2. Заббарова И.В., Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Губкин А.А., Петрова

УДК 547.915
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФЕРРИТИНА И МИОГЛОБИНА КАК ИНДУКТОРОВ
ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ. РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ
КИСЛОРОДА И АЗОТА
И.В. Заббарова, К.Б. Шумаев*, А.Ф. Ванин**, А.А. Губкин, Н.Э. Петрова*,
Э.К. Рууге
Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ,
121552 Москва, 3-я Черепковская 15А, E.mail: [email protected]
*Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский пр., 33
**Институт химической физики РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина 4
Аннотация
Исследовано
влияние
динитрозильных
комплексов
железа
(ДНКЖ),
S-нитрозоглутатиона (GSNO) и глутатиона (GSH) на индуцированное гидропероксидом
трет-бутила и метмиоглобином или их комбинацией с ферритином свободнорадикальное
окисление митохондрий из сердца крысы. Показано, что ДНКЖ или сочетание GSNO и
GSH наиболее эффективно ингибируют перекисное окисление мембран митохондрий.
Обнаружено, что ферритин стимулирует прооксидантное действие метмиоглобина. С
использованием спектроскопии ЭПР установлено, что в условиях генерации О2•–
происходит деструкция ДНКЖ. ДНКЖ также ингибировали образование тиильного
радикала возникающего при генерации О2•– в системе содержащей GSH и GSNO.
Существенно что, в данной реакционной системе формирование ДНКЖ происходило с
участием ферритина. Выдвинуто предположение, что в присутствии доноров NO
прооксидантное действие ферритина и миоглобина может инвертироваться в
антиоксидантное.
Ключевые
слова:
нитрозильные
комплексы
железа,
оксид
азота,
S-нитрозоглутатион, метмиоглобин, ферритин, супероксидные радикалы, ионы железа,
перекисное окисление липидов.
Активные формы кислорода и азота участвуют в защитном действии
макрофагов, синтезе простогландинов, лейкотриенов и тромбоксанов в регуляции
апоптоза и в других процессах необходимых для нормального функционирования
организма
[1-4].
В
то
же
время
нарушение
баланса
между
реакциями
свободнорадикального окисления и действием антиоксидантных систем способствует
развитию
таких
патологий
как
атеросклероз,
инфаркт
миокарда,
рак
и
нейродегенератиные заболевания [1-9]. Существенное значение для генерирования
свободнорадикальных интермедиатов в биологических системах имеют ионы железа и
их гемовые и негемовые комплексы [6-13]. Так гемсодержащие белки (миоглобин и
гемоглобин) играют важную роль в инициации перекисного окисления липидов (ПОЛ)
в биологических мембранах и участвуют в развитии окислительного стресса в ходе
ишемии и реперфузии [6, 9-11]. В то же время ферритин – белок, являющийся
основным депо железа у большинства живых организмов, может проявлять как
антиоксидантные, так и прооксидантные свойства [7, 8, 12-15]. Активные формы азота
также проявляют двойственные свойства в одних условиях стимулируя ПОЛ и
окислительный стресс, а в других ингибируя эти процессы [4, 5, 15-20]. Хорошо известно,
что при взаимодействии оксида азота с супероксидным радикалом образуется один из
сильнейших окислителей – пероксинитрит (ONОO-) [4, 5]. С другой стороны образование
близких к ONОO- по строению органических нитрозопероксикомплексов в реакции NO с
свободными радикалами липидов приводит к обрыву цепных реакций ПОЛ [16-18].
В литературе появляется все больше данных о связи метаболизма ферритина,
активных форм кислорода и NO [12, 15, 20-23]. Так, ферритин может участвовать в
образовании нитрозильных комплексов железа [21, 22]. В то же время синтез самого
ферритина регулируется оксидом азота [15, 22], а проходящая с участием ферритина,
микросомальная продукция активных форм кислорода, ингибируется донорами NO [12].
