ПРИЛОЖЕНИЕ IV

ПРИЛОЖЕНИЕ IV
Определение параметров процессов,
одиночных клеток в суспензионных
непрерывным способом.
происходящих на уровне
культурах, выращиваемых
В приложениях II и III иллюстрировался разработанный нами способ определения
параметров процессов, происходящих в асинхронных суспензионных клеточных
популяциях на уровне одиночной клетки, который применялся только к клеточным
популяциям, культивируемым периодическим методом. При периодическом
культивировании популяция микоорганизимов или клеток проходит определенный цикл
развития, в течение которого происходит смена фаз или периодов* (рис.1).
[*Нами в ЭФР выявлены четыре новых однозначно идентифицируемых фаз роста : первая переходная фаза
роста (I-ПФР); стабильная фаза роста (СФР); C – вторая переходная фаза роста (II - ПФР). В
определенных ситуациях при периодическом культивировании вместо ЭФР имеет место промежуточная
фаза роста (ПрФР).]
Для клеток при периодическом культивировании экспоненциальная фаза роста
(ЭФР) является наиболее благоприятной фазой. В этой фазе клетки популяции полностью
адаптируются к заданным условиям и рост культуры не ограничивается ни недостатком
питательных веществ, ни избытком продуктов обмена. То есть, в ЭФР имеет место
нелимитированный рост. Нахождение культуры в ЭФР можно продлить непрерывнопроточным культивированием. В настоящее время существует множество
автоматизированных культиваторов с непрерывной подачей в него питательных веществ и
одновременным оттоком культуральной жидкости. При непрерывном культивировании
можно застабилизировать рост популяции в любой активной фазе развития, в том числе
и экспоненциальной. В основном контроль и управление процессами непрерывного
культивирования суспензионных клеточных популяций осуществляется двумя способами:
турбидостатным и хемостатным.
Турбидостатное культивирование. При турбидостатном культивировании в
автоматическом режиме на определенном уровне поддерживается оптическая плотность
(ОП) культуры (или концентрация биомассы клеток популяции) (рис.2). При увеличении
ОП культуры до заданного предела происходит слив из культиватора определенной части
суспензионной культуры и одновременно в культиватор добавляется такой же объем
порции свежей питательной среды. После чего ОП культуры понижается до нижнего
заданного уровня. Продолжающийся рост популяции и увеличение ОП суспензии
приводит к следующему циклу слива-долива. Чем выше чувствительность датчика, тем
меньше величина зубцов на кривой изменения оптической плотности, тем точнее уровень
поддержания концентрации биомассы при сохранении постоянства объема суспензионной
культуры в культиваторе или ферментере. Таким образом, несмотря на дискретную
подачу питательной среды, процесс роста может быть превращен в квазинепрерывный, т.е.
фактически в непрерывный. Соответственно, и клетки суспензионной культуры на
протяжении всего процесса практически будут находиться в одинаковых условиях. При
высоких скоростях роста популяции акты слива-долива могут чередоваться друг за другом
в пределах нескольких десятков секунд. Оптимальной областью применения
турбидостатного культивирования является ЭФР (a) (рис.3).
Турбидостатное культивирование является очень удобным способом для получения
процессов с максимальной скоростью роста суспензионных культур. Его используют как
для получения максимального количества биомассы, некоторых ферментов и других
продуктов, так и для исследовательских целей.
Несложно застабилизировать или зафиксировать развитие популяции и в какойлибо точке фазы замедления роста: для этого нужно, согласно ранее установившимся
1
представлениям, подавать в культиватор свежую питательную среду с постоянной
скоростью, соответствующей скорости роста популяции в данной точке.
Хемостатное культивирование. При хемостатном культивировании в ферментер
с выбранной постоянной скоростью поступает питательная среда , с такой же
скоростью происходит отток культуры. Данный способ культивирования широко
используется при различных экспериментальных исследованиях. Во время хемостатаного
культивирования в питательной среде, подаваемой в культиватор, обычно в избытке
содержатся все компоненты среды за исключением какого-либо одного фактора,
являющегося ограничителем роста клеток микроорганизмов. К тому же имеется
возможность варьировать концентрацией этого лимитирующего фактора. Таким образом,
имеется возможность оценивать количественное влияние того или иного фактора на
развитие популяции. Областью применения хемостатного культивирования является
фаза замедления роста (b) (рис.3).
