МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ Вінницький національний медичний університет імені М.І.Пирогова

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
Вінницький національний медичний університет
імені М.І.Пирогова
ЗАТВЕРДЖЕНО
на методичній нараді кафедри
__мікробіології__
(назва кафедри)
Завідувач кафедри
проф. Г.К.Палій
(ПІБ, підпис)
«_____»____________2015 р.
МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ СТУДЕНТІВ ПРИ
ПІДГОТОВЦІ ДО ПРАКТИЧНОГО ЗАНЯТТЯ
З_мікробіології, вірусології та імунології__
(назва навчальної дисципліни)
_____стоматологічного___факультету
(назва факультету)
Вінниця – 2015
Методические рекомендации для самостоятельной работы
студентов фармацевтического факультета
(специальность - фармация)
при подготовке к практическому занятию №30
1.
Тема занятия. Общая вирусология. Морфология и ультраструктура вирусов. Методы
культивирования, индикации и идентификации вирусов. Принципы лабораторной диагностики
вирусных заболеваний.
2.
Цель занятия.
2 а. Общая: Ознакомиться с морфологией,ультраструктурой и методами культивирования
вирусов; с методами индикации и идентификации вирусов
2 б. Конкретная:
1.
Трактовать морфологию и ультраструктуру вирусов.
2.
Анализировать особенности взаимодействия вирусов с живыми системами.
3.
Оценивать результаты размножения вирусов в живых системах.
4.
Анализировать методы культивирования вирусов в лабораторных условиях.
5.
Знать этапы постановки современных методов культивирования, индикации и
идентификации вирусных заболеваний.
3.
Базовые знания, навыки, необходимые для изучения темы.
1.
И нтерпретуваты микроскопическую и субмикроскопическую структуру клеток
2.
Объяснять на молекулярно-биологическом и клеточном уровне закономерности
биологических процессов
3.
Трактовать общие физико-химические закономерности, лежат в основе процессов
развития клеток.
4.
Основные теоретические вопросы, подлежащие изучению.
1. Общая характеристика вирусов, их основные свойства.
2. Морфология и ультраструктура вириона.
3. Классификация вирусов. Принципы, положенные в основу.
4. Методы культивирования вирусов.
5. Методы индикации и идентификации вирусов (характер ЦПД в культуре ткани, реакция
гемадсорбции и гемагглютинации и др.)
6. Современные методы лабораторной диагностики вирусных заболеваний.
5.
Содержание темы.
Вирусы - особое царство организмов ультрамикроскопических размеров, обладают только
одним типом нуклеиновых кислот, лишенные собственных систем синтеза белка и
мобилизации энергии и поэтому являются абсолютными внутриклеточными паразитами. В
1892 российский ученый-ботаник Д.И. Ивановский, изучая мозаичную болезнь листьев табака,
установил, что заболевание это вызывается мельчайшими микроорганизмами, которые
проходят через мелкопористый бактериальные фильтры. Эти микроорганизмы получили
название вирусов (от лат. Virus - яд). Большой вклад в изучение вирусов внесли вирусологи:
М.А. Морозов, Н.Ф. Гамалея, Л. Зильбер, М.П.Чумаков, А.А. Смородинцев, В.М. Жданов и др.
Вирусы - мельчайшие микробы («агенты, фильтруются»), не имеют клеточного строения,
белоксинтетической системы, содержащие один тип нуклеиновой кислоты (только ДНК или
РНК). Вирусы, будучи облигатными внутриклеточными паразитами, репродуцируются в
цитоплазме или ядре клетки. Они являются автономными генетическими структурами и
отличаются особым, разобщенным (дизъюнктивным), способом репликации (репродукции): в
клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их
сборка в вирусные частицы. Сложившаяся вирусная частица называется вирионов.
Основными свойствами вирусов:
1. ультрамикроскопических размеры;
2. Содержание нуклеиновой кислоты только одного типа (ДНК или РНК)
3. Отсутствие способности к росту и бинарного деления;
4. Репликация путем воспроизведения себя по собственной нуклеиновой кислоты генома;
5. Отсутствие собственных систем мобилизации энергии;
6. Отсутствие белок-синтезирующих систем;
7. Вирусы - абсолютные внутриклеточные паразиты.
Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью электронной микроскопии, поскольку
их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий. Различают просто устроенные
вирусы (например, вирусы полиомиелита, гепатита А) и сложно устроенные вирусы (например,
вирусы кори, гриппа, герпеса, коронавирусы). В просто устроенных вирусов нуклеиновая
кислота связана с белковой оболочкой, называемой капсидом (от лат. Capsa - футляр). Капсид
состоит из повторяющихся морфологических субьодиниць - капсомеров. Нуклеиновая кислота
и капсид взаимодействуют друг с другом и вместе называются нуклеокапсидом. В сложно
устроенных вирусов капсид окружен липопротеиновой оболочкой - суперкапсида или
пеплоса. Оболочка вируса является производной структурой от мембран вирусинфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновых «шпильки», или
«шипики» (пепломеры или суперкапсидни белки). Под оболочкой некоторых вирусов
находится М-белок. Таким образом, просто устроеные вирусы состоят из нуклеиновой
кислоты и капсида. Сложно устроеные вирусы состоят из нуклеиновой кислоты, капсида
и липопротеиновой оболочки. Вирионы имеют спиральный, икосаэдрической (кубический)
или сложный тип симметрии капсида (нуклеокапсида). Спиральный тип симметрии обусловлен
винтообразной
структурой
нуклеокапсида
(например,
у
вирусов
гриппа,
коронавирусов). Икосаэдрической тип симметрии обусловлен образованием изометричных
полого тела с капсида, содержащий вирусную нуклеиновую кислоту (например, у вируса
герпеса). Капсид и оболочка (суперкапсид) защищают вирионы от воздействия окружающей
среды, обусловливают избирательную взаимодействие (адсорбцию) с определенными клетками,
а также антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов
называют сердцевиной. В аденовирусов сердцевина состоит из гистоноподибних белков,
связанных с ДНК, реовирусов - из белков внутреннего капсида. Форма вирионов может быть
различной:
палочковидных
(ортомиксовирусы,
парамиксовирусы,
коронавирусы),
пульоподибною (рабдовирусы), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ, аденовирусы ),
нитевидного (филовирусами), в виде сперматозоида (бактериофаги).
Размеры вирусов определяют с помощью электронной микроскопии, методом
ультрафильтрации
через
фильтры
с
известным
диаметром
пор,
методом
ультрацентрифугирования. Наиболее мелкими вирусами парвовирусы (18 нм) и вирус
полиомиелиту (около 20 нм), наиболее крупным - вирус натуральной оспы (около 350 нм).
Различают вирусы, содержащие ДНК или РНК. Они обычно гаплоидные, то есть имеют один
набор генов. Исключением являются ретровирусы, имеющих диплоидный геном. Геном
вирусов содержит от шести до нескольких сотен генов и представлен различными видами
нуклеиновых
кислот:
двухнитевыми,
однониточная
линейными,
кольцами,
фрагментированными. Среди РНК-содержащих вирусов различают вирусы с положительным
(плюснитка РНК) геномом. Плюс-нить РНК этих вирусов выполняет наследственную
(геномной) функцию и функцию информационной РНК (иРНК). Есть также РНК-содержащие
вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих вирусов выполняет
только наследственную функцию. Геном вирусов способен включаться в геном клетки в виде
провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых
вирусов, например, вирусов герпеса, могут находиться в цитоплазме инфицированных клеток,
напоминая плазмиды.
В вирусологии используют следующие таксономические категории: семейство (название
заканчивается на viridae), подсемейство (название заканчивается на virinae), род (название
заканчивается на virus). Однако названия родов и особенно подсемейств не для всех
вирусов. Вид вируса не получил биноминальной названия, как у бактерий.
В основу классификации вирусов положены следующие категории:

тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура,

количество нитей (одна или две),

особенности воспроизведения вирусного генома,

размер и морфология вирионов,

количество капсомеров и тип симметрии нуклеокапсида,
наличие оболочки (суперкапсида),
чувствительность к эфиру и дезоксихолат,
место репродукции в клетке,
антигенные свойства и др.
Другими необычными агентами, близкими к вирусам, является вироиды - небольшие
молекулы кольцевой РНК, суперспирализована, они не содержат белка и вызывают заболевания
растений.
Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и
интеграционный. 1. Продуктивный тип - завершается образованием нового поколения
вирионов и гибелью (лизисом) зараженных клеток (цитолитическое форма). Некоторые вирусы
выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитична форма). 2. Абортивный тип - не
заканчивается образованием новых вирионов, поскольку инфекционный процесс в клетке
прерывается на одном из этапов. 3. Интегративный тип, или вирогения - характеризуется
встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их
совместным сосуществованием (совместная репликация).
Репродукция вирусов
И. Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой, то есть репродукция вируса (лат. Re повторение, productio - производство), проходит в 6 стадий:
1) адсорбция вирионов на клетке;
2) проникновение вируса в клетку;
3) «раздевание» и высвобождение вирусного генома (депротеинизация вируса)
4) синтез вирусных компонентов;
5) формирование вирионов;
6) выход вирионов из клетки.
II в. Абортивный тип взаимодействия вирусов с клеткой. Этот тип взаимодействия не
заканчивается образованием вирусного потомства и может возникать при следующих
обстоятельствах:
1) заражение чувствительных клеток дефектными вирусами или дефектными вирионов;
2) заражение стандартным вирусом генетически резистентных к нему клеток;
3) заражения стандартным вирусом чувствительных клеток в непермисивних (не позволяют)
условиях.
Различают дефектные вирусы, дефектные вирионы и псевдовирионы.
Дефектные вирусы существуют как самостоятельные виды, которые репродуцируются только
при наличии вируса-помощника (например, вирус гепатита D размножается только в
присутствии вируса гепатита В). Дефектные вирионы обычно лишены части генетического
материала и могут накапливаться в популяции многих вирусов при множественном заражении
клеток. Псевдовирионы - это вирусы, в капсид которых помещена нуклеиновая кислота клетки
хозяина, а не вирусная нуклеиновая кислота.
