Синтез, физико-химические свойства и механизм образования аминобутилиден-1,1-бисфосфоновой кислоты и её солей
реклама
Российский химико-технологический университет имени Д. И. Менделеева На правах рукописи Ильин Вадим Игоревич Синтез, физико-химические свойства и механизм образования 1-гидрокси-4аминобутилиден-1,1-бисфосфоновой кислоты и её солей 02.00.03 – Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва − 2010 год Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете имени Д.И. Менделеева Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Офицеров Евгений Николаевич Официальные оппоненты: доктор химических наук, вед. науч. сотрудник Вацадзе Сергей Зурабович доктор химических наук профессор Коротеев Михаил Петрович Ведущая организация: Учреждение Российской Академии наук Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН Защита состоится «17» декабря 2010 года на заседании диссертационного совета Д 212.204.04 в РХТУ им. Д. И. Менделеева (125047 г. Москва, Миусская пл., д. 9) в 12.00 в малом актовом зале им. А.П. Бородина. С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева. Автореферат диссертации разослан «__» ноября 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.204.04 Доктор химических наук, профессор Бухаркина Т.В. Общая характеристика работы Актуальность бисфосфоновые Гидроксилсодержащие проблемы. кислоты, в частности, аминоалкилиден-1,1- 1-гидрокси-4-аминобутилиден-1,1- бисфосфоновая (алендроновая, AleH) кислота, находят широкое применение в качестве экстрагентов при выделении радиоактивных элементов, в гидрометаллургии, сельском хозяйстве и, особенно, в медицине. Несмотря на большую мощность производства, совокупную прибыль от продаж (более 4 млрд. $ США ежегодно) и богатую историю изучения этого класса соединений, открытого научной группой Кабачника М.И. в 1978 году, получение лекарственных препаратов (ЛП) на основе этой группы соединений в РФ отсутствует. Для создания отечественных дженериковых ЛП на основе AleH и других аминогембисфосфоновых кислот необходима разработка и усовершенствование производственной схемы с точки зрения технологии, охраны окружающей среды, а также цены на готовую субстанцию. Необходимо отметить, что в научной литературе слабо проработаны как теоретическая, так и доказательная базы механизма реакции образования вышеописанных соединений. Индивидуальность физико-химических свойств каждой из 1-гидрокси-1,1-бисфосфоновых кислот предопределяет выбор и последующую разработку количественных и качественных методов физико-химического анализа последних как в виде фармацевтической субстанции, так и в составе готовой лекарственной формы (ГЛФ). В связи с этим, изучение механизма синтеза бисфосфонатов, а также их физико-химических свойств на примере алендроновой кислоты, является необходимым элементом в комплексе исследований по разработке и оптимизации производственного цикла при организации выпуска лекарственных препаратов для лечения остеопороза и других нарушений метаболизма костной ткани, что представляется важной прикладной задачей по обеспечению фармацевтической безопасности РФ. Цель работы. Настоящая диссертационная работа посвящена исследованию механизма реакции образования 1-гидрокси-4-аминобутилиден-1,1-бисфосфоновой кислоты, изучению её физико-химических свойств, а также решению задачи 3 комплексной разработки производственного цикла получения AleH как субстанции для выпуска дженерикового ЛП. Научная новизна работы. В ходе исследования механизма взаимодействия алканкарбоновых (в частности, 4-аминобутановой (ГАМК) и уксусной) кислот и PCl3 в среде метансульфоновой и фосфористой кислот впервые синтезированы, выделены и охарактеризованы новые, ранее не описанные в научной литературе соединения. Изучены отдельные стадии процесса фосфорилирования уксусной, фосфористой и метансульфоновой кислот: анализ результатов этих исследований позволяет судить