Интересно,
что
антиоксидантное
действие
NO
при
инкубации
культуры
эритролейкемических клеток с гидропероксидом трет-бутила и гемоглобином
сопровождается формированием нитрозильных комплексов железа [20]. Ранее нами
было
показано,
что
окислительная
деструкция
β-каротина
индуцированная
метмиоглобином или ферритином в сочетании с органическими гидропероксидами
эффективно ингибируется такими метаболитами NO как S-нитрозоглутатион и
динитрозильные комплексы железа с глутатионом [18, 19]. В настоящей работе
представлены результаты исследования взаимодействия миоглобина и ферритина как
индукторов ПОЛ в биологических мембранах, а также антиоксидантного действия в этих
2
условиях физиологических комплексов NO.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали восстановленный глутатион (Calbiochem, США),
гидропероксид трет-бутила (Merk, Германия), DEPMPO (5-диэтоксифосфорил-5метил-1-пирролин N-оксид) (OXIS, США), ксантиноксидазу, метмиоглобин, ферритин
и 2-тиобарбитуровую кислоту (Sigma, США).
S-нитрозоглутатион и динитрозильные комплексы железа с глутатионом в
диамагнитной димерной форме получали, как описано ранее [24], смешивая 300 мМ
NaNO2 и 200 мМ восстановленного глутатиона в кислой среде или растворы FeSO4 и
глутатиона в молярном соотношении 1:2 сосуде Тунберга в атмосфере NO,
соответственно. Препараты GSNO и ДНКЖ хранили при –20οС. Концентрацию ДНКЖ
определяли методом спектроскопии ЭПР. Поскольку в используемом препарате ДНКЖ
в основном содержалась не обнаруживаемая методом ЭПР димерная форма, ее
переводили в мономерную парамагнитную форму. Для этого в реакционную среду
добавляли цистеин в молярном отношении к ДНКЖ 1:25, что приводило к
образованию ЭПР-детектируемых мономерных ДНКЖ с цистеином. Пероксинитрит
получали, смешивая охлажденные растворы 1 М NaNO2 и 1 М Н2О2 в 0,3 М H2SO4
после чего быстро добавляли равный объём 1,4 М NaOН [18]. Концентрацию GSNO и
ONOO- определяли по оптической плотности, используя молярные коэффициенты
поглощения ε338 = 930 М-1см-1 и ε302= 1670 М-1см-1, соответственно [18].
Выделение митохондрий из сердца крыс проводили, как описано в работе [25].
Крысы линии Wistar-Kyoto (250-300 г) наркотизировали введением 20% раствора
уретана, затем быстро извлекали сердце и помещали в холодную (~4°C) среду
выделения. Среда выделения содержала: 0,3 М сахарозы; 10 мМ HEPES; 0,5 мМ EDTA;
pH 7,4. Измельченные ножницами сердце пропускали через давилку с диаметром
отверстий 1 мм и гомогенизировали в течение 3 мин при соотношении ткань-среда
выделения 1:8. Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 800 g, после чего
супернатант,
в
котором
содержались
митохондрии,
фильтровали
и
снова
центрифугировали в течение 10 мин при 14000 g. Осадок суспендировали в 0,4 мл
среды выделения, содержащей 2 мг/мл БСА, и промывали повторным осаждением.
После третьего осаждения митохондрии суспендировали в среде выделения (~40 мг/мл
белка) и хранили во льду или замораживая при –20°С. Перед экспериментами по
3
индуцированному перекисному окислению препарат митохондрии разбавлялся Na,Kфосфатным буфером (100 мМ, pH 7,4) до концентрации 0,5 мг белка в мл. Концентрацию
белка определяли модифицированным биуретовым методом [25].
Свободнорадикальное окисление митохондрий индуцировали добавлением
400 мкМ гидропероксида трет-бутила и 100 мкМ метмиоглобина. В ряде
экспериментов вместо метмиоглобина или совместно с ним добавляли ферритин (2,5
мг/мл). Образцы объемом в 1 мл инкубировались в течение 2 часов при 37°С после
чего в них определялось содержание малонового диальдегида (МДА). Для этого к 0,5
мл инкубационной смеси, содержащей препарат митохондрий, добавляли 1,5 мл 1%ной фосфорной кислоты, 10-4 М ЭДТА, 10-5 М ВНТ и 1 мл 0,5%-ного раствора 2тиобарбитуровой кислоты (ТБК), после чего инкубировали 45 мин при 100°С. После
охлаждения смеси, комплекс МДА с ТБК экстрагировали н-бутанолом. В бутанольной фазе
регистрировали спектр поглощения в области 515-550 нм. Концентрацию МДА
рассчитывали по оптической плотности комплексов МДА-ТБК при 532 нм (ε532= 1,56 .