ІІІ. Интегративный тип взаимодействия вирусов с клеткой (вирогения). Это взаимное
сосуществование вируса и клетки в результате интеграции нуклеиновой кислоты вируса в
хромосому клетки хозяина. При этом интегрированный геном вируса реплицируется и
функционирует как составная часть генома клетки.
Культивирование вирусов.
Культивировать вирусы можно только на биологических моделях: в организме лабораторных
животных, в куриных эмбрионах, развивающихся и культурах клеток.
Методы культивирования и индикации вирусов
1. Культивирование вирусов в организме лабораторных животных.
2. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах.
3. Культивирование вирусов в тканевых культурах.
Клеточная культура - система клеток, получаемый из ткани, находится в виде слоя клеток,
прикрепленных к стеклу, или в виде суспензии. Наиболее практическое применение получили
однослойные культуры первично-трипсинизованих клеток и линий клеток перевиваемых. Суть
методов при приготовлении первичных культур тканей заключается в разрушении
межклеточного
ткани
и
разъединение
клеток
для
последующего
получения




монослоя. Разъединение клеток проводится путем воздействия на ткань протеолитических
ферментов (трипсина). Для культивирования культуры клеток применяют синтетические
питательные среды - 199, Игла, Хэнкса, Эрла (эти среды имеют аминокислоты, витамины,
глюкозу, минеральные соли). Изменение питательной среды проводится через 2-3 дня.
1. Первичные (трипсинизовани) культуры клеток - в которых межклеточные связи разрушают
ферментами (трипсином, панкреатином) и получают монослой клеток на стекле.
2. Что перевиваются (стабильные):
а) нормальные (ПКБ - почки барана; СМЦ - сердце обезьяны циномольгус)
б) опухолевые - Hela - рак шейки матки; Hep - 1 - эпидермоидная рак гортани Дейтройт 6 костный мозг больного раком легкого. О наличии вируса в зараженной культуре клеток можно
судить по цитопатическим действием (ЦПД) - патологическими изменениями морфологии
клеток, вплоть до их гибели, возникающих в результате репродукции вирусов, и наблюдаются
под микроскопом: 1. Дегенерация клеток (округление, изменение формы, разрушение) ; 2.
Появление включений (Липшются - вирус герпеса; Гварниери - вирус натуральной оспы и
телец Бабеша-Негри - вирус бешенства); 3. Разрушение пласта клеток (парамиксовирусы) 4.
Образование гигантских многоядерных клеток - симпластов (вирус кори). 5. Образование
«негативных колоний», или «бляшкоутворення» - ограниченные участки разрушенных
вирусами клеток в сплошном монослое культуры клеток. Они видны невооруженным глазом в
виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Добавление агара в
питательную среду ограничивает распространение вирусов по всему монослоя после выхода их
из разрушенной клетки и обеспечивает взаимодействие вирусов только с соседними
клетками. Каждая «бляшка» образуется потомством одного вириона.
Основные методы индикации вирусов в культуре тканей
1. гемагглютинация;
2. гемадсорбции;
3. Реакция нейтрализации вирусов в культуре тканей;
4. Цветная реакция Солка.
- Реакция гемагглютинации - склеивание эритроцитов при добавлении материала,
содержащего вирус (есть вирус - эритроциты оседают в виде "зонтика"; нет вирусов - в виде
"диска"). - Реакция гемадсорбции - адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных
вирусом клеток и образование характерных скоплений (вирус гриппа вызывает агглютинацию
эритроцитов островкового типа).
- Цветная реакция Солка - основана на изменении цвета питательной среды. В результате
жизнедеятельности клеток в питательную среду выделяются продукты клеточного метаболизма
и происходит сдвиг рН в кислую сторону, о чем свидетельствует изменение цвета среды с
красного в желтый. Если вирус присутствует и реплицируется в культуре, то вследствие
разрушающего действия вируса клетки дегенеруються, и подавляется их метаболизм, то есть
цвет среды не меняется.
Методы диагностики вирусных заболеваний
1. Вирусоскопичний - в исследуемом материале с помощью электронной микроскопии
выявляются вирионы, а с помощью светооптической - внутриклеточные включения (недостаток
светооптической микроскопии - неспецифичность).
2. Метод иммунной электронной микроскопии - специфический, чувствительный и надежный
метод. В основе лежит взаимодействие антител (Ат) с вирусами при смешивании материала со
специфической сывороткой. В результате образуется микропреципитат, состоящий из вирусных
частиц, покрытых «венчиком» (метод громоздкий и не применяется для массовых
исследований).
3. вирусологический - выделение и идентификация вирусов с использованием клеточных
культур или куриных эмбрионов, заражением лабораторных животных. Методы
идентификации вирусов: - нейтрализации цитопатического действия (ЦПД) - Нейтрализация
реакции гемадсорбции; - Торможение реакции гемагглютинации; - Нейтрализация в опытах на
животных. Для идентификации применяются типоспецифические сыворотки.
4. Серологические - для выявления как специфических антител (АТ), так и вирусных антигенов
(АГ):
5. Иммунофлуоресцентный метод (ускоренная диагностика).
6. Биологический метод.
7. Иммунохроматографический анализ.
8. Метод ДНК-зонда (гибридизация) в основе лежит способность однонитчастих молекул
нуклеиновых кислот вступать во взаимодействие с комплементарными нитями и образовывать
двунитчасти
гибридные
молекулы. Гибридизация
осуществляется
на
мембране
нитроцеллюлозы (твердая подложка). Исследуемую клеточную суспензию лизируют для
высвобождения нуклеиновых кислот. ДНК денатурирует, а одноцепочечные молекулы,
образовавшиеся переносят на мембрану, где они ковалентно связываются с ДНК-зондом,
который является мечеными изотопом или ферментом денатурированными молекулами
нуклеиновой кислоты. Гибридизация (спаривания) произойдет, если между зондом и нитью
ДНК является гомология.
9. ПЦР (полимеразная цепная реакция) - данный метод основан на выявлении в исследуемом
образце специфического фрагмента ДНК возбудителя и на принципе естественной репликации
ДНК, включая распускание двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и
комплиментарное достройку обеих нитей.
6.
Практические работы, которые выполняются на занятии.
1.
Изучить морфологические и структурные особенности вирусов
2.
Зарисовать основные морфологические ты пи вирионов
3.
Зарисовать в протоколе этапа взаимодействия вириона с чувствительными клетками
нами и репликацию.
4.
Трактовать современные методы лабораторной диагностики вирусных заболеваний.
5.
Оценить цветную пробу Солка, реакцию гемагглютинации и гемадсорбции.
6.
Проводить микроскопию препаратов культуры клеток с различными видами ЦПД
вирусов с помощью иммерсионного микроскопа.
7.
Рекомендуемая литература.
7а. Основная:
1.
Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. Под ред. акад .. НАН
Украины В.В.Широбокова. Винница. Новая книга .2011.- С .109-127.
2.
К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология, К., 1982. Стр. 38-41, 44.
3.
С.И.Климнюк, И.О.Ситник, М.С.Творко, В.П.Широбоков. Практическая микробиология.
Тернополь, 2004. Стр .316-329.
7б. Дополнительная
1.
Словарь по микробиологии, вирусологии, иммунологии и инфекционным
заболеваниям. Общая ред .. Г.К.Палий, К., 2004.
2.
Ле кцийний материал.
8.
Материалы для самоконтроля:
Тесты:
1.
Возбудитель гепатита Д (Дельта - агент) является дефектным вирусом,
который может реплицироваться
только в клетках, уже инфицированных одним из перечисленных вирусов:
A вирусом гепатита В
B Вирусом гепатита А
C Вирусом гепатита Е
D вирусом Эпстайна-Барр
E Вирусом иммунодефицита человека
2.
В основу классификации вирусов положено:
A.
Все переаховане
B.
тип нуклеиновой кислоты
C.
содержание пар гуанин / цитозин
D.
C. тип симметрии вирионов
E.
D. Наличие или отсутствие суперкапсида
3.
Структурным элементом вирусной оболочки является:
A.
Капсомер
B.
пепломер
C.
гемагглютинин
D.
шипы
E.
Нейраминидаза
4.
Вирусы содержат все компоненты, кроме:
A.
Споры.
B.
РНК.
C.
Капсида
D.
ДНК.
E.
Суперкапсида.
5.
У больной с диагнозом "рак шейки матки" с помощью ПЦР врач обнаружил вирус
папилломы человека типа 16 (ПВЛ-16), который, как известно, интегрирует свою ДНК в геном
клетки хозяина. Как называется вирус, который интегрировал в геном клетки?
A.
Провирус.
B.
Вироидов.
C.
Вирусоид.
D.
вироидов
E.
прион
Автор:
доцент Коваленко И.Н.
Методические рекомендации
по микробиологии, вирусологии и иммунологии по проведению практических занятий
для студентов стоматологического факультета №31
1. Тема занятия: Вирусы гриппа, кори и паротита. Биологические свойства. Методы
лабораторной диагностики заболеваний.
2. Цель занятия:
2.2. Общая: Уметь избирать методы лабораторной диагностики, профилактики вирусов гриппа,
кори и паротита.
2.2. Конкретная: Уметь идентифицировать вирусы в инфекционном материале; проводить учёт
результатов серологических реакций, избрать методы лабораторной диагностики заболевания в
зависимости от сроков болезни; знать препараты для лечения и специфической профилактики
гриппа, кори и паротита.
3. Базовые знания, навыки, необходимые для изучения темы.
3.1. Знать ультраструктуру вирусов и методы их культивирования.
3.2. Знать антигенное строение и типы вирусных геномов.
3.3. Знать этапы и типы взаимодействия вирусов с клеткой.
3.4. Знать методы диагностики вирусных инфекций.
3.5. Знать виды вакцин, принципы профилактики вирусных инфекций.
4. Основные теоретические вопросы, которые подлежат изучению.
4.1.Систематическое положение, ультраструктура, антигенное строение вирусов гриппа, кори и
паротита.