об определённой направленности, лимитирующих факторах, а также необратимости отдельных процессов получения производных RCOOH и H3PO3, конденсация которых приводит к образованию фосфор-углеродной связи. Сделаны предположения о структуре таких производных, а также обобщён предполагаемый механизм образования P-C-связи как промежуточного этапа в синтезе 1-гидрокси-4аминобутилиден-1,1-бисфосфоновой кислоты. Методом ацетилхлорида 31 P-ЯМР из спектроскопии уксусной кислоты показано, и что в процессе синтеза трёххлористого фосфора, помимо фосфористой кислоты и её неполных хлорангидридов и ацетилпроизводных, образуется 1-ацетилоксиэтилиден-1,1-бисфосфоновая кислота, что, с одной стороны, проливает свет на фундаментальную проблему количественного образования ацилхлоридов из карбоновых кислот и PCl3, а с другой – даёт ключ к оптимизации и увеличению практических выходов RC(O)Cl в этой реакции. В ходе анализа образцов AleH, а также её мононатриевых солей методом ТГА опровергнуты существующие в литературе противоречивые данные о процессе плавления вышеописанных соединений. Предложены вероятные схемы последовательной трансформации последних при различных температурах. Сочетанием электрохимических методов и математического моделирования показано существование в растворах алендроновой кислоты при различных значениях pH ассоциатов разнообразного строения, имеющих собственные кислотно-основные свойства. Практическая значимость работы. Базируясь на данных исследования механизма реакции бисфосфорилирования RCOOH, предложены некоторые альтернативные производные (в частности, соли ГАМК с хлористоводородной и 4 метансульфоновой кислотами) аминокарбоновых кислот, использование которых позволяет увеличить выходы конечного продукта при внедрении схемы с применением апротонных растворителей в отсутствии H3PO3. На основании результатов изучения физико-химических свойств алендроновой кислоты разработан экспрессный и высокоэффективный аналитический метод капиллярного зонного электрофореза, рекомендуемый для качественного и количественного определения субстанции бисфосфоната и его основных примесей как в индивидуально чистой форме, так и в составе ГЛФ. Подобраны и оптимизированы реакционные условия синтеза 1-гидрокси-ωаминоалкилиден-1,1-бисфосфоновых кислот (на примере алендроновой кислоты), проведено масштабирование, а также составлены материальные балансы процесса получения AleH, а также процедуры рециклизации основных реагентов и растворителей, используемых в последнем. Применение разработанных схем позволяет снизить стоимость лечения социально-значимого заболевания не менее чем на 100% по сравнению с использованием оригинального препарата, что особенно важно для малоимущих слоёв населения преклонного возраста и детей школьного возраста, имеющих начальную стадию остеопороза – остеопению. Автор приносит благодарность Васяниной Л.К. (МПГУ, к.х.н., вед. науч. сотр.) и Орешкиной А.В. (МПГУ, к.х.н., доц.) за помощь в регистрации и последующей интерпретации спектров ЯМР и термогравиметрического анализа, Девятову Ф.В. (проф., д.х.н., КГУ им. В.И. Ульянова-Ленина) за вклад в изучение электрохимических свойств синтезированных продуктов, а также Тихонову В.П. (ОАО «ДИОД», ген. дир.) за финансовую поддержку работы. Апробация работы. По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи в научных журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ. Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: XXI международная конференция молодых учёных по химии и химической технологии “МКХТ-2007” (Москва, 14-17 ноября, 2007 г.), XV международная конференция по химии соединений фосфора (Санкт-Петербург, 25-30 мая, 2008 г.), Всероссийская конференция «Итоги и перспективы химии элементорганических соединений» (Москва, 28 сентября-2 октября, 2009 г.), XVIII Международная конференция по химии соединений фосфора (Вроцлав, Польша, 11-15 июля, 2010). 