Уборка лабораторного помещения
реклама
G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. -ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Г.СЕМЕЙ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ПРАКТИКЕ Специальность: 5В110400 - медико профилактическое дело Учебно- производственная практика в качестве лаборанта микробиологической лаборатории Кафедра: микробиологии Высшее базовое медицинское образование, курс 2 Составитель: Рахимжанова Б.К Семей 2011г. (НА ОБОРОТЕ ТИТУЛЬНОГО ЛИСТА) Утверждены на заседании кафедры Протокол № 9 от "15" апреля 2011 г. Заведующий кафедрой __________________________проф. М.М.Уразалин Страница 1 из 38 G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 2 из 38 1. Введение Учебно-производственная практика в качестве лаборанта микробиологической лаборатории по специальности 051104 «Медико-профилактическое дело» является составной частью учебного процесса студентов 2-го курса. 2. Цель практики - приобретение студентами практических навыков и умений общим методам исследования в микробиологии, закрепление и углубление теоретических знаний, полученных при изучении дисциплины «Микробиология», приобретение опыта и навыков самостоятельной работы. 3. Задачи практики знакомство со структурой и организацией микробиологических лабораторий; изучение инструментально-технического оснащения различных подразделений микробиологических лабораторий; приобретение навыков по подготовке к работе лабораторной посуды, приготовлению титрованных растворов реактивов, стандартных микробиологических (бактериологических, микологических и вирусологических) питательных сред, их стерилизации и разливу в чашки Петри, пробирки; приобретение навыков и умений по дезинфекции и стерилизации лабораторного инструментария и лабораторной посуды; получение необходимых знаний и умений для проведения эксперимента. 4. Конечные результаты прохождения практики - за время прохождения учебно-производственной практики каждый студент должен освоить все виды выполняемой работы. По окончании учебно-производственной практики студент должен знать: структуру и функции микробиологической лаборатории; обязанности лаборанта; правила техники безопасности при работе с заразным материалом; характеристику основных методов и способов подготовки лабораторной посуды, инструментария и расходных материалов для микробиологических исследований, основы техники лабораторных исследований. Студент должен уметь: -соблюдать технику безопасности при работе с заразным материалом - подготовить к работе лабораторную посуду и инструментарий - подготовить и работать с микробиологическим оборудованием - приготовить питательные среды для микробиологических исследований - проводить контроль качества дезинфекции и стерилизации лабораторной посуды и инструментария - проводить отбор, транспортировку, обработку исследуемого материала - проводить серийные разведения и микробиологический посев - владеть техникой бактериологического исследования - владеть техникой серологических и молекулярно-генетических исследований -вести документацию - владеть коммуникативными навыками 5. Политика проведения практики (все требования по проведению практики) a. Все виды практик по своему статусу приравниваются к учебной дисциплине и поэтому входят в ИУП студента. b. Практика включается в ИУП студента при условии, если он освоил необходимый минимум теоретических базовых курсов, необходимых для выполнения программы практики. c. Производственная, учебная практики проводятся в соответствии с рабочими учебными планами специальностей. d. Производственная практика проходит в отрыве от учебного процесса. e. Производственная практика проводится на базах практики, с которыми СГМУ заключил договора на прохождение студентами конкретных видов практики. f. Все виды практики имеют кредитное выражение согласно ГОСО специальности. Результаты практики оцениваются по 4-балльной шкале (табл. 1) и учитываются при подсчете GPA студента, при решении вопроса о переводе его с курса на курс. g. Приказ о прохождении практики подписывает ректор ГМУ г.Семей. Проект приказа готовит специалист по производственной практике. В приказе отражается, кто из числа ППС кафедры назначается руководителем практики. Каждый студент-практикант, руководитель практики от кафедры и руководитель с базы практики получают на руки рабочую программу практики, разработанную кафедрой с учетом профиля специальности и особенностей базы практики. Методические указания по проф.практике G-041.08.01.01-2007 Ред. 2. Страница 3 из 38 Каждая программа обязательно содержит пререквизиты практики, то есть перечень теоретических базовых курсов, необходимых для прохождения практики. Рабочая программа практики должна отражать: – продолжительность практики; – цели и задачи практики; – содержание и сроки выполнения студентами индивидуальных заданий, форм и сроков контроля за выполнением студентом программы практики. – критерии выставления рейтинговой оценки студенту за подготовку отчетной документации; – порядок подготовки и сроки защиты отчетов по практике. i. При прохождении практики студент имеет право отказаться от выполнения работы, не предусмотренной программой практики, предварительно поставив в известность руководителя практики от кафедры. j. После окончания практики готовит письменный отчет о результатах практики, характеристика на каждого студента-практиканта с оценкой степени и качества выполнения ими программы практики по 100%-ой шкале. k. Оценивание результатов практики осуществляет комиссия кафедры, перед которой студент защищает свой отчет по практике. При оценивании принимается во внимание качество ведения дневника практики, отчета, содержащаяся в отзывах оценка со стороны руководителей и руководителя практики. l. Защита отчетов - практиков проводится в последний день практики. m. Оценка по практике заносится руководителем от кафедры в ведомость по практике и затем в зачетную книжку. Офис регистратор заносит оценку в транскрипт студента. n. Студент, не прошедший практику по уважительной причине после предоставления соответствующего документального подтверждения на имя декана, имеет право пройти ее бесплатно в сроки, установленные кафедрой и без отрыва от основного учебного процесса. Для этого издается приказ на каждого студента отдельно. При этом длительность такой практики, проводимой без отрыва от учебного процесса, увеличивается. o. К прохождению учебной практики без отрыва от учебного процесса допускаются все студенты независимо от их академической успеваемости. p. Студенты, не выполнившие программу практики, или не прошедшие ее имеют академическую задолженность по практике. 6. Формы ежедневного контроля студентов преподавателем группы: Текущий контроль осуществляется за: - посещаемостью и практической деятельностью студентов на рабочем месте в микробиологической лаборатории; - за освоением практических навыков и умений студентами; ежедневный контроль практических навыков, с занесением результатов в таблицу учета практических навыков в дневнике студента. - ведением дневников студентами. Итоговый контроль: дифференцированный зачет. h. Для допуска к итоговому контролю студент должен иметь: 1. дневник учебно-производственной практики; 2. характеристику, подписанную руководителем практики соответствующей микробиологической лаборатории – базы для практики. Во время прохождения учебно-производственной практики студент ведет дневник, являющийся основным документом отчета о проделанной работе. Дневник состоит из следующих разделов: 1. титульный лист (унифицирован); 2. индивидуальный план работы студента во время прохождения учебно-производственной практики (таблица 1); 3. письменный отчет о результатах пройденной практики; 4. заключение (характеристика на студента) базового руководителя. 5. Ежедневный учет выполнения практических навыков. 6. руководитель практики принимает выполнение навыков согласно перечню, поочередно в течение всех дней прохождения практики с фиксацией в таблице «Результаты практики» в дневнике студента по форме. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 4 из 38 По окончании учебно-профессиональной практики заполняется «Ведомость результатов учебнопроизводственной практики в качестве лаборанта микробиологической лаборатории по специальности 5В110400 «Медико-профилактическое дело». После сдачи отчета и проведения дифференцированного зачета руководителем практики заполняется «Зачетная ведомость» с оценкой за учебно-производственную практику. ДНЕВНИК УЧЕБНО-ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ПРАКТИКИ Титульный лист дневника учебно-производственной практики содержит наименование ВУЗа, название кафедры, наименование практики, ФИО студента с указанием факультета, курса и номера академической группы; ФИО и должность преподавателя кафедры, ответственного за академическую группу; название базовой лаборатории и ФИО и должность базового руководителя практики. 6. Содержание практики: тематический план практики с расшифровкой; перечень практических навыков, которые необходимо усвоить или закрепить; темы УИРС. ПРИМЕРНЫЙ ГРАФИК РАСПРЕДЕЛЕНИЯ РАБОЧЕГО ВРЕМЕНИ УЧЕБНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ ПРАКТИКИ Наименование выполняемой работы* Устройство микробиологической лаборатории. Правила работы. Техника безопасности. Виды, назначение и принцип работы лабораторного оборудования (термостаты, весы, центрифуги, сухожаровые шкафы, автоклавы и пр.) и специального инструментария. Этапы подготовки лабораторной посуды к работе и методы ее обеззараживания. Методы дезинфекции и стерилизации лабораторной посуды. Контроль качества. Техника приготовления, подготовки к стерилизации, разлива микробиологических питательных сред, применяемых для культивирования микроорганизмов и культур клеток. Титрование микробных взвесей. Приготовление растворов анилиновых красителей. Техника проведения микробиологического анализа: отбор, обработка, посев исследуемого материала на микробиологические питательные среды, выделение чистой культуры микробов. Техника приготовления, специальной окраски и микроскопии мазков-препаратов из исследуемого материала и культур микроорганизмов. Итоговое занятие. Отчет по итогам учебно-профессиональной практики. Дифференцированный зачет. Перечень практических навыков и умений, которыми студент должен овладеть после прохождения учебно-производственной практики № 1 2 3 4 5 № 1 2 3 4 5 Часы 6 6 6 6 6 Практические навыки соблюдение техники безопасности при работе с заразным материалом подготовка к работе лабораторной посуды и инструментария подготовка и работа с микробиологическим оборудованием приготовление питательных сред для микробиологических исследований проведение контроля качества дезинфекции и стерилизации лабораторной посуды и инструментария проведение отбора, транспортировки, обработки, приготовления серий-ных разведений и 6 микробиологического посева исследуемого материала владение техникой бактериологического исследования (приготовление мазков-препаратов, окраска, 7 микроскопия, выделение чистой культуры бактерий, приготовление взвеси по стандарту мутности, определение биохимической активности, чувствительности к антибиотикам и фагам). владение техникой серологических и основами (принципами) молекулярно-генетических 8 исследований владение документацией 9 10 владение коммуникативными навыками 7. Раздаточный материал Методические указания для студентов по практическим навыкам ( см.