4.2.Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов гриппа, кори, паротита.
4.3. Эпидемиология и патогенез гриппа, кори, паротита.
4.4. Особенности лабораторной диагностики гриппа.
4.5. Лабораторная диагностика кори, паротита. Особенности вирусологического и
серологического методов.
4.6. Методы пассивной и активной профилактики, лечение гриппа, кори и паротита.
5. Содержание темы.
Вирус гриппа принадлежит к семейству Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus. Морфология:
вирус представлен однониточной РНК, сферической формы, сложный за строением.
Антигенное строение: N-нейраминидаза (N1, N2); H-гемаглютинины (H1, H2, H3).
Культивируют вирусы на куриных эмбрионах, культурах клеток. Источником инфекции
является человек (больной или носитель). Основной механизм передачи заболевания воздушно-капельный. Инкубационный период короткий - 1-2 дня. Вирус адгезируется и
внедряется в клетки эпителия верхних дыхательных путей, где он репродуцируется и разрушает
инфицированные клетки, что клинически проявляется сухим болезненным кашлем. Вирус
гриппа малоустойчивый в окружающей среде, чувствительный к ультрафиолетовому
облучению, высокой температуре и дезинфицирующим средствам. Материал для исследования
используют смывы с носоглотки, выделения из носа, кровь, спинномозговая жидкость,
секционный материал. Во время проведения вирусологического исследования наиболее
чувствительным методом выделения вируса есть заражения 10-11 дневных куриных эмбрионов.
При серологическом исследовании проводят определение титра антител в парных сыворотках
больного с помощью РТГА и РСК. Применяют биологический метод: заражение материалом
белых мышей или хомяков. Для экспресс-диагностики используют риноцитоскопию, РИФ и
ПЦР. Постинфекционный иммунитет: напряженный, продолжительный, типоспецифический.
Для профилактики гриппа применяют живые, инактивированные, рекомбинантные, химические
вакцины и противогриппозный гамма-глобулин.
Вирусы кори и паротита принадлежат к семейству Paramyxoviridae, рода
Paramyxovirus. Геном парамиксовирусов содержит однониточною РНК, сферической формы,
сложного строения. Культивируют вирусы в культурах клеток, куриных эмбрионах.
Источником инфекции является человек (больной или носитель). Основной механизм передачи
заболеваний - воздушно-капельный, для вируса кори существует также вертикальный от матери
до ребенка через плаценту. Вирусы малоустойчивые в окружающей среде, чувствительные к
ультрафиолетовому облучению, высокой температуре и дезинфицирующим средствам.
Иммунитет при эпидемическом паротите и кори - напряженный, продолжительный, остаётся в
течение всей жизни. Для лабораторной диагностики применяют вирусологический,
серологический и экспресс-методы. Материалом для исследования: используют смывы с
носоглотки, кровь, моча, пунктат желез, спинномозговая жидкость, секционный материал. Во
время проведения вирусологического исследования заражают культуры клеток, куриные
эмбрионы (паротит). При серологическом исследовании проводят определение титра антител в
парных сыворотках больного с помощью РТГА и РСК. Для экспресс-диагностики используют
РИФ. Специфическую профилактику проводится живой атенуированой коревой или
паротитной вакциной согласно календаря прививок, или трёхкомпонентной КПК (корь,
паротит, краснуха) вакциной.
6. Практические работы, которые выполняются на занятии.
6.1. Для серотипирования вируса гриппа ставят РТГА капельным методом. На
предметные стекла наносят 5 капель смыва из носоглотки больного. Добавляют по капле
типичные анти гриппозные сыворотки N1H1, N2H2 и нормальную сыворотку для контроля.
Затем в каждую каплю прибавляют по 1 капле взвеси куриных эритроцитов. Результаты
учитывают через 2-5 мин. Тип вируса отвечает той диагностической сыворотке, в присутствии
которой происходит торможение гемагглютинации. Другие сыворотки, в частности
нормальная, не тормозят агглютинацию эритроцитов.
6.2. Студенты учитывают результаты РТГА в демонстрационном опыте для выявления
прироста титра антител против вируса паротита в парных сыворотках больного.
Реакция ставится в двух рядах лунок. В каждом ряду лунок находится разведения
сыворотки пациента, взятой в начале заболевания (и ряд) и через 10 дней (II ряд). В лунки
каждого ряда внесли вирусный диагностикум в объеме 0,2 мл (4 гемаглютинирующие
единицы). Исходное разведение сывороток от 1:10 до 1: 640. После чего в каждую лунку
добавили 1% суспензию куриных эритроцитов. Реакция сопровождается контролями: К1контроль сыворотки; К2 - контроль диагностикума, К3 - контроль эритроцитов. Результат
реакции оцениваем начиная с контролей в котором наблюдаем компактный осадок
эритроцитов в виде "пуговицы" (К1, К3) и агглютинация эритроцитов "зонтик" (К2). В
некоторых исследовательских луночках эритроциты оседают компактно в виде "пуговицы"
(результат положительный). Это происходит потому, что антитела пациента взаимодействуют
с гемагглютинином вирусного диагностикума и эритроциты оседают на дно лунки. В
некоторых исследовательских луночках происходит склеивание эритроцитов с помощью
вирусного диагностикума (результат отрицательный). Титр антител - наибольшее разведение
исследуемой сыворотки, которое дает положительную реакцию (последняя луночка с
компактным осадком). Нарастание титра антител в 4 и более раз подтверждает диагноз.
6.3. Для выявления прироста титра антител против вируса кори студенты учитывают с
помощью реакции связывания комплемента (РСК), которая состоит из 2 систем: антиген +
антитело + комплемент (1 система), завис эритроцитов + гемолитическая сыворотка (II
система). Проходит в 2 фазы: 1 специфическая, обусловливает связывания комплемента в
случае соответствия антител и антигена, при несоответствии - антиген остается свободным.
При введении в опыт 2 (индикаторной) системы гемолиз состоится только при наличии
свободного комплемента (реакция отрицательная). В случае, когда комплемент адсорбировался
на системе антиген-антитело, гемолиз не происходит (реакция положительная).
6.4. Студенты в протокол записывают сведения о химиотерапевтических и профилактических
средства, применяемые при грипе, кори и паротите.
Химиотерапевтические средства для этиотропного лечения: амантадин, ремантадин блокируют
проникновение вирусов в клетки макроорганизма; препараты рекомбинантного интерферона блокируют синтез вирусных белков. Специфическую профилактику гриппа проводят
противогрипозним гамма-глобулин, который изготавливают из сыворотки крови доноров,
иммунизированных живой гриппозной вакциной типов А и В. Применяют для лечения и
профилактики гриппа в эпидемических очагах. Живая гриппозная вакцина - изготавливают из
алантоисной жидкости куриных эмбрионов, инфицированных вакцинными штаммами вируса
гриппа основных серотипов. Применяют также, инактивированные, рекомбинантные и
химические вакцины для профилактики гриппа. Специфическую профилактику кори проводят
противокоровим гамма-глобулин, живой, аттенуированной коровой, профилактику паротита ¬живой паротитной вакцинами, или трехкомпонентной КПК (против кори, паротита краснухи)
согласно календарю прививок детям в возрасте 12-15 месяцев, ревакцинацию в возрасте 6 лет.
Вакцина формирует длительный иммунитет.
7. Рекомендованная литература.
7а. Основная.
К. Д. Пяткин, Ю. С. Кривошеин. Микробиология, М., 1980. - С. 406-411.
В. Д. Тимаков. Микробиология, М., 1983. - С. 403-413.
А.И.Коротяев, С. А. Бабичев. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. С.Петербург, 2002. - С. 263-269, 271-273.
Л. Б. Борисов. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, М., 1984. - С. 229-239.
Ю.С. Кривошеин. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, М.,
1986. - С. 221-225.
7б. Дополнительная.
Микробиология, вирусология, иммунология, инфекционные болезни. Словарь/ Под ред.
Г.К.Палия, В.Г.Палия. - Киев: Здоровье, 2004. - С. 33, 83, 88, 91.
Сборник задач для подготовки к тестовому экзамену по естественно-научным дисциплинам
«Крок-1. Общая врачебная подготовка» /Кол.авторов; под ред. В.Ф.Москаленка и соавт. К.:Медицина, 2004. - С.328-331.
8. Материалы для самоконтроля:
Приложение 1: тестовые задания для проверки уровня знаний
1. Вирус гриппа содержит внутренние антигены - нуклеопротеидные (NP), полимеразные (P1,
P2, P3), матриксный белок (М) и внешние антигены - гемагглютинин (Н) и нейраминидазу (N).
Которым из них принадлежит основная роль в создании иммунитету к гриппозной инфекции?
A Полимеразные белки
B Нуклеопротеидные антигены
C Матриксной белок
D Гемагглютинин и нейраминидаза
E Нейраминидаза
2. В больного с подозрением на грипп взяли для исследования смыв с носоглотки, которым в
дальнейшем будут инфицированные куриные эмбрионы для выделения вируса. Как необходимо
обработать патологический материал перед заражением?
A Прогреванием до 60o С
В Раствором антибиотику
C Диагностической сывороткой
D Раствором трипсина
E Многоразовым замораживанием и размораживанием
3. В мальчика 6 лет повышение температуры тела, заушные железы увеличены. Со слюны
больного был выделен вирус, который размножается в куриных эмбрионах и тканевых
культурах, имеет гемагглютинирующие свойства и вызывает образование симпластов в
культуре клеток. Какие еще органы наиболее вероятно могут быть поражены вследствие
инфекции, вызванной этим вирусом?
A Головной мозг
B Печень
C Легкие
D Глоточные миндалины
E Половые железы
4. В детском учреждении зарегистрирована вспышка кори. В чем состоит специфическая
экстренная профилактика относительно контактных не привитых детей?
A Ведение вакцины АДС - М
B Ведение живой противокоревой вакцины
C Ведение противокоревого гамма-глобулину
D Установление медицинского наблюдения за детьми
E Изоляция и лечения больных
5. Мальчик 1,5 года, который не получал плановые прививки, контактировал с больным корью.
