Порины, акваппорины, перфорины, ядерные поры, коннексоны
advertisement
Порины, акваппорины, перфорины, ядерные поры, коннексоны Порины формируют в наружной мембране митохондрий каналы, через которые из цитозоля в межмембранное пространство митохондрий диффундируют вещества с молекулярной массой до 5 кД. Аквапорины (AQP) — семейство мембранных пор для воды (рис. 2–5). Идентифицировано 10 аквапоринов, AQP3, AQP7 и AQP9 дополнительно проницаемы для глицерола и других небольших молекул, а AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5 — только для воды. Перфорины — белки гранул цитотоксических Т-лимфоцитов и NK‑клеток, образуют в клетках–мишенях, подлежащих уничтожению (клетки трансформированные, инфицированные вирусами и чужеродные), трансмембранные каналы. Выделяемые Tкиллером молекулы перфорина полимеризуютcя в мембране клетки–мишени в приcутcтвии Ca2+. Сформированные в плазматической мембране клетки–мишени перфориновые поры диаметром около 10 нм пропуcкают воду и cоли, но не молекулы белка. В результате осмотического шока клетка–мишень лизируется. Аналогично образуются поры, сформированные молекулами компонента комплемента C9. Ядерная пора имеет диаметр 80–150 нм, содержит канал поры и комплекс ядерной поры. Содержимое ядра сообщается с цитозолем через 2–4 тыс. специализированных коммуникаций — ядерных пор, осуществляющих диффузию воды, ионов и транспорт множества макромолекул (в т.ч. молекул РНК) между ядром и цитоплазмой. Перенос макромолекул через ядерные поры осуществляют специальные транспортные белки — кариоферины, которые специфически распознают и связывают «свои» молекулы и курсируют между ядром и цитоплазмой, перенося связанную молекулу в одном направлении: из цитоплазмы в ядро (импортины) или из ядра в цитоплазму (экспортины). Коннексон — трансмембранный белок цилиндрической конфигурации; состоит из 6 СЕ коннексина. Два коннексона соседних клеток соединяются в межмембранном пространстве и образуют канал между клетками (см. рис. 4‑7). Канал коннексона диаметром 1,5 нм пропускает ионы и молекулы с Mr до 1,5 кД. В отличие от других трансмембранных пор коннексоны имеют 2 состояния: открытое и закрытое. Коннексоны соседних клеток образуют так называемый щелевой контакт аккумуляции указанных Сахаров электрохимический протонный градиент. Переносчик глюкозы из мембраны эритроцитов не транспортирует Н+ и не способен к транспорту против градиента глюкозы. Очень важными представляются работы по изучению взаимосвязи структуры белкового комплекса и механизма его работы. 2 источник Из эритроцитов человека выделен специфический переносчик глюкозы, оказавшийся интегральным белком плазмолеммы. Искусственные липидные мембраны, в которые его встраивают, приобретают селективную проницаемость, свойственную клеточным мембранам человека и животных: через них с большой скоростью переносится только D-глюкоза, тогда как 1глюкоза практически не проникает. По-видимому, переносчики в БМ могут работать, используя разные способы перемещения (миграционный, ротационный, сдвиговый и т. д.). Представляя себе миграцию переносчика в клеточной мембране, полезно вспомнить гипотезу о механизме валиномицинового транспорта в искусственной мембране. Среди мигрирующих переносчиков можно выделить две разновидности. Одни транспортеры мигрируют внутри мембраны, взаимодействуя с переносимым веществом только на ее поверхностях. Этот механизм транспорта называют малой каруселью. Другие мигрирующие переносчики способны покидать биомембрану и выходить в при мембранное пространство в поисках транспортируемого агента. Поиск направляется действием электростатических сил и химическим взаимодействием. Вместе с переносимым веществом транспортер второго типа возвращается в БМ, проходит ее насквозь, выходит в противоположное примембранное пространство и оставляет там свой «багаж». В этом случае говорят о большой «карусели». Тип «карусели» зависит от поверхностно-активных свойств и растворимости самого переносчика. По механизму малой карусели работают транспортеры, плохо растворяющиеся в воде и являющиеся поверхностно-активными веществами. Миграционный механизм присущ переносчикам, размеры которых меньше, чем толщина БМ. Вместе с тем транспортерами могут служить крупные белковые молекулы и их комплексы, прободающие насквозь липидный бислой. Они переносят вещества через БМ посредством ротации или сдвига на расстояние, равное толщине мембраны. Переносчик глюкозы в эритроцитах Этот переносчик охарактеризован наиболее полно из всех белков, катализирующих диффузию единственного вещества через мембрану. Он переносит через эритроцитарную мембрану D-глюкозу, которая затем используется при гликолизе. Такие же или аналогичные переносчики глюкозы присутствуют и в других типах животных клеток. Большой прогресс в этой области исследований был достигнут благодаря секвенированию ДНК, кодирующей переносчик глюкозы из клеток гепатомы человека и из клеток мозга крысы. Очищенный переносчик из эритроцитов представляет собой гликопротеин с кажущейся мол. массой 55 000. По-видимому, в мембране он находится в виде димера. Если судить по данным об аминокислотной последовательности, то переносчик должен содержать 12 трансмембранных α-спиральных участков, однако экспериментальные данные не дают окончательного ответа на этот вопрос. Очищенный переносчик удалось встроить в фосфолипидные везикулы, при этом оказалось, что он ориентирован асимметрично. Как и при исследовании канальных белков, очень важную роль сыграли опыты с использованием специфических ингибиторов, обладающих высоким сродством к переносчику. В число этих ингибиторов входят цитохалазин В и флоретин, которые связываются с переносчиком со стехиометрией 