105 М-1 см-1) [26]. Все оптические измерения проводили на спектрофотометрах
Hitachi 557 (Япония) и Beckman Coulter ∆ 650 (США).
При исследовании взаимодействия ДНКЖ с супероксидным радикалом (О2•–),
последний генерировали добавлением к реакционной смеси свежеприготовленного
раствора супероксида калия (КО2) в диметилсульфоксиде или использовали систему
ксантин-ксантиноксидаза для ферментативной генерации О2•– [19, 31]. В этих
экспериментах для связывания ионов железа возникающих при деструкции ДНКЖ в
инкубационную
среду
вводили
0,2-0,5
мМ
комплексона
железа
-
диэтилентриаминопентауксусной кислоты (ДТПА).
Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре E-109Е фирмы Varian (США),
при комнатной температуре (~25°C). Образцы перед измерением помещали в
стеклянные капилляры или в ряде экспериментов с генерацией О2•– – в
газопроницаемые тефлоновые капилляры (Norell, США). Условия записи спектров
ЭПР: СВЧ мощность 10 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,1 мТл
(для спин-аддуктов DEPMPO) или 0,4 мТл (для ДНКЖ).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Митохондрии являются одним из основных источников активных форм
4
кислорода и азота в живой клетке. Окислительное поражение этих органелл может играть
важную роль в возникновении многих патологий и инициировать гибель клетки по пути
апоптоза или некроза [3, 5, 27]. В работе [28] показано, что миоглобин регулирует
связанный с митохондриями обмен кислорода и NO в кардиомиоцитах. Ферритин, в том
числе его митохондриальная форма, является источником железа для многочисленных
железосодержащих белков этих органелл [7]. В то же время возможное влияние
миоглобина и ферритина на окислительную модификацию митохондрий изучено
недостаточно. В связи с этим мы исследовали свободнорадикальное окисление
митохондрий
индуцированное
сочетанием
гидропероксида
трет-бутила
с
метмиоглобином или их комбинацией с ферритином. На рис. 1 представлены результаты
изучения влияния S-нитрозоглутатиона (GSNO), GSH и ДНКЖ на образование вторичных
продуктов перекисного окисления (МДА) в препарате митохондрий из миокарда крысы.
Все исследуемые соединения ингибировали индуцированное гидропероксидом третбутила и миоглобином перекисное окисление в митохондриях, как в присутствии, так и
отсутствии ферритина (рис. 1 в-е). Образование МДА наиболее эффективно
подавлялось под действием ДНКЖ (рис.1 е), а также при сочетанном действии GSNO и
GSH (рис. 1 д). Следует отметить, что в последнем случае возможно формирование ДНКЖ
при взаимодействии GSNO, GSH и ионов железа содержащихся в реакционной среде [19].