С целью экстренной специфической профилактики ребенку было введено донорский гаммаглобулин. Какой вид иммунитета было создано при этом?
A Естественный
B Пассивный
C Антитоксический
D Поствакцинальный
E Местный
Ситуационная задача
1. У ребенка признаки острой респираторной вирусной инфекции. На 4-и день после
заболевания появилась папулёзная сыпь за ушами, потом на лбе, лице, а дальше на туловище;
на слизистой оболочке щек имеются пятна Коплика-Филатова. Какой диагноз можно поставить
за клиническими признаками? Как его уточнить?
Автор: ассистент, К.мед.н. Осадчук Н.І.
Методические рекомендации для самостоятельной работы
студентов стоматологического факультета
при подготовке к практическому занятию №32
1. Тема: Вирусы полиомиелита, бешенства и энцефалитов. Биологические свойства. Методы
лабораторной диагностики заболеваний.
2. Цель занятия.
2а. Общая: уметь выбрать метод лабораторной диагностики полиомиелита, бешенства,
японского и клещевого энцефалита при подозрении на заболевание, знать биологические
свойства возбудителей полиомиелита, бешенства, японского и клещевого энцефалитов,
обусловливающие патогенез заболевания, обосновать методы профилактики заболеваний.
2б. Конкретная:
1. Изучить биологические свойства вируса полиомиелита.
2. Знать эпидемиологию, патогенез и клинические проявления бешенства.
3. Овладеть методами лабораторной диагностики полиомиелита.
4. Освоить специфическую профилактику полиомиелита согласно календаря профилактических
прививок.
5. Изучить биологические свойства вируса бешенства.
6. Знать эпидемиологию, патогенез и клинические проявления бешенства.
7. Уметь выбрать методы прижизненного и постмортального выявления вируса бешенства в
организме человека.
8. Знать препараты, которые используют для специфической профилактики бешенства.
9. Изучить биологические свойства возбудителей клещевого и японского энцефалитов.
10. Знать патогенез клещевого и японского энцефалитов.
11. Уметь выбрать методы лабораторной диагностики клещевого и японского энцефалитов.
12. Знать специфическую и неспецифическую профилактику клещевого и японского
энцефалитов.
3. Базовые знания, навыки, необходимые для изучения темы:
3.1. Морфология вирусов. Этапы репродуктивного цикла вирусов.
3.2. Модели для культивирования вирусов.
3.3. Противовирусный иммунитет.
3.4. Специфическая и неспецифическая профилактика вирусных инфекций.
4. Основные теоретические вопросы, подлежащие изучению.
4.1. Таксономическое положение, биологические свойства вируса полиомиелита.
4.2. Патогенез поражения нервной системы.
4.3. Лабораторная диагностика полиомиелита.
4.4 Специфическая и неспецифическая профилактика заболевания.
4.5.Таксономичне положение, морфология и резистентность вируса бешенства.
4.6. Патогенез бешенства.
4.7. Лабораторная диагностика бешенства: прижизненная и постмортальная.
4.8. Профилактика бешенства: неспецифическая и специфическая.
4.9. Таксономическое положение, морфология и резистентность вирусов клещевого и японского
энцефалитов.
4.10. Методы культивирования и резистентность флавивирусов.
4.11. Патогенез клещевого и японского энцефалитов.
4.12. Методы лабораторной диагностики клещевого и японского энцефалитов.
4.13. Профилактика клещевого и японского энцефалитов: специфическая и неспецифическая.
5. Содержание темы.
Граф логической структуры содержания:
Вирусы полиомиелита
Picornaviridae
Семейство
Тип НК
Однониточная РНК
Морфология
Форма
Многогранник
Антигенное строение
Методы
культивирования
Резистентность
Сложность
Простой
строения
Вирус полиомиелита - серовары I, II, III
Культура клеток фибробластов, HeLa
Устойчивые к детергентам, спиртам
Чувствительны к альдегидам, соединениям хлора, фенола, УФЛ,
высушиванию
Больной человек, носитель
Источник заражения
Механизм
и
пути Фекально-оральный механизм
Алиментарный путь
передачи заболевания
Энтероциты,
лимфоидный
аппарат
тонкого
кишечника,
Органотропность
мотонейроны головного и спинного мозга
Типоспецифический
Иммунитет
Методы лабораторной Вирусологический
Серологический
диагностики
РИФ
Полиомиелита:
Специфическая
1)
Живая вакцина Сейбина
профилактика
2)
Инактивированная вакцина Солка
Интерферон, иммуноглобулин
Терапия
Вирус бешенства
Rabdoviridae
Семейство
Тип НК
РНК
Морфология
Форма
Пулевидная
Сложность
Сложный
строения
Различают „дикий” штамм и фикс-вирус.
Антигенное строение
1) Перевиваемые культуры HeLa
Методы
2) Куриный эмбрион
культивирования
3) Белые мыши
Чувствителен к детергентам, эфиру, спирту, УФЛ
Резистентность
Стойкий к низким температурам
Больные животные (кошки, собаки)
Источник заражения
Механизм
и
пути Укусы и ослюнение ран.
Инкубационный период - 12 дней - 1 год
передачи заболевания
Клетки ЦНС
Органотропность
Вируснейтрализующие АТ, интерферон.
Иммунитет
Методы лабораторной Экспресс-диагностика: РИФ, ИФА, РИА.
Молекулярно-генетический: ПЦР.
диагностики
Серологический: РСК, РТГА.
Биологический.
Цитоскопический:
выявление
телец
Бабеша-Негри
гистологических срезах головного мозга.
Живая аттенуированная вакцина
Профилактика
Культуральная инактивованная вакцина
Иммуноглобулин
Вирусы клещевого и японского энцефалитов
Flaviviridae
Семейство
Тип НК
РНК
Морфология
Форма
Сферическая
Сложность
Сложные
в
строения
Вирус клещевого энцефалита - 3 серотипа
Антигенное строение
Вирус японского энцефалита - 2 серотипа
Чувствительные к УФЛ эфиру, высокой температуре.
Методы
Стойкие к низким температурам, высушиванию.
культивирования
Клеточные культуры HeLa
Резистентность
Оболочки куриного эмбриона
Белые мыши
Животных и птицы
Источник заражения
Механизм
и
пути Трансмиссивный: иксодовые клещи, комары рода Culex.
Алиментарный: молоко.
передачи заболевания
Клетки ЦНС
Органотропность
Стойкий
Иммунитет
Методы лабораторной Вирусологический
Серологический
диагностики
Биологический
Молекулярно-генетический
Инактивированные вакцины
Профилактика
Гетерологические и гомологические иммуноглобулины
Терапия
Интерферон
Граф логической структуры лабораторного исследования полиомиелита
Материал для исследования: фекалии, ликвор, кровь, моча, секционный материал.
Вирусологическое исследование
1.
Культивирование вирусов: заражение культуры клеток HeLa
2.
Индикация вирусов по ЦПД, бляшкообразованию, „цветной” пробе
3.
Идентификация вирусов в РСК, РН в культуре клеток
Серологическое исследование
Выявление титра антител в парных сыворотках с помощью РСК, РН.
Экспресс-диагностика
РИФ, иммунная электронная микроскопия
Граф логической структуры лабораторного исследования бешенства
Материал для исследования: слюна, слюнные железы, мозг, сыворотка крови.
Микроскопическое исследование: окраска по Туревичу и Муромцеву гистологических срезов
слюнных желез, мозга для выявления телец Бабеша-Негри.
Биологическое исследование: интрацеребральное заражение белых мышей (развитие
паралитической формы бешенства); выявление телец Бабеша-Негри.
Серологическая диагностика: выявление антирабических антител в РСК, РИА, ИФА, РН на
мышах.
Экспресс-диагностика: РИФ для выявления вирусных антигенов на мазках-отпечатках
роговицы, гистологических срезах слюнных желез или мозга.
Граф логической структуры лабораторного исследования клещевого и японского
энцефалитов.
Материал для исследования: спинномозговая жидкость, мозг, сыворотка крови.
Вирусологический метод: культивирование в культуре клеток, оболочках куриного эмбриона,
в организме новорожденных мышей.
Индикация: ЦПД, бляшкообразование, гибель мышей и куриных эмбрионов.
Идентификация: РН, РТГА, РСК.
Серологический метод: выявление титра антител в РН, РТГА, РСК с парными сыворотками.
Обнаруживают Ig M ( 3-4 день), Ig G (3 неделя).
Биологический: заражение новорожденных мышей.
Экспресс-диагностика: РИФ, РИА, ИФА.
Молекулярно-генетический метод: ПЦР.
6. Практические работы, которые выполняются на занятии.
6.1. Промикроскопировать и зарисовать неизмененную культуру клеток и ЦПД вируса
полиомиелита.
6.2. Учесть результаты РН методом "цветной" пробы для идентификации вируса полиомиелита.
№ пробирки
Компоненты для постановки реакции
Рисунок
1
Культура клеток Сыворотка
Вирус типа І
в среде 199
пациента
2
Культура клеток Сыворотка
Вирус типа ІІ
в среде 199
пациента
3
Культура клеток Сыворотка
Вирус типа ІІІ
в среде 199
пациента
6.3. Учесть результаты РН методом "цветной" пробы для установления титра антител в
сыворотке крови больного полиомиелитом.
Разведение сыворотки
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
6.4. Учесть результаты РСК. Определить титр антител в парных сыворотках больного
полиомиелитом.
Тип вируса
Разведение сыворотки
1:5
1:10
1:20
1:40
1:80
1:160
Начало заболевания
І
ІІ
10-и день заболевания
І
ІІ
6.5. Осуществить постановку реакции торможения гемагглютинации (капельный метод) с
целью идентификации вирусов японского и клещевого энцефалитов. Сведения внести в
протокол.
На предметное стекло к изучаемому материалу вносят диагностические сыворотки, а затем
завис эритроцитов. Вид вируса определяют по сыворотке, которая тормозит гемагглютинацию
эритроцитов.