1: 1. Одни ингибиторы (цитохалазин В) связываются с переносчиком только в том случае, если они находятся с цитоплазматической стороны мембраны, другие специфически связываются с наружной стороны мембраны (флоретин). Места связывания двух указанных ингибиторов находятся вблизи С-конца полипептида. Большинство кинетических данных и данных по связыванию согласуются с простой моделью четырех состояний (рис.2), в которой предполагается, что существует единственное место связывания D-глюкозы, находящееся внутри канала. Для измерения индивидуальных констант скоростей использовали ЯМР и метод остановленной струи. Конформация загруженного канала изменяется с константой скорости 2000 с-1, которая приблизительно в семь раз выше аналогичной константы для незагруженного канала (300с-1 при 23°С). Следовательно, обмен глюкозы происходит с большей скоростью, чем транспорт как таковой, для осуществления которого незагруженный переносчик должен возвратиться через мембрану. Природа конформационного изменения неизвестна, хотя оно было зарегистрировано при помощи инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье и, как предполагают, включает скольжение αспиралей друг относительно друга. Между переносчиком глюкозы из клеток млекопитающих и некоторыми транспортными системами бактерий наблюдается значительная гомология. Удивительно, что такая гомология наблюдается также между переносчиком глюкозы и белками, осуществляющими симпорт Н+ - арабинозы и Н+ - ксилозы. Эти симпортеры, как и описываемая ниже система транспорта Н+ - лактозы, используют для ПЕРЕНОС ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ Любая молекула может пройти через липидный бислой, однако скорость пассивной диффузии веществ, т.е. перехода вещества из области с большей концентрацией в область с меньшей, может сильно отличаться. Для некоторых молекул это занимает столь длительное время, что Рис. 5-13.Строение рецептора липопротеина низкой плотности (ЛПНП). 1 внутриклеточный домен; 2 трансмембранный домен; 3 Олигосахаридные остатки, присоединённые к ОН-группам серина или треонина; 4 Олигосахаридные остатки, присоединённые через амидную группу аспарагина; 5-ЛПНПсвязывающий домен. можно говорить об их практической непроницаемости для липидного бислоя мембраны. Скорость диффузии веществ через мембрану зависит главным образом от размера молекул и их относительной растворимости в жирах. Легче всего проходят простой диффузией через липидную мембрану малые неполярные молекулы, такие как О2, стероиды, тиреоидные гормоны, а также жирные кислоты. Малые полярные незаряженные молекулы - СО2, NH3, Н2О, этанол, мочевина - также диффундируют с достаточно большой скоростью. Диффузия глицерола идёт значительно медленнее, а глюкоза практически не способна самостоятельно пройти через мембрану. Для всех заряженных молекул, независимо от размера, липидная мембрана непроницаема. Транспорт таких молекул возможен благодаря наличию в мембранах либо белков, формирующих в липидном слое каналы (поры), заполненные водой, через которые могут проходить вещества определённого размера простой диффузией, либо специфических белков-переносчиков, которые избирательно взаимодействуя с определёнными лигандами, облегчают их перенос через мембрану (облегчённая диффузия). Кроме пассивного транспорта веществ, в клетках есть белки, активно перекачивающие определённые растворённые в воде вещества против их градиента, т.е. из меньшей концентрации в область большей. Этот процесс, называемый активным транспортом, осуществляется всегда с помощью белковпереносчиков и происходит с затратой энергии. А. Строение и функционирование белковых каналов Каналы в мембране формируются интегральными белками, которые "прерывают" липидный бислой, образуя пору, заполненную водой. Стенки канала "выстилаются" радикалами аминокислот этих белков. Если каналы различают вещества только по размеру и пропускают все молекулы меньше определённой величины, по градиенту концентрации, т.е. служат фильтрами, то их называют "неселективные каналы", или "поры". Такие поры есть в наружной мембране митохондрий, где молекулы белкапорина образуют широкие гидрофильные каналы. Через них могут проходить все молекулы с молекулярной массой 10 кД и меньше, в том числе и небольшие белки. Селективные каналы, как правило, участвуют в переносе определённых ионов. Ионная селективность (избирательность) каналов определяется их диаметром и строением внутренней поверхности канала. Например, катионселективные каналы пропускают только катионы, так как содержат много отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Открытие или закрытие селективных каналов регулируется либо изменением концентрации специфических регуляторов, таких как медиаторы, гормоны, циклические нуклеотиды, NO, G-белки, либо изменением трансмембранного электрохимического потенциала (рис. 5-14). Воздействие регуляторного фактора вызывает конформационные изменения каналообразующих белков, канал открывается и ионы проходят по градиенту концентрации. Транспорт веществ через каналы не приводит к конформационным изменениям белков и зависит только от разности концентраций веществ по обе стороны мембраны. Поэтому скорость транспорта веществ через такие каналы может достигать 106-108 ионов в секунду. Рис. 5-14. Регулируемый канал. Заштрихованные квадраты - регуляторы, светлые кружки - переносимые ионы. Б. Облегчённая диффузия веществ В мембранах клеток существуют белкитранслоказы. Взаимодействуя со специфическим лигандом, они обеспечивают его диффузию (транспорт из области большей концентрации в область меньшей) через мембрану. В отличие от белковых каналов, транслоказы в процессе взаимодействия с лигандом и переноса его через