Накопление МДА при окислении мембран митохондрий индуцированном
гидропероксидом трет-бутила в сочетании с метмиоглобином и ферритином было достоверно
выше, чем в присутствии гидропероксида трет-бутила и миоглобина (рис. 1 б). В реакциях
между метмиоглобином и органическими гидропероксидами образуются алкоксильные (RO.),
алкилпероксильные (ROO.) радикалы и оксоферрилмиоглобин (Mb-FeIV=O):
Mb-FeIII + ROOH → Mb-FeIV=O + RO. + OH-
(1)
Mb-FeIII + ROOH → Mb-FeII + ROO. + H+
(2)
Mb-FeII + ROOH → Mb-FeIII + RO. + OH-
(3)
В то же время, в реакциях 2 и 3 могут участвовать свободные ионы железа,
содержащиеся в препарате митохондрий и высвобождающиеся из ферритина. Так как
инкубация препарата митохондрий с гидропероксидом трет-бутила и ферритином
вызывала лишь незначительное окисление митохондриальных мембран (рис 1 а) можно
предположить, что ионы FeII быстро окисляются до менее активных ионов трехвалентного
железа. С другой стороны ионы железа могут вызывать генерацию O2.- в реакции ХабераВайса приводящей далее к образованию перекиси водорода и гидроксильного радикала
(НO.):
5
FeII + O2 → FeIII + O2.-
(4)
FeII + O2.- + 2Н+ → FeIII + Н2О2
(5)
FeII + Н2О2 → НO. + FeIII
(6)
Другим источником O2.- в используемой нами модельной системе может быть
убисемихинон и другие компоненты митохондриальной мембраны способные к
одноэлектронному восстановлению кислорода:
Q10.- + O2 → Q10 + O2.-
(7)
Хорошо известно, что O2.- вызывает высвобождение ионов Fe2+ из ферритина
[13, 22]. Показано также [11], что образующаяся из O2.- перекись водорода окисляет
миоглобин с образованием таких мощных окислителей как оксоферрилмиоглобин и
гидроксильный радикал:
Mb-FeOHIII + H2O2 → Mb-FeIV=O + HO. + H2O
(8)
Таким образом, более высокий уровень индуцированного миоглобином и
гидропероксидом трет-бутила окисления митохондриальных мембран в присутствии
ферритина, по-видимому, связан со стимуляцией образования O2.- и увеличением
концентрации свободных ионов железа. Восстановленный глутатион и NO также
способствуют высвобождению ионов железа из ферритина [23, 29], причем GSH может
играть и прооксидантную роль восстанавливая ионы FeIII, и тем самым катализируя
реакцию Хабера-Вайса.
Связывание ионов железа с образованием нитрозильных комплексов может
объяснять высокую эффективность антиоксидантного действия сочетания GSNO и
глутатиона. Действительно ранее нами было показано, что в присутствии доноров NO,
GSH и ферритина происходит образование ДНКЖ, причем генерация O2.- стимулирует
этот процесс [19]. ДНКЖ в свою очередь могут взаимодействовать с липидными
радикалами [17] и восстанавливать оксоферрилмиоглобин [30].
В то же время, нельзя исключить, что ДНКЖ могут реагировать
непосредственно с O2.- . Действительно из рис. 2 видно, что ДНКЖ ингибирует
образование спиновых аддуктов DEPMРО и O2.- в условиях происходящей при
декомпозиции KO2 интенсивной генерации супероксидного радикала. Данный факт
согласуется с ранее обнаруженным антиоксидантным действием мононитрозильных
комплексов железа в ходе ферментативной генерации O2.- [31]. На рис 3 представлены
кинетики деструкции ДНКЖ при ферментативной генерации O2.- в системе ксантин ксантиноксидаза. В присутствии метмиоглобина скорость распада ДНКЖ резко
6
возрастает (рис 3 А, кривая 2), однако этот эффект почти полностью снимается
каталазой (рис 3 Б). Полученные результаты указывают на то, что снижение ЭПРдетектируемой концентрации ДНКЖ происходит как под действием O2.-, так и
гидроксильного радикала, возникающего в условиях наших экспериментов в реакции
между Н2О2 и метмиоглобином (реакция 8).
Высокая антиоксидантная активность ДНКЖ, позволяет заключить, что при
взаимодействии этого комплекса NO с O2.-, по-видимому, не происходит образования
пероксинитрита. Тем не менее, формирование ONOO- может происходить в реакции
между O2.- и свободным NO. С этим эффектом, возможно, связана сравнительно низкая
антиоксидантная активность GSNO в ходе окисления препарата митохондрий в
системе содержащей миоглобин, ферритин и гидропероксид трет-бутила (рис 1 в).
