СОДЕРЖАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ КИСЛОТ В

ÁÞËËÅÒÅÍÜ ÂÑÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ, 2010, ¹ 3 (73)
УДК 615.322–038:615.243.3
П.Б. Лубсандоржиева
СОДЕРЖАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ КИСЛОТ В МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СБОРАХ
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ
В 6 сборах для лечения и профилактики заболеваний органов пищеварения определено количественное
содержание фенолокислот. Фенолокислоты очищали на колонке с алюминия окисью, элюируя 95%
этанолом. Метод позволяет определить содержание фенолокислот и арбутина в одной аналитической
пробе в некоторых сборах. Сопоставимые значения количественного содержания фенольных кислот
можно получить при разделении кислот от флавоноидов (хроматоспектрофотометрический метод)
и экстракции кислот при рН 2.0 (экстракционно-спектрофотометрический метод).
Ключевые слова: растительные сборы, фенолокислоты
THE CONTENT OF PHENOLIC ACIDS IN MULTY-COMPONENTAL HERB TEAS
P.B. Lubsandorzhieva
Institute of General and Experimental Biology SB RAS, Ulan-Ude
The quantitave determination of phenolic acids was defined in 6 multy-componental herb teas for treatment
and prevention of gastroenteropathy. The phenolic acids were separated using aluminium oxide column by
elution with 95 % ethanol. The chromato-spectrophotometric method allows to define the phenolic acids and
arbutin contents in one analytical test of some herb teas. The comparable data of quantitative content of phenolic acids can be received by acids separation from flavonoids (chromato-spectrophotometric method) and
by acids extraction at pH 2,0 (extracting-spectrophotometric method) separation from acids.
Key words: herb teas, phenolic acids
Фенольные кислоты (ФК) встречаются в растениях в свободном (агликоны) и связанном (эфиры,
гликозиды, комплексы с полисахаридами) виде,
являются материалом для синтеза более сложных
фенольных соединений, а также, продуктами их
разложения. ФК, как и большинство фенольных соединений широко метаболизируются в желудочнокишечном тракте (ЖКТ) in vivo, в основном, в ходе
прохождения через тонкий кишечник, под воздействием кишечной микрофлоры, и в печени [8]. В результате метаболизма ФК происходит значительная
деформация их окислительно-восстановительного
потенциала. Метаболиты ФК имеют низкую антиоксидантную активность (АОА), потому что радикалперехватывающие гидроксильные группы
блокируются метилированием, сульфатированием,
глюкуронидацией. ФК могут оказывать благоприятное воздействие до абсорбции, защищая ЖКТ
от воздействия патогенных агентов (активированных кислородных метаболитов, канцерогенных
веществ, высвобождаемых из пищевой матрицы и
т. д.) [10, 11, 13]. Степень протективного действия
ФК зависит от биодоступности, о которой можно
судить по абсорбционной способности веществ.
Наибольшей биодоступностью обладают свободные
ФК, имеющие более высокую абсорбционную способность по сравнению со связанными ФК [9, 15].
Для количественного анализа ФК используются, в основном, методы ВЭЖХ [14]. При отсутствии
дорогостоящего оборудования ВЭЖХ наиболее
распространенными методами для количественного анализа ФК являются хроматоспектрофотометрический [4, 6, 7], спектрофотометрический [1, 2,
3, 5], фотоколориметрический [12] методы.
Цель данной работы – определить содержание свободных фенольных кислот в многокомпонентных сборах, предназначенных для лечения
заболеваний органов пищеварения хроматоспектрофотометрическим методом.
МЕТОДИКА
В состав сбора № 1 для лечения и профилактики гиперлипидемии входят черные листья
B. сrassifolia, цветки Matricaria recutita L., трава
Polygonum aviculare L., плоды Rosa L. и Crataegus
L., корни A. calamus L. и Taraxacum officinale Wigg.
В состав сбора № 2 для лечения патологического
влечения к алкоголю входят корни Acorus calamus
L., трава Achillea millefolium L., Thymus vulgaris L.,
цветы Tanacetum vulgaris L., листья Urtica dioica L.