5 Cтруктура работы. Диссертационная работа изложена на 170 cтраницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и приложения, содержит 22 рисунка и 5 таблиц. Библиография насчитывает 207 наименования. Основное содержание работы 1. Обзор литературы. Литературный обзор построен по принципу разделения и анализа синтетических методов AleH на те, с помощью которых конструируется гембисфосфоновая структура, а также на те, с помощью которых эта структура химически модифицируется. Из них выделяются реакции Арбузова-Михаэлиса и Михаэлиса-Беккера, присоединение эфиров H3PO3 по кратной связи элементуглерод, взаимодействие производных карбоновых кислот с H3PO3 и PCl3, а также различные прочие методы, среди которых трёхкомпонентное взаимодействие ортоформиатов, диалкилфосфитов и вторичных аминов, а также конденсация фосфоноацеталей с ароматическими аминами и дериватами фосфинистой кислоты. 2. Некоторые новые данные о процессах, происходящих при синтезе 1-гидрокси-ω-аминоалкилиден-1,1-бисфосфоновых кислот. В настоящее время промышленный синтез AlеH основан на следующих схемах: H2N OH 3 H 2N B 6,4 eq. MSA t = 650C. T = 7-15h. O A OH 3 O C 3 O 1 eq. H3PO3 1,5 eq. PCl3 chlorobenzene t = 900C. T = 2-3h. OH H2N 1 eq. H3PO3 2eq. PCl3 1 eq. H3PO3 1,57 eq. PCl3 PEG-400, toluene t = 75-800C. T = 2-3h. O ... H 2O T = 3-5h. ... NaOH pH = 2,0 OH P H2N OH 3 OH P HO OH 78-85% O O ... H 2O T = 3-5h. ... Acetone H 2O OH P H2N OH 3 OH P HO OH 22-50% O O ... H2O T = 3-5h. ... Acetone H2O OH P H2N 3 HO P 60-63% O 6 OH OH OH Поэтому нами в рамках исследования взаимодействия стартовых реагентов и растворителей синтеза 1-гидрокси-ω-аминоалкилиден-1,1-бисфосфоновых кислот была проведена серия экспериментов по модельному потенциометрическому титрованию 4-аминобутановой кислоты соляной, фосфористой, и метансульфоновой кислотами. Необходимость выбора последних была продиктована их непосредственным участием в процессе бисфосфорилирования. Большинство предложенных методов синтеза алендроновой кислоты основано на аналогии с получением ОЭДФК (1-гидроксиэтилиден-1,1-бисфосфоновая кислота). Однако введение аминогруппы существенно изменило механизм образования бисфосфоната и сделало промышленный синтез в тех условиях, какие отличают получение ОЭДФК, невозможным. Дело в том, что на первой стадии в избытке PCl3 образуется ацилдихлорфосфит в виде соли: 2 PCl3 + NH2(CH2)3COOH Cl2POCO(CH2)3NH3 Cl + PCl 3 и реакция на этой стадии заканчивается. Как показано нами в отдельных опытах, образующийся ацилдихлорфосфит представляет собой в используемых растворителях (бензол, хлорбензол, толуол) сплошной сгусток, препятствующий перемешиванию и, как следствие, дальнейшему проведению процесса. В том случае, если к суспензии аминокислоты в вышеописанных растворителях прикапывают PCl3, то P[OCO(CH2)3N+H3Cl-]3, в этом который варианте отличается сначала большой образуется фосфит гидролитической устойчивостью и малой растворимостью. После добавления избытка трёххлористого фосфора в реакционной среде реализуется система реакций диспропорционирования с образованием продуктов: ClP[OCO(CH2)3N+H3Cl-]2 Cl2POCO(CH2)3N+H3Cl- Последние вступают в серию дальнейших превращений, о которых указано ниже. Поэтому в реакционную смесь вынуждены добавлять гидролизующие реагенты – кислоты, по силе сравнимые с HCl. В качестве такого реагента используют H3PO3. Однако, как обнаружено нами, эта кислота образует с ГАМК (4-аминомасляная кислота) соль состава 1:1. 