ИНСТРУКЦИЯ

ИНСТРУКЦИЯ
по применению комплекта реагентов для выявления аллеля 27
локуса В главного комплекса гистосовместимости человека (HLA
B27) методом полимеразной цепной реакции
в режиме реального времени
ВНИМАНИЕ! Изучите инструкцию перед началом работы
ИНСТРУКЦИЯ
по применению комплекта реагентов для выявления аллеля
27 локуса В главного комплекса гистосовместимости
человека (HLA B27) методом ПЦР в режиме реального
времени
1.
НАЗНАЧЕНИЕ
1.1.
Комплект реагентов HLA B27 предназначен для выявления
аллеля 27 локуса В главного комплекса гистосовместимости
человека (HLA B*27). Положительный результат будет
получен в случае наличия аллеля HLA B27 как в гомо-, так
и в гетерозиготном состоянии.
Выявление
HLA
B27
позволяет
определить
предрасположенность к развитию таких аутоиммунных
заболеваний, как ревматоидный артрит и анкилозирующий
спондилит (болезнь Бехтерева).
1.2.
Комплект
может
быть
исследовательской практике
использован
2.
ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКТА
2.1.
Принцип действия
в
научно-
Принцип метода ПЦР основан на использовании процесса
амплификации ДНК, заключающегося в повторяющихся циклах
температурной
денатурации
ДНК,
отжига
праймеров
с
комплементарными
последовательностями
и
последующей
достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров Taqполимеразой.
Для повышения чувствительности и специфичности реакции
предусмотрено
применение
«горячего»
старта,
который
обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси,
состоящей из двух слоёв, разделённых прослойкой из парафина.
Смешение слоёв и превращение их в реакционную смесь
происходит только после плавления парафина, что исключает
неспецифический отжиг праймеров на ДНК-мишени при начальном
прогреве пробирки.
В реакционную смесь для амплификации введены ДНК–
зонды, каждый из которых несёт флуоресцентную метку и гаситель
флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНКзонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку
2
прекращается, что ведёт к возрастанию уровня флуоресценции.
Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень
флуоресценции)
увеличивается
пропорционально
количеству
образовавшихся специфических ампликонов и измеряется на
каждом цикле амплификации.
Исследование с использованием комплекта реагентов HLA
B27
состоит
из
следующих
этапов:
выделение
ДНК
(пробоподготовка) и ПЦР-амплификация ДНК в режиме реального
времени.
Комплект реагентов HLA B27 включает смесь для
амплификации, специфичную для аллеля HLA B27 и внутреннего
контроля. В качестве внутреннего контроля используется контроль
взятия материала для системы HLA B27. Использование внутреннего
контроля позволяет избежать ложноотрицательных результатов в
случае недостаточного для анализа количества геномной ДНК
человека в образце.
В состав ДНК-зонда, использующегося для детекции
продукта амплификации HLA B27, включена флуоресцентная метка
Fam. В состав ДНК-зонда, использующегося для детекции продукта
амплификации внутреннего контроля, входит флуоресцентный
краситель Hex (Таблица 1).
Использование нескольких флуоресцентных красителей
позволяет сократить количество пробирок, поскольку появляется
возможность одновременно регистрировать результаты разных
реакций амплификации, проходящих в одной пробирке.
Интерпретация результатов проводится с учётом значений
индикаторных циклов (Cp) для специфического продукта и
внутреннего контроля.
Для
проведения
ПЦР
используют
амплификаторы
детектирующие (ООО «НПО ДНК-Технология») ДТ-322, ДТлайт1,
ДТпрайм2 и ДТ-96.
ВНИМАНИЕ! Возможность использования других амплификаторов
необходимо уточнить у представителя компании.
1
2
– только модели 4S1, 4S2, 5S1, 5S2, 6S1, 6S2.
– только модели 4M1, 4M3, 4M6, 5M1, 5M3, 5M6, 6M1, 6M3, 6M6.
3
Таблица 1.
Каналы детекции продуктов амплификации
FAM
HEX
Rox
Cy5
Cy5.5
HLA B27
ВК B27
-
-
-
2.2.
Комплект рассчитан на проведение 48 определений,
включая анализ неизвестных образцов, положительных
контрольных образцов и отрицательных контрольных
образцов.
2.3.
Состав комплекта
Комплект реагентов для выявления аллеля 27 локуса В
главного комплекса гистосовместимости человека (HLA B27)
методом ПЦР в режиме реального времени включает:

