Худякова Наталья Евгеньевна РАСТВОРИМЫЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЕ АНТИГЕНЫ И МОЛЕКУЛЫ ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ

3
На правах рукописи
Худякова Наталья Евгеньевна
РАСТВОРИМЫЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЕ АНТИГЕНЫ
И МОЛЕКУЛЫ ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ
У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ, ИМЕЮЩИХ МАРКЕРЫ СОПУТСТВУЮЩИХ ИНФЕКЦИЙ
14.00.36 – аллергология и иммунология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва, 2004
4
Работа выполнена в Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной МЗ РФ
Научный руководитель:
Доктор биологических наук, профессор В.В. Новиков
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, Кравченко Алексей Викторович,
Доктор биологических наук, Селиванов Николай Александрович
Ведущая организация:
Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН
Защита состоится «12» февраля 2004 года в «___» часов на заседании
Диссертационного совета К 208.046.01 при Московском НИИ эпидемиологии и
микробиологии им. Г.Н. Габричевского по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИ
эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.
Автореферат разослан «22» декабря 2003 года
Ученый секретарь
Диссертационного Совета
кандидат медицинских наук
Л.И. Новикова
5
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В России, как и в большинстве стран мира, ВИЧ-инфекция остается одной из главных проблем здравоохранения. По экспертным оценкам ВОЗ в мире
в настоящее время насчитывается более 36 млн. ВИЧ-инфицированных. По
данным Российского Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИД на октябрь 2003 г. в России было более 250 тысяч ВИЧинфицированных [Онищенко, 2003].
В настоящее время основным путем заражения ВИЧ в России продолжает оставаться инфицирование при внутривенном употреблении психоактивных
веществ. Вследствие этого значительная часть ВИЧ-инфицированных лиц одновременно несет маркеры вирусных гепатитов С, В, G и других инфекций. [Абдурахимова и др., 2002; Ганкина и др., 2003; Муляр и др., 2003]. Патогенез
смешанной инфекции, вызываемой сочетанием этих вирусов, изучен мало, что
определяет актуальность детального исследования молекулярных механизмов
иммунного ответа.
Важную роль в регуляции иммунного ответа играют растворимые формы
мембранных антигенов клеток иммунной системы, образующиеся за счет
шеддинга или альтернативного сплайсинга матричной РНК. Получены данные
о том, что они могут выполнять функции ограничителей иммунных реакций или
же выступать в роли активаторов иммунологических процессов. Кроме того, сывороточный уровень отдельных антигенов является мониторинговым показателем течения патологического процесса при ряде заболеваний, в том числе и
при ВИЧ-инфекции [Bedini et al., 1998; Gaddi et al., 2000; Jiang et al., 1997]. Информация о наличии и функциональной роли растворимых форм получена
лишь для немногих из более 240 идентифицированных в настоящее время
дифференцировочных антигенов. Таким образом, исследование количественного содержания растворимых форм (s-форм) мембранных белков клеток иммунной системы имеет как практическое, так и теоретическое значение.
Цель исследования
Изучить характер изменения уровня растворимых форм CD25, СD38,
CD50, CD54, CD95 антигенов и растворимых антигенов HLA класса I и II в сы-
6
воротке крови ВИЧ-инфицированных лиц, имеющих маркеры сопутствующих
вирусных инфекций.
Задачи
1. Разработать иммуноферментный метод определения растворимой формы
HLA-DR антигенов.
2. Исследовать сывороточное содержание этих протеинов при хроническом гепатите С, цитомегаловирусной инфекции, при коинфицировании вирусами
гепатитов В и С, у носителей молекулярно-генетических и иммунологических
маркеров вирусного гепатита G.
3. Определить сывороточный уровень растворимых молекул HLA I класса,
HLA-DR, CD38, CD50, CD54, CD95 антигенов при моноинфицировании ВИЧ.
4. Оценить характер изменения сывороточного содержания молекул HLA I и II
класса, растворимых форм CD25, CD38, CD50, CD54 и СD95 антигенов при
наличии у ВИЧ-инфицированных лиц маркеров вирусных гепатитов В, С, G и
цитомегаловирусной инфекции в различных сочетаниях.
Научная новизна
Выявлено,
что
уровень
sHLA-DR(*)
увеличивается
у
ВИЧ-
инфицированных лиц, положительных по антителам к вирусу гепатита С, независимо от наличия маркеров других тестируемых инфекций, в то время как концентрация антигенов sHLA-I статистически достоверно возрастает у ВИЧинфицированных лиц, имеющих маркеры вирусного гепатита С и цитомегаловирусной инфекции, а также у лиц, несущих, кроме того, HBs антиген. Статистически достоверно повышенный уровень sCD50 у ВИЧ-инфицированных лиц
ассоциирован с одновременным инфицированием организма вирусами гепатитов В и С. Более высокое содержание sCD50 антигена зарегистрировано при
дополнительном наличии антител класса IgM против цитомегаловируса.