6.6. Провести учет результатов реакции нейтрализации цветной пробы в пробирках,
поставленную с целью установления титра антител к вирусу клещевого энцефалита в сыворотке
крови пациента. Сведения занести в протокол.
При постановке реакции сначала смешивают 0,25 мл исследуемого вируссодержащего
материала, с различными разведенными специфической противовирусной иммунной
сыворотки. После 30-60-минутной инкубации при температуре 37°С в пробирки добавляют по
0,25 мл клеточной суспензии с индикатором фенолрот и заливают их слоем вазелинового масла
или закрывают резиновыми пробками. Пробирки выдерживают в термостате при 37 ° С в
течение одной недели, а затем читают результаты. «+» результат - изменение цвета среды на
соломенно-желтый или оранжевый; «-» результат - среда остается красного цвета.
6.7. Провести учет реакции связывания комплемента, поставленной с целью установления титра
антител в сыворотке крови больного японским энцефалитом. Результаты занести в протокол.
Для постановки РСК компоненты вносят в определенной последовательности. Сначала в
пробирки, в которых содержится разведенная сыворотка больного, добавляют равные объемы
антигена и комплемента в рабочей дозе. Пробирки тщательно встряхивают и помещают в
термостат при 37°С на 1 час. За это время соединяется антиген с антителом, и на этом
комплексе фиксируется комплемент. Одновременно в термостате инкубируют гемолитической
систему. Через час во все пробирки основного опыта добавляют по 1 мл гемолитической
системы и снова ставят в термостат. Через 30-45 мин проводят учет реакции при условии
полного гемолиза в контролях сыворотки, антигена и комплемента. «+» результат - красный
осадок на дне пробирки, над осадочная жидкость прозрачная; «-» результат - полный гемолиз,
осадок отсутствует, жидкость красная и прозрачная.
6.8. Провести учет результатов реакции торможения гемагглютинации, поставленную с целью
установления титра антител к возбудителям японского и клещевого энцефалитов. Результаты
занести в протокол.
Для постановки реакции с целью определения неизвестного вируса или его антигенов в
буферном растворе (0,2) делают двукратные разведения иммунной сыворотки (исходное
разведение 1:10), а затем добавляют неизвестный антиген в объеме 0,2 мл - в первый ряд лунок
планшетки к разведению сыворотки (1:10-1: 5120) внесены диагностикум вируса клещевого
энцефалита, во второй ряд - диагностикум вируса японского энцефалита. Систему инкубируют
в зависимости от свойств вируса при температуре 4°С, 18°С, 37°С 1-18ч. Затем к комплексу
добавляют двойной объем взвеси эритроцитов. Пластины инкубируют в течение 1-3 ч при той
же температуре до полного оседания эритроцитов и оценивают результаты.
6.9. Оформить протокол, сделать вывод.
7. Рекомендуемая литература:
7а. Основная:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студ. высш. мед.
учеб. заведение / Под редакцией В.П.Широбокова / Издание второе. - Винница: Новая Книга,
2011. - 952 с. : Ил.
2. К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология, К., 1982. - С. 360-363, 371-374.
3. К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология, М., 1980. - С. 415-418, 425-427, 429-430.
7б. Дополнительная.
1. Микробиология, вирусология, иммунология, инфекционные болезни. Словарь / Под ред
Г.К.Палия, В.Г.Палия. - Киев: Здоровье, 2004. - С. 67, 102, 139, 146.
2. Сборник задач для подготовки к тестовому экзамену по естественно-научным дисциплинам
«Крок-1. Общая врачебная подготовка »/Кол.авторив; Под ред. В.Ф.Москаленко и соавт. - М.:
Медицина, 2004. - С.328-331.
3. Лекционный материал.
8. Материалы для самоконтроля:
Тесты:
1. В больницу поступил больной с рваной раной голени, вследствие укуса больного бешенством
животного. Какую вакцину необходимо ввести для предупреждения бешенства?
A АДС
B АКДС
C антирабическую вакцину
D БЦЖ
E ТАВte
2. Больной обратился к поликлиники по поводу укусов собаки. Собаку удалось поймать, и
оказалось, что животное больно бешенством. Какую вакцину необходимо использовать для
специфической профилактики бешенства у человека?
A. анатоксин
B. Живу
C. Химическую
D. Рекомбинантную
E. Синтетическое
3. В инфекционную больницу поступил пациент с клиническими признаками энцефалита. В
анамнезе - укус клеща. В реакции задержки гемагглютинации обнаружены антитела против
возбудителя клещевого энцефалита в разведении 1:20, что не является диагностическим.
Укажите следующие действия врача после получения указанного результата:
A Повторить исследования с другим диагностикумом.
B Исследовать эту же сыворотку повторно.
C Использовать более чувствительную реакцию.
D Повторить исследование с сывороткой, взятой через 10 дней
E Отклонить диагноз клещевого энцефалита.
4. В клетках мозга лисы, отловленной в пределах города, обнаружены включения в виде телец
Бабеша-Негри. Источником которого заболевания было животное?
A Бешенство
B Инфекционный мононуклеоз
C Грипп
D Клещевой энцефалит
E Ветряная оспа
5. Укажите наиболее распространенный путь передачи инфекции при клещевом энцефалите.
A. Вертикальный
B. фекально-оральный
C. Контактный
D. Воздушно-капельный
E. Трансмиссивный
6. У больного мальчика 5 лет на п "пятый день после начала заболевания из слизистой
носоглотки и миндалин выделен возбудитель полиомиелита. Какую реакцию следует
использовать для установления серотипа возбудителя?
A. Реакция вирусной нейтрализации цитопатического действия
B. Реакция торможения гемагглютинации
C. Реакция торможения гемадсорбции
D. Реакция непрямой гемагглютинации
E. Реакция связывания комплемента
7. В лабораторию поступил материал от пациента полиомиелитом. Как выделить вирус?
A. На культуре клеток
B. На дифференциально-диагностических средах.
C. На элективных средах.
D. На синтетической среде №199.
E. На селективных средах.
Ситуационная задача.
Больной 48 лет, лесничий, доставлен в больницу с жалобами на периодические приступы
психомоторного возбуждения и агрессивности. Два дня назад ухудшилось настроение,
появились боли в спине, слабость, водобоязнь. Месяц назад поймал лису, которая через 2 дня
исчезла.
1. Назовите возбудителя, вызвавшего заболевание.
2. Какие методы лабораторной диагностики можно использовать для постановки диагноза?
3. Какие методы специфического лечения существуют для лечения и профилактики
заболевания?
Автор
Доцент Фомина Н. С.
Методические рекомендации
для самостоятельной работы студентов стоматологического факультета
при подготовке к практическому занятию №33
1. Тема: Вирусы гепатитов. Вирус иммунодефицита человека. Биологические свойства.
Методы лабораторной диагностики, профилактики заболеваний.
2. Цель занятия.
2.1. Общая. Уметь обосновывать использование методов диагностики гепатитов, ВИЧинфекции.
2.2. Конкретная. Уметь объяснить этапы постановки иммуноферментного анализа для
выявления противовирусных антител, интерпретировать результаты ИФА, поставленную с
целью выявления антигенов.
3. Базовые знания, навыки, необходимые для изучения темы.
3.1. Знать принципы классификации вирусов, их основные биологические свойства.
3.2. Знать основные периоды и типы взаимодействия вирусов с чувствительными клетками.
3.3. Основные механизмы неспецифического и специфического противовирусного защиты.
4. Основные теоретические вопросы, подлежащие изучению.
4.1. Классификация вирусов гепатитов. Их дифференциальные признаки.
4.2. Ультраструктура, антигенное строение и резистентность вируса гепатита А.
4.3. Патогенез вирусного эпидемического гепатита.
4.4. Ультраструктура, антигенное строение и резистентность вируса гепатита В.
4.5. Патогенез вирусного гепатита В.
4.6. Методы лабораторной диагностики вирусных гепатитов.
4.7. Общая характеристика семейства Ретровирусов. Классификация, роль в патогенезе
человека.
4.8. Ультраструктура, антигенное строение, резистентность ВИЧ.
4.9. Патогенез ВИЧ-инфекции.
4.10. Методы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции.
4.11. Профилактика вирусных гепатитов, СПИДа.
5. Содержание темы.
Классификация: Семейство пикорнавирусов, род гепатовирус, вирус гепатита A
(эпидемический гепатит). Семейство гепаднавирусов, род ортогепаднавирус, вирус гепатита B
(сывороточный гепатит). Семейство флавивирусов, род гепацивирус, вирус гепатита C, вирус
гепатита
G.
Семейство
аденовирусов,
род
аденовирус,
вирус
гепатита
F.
Неклассифицированный вирус гепатита D; вирус гепатита Е; ТТ-вирус; SEN-вирус. По способу
передачи различают вирусы с преимущественно фекально-оральным механизмом передачи вирусы гепатитов А и Е (вызывают инфекционные гепатиты) и вирусы с преимущественно
парентеральным механизмом передачи - вирусы гепатитов B, C, D, G (вызывают сывороточные
гепатиты). Течение заболевания зависит от типа вируса и особенностей иммунного ответа
инфицированного человека (острый, хронический с периодическими обострениями или
медленно прогрессирующее течение, формирования носительства). Принципы лабораторной
диагностики инфекционных гепатитов: Обнаружение вирусов или их антигенов в фекалиях
больного (ИЭМ, ИФА, РИА, РИФ) и выявления вирус-специфических антител в парных
сыворотках пациента: Ig M (в острой фазе) и Ig G (после перенесенного гепатита) с помощью
РСК, РНГА, ИФА, РИА. Принципы лабораторной диагностики сывороточных гепатитов:
выявление вирусных антигенов в крови (ИФА, РИА, РИФ) и выявления вирус-специфических
антител в сыворотке пациента (РНГА, ИФА, РИА). Молекулярно-генетические методы в
диагностике вирусных гепатитов: выявление вирусных нуклеиновых кислот в крови с помощью
ПЦР. Вирус гепатита А: простой, (+) РНК-геном однониточный, тип симметрии - кубический.
