Рыжманова Яна Владимировна
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО НАУЧНЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН) На правах рукописи РЫЖМАНОВА ЯНА ВЛАДИМИРОВНА НОВЫЕ ЭКСТРЕМОФИЛЬНЫЕ АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ, ВОССТАНАВЛИВАЮЩИЕ СОЕДИНЕНИЯ СЕРЫ И ЖЕЛЕЗА Специальность: 03.02.03 – Микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических Щербакова В. А. Пущино - 2015 наук, 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение…………………………………………………………………………………..4 Обзор литературы……….…………………………………………………………........9 Глава 1. Биоразнообразие сульфатвосстанавливающих бактерий в экстремальных местах обитания…………………………………………………………………………..9 1.1. Характеристика сульфатвосстанавливающих бактерий…………………………..9 1.1.1. Особенности конструктивного и энергетического обмена СВБ…....................10 1.1.2. Филогения сульфатвосстанавливающих прокариот…………………...……….13 1.1.3. Экология и распространение сульфатвосстанавливающих бактерий ..……....17 1.1.4. Методы детекции и анализа популяций сульфатредукторов.............................18 1.2. Распространение и активность сульфатвосстанавливающих бактерий в экосистемах содовых озер…………………………………………………………........21 1.3. Сульфатвосстанавливающие бактерии многолетнемерзлых отложений полярных областей …………………...............................................................................23 Глава 2. Алкалофильное микробное сообщество содовых озер……………….........25 2.1. Содовые озера: происхождение и распространение……………………………...25 2.2. Содовые озера Забайкалья …………...……………………….…….......................26 2.3. Первичная продукция органического вещества в содовых озерах……..……….28 2.4. Начальные этапы разложения органического вещества в содовых озерах……..30 2.5. Терминальная стадия деструкции органического вещества …………………….32 2.6. Микробное восстановление железа в содовых озерах ….......……...………........34 Заключение по обзору литературы……………………………………….….................35 Глава 3. Материалы и методы исследования…………………………………............37 3.1 Районы и объекты исследования ………………………..………..……..................37 3.2. Среды и условия культивирования……………………………….……………….39 3.3. Микробиологические методы учета численности бактерий…………….............41 3.4. Методы контроля чистоты культур………………………………….….................43 3.5. Микроскопические методы исследования………………………………..............43 3.6. Изучение физиолого-биохимических свойств изолятов……………....................43 3.7. Спорообразование…………………………………………………………………..45 3.8. Аналитические методы..……………………………………………………..……..45 3 3.8.1. Определение продуктов брожения и окисления……………………..................45 3.8.2. Определение сероводорода………………………………………………...…….46 3.8.3. Определение десульфовиридина, цитохромов и менахинонов ……….…........46 3.8.4. Определение ионов двухвалентного железа…………………………................47 3.8.5. Анализ жирнокислотного состава клеток…………………………….................47 3.9. Молекулярно-генетические методы…………………………………….................48 3.9.1. Выделение хромосомной ДНК……………………………..................................48 3.9.2. Определение содержания Г+Ц пар в ДНК………………..……………………..49 3.9.3. ДНК-ДНК гибридизация……………………………………………….…...........50 3.9.4. Разработка праймеров in silico..……………………………………..……...........50 3.9.5. Полимеразная цепная реакция……………………………………..…….............50 3.9.6. Секвенирование ………………………………………………….....……….........52 3.9.7. Филогенетический анализ……………………………………………….….........52 Глава 4. Результаты и обсуждение…………………………………………………….53 4.1. Определение численности бактерий в криопэгах полуострова Ямал..................53 4.2. Психротолерантный сульфатредуктор из арктического криопэга………...…….55 4.3. Обнаружение сульфатвосстанавливающих бактерий в содовых озерах Соленое и Сульфатное…………..………………………………………………….......................59 4.4. Определение численности сульфатредукторов в содовых озерах…………........62 4.5. Новые анаэробные бактерии содовых озер………………………………….........64 4.5.1. Сульфатвосстанавливающие бактерии……………….……………………........64 4.5.2. Выделение и характеристика анаэробной алкалофильной протеолитической бактерии………………………………………………………………………………….71 4.6. Восстановление Fe(III) сульфатвосстанавливающими бактериями в щелочных условиях………………………………………………………………………………….78 4.7. Новые виды анаэробных бактерий………………………….…………...…..…….79 Заключение………………………………………...……………………………………82 Выводы…………………………………………...…………………………..………….84 Список сокращений………………..…………………………………….……….........85 Список литературы………………………………………………………….…...........86 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. К настоящему времени известным фактом является участие микроорганизмов в природных биогеохимических циклах. Анаэробные микроорганизмы принимают участие в процессах восстановления соединений переменновалентных элементов, к которым относятся сера и железо. Сульфатвосстанавливающие прокариоты – это обширная группа микроорганизмов, объединяющая археи и бактерии, представители которой способны, кроме соединений серы, восстанавливать соединения железа, марганца, мышьяка, хрома и других элементов. Сульфатредукторы населяют различные экосистемы и хорошо адаптированы к экстремальным условиям существования. Несмотря на общепринятое представление о низких скоростях биохимических реакций, идущих при пониженных температурах, глобальный вклад низкотемпературных микробных сообществ может быть очень значительным, учитывая масштабы занимаемых ими территорий. В последнее время интерес к микроорганизмам холодных экосистем активизировался еще и в связи с угрозой глобального потепления, в случае которого огромное количество захороненного органического вещества окажется вновь вовлеченным в биогеохимические циклы с участием присутствующей микрофлоры. Все перечисленные факторы обусловили активное развитие относительно новой области микробиологии - исследования холодоустойчивых микроорганизмов и микробных сообществ (Cowan et al., 2002; Deming, 2002; Priscu et al., 2004; Rivkina et al., 2004; Trotsenko et al., 2005; Steven et al., 2006). Уникальной экологической нишей являются криопэги – закрытые водные системы морского происхождения, залегающие в мерзлых толщах возрастом 6-120 тысяч лет на глубине нескольких десятков метров в виде линз хлоридно-натриевых вод, характеризующиеся постоянной отрицательной температурой и высокой минерализацией (60-300 г/л) (Gilichinsky et al., 2005). Как показали исследования последнего десятилетия, криопэги являются местом обитания психрофильных, психротрофных и галофильных микроорганизмов. Арктические криопэги 5 характеризуются высоким содержанием сульфата (0.62-3.84 г/л) и населены сульфатредукторами, которые осуществляют в них терминальную стадию разрушения органического вещества (Gilichinsky et al., 2003; Печерицына и др., 2007). Однако на данный момент выделен и описан лишь один психроактивный сульфатредуктор из распресненных криопэгов полуострова Варандей - Desulfovibrio arcticus (Pecheritsyna et al., 2012). Исследования состава сообществ сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ) криопэгов молекулярно- экологическими методами до настоящего времени не проводились. Содовые озера распространены во внутриконтинентальных аридных районах, и по своим характеристикам относятся к экстремальным системам из-за высокой минерализации (от 10 до 475 г/л) и рН (от 8.5 до 11). Первые комплексные микробиологические исследования центрально-азиатских содовых озер были проведены в Кулундинской степи Б.Л. Исаченко в 30-х годах ХХ века (Исаченко, 1951). Исследования были возобновлены в 90-х годах во многом благодаря гипотезе Г.А. Заварзина о том, что микробные сообщества внутриконтинентальных содовых водоемов могут рассматриваться как реликтовый аналог наземной биоты раннего протерозоя и, возможно, могли являться центрами микробного биоразнообразия (Заварзин, 1993; Заварзин и др., 1999; Zavarzin et al., 2000). В результате были выделены почти все представители микроорганизмов, обеспечивающих замкнутость циклов основных биогенных элементов в содовых озерах. Описанию микрофлоры содовых водоемов как целостных экосистем посвящен ряд обзоров (Заварзин и др., 1999; Заварзина и др., 2012; Grant et al., 2000; Zavarzin et al., 2000; Tindall, 1988; Sorokin et al., 2011а, 2014a). Изучение разнообразия и распространения СВБ в соленых и гиперсоленых содовых озерах Африки, Алтая и Северной Америки показало доминирование в них родов Desulfonatronovibrio, Desulfonatronum и Desulfonatronospira (Scholten et al., 2005; Foti et al., 2007; Sorokin et al., 2010a; Sorokin et al., 2011a). Однако исследования биоразнообразия СВБ содовых озер Бурятии молекулярными методами до сих пор не проводились. Также до 6 настоящего времени не было известно случаев описания алкалофильной железоредукции, осуществляемой сульфатвосстанавливающими бактериями. В настоящее время изучение микроорганизмов экстремальных экосистем создает основы для новых биотехнологических разработок (Horikoshi, 1999; Podar et al., 2006; Cavicchioli et al., 2011; Zhang et al., 2011). Выделенные и охарактеризованные экстремофильные и экстремотолерантные микроорганизмы представляют интерес как модели для изучения механизмов адаптации и способов стабилизации биомолекул и целых клеток при воздействии различных физико-химических факторов, а также являются источниками получения криопротекторов и ферментов, стабильных в широком диапазоне рН, солености и температуры. Цель данной работы – поиск, идентификация и количественная оценка анаэробных бактерий, способных использовать соединения серы и железа в качестве акцепторов электронов, в криопэгах полуострова Ямал и донных осадках содовых озер Соленое и Сульфатное (Южная Бурятия) с использованием микробиологических и молекулярно-биологических методов. Задачи работы: 1. Оценка численности сульфатвосстанавливающих бактерий в криопэгах полуострова Ямал и донных осадках содовых озер Соленое и Сульфатное с помощью метода ПЦР “в реальном времени”. 