Обнаружено, что сывороточный уровень sCD54 антигена у ВИЧинфицированных лиц статистически достоверно повышается при наличии антител против вируса гепатита С (HСV), а также при дополнительном присутствии
антител класса IgM против цитомегаловируса, но не маркеров вирусных гепатитов В и G.
sHLA-DR, sHLA-I, sCD25, sCD38, sCD50, sCD54, sCD95 - растворимые формы молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов, CD25, CD38,
CD50, CD54, CD95 антигенов
(*)
7
Установлено, что преимущественное влияние на сывороточное содержание суммарного sCD38 антигена оказывает наличие инфицирования ВИЧ. Обнаружено статистически достоверное повышение концентрации димерной
фракции данного антигена при моноинфекции ВИЧ. Присутствие антител к вирусу гепатита С, HBs антигена или антител к Е2 протеину вируса гепатита G
приводит к дополнительному увеличению уровня димерного sCD38 антигена.
Показано повышение концентрации sCD25 антигена в сыворотке крови
ВИЧ-инфицированных лиц при наличии антител к вирусу гепатита С и одновременном инфицировании вирусом гепатита В или цитомегаловирусом, а также
при одновременном обнаружении антител против Е2-протеина HGV.
Характер изменения уровня олигомерного sCD95 антигена при ВИЧинфекции отличается от характера изменения сывороточного содержания суммарного sCD95 антигена. Уровень суммарного sCD95 антигена при моноинфицировании ВИЧ имеет тенденцию к повышению, тогда как сывороточное содержание олигомерной формы sCD95 антигена статистически достоверно понижается.
Установлено, что при инфицировании организма вирусом гепатита
G повышается сывороточный уровень растворимой формы HLA-DR антигенов. Cодержание sHLA-DR нормализуется при освобождении организма от вируса. Показано увеличение сывороточного содержания sHLA-DR
антигенов при цитомегаловирусной инфекции.
Полученные данные расширяют знания о роли растворимых форм мембранных антигенов в реализации иммунного ответа при вирусных инфекциях.
Практическая значимость работы
С использованием моноклональных и поликлональных антител разработан иммуноферментный метод определения суммарной фракции растворимых
HLA-DR антигенов в биологических жидкостях. Метод применим для изучения
их роли в молекулярных механизмах иммунных реакций, а также для определения дифференциально-диагностической значимости уровня растворимых
форм данных антигенов при различных заболеваниях. Примененные в работе
методические подходы к определению сывороточного уровня растворимых
форм мембранных антигенов клеток иммунной системы потенциально могут
8
быть использованы в качестве методов оценки прогноза течения ВИЧинфекции, осложненной вирусными гепатитами.
Положения, выносимые на защиту
1. Присутствие маркеров других вирусных инфекций у ВИЧ-инфицированных
сопровождается изменением сывороточного содержания растворимых форм
CD25, CD38, CD50, CD54, CD95 антигенов, HLA I и II класса.
2. Основным фактором, влияющим на содержание исследованных растворимых антигенов у ВИЧ-инфицированных лиц, несущих маркеры сопутствующих инфекций, является инфицирование вирусом гепатита С.
Апробация работы
Результаты работы представлены на II(IV) Конгрессе специалистов клинической лабораторной диагностики (Москва, 2000); VII Нижегородской сессии
молодых ученых (Н.Новгород, 2002); VI Всероссийской научной конференции с
международным
участием «Дни иммунологии
в Санкт-Петербурге»
(С.-
Петербург, 2002); Научной конференции и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине» (С.-Петербург, 2002); Научно-практической международной конференции, посвященной памяти академика РАМН и РАМТН И.Н. Блохиной «Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской биотехнологии» (Москва,
2002); I научно-практической конференции Приволжского федерального округа
«Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики ВИЧ-инфекции/СПИДа в Приволжском федеральном округе» (Ижевск,
2003);
Научно-практической
конференции
«Актуальные
проблемы
ВИЧ-
инфекции» (Астрахань, 2003); Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова
(Томск, 2003); III Всероссийской научной конференции с международным участием по вопросам ВИЧ/СПИД и вирусных гепатитов (Суздаль, 2003); IV Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием
«Актуальные аспекты инфекционной патологии и деятельности госсанэпидслужбы» (Омск, 2003).
Апробация диссертации состоялась на расширенной межлабораторной
конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад.
И.Н. Блохиной 16 октября 2003 года.