В состав сбора № 3 для лечения и профилактики
язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки
входят цветки Calendula officinalis L., плоды Rosa,
Crataegus, Hippophae rhamnoides L., Coriandrum
sativum L., корневища Inula helenium L. и Glycyrrhiza
glabra L., трава Gnaphalium uliginosum L.s.l., листья
Plantago major L. В состав сбора № 4 для лечения
алкогольного гепатита с сопутствующим колитом
входят черные листья и корни Bergenia сrassifolia
(L.) Fritsch., листья M. piperita L., цветки Calendula
officinalis L., побеги Pentaphylloides fruticosa (L.)
Schwarz, M., корни Scutellaria baicalensis Georgi.
В состав сбора № 5 для лечения и профилактики
хронического колита входят черные листья B.
сrassifolia, листья M. piperita, цветки M. recutita,
трава A. millefolum L. В состав сбора № 6 для лечения
алкогольного гепатита и абстинентного синдрома
входят листья Vaccinium vitis-idaea L. и Mentha pi-
Экспериментальные исследования в биологии и медицине
241
ÁÞËËÅÒÅÍÜ ÂÑÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ, 2010, ¹ 3 (73)
perita L., трава Gnaphalium uliginosum L.s.l., плоды
Rosa и Crataegus, корневища Inula helenium L., кор����
ни Eleutherococcus senticosus Rupr. Et Maxim.
Количественное определение ФК в сборах
проведено хроматоспектрофотометрическим
методом после очистки извлечений на окиси алюминия (методика 1). Для выбора стандарта были
сняты спектры поглощения аналитических проб в
области 200–360 нм. Для сравнения количественное определение ФК провели экстракционноспектрофотометрическим методом после извлечения ФК этилацетатом в кислой среде (методика 2)
[5] и прямым спектрофотометрическим методом
(методика 3).
Методика 1. Около 3,0 г (точная навеска) сбора
экстрагировали 50 мл 70% спирта этилового на кипящей водяной бане с обратным холодильником в
течение 1 ч. Экстракцию повторили с 50 мл спирта
в тех же условиях в течение 30 мин. Извлечение отфильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл,
довели до метки 70% спиртом (раствор А).
Раствор А упаривали на роторном испарителе
для удаления спирта, водный остаток сгущали до
5 мл, помещали в мерную пробирку вместимостью
20 мл, довели 96 % спиртом этиловым до метки. Выпавшие в пробирке полисахариды отфильтровали,
фильтрат довели до метки (20 мл) 96% спиртом. 1 мл
фильтрата помещали в колонку с 2 г окиси алюминия, элюировали 25 мл 96% спирта этилового, затем
измеряли оптическую плотность элюата.
Методика 2. Раствор А упаривали на роторном
испарителе для удаления спирта, водный остаток
сгущали до 10–15 мл. Водный остаток раствора А
(10–15 мл) переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, довели буферным раствором (рН 2,0) до
метки (раствор Б). 10 мл раствора Б экстрагировали
четырехкратно в делительной воронке 10 мл этилацетата. Этилацетатные извлечения объединили,
отфильтровали через безводный натрия сульфат,
растворитель удалили на роторном испарителе,
сухой остаток растворили в 96% спирте этиловом
и количественно переносили в мерную пробирку
вместимостью 10 мл, затем измеряли оптическую
плотность раствора.
Методика 3. Около 3,0 г (точная навеска) сбора
экстрагировали гексаном по 10 мл трехкратно при
комнатной температуре для удаления липофильных веществ, шрот высушивали. Высушенный
шрот экстрагировали 30 мл 70% спирта этилового
на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин, затем экстракцию повторили
дважды при тех же условиях. Извлечения отфильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл,
довели спиртом до метки и измеряли оптическую
плотность раствора.