смесь для амплификации, запечатанную парафином –
48 пробирок или 6 стрипов по 8 пробирок (по 20 мкл в
каждой);

раствор Taq-полимеразы – 1 пробирка (480 мкл);

минеральное масло – 1 пробирка (960 мкл);

положительный контрольный
1 пробирка (150 мкл).
образец
(«К+»)
–
2.4.
Время проведения анализа (без учета пробоподготовки) –
от 1,5 часов.
3.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1
Специфичность анализа
Для
образцов
биологического
материала
человека,
содержащих ДНК HLA B27, амплификатор должен регистрировать
положительный результат по каналам Fam и Hex; при этом
∆Cp=Cp(Fam) – Cp(Hex) для каждого образца должна быть менее 8,0.
Для образцов биологического материала, не содержащих
ДНК HLA B27, амплификатор должен регистрировать либо
отрицательный результат по каналу Fam и положительный по
каналу Hex; либо положительный результат по обоим каналам, но
при этом ∆Cp= Cp(Fam) – Cp(Hex) для каждого образца должна быть
более 10.
4
3.2
Чувствительность анализа
Количество анализируемой ДНК должно быть не менее
1,0 нг на амплификационную пробирку. При использовании
меньшего количества ДНК возможно получение недостоверного
результата.
4
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Организация работы ПЦР-лаборатории, оборудование и
материалы должны соответствовать Методическим указаниям МУ
1.3.2569–09 «Организация работы лабораторий, использующих
методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с
материалом,
содержащим
микроорганизмы
I–IV
групп
патогенности».
5.
ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
При работе с комплектом реагентов HLA B27 требуются
следующие оборудование и материалы:

амплификатор детектирующий;

микроцентрифуга/вортекс;

холодильник бытовой;

штатив «рабочее место» для пробирок объёмом 0,2 мл
или стрипованных пробирок объёмом 0,2 мл;

пипетки
полуавтоматические
одноканальные
переменным объёмом 2–20 мкл, 20–200 мкл;

одноразовые
наконечники
с
фильтром
для
полуавтоматических пипеток, свободные от РНКаз и
ДНКаз, объёмом 20 мкл, 200 мкл;

одноразовые перчатки
текстурированные;

ёмкость для сброса использованных наконечников,
пробирок и другие расходных материалов;

комплект для выделения ДНК из биологического
материала (рекомендуется ПРОБА-ГC-ГЕНЕТИКА или
ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА производства ООО «НПО
ДНК-Технология»).
5
медицинские,
без
с
талька,
Программное
обеспечение
для
амплификаторов
детектирующих ДТ-322, ДТлайт, ДТпрайм и ДТ-96:
6.