7 Наличие перегибов и плато на представленной кривой титрования H3PO3 водным раствором ГАМК свидетельствует о взаимодействии собой: при титрования частицы этом в в первый растворе между момент присутствуют диссоциированной определяющие Рисунок 1. Кривая титрования раствора H3PO3 водным раствором ГАМК компонентов общее H3PO3, значение pH раствора, а также небольшое количество соли ГАМК*H3PO3. В ИК-спектре вышеописанные процессы выражаются в сдвиге νС=O протонированного карбоксила в сторону более высоких частот относительно таковых у ионизированного карбоксила (1720 см-1 в случае соли против 1580 см-1 у ГАМК), тогда как рентгено-структурный анализ свидетельствует о супрамолекулярности структуры полученной субстанции: в её основе лежат полимерные цепи, образованные за счет водородных связей фосфористой кислоты и протонов кватернизированного атома азота. Молекулы ГАМК образуют циклические димеры по типу «голова-хвост». Эти димеры уложены в стопки. Димеры в стопке между собой удерживаются водородными связями, образованными молекулами H3PO3. Образование вышеописанных структур также Рисунок 2. Димерная структура ГАМК в кристалле (данные РСА) не будет способствовать гомогенизации на начальной стадии смеси стартовых реагентов в неполярных, и, к тому же, апротонных растворителях, таких как толуол, хлорбензол, анизолы, ксилолы и пр. Очевидно, что для этих целей более подходящими будут являться полярные растворители-доноры протонов, - такие, как, например, алкилсульфокислоты, в частности, метансульфоновая кислота (МСК). МСК, будучи в «псевдоизбытке», и, к тому же, являясь более сильной кислотой, будет постепенно вытеснять более слабую фосфористую кислоту из её солей с ГАМК: 8 Образующаяся при этом соль D ведёт себя в последующих реакциях подобно уксусной кислоте. Являясь на два с половиной порядка слабее МСК , H3PO3 в смеси с метансульфоновой кислотой является основанием, вступая в реакцию нейтрализации с последней: (НО)2НР=О + HOSO2CH3 (НО)2НР+ --О--H + -OSO2CH3 1 eq. Таким образом, в реакционной смеси на момент добавления трёххлористого фосфора нет свободной фосфористой кислоты, а есть сопряженная кислота (НО)2НР+--О—H: pK МСК < pK (HO)3P+H < pK (HO)2P(O)H не диссоциирующая в среде метансульфоновой кислоты. Поэтому реакционная среда стартовых реагентов – сосредоточие двух нуклеофильных центров – аниона МСК, отличающегося довольно низкой нуклеофильностью, а также гидроксила карбоксильной группы аминокарбоновой кислоты, нуклеофила гораздо более сильного не только по отношению к метансульфонат-иону, но и даже цвиттер-иону ГАМК. На второй же стадии появляется ещё одна кислота – HCl. Изучение взаимодействия с компонентами стартовой смеси выделяющегося в процессе ацилирования аминокарбоновой кислотой PCl3 хлористого водорода показало, что, обладая поляризованной ковалентной связью, HCl способен давать комплексы с ионизированными группами и анионами. На примере H3PO3, образование таких структур можно показать следующим образом: Cl (HO)2 P H O + HCl (HO) 2P OH HCl (HO)2P OH Cl H Cl H H С одной стороны, представленную выше схему взаимодействия можно обосновать на основании данных матбалансных экспериментов, показавших, что всего лишь 62-66% от теоретически возможного количества хлористого водорода выделяется в ходе реакции бисфосфорилирования и последующего гидролиза из 9 реакционной массы в газоуловитель. С другой стороны, результаты исследования по потенциометрическому титрованию H3PO3 раствором HCl, свидетельствуют в пользу образования при различном соотношении фосфит/HCl ионных пар [P(OH)3H]+ [ClHCl]-n, имеющих различные электрохимические характеристики, такие как константы диссоциации, буферная емкость в водных растворах и др. Данные 31 P ЯМР-спектроскопии образца, содержащего фосфористую кислоту в присутствии избытка хлористого водорода, также подтверждают вышеприведенные предположения: в ЯМР-спектре присутствует чёткий и узкий сигнал с δ=4,82 (JP-H = 693 Гц) (Рис.3а), соответствующий H3PO3 с протонированной фосфорильной группой, стабилизированной в среде полярного апротонного растворителя, тогда как в случае отсутствия HCl (Рис.3б) сигнал с δ=7,94 (JP-H = 650 Гц) весьма уширен, что говорит о довольно быстром протонном обмене между свободной и протонированной фосфорильными группами (Рис.3): В основе синтеза гидроксилсодержащих