мембрану претерпевают конформационные изменения. Кинетически перенос веществ облегчённой диффузией напоминает ферментативную реакцию. Для транслоказ существует насыщающая концентрация лиганда, при которой все центры связывания белка с лигандом заняты, и белки работают с максимальной скоростью Vmax. Поэтому скорость транспорта веществ облегчённой диффузией зависит не только от градиента концентраций переносимого лиганда, но и от количества белков-переносчиков в мембране. Существуют транслоказы, переносящие только одно растворимое в воде вещество с одной стороны мембраны на другую. Такой простой транспорт называют "пассивный унипорт". Примером унипорта может служить функционирование ГЛЮТ-1 - транслоказы, переносящей глюкозу через мембрану эритроцита (рис. 5-15): Рис. 5-15. Облегчённая диффузия (унипорт) глюкозы в эритроциты с помощью ГЛЮТ-1 (S - молекула глюкозы). Молекула глюкозы связывается переносчиком на наружной поверхности плазматической мембраны. Происходит конформационное изменение, и центр переносчика, занятый глюкозой, оказывается открытым внутрь клетки. Вследствие конформационных изменений переносчик теряет сродство к глюкозе, и молекула высвобождается в цитозоль клетки. Отделение глюкозы от переносчика вызывает конформационные изменения белка, и он возвращается к исходной "информации. Рис. 5-16. Типы (виды) облегчённой диффузии с участием переносчиков (транслоказ). S1, S2разные молекулы. Некоторые транслоказы могут переносить два разных вещества по градиенту концентраций в одном направлении - пассивный симпорт, или в противоположных направлениях пассивный антипорт (рис. 5-16). Примером транслоказы, работающей по механизму пассивного антипорта, может служить анионный переносчик мембраны эритроцитов (рис. 5-17). Внутренняя митохондриальная мембрана содержит много транслоказ, осуществляющих пассивный антипорт (рис. 5-18). В процессе такого переноса происходит эквивалентный обмен ионами, но не всегда эквивалентный обмен по заряду. В. Строение и функционирование белковпереносчиков, осуществляющих активный транспорт Перенос некоторых лигандов (ионов, глюкозы, аминокислот) через мембраны происходит против градиента концентрации и сопряжён с затратой энергии (активный транспорт). Перенос лигандов через мембрану, связанный с затратой энергии АТФ, называют "первично-активный транспорт". 1. Первично-активный транспорт Перенос некоторых неорганических ионов идёт против градиента концентрации при участии транспортных АТФ-аз (ионных насосов). Все ионные насосы одновременно служат ферментами, способными к аутофосфорилированию и аутодефосфорилированию. АТФ-азы различаются по ионной специфичности, количеству переносимых ионов, направлению транспорта. В результате функционирования АТФ-азы переносимые Рис. 5-17. Пассивный антипорт анионов НСО3- и Сl- через мембрану эритроцитов. А когда эритроцит находится в венозных капиллярах, анион НСО3-, образованный при диссоциации угольной кислоты, по градиенту концентрации выходит в кровь. В обмен на каждый транспортируемый из клетки ион НСО3- транслоказа переносит в эритроцит ион Cl-; Б - когда кровь достигает лёгких транслоказа производит обмен ионами в противоположных направлениях. Такая "челночная" система работает очень быстро и обеспечивает удаление СО2 из организма и в то же время сохранение оптимального значения рН в клетке. Рис. 5-18. Некоторые митохондриальные переносчики. ионы накапливаются с одной стороны мембраны. Наиболее распространены в плазматической мембране клеток человека Nа+,К+-АТФ-аза, Са2+-АТФ-аза и Н+,К+,-АТФаза слизистой оболочки желудка. Nа+,К+-АТФ-аза Этот фермент-переносчик катализирует АТФзависимый транспорт ионов Na+ и K+ через плазматическую мембрану. Nа+,К+-АТФ-аза состоит из субъединиц α и β; α каталитическая большая субъединица, a β малая субъединица (гликопротеин). Активная форма транслоказы - тетрамер (αβ)2 (рис. 519). Nа+,К+-АТФ-аза отвечает за поддержание высокой концентрации К+ в клетке и низкой концентрации Na+. Так как Nа+,К+-АТФ-аза выкачивает три положительно заряженных иона, а закачивает два, то на мембране возникает электрический потенциал с отрицательным значением на внутренней части клетки по отношению к её наружной поверхности. Са2+-АТФ-аза В цитозоле "покоящихся" клеток концентрация Са2+ составляет ~10-7 моль/л, тогда как вне клетки она равна ~2 10-3 моль/л. Поддерживает такую разницу в концентрации система Рис. 5-19. Строение и функционирование Nа+,К+-АТФ-азы плазматической мембраны. 1 - три иона натрия связываются специфическим центром транслоказы; 2 изменение конформации транслоказы, вызванное присоединением 3Na+, приводит к активации каталитической субъединицы и увеличению сродства активного центра к субстрату (АТФ). Протекает реакция аутофосфорилирования по карбоксильной группе аспарагиновой кислоты; 3 аутофосфорилирование изменяет заряд и конформа-цию транслоказы, она закрывается с внутренней стороны мембраны и открывается с наружной, уменьшается сродство к ионам натрия и они диссоциируют от переносчика; 4 - Na+, К+-АТФ-аза открытая с наружной стороны мембраны имеет специфический центр связывания для 2К+; Присоединение двух ионов калия к фосфорилированной транслоказе вызывает изменение конформации и появление аутофосфатазной активности. Протекает реакция аутодефосфорилирования; 5 дефосфорилирование изменяет заряд и конформацию транслоказы, она закрывается с наружной стороны мембраны и открывается с внутренней, уменьшается сродство к ионам калия и они диссоциируют от Na+, К+-АТФ-азы; 6 - АТФ-аза возвращается в первоначальное состояние. активного транспорта ионов кальция; ее основные компоненты - кальциевые насосы Са2+-АТФ-азы и Na+,Ca2+-обменники. Са2+-АТФ-аза