Публикации
9
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа в объеме 140 листов состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных
результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 10 таблицами. Библиографический
указатель включает 234 источника литературы (48 отечественных и 186 иностранных авторов).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В качестве объектов исследования при отработке и апробации метода
определения относительной концентрации растворимой формы HLA-DR антигенов применяли образцы сыворотки крови 300 здоровых доноров, предоставленные Нижегородской областной станцией переливания крови. Были исследованы также образцы сыворотки крови 20 больных псориазом, проходивших лечение в Нижегородском научно-исследовательском кожно-венерологическом
институте (Ю.С. Савкина, Г.Ю. Курников). Для определения возрастных различий в уровне растворимых антигенов HLA-DR исследовали образцы сыворотки,
полученные от здоровых детей 3-7 лет (n=42), взрослых 18-20 лет (n=108) и
взрослых лиц 40-55 лет (n=38). Образцы сыворотки были предоставлены кафедрой эпидемиологии Военно-медицинского института пограничных войск
Нижегородской государственной медицинской академии. Также для исследований были использованы 318 образцов сыворотки крови больных гепатитами В и
С, любезно предоставленные нам сотрудниками кафедры инфекционных болезней НГМА (И.А. Отмахова, О.В. Корочкина), 24 образца сыворотки больных
CMV-инфекцией (Городская инфекционная больница № 2 г. Нижнего Новгорода). Образцы сыворотки крови лиц, инфицированных вирусом гепатита G (75
человек), были любезно предоставлены сотрудниками Института вирусологии
им. Д.И. Ивановского, г. Москва (Д.В. Новиков). Диагноз вирусного гепатита G
ставился на основании определения в сыворотке крови РНК вируса гепатита G
c помощью полимеразной цепной реакции.
10
Материалом для дальнейших исследований послужили образцы сыворотки крови лиц, инфицированных вирусом иммунодефицита человека, любезно предоставленные нам Приволжским окружным центром по борьбе и профилактике СПИД МЗ РФ (Носов Н.Н., Иванова Н.И.). Было исследовано 652 образца сыворотки крови ВИЧ-инфицированных лиц, поступивших в центр в период с 1999 по 2001 год.
Определение уровня растворимых форм мембранных антигенов проводили с помощью иммуноферментных методов с использованием поликлональных антител, специфичных к мембранным антигенам мононуклеарных клеток
крови человека и моноклональных антител (МКА) серии ИКО [Новиков, 2001].
Данные методы были разработаны в лаборатории молекулярной иммунологии
бактериальных и вирусных инфекций Нижегородского НИИЭМ им. акад. И.Н.
Блохиной группой авторов (Птицына Ю.С., Вязьмина Е.С., Егорова Н.И., Худякова Н.Е., Мартынова Т.Г.) во главе с проф. Новиковым В.В. Определение сывороточного уровня растворимых CD50,
CD54, CD25 и суммарной фракции
CD95 и CD38 антигенов проводили с применением МКА ИКО-60, ИКО-218, ИКО105, ИКО-160 и ИКО-20, соответственно. Для определения уровня олигомерного sCD95 антигена использовали МКА ИКО-160 в качестве первых и вторых антител. Содержание димерного sCD38 определяли аналогичным образом, применяя МКА ИКО-20. Для определения сывороточного уровня растворимых молекул главного комплекса гистосовместимости I класса использовали МКА ИКО53 и ИКО-216. Определение уровня растворимых HLA-DR антигенов проводили
с использованием поликлональных антител, специфичных к мембранным антигенам мононуклеарных клеток крови человека и моноклональных антител ИКО1. Моноклональные антитела были получены из Онкологического научного центра РАМН, г. Москва (Барышников А.Ю.).
Статистический анализ проводили с использованием критериев Крускала-Уоллиса, Манна-Уитни, Стьюдента и критерия ранговой корреляции Спирмена.
Результаты и их обсуждение
С помощью разработанного иммуноферментного метода было определено содержание растворимых молекул HLA-DR у больных хроническим гепатитом С. Обнаружено повышение уровня sHLA-DR антигенов в 2,3 раза в срав-
11
нении с нормой (Рис. 1). У больных смешанным гепатитом В+С сывороточный
уровень данного антигена был увеличен почти в 3 раза. Обнаружено увеличение уровня sHLA-DR более чем в три раза у больных псориазом. Полученные
результаты подтверждают имеющиеся в литературе сообщения японских и
немецких исследователей о повышении сывороточного уровня молекул sHLADR при данных заболеваниях [Hausmann et al., 1994; Hosoi
 et al., 2000].
U/ml


350
300
250
200
150
100
50
0
1
2
3
4
5
Рис. 1. Сывороточный уровень sHLA-DR у больных различными заболеваниями.
1, 4 – здоровые доноры,
2 – больные вирусным гепатитом С,
3 – больные смешанным гепатитом В+С,
5 – больные псориазом.
 - статистически достоверные различия со здоровыми донорами (р<0,05).
Известно, что гепатит С, нередко сопровождающий ВИЧ-инфекцию, в
свою очередь, часто ассоциирован с вирусным гепатитом G. В связи с этим
следующим этапом нашего исследования было определение содержания растворимых HLA-DR антигенов у лиц, имеющих иммунологические и молекулярно-генетические маркеры вирусного гепатита G. Сравнение проводили с контрольной группой здоровых доноров, у которых не было выявлено ни РНК HGV,
ни антител к E2-гликопротеину вируса гепатита G. У РНК HGV(+), анти-Е2(-) лиц
выявлено статистически достоверное повышение сывороточного уровня sHLADR молекул в сравнении с группой здоровых доноров. У лиц, имеющих в крови
как РНК HGV, так и анти-Е2, уровень sHLA-DR молекул сохранялся в пределах
12
нормы. При наличии только антител к Е2-протеину вируса гепатита G содержание sHLA-DR также находилось в пределах нормы. Представленные данные
свидетельствуют о том, что сывороточный уровень растворимых HLA-DR антигенов повышается при инфицировании вирусом гепатита G, и предполагают их
возможное участие в реализации молекулярных механизмов иммунного ответа

на HGV.