гембисфосфоновых кислот лежит известная реакция получения RC(O)Cl из RCOOH и PCl3 при соотношении реагентов 3:1 с выходом, не превышающим 50-55%. Результаты, полученные при моделировании взаимодействия алканкарбоновых кислот с РCl3 (в качестве карбонильной А Б компоненты Рисунок 3. А) 31P-ЯМР Н3PO3 в МТБЭ + HCl; Б) 31P-ЯМР спектр H3PO3 в МТБЭ была взята CH3COOH) позволяют предположить, что на первой стадии реализуется схема, учитывающая катализ трёххлористого фосфора молекулами HCl и образование устойчивого к действию последнего ацилдихлорфосфита: PCl3 ... H-Cl ... H-Cl Cl 2P Cl...H...Cl + HCl Cl 2P Cl2P O C R Cl ... H-OSO2CH3 + H-Cl...H-Cl...H-OSO2CH3 O ... H-Cl 10 - + RCOOH Реакция ацидолиза, как и гидролиза P-Cl связи является автокаталитической. Каталитические свойства хлористого водорода в этой реакции вытекают из того факта, что, как было практически показано, ни PCl3, ни HCl в отдельности при комнатной температуре не расщепляют метилтретбутиловый эфир до метилдихлорфосфита или метанола, тогда как при их совместном применении в значительном количестве образуется CH3OPCl2: 200C O PCl 3 + HCl PCl 2 Образование подобных O + хлорангидридов MeOH HCl должно происходить и + t-BuCl в случае каталитического взаимодействия PCl3 и МСК: PCl3 + CH3SO2OH CH3SO2O-PCl 2 + HCl Однако, ни при комнатной температуре, ни при подогревании нам не удалось найти продуктов данной реакции в спектре 31 P-ЯМР эмульсионной массы смешения вышеописанных реагентов. Реакция образования галогенированных ацилфосфитов является обратимой. Смещение равновесия в правую сторону происходит за счет выведения смешанных ангидридов из равновесия. XPCl2 + AcOH H+ OC(O)CH3 + P Cl X HCl HCl 1 O Cl H X P X Cl P + AcCl OH X = -OC(O)Alk, -OC(O)Ar, -OSO2Alk Как можно видеть из представленных выше и ниже схем, это осуществляется посредством дальнейшего ацидолиза RC(O)PCl2 с образованием диацилхлорфосфитов и триацилфосфитов, гидролизуемых в дальнейшем хлористым водородом с образованием ацилхлоридов и неполных ангидридов фосфористой кислоты: 11 Cl X P OAc 2 AcOH + X H+ P + HCl OAc OAc 3 H O AcCl + O HCl P X H + P X OH AcCl OAc X = -OC(O)Alk, -OC(O)Ar, -OSO2Alk Как стадия 2, протекающая быстрее стадии 1, так и стадия образования XClPOAc проходят без протонирования атома P. Очевидно, что в присутствии избытка HCl, источником которого являются не только процессы ацидолиза, фосфо-эфирные связи смешанных ангидридов подвергаются расщеплению: Неполные ангидриды фосфористой кислоты E представляют собой исходные компоненты для получения активированных производных, содержащих трёхкоординированный атом фосфора: Cl H+ 3 Cl 2POH H+ O Cl P Cl 3 Cl P O O Cl H P P O O P Cl На наш взгляд, именно производные такого типа в процессе синтеза 1-гидрокси-ωаминоалкилиден-1,1-бисфосфоновых кислот способны при взаимодействии с другой активированной компонентой – RC(O)Cl образовать первую из двух необходимых PC-связей. В результате последующих реакций образуется не только H3PO3, как принято считать, а целая гамма кислот фосфора (Рис.4). Образование же неполных ангидридов возможно и из фосфористой кислоты и PCl3 при удалении HCl из сферы реакции. 12 Рисунок 4. 31P ЯМР-спектр реакционной массы синтеза ацетилхлорида 3. Синтез и физико-химические свойства 1-гидрокси-4-аминобутилиден-1,1-бисфосфоновой кислоты. Полученные на этапе исследования механизма реакции данные позволили целенаправленно перейти к оптимизации лабораторной и технологической прописей синтеза AleH. Для этого на этапе разработки промышленного регламента получения субстанции алендроната был проведен ряд экспериментальных исследований по синтезу последнего в среде различных растворителей (ПЕГ-400, хлорбензол, метансульфоновая кислота) с использованием патентных данных. Наиболее высокий практический выход конечного бисфосфоната получается при использовании в качестве растворителяреагента метансульфоновой