Действительно, в реакционной среде содержащей GSNO, GSH и ферментативную
систему генерации O2.- возникал аддукт тиильного радикала и DЕРМРО аналогичный
образующемуся при взаимодействии GSH и ONOO- (рис. 4, спектры 1 и 2). Добавление
ферритина одновременно с GSNO в условиях ферментативной генерации O2.- не
приводит к существенному снижению сигнала ЭПР аддукта тиильного радикала с
DЕРМРО (рис. 4, спектр 3). В то же время образование тиильного радикала практически
полностью
ингибировалось,
если
ксантин
и
ксантиноксидаза
добавлялись
в
реакционную среду после предварительной инкубации GSNO, GSH и ферритина (рис. 4,
спектр 4). Как уже отмечалось ранее в ходе такой инкубации происходит
формирование ДНКЖ (рис. 5, спектр г), взаимодействие которых с O2.- и, вероятно, с
ONOO- [19, 31] предотвращает образование тиильного радикала.
Таким
образом,
проведенные
нами
эксперименты
свидетельствуют
о
возможности прооксидантного синергизма ферритина и миоглобина, реализующегося, повидимому, в условиях генерации активных форм кислорода. Напротив GSH и Sнитрозоглутатион в присутствии ферритина и миоглобина действуют, как антиоксиданты
синергисты. Этот факт, как мы полагаем, связан с образованием ДНКЖ, которые
способны эффективно восстанавливать оксоферрилмиоглобин [30] и нейтрализовывать
различные свободные радикалы, в том числе органические пероксильные радикалы и O2.-,
предположительно в ходе следующих реакций:
Mb-FeIV=O + (GS-)2-Fe-(NO+)2 → Mb-FeIII + (GS-)2-FeII-(NO+)ONO
(GS-)2-FeII-(NO+)ONO + GSH → (GS-)2-Fe-(NO+)2 + GSOH
(GS-)2-Fe-(NO+)2 + ROO. + H2O → 2GS- + FeNO + ROH + HNO2
7
(9)
(10)
(11)
(GS-)2-Fe-(NO+)2 + O2.- → 2GS- + FeNO + NO3-
(12)
Известно, что нитрозомиоголобин проявляет антиоксидантные свойства
ингибируя соокисление β-каротина и полиненасыщенных жирных кислот [10].
Следовательно, в условиях генерации NO возможна инверсия прооксидантных свойств
ферритина и миоглобина в антиоксидантные, так как первый является источником
ионов железа для ДНКЖ, а второй может переходить в нитрозилированую форму.
Исходя из этого представляется вероятным, что взаимодействие NO, ферритина и
миоглобина может играть ключевую роль в поддержании тонкого равновесия в
реакциях свободнорадикального окисления от которого во многом зависит судьба
клетки в условиях гипоксии и последующей реоксигенации особенно характерных для
ишемического поражения мышечной ткани.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов INTAS № 00-0554,
РФФИ № 01-04-48132 и № 02-04-49951.
8
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Зенков
Н.К.,
Ланкин
биохимический
и
В.З.,
Меньщикова
Е.Б.
патофизиологический
//
Окислительный
аспекты.
М.
стресс:
МАИК
Наука/Интерпериодика, 2001. 344 с.
2. Droge W. // Physiol. Rev. 2003. V. 82. 47-95.
3. Chandra J., Samali A., Orrenius S. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29. P. 323-333.
4. Bloodsworth A., O’Donnell V.B., Freeman B.A. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2000.
V. 20. P. 1707-1715.
5. Valdez L.B., Alvarez S., Arnaiz S.L., Schopfer F., Carreras M.C., Poderoso J.J., Boveris
A. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29. P. 349-356.
6. Sevanian A., Ursini F. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29. P. 306-311.
7. Arosio P., Levi S. // Free Rad. Biol. Med. 2002. V. 33. P. 457-463.
8. Linert W., Jameson G.N. // J. Inorg. Biochem. 2000. V. 79. P. 319-326.
9. Calaris D., Eddy L., Arduini A., Cadenas E., Hochstein P. // Biochem. Biophys. Res.
Commun. 1989. V. 160, P. 1162-1168.