U/ml
160
120
80
40
0
1
2
3
4
Рис. 2. Содержание sHLA-DR в сыворотке крови лиц, имеющих маркеры
вирусного гепатита G.
1 – РНК HGV(-), анти-Е2(-) HGV,
2 – РНК HGV(+) анти-Е2(-) HGV,
3 – РНК HGV(+), анти-Е2(+) HGV,
4 – РНК HGV(-), анти-Е2(+) HGV.
 - статистически достоверные различия с группой здоровых доноров (р<0,05).
Разработанный метод был использован для исследования сывороточного содержания растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы при ВИЧ-инфекции. Наряду с растворимыми формами молекул гистосовместимости I и II классов исследовали сывороточный уровень антигенов адгезии CD50, CD54, антигенов CD38, CD25, CD95 антигена, опосредующего
апоптоз. Уровень данных антигенов был определен при моноинфицировании
ВИЧ, а также у ВИЧ-инфицированных лиц, имеющих маркеры вирусных гепатитов С, В, G и цитомегаловирусной инфекции.
Центральная роль в антигенной презентации и формировании иммунного
синапса принадлежит молекулам гистосовместимости I и II класса. Растворимые формы этих белков активно участвуют в регуляции иммунного ответа. В
13
сыворотке крови ВИЧ-инфицированных лиц без маркеров сопутствующих инфекций, у анти-HCV(+) ВИЧ-инфицированных и лиц, несущих дополнительно
HBs антиген, наблюдалась тенденция к повышению уровня sHLA-I (Рис. 3). У
ВИЧ-инфицированных лиц с маркерами вирусного гепатита С и цитомегаловирусной инфекции, а также у лиц, дополнительно имеющих в крови HBs антиген,
было выявлено статистически достоверное повышение сывороточного
содер

жания sHLA-I в 1,7 и в 1,6 раза, соответственно.
U/ml
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1
2
3
4
5
6
Рис. 3. Сывороточный уровень sHLA-I у ВИЧ-инфицированных лиц.
1 – здоровые доноры;
2 – ВИЧ-инфицированные без маркеров других инфекций;
3 – ВИЧ-инфицированные, несущие антитела к HCV;
4 – ВИЧ-инфицированные, имеющие антитела к HCV и HВs антиген;
5 – ВИЧ-инфицированные, положительные по анти-HCV и анти-CMV IgM;
6 – ВИЧ-инфицированные, несущие анти-HCV, HВs антиген и анти-CMV IgM.
 - статистически достоверные различия со здоровыми донорами (р<0,05).
В сравнении с sHLA-I изменение сывороточного содержания sHLA-DR антигенов носило более выраженный характер (Табл. 1). Концентрация sHLA-DR
в образцах сыворотки ВИЧ-инфицированных лиц, не содержащих маркеров каких-либо тестируемых инфекций, была в 1,8 раза выше, чем у здоровых доноров. В группе анти-HCV(+) ВИЧ-инфицированных сывороточный уровень sHLADR был почти в 40 раз выше, чем у здоровых доноров и в 20 раз выше, чем у
лиц с ВИЧ-моноинфекцией. В обоих случаях различия были статистически до-
14
стоверны. Эти данные свидетельствуют о том, что при смешанном инфицировании ВИЧ и вирусом гепатита С увеличение уровня циркулирующих антигенов
HLA-DR преимущественно связано с инфицированием вирусом гепатита С. В
образцах сыворотки ВИЧ-инфицированных лиц с маркерами гепатитов В и С
было обнаружено статистически достоверное повышение уровня sHLA-DR в
сравнении с донорами и с моноинфицированными ВИЧ, но не в сравнении с анти-HCV-положительными ВИЧ-инфицированными лицами. При наличии маркеров CMV-инфекции у лиц, инфицированных ВИЧ и HCV, уровень sHLA-DR был
повышен в 52 раза в сравнении со здоровыми донорами. Также статистически
достоверные различия наблюдались между этой группой и моноинфицированными ВИЧ. Однако относительно лиц, коинфицированных ВИЧ и вирусом гепатита С, повышение не было статистически достоверным. Таким образом, значительное влияние на сывороточное содержание sHLA-DR антигенов у ВИЧинфицированных лиц оказывает инфицирование вирусами гепатитов В и С, а
также цитомегаловирусом, что приводит к увеличению уровня sHLA-DR антигенов в десятки раз. Кроме того, сывороточный уровень данных антигенов статистически достоверно повышается при одновременном присутствии у ВИЧинфицированных антител к вирусам гепатита С и G.