Для качественного обнаружения фенолокислот
аналитические пробы (10–25 мл) концентрировали до 1–2 мл, хроматографировали на бумаге
(БХ) в системе растворителей: I – 15% уксусная
кислота; II – бутанол – уксусная кислота – вода
(4:1:2); пластинках с силикагелем (ТСХ) в системе
растворителей III������������������������������
���������������������������������
– гексан – этилацетат – муравьиная кислота (15:9:2). Использованы достоверные
хроматографически чистые образцы феруловой,
кофейной, хлорогеновой кислот, проявляющие
реагенты – пары аммиака, 5% раствор калия гидроксида в спирте этиловом, диазореактив (для
проявления ФК), реактив Паули (для проявления
арбутина), 5% спиртовой раствор алюминия хлорида (для проявления флавоноидов). Данные опытов
приведены в таблицах 1, 2.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Хроматографическое изучение извлечений
сборов, очищенных на окиси алюминия показало
наличие от 2 (сбор № 5) до 5 (сбор № 3) ФК на бумажной хроматограмме (табл. 1). С достоверными
образцами обнаружено присутствие феруловой
кислоты с R f 0,46 – 0,50 (�����������������������������
I����������������������������
) в сборе № 1, 3 и 4; кофейной кислоты с R f 0,20 – 0,28 (I) и 0,50 – 0,54 (III) в
сборах № 2, 5 и 6; хлорогеновой кислоты с R f 0,48 –
0,51 (I) / 0,51 (II) и 0,30 (III) в сборах № 2 и 6.
Максимумы поглощения в УФ спектре элюатов
сборов № 1, 3 и 4 при 318 нм совпадают с полосой
поглощения феруловой кислоты, в элюатах сборов
№ 2 и 5 полоса поглощения при 325 нм совпадают
с таковой кофейной кислоты. Для определения
количественного содержания ФК использова-
Таблица 1
Результаты количественного определения фенолокислот в сборах хроматоспектрофотометрическим методом
Наименование
УФ-спектр извлечения,
очищенного на окиси
алюминия, нм
Сбор 1
275, 283, 318
Сбор 2
272, 280, 325
Сбор 3
272, 318
Сбор 4
272, 283, 318 пл
Сбор 5
275, 283, 325
Сбор 6
275, 285, 328
Зоны веществ на хроматограмме, Rf
в системе растворителей
фенолокислот
примеси
Фенолокислоты,
в пересчете на феруловую
кислоту, %
0,35 (I); 0,50 (I); 0,30 (I)
0,78 (I)
0,193 ± 0,007
0,28 (I); 0,30 (I); 0,80 (I)
0,15 (I)
0.168 ± 0,002*
0,30 (I)
0,258 ± 0,002
0,20 (I); 0,78 (I)
0,470 ± 0,004
0,78 (I) / 0,38 (II)
0,212 ± 0,003*
БХ: 0,78 (I)
0,312 ± 0,003**
БХ: 0,15 (I); 0,40 (I); 0,50 (I);
0,65 (I); 0,80
0,62 (I)/0,66 (II); 0,46 (I)/0,70
(II)
0,20 (I)/0,85 (I); 0,45 (I)/0,90
(II); ТСХ: 0,50 (III); 0,70 (III)
0,48 (I); 0,32(I); 0,35 (I);
0,40(I);
ТСХ: 0,50 (III); 0,30 (III)
Примечание: * – в пересчете на кофейную, ** – на хлорогеновую кислоты; I, II, III – пояснения в тексте.
242
Экспериментальные исследования в биологии и медицине
ÁÞËËÅÒÅÍÜ ÂÑÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ, 2010, ¹ 3 (73)
Таблица 2
Содержание фенолокислот в сборах, определенное разными методами
Сбор 1
Сбор 2
Сбор 3
Методика 2
Фенолокислоты, %
0,176 ± 0,01
0,166 ± 0,01
0,265 ± 0,002
Флавоноиды, %
0,160 ± 0,01
0,07 ± 0,01
0,21 ± 0,01
0,45; 0,35; 0,30
0,30; 0,50; 0,70
0,15; 0,18; 0,20; 0,40; 0,65; 0,75
0,214 ± 0,01
0,364 ± 0,001
Зоны фенолокислот на хроматограмме,
R f в системе растворителей (III)
Методика 3
Фенолокислоты, в пересчете на
феруловую кислоту, %
Флавоноиды, в пересчете на рутин, %
Зоны фенолокислот на хроматограмме,
R f в системе растворителей (I/II)
0,325 ± 0,01
0,320 ± 0,01
0,21 ± 0,01
0,62 ± 0,01
0,05/0,2; 0,35/0,2;
0,3/0,3; 0,45/0,05
0,33/0,83; 0,42/0,82
0,44/0,90; 0,5/0,5
0,55/0,4; 0,23/0,78; 0,26/0,88;
0,05/0,95; 0,2/0,65; 0,35/0,9; 0,6/0,22
ны удельные показатели поглощения феруловой кислоты при 318 нм, равный 910; кофейной
кислоты при 325 нм, равный 950 нм [4, 6]. В УФ
спектре элюатов сбора № 6 присутствует полоса
поглощения при 328 нм, совпадающая с таковой
хлорогеновой кислоты. С учетом доминирования
пятна хлорогеновой кислоты на хроматограмме
элюата, для определения содержания ФК в сборе
№ 6 использован удельный показатель поглощения
хлорогеновой кислоты в 95% спирте этиловом при
325–327 нм, равный 507 [3].