приложение). 8. Критерии оценки практики Умения и навыки, полученные в ходе учебно-производственной практики, оцениваются по буквенно-балльной системе (положительные оценки по мере убывания от А до D, соответствующие цифровому эквиваленту по четырех балльной системе). Неудовлетворительная оценка соответствует цифровому эквиваленту «0» и буквенной оценке «F». Выполнение каждого навыка расписывается по шагам, каждый из которых оценивается таким образом, чтобы в сумме получалось 4 балла. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. № НАВЫКИ И УМЕНИЯ, КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ 1 1.1 соблюдение техники безопасности при работе с заразным материалом наличие и использование санитарно-защитной одежды (медицинский халат, колпак, сменная обувь) содержание в порядке рабочего места Уметь обеззараживать (деконтаминировать) очаг инфицирования объектов лаборатории владение техникой приготовления свежих растворов дезинфектантов подготовка к работе лабораторной посуды и инструментария знание и соблюдение техники безопасности при работе с поступающим на исследование материалом, использованной лабораторной посудой и инструментарием владение техникой обеззараживания лабораторной посуды и инструментария владение техникой механической очистки лабораторной посуды и инструментария владение техникой подготовки лабораторной посуды и инструментария к стерилизации автоклавированием владение техникой стерилизации лабораторной посуды и инструментария другими методами уметь правильно отобрать лабораторную посуду для определенных микробиологических исследований подготовка и работа с микробиологическим оборудованием 1.2 1.3 1.4 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 4 4.1 4.2 4.3 4.4 5 5.1 5.2 5.3 5.4 6 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 7 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 знать устройство и принцип работы сухо-жарового шкафа знать устройство и принцип работы с центрифугами знать устройство и принцип работы со спектрофотометром уметь работать с рН-метром знать устройство и принцип работы термостата/анаэростата знать устройство и принцип работы автоклава знать и уметь работать со световым микроскопом уметь взвешивать на аналитических и электронных весах приготовление питательных сред для микробиологических исследований знать технику приготовления питательных сред владение техникой подготовки питательных сред к стерилизации владение техникой разлива питательных сред владение техникой хранения питательных сред проведение контроля качества дезинфекции и стерилизации лабораторной посуды и инструментария знание и владение методикой визуального контроля качества владение техникой контроля качества дезинфекции владение техникой контроля качества предстерилизационной очистки владение методиками контроля качества стерилизации проведение отбора, транспортировки, обработки и микробиологического посева исследуемого материала умение провести правильный отбор проб для микробиологического исследования уметь подготовить пробы к транспортировке владение техникой обработки исследуемого материала знание и владение техникой консервации проб исследуемого материала владение техникой бактериологического посева проб различными способами (бак.петлей, шпателем, тампоном и др.) владение техникой бактериологического исследования уметь приготовить, окрасить, микроскопировать и интерпретировать мазок-препарат уметь приготовить бактериальную взвесь по стандарту мутности владеть техникой выделения чистой культуры и пересевов на различные питательные среды уметь изучить культуральные свойства микроорганизмов на различных питательных средах уметь изучить биохимическую активность бактерий Страница 5 из 38 Пошаговая оценка в баллах 4,0 1,0 1,0 1,0 1,0 4,0 1,0 1,0 0,5 0,5 0,5 0,5 4,0 1,0 0,25 0,25 0,25 1,0 0,5 0,5 0,25 4,0 1,5 1,0 1,0 0,5 4,0 0,5 1,5 0,5 1,5 4,0 1,0 0,5 1,0 0,5 1,0 4,0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. уметь приготовить серийные разведения растворов антибиотиков владеть методиками изучения чувствительности к антибиотикам уметь провести типирование специфическими бактериофагами владение техникой серологических исследований и принципами молекулярногенетических исследований уметь отобрать и подготовить необходимую посуду и инструментарий владение техникой подготовки компонентов реакции Знать технику постановки серологических реакций и ориентировочного учета результатов знать принцип метода исследования и основы работы оборудования, используемого для молекулярно-генетических исследований владение документацией владение техникой заполнения лабораторных журналов уметь составить сопроводительную документацию к отобранным для исследования пробам Знать основы учета результатов лабораторных исследований уметь заполнять бланки по результатам лабораторных исследований владение коммуникативными навыками уметь налаживать профессиональные контакты с персоналом лаборатории уметь налаживать профессиональные контакты с пациентами 7.6 7.7 7.8 8 8.1 8.2 8.3 8.4 9 9.1 9.2 9.3 9.4 10 10.1 10.2 Страница 6 из 38 0,5 0,5 0,5 4,0 0,5 0,5 1,5 1,5 4,0 1,0 1,0 1,0 1,0 4,0 2,0 2,0 Приложение 1. 1. Бактериологическая лаборатория. Бактериологические лаборатории как самостоятельные структурные единицы организуются при санитарноэпидемиологических станциях (СЭС), в инфекционных больницах, больницах общего типа, некоторых специализированных стационарах (например, в туберкулёзных, ревматологических, кожновенерологических) и в поликлиниках. Бактериологические лаборатории при СЭС исследуют на общую бактериальную загрязнённость, а также на заражённость условно патогенной и патогенной микрофлорой объекты внешней среды: воздух, воду, почву продукты питания; проводят обследование организованных коллективов и отдельных лиц на носительство патогенных бактерий кишечной группы, коринебактерий дифтерии, коклюша, паракоклюша, менингококка. Работа микробиологической лаборатории в комплексе с другими отделами СЭС имеет определённую задачу — оздоровление окружающей среды и снижение заболеваемости населения. Бактериологические лаборатории при лечебно-профилактических учреждениях выполняют анализы, необходимые для постановки и уточнения диагноза инфекционного заболевания, способствуя правильному выбору специфического лечения и определению сроков выписки больного из инфекционной больницы. Предметом для исследования в бактериологических лабораториях являются: выделения из организма человека: моча, кал, мокрота, гной, а также кровь, спинномозговая жидкость и трупный материал; объекты внешней среды: вода, воздух, почва, продукты питания, смывы с предметов инвентаря, рук и т. п. Помещение бактериологической лаборатории и оборудование рабочего места Специфика микробиологических работ требует, чтобы помещение, отведённое под лабораторию, было изолировано от больничных палат, жилых комнат, пищевых блоков. В состав бактериологической лаборатории входят: лабораторные комнаты для бактериологических исследований и подсобные помещения; автоклавная или стерилизационная для обеззараживания отработанного материала и заражённой посуды; моечная, оборудованная для мытья посуды; средоварочная для приготовления, розлива, G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 7 из 38 стерилизации и хранения питательных сред; виварий для содержания подопытных животных; материальная для хранения запасных реактивов, посуды, аппаратуры и хозяйственного инвентаря. Перечисленные подсобные помещения как самостоятельные структурные единицы входят в состав крупных бактериологических лабораторий. В небольших лабораториях средоварочную и стерилизационную объединяют в одной комнате; специальное помещение для содержания подопытных животных отсутствует. Под лабораторные комнаты, в которых производят все бактериологические исследование, отводят наиболее светлые, просторные помещения. Стены в этих комнатах на высоту 170 см от пола окрашивают в светлые тона масляной краской. Пол покрывают релином или линолеумом. Такого рода отделка позволяет пользоваться при уборке помещения дезинфицирующими растворами. В каждой комнате должна быть раковина с водопроводной подводкой и полкой для бутыли с дезинфицирующим раствором. В одной из комнат оборудуют застеклённый бокс с предбоксником для выполнения работ в асептических условиях. В боксе ставят стол для произведения посевов, табурет, над рабочим местом монтируют бактерицидные лампы. В предбоксник помещают шкаф для хранения стерильного материала. Лабораторное помещение оборудуется столами лабораторного типа, шкафами и полками для хранения необходимой при работе аппаратуры, посуды, красок, реактивов. Очень большое значение для работы имеет правильная организация рабочего места врача — бактериолога и лаборанта. Лабораторные столы устанавливают около окон. При размещении их нужно стремиться к тому, чтобы свет падал спереди или сбоку от работающего, лучше с левой стороны, но ни в коем случае не сзади. Желательно, чтобы комнаты для проведения анализов, особенно для микроскопирования, имели ориентацию окон на север или северо-запад, так как для работы необходим равный рассеянный свет. Освещённость поверхности столов для работы должна быть 500 лк. Для удобства дезинфекции поверхность лабораторных столов покрывают пластиком, а каждое рабочее место на нём — зеркальным стеклом. За каждым сотрудником лаборатории закрепляют отдельное рабочее место площадью 150×60 см. Все рабочие места оборудуют предметами, необходимыми для повседневной работы. Правила работы и поведения в лаборатории Особенностью бактериологических работ является постоянное соприкосновение сотрудников лаборатории с заразным материалом, культурами патогенных микробов, заражёнными животными, кровью и выделениями больного. Поэтому все сотрудники бактериологической лаборатории обязаны соблюдать следующие правила работы, которые обеспечивают стерильность в работе и предупреждают возможность возникновения внутрилабораторных заражений: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. В помещения бактериологической лаборатории нельзя входить без специальной одежды — халата и белой шапочки или косынки. Нельзя вносить в лабораторию посторонние вещи. Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнее платье на халат. В помещении бактериологической лаборатории категорически запрещается курить, принимать пищу, хранить продукты питания. Весь материал, поступающий в лабораторию, должен рассматриваться как инфицированный. При распаковке присланного заразного материала необходимо соблюдать осторожность: банки, содержащие материал для исследования, при получении обтирают снаружи дезинфицирующим раствором и ставят не прямо на стол, а на подносы или в кюветы. Переливание жидкостей, содержащих патогенные микробы, производят над сосудом, наполненным дезинфицирующим раствором. О случаях аварии с посудой, содержащей заразный материал, или проливания жидкого заразного материала надо немедленно сообщать заведующему лабораторией или его заместителю. Мероприятия по обеззараживанию загрязнённых патогенным материалом платья частей тела, предметов рабочего места и поверхностей осуществляют немедленно. При исследовании заразного материала и работе с патогенными культурами микробов необходимо строго соблюдать общепринятые в бактериологической практике технические приёмы, исключающие возможность соприкосновения рук с заразным материалом. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 8 из 38 10. Заражённый материал и ненужные культуры подлежат обязательному уничтожению, по возможности в тот же день. Инструменты, использованные в работе с заразным материалом, тотчас посте их употребления дезинфицируют, как и поверхность рабочего места. 11. При выполнении бактериологических работ нужно строго следить за чистотой рук: по окончании работы с заразным материалом их дезинфицируют. Рабочее место в конце дня приводят в порядок и тщательно дезинфицируют, а заразный материал и культуры микробов, необходимые для дальнейшей работы, ставят на хранение в запирающийся рефрижератор или сейф. 12. Работники бактериологической лаборатории подлежат обязательной вакцинации против тех инфекционных болезней, возбудители которых могут встретиться в исследуемых объектах. Уборка лабораторного помещения Микробиологическую лабораторию необходимо содержать в чистоте. Следует регулярно проводить гигиеническую уборку помещений лаборатории. Обеспечить полную стерильность лаборатории очень трудно и это не всегда необходимо, но значительно снизить количество микроорганизмов в воздухе и на различных поверхностях в лабораторных помещениях возможно. Это достигается путём применения на практике методов дезинфекции, то есть уничтожения возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды. Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории обрабатывают пылесосом и протирают различными дезинфицирующими растворами. Обработка пылесосом обеспечивает освобождение предметов от пыли и удаление с них значительного количества микроорганизмов. Установлено, что при 4-кратном проведении щёткой пылесоса по поверхности предмета с него удаляется примерно 47 % микроорганизмов, а при 12-кратном — до 97 %. В качестве дезинфицирующих растворов чаще всего применяют 2-3%-ным раствором соды (бикарбонат натрия) или лизола (препарат фенола с добавлением зелёного мыла), 0,5-3%ным водным раствором хлорамина и некоторыми другими дезинфектантами. Воздух в лаборатории наиболее просто дезинфицировать проветриванием. Продолжительная вентиляция помещения через форточку (не менее 30-60 минут) приводит к резкому снижению количества микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной разнице в температуре между наружным воздухом и воздухом помещения. Более эффективный и наиболее часто применяемый способ дезинфекции воздуха — облучение УФ-лучами с длиной волны от 200 до 400 нм. Эти лучи обладают высокой антимикробной активностью и могут вызывать гибель не только вегетативных клеток, но и спор микроорганизмов. 2. Выделение чистых культур микроорганизмов Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий - обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами. Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов. Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные , биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация. Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп. Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение). Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 ° С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды. Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара . Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 9 из 38 скошенному агару , неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева. Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру. Метод Дригальского - широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры. Метод Вейнберга . Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского , но после этого чашки сразу помещают в анаэростат . Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 ° С агаризированной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри , пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар , прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци ). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку. Метод Хангейта - когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (ст рогие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта . Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом. Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора . Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки ( микропетли ), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток. 3. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ, исследование, применяемое для выявления патогенных бактерий в материале от больных животных или их трупов, обнаружение микробов в объектах внешней среды, кормах, мясе и т. д. Характер и методика взятия проб, способ пересылки материала при различных инфекц. болезнях неодинаковы, но существуют общие положения, к-рые необходимо учитывать независимо от объекта исследования и свойств материала. Исследуемый материал по возможности собирают в асептич. условиях в стерильную посуду и доставляют в ближайшее время с сопроводительным документом в лабораторию (в нём указаны дата взятия, характер и источник материала, осн. клинич. признаки болезни и патологоанатомич. изменения, цель исследования). Б. и. включает 3 осн. метода: микроскопию (бактериоскопию) мазков из патол. или др. исследуемого материала; выделение чистой культуры бактерий с последующим изучением морфологич., культурально-биохимич., антигенных и патогенных свойств бактерий. Б. и. начинают с микроскопии, что позволяет обнаружить в материале микробов, изучить их морфологию (форму, размер, строение). При микроскопии патол. материала готовят мазки-отпечатки из G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 10 из 38 органов, тканей или тонкие мазки из др. исследуемого материала, высушивают их на воздухе, фиксируют (чаще фламбированием) и окрашивают тем или иным методом в зависимости от направленности исследования (см. Окраска микроорганизмов). Для обнаружения нек-рых бактерий (напр., возбудителя туберкулёза) патол. материал предварительно обрабатывают одним из методов обогащения, чтобы повысить в нем концентрацию бактерий и избавиться от посторонних микробов. Для ускоренного обнаружения бактерии применяют люминесцентную микроскопию. Для изучения подвижности бактерий, обусловленной наличием жгутиков, используют микроскопию молодой (12—24 ч) живой культуры с помощью препаратов висячей капли или раздавленной капли. Подвижность бактерий может быть установлена также на основе особенностей роста культуры в полужидком МПА. Выделение культуры бактерий проводят путём посева материала на среды питательные. Чтобы облегчить и ускорить выделение бактерий, используют дифференциально-диагностические и элективные питат. среды (плотные и жидкие), на к-рых определенные виды бактерий дают характерный для них рост (при этом задерживается рост посторонних микробов). Посев на плотные питат. среды в бактериол. чашках проводят путём растирания шпателем нескольких капель материала по поверхности среды. При исследовании паренхиматозных органов убитых или павших животных обжигают или фламбируют кусочек органа, затем надрезают его стерильными ножницами и с помощью пинцета проводят надрезанной поверхностью по питат. среде в чашке. В жидкую среду посев материала делают пастеровской пипеткой. Чтобы получить рост изолированных колоний микробов на плотной среде и отделить исследуемые бактерии от сопутствующих микроорганизмов, проводят дробный посев по методу Дригальского. Засеянные чашки и пробирки инкубируют в термостате при оптимальной для роста каждого вида бактерий темп-ре (чаще 37 °С) в течение 1—2 сут, в нек-рых случаях (туберкулёзные бактерии) — до 3—4 нед. Наиболее длительный и сложный этап Б. и.— родовая и видовая идентификация выделенных культур. Изучают только чистые культуры, полученные после пересева из одной колонии и имеющие идентичные морфологич. и тинкториальные свойства (см. Идентификация микробов). Антигенные свойства культуры изучают в реакции агглютинации. Определение патогенных свойств бактерий проводят путём заражения лабораторных животных культурой или фильтратом культуры (при определении токсинообразования). После изучения свойств бактерий сопоставляют полученные данные с признаками бактерий, имеющимися в классификационных схемах или определителях микробов (Д. Берджи, 1974; Н. А. Кра-силышков, 1949, и др.), и проводят их родовую и видовую дифференциацию. В сомнительных случаях проводят повторное исследование материала. Результаты Б. и. записывают в регистрационный журнал или на бланке лабораторной экспертизы, в заключении к-рой указывают, какой микроб выделен из исследуемого материала. Диагноз на инфекционную болезнь может быть поставлен только при учёте эпизоотологич., клинич. и патологоанатомич. данных. 4. Методы окраски. Исследование окрашенных препаратов Исследование бактерий в окрашенном препарате дает возможность не только изучить их морфологию, но и судить о некоторых деталях их химического строения. Это достигается применением специальных окрасок. Препараты для окрашивания готовят на предметных стеклах (подготовку стекол см. выше). Техника приготовления препаратов проста и заключается в следующем. Из жидких культур каплю материала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде петлей берут ничтожную частичку, размешивают в заранее нанесенной на предметное стекло капле водопроводной воды или физиологического раствора и размазывают по стеклу. Мазку дают высохнуть на воздухе, затем его фиксируют. Самый простой и распространенный способ — фиксация жаром. Держа стекло мазком вверх, его трижды проводят через пламя газовой или спиртовой горелки. Во избежание перегрева препарата время фиксации не должно превышать 5—6 секунд, а время прямого воздействия пламени — 2 секунды. В этом случае мазок будет хорошо держаться на стекле. Кроме жара, для фиксации могут быть применены следующие вещества. 1. Этиловый 95° спирт. Время фиксации 10—15 минут. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 11 из 38 2. Смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира (по Никифорову) — 10—15 минут. 3. Метиловый спирт — 2—3 минуты. 4. Ацетон — 5 минут. 5. 1% раствор сулемы— 10—15 минут и затем промывание препарата раствором NaCl и водой. 6. 10% раствор AgN03—10 минут. 