Таблица 1
Содержание растворимых молекул HLA-DR в образцах сыворотки крови
ВИЧ-инфицированных лиц
Группа
Мm, (U/ml)
Достоверность различий с нормой (р)
Здоровые доноры
86,026,4
Моноинфекция ВИЧ
157,1118,7
р>0,05
Анти-HCV(+)
3313,31583,7
р<0,05
Анти-HCV(+), HBsAg(+)
6592,35764,0
р<0,05
Анти-HCV(+), анти-Е2 HGV(+)
7567,04928,2
р<0,05
Анти-HCV(+), анти-CMV IgM(+)
4469,34039,0
р<0,05
В процессе инициации иммунного ответа важная роль отводится молекулам адгезии. Функциональное значение растворимых CD50 (ICAM-3) и CD54
15
(ICAM-1) антигенов состоит в ограничении процессов адгезии. Увеличение концентрации sCD50 в биологических жидкостях может приводить к блокаде взаимодействия мембранной формы CD50 с молекулами CD209 и LFA-1 [Bleijs et al.,
2001]. Результатом этого может быть уменьшение уровня активации Т-клеток.
При моноинфицировании ВИЧ выявлена тенденция к повышению среднего сывороточного уровня sCD50 антигена (Рис. 4). Подобная направленность отмечена в образцах, положительных по антителам против вируса гепатита С и антителам класса IgM против цитомегаловируса.
U/ml 1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200

0
1
2
3
4
5
6
Рис. 4. Содержание растворимого CD50 антигена в сыворотке крови
ВИЧ-инфицированных лиц.
1 – здоровые доноры;
2 – ВИЧ-инфицированные лица без маркеров других инфекций;
3 – ВИЧ-инфицированные лица, несущие антитела к HCV;
4 – ВИЧ-инфицированные лица, имеющие антитела к HCV и HВs антиген;
5 – ВИЧ-инфицированные лица, положительные по анти-HCV и анти-CMV IgM;
6 – ВИЧ-инфицированные лица, несущие анти-HCV, HВs антиген и анти-CMV
IgM.
 - статистически достоверные различия со здоровыми донорами (р<0,05).
У ВИЧ-инфицированных лиц, имеющих в крови HBs антиген и антитела
против вируса гепатита С, сывороточное содержание sCD50 антигена статистически
достоверно
повышалось
в
сравнении
с
донорами
и
ВИЧ-
моноинфицированными. У ВИЧ-инфицированных, в сыворотке крови которых
одновременно обнаруживались антитела к вирусу гепатита С, HBs антиген и
16
анти-CMV IgM, уровень растворимого CD50 антигена был повышен в 5,1 раза в
сравнении с нормой и в 3,4 раза в сравнении с ВИЧ-моноинфицированными. В
обоих случаях наблюдались статистически достоверные различия (р<0,05).
Можно сделать вывод о том, что одновременное присутствие четырех вирусов
в наибольшей степени влияет на повышение сывороточного уровня растворимого антигена ICAM-3 (CD50), что, вероятно, вызвано кумулятивным эффектом
усиления иммунного ответа на инфицирование сразу несколькими вирусами.
Изменения в уровне sCD54 антигена у ВИЧ-инфицированных лиц без
маркеров других инфекций нами не обнаружены. Однако были обнаружены
статистически достоверные различия между
HСV-положительными и HСV-
отрицательными ВИЧ-инфицированными лицами (Табл. 2). Это предполагает,
что увеличение уровня sCD54 антигена в сыворотке крови HСV(+) ВИЧинфицированных лиц также происходит под влиянием вируса гепатита C.
Таблица 2
Сывороточный уровень растворимого CD54 антигена у ВИЧинфицированных лиц
Группа
Мm, (U/ml)
Достоверность различий с нормой, (р)
Здоровые доноры
37,017,6
Моноинфекция ВИЧ
38,524,2
p>0,05
Анти-HCV(+)
2390,01143,2
р<0,05
Анти-HCV(+), HBsAg(+)
205,7141,4
p>0,05
Анти-HCV(+), анти-E2 HGV(+)
3296,02807,1
p>0,05
Анти-HCV(+), анти-CMV IgM(+)
2258,02212,0
р<0,05
При наличии маркеров гепатитов В и С у ВИЧ-инфицированных лиц
уровень sCD54 антигена был увеличен, но в меньшей степени, чем у антиHCV(+) ВИЧ-инфицированных. Можно предположить, что повышение уровня
sCD54 не связано с инфицированием вирусом гепатита B. Более того, присутствие HBs-антигена приводит к понижению сывороточного уровня sCD54 в
сравнении с анти-HCV(+) ВИЧ-инфицированными. У ВИЧ-инфицированных
лиц с анти-HCV и анти-Е2 HGV выявлена тенденция к увеличению содержания
17
sCD54 антигена. Лица, инфицированные ВИЧ, HCV и CMV, также имели повышенный уровень CD54 антигена. Его содержание в крови было статистически достоверно увеличено в сравнении с нормой. Однако достоверных различий с группой ВИЧ-инфицированных лиц, несущих только антитела к вирусу
гепатита С, т.е. дополнительного влияния цитомегаловируса не обнаружено.
