, Ward E, Branty MD. Cancer statistics 2011. C A Cancer Clin. 2011;61:212-236 90. Skates S.J., Horick N., Yu Y., Xu F.J., Berchuck A., Havrilesky L.J., de Bruijn H.W., van der Zee A.G., Woolas R.P., Jacobs I.J., Zhang Z., Bast R.C. Jr. Preoperative sensitivity and specificity for early-stage ovarian cancer when combining cancer antigen CA-125II, CA 15-3, CA 72-4, and macrophage colony-stimulating factor using mixtures of multivariate normal distributions. // J. Clin. Oncol., 2004; 22(20), p. 4059-4066. 91. Skubitz A.P., Pambuccian S.E., Argenta P.A., Skubitz K.M. Differential gene expression identifies subgroups of ovarian carcinoma. // Transl. Res., 2006; 148(5), p. 223-248. 92. Stevens JB, Horne SD, Abdallah BY, Ye CJ, Heng HH. Chromosomal instability and transcriptome dynamics in cancer.//Cancer Metastasis Rev. 2013 Apr 18. 93. Tan A.C., Naiman D.Q., Xu L., Winslow R.L., Geman D. Simple decision rules for classifying human cancers from gene expression profiles. // Bioinformatics. 2005; 21(20):3896-3904. 94. Tavtigian S. V., Simard J., Rommens J. et al. The complete BRCA2 gene and mu-tations in chromosome 13q-linked kindreds // Nat. Genet. — 1996. — Vol. 12. — P. 333. 95. Thompson D., Easton D. Breast Cancer Linkage Consortium Variation in BRCA1 cancer risks by mutation position. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 2002, Vol. 11, N 4, p. 410-419. 96. Thompson D., Easton D. Variation in cancer risk, by mutation position, in 106 BRCA2 mutation carriers. Am. J.Hum. Genet., 2001, Vol.68, p. 410-419. 97. Tolson J., Bogumil R., Brunst E., Beck H., Elsner R., Humeny A., Kratzin H., Deeg M., Kuczyk M., Mueller G.A., Mueller C.A., Flad T. Serum protein profiling by SELDI mass spectrometry: detection of multiple variants of serum amyloid alpha in renal cancer patients. // Lab. Invest., 2004; 84(7), p. 845-856. 98. Toropygin I., Serebryakova M.V., Khrya-pova E.V., Mirgorodskaya O.A.// VI symposium "Chemistry of proteolytical enzymes", 2007. P. 54. 99. Ueland FR, DePriest P, Desimone C, et al. The accuracy of examination under anesthesia and transvaginal sonography in evaluating ovarian size. Gynecol. Oncol.2005;99:400-403 100. Uhlar C.M., Whitehead A.S. Serum amyloid A, the major vertebrate acutephase reactant. // Eur. J. Biochem., 1999; 265(2), p. 501-523. Review. 101. Unlu M., Morgan M.E., Minden J.S. Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. // Electrophoresis. 1997; 18(11), p. 2071-2077. 102. Vallon R., Freuler F., Desta-Tsedu N., Robeva A., Dawson J., Wenner P.., Engelhardt P., Boes L., Schnyder J., Tschopp C., Urfer R., Baumann G. Serum amyloid A (apoSAA) expression is up-regulated in rheumatoid arthritis and induces transcription of matrix metalloproteinases. // J. Immunol., 2001; 166(4), p. 2801-2807. 103. van Bennekum A.M., Wei S., Gamble M.V., Vogel S., Piantedosi R., Gottesman M., Episkopou V., Blaner W.S. Biochemical basis for depressed serum retinol levels in transthyretin-deficient mice. // J. Biol. Chem., 2001; 276(2), p.1107-1113. 104. Vapnik, V.N., Statistical Learning Theory, Springer-Verlag, New York 1998 105. Vijg J, Suh Y. Genome instability and aging. Annu Rev Physiol. 2013;75:645-68. doi: 10.1146/annurev-physiol-030212-183715. 