локализована не только в плазматической мембране, но и в мембране ЭР. Фермент состоит из десяти трансмембранных доменов, пронизывающих клеточную мембрану. Между вторым и третьим доменами находятся несколько остатков аспарагиновой кислоты, участвующих в связывании кальция. Область между четвёртым и пятым доменами имеет центр для присоединения АТФ и аутофосфорилирования по остатку аспарагиновой кислоты. Са2+-АТФ-азы плазматических мембран некоторых клеток регулируются белком кальмодулином. Каждая из Са2+-АТФ-аз плазматической мембраны и ЭР представлена несколькими изоформами. Работа Са2+-АТФ-азы цитоплазматической мембраны по стадиям представлена на рис. 520. Нарушение активности Са2+-АТФ-азы при патологии. Одна из причин нарушения работы Са2+-АТФ-азы - активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран. Окислению подвергаются как ацильные остатки жирных кислот в составе фосфолипидов, так и SH-гpyппы в активном центре фермента. Нарушение структуры липидного окружения и структуры активного центра приводит к изменению кон-формации АТФ-азы, потере сродства к ионам кальция и способности к аутофосфорилированию. АТФаза перестаёт выкачивать ионы кальция из цитозоля клетки, повышается концентрация внутриклеточного кальция, Са2+ усиливает мышечное сокращение, возрастает тонус мышечной стенки, что приводит к повышению АД. Не последнюю роль нарушение функционирования Са2+-АТФ-азы играет в развитии атеросклероза, рака, иммунных патологий. 2. Вторично-активный транспорт Перенос некоторых растворимых веществ против градиента концентрации зависит от одновременного или последовательного переноса Рис. 5-20. Последовательность событий в процессе работы Са2+-АТФ-азы. 1 связывание двух ионов кальция участком АТФазы, обращённой в цитозоль; 2 - изменение заряда и конформации фермента (АТФ-азы), вызванное присоединением двух ионов Са2+, приводит к повышению сродства к АТФ и активации аутофосфорилирования; 3 аутофосфорилирование сопровождается информационными изменениями, АТФ-аза закрывается с внутренней стороны мембраны и открывается с наружной; 4 происходит снижение сродства центров связывания к ионам кальция и они отделяются от АТФ-азы; 5 - аутодефосфорилирование активируется ионами магния, в результате Са2+-АТФ-аза теряет фосфорный остаток и два иона Мg2+; 6 - АТФ-аза возвращается в исходное состояние. другого вещества по градиенту концентрации в том же направлении (активный симпорт) или в противоположном (активный антипорт). В клетках человека ионом, перенос которого происходит по градиенту концентрации, чаще всего служит Na+. Примером такого типа транспорта может служить Na+,Са2+-обменник плазматической мембраны (активный антипорт), ионы натрия по градиенту концентрации переносятся в клетку, а ионы Са2+ против градиента концентрации выходят из клетки (рис. 5-21). По механизму активного симпорта происходят всасывание глюкозы клетками кишечника и реабсорбция из первичной мочи глюкозы, аминокислот клетками почек (рис. 522). Г. Перенос через мембрану макромолекул и частиц: эндоцитоз и экзоцитоз Траспортные белки обеспечивают перемещение через клеточную мембрану полярных молекул небольшого размера, но они не могут транспортировать макромолекулы, например белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды или ещё более крупные частицы. Механизмы, с помощью которых клетки могут усваивать такие вещества или удалять их из клетки, отличаются от механизмов транспорта ионов и полярных соединений. Эндоцитоз Перенос вещества из среды в клетку вместе с частью плазматической мембраны называют "эндоцитоз". Путем эндоцитоза (фагоцитоза) клетки могут поглощать большие частицы, такие как вирусы, бактерии или обломки клеток. Захват больших частиц осуществляется в основном специализированными клетками - фагоцитами. Поглощение жидкости и растворённых в ней веществ с помощью небольших пузырьков называют "пиноцитоз". Усвоение веществ механизмом эндоцитоза (пиноцитоза) характерно для всех клеток. Рис. 5-21. Натрий-зависимый транспорт ионов кальция. A - Na+-зависимый переносчик ионов кальция; Б - Na+, К+-АТФ-аза. воздействии на клетку специфического стимула. С помощью регулируемой секреции происходят выделение пищеварительных ферментов в период переваривания пищи, а также секреция гормонов, нейромедиаторов и других биологически активных веществ. Пример такого типа секреции - выброс пептидного гормона инсулина в кровь после еды. Стимулом к секреции инсулина, хранящегося в секреторных гранулах β-клеток островков Лангерханса поджелудочной железы, является повышение концентрации глюкозы в крови и β-клетках (рис.5-25). Рис. 5-22 Механизм активного симпорта. А Na+ и глюкоза связываются в разных центрах транспоказы. Ионы стремятся войти в клетку по градиенту концентрации и "тащат" глюкозу за собой, если концентрация Na+ вне клетки уменьшается, транспорт глюкозы в клетки снижается; Б - ионы натрия, проникающие в клетку вместе с глюкозой, "выкачиваются" обратно Nа+,К+АТФ-азой, поддерживающей градиент концентрации Na+ и контролирующей транспорт глюкозы. Цикл эндоцитоза начинается в определённых участках плазматической мембраны, называемых "окаймлённые ямки" (рис. 5-23). На долю окаймлённых ямок приходится всего 1-2% общей площади мембраны. Белок клатрин образует решётчатые структуры, связанные с углублениями на поверхности плазматической мембраны. Окаймлённые ямки втягиваются в клетку, сужаются у основания, отделяются от мембраны, образуя окаймлённые пузырьки (пиноцитозные пузырьки). Время жизни окаймлённых ямок невелико, они формируются в течение минуты, затем совершают цикл эндоцитоза. Вещества в составе пиноцитозных пузырьков не смешиваются с другими макромолекулами клетки. Они заканчивают свой путь в лизосомах, а мембранные компоненты пузырьков, содержащие клатрин, возвращаются в плазматическую мембрану. Эндоцитоз, происходящий с участием рецепторов, встроенных в окаймлённые ямки, позволяет клеткам поглощать специфические вещества. Макромолекулы или частицы связываются рецепторами и накапливаются в окаймлённой ямке. Затем следует погружение в клетку и отделение эндоцитозного пузырька, в составе которого находится поглощённое вещество, мембранные компоненты окаймлённой ямки и рецептор. В разные окаймлённые ямки могут быть встроены разные рецепторы. Белок полосы 3 Белок полосы 3 - белок цитоскелета эритроцита. Делеция гена белка полосы 3 делает мембрану эритроцита ригидной и защищает эритроциты от внедрения малярийных плазмодиев .