Важная роль в механизмах иммунного ответа принадлежит CD95 (Fas)
антигену. Через него реализуется один из путей передачи апоптотического сигнала в клетку. Растворимая форма CD95 антигена, напротив, служит ингибитором апоптоза [Cascino et al., 1995]. У ВИЧ-инфицированных лиц наблюдалась
тенденция к увеличению сывороточного содержания суммарного sCD95 антигена, не имеющая, однако, статистически достоверного характера. Известно, что
гепатоциты обладают способностью к продукции растворимого CD95 антигена,
увеличивающейся при патологии печени, связанной с вирусными гепатитами,
что можно рассматривать как защитную реакцию организма на апоптотическое
уничтожение гепатоцитов [Krams et al., 1998]. Показанное в наших исследованиях отсутствие достоверного повышения уровня sCD95 антигена в сыворотке
крови ВИЧ-инфицированных, имеющих маркеры гепатитов В или С, предполагает нарушение продукции растворимой формы данного антигена гепатоцитами, ведущее к большему поражению печени. По-видимому, это связано с взаимовлиянием вирусов гепатитов В и С и вируса иммунодефицита человека, а
также возможной модуляцией механизмов образования растворимой формы
Fas-антигена.
Известно, что растворимый CD95 антиген также может существовать в
олигомерной форме [Walczak et al., 2000]. У ВИЧ-инфицированных лиц, имеющих маркеры сопутствующих инфекций, выявлена тенденция к увеличению сывороточного уровня олигомерной формы sCD95 антигена (Табл. 3). В группе
лиц, моноинфицированных ВИЧ, сывороточный уровень олигомерного sCD95
был статистически достоверно снижен в 1,5 раза в сравнении с группой доноров. Таким образом, при ВИЧ-инфекции изменяется показатель соотношения
сывороточного уровня суммарной и олигомерной фракции растворимого CD95
антигена. Можно предположить, что при ВИЧ-инфекции значительный дисбаланс, способствующий повышению чувствительности лимфоцитов к апоптозу,
наблюдается не только в системе «CD95 и его лиганд», но и в соотношении мономерных и агрегированных растворимых форм CD95 антигена.
18
Таблица 3
Уровень олигомерной формы sCD95 антигена у ВИЧ-инфицированных
Группа
Мm, (U/ml)
Достоверность различий с нормой, (р)
Здоровые доноры
268,515,8
Моноинфекция ВИЧ
174,027,0
р<0,05
Анти-HCV(+)
421,949,7
р>0,05
Анти-HCV(+), HВsAg(+)
552,3186,5
р>0,05
Анти-HCV(+), HВsAg(+), анти-CMV
IgM(+)
1091,3562,8
р>0,05
Анти-HCV(+), анти-CMV IgM(+)
516,1122,4
р>0,05
При исследовании сывороточного уровня суммарного CD38 антигена
установлено, что у ВИЧ-инфицированных лиц без маркеров других тестированных инфекций уровень данного антигена был статистически достоверно увеличен в сравнении с нормой в 1,7 раза (Рис. 5).
*
U/ml
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1
2
*
3
4
Рис. 5. Сывороточный уровень суммарной фракции sCD38 антигена в
крови ВИЧ-инфицированных лиц.
1 - здоровые доноры;
2 - ВИЧ-инфицированные лица без маркеров других инфекций;
3 - ВИЧ-инфицированные лица, несущие антитела к HCV,
19
4 - ВИЧ-инфицированные лица, имеющие HBs антиген.
 - статистически достоверные различия со здоровыми донорами (р<0,05).
Повышенный уровень sCD38 антигена у ВИЧ-инфицированных лиц может быть следствием активации иммунной системы, ведущей к анергии, и свидетельствовать о вероятном участии растворимого CD38 антигена в патогенетических механизмах развития ВИЧ-инфекции. Подъем содержания sCD38 антигена может ограничивать иммунный ответ на ВИЧ-инфекцию. При наличии в
крови анти-HCV сывороточное содержание sCD38 антигена было повышено,
так же, как у моноинфицированных ВИЧ.
Известно, что растворимый CD38 антиген присутствует в сыворотке также в виде димера [Mallone et al., 1998]. Исследование сывороточного уровня
димерного sCD38 в сыворотке крови ВИЧ-моноинфицированных лиц показало,
что содержание данного антигена было повышено в 4 раза в сравнении с нормой (Табл. 4).