В пределах данного приложения проиллюстрируем принцип применения способа
выявления параметров процессов, происходящих на уровне одиночной клетки
суспензионных культур, выращиваемых турбидостатным способом.
Рис. 1. Три составляющие экспоненциальной фазы роста численности клеток
суспензионной культуры.
A – первая переходная фаза роста (I-ПФР), (μ = μmax,); B – стабильная фаза роста
(СФР), (μ = μmax,); C – вторая переходная фаза роста (II - ПФР), (μ = μmax,). При фазе
ускорения роста (II) и фазе замедления роста (IV) - (μ < μmax).
Нами в ЭФР выявлены четыре новых однозначно идентифицируемых фаз роста : первая переходная фаза
роста (I-ПФР); стабильная фаза роста (СФР); C – вторая переходная фаза роста (II - ПФР). В
2
определенных ситуациях при периодическом культивировании вместо ЭФР имеет место промежуточная
фаза роста (ПрФР).]
Рис. 2. Поддержка суспензионной культуры клеток в экспоненциальной фазе роста
турбидостатным способом.
Стрелками обозначены моменты отбора части культуры и добавления свежей среды.
X – оптическая плотность (биомасса или концентрация клеток), t – время.
Рис. 3. Области применения турбидостатного и хемостатного культивирования на
S-образной кривой роста суспензионной культуры клеток.
3
a – зона применения турбидостатного культитвирования (в пределах экспоненциальной
фазы роста).
b - зона применения хемостатного культитвирования (в пределах фазы замедления
роста).
X – оптическая плотность (биомасса или концентрация клеток), t – время.
Поддержание концентрации компонентов питательной среды при разбавлении
суспензионной культуры с учетом ее возрастного состава.
Обычно основным показателем разбавления суспензионной культуры является
концентрация клеток суспензионной культуры, а точнее биомасса культуры, определяемая
оптической плотностью (ОП) культуры.
Независимо от того, производится ли разбавление культуры в два раза при
достижении одного и того же уровня определенной концентрации культуры (рис.4 → b)
или культура разбавлялась через каждый один и тот же фиксированный дискретный шаг
времени Δt разбавлялась в (1+ ΔXj/Xj) раз (рис.5 → b), тем не менее, как в первом, так и во
втором случаях при разбавлении суспензионной культуры не учитывалась оптимальность
концентрации питательной среды для неперывно изменяющегося распределения клеток
культуры по возрасту (возрастного состава клеток культуры). Следовательно,
оптимальный уровень концентрации субстрата (Sopt = q мг/мл) в культуре, с учетом ее
возрастного состава, не восстанавливается.
Мы же, в отличие от установившихся традиционных методов непрерывного
культивирования имеем возможность при разбавлении суспензионной культуры
питательной средой определять и учитывать:
a)
непрерывно изменяющийся возрастной состав клеток культуры;
b) оптимальную динамику утилизации каждого из компонентов питательной среды
одиночной клеткой в зависимости от ее возраста, когда клетка в течение ее
жизненного цикла синтезирует продукт с максимальной интенсивностью.
На рис.6 проиллюстрированы результаты имитационной модели, когда
суспензионная культура, также как и на приведенном ранее примере (рис.4), разбавляется
в два раза через период времени равный длительности клеточного цикла. Но в отличие от
предыдущего случая имеется возможность одновременно и непрерывно вычислять расход
субстрата и количество синтезируемого вещества в зависимости от возрастнгого состава
популяции. И только основываясь на этих двух показателях через период равный
длительности клеточного цика добавлять соответствующее количество субстрата или его
составляющих по отдельности.
На рис.7 проиллюстрированы результаты имитационной модели, когда
суспензионная культура, также как и на приведенном ранее примере (рис.5), разбавляется
через небольшой, относительно длительности клеточного цикла, интервал времени. Здесь
также непрерывно производятся вычисления для определения расхода питательного
субстрата или его компонентов, а также количества синтезированного продукта в
зависимости от возрастного состава и при этом каждый раз добавляется уже
оптимизированный состав компонентов питательного субстрата именно для текущего
момента времени, точнее, для соответствующего возрастного состава клеток
суспензионной культуры.