2. Разработка праймеров для детекции алкалофильных сульфатредукторов рода Desulfonatronum в природных экосистемах. 3. Выделение новых экстремофильных анаэробных бактерий из содовых озер и криопэгов и их физиолого-биохимическая и филогенетическая характеристика. 4. Изучение способности новых изолятов алкалофильных сульфатредукторов восстанавливать Fe(III) в щелочных условиях. Научная новизна работы. Впервые проведена оценка численности сульфатредукторов в двух экстремальных экосистемах – cодовых озерах Соленое и Сульфатное и криопэгах полуострова Ямал – методом ПЦР “в реальном 7 времени”. В результате численность СВБ в образцах донных осадков cодовых озер составила 104-106 кл/г, а в воде криопэгов – 102-103 кл/мл. Расширено знание о видовом разнообразии и метаболическом потенциале сульфатвосстанавливающих арктического криопэга бактерий содовых озер и криопэгов. Из выделен новый психротолерантный галофильный сульфатредуктор, являющийся представителем нового вида ‘Desulfovibrio algoritolerans’ sp. nov., способный расти при отрицательных температурах и восстанавливать Fe(III). Из донных осадков содовых озер выделены и охарактеризованы три штамма галоалкалофильных СВБ. Описан новый вид алкалофильных сульфатредукторов Desulfonatronum buryatense sp. nov. Выделена и охарактеризована бактерия-спутник алкалофильных сульфатредукторов протеолитическая аммонифицирующая бактерия ‘Anoxynatronum buryatense’ sp. nov., характеризующаяся способностью восстанавливать соединения серы в процессе роста. Впервые у представителей алкалофильных сульфатредукторов обнаружена способность к восстановлению трехвалентного железа в условиях высокой щелочности среды. Практическая значимость. Разработаны новые пары праймеров на функциональный ген dsrA сульфатвосстанавливающих бактерий и 16S рРНК сульфатредукторов рода Desulfonatronum, подходящие для использования в ПЦР “в реальном времени”. Новый психротолерантный галофильный сульфатредуктор ‘Desulfovibrio algoritolerans’ K3ST может представлять интерес как источник холодоактивных ферментов, а также как компонент искусственно создаваемых сообществ, способных к биодеградации поллютантов в условиях холодного климата. Галоалкалофильные штаммы видов Desulfonatronum buryatense Ki5T и ‘Anoxynatronum buryatense’ Su22T также могут найти применение в системах биоремедиации посредством удаления токсичных ионов металлов и серы из сточных вод, характеризующихся повышенными значениями солености и рН. Апробация работы. Материалы работы были представлены на российских и международных конференциях: “Биология - наука ХХI века- 2009, 2013”, на 8 всероссийском симпозиуме с международным участием “Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов – 2009”, на международной конференции “10th European Workshop on Astrobiology EANA’2010”, на международной конференции “The 5thFEMS Congress of European Microbiologists – 2013”, на 10-м международном конгрессе “Extremophiles 2014” (Санкт-Петербург, Россия). Публикации. Материалы диссертации представлены в 8 печатных работах: 2 экспериментальных статьях и 6 тезисах. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и включает 22 рисунка и 15 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования и их обсуждение, выводов и списка литературы, который включает 230 наименований. Место проведения работы и благодарности. Работа выполнена в лаборатории анаэробных микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (ИБФМ РАН). Автор выражает искреннюю благодарность Щербаковой В.А. и всему коллективу лаборатории анаэробных микроорганизмов за практическую помощь, ценные советы и поддержку при написании диссертации. Особую благодарность хотелось бы выразить с.н.с., к.б.н. Арискиной Е.В. (ИБФМ РАН) за помощь в определении Г+Ц состава ДНК и проведении анализа ДНК-ДНК гибридизации; с.н.с., к.б.н. Сузиной Н.Е. и к.б.н. Абашиной Т.Н. (ИБФМ РАН) за помощь в проведении микроскопических исследований; к.б.н. Автуху А.Н. (ИБФМ РАН) за помощь в определении продуктов метаболизма; д.б.н. Осипову Г.А. за определение жирнокислотного состава клеток; д.б.н. Сорокину Д.Ю. (ИНМИ РАН) за предоставленные культуры СВБ; д.б.н., проф. Намсараеву Б.Б. (ИОЭБ СО РАН) за предоставленные образцы донных осадков содовых озер; к.г-м.н. Демидову Н.Э. (ИФХиБПП РАН) за предоставленные образцы воды ямальских криопэгов, а также д.б.н. Хмелениной В.Н. и к.б.н. Решетникову А.С. (ИБФМ РАН) за ценные советы при написании диссертации. 9 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. БИОРАЗНООБРАЗИЕ СУЛЬФАТВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ МЕСТАХ ОБИТАНИЯ 1.1. Характеристика сульфатвосстанавливающих бактерий Сульфатвосстанавливающие микроорганизмы – физиологическая группа прокариот (бактерий и архей), осуществляющих диссимиляционное восстановление сульфатов до сульфида (H2S). Они представляют важное звено, связывающее потоки углерода и серы в анаэробных биотопах, содержащих сульфат. Ассимиляционная сульфатредукция направлена на биосинтез серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин, метионин) при выращивании бактерий на среде, где источником серы служат сульфаты, и не приводит к накоплению сульфида. Активность процесса диссимиляционной сульфатредукции намного выше, чем ассимиляционной, следствием чего является накопление в среде больших количеств H2S. Первая сульфатвосстанавливающая бактерия (СВБ) была открыта в 1895 г., когда Бейеринк описал бактерию ‘Spirillum desulfuricans’, продуцирующую сульфид водорода в донных отложениях посредством восстановления сульфата (Beyerinck, 1895, цит. по Barton et al., 2009). Но, поскольку техника культивирования анаэробов была недостаточно разработана, знания о СВБ накапливались медленно на протяжении более 50 лет. К середине двадцатого века интерес к этой группе микроорганизмов возрос благодаря их экологической роли и практической значимости в различных областях. Помимо отрицательного воздействия сульфатредукторов на окружающую среду в результате загрязнения выделяемым H2S, биокоррозии металлов и трубопроводов, порчи продуктов термофильными спорообразующими СВБ, сульфатредукторы нашли применение в биоремедиации природной среды от токсичных соединений серы, углеводородов и других органических и неорганических загрязняющих веществ (Widdel, 1986; Janssen et al., 2009; Sorokin et al., 2012b). 10 1.1.1. Особенности конструктивного и энергетического обмена СВБ По степени окисления органического вещества все сульфатредукторы делятся на 2 основные группы. К первой относят виды, полностью окисляющие органические субстраты до СО2. Вторую группу составляют организмы, окисляющие субстраты до ацетата и СО2. Сульфатвосстанавливающие бактерии, осуществляющие полное окисление органического вещества до СО2, используют два различных метаболических пути. Один из них – модифицированный цикл трикарбоновых кислот, детально описанный у Desulfobacter postgatei (Brandis-Heep et al., 1983). Второй – ацетилкоэнзимный путь (путь Вуда-Люнгдаля) (Wood et al., 1986), при котором ацетил-КоА преобразуется с участием СО-дегидрогеназы до СО2. Представителями этой метаболической группы являются бактерии родов Desulfobacterium, Desulfotomaculum и Desulfococcus (Schauder et al., 1986), а также вида Desulfobacca acetoxidans (Elferink et al., 1999). Сульфатредукторы, осуществляющие неполное окисление субстратов, образуют ацетил-КоА, который далее преобразуется в ацетилфосфат при участии фосфотрансферазы. Из ацетилфосфата в реакции, катализируемой ацетаткиназой, образуется ацетат. Этот процесс сопровождается субстратным фосфорилированием. Данный тип метаболизма характерен для представителей родов Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobulbus и др. Первоначально считалось, что СВБ способны утилизировать ограниченный спектр субстратов (лактат, формиат, пируват, этанол и др.), но недавние микробиологические и биохимические исследования существенно расширили ряд акцепторов и доноров электронов, используемых СВБ. Более ста веществ, включая сахара, аминокислоты, монокарбоновые и дикарбоновые кислоты, спирты и ароматические соединения являются возможными донорами электронов для СВБ (Fauque et al., 1991, 2004; Rabus et al., 2006). Что касается акцепторов электронов, то СВБ могут восстанавливать большое количество различных соединений. Помимо использования соединений серы (сульфат, сульфит, тиосульфат и элементная сера) и фумарата (Miller et al., 1966), 11 некоторые СВБ (Desulfobulbus propionicus, Desulfovibrio desulfuricans) могут осуществлять диссимиляционную редукцию нитрата или нитрита до аммония (Dannenberg et al., 1992), причем этот процесс дает больший выход биомассы, чем сульфатредукция (Seitz et al., 1986). Desulfosporosinus orientis способен осуществлять карбонатное дыхание, используя CO2 как акцептор электронов, который восстанавливается до ацетата при гомоацетатном брожении (Klemps et al., 1985). Более того, некоторые виды Desulfovibrio могут восстанавливать Cr(VI) (Lovley et al., 1994), Fe(III) и U(VI) (Coleman et al., 1993; Wall