Недостаточность этого белка наследуется аутосомнодоминантно и приводит к легкой анемии . Белок полосы 3 - это транспортный трансмембранный белок , который в пределах липидного бислоя находится в наиболее глобулярной конформации. Его полипептидная цепь пронизывает бислой несколько раз. Его молекулярная масса около 1ОО ООО и содержит небольшой углевод, выступающий на наружной поверхности клетки. Белок носит название полосы 3, поскольку при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии ДСН он занимает соответствующее положение относительно других белков. Белок полосы 3 принимает участие в переносе кислорода из легких к тканям и углекислого газа из тканей к легким . Находясь в легких , эритроциты избавляются от углекислого газа путем замены аниона НСО3 на анион Сl . В мембране есть специальный анионный канал для осуществления данного процесса. Газообмен может быть заблокирован с помощью специфического ингибитора, связывающегося с белком, формирующим этот канал. При использовании ингибитора, меченного радиоактивным изотопом, можно идентифицировать в мембране эритроцитов белок, образующий ионный канал . Таким белком оказался белок полосы 3. Пассивный транспорт полярных молекул через неполярный бислой трансмембранным белком полосы 3 происходит следующим образом: например, белок полосы 3 (или его димер) мог бы сформировать гидрофильный канал необходимого размера и заряженный соответствующим образом, что позволило бы ионам Сl и НСО перетекать через бислой по градиентам их концентраций. Однако маловероятно, что подобный транспорт может осуществлять молекула гликофорина , которая пронизывает бислой в виде простой аальфа-спирали. Можно полагать, что белки, непосредственно участвующие в активном или пассивном транспорте полярных молекул через мембраны, по способу ассоциации с липидным бислоем гораздо больше похожи на белок полосы 3, чем на гликофорин. Для того, чтобы понять механизм функционирования транспортных белков, необходима точная информация об их трехмерной структуре в составе бислоя. Единственнй мембранный транспортный белок, для которого подобные детали известны, это - бактериородопсин . Интегральный мембранный белок полосы 3 является переносчиком анионов (НСО3/С1 анионо-обменник, AE1 ). В цитоплазматическом домене белка полосы 3 выявлена последовательность Ala-Leu-LeuLeu-Lys, которая необходима для связывания анкирина с этим белком [ Jordan C. et al., 1995 ]. Примерно 40% всех мономеров белка полосы 3 в одном эритроците (около 400 тысяч молекул) характеризуется ограниченной вращательной подвижностью, что, повидимому, вызвано взаимодействием белка полосы 3 с цитоскелетом . Гомология в аминокислотной последовательности цитоплазматических доменов эритроцитарного и неэритроцитарного белка полосы 3 составляет около 35%, но есть очень консервативный участок, расположенный между аминокислотами 157-177. Первоначально предполагалось, что именно эта последовательность участвует в связывании анкирина [ Morrow J.S. et al., 1989 ]. Действительно, исследования с применением химерных молекул, образованных частью белка полосы 3 (AE1) и частью близкородственного ему эпителиального белка AE2, который не связывает анкирин, показали, что для связывания анкирина необходима последовательность, состоящая из 40 аминокислотных остатков (155-195) [ Ding Y. et al., 1996 ]. Однако было установлено, что для связывания анкирина с белком полосы 3 необходимы также первые 79 аминокислотных остатков в N-концевой части молекулы белка полосы 3, так как lелеция этого участка устраняет связывание анкирина, характеризующееся высоким сродством [Ding Y. et al., 1995]. Таким образом, анкирин взаимодействует как минимум с двумя участками молекулы белка полосы 3. Имеются данные о том, что анкирин связывается с белком полосы 3, когда он находится еще в эндоплазматическом ретикулуме или в первом компартменте аппарата Гольджи, и в таком виде встраивается в мембрану. За выход комплекса из мембран ретикулума отвечает, повидимому, именно анкирин [Morrow J.S. et al., 1989]. При исследовании влияния анкирина на олигомеризацию белка полосы 3 было установлено, что удаление анкирина приводит к постепенному превращению тетрамеров белка полосы 3 в димеры и далее в мономеры. Внесение избытка анкирина в такую смесь опять вызывает олигомеризацию белка полосы 3, в результате чего он вновь переходит в Рис. 5-23. Последовательность событий при образовании окаймлённого пузырька из окаймлённой ямки. Примером рецептор-зависимого эндоцитоза может служить поступление в клетку холестерола в составе липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) (рис. 5-24). Количество рецепторов в окаймлённой ямке плазматической мембраны варьирует в зависимости от потребности клетки в холестероле. Нарушение структуры рецепторов ЛПНП (мутации в гене) не позволяет им встраиваться в плазматическую мембрану в область окаймлённой ямки. Положение рецептора вне окаймлённой