107 106. Wamunyokoli F.W., Bonome T., Lee J.Y., Feltmate C.M., Welch W.R., Radonovich M., Pise-Masison C., Brady J., Hao K., Berkowitz R.S., Mok S., Birrer M.J. Expression profiling of mucinous tumors of the ovary identifies genes of clinicopathologic importance. // Clin. Cancer Res., 2006; 12(3 Pt 1), p. 690-700. 107. Welsh P.L., King M.C. BRCA1 and BRCA2 and the genetics of breast of breast and ovarian cancer. Hum. Molec. Genet., 2001, Vol.10, p. 705-713. 108. White C.N., Zhang Z., Chan D.W. Quality control for SELDI analysis. // Clin. Chem. Lab. Med., 2005; 43(2):125-126. 109. Wolters S, Schumacher B. Genome maintenance and transcription integrity in aging and disease. Front Genet. 2013;4:19. 110. Woolas R.P., Conaway M.R., Xu F., Jacobs I.J., Yu Y., Daly L., Davies A.P., O'Briant K., Berchuck A., Soper J.T., et al. Combinations of multiple serum markers are superior to individual assays for discriminating malignant from benign pelvic masses. // Gynecol. Oncol., 1995; 59(1), p 111-116. 111. Wooster R. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2 // Nature. — 1995. — Vol. 378. — P. 789—792.Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований женских половых органов.// Клиническая онкогинекология. Под. ред. Козаченко В.П. //Москва «Медицина» 2005, стр. 9-17. 112. Wulfkuhle J.D., Liotta L.A., Petricoin E.F. Proteomic applications for the early detection of cancer. // Nat. Rev. Cancer., 2003; 3(4), p. 267-75. Review. 113. Xiao Z., Prieto D., Conrads T.P., Veenstra T.D., Issaq H.J. Proteomic patterns: their potential for disease diagnosis. // Mol. Cell. Endocrinol., 2005; 230(1-2), p. 95-106. Review. 114. Xu F.J., Yu Y.H., Daly L., Anselmino L., Hass G.M., Berchuck A., Rodriguez G.C., Soper J.T., Clarke-Pearson D.L., Hollis D., et al. OVX1 as a marker for early stage endometrial carcinoma. // Cancer, 1994; 73(7), p.18551858. 108 115. Xu L., Tan A.C., Naiman D.Q., Geman D., Winslow R.L. Robust prostate cancer marker genes emerge from direct integration of inter-study microarray data. // Bioinformatics, 2005; 21(20), p. 3905-3911. 116. Zhang X., Lu X., Shi Q., Xu X.Q., Leung H.C., Harris L.N., Iglehart J.D., Miron A., Liu J.S., Wong W.H. Recursive SVM feature selection and sample classification for mass-spectrometry and microarray data. // BMC Bioinformatics. 2006; 7:197. 117. Zhang Z., Barnhill S.D., Zhang H., Xu F., Yu Y., Jacobs I., Woolas R.P., Berchuck A., Madyastha K.R., Bast R.C. Jr. Combination of multiple serum markers using an artificial neural network to improve specificity in discriminating malignant from benign pelvic masses. // Gynecol. Oncol., 1999; 73(1), p. 56-61. 118. Zhang Z., Bast R.C. Jr., Yu Y., Li J., Sokoll L.J., Rai A.J., Rosenzweig J.M., Cameron B., Wang Y.Y., Meng X.Y., Berchuck A., Van Haaften-Day C., Hacker N.F., de Bruijn H.W., van der Zee A.G., Jacobs I.J., Fung E.T., Chan D.W. Three biomarkers identified from serum proteomic analysis for the detection of early stage ovarian cancer. // Cancer Res., 2004; 64(16), p. 5882-5890. 119. Zhou G., Li H., DeCamp D., Chen S., Shu H., Gong Y., Flaig M., Gillespie J.W., Hu N., Taylor P.R., Emmert-Buck M.R., Liotta L.A., Petricoin E.F. 3rd, Zhao Y. 2D differential in-gel electrophoresis for the identification of esophageal scans cell cancer-specific protein markers. // Mol. Cell. Proteomics, 2002; 1(2), p. 117-124. 109