et al., 2006), хотя восстановление ионов металлов у этих бактерий не сопряжено с ростом. Однако Desulfotomaculum auripigmentum и ‘Desulfotomaculum reducens’ способны расти с арсенатом (Newman et al., 1997) или Fe(III), Mn(IV), U(VI) и Cr(VI) (Tebo et al., 1998) как акцепторами электронов. Desulfobulbus propionicus, Desulfococcus multivorans, Desulfobacterium autotrophicum и некоторые виды Desulfovibrio могут осуществлять аэробное дыхание, причем скорость дыхания у Desulfovibrio termitidis выше, чем у большинства аэробных бактерий (Dilling et al., 1990; Kuhnigk et al., 1996; Cypionka et al., 2000). Однако этот процесс не поддерживал рост микроорганизмов. Виды Syntrophobacter являются особой группой СВБ. Они способны расти на пропионате и сульфате, но были выделены как бактерии, превращающие пропионат в ацетат, СО2 и Н2 в cокультуре с водородпотребляющими метаногенами и сульфатредукторами (Boone et al., 1980; Harmsen et al., 1993; Wallrabenstein et al., 1994). Все СВБ имеют уникальные ключевые ферменты, катализирующие процесс диссимиляционной сульфатредукции. Для восстановления SO42- до Н2S необходимо 8 электронов и несколько промежуточных стадий. Сульфат – химически инертное соединение и не может быть восстановлен без первичной активации с использованием АТФ. Фермент АТФ-сульфурилаза катализирует прикрепление SO42- к фосфату АТФ с образованием аденозин-5’-фосфосульфата (APS) (Рисунок 1). Затем аденозин-5’-фосфосульфатредуктаза (Apr) превращает APS в аденозинмонофосфат (АМР) и сульфит (SO32-), который в итоге 12 восстанавливается до сульфида диссимиляционной бисульфитредуктазой (Dsr). При ассимиляционной сульфатредукции к APS присоединяется другой фосфат с образованием фосфоаденозин-5’-фосфосульфата при участии APS-киназы, и только затем происходит восстановление SO42- до SO32-. Последующее восстановление SO32- до Н2S осуществляется с помощью ассимиляционной сульфитредуктазы, катализирующей перенос 6 электронов на SO32-. Рисунок 1 Схема диссимиляционной и ассимиляционной сульфатредукции (по Madigan et al., 2010). При диссимиляционной сульфатредукции транспорт электронов приводит к возникновению протондвижущей силы и синтезу АТР с помощью АТР-азы. Основным транспортером электронов в этом процессе является периплазматический цитохром c3 (Рисунок 2). Цитохром c3 принимает электроны от гидрогеназы, расположенной в периплазме, и переносит их к мембрансвязанному белковому комплексу. Этот комплекс, названный Hmc, транспортирует электроны через цитоплазматическую мембрану к Fe-Sсодержащему белку (FeS), где они становятся доступными для APS-редуктазы и бисульфитредуктазы. Источником электронов является как внешний Н2, так и Н2, образующийся при катаболизме органических соединений, таких как лактат и пируват, при участии лактатдегидрогеназы (Madigan et al., 2010). 13 Периплазма ферродоксин Рисунок 2 Электрон-транспортные и энергетические механизмы СВБ (по Madigan et al., 2010). 1.1.2. Филогения сульфатвосстанавливающих прокариот Сульфатредукторы представляют собой разнообразную группу прокариот, включающую 5 классов домена Bacteria и 2 класса домена Archaea (Таблица 1, Рисунок 3). На основании анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, сульфатредукторов можно разделить на 4 группы: грамотрицательные мезофильные СВБ, грамположительные спорообразующие СВБ, термофильные СВБ, и термофильные сульфатвосстанавливающие археи. Все эти группы объединяет использование сульфата как конечного акцептора электронов. Грамотрицательные мезофильные СВБ. Эта группа СВБ располагается внутри класса Deltaproteobacteria и включает 4 порядка СВБ: Desulfarculales, Desulfovibrionales, Desulfobacterales и Syntrophobacterales. Интересными морфологическими аспектами порядка Desulfobacterales являются образование пакетов клеток бактериями рода Desulfosarcina и скользящее движение с помощью филаментов Syntrophobacterales у Desulfonema. характерен как Для представителей синтрофный рост с порядка водород- утилизирующими бактериями на пропионате, так и рост в чистой культуре (Boone et al., 1980; Harmsen et al., 1993; Wallrabenstein et al., 1994; Plugge et al., 2011). 14 Таблица 1. Таксономия (по данным сервера http://www.bacterio.net/ на 01.02.2015) и некоторые характеристики СВБ. Порядок Семейство Род Подвижность Г+Ц состав ДНК Окисление субстрата Диапазон рН Диапазон температуры, оС 66 62.5 41-58 46-50 55 56.6 57.8-59.1 44-46 41-52 40-42 51-53 35 46-57 46 49-53 52-53 58-62 54 35-55 н.д. 54 51 49 52-62 59-60 47-51 56 50-55 48-50 42-47 52-67 65 67-70 42-66 49-63 П1 н.д. П Н2 П н.д.3 П П П П Н Н П П Н П/Н Н П П Н П П П П/Н Н Н/А3 Н Н Н Н Н Н Н Н Н 6.8-8.2 6.5-8.0 6.2-8.0 6.5-8.3 6.5–8.0 6.2–7.9 6.0-8.0 5.5-8.1 6.5-8.3 н.д. н.д.-10.7 5.8-7.6 6.8-7.8 5.5-8.5 6.0-7.8 н.д. 5.6-8.5 8.5-10.6 н.д. н.д. 6.0-8.3 6.2-7.9 6.5-7.9 6.5-9.0 6.0-10.2 6.0-8.2 6.7-8.3 6.3-8.5 5.7-8.2 н.д. 5.8-8.8 5.5–8.5 5.0-9.0 5.0-10.0 6.7-10.5 20-39 16-37 15-40 16-38 15-37 13–45 12-40 0-38 0-37 н.д. 15-40 14-37 20-35 0-20 -1.8-33 -1.8-27 10-37 н.д.-38 28-37 н.д.-32 15-40 15-38 8-30 10-42 10-43 4-35 15-37 10-40 0-35 -1.8-26 15-60 22–44 15-50 -2-65 15-48 Домен Bacteria 1. Класс Deltaproteobacteria Desulfarculales Desulfarculaceae Desulfobacterales Desulfobacteraceae Desulfobulbaceae Desulfovibrionales Desulfomicrobiaceae Desulfovibrionaceae Desulfonatronaceae Desulfarculus Desulfocarbo Desulfatibacillum Desulfatiferula Desulfatirhabdium Desulfatitalea Desulfatiglans Desulfobacter Desulfobacterium Desulfobacula Desulfobotulus Desulfocella Desulfococcus Desulfoconvexum Desulfofaba Desulfofrigus Desulfoluna Desulfonatronobacter Desulfonema Desulforegula Desulfosalsimonas Desulfosarcina Desulfospira Desulfotignum Desulfobulbus Desulfocapsa Desulfofustis Desulfopila Desulforhopalus Desulfotalea Desulfomicrobium Desulfobaculum Desulfocurvus Desulfovibrio Desulfonatronum + + – + н.д. + – –/+ –/+ –/+ + + –/+ + + + –/+ + + + + +/– – +/– –/+ + + –/+ – –/+ +/– + + –/+ + 15 Порядок Семейство Desulfohalobiaceae Syntrophobacterales Syntrophaceae Syntrophobacteraceae Syntrophorhabdaceae Род Подвижность Desulfohalobium Desulfonatronospira Desulfonatronovibrio Desulfonauticus Desulfothermus Desulfovermiculus Desulfobacca Desulfomonile Desulfacinum Desulfoglaeba Desulforhabdus Desulfosoma Desulfovirga Syntrophobacter Thermodesulforhabdus Syntrophorhabdus –/+ + + + + – – –/+ – – –/+ + – + – Г+Ц состав ДНК 51-57 50 43-49 34 35-37 55 51 49 59-64 54 53 56-58 60 57-61 51 н.д. Окисление субстрата Н Н П П П П П Н П П П П П Н П Н Диапазон рН 5.5-8.3 8.0-10.6 7.2-10.5 6.2-8.6 5.9-7.1 6.0-8.5 6.5-8.3 6.5-7.8 6.0-8.4 4.5-8.2 6.6-8.5 5.7–7.7 6.6-7.4 6.0-8.8 6.1-7.7 6.6-7.4 Диапазон температуры, оС 15-44 н.д.-45 н.д.-45 30-64 36-69 25-47 27-47 30-38 37-64 17-50 25-45 40-62 20-36 20-48 44-74 25-37 Desulfotomaculum Desulfosporosinus Desulfurispora Desulfovirgula Thermodesulfobium +/– +/– + + – 41-56 37-47 53 60 35 Н/П Н Н Н н.д. 5.0-10.2 3.6-8.2 6.4-7.9 6.4-7.9 4.0-6.5 20-85 4-47 40-67 61-80 37-65 ‘Desulfosporomusa’ + 45-46 Н 6.1-8.2 4-37 Thermodesulfovibrio –/+ 30-38 Н 5.5-8.5 40-70 Thermodesulfobacterium Thermodesulfatator –/+ + 28-40 45-46 Н н.д. 6.0-8.0 5.5-8.0 45-85 55-80 43 52 Н Н 2.3-6.4 2.6-5.9 60-92 45-82 Н 4.5-8.0 60-95 2. Класс Clostridia Clostridiales Peptococcaceae Thermoanaerobacterales Thermoanaerobacteraceae Thermodesulfobiaceae 3. Класс Negativicutes Selenomonadales Veillonellaceae 4. Класс Nitrospirae Nitrospirales Nitrospiraceae 5. Класс Thermodesulfobacteria Thermodesulfobacteriales Thermodesulfobacteriaceae Домен Archaea 1. Класс Crenarchaeota (Thermoprotei) Thermoproteales Thermoproteaceae Caldivirga Thermocladium – – 2. Класс Euryarchaeota (Archaeoglobi) Archaeoglobales Archaeoglobaceae Archaeoglobus +/– 41-48 Н1 – неполное окисление; П2 - полное окисление; А3 – хемолитоавтотрофный рост; н.д.3 – нет данных. 16 Рисунок 3 Филогенетическое древо, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК сульфатвосстанавливающих прокариот (Muyzer et al., 2008). Грамположительные спорообразующие СВБ относятся к классам Clostridia и Negativicutes и включают порядки Clostridiales (рода Desulfotomaculum, Desulfosporosinus), Selenomonadales (род Desulfosporomusa) и Thermoanaerobacterales (род Desulfovirgula). Все они характеризуются низким содержанием Г+Ц пар в ДНК. Большая часть представителей грамположительных СВБ обладает способностью к образованию эндоспор, что 17 позволяет им выживать в аэробных условиях и длительных периодах высыхания. Доминирующим в этой группе СВБ является род Desulfotomaculum. Различные виды рода Desulfotomaculum обнаруживают большое разнообразие в отношении используемых доноров электронов, среди которых ацетат, анилин, сукцинат, катехол, индол, этанол, никотинат, фенол, ацетон, стеарат и др. (Castro et.al., 2000; Widdel, 2006). В отличие от СВБ класса Deltaproteobacteria, некоторые представители грамположительных СВБ способны использовать Fe(III) как конечный акцептор электронов для роста (Tebo et al., 1998). Некоторые виды Desulfotomaculum являются термофильными, хотя их оптимальная температура роста ниже, чем у термофильных грамотрицательных СВБ и архейных сульфатредукторов Представители термофильных СВБ принадлежат к трем различным классам бактерий: Nitrospirae (род Thermodesulfovibrio), Thermodesulfobacteria (род Thermodesulfobacterium) и Clostridia (род Thermodesulfobium). Общим для всех представителей этой группы является использование ограниченного числа доноров электронов: водород, лактат, формиат и пируват (Sonne-Hansen et al., 1999; Mori et al., 2003; Muyzer et al., 2008). Термофильные архейные сульфатредукторы принадлежат к родам Archaeoglobus (Euryarchaeota), Thermocladium и Caldirvirga (Crenarchaeota) и населяют места обитания с гипертермофильными условиями (Itoh et al., 1998, 1999; Steinsbu et al., 2010). Вопрос о приобретении археями способности к сульфатредукции остается нерешенным, хотя Вагнер с соавторами (Wagner et al., 1998) предположили, что либо общий предок архей и бактерий обладал ключевыми генами сульфатредукции, либо данные ферменты были переданы археям от представителей Bacteria путем горизонтального переноса вскоре после эволюционного расхождения доменов. 