7. Жидкость Буэна: формалина неразбавленного 10 мл, ледяной кислоты 2 мл и насыщенного водного раствора пикриновой кислоты 30 мл. 8. Жидкость Карнуа: ледяной уксусной кислоты 10 мл, хлороформа 30 мл и 96° спирта 60 мл. Методы окраски микробов разнообразны и многочисленны. В бактериологической работе наиболее употребительны приводимые ниже рецепты красок и способы окраски препаратов, которые в основном можно разделить на две группы: ориентировочные простые «краски и окраски дифференциальные, выявляющие химические и структурные особенности бактерий. а) Ориентировочная окраска Ориентировочная окраска бактерий, выявляющая только их морфологию, хорошо удается: 1) разведенным (1 : 10) карболовым фуксином—10—30 секунд; 2) Метиленовым синим Леффлера — 3—10 минут; 3) спиртово-водным раствором метиленового синего — 3—5 минут; 4) водным раствором метиленового синего — 5—10 минут. Спиртово-водный раствор метиленового синего: красителя 1 г, 95° спирта 10 мл, дистиллированной воды 100 мл. Водный раствор метиленового синего дает нежные отчетливые препараты: красителя 1 г, дистиллированной воды 1000 мл. Щелочной метиленовый синий Леффлера — стойкий и хорошо красящий раствор: дистиллированной воды 100 мл, 10% раствора едкого кали 2 капли, насыщенного (1%) раствора метиленового синего 30 мл; или: метиленового синего 3 г, 95° спирта 20 мл, 1% раствора едкого кали 1 мл, дистиллированной воды 100 мл. б) Дифференциальная окраска G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 12 из 38 Наиболее употребительной среди дифференциальных окрасок является окраска по Граму. При этом методе выявляется способность бактерий удерживать краситель или обесцвечиваться в спирте, что связано с химической структурой микробной клетки. Для выполнения окраски по Граму надо приготовить следующие растворы. Карболовый раствор генцианвиолета или кристалвиолета: красителя 1 г, 96° спирта 10 мл, кристаллической карболовой кислоты 2 г, дистиллированной воды 100 мл. Растирают в ступке краситель с карболовой кислотой до кашицы, прибавляют небольшими порциями спирт и окончательно разводят водой. Сливают в бутыль, оставляют на сутки, затем фильтруют. Или: насыщенного (4,8%) спиртового раствора красителя 10 мл, 2% карболовой воды 100 мл. Раствор Люголя (в модификации Грама): йодистого калия 2 г, дистиллированной воды 10 мл, йода кристаллического 1 г. Смесь хорошо закупоривают, оставляют на сутки, после чего добавляют дистиллированной воды до 300 мл. Методика окраски по Граму. На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генцианвиолета от 30 сек до 1 минуту. Сливают краситель и, не смывая, наливают раствор Люголя на 1 минуту. Сливают раствор Люголя и прополаскивают препарат в 95° спирте в течение 1/2 до 1 минуты, пока не перестанет отходить краситель. Промывают водой. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином от 30 сек-1 минуту. Сливают краситель, промывают и высушивают препарат. Видоизменение окраски Грама по А. И. Синеву. Заготовляют полоски фильтровальной бумаги, пропитанной 1% спиртовым раствором кристалвиолета и высушенной. На препарат накладывают полоску такой бумаги (немного меньше предметного стекла) и наливают 2—3 капли воды. Окрашивают в течение 2 минут. Снимают бумажку пинцетом и наливают раствор Люголя на 1 минуту. Обесцвечивают спиртом. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином. Грамположительные микробы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в розовый и красный. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 13 из 38 Модификация окраски Грама по Г. П. Калине. В небольшую каплю дистиллированной воды на предметном стекле внести минимальное количество микробных клеток, суспензию смешать с одной петлей 0,5% спиртового раствора бриллиантового зеленого, распределить равномерно на площади 1 см2, подсушить и фиксировать однократным проведением через пламя. Затем обработать в течение полутора двух минут реактивом: 5% спиртового раствора фуксина 2 мл, 5% спиртового раствора йода 2 мл и 0,5% спиртового раствора йодистого калия 96 мл. Промыть 30% этиловым спиртом до конца отхождения красителя, ополоснуть водой, докрасить 10% водным раствором фуксина. Видоизменение окраски Грама по Эткинсу. Готовят следующие растворы. 1. Насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета -1 часть, 1% водный раствор сернокислого анилина- 3 части. Для приготовления сернокислого анилина к 100 мл 5% раствора серной кислоты прибавляют по каплям 20 мл анилинового масла. Выпавший обильный белый рыхлый осадок фильтруют, снимают с фильтра и размешивают в 30 мл 95° спирта, снова фильтруют, собирают осадок и высушивают. Для получения более чистого продукта высушенный осадок растворяют в небольшом количестве кипящей воды и выливают в кристаллизатор. Сейчас же сернокислый анилин выпадает в виде красивых снежно-белых листочков. Дают остыть, сливают маточный раствор, отжимают кристаллическую массу фильтровальной бумагой и высушивают. 2. Йод кристаллический — 2 г, 4% едкий натр — 10 мл, дистиллированная вода — до 100 мл. Для дополнительной окраски применяют спиртово-водный раствор сафранина (насыщенного спиртового раствора 1 часть, дистиллированной воды 10 частей). Окрашивание: 1) красить генцианвиолетом 1 минуту; 2) промыть водой; 3) обработать йодом 1 минуту; 4) обесцвечивать спиртом 5 минут; 5) дополнительно красить 10 секунд; 6) промыть водой, высушить. Модификация Николля. Готовят растворы: 1. Насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета-10 мл, 1% водный раствор карболовой кислоты-100 мл. 2. Абсолютный спирт — 3 части, ацетон — 1 часть. Методические указания по проф.практике G-041.08.01.01-2007 Ред. 2. Страница 14 из 38 Окрашивание: 1) красить 1—2 минуты, слегка подогревая препарат на слабом пламени; 2) не промывая, нанести несколько капель раствора Люголя. Повторить 2—3 раза в течение 5 секунд; 3) дифференцировать смесью спирта и ацетона 10 секунд; 4) промыть водой; 5) докрасить фуксином Пфейффера 30—60 секунд; 6) промыть водой и высушить. Окраска кислото- и спиртоустойчивых микробов. Карболовый фуксин Циля: основного фуксина 1 г, 96° спирта 10 мл, кристаллической карболовой кислоты 5 г, дистиллированной воды 100 мл. Готовят, как описано для генцианвиолета, растиранием в ступке. Другой метод приготовления. Берут 10 мл насыщенного (10%) спиртового раствора основного фуксина, 100 мл 5% раствора карболовой кислоты. Этот краситель в чистом виде употребляется только для окраски кислото- и спиртоустойчивых бактерий и спор. Для обычной окраски пользуются разведенным фуксином: фуксина Циля 1 мл, дистиллированной воды 9 мл. Окрашивают препарат 1/2—1 минуту. Готовят ex tempore, так как он быстро портится. Окраска по Цилю — Нильсену — наиболее употребительный метод окраски микобактерий туберкулеза. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, не превышающий по размерам предметное стекло; наливают фуксин Циля и осторожно нагребают на горелке до отхождения паров, после чего оставляют краситель, пока препарат несколько остынет. Снимают бумагу с фуксином, ополаскивают препарат водой, опускают препарат в стаканчик с 5% раствором серной кислоты или смесью 10 частей спирта и 1 части соляной кислоты, прополаскивают до обесцвечивания. Тщательно промывают водой. Докрашивают любым раствором метиленового синего в течение 3—5 минут. Мазок, окрашенный по Цилю — Нильсену, вместо докраски метиленовым синим можно протравливать насыщенным раствором пикриновой кислоты (по Шпенглеру). Кислото- и спиртоустойчивые палочки принимают красный цвет, все остальные микробы — синий. Окраска по Семеновичу — Марциновскому. Мазок красить 2 минуты разведенным (1:3) карболовым фуксином Циля. Затем промыть водой и 3—5 минут красить синькой Леффлера. Вновь промыть водой и сушить. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 15 из 38 Окраска по Баумгартену. Красить без подогревания а растворе фуксина (5 капель насыщенного спиртового раствора фуксина и 5 мл дистиллированной воды) в течение 5—7 минут. Затем обесцветить в смеси 10 частей спирта и 1 части соляной кислоты (15 секунд), промыть водой и докрасить разведенным метиленовым синим. Оба метода (Семеновича — Марциновского и Баумгартена) применимы для отличия лепрозных палочек, окрашивающихся при этом, от туберкулезных, не окрашивающихся. Окраска по Бунге — Траутенроту. Препарат для извлечения жира на 3 часа кладут в абсолютный спирт и на 15 минут в хромовую кислоту, промывают водой и красят при подогревании карболфуксином. После 3-минутного обесцвечивания разведенной серной кислотой докрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленового синего 5 минут. Применяют для дифференциации туберкулезных микобактерий (окрашиваются в красный цвет) от палочек смегмы (окрашиваются в синий цвет). Окраска по Муху. В смеси 10 мл насыщенного спиртового раствора метилвиолета и 100 мл 2% водного раствора карболовой кислоты препарат выдерживают сутки. Затем его 1—2 минуты обрабатывают раствором Люголя, 1 минуту — 5% раствором азотной кислоты и 10 секунд—3% раствором соляной кислоты. После дифференцирования в смеси, состоящей из равных объемов спирта и ацетона, до прекращения отхождения краски промывают водой, докрашивают фуксином Пфейффера, вновь промывают водой и высушивают. Окраска по Козлову. Красят 45 минут в смеси: 1 г генцианвиолета, 6 г карболовой кислоты, 40 мл глицерина и 100 мл дистиллированной воды. Генцианвиолет и карболовую кислоту предварительно растирают в ступке, после чего прибавляют глицерин и дистиллированную воду. Перед употреблением краску разводят 3 частями дистиллированной воды и фильтруют. После промывания препарата водой его 20 секунд обрабатывают раствором Люголя, промывают водой, 2—3 секунды окрашивают 0,1% раствором сафранина, вновь промывают водой и сушат. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет. Оба метода применяют для выявления зернистой формы туберкулезных микобактерий (зерен Муха). Окраска включений в бактериях. Краска Нейссера: а) метиленового синего 0,1 г, 95° спирта 2 мл, ледяной уксусной кислоты 5 мл, дистиллированной воды 100 мл; G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 16 из 38 б) раствор хризоидина, везувина или бисмар браун: красителя 1 г, дистиллированной воды 300 мл. Краситель растворяют в кипящей воде и фильтруют через бумагу. Окраска по Нейссеру для выявления зернистости дифтерийных палочек. В растворе метиленового синего держат 1 минуту, в растворе Люголя—1 минуту. Промывают водой. Докрашивают раствором хризоидина (или везувина, или бисмарк-браун) 1—3 минуты. Промывают водой. Тела бактерий окрашиваются в нежно-желтый цвет, зерна Бабеша — Эрнста—в темно-синий. Окраска по Мейеру. Одновременно из исследуемых бактерий готовят два одинаковых препарата и фиксируют жаром или 5—15 минут в жидкости Карнуа. Красят оба мазка 10 минут метиленовым синим Леффлера и затем один помещают в 1% водный раствор серной кислоты, другой - в 4% водный раствор поташа. Через 5 минут препараты сушат фильтровальной бумагой (не промывать!). Препарат, обработанный кислотой, докрашивают 0,2% раствором светлого зеленого (лихтгрюн) с 2-3 капля и крепкой уксусной кислоты или хризоидином. Бактерии окрашиваются в зеленый или коричневый цвет, зерна волютина - в вишневокрасный. В препарате, обработанном щелочью, волютин обесцвечен — пустоты на фоне слабо окрашенных бактерий. Окраска по Раскиной. На препарат наливают краситель, состоящий из карболового фуксина Циля -4 мл, насыщенного раствора метиленового синего-4 мл, ледяной уксусной кислоты-5 мл, 95° спирта-95 мл, дистиллированной воды -до 200 мл. Препарат подогревают на пламени до сгорания спирта, а затем промывают водой и высушивают. Бактерии окрашиваются в светло-красный цвет, зерна волютина - в черно-синий. Окраска капсул. Окраска капсул микробов может иногда иметь диагностическое значение. В мазках из органов или из тканей жидкости капсулы можно обнаружить при помощи гростой окраски щелочным или другими растворами метиленового синего. Однако специальные окраски дают более четкие препараты. Окраска по Бурри. На середине предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и микроскопируют. На черном фоне видны неокрашенные микробы, капсулы, жгутики. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 17 из 38 Окраска по Ольту. Приготовляют ex tempore 2% раствор сафранина в горячей воде и фильтруют его. Фиксированный мазок окрашивают сафранином при подогревания в течение 1-2 минут. Промывают, высушивают. Препарат рассматривают в воде: на мазок наносят каплю воды, накрывают покровным стеклом, на него кладут иммерсионное масло. Тело бактерии и капсула различно преломляют лучи света. Эта разница усиливается при прохождении лучей через слой воды. Тела микробов окрашиваются в оричнево-красный цвет, капсулы -в бледно-желтый. Окраска по Антони. Мазок красят (без фиксации!) на холоду 1% водным раствором кристалвиолета 2 минуты. Затем промывают 20% водным раствором CuSO4 и высушивают фильтровальной бумагой. Бактерии окрашиваются в темносиний цвет, капсулы - в сине-фиолетовый. Окраска по Гиссу. Препарат, фиксированный любым способом, кроме жара, красят 5% водным раствором генцианвиолета, подогрева до появления паров. Мазок промывают 20% водным раствором медного купороса и сушат. Бактерии и капсулы окрашиваются в фиолетовый, цвет. Окраска по Гинсу. Мазок, покрашенный тушью по Бурри, фиксируют сулемой, метиловым спиртом или на пламени. После промывки водой красят 5-10 минут карболовым раствором тионина или фуксина и вновь промывают, а затем высушивают. Бактерии фиолетовые или красные. Фон черный. Капсулы неокрашенные! Окраска спор. Наиболее простой метод подобен окраске кислотоустойчивых бактерий. Препарат, приготовленный обычным способом, при нагревании окрашивают 1—2 минуты карболовым фуксином Циля, промывают водой и обесцвечивают, погружая стекло в 2% раствор азотной кислоты в спирте или в 1 % водный раствор серной кислоты. Обесцвечивать надо так, чтобы на препарате не было видно следов красителя. Затем промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего. Споры окрашивают в красный цвет. Способ Ожешки. На нефиксированный мазок наливают 0,5% раствор соляной кислоты и подогревают 1—2 минуты. С препарата сливают кислоту, промывают его водой и после высыхания фиксируют на пламени. Фиксированный препарат красят по способу Циля — Нильсена. В результате тела бактерий окрашиваются в G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 18 из 38 синий цвет, споры — в красный Окраска по Биттеру. Нефиксированный мазок, обработанный 10% раствором формалина (10 минут), промытый водой и высушенный, красят аммиачным метиленовым синим (20 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего, 3 мл крепкого NH4OH и 80 мл дистиллированной воды) 3 минуты, нагревая стекло до закипания жидкости. После промывания водой и высушивания докрашивают мазок везувином или сафранином 3—5 минут. Вновь промывают, высушивают и микроскопируют. В окрашенном этим способом мазке бактерийные тела красные или буро-желтые (в зависимости от краски, примененной для докрашивания), споры синие. Метод Шеффера и Фултона. На препарат, фиксированный жаром, наносят 5% водный раствор малахитового зеленого и нагревают до появления паров 3—4 раза. Мазок промывают и докрашивают 30 секунд 0,5% водным раствором сафранина. При этой окраске споры зеленые, а клетки красные. Метод Пешкова. На мазок, фиксированный жаром (над пламенем!), наливают синьку Леффлера и подогревают стекло до закипания краски. Дают 15—20 секунд покипеть, а затем (после того как стекло остынет!) промывают водой и докрашивают препарат 30 секунд 0,5% водным раствором нейтральрота. Вновь промывают, сушат и микроскопируют; споры голубые, клетки розовые. Окраска жгутиков. Это одна из наиболее трудных процедур в бактериологической технике, так как жгутики очень легко повреждаются при приготовлении препарата. Поэтому здесь требуется особая тщательность работы. Стекла для препаратов должны быть абсолютно чисты и обезжирены. Обычно работают с новыми покровными стеклами, которые предварительно кипятят в течение 10 минут в хромовой смеси (двухромовокислого калия 20 г, воды 200 мл, серной кислоты 20 мл; приливать в указанном порядке). После кипячения стекол хромовую смесь сливают, промывают стекла 5 минут в слабом растворе едкого натра, после чего обильно промывают водой, ополаскивают спиртом и хранят в спирте (во время промывания не прикасаться к стеклам руками). Перед употреблением стекла вынимают из спирта чистым пинцетом и удаляют спирт обжиганием (ничем не вытирать!). Исследуемая культура должна быть не старше 12—18 часов. Материал берут осторожным прикосновением петли к культуре и вносят в пробирку с несколькими миллилитрами водопроводной воды, погружая петлю в воду и держа ее неподвижно некоторое время. Повторяют это 2—3 раза, пока не получится тонкая, лишь слегка опалесцирующая взвесь. Полученной взвеси дают постоять 15—20 минут в термостате для равномерного распределения микробов в воде. Затем платиновой петлей кладут каплю из нее на покровное стекло. Если стекло достаточно чисто, капля принимает правильную круглую форму, легко расплывается и быстро высыхает на воздухе без подогревания. Препараты фиксируют на огне и окрашивают специальными способами, причем перед окраской обрабатывают протравой, которая усиливает действие краски. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 19 из 38 Серебрение по Морозову. Приготовляют 3 реактива: 1) 1 мл ледяной уксусной кислоты + 2 мл продажного формалина + 100 мл дистиллированной воды; 2) 5 г танина + 1 мл жидкой карболовой кислоты (liquefaciens) + 100 мл дистиллированной воды; 3) 5 г кристаллического азотнокислого серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отливают 20 мл в другой сосуд, к оставшимся 80 мл раствора серебра по каплям добавляют раствор аммиака, пока не растворится образующийся осадок и не останется легкая опалесценция; если аммиака будет добавлено слишком много, то из отлитых в другой сосуд 20 мл раствора серебра надо по каплям добавлять до получения нужной слабой опалесценции. Для окраски препарата раствор серебра разводят дистиллированной водой 1:10. Окраска препарата: наливают на 1 минуту первый реактив, сливают, промывают препарат водой, наливают второй реактив, подогревают на легком пламени до отхождения паров (1 минуту), тщательно промывают водой, 1—2 минуты при подогревании обрабатывают препарат третьим реактивом до появления темнокоричневой окраски мазка, тщательно промывают водой, высушивают. Рассматривают с иммерсионной системой. Метод Бениньетти. Готовят 3 раствора за 2—3 дня до окраски: 1) сульфата цинка 1 г, танина 15 г, дистиллированной воды 100 мл. 2) насыщенный горячий водный раствор квасцов; 3) насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета. Непосредственно перед окраской растворы смешивают в пропорции 1-й, 2-й, 3-й = 5:5:3. Наливают на фиксированный мазок смешанную краску и подогревают над пламенем 2—3 минуты до появления паров. Тщательно обмывают водой и просушивают. Рассматривают с иммерсионной системой. Метод Леффлера. За 1—2 суток до употребления готовят протраву, состоящую из 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 10 мл 20% водного раствора танина, 5,5 мл насыщенного на холоду водного раствора сернокислого закисного аммиачного железа (соль Мора). Перед употреблением фильтруют. Препарат, приготовленный на покровном стекле, фиксируют и помещают на часовое стекло. Наливают протраву и 30—50 секунд подогревают до отхождения паров. Дав стеклу остыть, его промывают водой и, поместив на другое часовое стекло, красят фуксином Циля 2—3 минуты при слабом подогревании. После тщательной промывки и высушивания препарат готов для микроскопирования. Метод Шенка. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 20 из 38 Протраву, состоящую из двух растворов, готовят за 7—10 дней до употребления. Первый раствор состоит из 30 мл насыщенного водного раствора танина и 10 мл 5% водного раствора полуторахлористого железа, второй — из 1 мл анилина и 4 мл 95° спирта. Протраву готовят на препарате, для чего на него наносят 8 капель первого и 1 каплю второго раствора. После того как избыток протравы сливают, на препарат наносят краску (без промывания). Красить можно 1% сафранином в 50% спирте или метиленовым синим Леффлера. Хорошие результаты можно получить, применив для окраски смесь 30 мл метиленового синего Леффлера и 8 мл второго раствора протравы. Метод Грея. Растворы, составляющие протраву, смешивают за сутки до употребления. Растворы состоят из: 1) насыщенного водного раствора калийных квасцов KAl(S04)2 *12Н20 — 5 мл, 20% водного раствора танина — 2 мл и насыщенного водного раствора двухлористой ртути HgCl2 —2 мл; 2) насыщенного спиртового раствора основного фуксина — 0,4 мл. Протраву наливают на препарат на 8-10 минут, затем промывают его дистиллированной водой и окрашивают 5 минут карболовым фуксином Циля. Вновь промывают водой, сушат на воздухе и микроскопируют. Жгутики окрашиваются в красный цвет. Метод Петрука. Является модификацией метода Грея. Вместо карболового фуксина применяют азотнокислое серебро, раствор которого готовят следующим образом: 1 г AgN03 растворяют в 20 мл дистиллированной воды, к нему по каплям добавляют 5% раствор аммиака до растворения образовавшегося осадка и появления легкой опалесценции. Этот исходный раствор разбавляют в 10 раз дистиллированной водой и применяют для окраски. Препарат с нанесенным на него раствором азотнокислого серебра слегка подогревают над пламенем. Жгутики окрашиваются в желто-коричневый цвет. Окраска клеточной стенки. При обычных методах окраски мазков клеточная стенка не окрашивается. Поэтому применяют специальные методы с протравами. Метод Гутштейна. Препарат, 1—2 часа фиксированный в жидкости Буэна, 2—3 минуты подвергают действию протравы (5— 10/0 водный раствор танина), ополаскивают водой и затем микроскопиругот в капле 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 21 из 38 Метод Кнайзи. Препарат, фиксированный жаром, обрабатывают 3—5 минут протравой, состоящей из 70 мл насыщенного водного раствора калийных квасцов и 30 мл 20% водного раствора танина. На мазок, промытый водой, наносят каплю карболового фуксина, накрывают покровным стеклом и микроскопируют, не удаляя краску. Метод Пешкова. Препарат фиксируют 15 минут в жидкости следующего состава: 90° спирта 60 мл, хлороформа 30 мл и уксусной эссенции 10 мл. Протравливают 2—5 минут в 10% водном растворе танина. Затем препарат промывают водой, красят 30—60 секунд фуксином Пфейффера и, не промывая, сушат и микроскопиругот. Окраска ядерных элементов. Метод Романовского. Препарат фиксируют метиловым спиртом, спирт-формолом, жидкостью Карнуа или смесью Никифорова. Окрашивают рабочим раствором красителя (2 капли продажного красителя Гимзы на 1 мл дистиллированной воды) 10—20 минут. Промывают дистиллированной водой и после просушивания микроскопируют. Дистиллированная вода, применяемая для разведения красителя, должна иметь нейтральное значение рН, так как от этого в высокой степени зависят результаты окрашивания. Реакция дистиллированной воды, кроме обычно применяемых с этой целью способов, может быть проверена путем прибавления к ней кристаллика гематоксилина или нескольких капель его спиртового раствора. Вода пригодна если в течение 2 минут не появляется розовая окраска; в противном случае она кислая и должна быть подщелочена 1% раствором углекислой соды (NaHC03). При микроскопии ядерные элементы имеют красно-фиолетовый цвет, цитоплазма—слабо розовый. Метод Пикарского. Препарат обрабатывают 1 N НС1 7 минут при подогревании до 60". После промывания мазок окрашивают по Романовскому. После окраски ядерные элементы темно-красные, протоплазма розовая. 5. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар в чашке Петри, после чего на его поверхность пинцетом помещают на равномерном расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков (рис. 43). Посевы инкубируют при 37°С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста культуры стафилококка судят об ее чувствительности к соответствующим антибиотикам. При зоне задержки роста диаметром до 10 мм культура расценивается как малочувствительная, а свыше 10 мм —как высокочувствительная. В том случае, если диски пропитаны разными концентрациями одного G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 22 из 38 Примечание. — отсутствие роста исследуемой бактериальной культуры; + наличие роста. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика 12,5 мкг/мл, и того же антибиотика, можно установить наименьшую дозу препарата, к которой чувствительна исследуемая бактериальная культура. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (в мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10е—107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37°С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий содержащейся в ней минимальной ингибирующей дозой антибиотика (табл. 7). Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений в питательном агаре. Данный метод определения минимальной ингибирующей концентрации антибиотика более точен, чем предыдущий. Готовят двукратные разведения антибиотика, после чего к 1 ч. каждого разведения добавляют 9 ч; питательного агара, расплавленного и остуженного до 45° С. Смесь хорошо перемешивают в пробирке и выливают в чашку Петри. Приготовленные таким образом G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 23 из 38 МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ чашки, каждая из которых содержит определенную концентрацию антибиотика, делят на 20 секторов так же, как при фаготипировании стафилококка. На агаровую поверхность каждого сектора петлей засевают суточную бульонную культуру исследуемой бактериальной культуры. Посевы инкубируют при оптимальной температуре до появления роста в контрольной чашке, не содержащей антибиотика, после чего учитывают результаты. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика "определяется по видимой задержке роста бактерий по сравнению с контролем на чашке, содержащей наименьшее количество данного препарата. Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом—исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм Staph, aureus, а при определении стрептомицина— Е. coli. После инкубирования посевов при 37°С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий,— 0,313 мкг/мл, то произведение 1024-0,313=320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл. 6. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ. РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА Для постановки реакции лизиса и реакции связывания комплемента (РСК) используют комплемент, который содержится в сыворотке крови морских свинок. Гемолитическая активность комплемента термолабильна и полностью утрачивается при прогревании сыворотки в течение 30 мин при 56°С. При адсорбции комплемента на комплексе антиген — антитело его действие проявляется в реакции лизиса антигена, если это клетки, или не сопровождается никакими видимыми изменениями, если это мелкодисперсные или растворимые антигены. Для учета результатов данной реакции РСК вводят вспомогательную (индикаторную) гемолитическую систему. Она состоит из взвеси эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 24 из 38 Рис 59. Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции преципитации в агаре. ^еыворотки кролика, полученной путем его иммунизации упомянутыми эритроцитами. Положительная РСК характеризуется задержкой гемолиза вследствие адсорбции комплемента системой антиген — антитело (рис. 60). Отрицательная РСК характеризуется наличием гемолиза, поскольку свободный комплемент связывается с системой эритроциты барана — гемолитическая сыворотка кролика. РСК обладает высокой чувствительностью й специфичностью, что позволяет использовать ее для серодиагностики многих заболеваний, а также для выявления антигенов в крови больного. Кроме того, ее применяют для идентификации бактерий, вирусов и других антигенов. РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА Комплемент. Для определения титра и рабочей дозы производят титрование комплемента с помощью реакции иммунного гемолиза. Для этого свежую сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида натрия от 1:10 до 1:40 (табл. 18). К 0,2 мл каждого разведения комплемента добавляют по 0,4 мл гемолитической системы (смеси равных объемов 3 % суспензии эритроцитов в (изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки в разведении, соответствующем ее тройному титру). Пробирки выдерживают при 37°С и через 30 мин определяют титр комплемента—наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочую дозу комплемента рассчитывают, исходя из его титра. Рабочая доза комплемента должна быть выше титра на 25%. Так, например, при титре комплемента 1 :20 в качестве рабочей дозы берут его предыдущее разведение 1:15 (см. табл. 18). G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 25 из 38 Антигены изготовляются - производственными институтами из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных антигенов, таптенов, экстрактов тканевых липидов. Взвесь эритроцитов барана получают из дефибри-нированной крови барана, отмывая эритроциты изотоническим раствором хлЪрида натрия до полной бесцветности и прозрачности надосадочной жидкости, и готовят из них 3 % взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия. РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА Гемолитическая сыворотка, приготовленная путем 3—4-кратной внутривенной иммунизации кролика 50% взвесью бараньих эритроцитов, инактивирована при 56°С (разрушен комплемент) и на этикетке ампул имеет обозначенный титр — максимальное разведение данной сыворотки, которое обеспечивает полный лизис 3 % взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента при 37°С в течение часа (рис. 61). Для РСК в качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре. Постановка основного опыта. После установления титра и рабочих доз всех ингредиентов ставят основной опыт РСК (табл. 19). Испытуемую и контрольные сыворотки предварительно инактивируют нагреванием при 56°С в течение 30 мин. Стандартная схема постановки РСК предусматривает проведение первой фазы —соединение антигена, испытуемой сыворотки и комплемента при 37°С в течение 30 мин. При постановке РСК на холоду эту фазу проводят при 0—4°С в течение 18—20 ч, что повышает чувствительность реакции. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 26 из 38 После добавления в каждую пробирку по 0,4 мл гемолитической системы пробирки встряхивают и выдерживают 20—30 мин при 37°С. Результаты опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках (см. табл. 19): реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жвдкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной—при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая кровь»). Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (ММ, -Н-f, -Н-, +). РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ При помощи РПГА определяют полные (бивалентные) антитела. Неполные (моновалентные, блокирующие) антитела не выявляются этим методом, так как, соединяясь с антигеном, блокируют его, но не могут вызвать агрегации частиц в крупные конгломераты. Для выявления неполных, например антирезусных, антител в исследуемой сыворотке используют специальную реакцию—пробу с антиглобу-линовой сывороткой, которая получила название р е а к ции Кумбса'. Реакция проходит в два этапа: 1) связывание эритроцитами (резус +) неполных антиэритроцитарных антител, содержащихся в сыворотке крови; 2) агглютинация эритроцитов при добавлении антиглобулиновой сыворотки в результате ее взаимодействия с фиксированными на эритроцитах неполными антителами—иммуноглобулинами, Задание для выполнения лабораторной работы G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 27 из 38 1. Поставить развернутую реакцию агглютинации в пробирках для определения титра специфических антител в сыворотке, полученной от кролика на предыдущем занятии. 2. Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с целью идентификации изучаемых бактерий. Объяснить отрицательные результаты в контрольных пробирках, исходя из необходимого сочетания ингредиентов, участвующих в реакции агглютинации. 3. Отметить результаты РПГА: а) определить титр специфических антител в сыворотке крови по результатам РПГА и б) присутствие специфического антигена в исследуемом материале от больного по результатам РПГА. Объяснить необходимость контролен в РПГА. 4. Отметить результаты реакции Кумбса: определить титр неполных антирезусных антител в сыворотке беременной женщины. Объяснить, какие конт-роли должны сопровождать реакцию Кумбса. Методические указания РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ Получение иммунной сыворотки. Из уха или сердца кролика на 7-й день после окончания иммунизации берут кровь, помещают в термостат при 37°С на 10—15 мин. После свертывания крови сгусток отслаивают от стенок пробирки стеклянной палочкой и выдерживают при 4°С в течение часа для лучшей ретракции сгустка и более полного отделения сыворотки. Затем сыворотку осторожно отсасывают пипеткой. Титрование исследуемой сыворотки. Схема постановки реакции агглютинации для определения титра антител приведена в табл. 16. Сначала готовят основное разведение сыворотки, которое в зависимости от титра может составлять 1:50, 1:100 или 1:1000. Затем делают серию разведений сыворотки путем последовательного переноса 1 мл из предыдущей пробирки в следующую пробирку ряда. Из последней пробирки 1 мл разведенной сыворотки удаляют для сохранения одинакового объема. В контрольную пробирку (контроль антигена) вносят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В каждую пробирку с разведениями сыворотки и в контрольную пробирку вносят пастеровской пипеткой по 2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки 1 Антиглобулиновую сыворотку против глобулинов человека получают путем гипернммунизации кролика человеческой сывороткой. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 28 из 38 встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 ч, затем сутки выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: I I 1 1 полная агглютинация — хлопья агглютината в абсолютно прозрачной жидкости; I I I неполная агглютинация — хлопья в слабоопалесцирующей жидкости; ++ частичная агглютинация — хлопья различимы, жидкость слегка мутная; + слабая, сомнительная агглютинация — жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; — отсутствие агглютинации — жидкость равномерно мутная (рис. 51). Реакцию учитывают как положительную при наличии отчетливой агглютинации, выраженной не менее ++ в опытной пробирке, и отсутствии агглютинации в обеих контрольных пробирках. За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем -Н-. Реакция агглютинации на стекле (пластинчатая реакция агглютинации). Ставится с одним разведением диагностической агглютинирующей сыворотки, которое в зависимости от ее титра составляет 1 :10, 1:25,1:50 или 1 :100. Предметное стекло делят восковым карандашом пополам. На одну половину наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия, а на другую —каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры Рис 51. Реакция агглютинации. о - плохо выраженная; б — хорошо выраженная. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 29 из 38 и перемешиают круговыми движениями в каждой капле до получения равномерной взвеси. Стекло можно слегка подогреть, высоко держа над пламенем горелки в течение 2—4 мин. Реакция протекает быстро. Наблюдают за появлением зерен агглютината в каплях. Учет производят через 3—5 мин (рис. 52). РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: I I 1 1 полная агглютинация — хлопья агглютината в абсолютно прозрачной жидкости; I I I неполная агглютинация — хлопья в слабоопалесцирующей жидкости; ++ частичная агглютинация — хлопья различимы, жидкость слегка мутная; + слабая, сомнительная агглютинация — жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; — отсутствие агглютинации — жидкость равномерно мутная (рис. 51). Реакцию учитывают как положительную при наличии отчетливой агглютинации, выраженной не менее ++ в опытной пробирке, и отсутствии агглютинации в обеих контрольных пробирках. За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем -Н-. Реакция агглютинации на стекле (пластинчатая реакция агглютинации). Ставится с одним разведением диагностической агглютинирующей сыворотки, которое в зависимости от ее титра составляет 1 :10, 1:25,1:50 или 1 :100. Предметное стекло делят восковым карандашом пополам. На одну половину наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия, а на другую —каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры Рис 51. Реакция агглютинации. о - плохо выраженная; б — хорошо выраженная. и перемешиают круговыми движениями в каждой капле до получения равномерной взвеси. Стекло можно слегка подогреть, высоко держа над пламенем горелки в течение 2—4 мин. Реакция протекает быстро. Наблюдают за появлением зерен агглютината в каплях. Учет производят через 3—5 мин (рис. 52). РПГА. Реакцию используют либо для выявления специфических антител в сыворотке больного при серодиагностике, либо для идентификации неизвестного возбудителя или индикации его антигенов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные диагностикумы или суспензионные антитела, полученные путем сенсибилизации обработанных танином (танизированных) эритроцитов антителами. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения сыворотки больного, ориентируясь на диагностический титр. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем (0,05 мл) 3% суспензии нагруженных антигеном эритроцитов — соответствующего эритроцитарного диагностикума. Через 2 ч инкубации при 37°С учитывают результат, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): отрицательная реакция — осадок G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 30 из 38 эритроцитов в виде компактного диска или колечка с ровными краями на дне лунки, положительная реакция — характерный кружевной вид осадка эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями (рис. 53). Реакция Кумбса. Для выявления неполных антител, например к резус-антигену эритроцитов в сыворотке беременной, реакция ставится в два этапа: .1) к двукратным разведениям испытуемой сыворотки добавляют эритроциты, содержащие резус-антиген, и выдерживают при 37ЬС в течение часа; 2) к тщательно отмытым после первого этапа эритроцитам добавляют кроличью античеловеческую антиглобулиновую сыворотку (в заранее оттитрованном рабочем разведении). После инкубации в течение 30 мин при 37°С результаты оценивают по наличию гемагглютинации (положительная реакция). Контроли ингредиентов реакции: 1) антиглобулино-вая сыворотка + заведомо сенсибилизированные эритроциты; РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ И ЕЕ ВАРИАНТЫ. ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД 1. Реакция преципитации: механизм, варианты постановки (кольцепреци-питация, преципитация в геле, иммуноэлектрофорез) и их диагностическое применение. 2. Иммунофлюоресцентный метод Кунса. Реакция преципитации характеризуется осаждением специфических мелкодисперсных антигенов эквивалентным количеством антител в присутствии электролита. Выпадение нерастворимого комплекса антиген — антитело в виде осадка наблюдается лишь при эквивалентных соотношениях ингредиентов. G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 31 из 38 Образовавшийся комплекс может раствориться в избытке антигена или антител. Антиген должен иметь характер прозрачного коллоидного раствора. В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний реакция преципитации служит главным образом для выявления или идентификации антигена (преципитиногена) по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела (преципитины). Для приготовления коллоидных антигенов, участвующих в реакции преципитации, используют различные методы их экстракции из исследуемого материала: физические, химические и биологические. Иммунофлюоресцентный метод. Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфицированных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Иммунофлюоресцентный метод относится к экспресс-диагностике, не уступая другим серологическим реакциям по чувствительности и специфичности (рис. 55). G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 32 из 38 СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ И ЕЕ ВАРИАНТЫ. ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоциа-ната флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности. При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические флюоресцирующие антитела, связавшиеся с микробными антигенами, образуют комплексы, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов (рис. 56). Недостатком прямого метода Кунса является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток против каждого изучаемого антигена. Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулино-вой, содержащей антитела только против кроличьих глобулинов. В связи с тем что диагностические антисыворотки содержат кроличьи глобулины (так как их получают путем иммунизации кроликов), они реагируют с флюоресцирующей аняиглобулиновой сывороткой в качестве антигена и вместе с тем соединяются с гомологичным исследуемым антигеном (микроорганизмом) как антитела. При этом на образовавшемся комплексе (специфические антитела+исследуе-мый антиген) фиксируются флюоресцирующие антиглобули-новые антитела, вызывая его свечение при люминесцентной микроскопии. Реакция преципитации. Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды и чистых культур бактерий. Один из распространенных методов хими- G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 33 из 38 ческой экстракции антигенов бактерий — получение комплексного антигена по Буавену с помощью гидролиза бактерий трихлоруксусной кислотой. В реакции используются прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата — помутнения. Реакция кольцепреципитации. Ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно, по стенке, держа пробирку в наклонном положении, наслаивают 0,1-0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Результаты опыта протоколируют (табл. 17). Учет реакции производят через 1—2 мин. В случае положительной реакции в первой пробирке на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В остальных (контрольных) пробирках преципитат не образуется (рис. 57). Реакция преципитации в геле (агаре). Чашки заливают агаром, в котором вырезают несколько луночек на равном расстоянии друг от друга. В центральную лунку вносят сыворотку, содержащую антитела, в остальные — различные испытуемые антигены или один и тот же антиген в различных разведениях. При диффузии реагентов в агаре в зонах оптимальных соотношений на месте встречи антигена и антител образуются мутные полосы —дуги преципитации (рис. 58). G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 34 из 38 В случае постановки реакции преципитации с различными разведениями антигена можно установить титр преципитиру-ющей сыворотки—максимальное разведение антигена, которое дает преципитацию с данной сывороткой. Одна из разновидностей реакции преципитации в геле позволяет определять токсигенность исследуемых бактерий (например, дифтерийной палочки) с помощью антитоксической сыворотки. Для этого в чашку Петри на питательную среду помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Затем чашку подсушивают в термостате и засевают испытуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги, на расстоянии 0,6-0,8 см от ее края. В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. Чашки инкубируют при 37°С в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации в виде дуг (рис. 59). Иммуноэлектрофорез. Исследование проводится в два этапа: 1) электрофоретическое разделение исследуемого материала в агаре; 2) иммунологический анализ. В агаре параллельно оси миграции электрофоретических фракций вырезают траншеи, в которые вносят иммунную сыворотку, содержащую антитела к исследуемым антигенам. В случае реакции между антигенами и диффундирующими в агар антителами формируется преципитат в виде дискретных дуг, соответстРнс. 58. Реакция преципитации в геле по Оухтерлони. вующих индивидуальным системам антиген—антитело (см. рис. 58). Иммунофлюоресцентный метод. На предметном стекле готовят мазок из испражнений больного ко-лиэнтеритом, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной сывороткой, содержащей антитела к возбудителям колиэнтерита. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 35 из 38 инкубируют при 37°С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия — удаляют несвязавшиеся с антигеном антитела. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку, выдерживают в течение 15 мин при 37°С и препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии. ФАГОЦИТОЗ И ДРУГИЕ ФАКТОРЫ ЕСТЕСТВЕННОГО ИММУНИТЕТА Постановка опыта фагоцитоза на белых мышах. За 24 ч до постановки опыта белым мышам вводят внутрибрюшинно по 2—3 мл стерильного 1% раствора крахмала. Это вызывает скопление в брюшной полости фагоцитирующих клеток как результат асептического воспаления и хемотаксиса фагоцитов к крахмалу. Затем мыши вводят внутрибрюшинно 1 мл двухмиллиардной взвеси белого стафилококка. Через 30 мин брюшную стенку мыши прокалывают концом тонкого капилляра пастеровской пипетки и набирают несколько капель экссудата. Из него готовят мазки на предметных стеклах, высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают раствором метиленового синего в течение 3—4 мин. При микроскопии мазков отмечают наличие микрофагов (полиморфно-ядерных клеток) и макрофагов (мононуклеаров) с поглощенными стафилококками, окрашенными в интесивно синий цвет на фоне светло-голубой цитоплазмы фагоцитов (рис. 49). Отмечают в препарате отдельные стадии фагоцитоза: прилипание, захват, частичное переваривание. ФАГОЦИТОЗ И ДРУГИЕ ФАКТОРЫ ЕСТЕСТВЕННОГО ИММУНИТЕТА Постановка опсонофагоцитарной реакции. В пробирку с одним объемом стерильного 2% раствора цитрата натрия вносят два объема свежевзятой крови и один объем взвеси бактерий, содержащей 1 млрд/мл микробных клеток, убитых нагреванием при 80°С в течение часа. Содержимое пробирки перемешивают, инкубируют в течение 30 мин при 37°С, затем готовят мазки и окрашивают по Романовскому—Гимзе. В мазке подсчитывают количество бактерий, захваченных каждым из 25 нейтрофилов. По результатам учета определяют следующие фагоцитарные показатели: фагоцитарный показатель (индекс) — процент фагоцитирующих нейтрофилов, фагоцитарное число — среднее количество фагоцитированных бактерий на один нейтрофил. Показатель опсонофагоцитарной реакции (ПОФР) вычисляют по формуле: ПОФР = За + 2b + lc + 0d, где а — число нейтрофилов, содержащих свыше 41 бактерии; b — число нейтрофилов, содержащих 21—40 бактерий; с—число нейтрофилов, содержащих от 1 до 20 бактерий; d— число G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 36 из 38 нейтрофилов, не содержащих бактерий. Максимальный показатель при такой системе учета составляет 75. Ориентировочно считают, что показатель в пределах 10—24 характеризует слабоположительную реакцию, 25^49 —ясно выраженную, 50—75 —резко положительную реакцию. Ясно выраженная и резко положительная реакции характеризуют опсонизирующую активность сыворотки больного и функциональную активность фагоцитов. 7. Бактериальный стандарт Бактериальный стандарт (стандарт мутности) — эталон для определения концентрации бактериальных (живых или убитых) клеток в суспензиях по степени мутности. Для бактерий различных размеров существуют соответствующие Б. с. Международный стандарт мутности состоит из взвеси частиц нейтрального стекла, близких по размерам к величине бактерий. Мутность его соответствует мутности коклюшных бактерий в концентрации 10 млрд. микробных тел в 1 мл. Чтобы произвести стандартизацию бактериальной взвеси, ее наливают в прилагаемую к стандарту мутности пробирку, по размеру идентичную эталону. Исходную взвесь разводят физиологическим раствором до тех пор, пока ее мутность не будет равна мутности эталона, что определяют по специальному шрифту, также прилагаемому к стандарту мутности. 8. Мытье и обработка лабораторной посуды Для мытья лабораторной посуды в микробиологических лабораториях отводится отдельное помещение - моечная. Сильно загрязненную посуду со следами жира обрабатывают в хромовой смеси. Хромовая смесь, будучи сильным окислителем, разрушает органические вещества с образованием растворимых или газообразных продуктов. Перед употреблением хромовую смесь подогревают до температуры 45-50 °С, а затем заливают ею грязную посуду. Мытье новой лабораторной посуды. В ведре с теплой водой растворяют хозяйственное мыло, чтобы образовалось небольшое количество пены, погружают в нее посуду и ставят на слабый огонь. После 15-минутного кипячения посуду вынимают, ополаскивают чистой водой, погружают в теплый 1-2 % раствор хлористоводородной кислоты, доводят до кипения и вываривают 10-15 мин, чтобы нейтрализовать избыток щелочи, который мог остаться при изготовлении стекла. После кипячения в кислоте посуду прополаскивают водопроводной водой и дважды дистиллированной. Мытье лабораторной посуды, бывшей в употреблении. Посуда, в которой содержался материал, автоклавируют. Перед мытьем из пробирок, чашек и колб обеззараженную жидкость выливают. Не очень загрязненную посуду моют ершом в горячей воде с мылом, содой или в растворе горчицы. Очень загрязненную жирную посуду, не поддающуюся мытью обычным способом, заливают на 30-40 мин хромовой смесью, а затем в течение продолжительного времени промывают проточной водопроводной водой. Простой и надежный способ мытья и обеззараживания лабораторной посуды предложен Г. П. Кирсановым (1972). Отработанную лабораторную посуду стерилизуют в автоклаве в течение 2 ч при 2 атм. После стерилизации, посуду загружают в бак и заливают раствором, содержащим на 100 мл дистиллированной воды 5 мл нашатырного спирта и 3 г порошка для стирки хлопчатобумажного и льняного белья. Лабораторная посуда хорошо отмывается и обезжиривается в течение 30 мин кипячения в указанном растворе, затем ее прополаскивают водопроводной водой и дважды дистиллированной. После этого, посуду высушивают в сушильном шкафу. Мытье градуированных пипеток. Пипетки и другая градуированная посуда, поступающие для работы, должны быть абсолютно чистыми и хорошо обезжиренными. На стенках плохо обезжиренной посуды при вливании жидкости остается большое количество капель, вследствие чего слитый объем жидкости не будет соответствовать той величине, которая указана на шкале деления. Градуированные пипетки, моют следующим образом: с помощью резинового баллончика, надетого на пипетку, насасывают в нее горячую тыльную воду и погружают затем в сосуд с такой же водой. Чтобы вода из пипеток не вытекала, уровень жидкости в сосуде должен соответствовать высоте пипеток. Выдержав 20-30 мин в мыльном растворе, пипетки прополаскивают водопроводной водой и переносят в 1-2 % раствор хлористоводородной кислоты, который постепенно доводят до кипения. Далее пипетки обрабатывают так же, как и остальную стеклянную посуду. Закупорившийся канал пипетки прочищают мандреном от тонких игл шприцов. Промытые пипетки складывают в таз, заливают теплым раствором горчицы или мыльной водой и ставят на слабый огонь. После 20-30-минутного кипячения пипетки вынимают и ополаскивают сначала теплой проточной водой, а затем дистиллированной. Сильно загрязненные пипетки также очищают ершом с мылом или содой, и погружают в хромовую смесь, G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 37 из 38 налитую в ванночку или банку, по высоте соответствующую длине обрабатываемых пипеток. В хромовой смеси пипетки выдерживают 20-30 мин, затем в течение нескольких минут промывают проточной и дважды ополаскивают дистиллированной водой. Сушка и хранение чистой лабораторной посуды. Высушенную посуду просматривают на свет. Стекло ее должно быть совершенно прозрачным, без матового налета и пятен. Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре или горячим воздухом в сушильном шкафу при температуре 100-105 °C. Стерилизация предусматривает в стерилизуемом объекте уничтожение всех вегетативных и споровых микроорганизмов и проводят её различными способами: паром, сухим горячим воздухом, кипячением, фильтрацией и т. д. Выбор того или иного способа стерилизации определяется качеством и свойствами микрофлоры стерилизуемого объекта. Подготовка и стерилизация лабораторной посуды. Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутыли, матрицы и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажные колпачки. Резиновые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в отдельном пакете, привязанном к горлышку посуды. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1-10 штук. Пастеровские пипетки по 3-15 шт. заворачивают оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в рот. При завертывании пипеток нужно соблюдать большую осторожность, чтобы не обломать запаянные концы капилляров. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец. Лабораторную посуду стерилизуют: а) сухим жаром при температуре 175°С - 1 ч., б) в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 20-30 мин. Стерилизацию кипячением производят в стерилизаторе. В стерилизатор наливают дистиллированную воду, так как водопроводная образует накипь. ( Стеклянные предметы погружают в холодную, металлические предметы - в горячую воду с добавлением гидрокарбоната натрия). Стерилизуемые предметы кипятят на слабом огне. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения инструменты берут стерильным пинцетом, который кипятят вместе с остальными предметами. Стерилизация сухим жаром производится в печи Пастера. Подготовленный к стерилизации материал кладут на полки так, чтобы он не соприкасался со стенками. Шкаф закрывают и после этого включают обогрев. Продолжительность стерилизации при температуре 150 °С - 2 ч, при 165 °С - 1 ч, при 180 °С - 40 мин, при 200 °С – 10-15 мин (при 170 °С бумага и вата желтеют, а при более высокой температуре обугливаются). Началом стерилизации считается тот момент, когда температура в печи достигнет нужной высоты. По окончании срока стерилизации печь выключают, но дверцы шкафа не открывают до полного охлаждения, так как холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде. Стерилизация паром под давлением производят в автоклаве. Автоклав состоит из двух котлов, вставленных один в другой, кожуха и крышки. Наружный котел называют водопаровой камерой, внутренний - стерилизационной камерой. В водопаровом котле происходит образование пара. Во внутренний котел помещают стерилизуемый материал. В верхней части стерилизационного котла имеются небольшие отверстия, через которые проходит пар из водопаровой камеры. Крышка автоклава герметически привинчивается к кожуху. Кроме перечисленных основных частей, автоклав имеет ряд деталей, регулирующих его работу: манометр, водомерное стекло, предохранительный клапан, выпускной, воздушный и конденсационный краны. Предохранительный клапан служит для предохранения от чрезмерного повышения давления. Его устанавливают на заданное давление, т. е. давление, при котором нужно производить стерилизацию, при переходе стрелки манометра за черту клапан автоклава автоматически открывается и выпускает лишний пар, замедляя тем самым дальнейший подъем давления. Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. После этого интенсивность подогрева уменьшают, чтобы давление в автоклаве в течение нужного времени оставалось на одном уровне. По окончании времени стерилизации подогревание прекращают. Закрывают вентиль в трубопроводе, подающем пар в стерилизационную камеру, и открывают вентиль на конденсационной (нисходящей) трубе для снижения давления пара в камере. После падения стрелки манометра до нуля медленно ослабляют прижимные приспособления и открывают крышку (дверь) автоклава. Температура и продолжительность стерилизации определяются качеством стерилизуемого материала и свойствами тех микроорганизмов, которыми он заражен. Стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Стерилизацию текучим паром следует проводить повторно, так как однократное прогревание при температуре 100 °С не обеспечивает полного обеспложивания. Такой метод получил название дробной стерилизации: обработку стерилизуемого материала текучим паром проводят по 30 мин ежедневно в течение 3 дней. В промежутках между G-041.08.01.01-2007 Методические указания по проф.практике Ред. 2. Страница 38 из 38 стерилизациями материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях. Тиндализация - дробная стерилизация с применением температуры ниже 100 °С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемого материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу при температуре 60-65 °С в течение 5 дней или при 70-80 °C в течение 3 дней. В промежутках между прогреваниями обрабатываемый материал выдерживают при температуре 25 °С для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.