кислоты (от 78% до 85%, см. стр.5). Кроме того, обсуждаемый метод характеризуется крайне высокой степенью воспроизводимости, в результате чего был легко масштабирован до килограммовых количеств пересчёте на конечную AleH. Полученные с применением метансульфоновой кислоты высокие процентные выходы объясняются бисфосфорилирования уникальными – выступать свойствами не столько последней в качестве в реакции полярного протонодонорного растворителя, сколько являться катализатором и реагентом, что, в частности, выражается в образовании реакционноспособных смешанных ангидридов, в дальнейшем легко присоединяемых к активированным производным фосфора P(III) с образованием P-C связи (Рис.5): 13 Рисунок 5. Каталитическая роль МСК в процессе синтеза AleH Уменьшение себестоимости конечной субстанции (МСК – дорогой реагент) удалось достичь, разработав лабораторный регламент процесса рециклизации основных реагентов и растворителей синтеза AleH, суть которого заключается в протонировании натриевой соли МСК хлористым водородом с последующим удалением NaCl в виду низкой растворимости концентрированной соляной кислоты (Рис.6). 14 последнего в среде Рисунок 6. Блок-схема процесса рециклизации основных реагентов и растворителей синтеза алендроновой кислоты Противоречивость данных относительно некоторых из физико-химических свойств AleH побудила нас детально исследовать особенности поведения её как субстрата при нагревании, а также в водных растворах при различных значениях pH, поскольку характеристики фазового перехода, а также титриметрические методы качественно-количественной оценки являются одними из основных, используемых в 15 Государственной Фармакопее для подтверждения подлинности субстанций, а проблема её биодоступности – проблема образования солей субстанции с Ca. Проведённые дериватографические испытания образцов показали, что AleH и её мононатриевая соль действительно не имеют точки плавления в интервале температур 20-450 °С (Рис.6), хотя в научной литературе приводятся: T. пл. AleH⋅H2O, °С: 228-235 Т. пл. AleNa⋅3H2O, °С: 257-262,5 Сравнение кривых ТГ и ДТА (Рис.7) позволяет сделать вывод о том, что при нагревании кристаллы исследуемых соединений претерпевают ряд структурных процессов. При нагревании образцов до 100-110 °С происходит Рисунок 7. Дериватограмма кристаллов алендроновой кислоты (ТГА). Величина эндоэффекта при 220°С по сравнению с эндоэффектом удаления молекулы кристаллизационной воды свидетельствует об образовании макроэргической связи. выделение одной молекулы кристаллизационной воды. При дальнейшем нагревании до температуры 220-240 °С происходит потеря одной молекулы воды от двух молекул алендроната с образованием симметричного P-O-P-ангидрида G: R = (СH2)3NH3+; И, наконец, при температурах выше 300 °С происходит потеря ещё трёх молекул воды образцом. Предположительно, при этом образуется ангидрид, содержащий два фосфазеновых цикла: 16 Результаты исследований позволяют заключить, что для ряда бисфосфоновых кислот такая характеристика, как температура плавления в действительности не отражает протекающего при этом фазового перехода. Поэтому её как параметр оценки подлинности при разработке фармакопейных статей на субстанции, в частности, алендроновой кислоты и её натриевых солей использовать нельзя. В водных растворах AleH ведёт себя как сильная органическая кислота с pKa по первой ступени, а потому существует в цвиттер-ионной форме. При обработке щелочами образует соли в соотношении 1:1 и 1:2, что, в диапазоне значений pH от 2 до 12 при проведении потенциометрического титрования характеризуется двумя точками эквивалентности. Наши попытки получить и выделить в индивидуально чистом виде описанные в литературе три- и тетранатриевые соли алендроновой кислоты закончились неудачей: вместо этого мы имели смеси моно- и ди-, в одном случае, и ди- и тринатриевых солей - в другом в различном процентном