1.1.3 Экология и распространение сульфатвосстанавливающих бактерий Сульфатвосстанавливающие бактерии и археи выполняют важную экологическую и метаболическую функции в природных экосистемах. В морских осадках, содержащих большое количество сульфата, более 50% органического 18 вещества минерализуется с участием сульфатредукторов (Fauque, 1995; Rabus et al., 2006). Кроме морских отложений (Ravenschlag et al., 2000; Mußmann et al., 2005; Webster et al., 2006) и гидрокарбонатных сипов (Knittel et al., 2003; Kniemeyer et al., 2007) СВБ населяют различные природные и искусственные экосистемы с широким диапазоном физико-химических условий: вулканический шлак (Stadnitskaia et al., 2005), анаэробные очистные сооружения (Ben-Dov et al., 2007; Dar et al., 2005, 2007), места нефтеразработок (Nilsen et al., 1996; Ollivier et al., 2007), рисовые поля (Stubner, 2004), ризосферу растений (Hines et al., 1999), гиперсоленые бактериальные маты (Teske et al., 1998; Minz et al., 1999) и даже организм человека Сульфатредукторы (Langendijk также et al., 2001; адаптированы к Loubinoux et экстремальным al., 2002). условиям существования при кислых (Alazard et al., 2010; Sánchez-Andrea et al., 2013) и щелочных (Foti et al., 2007, 2008; Sorokin et al., 2011a, 2014a) значениях рН, к жизни при низких температурах (Karr et al., 2005; Pecheritsyna et al., 2012), найдены в гидротермальных вентах (Jeanthon et al., 2002) и горячих источниках (Sonne-Hansen et al., 1999; Baena et al., 2011). Большинство сульфатредукторов являются свободно живущими, но некоторые виды составляют консорциумы с другими микроорганизмами, например с метаногенными археами (Boetius et al., 2000), и даже способны вместе с сероокисляющими Gammaproteobacteria существовать в качестве эндосимбионтов морского червя Olavius algarvensis, тем самым обеспечивая хозяина питательными веществами (Woyke et al., 2006). 1.1.4. Методы детекции и анализа популяций сульфатредукторов В настоящее время разработан и успешно применяется широкий спектр радиоизотопных, иммунологических, биохимических и молекулярно- биологических методов детекции и идентификации СВБ in situ. Общую численность культивируемых сульфатредукторов определяют методом предельных разведений с использованием селективных сред. Недостатком этого метода является его трудоемкость, большая длительность по времени, а также возможность культивирования небольшого процента бактерий (менее 1%). 19 Наличие в природных экосистемах представителей различных групп СВБ может быть определено по анализу фосфолипидов (Muyzer et al., 2008). Однако эта техника имеет ограничения при установлении таксономической принадлежности сульфатредукторов. Активность СВБ оценивают по измерению скорости сульфатредукции с помощью 35 S-меченного сульфата (Fossing et al., 1989). Также для изучения состава активной популяции СВБ применяется метод с использованием стабильных меченых изотопов различных субстратов – SIP (stable isotope probing) (Radajewski et al., 2000; Miyatake et al., 2009). Обычно определяется включение метки в ДНК, РНК или мембранные липиды клеток. Для анализа природных микробных популяций наиболее перспективны молекулярно-биологические сульфатредукторов методы, различных которые таксономических позволяют групп, обнаружить определить их численность и видовой состав. Особое преимущество данных методов определяется возможностью обнаруживать микроорганизмы, ранее не описанные и не культивируемые в лабораторных условиях. В качестве маркера наиболее широко используется ген, кодирующий 16S рРНК. С его помощью все известные СВБ можно разделить на 7 филогенетических линий: 5 бактериальных и 2 архейных (Рисунок 3). Для определения различных филогенетических подгрупп СВБ разработаны наборы праймеров (Daly et al., 2000). Более специфический подход для детекции СВБ дает использование функциональных генов диссимиляционной бисульфитредуктазы dsrAB (Wagner et al., 1998; Scholten et al., 2005; Foti et al., 2007) и диссимиляционной аденозин-5- фосфосульфатредуктазы aprBA (Scholten et al., 2005; Deplancke et al., 2000), которые характерны только для микроорганизмов, осуществляющих сульфатное дыхание. Денатурирующий/температурный градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ/ТГГЭ) амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК (Dar et al., 2005), dsrA (Dar et al., 2007; Geets et al., 2006; Minz et al., 1999) или aprA (Meyer et al., 2007) также используется для определения разнообразия СВБ в различных местах обитания. 20 Для идентификации, установления местонахождения и подсчета единичных микробных клеток и кластеров в природном образце широко используют такой цитогенетический метод как флуоресцeнтная гибридизaция in situ (FISH) (Devereux et al., 1989, 1992; Amann et al., 1995; Lückner et al., 2007). Клетки гибридизуются с флуоресцентно меченными олигонуклеотидными зондами, комплементарными специфическим участкам гена 16S рРНК, после чего исследуются под микроскопом. Как правило, с помощью FISH бактерии не идентифицируют до вида, а определяют их принадлежность к более крупным таксонам. Для повышения точности и чувствительности метода вплоть до количественной оценки активности единичной клетки вместо стандартной флуоресцентной гибридизации используется технология CARD-FISH - катализируемое осаждение метки с флуоресцентной гибридизацией in situ. Метод CARD-FISH основан на применении меченых молекул тирамина (Mußmann et al., 2005). Тирамины – это фенольные соединения, используемые для амплификации флуоресцентного сигнала. Меченные флуорохромом тирамины откладываются в месте гибридизации, что приводит к сильному увеличению чувствительности FISH по сравнению с обычными зондами. Комбинация микроавторадиографии с флуоресцентной гибридизацией in situ (MAR-FISH) представляет собой фотографический метод для визуализации поглощения радиоактивно меченных субстратов отдельными клетками (Ito et al., 2002). Наиболее важное преимущество микроавторадиографии – это возможность проследить включение одной клеткой меченных радионуклидом компонентов (Höfle et al., 2008). К недостаткам метода MAR-FISH относится его трудоёмкость, что ограничивает количество проводимых параллельно экспериментов (Adamczyk et al., 2003). Мультиизотопная визуализирующая масс-спектрометрия (MIMS) является cамым чувствительным методом регистрации включения изотопных меток в клетку (Höfle et al., 2008). Это новое поколение вторичной ионной массспектрометрии (SIMS), объединённой с FISH, со сложной ионной оптикой и программным обеспечением, количественно анализирующим изображения 21 (Lechene et al., 2006). MIMS в 1000 раз превосходит по чувствительности микроавторадиографию и имеет точность учёта стабильных изотопов ±1%. Как и Raman-FISH, комбинация MIMS с FISH позволяет проводить филогенетический и изотопный анализ природного образца в одно сканирование. Бэренс с соавторами (Behrens et al., 2008) объединили собственную модификацию CARDFISH с MIMS и показали её применимость для установления биогеохимических функций некультивируемых бактерий. Мультиизотопная визуализирующая массспектрометрия была бы идеальным методом для изучения сообществ бактерий, если бы позволяла идентифицировать все бактерии, потребившие субстрат, до вида (Колмакова, 2013). Для определения СВБ в природных образцах также применяют микрочипирование нуклеиновых кислот (СВБ-филочипирование) (Loy et al., 2002) и дот-блот гибридизацию рРНК (Sahm et al., 1999; Ravenschlag et al., 2000). Однако эти методы неудобны тем, что они не дают информации о количестве клеток СВБ в образце. Широкое применение получил метод ПЦР “в реальном времени” (ПЦРРВ), позволяющий делать количественную оценку как целой популяции СВБ, так и определять численность отдельных филогенетических групп (Heid et al., 1996; Freeman et al., 1999; Klein, 2002; Foti et al., 2007; Blazejak et al., 2011). Количественная оценка экспрессии функциональных генов (мРНК) с помощью ПЦР-РВ позволяет подсчитать in situ микробную активность СВБ (Neretin et al., 2003). 1.2. Распространение и активность сульфатвосстанавливающих бактерий в экосистемах содовых озер В анаэробном алкалофильном сообществе содовых озер заключительный этап разложения органического вещества осуществляется сульфатредукторами, имеющими высокую активность и занимающими доминирующее положение по сравнению с метаногенами и ацетогенами, что обусловлено избытком сульфата и нахождением серы в доступной полисульфидной форме H2Sn (Заварзин и др., 1996; Горленко и др., 1999; Намсараев и др., 2007; Sorokin et al., 2004). 