Имеет рецепторы к энтероцитам тонкого кишечника, лимфатическому аппарату кишечника,
гепатоцитам; выделяют 1 тип вируса по HAV-Ag (нуклеокапсид). Чувствителен к воздействию
УФ лучей, высоких температур, дезинфектантов; устойчив к низким температурам, действию
эфира, спирта, детергентов, хорошо сохраняется во внешней среде (в воде). Культивируют в
культуре гепатоцитов мышей, но ЦПД слабо выражена или отсутствует. Источником инфекции
является больной человек или вирусоноситель; преимущественный путь передачи - водный;
человек выделяет вирус последние 10-14 дней инкубационного периода. Стадии патогенеза энтеральная фаза, фаза регионарного лимфаденита, фаза первичной генерализации инфекции
(первичная вирусемия), гепатогенная фаза (паренхиматозная диффузия), фаза неустойчивой
локализации и повторной вирусемии, фаза иммуногенеза и освобождение организма от
возбудителя. Иммунитет длительный, напряженный. Специфическая профилактика инактивированные вакцины (Хаврикс, Аваксим), нормальный человеческий иммуноглобулин
для контактных лиц. Лечение: использование индукторов интерферона.
Вирус гепатита В: сложный, ДНК-геном (одна из нитей неполная, связанная с вирусной ДНКполимеразой), имеет рецепторы к α-протеину мембраны гепатоцитов. Антигены вируса HBsAg - гликопротеин и липид суперкапсида, HBcAg - нуклеопротеин, который содержится в
капсиде вирионов, HBeAg отщепляется от HBc-Ag при прохождении вируса через мембрану
гепатоцита, HBxAg - регуляторный белок, участвует в опухолевой трансформации гепатоцитов
(опухолевый антиген). Вирус увствителен к альдегидам, детергентам, спирту, эфиру; устойчив
к низким и высоким температурам, УФ лучам. ЦПД при культивировании слабо выражено.
Источником инфекции является больной человек и вирусоноситель; заражение происходит
половым, парентеральным, трансплацентарным, трансплантационным путями; поражения
печени
происходит
под
действием
натуральных
киллеров,
Т-киллеров,
антитилопосередованного цитолиза, возможно развитие карциномы печени под влиянием HBxантигена. Иммунитет при циклическом течении (выведение вируса) стерильный, пожизненный;
при ациклические течения (вирус интегрируется в геном гепатоцита и не выводится)
нестерильный, имеет место репродукция вируса гепатита В. Профилактика специфическая плановая вакцинация рекомбинантными генноинженерного вакцинами (содержит HBsAg)
новорожденных с ревакцинацией в 2 мес. и 7-8 мес., введение специфического антиHBs γглобулина. Лечение-противовирусные ХТС - ингибиторы ДНК-полимеразы, интерферон, его
индукторы, специфический γ-глобулин.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) относят к семейству Retroviridae. Вирус сложный,
сферической формы. Имеет двухцепочную РНК. Антигенное строение: поверхностные Аг
(гликопротеины суперкапсида (gp 41, gp 120), внутренние типоспецифические Аг (структурные
белки капсида - матриксный белок - р17, капсидный белок - р 24, связующие белки - р9 и р6).
Методы культивирования: перевиваемые культуры лейкозных Т-хелперов, монослой культуры
астроцитов, первичные культуры Т-хелперов, стимулированные ИЛ-2. Резистентность:
чувствителен к Н2О2, концентрированных кислот и щелочей, жирорастворителям (этиловый
спирт, эфир, ацетон), глютаральдегиду; устойчив к низким температурам, ионизирующей
радиации , УФЛ. Источник заражения - больной человек, носитель (ВИЧ-инфицированный).
Механизм и пути передачи заболевания: парентеральный. Половой, трансфузионный,
инструментальный,
инъекционный,
трансплантационный,
трансплацентарный
пути.
Органотропность: клетки с CD -4 рецепторами: макрофаги, моноциты, дендритные клетки
лимфатических узлов, астроциты, олигодендроциты головного мозга, клетки Лангерганса, Тхелперы. Иммунитет: развивается иммунодепрессия. Методы лабораторной диагностики: ИФА;
РИА; иммуноблотинг; ПЦР. Профилактика: раннее выявление источника инфекции; разрыв
механизмов и путей передачи инфекции. Терапия: нуклеозидные ингибиторы обратной
транскриптазы, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы протеазы,
ингибитор интегразы, блокаторы вирусных рецепторов.
Граф логической структуры микробиологического исследования гепатитов
Материал для исследования: сыворотка крови, испражнения.
Выявление вирусов - иммунная электронная микроскопия.
Выявления антигенов вирусов - ИФА, РИА.
Выявление антител - РНГА, ИФА, РИА.
Выявление генетического материала вирусов - ПЦР.
Граф логической структуры микробиологического исследования ВИЧ-инфекции
Материал для исследования: кровь, сыворотка.
Серологическая диагностика.
1 этап - выявление антител с помощью ИФА (трехкратный повтор).
2 этап - выявление антител к определенным вирусных белков с помощью иммуноблоттинга.
Молекулярно-генетический метод.
Выявление провируса в лимфоцитах, вирусных нуклеиновых кислот в патологическом
материале с помощью ПЦР.
Вирусологический диагностика.
1 этап - заражение культур клеток Т-лимфоцитов.
2 этап - идентификация вирусов с помощью ИФА, РИФ.
6. Практические работы, выполняемые на занятии.
6.1. Ознакомиться с принципом постановки ИФА с целью выявления специфических антигенов
в сыворотке крови больного.
На занятии в качестве твердофазного носителя используют планшеты с адсорбированными на
дне лунок антителами. В лунки вносят по 1 капле исследуемой сыворотки и помещают
планшеты в термостат при t 37 0C. Промывают луночки буферным раствором и вносят
меченные ферментом (пероксидазой хрена) антитела против этого антигена (прямой вариант).
Планшеты помещают в термостат при t 37 0C. Промывают луночки буферным раствором,
вносят по 1 капле перекиси водорода и ортофенилдиамина (ОФД). Планшеты помещают в
термостат до появления желтой окраски в луночке с контролем. Количество присоединенного к
твердой фазе энзима соответствует количеству антигенов. При наличии в исследуемой
сыворотке антигенов вируса в лунках изменяется цвет жидкости на желтый или желтоватокоричневый (результат положительный). В лунках с сывороткой, которая не содержит
антигенов вирусов, цвет жидкости не изменяется (результат отрицательный). Зарисовать схему
реакции.
6.2. Ознакомиться с принципом постановки иммуноферментного метода с целью выявления
специфических протиВИЛ-антител в сыворотке крови больного.
Для воспроизведения принципа ИФА на занятии в качестве твердофазного носителя
используют планшетки с адсорбированными на дне лунок антигенами. В луночки вносят по
одной капле исследуемых сывороток и вмещают планшетки в термостат на 30 минут (37С).
Затем промывают буферным раствором и вносят меченные ферментом (пероксидазой хрена)
антивидовые (антиимуноглобулинови) сыворотки. Планшеты помещают в термостат на 30-40
минут при температуре 37С. Промывают луночки буферным раствором, вносят по капле
перекиси водорода и ортофенилдиамину (ОФД). Вмещает в термостат до появления желтой
окраски в луночци с контрольной положительной сывороткой. Интенсивность окраски зависит
от количества присоединенного к твердой фазе энзима и соответствует количеству
вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. Схему реакции зарисовать.
6.3. Познакомиться с принципом постановки реакции гибридизации нуклеиновых кислот.
Целью метода является выявление в исследуемом материале участков ДНК, характерных для
данного возбудителя. Для этого используют их гибридизацию с диагностическими ДНКзондами. ДНК-зонды - это однонитевые фрагменты ДНК (комплементарные к специфическим
участкам ДНК возбудителя), меченые радионуклидами, ферментами или флуорохромами.
Схему реакции зарисовать.
6.4. Провести учет результатов реакции связывания комплемента, поставленную с сывороткой
больного гепатитом А.
Для постановки РСК в пробирках готовят последовательные разведения сыворотки пациента
(1:5 - 1:160). Затем добавляют оттитрованы антиген и комплемент в рабочих дозах. Опыт
сопровождают 2 контролями: сыворотки (физиологический раствор, сыворотка, комплемент) и
антигена (физиологический раствор, антиген, комплемент). Одновременно готовят
индикаторную систему (инактивированная гемолитическая сыворотка кролика и 3% взвесь
эритроцитов барана в физиологическом растворе). Обе системы выдерживают в термостате 40
мин. После чего к основному опыту и контролям добавляют гемолитической систему. Повторно
выдерживают реакцию в термостате до появления гемолиза в контролях. РСК считают
положительной при задержке гемолиза в опытных пробирках не менее чем на «++». Титр
антител определяют по наибольшему разведением сыворотки, при котором регистрируют
положительную РСК.
6.5. Провести учет результатов реакции пассивной гемагглютинации, поставленную с парными
сыворотками больного хроническим гепатитом В и эритроцитами, нагруженными HBsAg.
В луночках планшета готовят ряд разведения сыворотки больного (в объеме 0,5 мл) 1:10, 1:20,
1:40, 1:80, 1: 160 к которому добавляют по 1 мл взвеси эритроцитарного диагностикума. Для
контроля № 1 используют взвесь эритроцитов, необработанных антигеном, а для контроля № 2
– взвесь диагностикума с нормальной сывороткой. Реакция происходит при комнатной
температуре в течение 30-45 минут. В некоторых луночках планшета эритроцитарный антиген
агглютинируется антителами сыворотки пациента, то есть, отмечают наличие осадка
эритроцитов с неровными краями («зонтики»). Такой результат считают положительным. В
контролях наблюдают неагглютинованные эритроциты, которые оседают в центре лунки
плотным скоплением с ровными краями («пуговки») - реакция отрицательная. Титр сыворотки это наибольшее ее разведение, при котором произошла агглютинация эритроцитарного
диагностикума (последняя лунка с «зонтиком»). Диагностическое значение имеет нарастание
тира антител во второй сыворотке более чем в 4 раза по сравнению с первой сывороткой.