Таблица 4
Уровень растворимой формы димерного CD38 антигена в сыворотке крови ВИЧ-инфицированных лиц
Группа
Мm, (U/ml)
Достоверность различий с нормой, (р)
Доноры
100,350,2
Моноинфекция ВИЧ
404,8399,7
р<0,05
Анти-HCV(+)
6746,42293,0
р<0,05
Анти-HCV(+), HBsAg(+)
11680,05739,0
р<0,05
Анти-HCV(+), анти-E2 HGV(+)
2194,01185,0
р<0,05
Анти-HCV(+), анти-CMV IgM(+)
4177,02751,0
р>0,05
Дополнительное присутствие анти-HCV в сыворотке приводило к еще
большему повышению уровня sCD38 димера. Средняя концентрация sCD38
димера у ВИЧ-инфицированных лиц с маркерами гепатитов В и С была увеличена более чем в 100 раз (p<0,05). У анти-HCV(+) ВИЧ-инфицированных лиц,
имеющих антитела против Е2 протеина HGV, сывороточное содержание sCD38
антигена было в 21,9 раза выше чем в норме (p<0,05). Однако уровень sCD38
20
димера в этой группе ВИЧ-инфицированных лиц был в 3,1 раза ниже, чем сывороточное содержание CD38 димера у ВИЧ-инфицированных только с антиHCV. Статистически достоверных различий между этими группами не обнаружено. У анти-HCV(+) и анти-CMV IgM(+) ВИЧ-инфицированных лиц уровень
sCD38 димера был в 40 раз выше нормы, но на 38% ниже, чем содержание
sCD38 димера у ВИЧ-инфицированных лиц, имеющих в крови только анти-HCV.
Существенное изменение уровня димерного sCD38 антигена по сравнению с
уровнем общей фракции sCD38 антигена предполагает особую роль CD38 димера в молекулярных механизмах иммунного ответа при вирусных инфекциях.
CD25 антиген представляет собой -цепь рецептора интерлейкина-2.
Сывороточный уровень растворимого CD25 антигена является маркером активации клеточного иммунитета [Sipsas et al., 2003]. В результате исследования
сывороточного содержания sCD25 антигена у ВИЧ-инфицированных лиц, в сыворотке которых отсутствуют маркеры других инфекций, показано, что уровень
данного антигена был повышен более чем в 7 раз в сравнении со здоровыми
донорами (Рис. 6).

U/ml

4000
3000
2000
1000
0
1
Рис.
6.
2
Содержание
3
sCD25
4
антигена
5
в
6
сыворотке
крови
инфицированных лиц.
1 – здоровые доноры;
2 – ВИЧ-инфицированные без маркеров других инфекций;
3 – ВИЧ-инфицированные, несущие антитела к HCV;
4 – ВИЧ-инфицированные, имеющие антитела к HCV и HВs антиген;
5 – ВИЧ-инфицированные, положительные по анти-HCV и анти-CMV IgM;
ВИЧ-
21
6 – ВИЧ-инфицированные, несущие анти-HCV и анти-Е2 HGV.
 – статистически достоверные различия со здоровыми донорами (р<0,05).
Увеличение среднего уровня sCD25 было зарегистрировано также у ВИЧинфицированных, в сыворотке которых были обнаружены антитела к белкам
вируса гепатита С. Однако статистически достоверных различий не обнаружено
вследствие широкого разброса данных, поскольку содержание sCD25 антигена
является высоколабильным показателем, зависящим от многих факторов и отражающим состояние активации иммунной системы [Monsalve-De Castillo et al.,
2002]. У ВИЧ-инфицированных, в сыворотке крови которых кроме антител к
белкам вируса гепатита С были найдены или HBs антиген, или антитела к белку
Е2 вируса гепатита G, или антитела класса IgM против цитомегаловируса, обнаружено статистически достоверное повышение среднего сывороточного
уровня растворимого CD25 антигена. Это говорит о выраженном увеличении
продукции
растворимой формы данного антигена при наличии у ВИЧ-
инфицированных дополнительно еще двух вирусных инфекций.
Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что при моноинфицировании ВИЧ наблюдается статистически достоверное повышение уровня суммарного и димерного sCD38 антигенов, причем изменение sCD38 димера носит
более выраженный характер. Содержание растворимых молекул HLA I и II
класса, sCD50, sCD25, суммарного sCD95 антигенов имеет выраженную тенденцию к увеличению. Присутствие антител к вирусу гепатита С у ВИЧинфицированных лиц приводит к более существенному росту сывороточного
уровня исследованных антигенов. Инфицирование организма наряду с ВИЧ и
HCV, вирусом гепатита В и цитомегаловирусом, либо присутствие антител против вируса гепатита G в различных сочетаниях сопровождается еще более выраженным подъемом сывороточного уровня растворимых форм исследованных
антигенов, однако основным фактором, влияющим на содержание исследованных растворимых молекул, является инфицирование вирусом гепатита С.
ВЫВОДЫ
1. Разработан иммуноферментный метод определения растворимой формы
HLA-DR антигенов. С помощью данного метода продемонстрировано повы-
22
шение содержания растворимых HLA-DR молекул у больных цитомегаловирусной инфекцией и у лиц, имеющих в крови РНК вируса гепатита G.
2. При моноинфицировании ВИЧ происходит повышение сывороточного уровня суммарной и димерной фракции растворимого CD38 антигена. Обнаружен дисбаланс между сывороточным содержанием суммарного и олигомерного sCD95 антигена.
3. Наличие у ВИЧ-инфицированных антител к вирусу гепатита С сопровождается статистически достоверным увеличением сывороточной концентрации
растворимых HLA-DR, CD38 и CD54 антигенов в сравнении с ВИЧмоноинфицированными лицами. Дополнительное присутствие анти-Е2 HGV
не оказывает влияния на уровень данных антигенов.