22 Измерение скоростей сульфатредукции показало высокую активность популяции СВБ, несмотря на щелочные значения рН и высокую минерализацию некоторых содовых озер. Наибольшая скорость сульфатредукции (1426 µмоль/дм3·день-1) была измерена в гиперсоленом озере Горькое (Кулундинская степь) при солености 200 г/л (Foti et al., 2008). Наиболее активный сульфидогенез наблюдался с элементной серой как акцептором электронов и формиатом в качестве донора электронов (Sorokin et al., 2004, 2010a; Foti et al., 2007). Для восстановления сульфатов оптимальным являлся рН 9-10, в то время как соленость выше 2М Na+ подавляла процесс сульфатредукции. Общая численность СВБ в донных отложениях содовых озер Забайкалья и Кулундинской степи, определенная методом десятикратных разведений (Намсараев и др., 2007; Колосов и др., 2010; Foti et al., 2007), составила 102-106 клеток/мл. Данные численности СВБ соленых и гиперсоленых содовых озер Кулундинской степи, полученные с помощью ПЦР-РВ (Foti et al., 2007), показали более высокие значения: 104-108 клеток/мл. Изучение разнообразия и распространения СВБ в содовых озерах Африки, Алтая и Северной Америки с помощью молекулярных методов показало доминирование двух основных групп галоалкалофильных бактерий: Desulfovibrionales и Desulfobacteraceae. Среди представителей первой группы преобладали представители родов Desulfonatronovibrio, Desulfonatronum и Desulfonatronospira. Обнаруженные представители семейства Desulfobacteraceae были близки галофильным СВБ Desulfotignum balticum и Desulfosarcina variabilis (Scholten et al., 2005; Foti et al., 2007; Sorokin et al., 2010a; Sorokin et al., 2011a). Анализ последовательностей генов 16S рРНК показал наличие в озере Моно Лэйк (США) представителей рода Desulfotomaculum (Scholten et al., 2005), хотя ни одной последовательности гена dsrAB, принадлежащей грамположительным спорообразующим СВБ, пока не было обнаружено (Foti et al., 2007; Sorokin et al., 2011a). К настоящему времени из содовых озер выделено лишь небольшое число чистых культур СВБ. В основном это представители порядка Desulfovibrionales: 23 Desulfonatronovibrio (Zhilina et al., 1997; Sorokin et al., 2011b), Desulfonatronum (Пикута и др., 1998; Pikuta et al., 2003a; Zhilina et al., 2005; Sorokin et al., 2011b) и Desulfonatronospira (Sorokin et al., 2008a). Также выделены единичные представители других семейств: Desulfobotulus alkaliphilus (Sorokin et al., 2010b), Desulfonatronobacter acidivorans и Desulfobulbus alkaliphilus (Sorokin et al., 2012а). Все известные СВБ содовых озер, за исключением Desulfonatronobacter acidivorans, осуществляют неполное окисление субстрата с образованием ацетата и СО2 (Sorokin et al., 2012а). Алкалофильные СВБ не могут использовать в качестве донора электронов ацетат. На данный момент единственным ацетат-использующим алкалофильным сульфидогеном является Desulfurivibrio alkaliphilus (Sorokin et al., 2008b). 1.3. Сульфатвосстанавливающие бактерии многолетнемерзлых отложений полярных областей Адаптированные к холоду микроорганизмы широко распространены в природе, так как более 80% поверхности Земли имеет температуру ниже 5оС. Микробиологические исследования многолетнемерзлых отложений и низкотемпературных морских осадков выявили наличие активной популяции сульфатредукторов, причем их численность достигала 106 кл/см3 (Knoblauch et al., 1999a; Rivkina et al., 2000), а скорость сульфатредукции была сравнима с таковой в теплых экосистемах (Sagemann et al., 1998; Glud et al., 1998). Изучение разнообразия и распространения СВБ в холодных экосистемах с помощью молекулярных методов показало большое разнообразие филогенетических групп сульфатредукторов, относящихся к родам Desulfovibrio, Desulfosarcina, Desulfotomaculum, Desulfobulbus, Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfofaba и Desulfotalea/Desulforhopalus, причем Desulfovibrio и Desulfotalea/Desulforhopalus были доминирующими (Sahm et al., 1999; Purdy et al., 2003; Karr et al., 2005). Из проб вечномерзлых грунтов и арктических морских отложений были выделены чистые культуры сульфатредукторов: Desulfofrigus oceanense, Desulfofrigus fragile, Desulfofaba gelida, Desulfotalea psychrophila, Desulfotalea arctica (Knoblauch et al., 1999b), Desulfovibrio lacusfryxellense (Sattley et al., 2010), 24 Desulfoconvexum algidum (Könneke et al., 2013), Desulfobacter psychrotolerans (Tarpgaard et al., 2006), Desulfovibrio frigidus и Desulfovibrio ferrireducens (Vandieken et al., 2006а), Desulfotomaculum arcticum (Vandieken et al., 2006b), Desulfosporosinus hippei (Vatsurina et al., 2008). Все они, за исключением Desulfotomaculum arcticum и Desulfosporosinus hippei, способны расти при отрицательных температурах. Уникальной экосистемой являются криопэги – закрытые водные системы морского происхождения, залегающие в мерзлых толщах возрастом 6-120 тысяч лет на глубине нескольких десятков метров в виде линз хлоридно-натриевых вод, характеризующиеся постоянной отрицательной температурой и высокой минерализацией (60-300 г/л). Общее число микроорганизмов, обнаруженных в криопэгах, составило 107 кл/мл, при этом численность сульфатредукторов достигала 2×106 кл/мл (Gilichinsky et al., 2003, 2005). Учитывая незначительное количество обнаруженных в воде криопэгов ацетогенов (1.0×101 кл/мл) и метаногенов (1.0×102 кл/мл), можно судить о ведущей роли сульфатредукторов в терминальной стадии разрушения органического вещества (Gilichinsky et al., 2003; Печерицына и др., 2007). Однако на данный момент выделена и описана лишь одна психроактивная СВБ из распресненного Варандейского криопэга (побережье Баренцева моря) – Desulfovibrio arcticus, способная расти в диапазоне температур от -2 до 28оС (Pecheritsyna et al., 2012). Исследования состава сообществ сульфатвосстанавливающих бактерий в криопэгах молекулярными методами до настоящего времени не проводились. 25 Глава 2. АЛКАЛОФИЛЬНОЕ МИКРОБНОЕ СООБЩЕСТВО СОДОВЫХ ОЗЕР 2.1. Содовые озера: происхождение и распространение Накопление соды в озерах углекислотного выветривания. является Субаэральное заключительным углекислотное этапом выветривание послужило основным геохимическим процессом, приведшим к освобождению атмосферы Земли от избытка СО2. Углекислота была фиксирована в отложениях карбонатов кальция и магния. После осаждения кальция из раствора система сохраняет натрий, который осаждается в виде карбонатов или комплексов этих солей, создавая буфер, поддерживающий устойчивый щелочной рН в содовых озерах. В случае преобладания испарения над осадками происходит выпадение солей из раствора с образованием эвапоритов и сильно минерализованных вод вплоть до рассолов (Заварзин, 1993, 2007а). Содовые озера распространены во всех климатических зонах: пресные содовые озера встречаются почти повсеместно и, как правило, являются проточными. Содовые озера с повышенной минерализацией обычно приурочены к аридным областям с широким развитием бессточных зон. Они характерны для сухой степи, полупустыни, лесостепи, саванны, и расположены преимущественно на западе Северной Америки, в Центральной Азии и других районах с аридным климатом. Содовые озера формируются также в горной местности в бессточных бассейнах и нередко подвержены влиянию поствулканических гидротермальных процессов (Горленко, 2007). Наиболее известны высокощелочные минерализованные содовые озера, расположенные в Восточно-африканской долине, в Кении и Танзании (Богория, Магади, Натрон) и в Ливийской пустыне Египта (озеро Вади-Натрун). Кенийские озера отличаются от египетских озер более высоким содержанием карбоната. Содовые степные озера распространены также в Западной Сибири, Забайкалье, в Монголии и Китае. В отличие от африканских озер, в степных засушливых районах озера меньше, мелководнее и менее минерализованы (Горленко, 2007). 26 2.2. Содовые озера Забайкалья На территории Забайкалья (Республика Бурятия, Агинский Бурятский автономный округ, Читинская область) выявлено более 500 озер с разным гидрологическим и гидрохимическим режимом (Дзюба и др., 1977) (Рисунок 4). Рисунок 4 Содовые озера Забайкалья (по Намсараеву и др., 2007). 1 – Онон-Борзинская группа озер, Агинский Бурятский автономный округ (Хилганта, Горбунка, Ножий, Холво тором); 2 – Онон-Борзинская группа озер, Ононский район Читинской области (Дабаса нур, Цаган нур, Бабье, Борзинской, Остоже, Барун Торей, Зун Торей); 3 – Селенгинская группа озер, Республика Бурятия (Верхнее Белое, Нижнее Белое, Соленое, Сульфатное, Оронгойское). Озера Забайкалья характеризуются минерализацией от 1.8 до 322 г/л и рН 8.5-10.2. Согласно классификации Валяшко, по минерализации вод озера делятся на солоноватые (сумма солей 1-25 г/л), соленые (26-50 г/л) и рассолы (свыше 50 г/л) (Таблица 2). При значительных вариациях размеров и минерализации, общими чертами содовых озер Забайкалья являются небольшая глубина, как правило, не превышающая нескольких метров, крайне ограниченная площадь водосбора, расположение в зонах семиаридного климата и отсутствие поверхностного стока (Скляров и др., 2011). По химическому составу большинство озер принадлежит к карбонатному типу. Водно-солевое питание содовые озера Забайкалья получают за счет грунтовых вод и временных 27 дождевых потоков. Грунтовые воды по составу различны, чаще преобладают гидрокарбонатные с минерализацией до 5 г/л. Значительную роль может играть также поступление минерализованных подземных вод глубоких горизонтов. Таблица 2. Физико-химические параметры некоторых содовых озер Забайкалья (по Намсараеву и др., 2007). Озеро Местоположение рН Дата отбора образцов 1.8 1.8 3.3 3.8 4.7 5.6 8.3 8.5 9.4 8.0 11.4 15.2 9.0 8.7 10.2 9.6 10.2 9.2 9.1 9.8 9.8 9.5 9.3 10.2 07.95 06.02 09.00 07.95 07.95 07.01 07.95 08.97 07.95 06.02 09.03 07.95 2.1 41.3 2.0 35.0 0.3 46.0 Рассолы 8.7 9.5 9.5 07.04 08.01 07.95 0.3 2.2 8.9 9.4 08.04 08.01 Площадь, км2 ОМ, г/л Солоноватые Барун Торей Белое Хужирта Нижнее Белое Ножей Сульфатное Горбунка Нухе-Нур Верхнее Белое Соленое Цайдам-1 Горбунка Холво Тором Хилганта Хилганта Борзинское Читинская область Бурятия Бурятия Бурятия Агинский округ Бурятия Агинский округ Бурятия Бурятия Бурятия Бурятия Агинский округ Агинский округ Агинский округ Агинский округ Читинская область 540.0 3.0 2.8 5.0 10.4 3.0 2.1 2.6 4.5 3.4 3.4 1.5 Соленые 230.0 322.0 В результате мелководности содовых озер Забайкалья, в зимнее время они промерзают до -40оС, в то время как летом температура в рапе поднимается до +26оС и выше. В летний период и осенью концентрация солей в озерах в результате испарения максимальна и в них создаются условия для развития бентосных галоалкалофильных цианобактериальных сообществ. В озерах формируются эфемерные маты толщиной 1-3 мм, возникающие в весеннеосенний период. Лишь в озерах с достаточно глубокой бессточной котловиной происходит засоление в результате испарения воды. Такие озера отличаются минерализацией выше солености морской воды, они не промерзают до дна, что обеспечивает сохранность бентосных микробных сообществ. В них сохраняется многолетний цианобактериальный мат толщиной в несколько сантиметров (Горленко и др., 1999). 