ямки не снижает его комгшементарность к ЛПНП, но эндоцитоз комплекса рецептор-ЛПНП не происходит. Экзоцитоз Макромолекулы, например белки плазмы крови, пептидные гормоны, пищеварительные ферменты, белки внеклеточного матрикса, липопротеиновые комплексы, синтезируются в клетках и затем секретируются в межклеточное пространство или кровь. Но мембрана непроницаема для таких макромолекул или комплексов, их секреция происходит путём экзоцитоза. Особенность экзоцитоза в том, что секретируе-мые вещества локализуются в пузырьках и не смешиваются с другими макромолекулами или органеллами клетки. В ходе экзоцитоза содержимое секреторных пузырьков выделяется во внеклеточное пространство, когда они сливаются с плазматической мембраной. В организме имеются как регулируемый, так и нерегулируемый пути экзоцитоза. Нерегулируемая секреция характеризуется непрерывным синтезом секретируемых белков, упаковкой их в транспортные пузырьки в аппарате Гольджи и переносом к плазматической мембране для Рис. 5-24. Положение рецепторов ЛПНП в цитоплазматической мембране. А положение рецепторов ЛПНП в окаймлённой ямке; Б - положение дефектных рецепторов ЛПНП вне окаймлённой ямки. секреции. Примером может служить синтез и секреция коллагена фибробластами для формирования межклеточного матрикса. Для регулируемой секреции характерны хранение приготовленных на экспорт молекул в транспортных пузырьках и их слияние с плазматической мембраной только при тетрамерное состояние. По-видимому, анкирин связывается не с димерами (как считалось ранее), а преимущественно с тетрамерами белка полосы 3. Кроме того, в результате диссоциации тетрамеров белка полосы 3 на димеры исчезает большинство анкирин-связывающих участков, расположенных на мембране эритроцита: в частности, утрачиваются все участки связывания анкирина с низким сродством (обеспечивающие быструю фазу связывания анкирина) и около половины участков связывания с высоким сродством (опосредующие медленную фазу связывания анкирина) [Van Dort H.M. et al., 1998]. Интегральный белок полосы 3 - белокпереносчик ионов С1- и НСО3- через плазматическую мембрану эритроцитов по механизму пассивного антипорта. Белок 3 может подвергаться множественным модификациям, с помощью которых регулируются его свойства. АТБ наиболее чувствителен к фосфорилированию тирозиназой, казеинкиназой, кальпаином. Белок 3 также может подвергаться протеолиз и дегликозилированию. Фосфорилирование тирозинкиназой N-терминального домена подавляет связывание с цитоскелетом и способно регулировать активность гликолитических ферментов на цитоплазматическом домене. Для нормальной транспортной активности белка 3 необходим Са2+-градиент мембраны, который определяет конформацию АТБ. При накоплении свободного Са2+ в цитоплазме анионтранспортная активности белка 3 падает. Вероятно, одним из путей регуляции анионного транспорта является цепь гликофорин-цитоскелет-цитоплазматический домен АТБ Специфическое метилирование белка 3 увеличивает проницаемость мембраны эритроцита для дивалентных катионов. Showe с соавт. (1987) картировали ген белка полосы 3 на 17q21 -qter. На посттранскрипционном этапе биосинтеза мРНК белка 3 содержит 3475 пар оснований, из которых только 911 кодируют первичную структуру анионтранспортного белка. Аминокислотные остатки Met664-Gln683 формируют трансмембранный сегмент АТБ. Последовательности Ser643-Met663 и Ile684Ser690 образуют соответственно вне- и внутриклеточные участки белка. Lux с соавт. (1989) показали, что эритроидный белок 3 имеет высокое сходство с другими анионными транспортерами в различных типах клеточных мембран и имеет 3 региона: гидрофобный цитоплазматический домен (1403 аминокислотные остатки), гидрофобный трансмембранный домен, формирующий анионный антипортер (404-082 аминокислотные остатки) и кислый Стерминальный домен с неизвесткой пока функцией (883-911 аминокислотные остатки). Согласно описанной авторами модели, белок 3 пронизывает толщу эритроцитарной мембраны 14 раз. Mueller и Morrison (1977), а также Hsu и Morrison (1985) сообщили о наличии двух биохимических вариантов анионного транспортера, отличающихся длиной Nтерминальной области белка. Оба варианта являются абсолютно нормальными и эритроциты по структурно-функциональным свойствам не отличаются. Palatnik с соавт. (1990) описали 3 фенотипа, основываясь на полиморфизме белка 3, большинство людей гомозигот имеют 60kD белок, а также у некоторых гетерозигот обнаруживался 60kD белок и гомозиготы с 63kD белком 3. Анионтранспортный белок найден в различных типах клеток: гепатоцитах, эпителиальных клетках, гладкомышечных клетках, кардиомиоцитах, клетках альвеол легких, лимфоцитах, почках, нейронах и фибробластах. белок также был обнаружен в мембранах ядра клетки, аппарата Гольджи, митохондрий. Lux с соавт. (1989) уточнили локализацию гена АТБ на 17q21-q22. Schofield с соавт. (1994) и Sahr с соавт. (1994) показали, что ген эритроидного АТБ имеет протяженность 18kb и состоит из 20 экзонов, разделенных 18 интронами. Кодирующая ДНК белка 3 содержит 4,906 нукпеотидов, за исключением поли-А участка. Охарактеризовано 2 неэритроидных гена АТБ. Tanner (1993) полагает, что эритроидный ген АТБ экспрессируется также в некоторых неэритроидных тканях, транскрипционная активность которых определяется различными тканеспецифическими промоторами. 