версия ПО 7.3.4.0, рекомендуемая версия 7.3.5.84.3

файл с параметрами анализа «HLA_B27.ini».
АНАЛИЗИРУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ
Для исследования используют цельную периферическую
кровь человека.
Взятие, предобработку и хранение материала проводят в
соответствии с инструкцией к комплекту реагентов для выделения
ДНК из биологического материала.
6.1.
Взятие цельной периферической крови
Взятие цельной периферической крови проводится в
вакуумные пластиковые пробирки типа Vacuette объёмом 2,0 или
4,0 мл с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой
солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации
2,0 мг/мл. В качестве антикоагулянта допускается также
использование цитрата натрия. Для перемешивания крови с
антикоагулянтом после взятия материала необходимо перевернуть
пробирку 2–3 раза.
ВНИМАНИЕ! Не допускается использование гепарина в качестве
антикоагулянта.
6.2.
Транспортировка и хранение исследуемого материала
Допускается хранение образцов при температуре 2–8 °С не
более 24 ч. В случае невозможности доставки материала в
лабораторию
в
течение
суток
допускается
однократное
замораживание материала. Допускается хранение замороженного
материала при температуре минус 20 °С в течение 1 месяца.
3
– по мере обновления программного обеспечения рекомендуемая
версия ПО может измениться. Последнюю рекомендуемую версию
ПО можно скачать на сайте компании «ДНК-Технология»:
http://www.dna-technology.ru/support/
6
7.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
7.1.
Выделение ДНК из биологического материала
Выделение ДНК проводят в соответствии с инструкцией к
используемому комплекту реагентов. Рекомендуемые комплекты
для выделения ДНК из биологического материала: ПРОБА-ГCГЕНЕТИКА или ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА. Полученную ДНК также
можно использовать для HLA генотипирования и определения
генетических полиморфизмов.
О возможности использования других комплектов реагентов
для выделения ДНК из биологического материала совместно с
комплектом реагентов HLA B27 можно узнать у представителя
компании.
Независимо от используемого комплекта для выделения
ДНК одновременно с выделением ДНК из периферической крови
необходимо
провести
через
все
этапы
пробоподготовки
отрицательный контрольный образец (в его качестве можно
использовать физиологический раствор в объеме согласно
инструкции к комплекту реагентов для выделения ДНК).
7.2.
Проведение полимеразной цепной реакции
7.2.1.
Промаркируйте по одной пробирке со смесью для
амплификации
для
каждого
исследуемого
образца,
отрицательного
контрольного
образца
(«K–»)
и
положительного контрольного образца («К+»).
Например, необходимо проанализировать 4 образца. Нужно
промаркировать 4 пробирки для исследуемых образцов,
одну пробирку для «К–» и одну для «К+». Общее
количество пробирок – 6.
7.2.2.
Встряхните пробирку с раствором Taq-полимеразы в
течение 3–5 сек, затем центрифугируйте в течение 1–3 сек
на микроцентрифуге/вортексе.
7.2.3.
Добавьте в каждую пробирку, не повреждая
парафина, по 10 мкл раствора Taq-полимеразы.
7.2.4.
Добавьте в каждую пробирку по 1 капле (около 20 мкл)
минерального масла. Закройте крышки пробирок.
7.2.5.
Для
предотвращения
контаминации
следует
перед
внесением ДНК открывать крышку только той пробирки, в
которую будет вноситься данный образец, и закрывать ее
7
слой
перед внесением следующего. Препараты ДНК следует
вносить наконечниками с фильтром.
Внесите, не повреждая слой парафина, по 5,0 мкл
выделенного
из
образцов
препарата
ДНК
в
соответствующие пробирки для исследуемых образцов.
7.2.6.
Внесите, не повреждая слой
парафина, 5,0
мкл
отрицательного контрольного образца, прошедшего этап
выделения ДНК, в пробирку, маркированную «K–».
Внесите, не повреждая слой
парафина, 5,0
мкл
положительного
контрольного
образца
в
пробирку,
маркированную «K+».
7.2.7.
Центрифугируйте пробирки на микроцентрифуге/вортексе в
течение 1–3 сек.
7.2.8.
Установите
все
пробирки
в
блок
амплификатора
детектирующего. Рекомендуется располагать пробирки по
центру термоблока.
7.2.9.
Запустите программное обеспечение RealTime_PCR в
режиме «Работа с прибором». При первом проведении ПЦР
загрузите файл «HLA_B27.ini» (п.7.3.) При последующих
постановках добавьте в протокол тест «HLA_B27» (п.7.4.),
укажите количество и идентификаторы образцов, в том
числе отрицательного и положительного контрольных
образцов, отметьте расположение пробирок на матрице