4. У лиц, имеющих одновременно антитела против ВИЧ, антитела против вируса гепатита С и HBs антиген, сывороточная концентрация растворимых
форм HLA-DR, CD50, димерного CD38 и CD25 антигенов увеличивается по
сравнению с нормой и моноинфицированными ВИЧ, но не в сравнении с анти-HCV-положительными ВИЧ-инфицированными.
5. Присутствие антител против вируса гепатита С и антител класса IgM против
цитомегаловируса у ВИЧ-инфицированных сопровождается повышением
сывороточной концентрации форм растворимых антигенов HLA I и II классов, CD50, CD54, CD25.
6. При наличии у ВИЧ-инфицированных лиц одновременно антител против вируса гепатита С, антител класса IgM против цитомегаловируса и HBs антигена происходит статистически достоверное повышение содержания растворимых антигенов HLA-I и CD50 в сравнении с нормой.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Птицына Ю.С., Борнякова И.А., Мартынова Т.Г., Худякова Н.Е., Барышников
А.Ю., Новиков В.В. Растворимый и мембранный Fas/APO-1 (CD95) антиген в
крови больных гепатитами В и С. // Клиническая лабораторная диагностика.
– 2000. - № 10. - С. 10-11.
2. Худякова Н.Е., Мартынова Т.Г., Никитина И.А., Савкина Ю.С., Курников Г.Ю.,
Новиков В.В. Разработка и апробация иммуноферментного метода опреде-
23
ления растворимой формы молекул HLA-DR. // Вестник Нижегородского
университета им. Н. И. Лобачевского. Сер. Биология. - 2001. - Вып. 1(5). - С.
191-194.
3. Худякова Н.Е., Егорова Н.И., Шломина И.А., Новиков В.В. Возрастные изменения сывороточного уровня растворимых форм антигенов HLA-DR и CD54
(ICAM-1). // Сборник научных трудов "Здоровье населения Нижегородской
области" (Итоги региональной программы). – Н. Новгород. – 2002. - С.111116.
4. Худякова Н.Е., Птицына Ю.С., Новиков Д.В., Мартынова Т.Г., Новиков В.В.
Сывороточный уровень растворимых форм HLA-DR антигенов при вирусном
гепатите G. // Медицинская иммунология. – 2002. – Т. 4. - № 2. - С. 265-266.
5. Худякова Н.Е., Егорова Н.И., Иванова Н.И., Пекшева О.Ю., Носов Н.Н., Новиков В.В. Уровень растворимых HLA-DR антигенов в сыворотке крови ВИЧинфицированных лиц и больных вирусными гепатитами В и С. // Материалы
научной конференции "Проблема инфекции в клинической медицине". - С.Петербург. - 2002. - С. 230-231.
6. Худякова Н.Е., Птицына Ю.С., Вязьмина Е.С., Шломина И.А., Носов Н.Н.,
Новиков В.В. Влияние цитомегаловирусной инфекции на уровень растворимых антигенов HLA I и II классов у ВИЧ-инфицированных лиц // Сборник "Актуальные проблемы медицины и биологии". – Томск. – 2003. - Вып. 2. - С.
230-230.
7. Худякова Н.Е., Птицына Ю.С., Кравченко Г.А., Мартынова Г.К., Копылова
Г.Е., Иванова Н.И., Носов Н.Н., Новиков В.В. Исследование сывороточного
уровня растворимых форм дифференцировочных антигенов и молекул
главного комплекса гистосовместимости клеток иммунной системы у ВИЧинфицированных. // Материалы научно-практической конференции "Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики ВИЧ-инфекции/СПИДа в Приволжском федеральном округе". – Ижевск.
– 2003. - С. 183-186.
8. Худякова Н.Е., Иванова Н.И., Носов Н.Н., Новиков В.В. Сывороточный уровень
олигомерной
фракции
растворимого
антигена
CD95
у
ВИЧ-
инфицированных лиц. // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы ВИЧ-инфекции». – Астрахань. – 2003. – С. 82-84.
24
9. Худякова Н.Е., Егорова Н.И., Иванова Н.И., Носов Н.Н., Новиков В.В. Сывороточный уровень растворимой формы антигена CD25 (IL-2R) у ВИЧинфицированных лиц. // Тезисы докладов межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР
С.П. Карпова. – Томск. – 2003. – С. 176-177.
10. Khudyakova N.E., Egorova N.I., Ptytsina Ju.S., Nosov N.N., Kopylova G.G.,
Kravchenko G.A., Baryshnikov A.Yu., Novikov V.V. Serum level of soluble adhesion molecules in HIV-infected with markers of other viral diseases. // Russian
Journal of Immunology. – 2003. – Т. 8. - № 4. - С. 245-250.
11. Худякова Н.Е., Новиков В.В., Кравченко Г.А., Иванова Н.И., Птицына Ю.С.,
Носов Н.Н. Уровень растворимых антигенов HLA I и II классов в сыворотке
крови ВИЧ-инфицированных лиц. // Журнал микробиологии, эпидемиологии
и иммунобиологии. – 2004. - № 1. - С. 42-45.