4 источник На долю белка полосы 3 приходится около 25% общего количества мембранных белков эритроцита человека; сходные белки присутствуют также в неэритроидных клетках. Этот белок выполняет несколько функций, причем их можно соотнести с двумя основными доменами белковой молекулы. Nконцевая часть (41 000 Да) является гидрофильной и локализована с цитоплазматической стороны эритроцитарной мембраны. Она содержит места связывания для компонентов цитоскелета (анкирина), а также для ферментов гликолиза и гемоглобина. Этот домен можно удалить путем протеолиза, не затронув С-концевого домена (52 000 Да), который остается связанным с мембраной и опосредует Сl /НСО3 - обмен, а также образует канал в мембране, через который может проникать вода. Внецитоплазматический компонент этой части белка содержит также углеводные антигенные детерминанты нескольких систем групп крови. В мембране белок полосы 3 находится в форме димера или тетрамера. Было проведено клонирование и секвенирование участка ДНК, кодирующего белок полосы 3 из эритроцитов мыши. Эти данные послужили основой для построения модели белка полосы 3. Было высказано предположение, что он имеет 12 трансмембранных α-спиралей, при этом некоторые из них являются амфифильными. Экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу, получены только для нескольких участков полипептида и основаны главным образом на результатах протеолиза и локализации связанных углеводов. Обширные кинетические исследования согласуются с моделью с чередованием конформаций и одним местом связывания (см. рис.2). Однако скорость равновесного анионного обмена с помощью переносчика по меньшей мере в 104 раз превышает скорость транспорта как такового. Следовательно, незагруженный переносчик не претерпевает быстрых конформационных превращений, необходимых для того, чтобы анион мог связаться с мембраной. По данным ЯМР с использованием 35С1, у переносчика имеется единственное место связывания, и оно может быть обращено как внутрь, так и наружу. Результаты опытов с использованием ингибиторов транспорта тоже свидетельствуют о том, что в канале имеется единственное место связывания аниона, локализованное где-то в середине канала. При этом предполагается, что переход этого места связывания с одной стороны мембраны на другую блокируется неким "скользящим барьером", который перемещается вдоль канала в результате конформационных изменений. Лимитирующей стадией является конформационный переход нагруженного переносчика, но происходит он достаточно быстро, с частотой 105 с-1 при 37 °С. Повидимому, такая высокая скорость предотвращает значительные конформационные изменения в белке. Природа этого конформационного перехода и точная структура канала экспериментально не определены. Конформационный переход загруженного переносчика, лимитирующий весь транспортный процесс, лишь в очень малой степени зависит от мембранного потенциала. Это согласуется с таким конформационным переходом, в результате которого через мембрану перемещается 0,1 связанного с белком заряда. Если этот переход сопряжен с перемещением анионного субстрата, то он должен сопровождаться переносом противоиона, например заряженной аминокислотной группы. В отличие от этого потенциалзависимое конформационное изменение, индуцирующее открывание натриевого канала, приводит к результирующему перемещению через мембрану шести связанных с белком зарядов. Ядерные поры Обмен веществами между ядром и цитоплазмой клетки осуществляется посредством ядерных пор — транспортных каналов, пронизывающих двухслойную ядерную оболочку. Переход молекул из ядра в цитоплазму и в обратном направлении называется ядерно-цитоплазматическим транспортом. Структура Ядерные поры — это не просто перфорации, а сложно устроенные, многофункциональные регулируемые структуры, организованные приблизительно 30 белками — нуклеопоринами. Белковая составляющая ядерной поры обозначается термином «комплекс ядерной поры» (англ. nuclear pore complex, NPC). Масса комплекса ядерной поры колеблется в пределах от ~44 МДа в клетках дрожжей до ~125 МДа у позвоночных. По данным электронной микроскопии, ядерные поры в поперечном сечении имеют форму «восьмиспицевого тележного колеса», то есть имеют ось симметрии восьмого порядка. Эти данные подтверждает тот факт, что молекулы нуклеопоринов присутствуют в составе ядерной поры в количестве, кратном восьми. Проницаемый для молекул канал располагается в центре структуры. Комплекс ядерной поры заякорен на ядерной оболочке с помощью трансмембранной части, от которой к просвету канала обращены структуры, получившие название спиц (англ., spokes), по аналогии со спицами тележного колеса. Эта коровая часть поры, построенная из восьми доменов, с цитоплазматической и ядерной сторон ограничена соответственно цитоплазматическим и ядерным кольцами (англ., rings; у низших эукариот они отсутствуют). К ядерному кольцу прикреплены белковые, направленные внутрь ядра, тяжи (ядерные филаменты, англ., filaments), к концам которых крепится терминальное кольцо (англ., terminal ring). Вся эта структура носит название ядерной корзины (англ., nuclear basket). К цитоплазматическому кольцу также прикреплены направленные в цитоплазму тяжи — цитоплазматические филаменты. В центре ядерной поры видна электрон-плотная частица, «втулка» или транспортер (англ., plug). Нуклепорины, белки, из которых построены ядерные поры, делят на три подгруппы. К первой относят трансмембранные белки, заякоривающие комплекс в ядерной оболочке. Нуклепорины второй группы содержат характерный аминокислотный мотив — несколько раз повторенные FG, FXFG или GLFG — последовательности (так называемые FG-повторы, где F — фенилаланин, G — глицин, L — лейцин, X — любая аминокислота). Функция FG-повторов, повидимому, заключается в связывании транспортных факторов, необходимых для осуществления ядерно-цитоплазматического транспорта. Белки третьей подгруппы не имеют ни мембранных доменов, ни FGповторов, наиболее консервативны среди всех нуклеопоринов, их роль, по-видимому, заключается в обеспечении связывания FGсодержащих