термоблока в соответствии с их установкой (п. 7.4.6.) и
проведите ПЦР.
При выборе теста «HLA_B27» в окне «Запуск программы
амплификации»
должна
отображаться
программа,
приведенная в таблице 2.
8
Таблица 2
Режим амплификации для амплификаторов детектирующих
ДТ-322, ДТлайт, ДТпрайм и ДТ-96
№ блока Температура, °С мин
сек
Число
циклов
Режим
оптических
измерений
Тип блока
1
80,0
94,0
0
1
30
30
1
2
94,0
64,0
0
0
30
15
5
3
94,0
64,0
0
0
10
15
45
4
94,0
0
5
1
Цикл
5
10,0
…
…
Хранение
Хранение
Цикл
Цикл
√
Цикл
√
ВНИМАНИЕ!
При
использовании
других
амплификаторов
необходимо уточнить программу амплификации у представителя
компании.
7.3.
Загрузка
теста
«HLA_B27»
для
амплификаторов
детектирующих при первой постановке на данном
компьютере.
Версия
7.3.5.84.4
ПО
не
ниже
7.3.4.0,
рекомендуемая
Примечание. Для
иллюстраций
в
настоящей
использованы скриншоты версий 7.3.4.0, 7.3.4.20.
версия
инструкции
Тест «HLA_B27» (файл HLA_B27.ini) для приборов ДТ-322,
ДТлайт, ДТпрайм и ДТ-96 предоставляется производителем
комплекта. Его установку в программу RealTime_PCR необходимо
производить в режиме «Работа с прибором» в следующем порядке:
4
– по мере обновления программного обеспечения рекомендуемая
версия ПО может измениться. Последнюю рекомендуемую версию
ПО можно скачать на сайте компании ДНК-Технология :
http://www.dna-technology.ru/support/
9
7.3.1.
Откройте
программное
обеспечение
RealTime_PCR,
выберите оператора, который будет работать с комплектом
HLA B27, выберите режим «Работа с прибором».
При добавлении нового оператора необходимо создать или
выбрать рабочую директорию для сохранения файла с
результатами.
7.3.2.
В меню «Тест» выберите закладку «Копировать группы
тестов».
7.3.3.
В левой половине окна «Копировать группы тестов»
выберите строку «из *.ini файла», откройте ini файл
«HLA_B27».
7.3.4.
В правой половине окна «Копировать группы тестов»
выберите оператора, в директорию которому необходимо
скопировать тест «HLA_B27».
7.3.5.
Нажмите кнопку
, после
появится в правой половине окна.
10
чего
выбранный
тест
7.3.6.
Теперь с тестом «HLA_B27» может работать оператор, для
которого был скопирован тест.
7.4.
Ежедневная работа с тестом «HLA_B27».
7.4.1.
Откройте
программное
обеспечение
RealTime_PCR,
выберите оператора, для которого копировали тест (см.
п.7.3.4), выберите режим «Работа с прибором».
7.4.2.
Нажмите кнопку «Добавить тест».
7.4.3.
Выберите из списка тест «HLA_B27».
11
7.4.4.
Укажите количество исследуемых образцов, положительных
и отрицательных контролей, нажмите кнопку «Ок».
7.4.5.
Укажите идентификаторы пробирок.
12
7.4.6.
Отметьте расположение пробирок на матрице термоблока в
соответствии с их установкой (при необходимости нажмите
кнопки «Очистить поле матрицы» и «Порядок заполнения» –
13
).
Если термоблок не заполнен полностью, рекомендуется
устанавливать пробирки по центру термоблока.
7.4.7.
Нажмите кнопку «Применить» в правом нижнем углу окна
«Протокол».
7.4.8.
В
окне
«Запуск
программы амплификации» будет
отображена
необходимая
программа
амплификации
«DnaTech-64».
7.4.9.
Нажмите кнопку «Запуск программы» в правом нижнем углу
окна.
14
7.4.10. Укажите имя файла и директорию на компьютере для
сохранения файла с результатами (по умолчанию будет
предложено сохранить файл в рабочую директорию
выбранного оператора, см. п.7.3.1).
8.
РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ
Регистрация сигнала проводится прибором автоматически
во время амплификации.
Детекция
и
учёт
результатов
амплификатором детектирующим автоматически.
осуществляются
После окончания программы амплификации на экране
появится соответствующее информационное сообщение и будет
предложено перейти к анализу результатов (п. 4.6 части 1 («Работа
с прибором») Руководства по эксплуатации для амплификаторов
детектирующих).Анализ проводится программным обеспечением.
На графике будет отображена зависимость флуоресценции
от номера цикла для каждой пробирки в термоблоке. В таблице
справа
будет
показан
идентификатор
образца,
название
исследования, индикаторный цикл (Ср), результат по каждому
образцу (качественный анализ).
По результатам анализа можно сформировать и распечатать
отчёт по результатам анализа.
Для создания лабораторного отчёта необходимо нажать
кнопку «Отчет по результатам анализа»
15
.
9.
УЧЁТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
9.1.
Интерпретация результатов проводится с учётом значений
Cp для каждого образца по каналу специфики (канал Fam)
и внутреннего контроля (канал Hex) в соответствии с