Иначе говоря, к непрерывным суспензионным культурам в стабильной фазе роста
(СФР) можно применять весь спектр разработанных нами способов и подходов,
предназначенных для периодических культур (СФР).
Определение и прогнозирование динамики численности клеточной популяции и
возрастного состава непрерывных (турбидостатных) суспензионных культур дает также
возможность определять динамику утилизации субстрата и динамику синтеза продукта
одиночной клеткой в течение ее жизненного цикла или в зависимости от ее возраста.
Учитывая возрастной состав клеток суспензионной культуры, можно весьма точно
4
прогнозировать динамику количества синтезируемого культурой продукта и,
соответственно, определить оптимальное время отбора из ферментера культуральной
жидкости,содержащей максимальное количество синтезируемого продукта.
В целом разработанные способы позволяют производить определение и
прогнозирование в процессе непрерывного (турбидостатного) культивирования при
варьировании значениями:
- оптимального объема культуры;
- оптимальной концентрации субстрата;
- оптимального (застабилизированного) уровня концентрации клеток;
- верхней и нижней границ концентрации клеток культуры в пределах которых
производится выращивание суспензионной культуры;
- интервалов времени, через которые производятся разбавления культуры;
- и т.д.
Рис. 4. Динамика роста численности (концентрации) клеточной популяции ЭФР (или
СФР) при периодическом и непрерывном (турбидостатном) культивировании
суспензионной культуры в моменты tj , j  0,18 , (g = 3Δt).
a) Динамики роста численности клеточной популяции при периодическом
культивировании.
b) Динамики роста численности клеточной популяции при непрерывном
(турбидостатном) культивировании; Δt – шаг дискретизации популяции по времени и
шаг дискретизации клеток по возрасту Δt = Δτ, g = 3Δτ – длительность клеточного цикла.
t6; t9; t12; t15; t18 - моменты разбавления (в два раза) суспензионной культуры при
достижении концентрации 40кл/мл. 40 и 20 кл/мл – заданные верхний (ВП) и нижний
(НП) пределы концентрации суспензионной культуры при турбидостатном
культивировании.
5
Xj – концентрация клеток популяции (кл/мл), tj – время.
Рис. 5. Динамика роста численности (концентрации) клеточной популяции ЭФР (или
СФР) при периодическом (a) и непрерывном (турбидостатном) (b) культивировании
суспензионной культуры в моменты tj , j  0,18 , (g = 3Δt).
Xj – концентрация клеток популяции (кл/мл), tj – время. Разбавление суспензионной
культуры началось с момента t7.
6
Рис. 6. Динамика численности клеток суспензионной культуры, утилизации
субстрата питательной среды и синтеза продукта в суспензионной культуре ЭФР
(СФР) при непрерывном (турбидостатном) культивировании. Выращивание
культуры осуществляется в пределах 20 – 40 кл/мл.
●—● X″j – число (или концентрация) клеток популяции (кл/мл) в момент tj
S″j - концентрация субстрата культуры (в условных единицах - у.е./мл) в момент tj
○—○ P″j - концентрация синтезируемого продукта культурой (у.е./мл) в момент tj
7
Длительность клеточного цикла g = 3tΔ. Разбавление произведено в t6; t9; t12; t15; t18 моменты времени. При
достижении концентрации 40 кл/мл культура разбавлялась в два раза (40→ 20 кл/мл). Оптимальная
концентрация субстрата равна S″j,opt = 291,5 у.е./мл.
8
Рис. 7. Динамика численности клеток суспензионной культуры, утилизации
субстрата питательной среды и синтеза продукта в суспензионной культуре ЭФР
9
(СФР) при непрерывном (турбидостатном) культивировании. Рост культуры
застабилизирован на уровне 40 кл/мл.
●—● X″j – число (или концентрация) клеток популяции (кл/мл) в момент tj
S″j - концентрация субстрата культуры (в условных единицах - у.е./мл) в момент tj
○—○ P″j - концентрация синтезируемого продукта культурой (у.е./мл) в момент tj
Длительность клеточного цикла g = 3tΔ. Разбавление производилось через Δt, начиная с t7 по t18 момент
времени включительно. Рост культуры застабилизирован на уровне концентрации клеток X″j,opt = 40 кл/мл.
Оптимальная концентрация субстрата равна S″j,opt = 207,5 у.е./мл.
Л. Казарян
10