соотношении. Математическое моделирование кривых потенциометрического титрования водных растворов AleH показало, что, помимо наличия традиционных кислотных форм разной степени диссоциации в воде имеют место комплексные явления, выражающиеся в образовании ассоциативных форм, по сути являющихся самостоятельными соединениями с присущими им индивидуальными физикохимическими характеристиками: 17 O O P H2N HO P O - (H4L±)2 O O P HO OH OH P * H3N P O OH OH OH 2 O P HO OH O HO 2 (L ) 2 H3N H3N O 4- O P - O O O O O OH O - P H3N OH O - HO OH O O P P OH O (H3L+,2-)2 O P H3N -* HO P O H3N HO OH O P H3L+,2-*H 2L+,3- HO P O O- - O - O O - P * H3N HO O HO P OH O 2 O O- O- - (H2L+,3-)2 OH O 2 O P H3N HO P O (HL+,4-)2 O O - P O O P H3N O P OH O O O O P OH O O H3N H4L±*H 3L+,2- O 2 - O O - - O 2 (H2L+,3-)2*HL+,4- Состав ассоциатов и характеристики вышеописанных диссоционных процессов, определяющих как конечную точку титрования, так и, в конечном итоге, интерпретацию данных, полученных в ходе титрования, сильно зависят от концентрации исходной формы 1-гидрокси-4-аминобутилиден-1,1-бисфосфоновой кислоты, а потому требуются дальнейшие исследования физико-химических свойств AleH в водных растворах, предшествующие внедрению титриметрических методов для количественной оценки алендроновой кислоты и её натриевых солей в составе фармацевтической субстанции. Разработка методов количественно-качественного анализа - актуальная задача, которую необходимо решать в процессе производства субстанции и выпуска лекарственного препарата на рынок. 18 Разработанный для решения этой задачи нами при тесном сотрудничестве с кафедрой аналитической химии МГУ (чл.-корр. РАН, Шпигун О.А.) метод капиллярного зонного электрофореза низким (КЗЭ) пределом исключения (Рис.8) обнаружения компонентов характеризуется для маточного всех без раствора, таких как хлорид-, фосфит-, метансульфонат-, фосфат-ионов, а также анионов γ-аминомасляной и Рисунок 8. Электрофореграмма модельной смеси ионов. Полимер – 3,6-ионен. Пики: 1 - Cl-, 2 - H2PO3-, 3 - H2PO4-, 4 - CH3SO3-, 5-AleH. Концентрации всех ионов – 20мг/л. алендроновой кислот, наравне с ВЭЖХ обладает необходимой селективностью количественной детекции следов целевой компоненты на фоне повышенного содержания в маточнике иного иона и характерной для аналитических методов воспроизводимостью, однако отличается от первой более высокой степенью экспрессности и разделения, меньшей трудоёмкостью и стоимостью анализа. Описанный выше метод физико-химического анализа был использован в ходе разработки методологии синтеза алендроновой кислоты и её солей с целью определения чистоты и подлинного полученного продукта, а также при исследовании направлений и путей рециклизации основных растворителей и реагентов синтеза для оценки количественных характеристик компонент продуктовых и маточных растворов и составления материальных балансов по ним. Разработанная схема (Рис.6), исходя из данных КЗЭ, позволяет на 98% очистить маточный раствор от ионов натрия, более чем 75% от изначально взятых в реакцию количеств метансульфоновой и Н3РО3 вернуть в рецикл, и, что наиболее важно, сохранить до 15% от получаемой AleH. Как следствие, применение вышеописанной стратегии позволяет снизить конечную стоимость субстанции на 70-80%, что, в купе с использованием эффективной схемы синтеза с применением МСК позволяет получать субстанцию AleH по цене, не превышающей 15 тыс. руб. за 1 кг., что в 2 раза меньше среднерыночной (30-35 тыс.руб., по данным базы данных «Chemical Abstracts»), и, следовательно, значительно уменьшить стоимость ЛП на её основе. 19 Основные результаты и выводы 1. Реакционная система синтеза алендроновой кислоты характеризуется сложностью и многочисленностью образующихся как побочных, находящихся в равновесии с исходными, так и промежуточных соединений. Так, например, при смешении фосфористой и 4-аминомасляной кислот в ходе реакции реализуется комплексное взаимодействие, выражающееся в образовании соли, имеющей супрамолекулярное «псевдополимерное» строение (что доказано методом РСА), определяющее её сольватацию в присутствии протонных полярных растворителей. 