С реактивом Паули на хроматограмме элюатов сборов № 1, 4, 5 и 6 проявляется арбутин с Rf
0,78 (I) / 0,38 (II). В области 290–300 нм находится
минимальный экстремум в УФ спектре элюатов,
т.е. полоса поглощения арбутина при 283–285
нм не перекрывает полосу поглощения ФК и не
мешает их определению. При обработке хроматограмм парами аммиака и раствором алюминия
хлористого проявляются примеси флавоноидов с
Rf 0,15 (I) в сборе № 2, Rf 0,20 (I) в сборе № 4, Rf 0,30
(I) в сборе № 3.
В таблице 2 приведены данные количественного определения ФК в сборах № 1–3 прямым
спектрофотометрическим и экстракционноспектрофотометрическим методами. Второй метод предусматривает 93–94%-ный переход ФК в
этилацетатный слой при рН 2.0 [2, 5].
Метод прямого спектрофотометрирования
отличается невысокой избирательностью и точностью из-за высокого содержания флавоноидов,
имеющих полосы поглощения в области поглощения ФК. Общее содержание флавоноидов в сборах
составляет: в сборе № 1 – 0,56 %; в сборе № 3 –
0,98 % в пересчете на рутин; в сборе № 2 – 1,25 % в
пересчете на лютеолин. В УФ спектре аналитических проб (методика 2 и 3), полученных при добавлении раствора алюминия хлористого присутствует
полоса поглощения флавоноидов при 390–395 нм
(сбор № 2), 410 нм (сборы № 1 и 3). Выход флавоноидов в извлечениях, полученных по методике 3
составляет 16,8 % (сбор № 2), 57 % (сбор № 1), 63 %
(сбор № 3) от общего содержания флавоноидов в
сборах, соответственно. На двумерной бумажной
хроматограмме спиртовых извлечений (методика
3), обработанных раствором алюминия хлористого
обнаружены окрашенные зоны флавоноидов: сбор
№ 1 – 6 веществ, сбор № 2 – 4 вещества, сбор
№ 3 – 7 веществ. Количественное определение
ФК, определенное методом прямого спектрофотометрирования дает завышенные значения по
сравнению с хроматоспектрофотометрическим
методом: в сборе № 1 – на 68 %, в сборе № 2 – на
27 %, в сборе № 3 – на 41 % соответственно.
Экстракция ФК этилацетатом при рН 2,0 (методика 2) дает более сопоставимые значения их количественного содержания с данными, полученными
при разделении кислот окиси алюминия (методика 1). При экстракции этилацетатом флавоноиды
переходят в органический слой на 28 % (сбор № 1),
на 5,4 % (сбор № 2), на 21,4 % (сбор № 3) от общего
содержания в сборах соответственно.
Таким образом, в разработанных сборах для
лечения и профилактики заболеваний органов
пищеварения содержатся фенольные кислоты, в
присутствии достоверных образцов в извлечениях
сборов обнаружены феруловая, кофейная, хлорогеновая кислоты. При использовании методов прямого спектрофотометрирования, экстракционноспектрофотометрического и хроматоспектрофотометрического установлено, что сопоставимые
значения количественного содержания фенольных
кислот можно получить при их разделении от флавоноидов методом колоночной хроматографии
(методика 1) и экстракции органическим растворителем при рН 2.0 (методика 2). Метод позволяет
определить содержание фенолокислот и арбутина в
одной аналитической пробе в некоторых сборах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Количественное определение суммы флавоноидов и гидроксикоричных кислот в почках
некоторых видов Populus L. / В.Б. Браславский,
В.А. Куркин, Г.Г. Запесочная, Н.А. Безрукова
// Растит. ресурсы. – 1991. – Т. 27, вып. 3. –
С. 130–134.