10. Kanner J., Ben-Gera I., Berman Sh. // Lipids. 1980. V. 15. P. 944-947.
11. Grisham M.B. // J Free Rad. Biol. Med. 1985. V. 1. P. 227-232.
12. Puntaro S., Cederbaum A.I. // Arch. Biochem. Biophys. 1997. V. 340. P. 19-26.
13. Reif D.W. // Free Rad. Biol. Med. 1992. V. 12. P. 417-427.
14. Balla J., Rosenberg M., Nath K., Apple F., Eaton J.W., Vercellotti M.// J. Biol. Chem. 1992.
V. 267. P. 18148-18153.
15. Oberle S., Schroder H. // Nitric Oxide. 1997. V. 1. P. 308-314.
16. Rubbo H., Radi R., Trujillo M., Telleri R., Kalyanaraman B., Barnes S., Kirk M.,
Freeman B.A. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 26066-26075.
17. Chamulirat W. // Antioxid. Redox Signal. 2001. V. 3. Р. 177-187.
18. Шумаев К.Б., Рууге Э.К., Ланкин В.З., Ванин А.Ф., Гомбоева С.Б. Беленков Ю.Н.//
Докл. РАН. 2001. Т. 379. С. 702-704.
19. Шумаев К.Б., Заббарова И.В., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. // Биофизика. 2003. Т. 48. С. 5-10.
9
20. Yalowich J.C., Gorbunov N.V., Kozlov A.V., Allan V., Kagan V.E. // Biochemistry. 1999.
V.38. P. 10691-10698.
21. Watts R.N., Richardson D.R. // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 3383-3392.
22. Lipinski P., Drapier J-C. // JBIC. 1997. V. 2. P.559-566.
23. Reif D.W., Simmons R.D. // Arch. Biochem. Biophys. 1990. V. 283. P. 537-41.
24. Vanin A.F., Muller B., Alencar J. L., Lobysheva I.I., Nepveu F., Stoclet J.-C. // Current
Topics in Biophisics. 2002. V. 26. P. 26101-113.
25. Коркина О.В., Рууге Э.К. // Биофизика. 2000. Т.45. С. 695-699.
26. Шумаев К.Б., Рууге Э.К., Дмитровский А.А., Быховский В.Я., Кухарчук В.В. //
Биохимия. 1997. Т.62. С.769-773.
27. Palomba L., Sestili P., Cantoni O. // J. Neurosci. Res. 2001. V. 65. P. 387-395.
28. Flogel U., Merx M.W., Godecke A., Decking U.K.M., Schrader J. // PNAS. 2001. V. 98.
P. 735-740.
29. Reif D.W., Samokyszyn V.M., Miller D.M, Aust S.D. // Arch. Biochem. Biophys. 1989.
V. 269. P. 407-414.
30. Шумаев К.Б., Петрова Н.Э., Заббарова И.В., Ванин А.Ф., Топунов А.Ф., Ланкин
В.З., Рууге Э.К. // Биохимия (в печати).
31. Vanin A.F., Huisman A., Stroes E.S.G., de Ruijter-Heijstek F.C.,Rabelink T.J., Faassen
E.E. // Free Rad. Biol. Med. 2001. V. 30. P. 813-824.
10
ПОДПИСИ К РИСУНКАМ
Рис. 1. Накопление МДА в ходе свободнорадикального окисления препарата
митохондрий из миокарда крысы. Реакционная среда содержала: (а) - препарат
митохондрий (0,5 мг белка/мл), 100 мМ Na,K-фосфатный буфер pH 7,4 и 400 мкМ
гидропероксида трет-бутила; (б) – то же, что и (а) плюс 100 мкМ метмиоглобина; (в) - то
же, что и (б) плюс 100 мкМ GSNO; (г) - то же, что и (б) плюс 200 мкМ GSH; (д) - то же,
что и (б) плюс 100 мкМ GSNO и 200 мкМ GSH; (е) - то же, что и (б) плюс 50 мкМ
ДНКЖ. В серии параллельных экспериментов в среду инкубации добавляли 2,5 мкг/мл
ферритина (заштрихованные столбики). Указаны средние значения и их стандартные
ошибки (n=4-5).
Рис. 2. Спектры ЭПР свободнорадикальных аддуктов ДЕПМПО с супероксидным радикалом.