28 Первое комплексное микробиологическое изучение центрально-азиатских содовых озер было проведено в Кулундинской степи Б.Л. Исаченко в 30-х гг. ХХ века (Исаченко, 1951). Исследования были возобновлены в 90-х годах во многом благодаря гипотезе Г.А. Заварзина о том, что микробные сообщества внутриконтинентальных содовых водоемов могут рассматриваться как реликтовый аналог наземной биоты раннего протерозоя и, возможно, могли являться центрами микробного биоразнообразия (Заварзин, 1993). В ходе многочисленных исследований были выделены почти все представители микроорганизмов, обеспечивающих замкнутость циклов основных биогенных элементов в содовых озерах (Заварзин и др., 1996; Заварзин и др., 1999; Калюжная и др., 1999; Кевбрин и др., 1999; Пикута и др., 1997;Троценко и др., 2002, 2008; Намсараев и др., 2007; Bryantseva et al., 1999; Zhilina et al., 1994). 2.3. Первичная продукция органического вещества в содовых озерах В содовых озерах непрерывно протекают процессы образования и разложения органического вещества при участии различных физиологических групп бактерий, поскольку развитие высших форм жизни ограничено высокими значениями рН и солености (Заварзин, 1993; Заварзин и др., 2000; Tindall, 1988). Первичная продукция в большинстве содовых озер является высокой благодаря большой плотности галоалкалофильных цианобактерий (Герасименко и др. 1993, Горленко, 1999). При умеренной солености доминирующими являются цианобактерии родов Synechocystis, Phormidium, Oscillatoria, Aphanothece, Rhabdoderma, Arthrospira, Anabaenopsis, Cyanospira (Дубинин, 1995; Герасименко,1996; Заварзин и др., 1999; Ballot et al., 2009; Dadheech et al., 2013; Krienitz et al., 2013). Однако при увеличении концентрации соли начинают преобладать одноклеточные эукариотные водоросли Picocystis salinarium и Dunaliella viridis (Krienitz et al., 2012; Roesler et al., 2002). В содовых озерах Центральной Азии была обнаружена алкалофильная эукариотная фототрофная зеленая микроводоросль, относящаяся к роду Chlorella (Дубинин и др., 1995). При благоприятных экологических условиях бентосные сообщества микроорганизмов образуют микробные маты. Высокая плотность (1.383 г/см 3) 29 мата исключает его всплытие со дна и ограничивает взмучивание воды (Герасименко и др., 1993). Микробные маты в содовых озерах Забайкалья и Монголии обнаруживались в основном в мелководных прибрежных частях озер. В них преобладали цианобактерии родов Phormidium, Microcoleus и Aphanothece. (Заварзин и др., 1999). В цианобактериальных матах лагун Арабатской косы (озеро Сиваш) с соленостью 1.6-2.0 г/л доминировали Microcoleus chtonoplaster, Aphanocapsa salina и зеленая микроводоросль D. salina (Бонч-Осмоловская и др., 1988). В микробных матах содовых озер Кулундинской степи были обнаружены зеленая водоросль Stenocladus и галоалкалофильные цианобактерии родов Geitlerinema, Nodosilinea, Leptolyngbya. Доминирующая в экваториальных содовых озерах цианобактерия Arthrospira не была обнаружена в озерах Южной Сибири (Sorokin et al., 2014a). К вторичным фототрофным продуцентам, использующим продукты обмена микробного сообщества, относятся анаэробные аноксигенные фототрофные бактерии. В содовых озерах с умеренной соленостью преобладают Thiorhodospira и Thiorhodovibriо, а в высокоминерализованных озерах – пурпурные серные бактерии родов Ectothiorhodospira и Halorhodospira (Bryantseva et al., 1999; Горленко, 2007; Компанцева и др., 2009). Пурпурные бактерии образуют анаэробный окислительный фильтр, работающий на свету в отсутствии О2. При этом вторичная продукция органического вещества у них сопряжена с регенерацией сульфата путем окисления Н2S, образующегося в результате деятельности СВБ. Фототрофные бактерии также участвуют в утилизации молекулярного водорода и органических веществ, образуемых первичными и терминальными деструкторами (Zhilina et al., 1994; Горленко, 2007; Заварзин и др., 2000; Заварзин, 2007б; Горленко, 2007). Высокая солнечная инсоляция, наличие биогенных элементов и веществ, весенне-осенний прогрев вод в щелочных озерах Забайкалья способствуют высокой продукции органического вещества оксигенными и аноксигенными бактериями и водорослями. В водной толще доминирует оксигенный фотосинтез, но в поверхностных слоях илов доля аноксигенного фотосинтеза 30 повышается и составляет 0.01-68.9% органического вещества (Намсараев и др., 2007). С повышением минерализации в донных осадках содовых озер наблюдается два пика продуктивности. Первый пик обнаруживается при минерализации 3-12 г/л, второй – при 165-215 г/л. При солености выше 220 г/л продуктивность снижается (Sørensen et al., 2004; Намсараев и др., 2007). 2.4. Начальные этапы разложения органического вещества в содовых озерах Процесс процессом, деструкции определяющим органического вещества существование является биологического важнейшим круговорота элементов в природе и обеспечивающим устойчивость биоценозов. Деструкция органического вещества в содовых озерах идет до полного его разложения (Рисунок 5) (Горленко и др., 1999; Намсараев и др., 1999; Заварзина, 2013). Первый этап – гидролиз полисахаридов (в основном целлюлозы) и белковых соединений, составляющих основную часть клеток цианобактерий, – осуществляют гидролитики – целлюлолитики и протеолитики. Целлюлолитики в щелочных водоемах представлены алкалофильными бактериями Clostridium alkalicellulosi (Жилина и др., 2005а), Cellulomonas bogoriensis (Jones et al., 2005) и Alkaliflexus imshenetskii (Zhilina et al., 2004). Недавно была описана экстремально галоалкалофильная бактерия Chitinivibrio alkaliphilus, использующая хитин в качестве ростового субстрата (Sorokin et al., 2014b). Алкалофильные протеолитики представлены родами Alkalimonas (Ma et al., 2004) и Proteinivorax (Kevbrin et al., 2013). Второй этап разложения органического вещества в анаэробном алкалофильном сообществе осуществляется вторичными гетеротрофами пептолитическими и сахаролитическими бактериями. Они специализируются на сбраживании моно- и дисахаридов, органических кислот, спиртов, а также аминокислот. Среди аэробов наиболее распространенными вторичными гетеротрофами являются Halomonas, Bacillus и представители Actinobacteria (Duckworth et al., 1996). 31 Рисунок 5. Трофические взаимодействия в анаэробном алкалофильном микробном сообществе с аллохтонным (целлюлоза) и автохтонным (цианобактерии) органическим веществом. Указанные здесь микроорганизмы не исчерпывают таксономического разнообразия, это лишь примеры той или иной физиологической группы (Заварзина, 2013). Из анаэробов доминируют рода Anoxynatronum (Garnova et al. 2003), Anaerovirgula (Pikuta et al., 2006), Halonatronum (Жилина и др., 2001а), Amphibacillus (Жилина и др., 2001б), Anaerobranca (Kevbrin et al., 2008), Haloanaerobacter, Natronincola (Zhilina et al., 1998; Жилина и др., 2009б), Tindallia (Kevbrin et al., 1998; Alazard et al., 2007), Alkaliphilus (Takai et al., 2001; Жилина и др., 2009а), Natranaerobius (Mesbah et al., 2007), Natronoflexus (Sorokin et al., 2011с), Natranaerobaculum (Zavarzina et al., 2013), Anaerobacillus (Zavarzina et al., 2009) и Natronovirga (Sorokin et al., 2012b). Отдельную группу составляют диссипотрофы, использующие низкомолекулярные продукты гидролиза в низких концентрациях. Классический пример этой подгруппы – спирохеты (Заварзина, 2013). Из содовых озер к настоящему моменту выделены алкалофильные виды рода Spirochaeta: S. 32 dissipatitropha, S. alcalica, S. africana и S. аsiatica (Pikuta et al., 2009; Жилина, 2007). Большая часть радиоуглерода при разложении 14 С-целлюлозы выявлена в СО2. Из летучих жирных кислот с наибольшей скоростью образуется ацетат. При этом скорости разложения целлюлозы и белка в донных осадках содовых озер в несколько раз выше, чем в водной толще. Данные радиоизотопного анализа подтверждаются большей численностью бактерий деструкторов в донных осадках по сравнению с водной толщей. Количество протеолитических бактерий в водной толще содовых озер варьирует от 103 до 105 кл/мл, численность целлюлолитиков ниже на два-три порядка, при этом преобладают аэробные бактерии. В донных осадках число аэробных и анаэробных протеолитиков и целлюлолитиков составляет 105-106 кл/мл (Намсараев и др., 2007). 