6.6. Записать препараты для профилактики гепатитов А и В и план прививок против гепатита В.
1) Гамма-глобулин против гепатита А.
2) Живая аттенуированная вакцина против гепатита А.
3) Культуральная инактивированная моновакцина вакцина против гепатита А.
4) Гамма-глобулин против гепатита В.
5) Плазменная вакцина для профилактики гепатита В.
6) Рекомбинантная вакцина против гепатита В содержащая очищенный HBsAg, полученный с
помощью генно-инженерной биотехнологии.
7) Комбинированные вакцины против гепатита А и В; против дифтерии, коклюша, столбняка и
гепатита В.
Прививки против гепатита В проводят по схеме: первые 10 часов жизни, 3 месяца, 5 месяцев.
7. Рекомендованная литература.
7.1. Основная.
1. А. И. Коротяев, С. А. Бабичев. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология.
С.-Петербург, 2002. - С. 286-295, 319-327.
2. И. Л. Дикий и соавт. Микробиология, Харьков, 1999. - С. 356-361, 375-391.
3. Ю. С. Кривошеин. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии,
М., 1986. - С. 245-248.
7.2. Дополнительная.
1. Микробиология, вирусология, иммунология, инфекционные болезни. Словарь / Под ред.
Г.К.Палия, В.Г.Палия. - Киев: Здоровье, 2004. - С. 58, 122, 110-111, 32, 39.
2. Л. Б. Борисов. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, М., 1984. - С. 246248.
8. Материалы для самоконтроля.
8.1. Тестовые задания для проверки исходного уровня знаний.
1. В геном вируса осповакцины был интегрирован ген вируса гепатита В, который отвечает за
образование HBsAg. Рекомбинантный вирус планируется использовать в качестве препарата
для прививки. К какому типу принадлежит полученная таким образом вакцина?
A Синтетическая
B Комбинированная
C Ассоциированная
D Генно-инженерная
E Химическая
2. У больного, перенесшего 10 недель назад желтуху, в крови был обнаружен HBsAg. Для какой
патологии это характерно?
A Вирусного гепатита А
B Вирусного гепатита В
C Вирусного гепатита С
D Вирусного гепатита Е
E Вирусного гепатита D
3. У больного с лихорадкой неясной этиологии, иммунодефицитным состоянием, поражениями
нервной и пищеварительной систем, предварительно установлен диагноз СПИД. Какие методы
диагностики необходимо использовать для подтверждения диагноза?
A Реакция гемаглютинации
B Реакция связывания комплемента
C Реакция агглютинации
D Реакция гемадсорбции
E Реакция иммунофлюоресценции, имуноблотинг, радиоиммунный анализ
4. Больной А. длительное время лечился по поводу пневмонии невыясненной этиологии,
устойчивой к стандартной терапии. Из анамнеза установлено, что он длительное время
находился в служебной командировке в США. Находясь в командировке, получил травму,
лечился в госпитале. После выздоровления возвратился на родину. Оценивая анамнез,
клиническую картину заболевания, врач заподозрил у больного СПИД. Результаты
какого
метода лабораторной диагностики позволяют подтвердить предварительно поставленный
диагноз у данного пациента?
A Иммуноферментный анализ
B Реакция Видаля
C Реакция связывания комплемента
D Электронная микроскопия
E РТГА-реакция торможения гемагглютинации
5. При обследовании донора, длительно не сдававшего кровь, методом ИФА выявлены антиНBS антитела. О чем свидетельствует в данном случае положительный результат ИФА?
A Остром гепатите С
B Остром гепатите В
C Перенесенном гепатите В
D Хроническом гепатите В
E Хроническом гепатите С
6. Во время предоставления стоматологической помощи, врач получил травму указательного
пальца с нарушением целости кожи и вероятным загрязнением кровью пациента. В таких
случаях инструкция предусматривает обследование пациента относительно ВИЧ-инфекции и
вирусных гепатитов. Какие исследования следует провести у пациента ?
A Исследовать кровь на наличие маркеров гепатитов и антител против ВИЧ
B Выделить возбудителей путем заражения культуры клеток
C Сделать посев крови на сахарный бульон
D Исследовать уровень Т-хелперов
E Выявить специфические антитела
Автор
ассистент, к.м.н. Назарчук А.А.
Методические рекомендации для самостоятельной работы
студентов стоматологического факультета
при подготовке к практическому занятию №34
1.Тема занятия: Вирусы простого герпеса и вирус везикулярного стоматита. Биологические
свойства. Методы лабораторной диагностики заболеваний.
2. Цель занятия:
2а. Общая: Освоить биологические свойства герпесвирусов, их роль в патологии человека.
2б. Конкретная:
1. Изучить методы идентификации вирусов простого герпеса.
2. Освоить методы диагностики герпетической инфекции.
3. Освоить специфическую профилактику и лечение герпетической инфекции.
4. Изучить особенности вируса везикулярного стоматита.
3. Базовые знания, навыки, необходимые для изучения темы.
1. Морфология и ультраструктура вирусов.
2. Взаимодействие вируса с клеткой хозяина.
3. Культивирование вирусов.
4. Индикация вирусов.
4. Основные теоретические вопросы, подлежащие изучению.
1. Общая характеристика семейства герпесвирусов.
2. Классификация герпесвирусов.
3. Морфология и биологические свойства вируса простого герпеса, характеристика серотипов
вируса.
4. Патогенез заболеваний обусловленных вирусами простого герпеса. Особенности протекания
герпетической инфекции. Персистенция вируса.
5. Лабораторная диагностика герпетической инфекции.
6. Биологические свойства вируса везикулярного стоматита.
7. Лабораторная диагностика заболевания вызванного вирусом везикулярного стоматита.
5. Содержание темы
Подроды
Alphaherpesviridae
Классификация вирусов простого герпеса
Род
Название вируса
Патология
SimplexВирус
простого Лабиальный
герпес,
virus
герпеса тип 1
энцефалит, поражение
глаз
Вирус
простого Генитальный
герпес,
герпеса тип 2
менингоэнцефалит, рак
шейки матки
VaricelloВирус
ветряной Ветряная
оспа,
virus
оспы
– опоясывающий герпес
опоясывающего
герпеса
Вирусы простого герпеса (Herpes simplex virus)
Морфология. Вирион вируса герпеса состоит из четырех структурных элементов: непрозрачной
для электронов сердцевины; окружающей сердцевину капсида; асимметрично расположенного
вокруг капсида материала, который обозначается как тегумент (покров) и внешней мембраны,
или оболочки (толщиной 5-10 нм), окружающей капсид и тегумент. На поверхности внешней
оболочки обнаружены отростки длиной 8-10 нм. Размер вирионов в среднем равен 180-200 нм.
Капсид у всех вирусов герпеса имеет ряд общих признаков: до 100 нм в диаметре и состоит из
162 капсомеров.
Большинство штаммов вируса герпеса не вызывают гемагглютинацию. Вирус может быть
обнаружен в РПГА с эритроцитами барана, обработанными танином.
Известная дифференциация вирусов герпеса простого на два типа. Вирусы 1-го типа
повреждают слизистую оболочку и кожу, вирусы 2-го типа - инфицируют гениталии. Оба типа
возбудителей различные по некоторым другим свойствам: способностью к размножению и
трансформации определенных клеток, характером морфологических изменений в зараженных
клетках, свойствами белков, в частности, тимидинкиназы, нуклеотидным составом ДНК.
Репродукция вирусов. Заражение начинается с прикрепления вирусов к клеточным рецепторам,
природа которых еще не выяснена. Попытки найти клетки животных, которые не имеют
рецепторов к HSV не привели к успеху, однако кроме человека "естественный" путь заражения
может происходить только у шимпанзе. Окончательно не выяснена и природа вирусных
рецепторов. Инфекционные свойства вирусы приобретают только на стадии образования
внешней оболочки. Пик инфекционности наблюдается через 12 ч после инфицирования.
Культивирование. Вирусы простого герпеса, как правило, размножаются во многих культурах
различного происхождения (эмбриональные ткани человека, куриные фибробласты, почки
обезьян, кроликов, поросят), а также в перевиваемых линиях VERO, HeLa, Hep-2, Детройт-6.
Чувствительные первичная культура почек кролика и культура клеток VERO.
Яркое проявление герпетической инфекции в культуре клеток - образование цитопатического
эффекта и формирования внутриядерных включений (телец Липшютца). Цитопатическое
действие проявляется образованием синцития и округлением клеток, слипанием и
формированием конгломератов. Сохранность монослоя нарушается. Симпластообразующий
фактор - это гликопротеид, который синтезируется в клетке и не является структурным
компонентом вириона.
Патогенность. ВГ-1 вызывает острый герпес, гингивостоматит (Венсана), герпетической
экземой, кератоконъюнктивит, менингоэнцефалит, герпес лабиалис.
ВГ-2 обусловливает возникновение генитального герпеса, герпеса новорожденных,
врожденных пороков, раневого герпеса, герпеса дантистов, герпеса борцов.
Эпидемиология и патогенез болезни. Простой герпес - инфекционное заболевание,
характеризующееся поражением различных органов и систем (кожа, слизистые, глаза, нервная
система), которое проявляется в основном возникновением везикулярных высыпаний на
ограниченных участках кожи и слизистых оболочек. Естественным источником вируса гепеса
простого является человек.
Основные входные ворота - кожа и слизистые. Вирус проникает через слизистую губ, ротовой
полости, конъюнктиву или гениталии и преимущественно размножается в месте
проникновения. Дальнейшее распространение вируса происходит гематогенно или по нервным
путям. При первичном инфицировании или рецидивах он проявляется в различных органах,
легко выделяется из жидкости герпетических везикул, может быть выделен из форменных
элементов. Проникнув в организм, вирус остается там в течение жизни и между рецидивами
сохраняется в клетках базального слоя эпидермиса, слюнных или слизистых железах, в
лимфатических узлах, способен сохраняться в ганглиях. Механизм латентной инфекции,
обусловленный персистированием в организме вирусной нуклеиновой кислоты, которая не
имеет белковой оболочки.