таблицей 3.
ВНИМАНИЕ!
учитывается.
Результат
в
графе
16
«Качественный
анализ»
не
Таблица 3
Интерпретация результатов при использовании амплификаторов
детектирующих ДТ-322, ДТлайт, ДTпрайм и ДТ-96.
Результат по
каналу Fam
(Fam Cp)
Результат по
каналу Hex
Cp указан
Cp указан
Менее 8,0
Cp указан
Cp указан
Более 10
Cp не указан
Cp указан
Не учитывается
Аллель HLA
B27 не
обнаружен
Cp указан
8,0 – 10
Результат
сомнительный
Cp не указан
Не учитывается
Cp ≥ 33,0
Не учитывается
Cp указан
Cp указан/не
указан
∆Cp ((Fam Cp)
минус (Hex Cp))
Интерпретация
результата
(Hex Cp)
Аллель HLA
B27 обнаружен
Результат
недостоверный
В случае получения сомнительного результата необходимо
повторить проведение полимеразной цепной реакции для данного
образца. При повторном получении такого же результата следует
повторить пробоподготовку и проведение полимеразной цепной
реакции для данного образца.
Примечание. Если ДНК получена при использовании комплекта
реагентов для выделения ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА и значение ∆Cp
((Fam Cp) минус (Hex Cp)) укладывается в пределы от 8,0 до 10,
следует развести полученный препарат ДНК в 10 раз стерильной
дистиллированной водой. При этом необходимо учесть, что
показание «Ср HEX» изменится. В данном случае для образца
достоверным необходимо считать только тот результат, для
которого Ср HEX ≥ 35,0.
17
Недостоверный результат может быть связан с присутствием
ингибиторов в препарате ДНК, полученном из клинического
материала;
неверным
выполнением
протокола
анализа;
несоблюдением температурного режима амплификации и др. В этом
случае требуется либо повторное выделение ДНК и постановка
ПЦР, либо повторное взятие клинического материала (выполняется
последовательно).
9.2.
В
положительном
контрольном
образце
должен
определяться
аллель
HLA
B27.
При
получении
отрицательного или недостоверного
результата для
положительного контрольного образца результаты всей
постановочной серии считают недостоверными. В этом
случае требуется повторная постановка амплификации всей
партии образцов.
9.3.
Для отрицательного контрольного образца программа
фиксирует недостоверный результат (Cp не указан по
каналам Fam и Hex). При получении положительных
значений результаты всей постановочной серии считают
недостоверными. В этом случае необходимо проведение
специальных мероприятий для устранения контаминации.
18
Пример.
Результат по каналу Fam:
Образец 1
«К+»
«К-»
Результат по каналу Hex:
Образец 2
«К+»
«К-»
19
Образец 1
Интерпретация результатов:
Результат по
каналу Fam
Результат по
каналу Hex
(Fam Cp)
(Hex Cp)
Образец_1
31,3
Образец_2
∆Cp ((Fam Cp)
минус (Hex Cp))
Интерпретация
результата
29,8
1,5
(менее 8,0)
Аллель HLA B27
обнаружен
Cp не указан
29,4
Не
учитывается
Аллель HLA B27
не обнаружен
К+
28,5
25,9
2,6
(менее 8,0)
Аллель HLA B27
обнаружен
К-
Cp не указан
Cp не указан
Не
учитывается
Результат
недостоверный
Идентификатор
10.
УСЛОВИЯ
ТРАНСПОРТИРОВКИ,
ЭКСПЛУАТАЦИИ КОМПЛЕКТА
10.1.
Срок годности комплекта – 6 месяцев с даты изготовления.
10.2.
Комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК следует
хранить при температуре 2–8 °С в течение всего срока
годности.
10.3.
Транспортировку комплекта осуществляют всеми видами
крытого транспорта при температурах, соответствующих
условиям хранения комплектов реагентов, входящих в
состав комплекта.
10.4.
Комплект с истекшим сроком годности использованию не
подлежит.
10.5.
Для получения надежных результатов необходимо строгое
соблюдение инструкции по использованию комплекта.
10.6.
Предприятие-изготовитель
гарантирует
соответствие
комплекта
требованиям
технических
условий
при
соблюдении
условий
транспортировки,
хранения
и
эксплуатации, установленных техническими условиями.
20
ХРАНЕНИЯ
И
По вопросам, касающимся качества комплекта реагентов для
выявления
аллеля
27
локуса
В
главного
комплекса
гистосовместимости человека (HLA B27) методом ПЦР в режиме
реального
времени,
следует
обращаться
к
официальному
представителю производителя по адресу:
ООО «ДНК-Технология», 117587, Москва, Варшавское шоссе,
д.125ж, к.6
Тел./факс +7 (495) 980-45-55
Е-mail: [email protected]
www.dna-technology.ru
Анкета для осуществления обратной связи находится на сайте
компании «ДНК-Технология»:
http://www.dna-technology.ru/support/
21
Номер: 196-2
09.02.13
22
23
ДНК-Технология
117587, Москва, Варшавское ш., д.125ж, корп.6
Тел./факс +7 (495) 980-45-55
Е-mail: [email protected]
www.dna-technology.ru
24