нуклепоринов с трансмембранными. Нуклеопорины также отличаются по своей мобильности в составе ядерной поры. Некоторые белки связаны с конкретной порой на протяжении всего клеточного цикла, в то время как другие полностью обновляются всего за несколько минут. Ядерно-цитоплазматический транспорт Ядерно-цитоплазматическим транспортом называется материальный обмен между Клеточное ядром и цитоплазмой клетки. Ядерно-цитоплазматический транспорт можно разделить на две категории: активный транспорт, требующий затрат энергии, а также специальных белков-рецепторов, и пассивный транспорт, протекающий путем простой диффузии молекул через канал ядерной поры. Пассивный транспорт Молекулы небольших размеров (ионы, метаболиты, мононуклеотиды и т. д.) способны пассивно диффундировать в ядро. Проводимость ядерных пор для молекул разных размеров различна. Белки массой менее 15 кДа быстро проникают в ядро, в то время как для белка массой более 30 кДа на это требуется определенное время. Белковые молекулы массой более 60-70 кДа, повидимому, вообще не могут пассивно проходить через ядерные поры. Активный транспорт Путём активного транспорта через ядерные поры могут проходить гораздо более крупные молекулы и целые надмолекулярные комплексы. Так, рибосомные субчастицы размерами до нескольких мегадальтон транспортируются из ядра в цитоплазму через ядерные поры, и нет никаких оснований предполагать, что процесс транспорта сопровождается частичной разборкой этих субчастиц. Системы активного транспорта обеспечивают весь макромолекулярный обмен между ядром и цитоплазмой. Молекулы РНК, синтезируемые в ядре, поступают через поры в цитоплазму, а в ядро попадают белки, участвующие в ядерном метаболизме. Причем одни белки должны поступать в ядро конститутивно (например, гистоны), а другие в ответ на определенные стимулы (например, транскрипционные факторы). У ядерных белков идентифицированы специальные последовательности, отвечающие за их локализацию. Самая распространенная из них, так называемый «классический» сигнал ядерной локализации — NLS (от англ., Nuclear Localization Signal), представляет собой один или два участка положительно заряженных аминокислот, аргинина и лизина. Транслокация белков в ядро, в отличие от транслокации в митохондрии и эндоплазматический ретикулум, не сопровождается отщеплением этой сигнальной последовательности и разворачиванием полипептидной цепи. NLSсодержащие белки, как и все другие субстраты систем ядерного транспорта, переносятся в ядро в комплексе со специальными белками — транспортинами или кариоферинами (англ., transportins, karyopherins). Каждый транспортин или комплекс транспортинов для осуществления своей функции должен обладать тремя активностями: во-первых, он должен узнавать и связывать транспортируемый субстрат, во-вторых, заякориваться на ядерной поре, и в-третьих, связывать небольшой белок — GTPазу Ran, относящуюся к семейству Ras-подобных ГТФаз и служащую для сопряжения транспорта с гидролизом ГТФ, что придает процессу необратимость (снабжает его энергией). Собственно акт гидролиза ГТФ осуществляется непосредственно этим белком. Фактор обмена нуклеотидов (англ., GTPase Еxchange Factor, GEF) для Ran, хроматинсвязывающй белок RCC1, локализован строго в ядре, а активаторы ГТФазной активности (англ., GTPase Activation Protein, GAP) RanGAP1 и некоторые другие белки — строго в цитоплазме. Эта асимметричная локализация приводит к формированию градиента: в ядре находится преимущественно ГТФ-связанная форма Ran, в цитоплазме, наоборот, ГДФсвязанная. Ran используется для снабжения энергией как процессов импорта, так и процессов экспорта различных субстратов, а вся схема носит название Ran-цикла (англ., Ran-cycle). Ran-цикл снабжает энергией и экспорт, и импорт, используя общий принципиальный механизм, ключевыми стадиями которого являются гидролиз ГТФ в цитоплазме и обмен ГДФ на ГТФ в ядре. Механизм импорта белков в ядро Рассмотрим механизм поступления субстратов в ядро на примере импорта NLS-содержащих белков. Первой стадией транспортировки является узнавание субстрата транспортинами, в данном случае комплексом импортинов-α/β (транспортины участвующие в транспорте в ядро называются импортинами, а из ядра — экспортинами). Затем образовавшийся комплекс заякоривается на белках ядерной поры с цитоплазматической стороны и транслоцируется через канал в ядро, где с ним связывается Ran-ГТФ, что вызывает диссоциацию комплекса и высвобождение груза. После чего импортины в комплексе с Ran-ГТФ направляются обратно в цитоплазму, где Ran под действием RanGAP1 гидролизует ГТФ (ГТФ => ГДФ + PO43-). Комплекс RanГДФ-импортины α/β нестабилен и диссоциирует. Ran-ГДФ поступает обратно в ядро при помощи собственного переносчика, димерного белка NTF2. В ядре под действием белка RanGEF, ГДФ в активном центре Ran заменяется на ГТФ и цикл, тем самым, замыкается. Механизм экспорта белков из ядра Теперь рассмотрим механизм экспорта из ядра на примере белков, содержащих сигналы ядерного экспорта (англ., Nuclear Export Signal, NES). Для этих сигнальных последовательностей характерно высокое содержание гидрофобных аминокислот. Первой стадией транспортировки здесь также является рецепция субстрата специфическим экспортином Crm1 (англ., Chromosome Region Maintenance) и образование комплекса. Главным отличием механизмов экспорта является тот факт, что в состав транслоцирующегося комплекса в случае экспорта помимо субстрата и Crm1 входит и Ran-ГТФ, то есть сопряжение с циклом Ran происходит на стадии транслокации, а не на стадии реимпорта рецептора. После прохождения через ядерную пору в цитоплазму Ran расщепляет ГТФ, комплекс теряет стабильность и диссоциирует, высвобождая груз.