Герпетическая инфекция передается капельным путем. Редко встречается контактное
инфицирование через травмированную кожу или слизистые.
Иммунитет. В крови большинства здоровых людей обнаруживают в высоких титрах
вируснейтрализирующие антитела, которые образуются в ответ на первичное инфицирование,
которое часто имеет бессимптомное течение. На фоне выраженного гуморального иммунитета
возникают рецидивы заболевания вследствие воздействия неблагоприятных факторов на
организм. Известная трансплацентарная передача вируснейтрализуючих антител, которые
сохраняются в течение 6 мес. Найдено разрушения клеток, содержащих вирусный антиген, под
влиянием антител в присутствии комплемента. Кроме того, инфицированные клетки могут
фагоцитироваться и разрушаться полиморфноядерными лейкоцитами.
Лабораторная диагностика. Вирусологический метод заключается в выделении вирусов с
герпетических пузырьков, слюны, цельной крови или форменных элементов, спинномозговой
жидкости, пузырьки на поверхности роговицы, тканей головного мозга и других внутренних
органов.
Для индикации вирусов в материале от больного разработаны реакция обратной пассивной
гемагглютинации (РОПГА), в которой эритроциты обрабатывают противогерпетическими Ig G.
Цитологический метод основан на выявлении внутриядерных включений в мазках или срезах
поврежденных органов. Для этого используют метод иммунофлюоресценции. Мазок
содержания герпетических везикул закрашивают специфической флюоресциирующей
сывороткой, а затем в ядрах и цитоплазме эпителиальных клеток обнаруживают вирусный
антиген. Серологический метод исследования (РН, РНГА, РСК) применяются при диагностике
первичных форм герпетической инфекции.
Специфическая терапия. Для лечения герпетической инфекции разработаны способы
специфической терапии. Для этого используют галогенированные аналоги тимидина (5-йод-2дезоксиурацил, цитозин-арабинозид). Первый выпускается в виде мази флореналь.
Перспективные препараты - производные фосфороцетовой кислоты - ингибиторы вирусной
ДНК-полимеразы в клетке. Широко используют ацикловир (зовиракс), вайдарабин, оксолин,
реаферон.
Противоэпидемические мероприятия. Специфическая профилактика применяется в случаях
тяжелого течения болезни и для предупреждения слепоты при рецидивирующих кератитах.
Используется специфический иммуноглобулин.
Из-за тяжести течения первичного герпеса у новорожденных применяют меры профилактики в
роддомах, детских учреждениях.
Семейство
Морфология
Антигеное строение
Методы
культивирования
Резистентность
Вирусы простого герпеса
Herpesvirus
Тип НК
Двонитчастая ДНК
Форма
Многогранник
Сложность
сложный
строения
V – антиген и S- растворимый антиген.
Два типа вируса – 1 и 2.
Хорион-алантоисная оболочка куриного эмбриона
Устойчивые к высушиванию и низким температурам
Чувствительные к дезинфектантам
Больной человек, носитель
Источник заражения
Механизм
и
пути Контактный
Воздушно-капельный
передачи заболевания
Ткани эндо- и эктодермального происхождения
Органотропность
Постинфекционный иммунитет не вырабатывется
Иммунитет
Методы лабораторной Вирусологический
Серологический
диагностики
РИФ
Не разработана
Специфическая
профилактика
Интерферон, иммуноглобулин, ацикловир
Терапия
Диагностика герпесвирусной инфекции
Материал для исследования
Клинический – корочки, содержание везикул,
слюна, спинно-мозговяа жидкость, сгусток крови,
клетки крови в выделениях с шейки матки или
влагалища, мазки выделений с язв
слизистой оболочки полости рта,
половых органов, соскобы поражонной
роговицы.
Секционный – кусочки ткани головного и
спинного
мозкга,
печени,
лимфатические узлы, нервные ганглии.
Сыворотка крови
Методы исследования
Экспресс
Вирусологический
І этап
МФА,
РИА, ИФА
Конечный
результат 6-24 час.
Выделение вируса в
культурах ткани (почки
кролей,
эмбрионе
человека)
ІІ этап
Индикация по ЦПД
(образование
синцития)
ІІІ етап
Идентификация
вируса по РН, МФА
Конечный
результат 3-4 суток
Биологический
Серологический
І этап
Заражение
животных (белые
миши, кролики,
куриные
эмбрионы)
РСК, РПГА,
ИФА, РИА
Конечный
ІІ этап результат 18-48 час.
Индикация по клиническим
проявлениям
(кератоконъюктивит, язвы и
рубци
на
роговице;
энцефалит,
летальный
исход.
На
хорионалантоисной обочке
куриных
эмбрионов
бляшки)
ІІІ этап
Идентификация
вируса по РН
Конечный
результат 40 час.- 5 суток
Граф логической структуры микробиологической диагностики герпесвирусной
инфекции.
1. вирусологический метод.
Материал для исследования: содержимое пузырьков, соскобы в области высыпаний.
Поставить и учесть ИФА.
Везикулярный стоматит - острое поражение слизистой оболочки рта, десен и глотки,
проявляется везикулярным высыпаниями. Возбудитель везикулярного стоматита - вирус рода
Vesiculovirus семейства Rhabdoviridae (единственный арбовирус этого семейства). Вирионы
вируса везикулярного стоматита имеют шаровидную форму размером 60-80x200 нм. Геном
вируса везикулярного стоматита образован однонитевой несегментированной молекулой - РНК.
Нуклеокапсид вируса везикулярного стоматита организован по типу спиральной симметрии и
окружен суперкапсидом, включающим гликопротеиновые шипы.
Репродукция вируса везикулярного стоматита реализуется в цитоплазме клетки. По антигенной
структуре выделяют 4 типа вируса везикулярного стоматита - Индиана, Кокал, Алагбас и
Мараба. Вирионы вируса везикулярного стоматита малоустойчивый во внешней среде и быстро
инактивируются под действием солнечного света и высокой температуры. Переносчики вируса
везикулярного стоматита - различные комары, в организме которых вирус размножается.
Отличительная особенность вируса везикулярного стоматита - способность индуцировать
выработку ИФН в больших титрах и высокая чувствительность к нему. Лабораторная
диагностика включает выделение вируса везикулярного стоматита из выделений везикул на
культурах клеток (вирус проявляет цитопатический эффект и образует бляшки) и в куриных
эмбрионах. Для идентификации возбудителя и серодиагностики применяют реакцию прямой
иммунофлюоресценции, РСК, ИФА и РИА. Лечение везикулярного стоматита
симптоматическое.
6. Практические работы, которые выполняются на занятии
Лабораторная диагностика герпетической инфекции базируется на использовании
экспрессметодов (вирусологический и серологический) и серологического.
Экспресс диагностика включает выявление вирусспецифического антигена с помощью ИФА и
МФА.
Серологический метод основывается на выявлении увеличения титра антител в 4 раза и более
при исследовании парных сывороток больного с помощью РПГА, ИФА, РСК.
1. С целью экспресс-герпетической инфекции поставить и учесть ИФА для выявления вирусспецифического антигена в исследуемом материале (содержимое везикул, жидкая фракция
растертых в дистиллированной воде корочек, смывы, полученные из мазков-отпечатков
элементов сыпи на коже). Для этого в лунки полистеролового планшета, на дне которых
конъюгированные антигерпетические антитела, вносим исследуемый материал, помещаем в
термостат, промываем буферным раствором и добавляем антивидовую (антиглобулиновую)
сыворотку, меченую ферментом пероксидазой хрена. Затем ставим в термостат, а после этого промываем буферным раствором и вносим Н2О2 и ортофенилдиамин (ОФД). Изменение цвета
жидкости свидетельствует о наличии герпесвируса в исследуемом материале.
7. Рекомендованная литература.
7а. Основная
К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология, 1980, с.380-403
В.Д.Тимаков. Микробиология, 1983, с.418-422
А.И.Коротяев, С.А.Бабич. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология, СанктПетергбург, 2002, с.294-299
И.Л.Дикий, И.Ю.Халупяк, Н.Е.Шевелева, М.Ю.Стегний. Микробиология, Харьков, 1999, с.391394
Л.Б.Борисов. Медицинская микробиологии, вирусология, иммунология, М., 2002, с.256-552
Ю.С.Кривошеин. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии,
М.,1986, с.225-227
7б. Дополнительная
Гайдаш І.С., Флегонтові В.В. Медична вірусологія, Луганськ, 2002, с.150-156
8. Материалы для самоконтроля:
1. Больная М. 25 лет, страдает рецидивирующим лабиальным герпесом. Какие методы лечения
возможно рекомендовать больной:
A - лечение химиопрепаратами (зовиракс, герпевир и др.) Во время обострения
B - антибиотикотерапия
C - использование сульфаниламидов
D - серотерапия
E - рентгенотерапия
2. Для лабораторной диагностики герпетической инфекции используют несколько методов.
Какой метод имеет ведущее значение для диагностики первичного герпеса:
A - серологический
B - биологический
C - иммунофлюоресцентный
D - цитологический
E - вирусоскопичний
3. У больного множественные поражения органов и тканей. Заболевание протекает по
общесистемному типу. Предполагается тяжелая форма простого герпеса. Как можно
подтвердить диагноз?
A - инфицировать белых мышей в мозг
B - поставить реакцию гемагглютинации
C - поставить непрямую реакцию Кунса
D - поставить цветную пробу
E - поставить реакцию гемадсорбции
4. У больного обнаружено образование везикул на границе кожи и слизистых оболочек. Как
можно провести экспресс-диагностику предполагаемой герпес-инфекции:
A - поставить РСК
B - провести ИФА
C - приготовить мазки-отпечатки с соскоб везикул, окрасить по Романовскому-Гимза,
промикроскопировать
D - инфицировать содержимым везикул куриные эмбрионы
E - инфицировать белых мышей
5. С целью установления длительного носительства вируса герпеса в организме человека
необходимо выявить:
A - вирус герпеса
B - Ig M
C - вирусы герпеса и антитела
D - Ig G
E - Ig A
Автор: ассистент Гончар О.О.