2. Косман В.М. Количественное экстракционноспектрофотометрическое определение суммарного
содержания гидроксикоричных кислот в присутствии флавоноидов в экстрактивных веществах
Экспериментальные исследования в биологии и медицине
243
ÁÞËËÅÒÅÍÜ ÂÑÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ, 2010, ¹ 3 (73)
некоторых лекарственных растений / В.М. Косман,
И.Г. Зенкевич // Растит. ресурсы. – 2001. – Т. 37,
Вып. 4. – С. 123–129.
3. Круглая А.А. Фармакогностическое изучение зопника колючего и зопника клубненосного,
произрастающих на Северном Кавказе: Автореф.
дис. … канд. фарм. наук / А.А. Круглая. – Пятигорск, 2008. – 24 с.
4. Крупникова Т.А. Количественное определение оксикоричных кислот в листьях кукурузы
/ Т.А. Крупникова, Л.И. Драник, И.Н. Давыдова
// Растит. ресурсы. – 1971. – Т. 7, Вып. 3. –
С. 449–453.
5. Ларькина М.С. Изучение динамики накопления фенолкарбоновых кислот в надземной части
василька шероховатого / М.С. Ларькина, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова // Химия растительного
сырья. – 2008. – № 3. – С. 71–74.
6. Мжаванадзе В.В. Количественное определение хлорогеновой кислоты в листьях черники
кавказской / В.В. Мжаванадзе, И.Л. Таргамадзе,
Л.Н. Драник // Сообщения АН Грузинской ССР. –
1971. – Т. 63, № 1. – С. 205–207.
7. Падалкина В.С. Хроматографические
методы определения фенолкарбоновых кислот
/ В.С. Падалкина // Методы анализа пищевых продуктов (Проблемы аналитической химии). – М.:
Наука, 1988. – Т. VIII. – С. 104–121.
8. Aura A.-M. Microbial metabolism of dietary
phenolic compounds in colon / A.-M. Aura // Phytochem. Rev. – 2008. – Vol. 7. – P. 407–429.
9. Bioavailability and pharmacokinetics of
caffeoylquinic acids and flavonoids after oral administration of Artichoke leaf extracts in humans / S.M. Wittemer, M. Ploch, T. Windeck, S.C. Muller et al. // Phytomedicine. – 2005. – Vol. 12. – P. 28–38.
10. Friedman M. Chemistry, biochemistry, and dietary role og potato polyphenols. A review / M. Friedman // J. Agric. Food Chem. – 1997. – Vol. 45. –
P. 1523–1540.
11. Halliwell B. Dietary polyphenols: good,
bad, or ndifferent for your health? / B. Halliwell
// Сardiovascular Research. – 2007. – Vol. 73. –
P. 341–347.
12. Perry N.B. Echinacea standardization:
analytical methods for phenolic compounds and typical
levels in medicinal species / N.B. Perry, E.J. Burgess,
V.A. Glennie // J. Agric. Chem. – 2001. – Vol. 49. –
P. 1702–1708.
13. Phenolics as potential antioxidant therapeutic
agents: mechanism and actions / M.A. Soobrattee,
V.S. Neergheen, A. Luximon-Ramma, O.I. Aruoma
et al. // Mutation Research. – 2005. – Vol. 579. –
P. 200–213.
14. Robards K. Strategies for the determination
of bioactive phenols in plants, fruit and vegetables
/ K. Robards // J. Chromatography (A). – 2003. –
Vol. 1000. – P. 657–691.
15. Zhaohui ZhaoChemistry, natural sources, dietary
intake and pharmacokinetic properties of ferulic acid: A
review / Zhao Zhaohui, M.H. Moghadasian // Food
Chemistry. – 2008. – Vol. 109. – P. 691–702.
Сведения об авторах
Лубсандоржиева Пунцык-Нима Базыровна – с.н.с. лаборатории медико-биологических исследований ИОЭБ СО РАН,
к. фарм.н., 670047, Улан-Удэ, ул. Сахъяновой, 6, ИОЭБ СО РАН, тел. 89146300703, e-mail: [email protected].
244
Экспериментальные исследования в биологии и медицине