2.5. Терминальная стадия деструкции органического вещества Заключительный этап разложения органического вещества осуществляют вторичные анаэробы, метаболизм которых основан на окислительно- восстановительных реакциях с участием химических элементов с переменной валентностью. Их основной функцией является сток водорода и поддержание его концентрации на низком уровне, что способствует полному разложению органического вещества в биотопе (Заварзин, 2007б). В содовых озерах Тувы (Жилина, 2007) и Танатар (Жилина и др., 2013а) удаление Н2 в основном обеспечивали серо-, тиосульфат- и сульфатредукторы, что связано с доминированием цикла серы в современных содовых озерах. Из содовых озер выделен ряд алкалофильных сульфатредукторов, использующих водород, которые относятся к родам Desulfonatronum, Desulfonatronovibrio, Desulfonatronospira, а также сульфидогены Desulfurivibrio и Dethiobacter, не восстанавливающие сульфат (Sorokin et al., 2011а). Ацетат – главный метаболит, накапливающийся при разложении органического вещества. Первый алкалофильный сульфидоген Desulfurivibrio alkaliphilus, окисляющий ацетат, был выделен лишь в 2008 году (Sorokin et al., 2008b). Альтернативой алкалофильному сульфидогенезу на ацетате служит его 33 синтрофное окисление ассоциатом бактерии порядка Clostridiales и литотрофной сульфатвосстанавливающей бактерии, где бродильщик утилизирует ацетат, а СВБ немедленно удаляет из системы водород, что делает реакцию термодинамически выгодной (Schink et al., 2002). Примерами таких бинарных синтрофных сульфидогенных культур являются “Candidatus Syntrophonatronum acetioxidans” и Desulfonatronospira sp. (Sorokin et al., 2014с), “Candidatus Contubernalis alkalaceticum” и Desulfonatronum cooperativum (Жилина и др., 2005б). При этом “Candidatus Contubernalis alkalaceticum” не может расти вне ассоциации и является примером первой алкалофильной облигатно синтрофной бактерии. Помимо ацетата данные сокультуры окисляют этанол, пропанол, изопропанол, серин, фруктозу, изомасляную кислоту. Метаногены и ацетогены содовых озер играют подчиненную роль в удалении водорода (Жилина и др., 2013а). В отсутствие других акцепторов, кроме СO2, утилизация водорода происходит либо через прямое восстановление СO2 литотрофными метаногенами, либо через дополнительный синтез ацетата из СO2 гомоацетогенными микроорганизмами с последующим его разложением ацетокластическими метаногенами. В содовых озерах преобладает метилотрофный метаногенез, в то время как ацетокластический метаногенез составляет 0.02-3.5% от общего процесса. Метилотрофные метаногены в содовых озерах представлены видами Methanolobus taylorii (Oremland et al., 1994), Methanohalophilus zhilinae (Mathrani et al., 1988) и Methanosalsum zhilinae (Кевбрин и др., 1997). Из гидрогенотрофных метаногенов известны только Methanobacterium alсaliphilum (Worakit et al., 1986) и Methanocalculus natronophilus (Жилина и др., 2013б). Группу галоалкалофильных органотрофных ацетогенов в анаэробной деструкции органического вещества в щелочных водоемах представляют Natroniella acetigena (Zhilina et al., 1996), Natronincola histdinovorans (Zhilina et al., 1998) и представители рода Tindallia (Kevbrin et al., 1998; Pikuta et al., 2003b; Alazard et al., 2007). Однако все они не используют водород. Единственным 34 описанным гидрогенотрофным ацетогеном является Fuchsiella alkaliacetigena из озер Танатар (Zhilina et al., 2012). 2.6. Микробное восстановление железа в содовых озерах Железоредукторы широко распространены в содовых озерах, несмотря на низкую растворимость железа в щелочных условиях, а их численность составляет от 103 до 106 клеток/г осадка. Деятельность железоредукторов приводит к окислению ацетата, водорода и образованию магнетита (Fe3O4) и сидерита (FeCO3) (Заварзина и др., 2006, 2012; Жилина и др., 2013а). Впервые ассимиляционное восстановление железа в щелочных условиях было показано у алкалофилов Tindallia magadiensis (Kevbrin et al., 1998) и Anoxynatronum sibiricum (Garnova et al., 2003). Ассимиляционное восстановление Fe(III) в содовых озерах также осуществляют алкалофильные бактерии Bacillus аrsenicoselenatis (Blum et al., 1998), Alkaliphilus metalliredigens (Ye et al., 2004), Anaerobranca californiensis диссимиляционные (Gorlenko et железоредукторы al., Алкалофильные 2004). представлены Geoalkalibacter ferrihydriticus (Заварзина и др., 2006). Характерно, что G. ferrihydriticus в качестве акцептора электронов (помимо железа) может использовать элементную серу, что позволяет ему существовать и при доминировании цикла серы. Alkaliphilus peptidofermentans (Жилина и др., 2009а), Alkaliphilus sp. (Захарюк, 2010) восстанавливают образующиеся и Natronincola железо при при облегченном сбраживании восстанавливают Fe(III). ferrireducens пептидов (Жилина брожении, или и др., когда сахаров, 2009б) электроны, опосредованно 35 Заключение по обзору литературы Содовые озера обладают уникальным разнообразием галоалкалофильных бактерий и архей. Многочисленные исследования показали, что современные алкалофильные сообщества содовых озер содержат все основные функциональные группы организмов и могут существовать автономно за счет замкнутости трофических цепей и биогеохимических циклов основных биогенных элементов. Сульфатвосстанавливающие доминирующую позицию бактерии деструкторов содовых озер органического занимают вещества на заключительном этапе в анаэробных условиях, что обусловлено избытком сульфата и нахождением серы в доступной полисульфидной форме (H2Sn). Численность этой группы бактерий в содовых озерах достигает 10 8 кл/мл, скорость сульфатредукции также имеет высокие значения (до 1426 µмоль/дм3·день-1), что подтверждает большую активность СВБ в щелочных экосистемах. Среди представителей СВБ, выделенных в чистые культуры, а также идентифицированных с помощью молекулярных методов, в экосистемах содовых озер четко определяется доминирование трех родов алкалофильных сульфатредукторов, а именно Desulfonatronovibrio, Desulfonatronum и Desulfonatronospira, по всей видимости, наиболее хорошо адаптированных к экстремальным условиям жизни в содовых озерах. В многолетнемерзлых отложениях полярных областей и криопэгах численность сульфатвосстанавливающих бактерий достигает 106 кл/мл. СВБ этих экосистем являются активным компонентом микробного сообщества и проявляют активность даже при отрицательных температурах, что указывает на существенный вклад в глобальный круговорот веществ и биогеохимические процессы, учитывая, что огромные площади земной поверхности круглогодично находятся при температурах не выше 5оС. Несомненно, щелочные и холодные экосистемы, населенные экстремофилами, представляют огромную ценность для биотехнологий в связи с продукцией ферментов (“экстремозимов”), активных при высоких значениях рН 36 и солености, а также при низких температурах. К примеру, уже сейчас устойчивые к щелочам внеклеточные протеазы, липазы, целлюлазы используются для производства моющих средств (Horikoshi, 1999). Соле- и щелочеустойчивые целлюлазы применяют для расщепления сахаров в сельскохозяйственных отходах производства биоэтанола из лигноцеллюлозы (Zhang et al., 2011). Помимо ферментов, целые клетки галоалкалофильных СВБ могут быть использованы для удаления токсичных соединений серы из сточных вод и газовых потоков (Janssen et al., 2009), а также для биодеградации углеводородов и других органических (нитроароматических) и неорганических (мышьяк, уран) загрязняющих веществ (Sorokin et al., 2012b). Что касается холодоустойчивых ферментов, то они применяются в производстве бытовых моющих средств, в хлебопекарной, лекарственной промышленности и в молекулярной биологии. Их высокая каталитическая активность при низких температурах позволяет снизить потребление энергии и затраты на производство (Cavicchioli et al., 2011). Интерес к СВБ экстремальных экосистем неуклонно растет, о чем свидетельствует все большее количество публикаций, посвященных выделению, описанию и изучению физиолого-биохимических свойств сульфатредукторов, адаптированных к условиям низких или высоких температур, экстремально низкой или высокой щелочности среды. Наша работа имеет целью внести свой вклад в изучение распространения и разнообразия СВБ в криопэгах полуострова Ямал и донных осадках содовых озер Соленое и Сульфатное (Южная Бурятия). 37 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Районы и объекты исследования Озеро Сульфатное расположено в Селенгинском районе республики Бурятия. Характеризуется как солоноватое, карбонатное, иловое. Мелководное, занимает площадь 3.0 км2. Озеро Соленое расположено в Кяхтинском районе республики Бурятия в долине реки Киран, относится к непересыхающим озерам Забайкалья. Характеризуется как солоноватое, карбонатное, иловое. Площадь озера 3.4 км 2, глубина достигает 3 м. Основные физико-химические показатели воды исследуемых озер (глубина 0.5 м) представлены в Таблице 3. Таблица 3. Гидрохимическая характеристика воды озер Сульфатное и Соленое. Концентрация, мг/л Eh, Соленость, Озеро Т°C pH мВ г/л CO32- HCO3S2SO42Сульфатное 22.1 9.1 +290 4.9 150.0 854.0 <1 1400 Соленое 14.3 9.9 +380 14 360.0 2342.8 7.5 723.1 Донные осадки озер Соленое и Сульфатное, отобранные в 2010 году, были предоставлены д.б.н., проф. Б.Б. Намсараевым (ИОЭБ СО РАН). Криопэги полуострова Ямал. Полуостров Ямал расположен в области сплошного распространения многолетнемерзлых пород, которое нарушается лишь на 5% территории сквозными таликами под озерами Нейто, Сохонто, Ямбуто, Модымалто и Хаданто. Образцы криопэгов в позднеплейстоценовых аллювиальных отложениях отобранны в районе реки Яра-Яхи и Бованенковского газового месторождения. Бованенковское месторождение (70о29′00″ с.