Генерация O2.- в ходе декомпозиции супероксида калия (КО2). Реакционная среда содержала:
(1) - 150 мМ К,Na-фосфатный буфер рН 7,4, 0,5 мМ DTPA, 25 мМ DEPMPO, 8 мМ КО2; (2) –
то же, что и (1) плюс 0,5 мМ ДНКЖ. Сигнал ЭПР с g фактором 2,03 соответствует
парамагнитной мономерной форме ДНКЖ.
Рис. 3. Кинетики деструкции ДНКЖ в условиях ферментативной генерации
супероксид-анион радикала: A - реакционная среда содержала 1 мМ ксантина, 0,2
ед./мл ксантиноксидазы, 120 мкМ ДНКЖ, 100 мМ Na,K-фосфатного буфера pH 7,4, 0,2
мМ DTPA; B - то же, что и A плюс 200 ед./мл каталазы. Кривые (2 А и 2 Б) отражают
кинетику распада ДНКЖ в присутствии 100 мкМ метмиоглобина. Указаны средние
значения и их стандартные ошибки (n=3-4).
Рис. 4. Спектры ЭПР свободнорадикальных аддуктов ДЕПМПО с тиильным радикалом.
Реакционная среда содержала: (1) - 150 мМ К,Na-фосфатный буфер рН 7,4, 25 мМ
DEPMPO, 20 мМ GSH, 1,5 мМ пероксинитрита; (2) – то же что и (1), но вместо
пероксинитрита добавлены 1 мМ ксантина, 0,2 ед./мл ксантиноксидазы и 2 мМ GSNO; (3) то же что и (2) плюс 2,5 мкг/мл ферритина; (4) - то же что и (3), но до добавления
ксантиноксидазы и ксантина ферритин 10 мин инкубировался с GSNO и GSH.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФЕРРИТИНА И МИОГЛОБИНА КАК ИНДУКТОРОВ
ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ. РОЛЬ АКТИВНЫХ ФОРМ
КИСЛОРОДА И АЗОТА
И.В. Заббарова, К.Б. Шумаев*, А.Ф. Ванин**, А.А. Губкин, Н.Э. Петрова*,
11
Э.К. Рууге
Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ,
121552 Москва, 3-я Черепковская 15А, E.mail: [email protected]
*Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский пр., 33
**Институт химической физики РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина 4
Interaction of Ferritin and Myoglobin as Inductors of Peroxidation of
Lipids. The Role of Reactive Oxygen and Nitrogen Species
I.V. Zabbarova, K.B. Shumaev*, A.F.Vanin**, Gubkin A.A., N.E. Petrova*,
E.K. Ruuge
Russian Cardiology Research Center, 3rd Cherepkovskaya ul. 15a, Moscow 121552,
Russia; fax: (095)415-2962, E-mail: [email protected]
* Bach Institut of Biochemistry of RAS, Leninsky prospekt 33; Moscow119071, Russia
** Institut of Chemical Physics of RAS, Moscow 119991, Russia
Исследовано
влияние
динитрозильных
комплексов
железа
(ДНКЖ),
S-нитрозоглутатиона (GSNO) и глутатиона (GSH) на индуцированное гидропероксидом третбутила и метмиоглобином или их комбинацией с ферритином свободнорадикальное
окисление митохондрий из сердца крысы. Показано, что ДНКЖ или сочетание GSNO и GSH
наиболее
эффективно
ингибируют
перекисное
окисление
мембран
митохондрий.
Обнаружено, что ферритин стимулирует прооксидантное действие метмиоглобина. С
использованием спектроскопии ЭПР установлено, что в условиях генерации О2•– происходит
деструкция ДНКЖ. ДНКЖ также ингибировали образование тиильного радикала
возникающего при генерации О2•– в системе содержащей GSH и GSNO. Существенно что, в
данной реакционной системе формирование ДНКЖ происходило с участием ферритина.
Выдвинуто предположение, что в присутствии доноров NO прооксидантное действие
ферритина и миоглобина может инвертироваться в антиоксидантное.
Ключевые
слова:
нитрозильные
комплексы
железа,
оксид
азота,
S-нитрозоглутатион, метмиоглобин, ферритин, супероксидные радикалы, ионы железа,
перекисное окисление липидов.
12