2. Фосфористая кислота в присутствии метансульфоновой кислоты и HCl ведёт себя как основание, а потому в растворах последних существует в виде сопряжённой кислоты и не может выступать в качестве нуклеофила при фосфорилировании производных карбоновых кислот, как принято считать в научной литературе. 3. Образование хлористого ацетила как промежуточного продукта при бисфосфорилировании есть результат многоступенчатого ацидолиза карбоновых кислот, катализируемого HCl и проходящего через равновесную стадию образования ацилдихлорфосфитов, атом фосфора в которых имеет высокий потенциал ионизации, а потому не способен к образованию квазифосфониевых производных. 4. Ряд исследованных 1-гидроксиаминоалкилиден-1,1-бисфосфонатов, в частности, алендроновая кислота, при нагревании претерпевают последовательные изменения в своей структуре, характеризующиеся образованием производных, содержащих фосфоангидридные связи. 5. Сочетанием методов рН-метрии и математического моделирования равновесных систем показано, что кроме традиционных форм H4L±, H3L+,2−, H2L+,3−, HL+,4−, L4− в водных растворах алендроновой кислоты образуются ассоциаты, проявляющие собственные, отличные от других, кислотно-основные свойства. 6. На основании результатов, полученных в ходе отработки и масштабирования схемы получения алендроновой кислоты с применением МСК, составлены лабораторные и опытно-промышленные регламенты синтеза AleH, а также процесса рециклизации основных реагентов и растворителей, используемых в процессе бисфосфорилирования. 20 7. По результатам исследования физико-химических свойств AleH предложен и, в последующем, разработан метод высокоэффективного капиллярного электрофореза для количественной и качественной оценки конечного продукта в соответствии с фармакопейными требованиями. Основное содержание работы изложено в следующих публикациях: 1. Офицеров Е.Н., Ильин В.И., Коваленко Л.В. Химия фосфорорганических соединений. Часть 1. Реакция Михаэлиса-Арбузова в синтезе алкилидендифосфоновых кислот и их производных // Бутлеровские сообщения, 2007, 12, 1. 2. Свидрицкий Е.П., Цзян М.Ш., Ильин В.И., Дыньков Д.И., Пирогов А.В., Шпигун О.А. Определение алендронат-иона и ряда неорганических ионов методом капиллярного электрофореза // Вестник МГУ, Серия 2. Химия, 2010, 51, 53. 3. Ilin V.I., Ofitserov E.N., Kovalenko L.V. 1-Hydroxyalkylidene-1,1-bisphosphonates. Synthesis and Physico-chemical Properties//Тез. докл. «XVIIIth International Conference On Phosphorus Compounds» (11-15 July 2010, Wroclaw, Poland), 2010, p.50. 4. Devyatov F.V., Ignat’eva K.A., Ilin V.I., Ofitserov E.N. Acid-Base Properties and Association Equilibria in Alendronic Acid Water Solutions // Тез. докл. «XVIIIth International Conference On Phosphorus Compounds» (11-15 July 2010, Wroclaw, Poland), 2010, P2.03.29 (p.149). 5. Ильин В.И., Офицеров Е.Н., Коваленко Л.В. Особенности процесса регенерации и рециклизации реагентов и растворителей синтеза 1-гидрокси-ω-аминоалкилиден1,1-бисфосфоновых кислот//Тез. докл. Всеросс. конф. «Итоги и перспективы химии элементорганических соединений» (2009, Москва), 2009, С.41. 6. Ильин В.И., Орешкина А.В., Офицеров Е.Н., Коваленко Л.В. Термическое поведение 1-гидрокси-4-аминобутилиден-1,1-бисфосфоновой (алендроновой) кислоты и её натриевой соли // Успехи химии и химической технологии, 2007, XXI, 75. 7. Москва В.В., Офицеров Е.Н., Исмагилов Р.К., Ильин В.И., Литвинов И.А., Коваленко Л.В. Фосфористая кислота как синтон в синтезе супрамолекулярных протонных проводников // Тез. докл. «XV-ой Международной конференции по химии соединений фосфора» (25-30 мая 2008, Санкт-Петербург), СанктПетербург, 2008, Р-90 (С.401). 21