ш., 68о00′00″ в.д.) расположено на западе центрального Ямала (бассейны рек Надояха и Мордыяха) в области сплошного распространения многолетнемерзлых пород, залегающих сразу под сезонно-талым слоем. До глубин 220-310 м мерзлую почву повсеместно подстилает горизонт 38 переохлажденных засоленных почв. Среднегодовая температура мерзлых толщ колеблется от (-2) до (-4)оС. Вода криопэгов характеризовалась нейтральными значениями рН, криопэги 2Y и 3Y имели хлоридно-натриевое засоление, а общая минерализация колебалась от 14.6 до 77.16 г/л. Основные гидрохимические характеристики воды криопэгов полуострова Ямал представлены в Таблице 4. Географическое расположение исследуемых криопэгов показано на Рисунке 6. Таблица 4. Гидрохимическая характеристика воды криопэгов полуострова Ямал*. Ионный состав воды, г/л Глубина МинераКриопэг Место отбора отбора, рН лизация, Катионы Анионы м г/л К+ Na+ Ca2+ Mg2+ HCO3- Cl- SO42Бованенковское газовое 1Y 120 7.9 14.6 месторождение Устье реки 2Y 5 7.4 56.23 Яра-Яха Пойма реки 3Y 12.5-20.0 7.5 77.16 Яра-Яха *-анализ выполнен М.С. Куприной (ИГЭ РАН). 0.12 0.196 2.0 2.04 0.46 9.59 0.19 0.85 16.35 0.52 2.38 1.02 31.24 2.88 0.41 22.68 1.04 3.79 1.71 47.22 0.31 1 2 3 Рисунок 6. Географическое расположение криопэгов полуострова Ямал. 39 Образцы воды криопэгов, отобранные в ходе экспедиции 2008 года, были предоставлены к.г-м.н. Н.Э. Демидовым (ИФХиБПП РАН). Для стерильного отбора проб при колонковом бурении мерзлых пород станком УКБ-12/25 была использована ранее отработанная методика (Гиличинский и др., 1989; Shi et al., 1997). Отбор проб из скважин, вскрывающих криопэги, осуществляли с помощью гидрохимического барометра ПЭ 1105 в предварительно стерилизованные бутыли объемом 500 мл. Отобранные пробы хранили при -20оС до начала анализов. Для сравнительных Всероссийской анализов коллекции использовали микроорганизмов штаммы (ВКМ) и бактерий Коллекции микроорганизмов и клеточных культур DSMZ (Брауншвейг, Германия): Desulfovibrio desulfuricans ВКМ B-1799Т, D. arcticus B-2367Т, Desulfomicrobium baculatum ВКМ В-1378Т, Desulfomicrobium macestii ВКМ B-1598Т, Desulfobulbus elongatus DSM 2908Т, Desulfobacterium autotrophicum ВКМ В-1955Т, Desulfosarcina variabilis ВКМ B-1627Т, Desulfohalobium utahense ВКМ В-2384Т, Desulfosporosinus orientis ВКМ В-1628Т, Desulfotomaculum alkaliphilum ВКМ B2192Т, Desulfonatronum lacustre B-2475Т, Desulfonatronum cooperativum ВКМ B2329T, Anoxynatronum sibiricum ВКМ B-2327Т, ‘Desulfonatronum zhilinae’ ВКМ B2744T, Escherichia coli K-12 DSM 5698. Все референтные культуры выращивали на соответствующих средах, если не указано иначе (www.vkm.ru; www.dsmz.de). Культуры сульфатредукторов Desulfonatronovibrio thiodismutans AHT9T, Desulfonatronum thioautotrophicum ASO4-1Т и Desulfonatronum thiosulfatophilum ASO4-2Т были любезно предоставлены д.б.н. Д.Ю. Сорокиным (Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН). 3.2. Среды и условия культивирования Для получения накопительных культур из образцов воды ямальских криопэгов использовали анаэробно приготовленную среду следующего состава (г/л): KH2PO4, 1.0; KCl, 0.5; NH4Cl, 1.0; MgCl2×6H2O, 0.25; CaCl2×2H2O, 0.1; Na2SO4, 3.0; дрожжевой экстракт, 0.05; раствор витаминов по Волину, 5 мл (Wolin et al., 1963); раствор микроэлементов SL-10, 2 мл; лактат натрия, 2.0; 40 Na2S×9H2O, 0.1. NaCl добавляли в количестве 15.0, 50.0 и 80.0 г/л. Раствор микроэлементов SL-10 (мг/л): HCl (25%; 7.7 M), 10.0 мл; FeCl3×4H2O, 1500; ZnCl2, 70.0; MnCl2×4H2O, 100.0; H3BO3, 6.0; CoCl2×6H2O, 190.0; CuCl2×2H2O, 2.0; NiCl2×6H2O, 24.0; Na2MoO4×2H2O, 36.0. Раствор витаминов по Волину (мг/л): биотин, 2.0 мг; фолиевая кислота, 2.0 мг; пиридоксин-HCl, 10.0 мг; тиамин-HCl, 5.0 мг; рибофлавин, 5.0 мг; никотиновая кислота, 5.0 мг; DL-пантотенат кальция, 5.0 мг; витамин B12, 0.1 мг; п-аминобензойная кислота, 5.0 мг; липоевая кислота, 5.0 мг. Все ингредиенты, за исключением сульфида и лактата натрия, растворяли в соответствующем количестве воды, кипятили среду около 1 минуты, затем охлаждали до комнатной температуры под током 100% бескислородного N2, разливали анаэробно в пробирки Хангейта и автоклавировали 30 мин при 121оС. После стерилизации добавляли стерильные анаэробные растворы сульфида и лактата натрия, и доводили рН среды до 7.0-7.2. Накопительные культуры инкубировали при температуре 6 и 15оС в течение 8 месяцев. Для выделения чистых культур использовали метод десятикратных разведений на твердых и жидких средах того же состава. Для получения твердой среды в основную среду добавляли агар (Difco) в количестве 20.0 г/л. Для поддержания чистой культуры штамма K3S использовали анаэробную среду следующего состава (г/л): NaHCO3, 0.5; KH2PO4, 0.3; MgCl2×6H2O, 2.0; NH4Cl, 1.0; Na2SO4, 3.0; KCl, 0.5; CaCl2×2H2O, 0.15; NaCl, 20.0; резазурин 0.002; дрожжевой экстракт, 0.1; раствор витаминов по Волину, 5 мл; раствор микроэлементов, 2 мл (Кевбрин и др., 1992); лактат натрия, 2.0; Na2S×9H2O, 0.25. Раствор микроэлементов (мг/л): (NH4)2Fe(SO4)2×6H2O, 784.0; CoCl2×6H2O, 238.0; (NH4)2Ni(SO4)2×6H2O, 395.0; Na2MoO4×2H2O, 24.0; Na2WO4×2H2O, 33.0; ZnSO4×7H2O, 144.0; CuCl2×2H2O, 2.0; Na2SeO4, 94.0; H3BO3, 6.0; MnCl2×4 H2O, 99. Стерильные растворы бикарбоната, сульфида и лактата натрия добавляли в среду перед посевом и доводили рН до 7.0-7.2. Для получения алкалофильных накопительных культур использовали анаэробную среду следующего состава (г/л): KH2PO4, 0.2; KCl, 0.2; NaCl, 5.0; NH4Cl, 1.0; MgCl2×6H2O, 0.1; CaCl2×2H2O, 0.33; Na2SO4, 4.0; резазурин 0.002; 41 раствор микроэлементов SL-10, 10 мл; раствор витаминов по Волину, 5 мл; Na2S×9H2O, 0.25. В качестве субстрата использовали лактат или формиат натрия в количестве 2.0 г/л. Стерильные растворы карбоната и бикарбоната натрия (г/л) добавляли в среду перед посевом и доводили рН до 9.0 (NaHCO3, 4.5; Na2CO3, 2.0), 9.5 (NaHCO3, 10.0; Na2CO3, 2.76), или 9.8 (Na2CO3, 2.76). Инкубацию культур осуществляли при температуре 29 и 37оС. Для поддержания чистых культур штаммов Ki4, Ki5 и Su2 использовали анаэробную среду следующего состава (г/л): KH2PO4, 0.2; MgCl2×6H2O, 0.1; NH4Cl, 1.0; Na2SO4, 5.0; раствор витаминов по Волину, 5 мл; раствор микроэлементов SL-10, 10 мл; лактат натрия, 2.0; Na2S×9H2O, 0.25; NaCl, 5.0 (для штамма Ki5) или 10.0 (для штаммов Ki4 и Su2). Стерильные растворы карбоната и бикарбоната натрия добавляли в среду перед посевом (г/л): NaHCO3, 2.0 и Na2CO3, 0.6 (для штамма Ki4); NaHCO3, 0.6 и Na2CO3, 1.6 (для штамма Ki5); Na2CO3, 3.0 (для штамма Su2). Выделение штамма Su22 и поддержание чистой культуры осуществляли на анаэробной среде АМ следующего состава (г/л): Na2CO3, 4.0; KCl, 0.2; MgCl2×6H2O, 0.1; NH4Cl, 0.5; K2HPO4, 0.2; NaCl, 20.0; дрожжевой экстракт, 2.0; раствор микроэлементов SL-10, 1.0 мл; витамины по Волину, 1.0 мл. Стерильный раствор карбоната натрия добавляли в среду перед посевом и доводили рН до 9.6. Anoxynatronum sibiricum ВКМ B-2327Т, использовавшуюся для сравнения, выращивали на среде АМ с добавлением 5.0 г/л глюкозы. Стерильный раствор карбоната натрия добавляли в среду перед посевом и доводили рН до 9.0. О росте сульфатвосстанавливающих бактерий судили по накоплению сульфида (методика описана далее). Рост штамма Su22Т и A. sibiricum B-2327Т оценивали по оптической плотности при длине волны 600 нм. 3.3. Микробиологические методы учета численности бактерий Общее количество микроорганизмов в воде криопэгов определяли методом прямого счета (МПС) по Разумову (1962). 3-5 мл воды криопэгов последовательно фильтровали через стерильные мембранные фильтры Зейтца с диаметром пор 0.22 мкм. Затем фильтры выдерживали в парах формалина. Для подсчета бактерий фильтры обрабатывали 4% раствором эритрозина, 42 приготовленном в 5% растворе карболовой кислоты, в течение 3-х часов. Затем фильтры многократно промывали, последовательно перенося их на фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой, до слабо-розовой окраски. Высушивали на воздухе и готовили препараты для микроскопирования. Вырезали кусочек фильтра и помещали его на предметное стекло в каплю иммерсионного масла, сверху наносили еще одну каплю масла и покрывали препарат покровным стеклом. Счет микроорганизмов проводили с помощью сетки Гаженко, просчитывая в 20 полях зрения палочковидные, кокковидные и прочие формы. Общее количество бактерий определяли по формуле: X= e×106×d/a×b×c, где X - количество клеток в 1 мл; е - площадь фильтра; 106 - переводной коэффициент мм2 в мкм2; d - сумма клеток, просчитанных во всех полях зрения; а - площадь окулярного счетного микрометра в мм 2; b – объем профильтрованной воды в мл; с - число просчитанных полей зрения. Учет численности жизнеспособных клеток СВБ в образцах донных осадков содовых озер проводили методом предельных разведений на элективной анаэробной среде (Sorokin et al., 2008) (г/л): Na2CO3, 1.2; NaHCO3, 1.85; NaCl, 15.0; K2HPO4, 0.5; MgCl2×6H2O, 0.1; Na2SO4, 3.0; Na2S×9H2O, 0.5; дрожжевой экстракт, 0.2; раствор микроэлементов SL-10, 1 мл; раствор витаминов по Волину, 5 мл; лактат натрия, 2.0. Стерильные растворы карбоната, бикарбоната, сульфида и лактата натрия добавляли в среду перед посевом и доводили рН до 9.6. Инкубацию проводили при температуре 30 оС. Численность психрофильных сульфатредукторов в образцах воды ямальских криопэгов определяли методом предельных разведений на анаэробной среде, содержащей (г/л): KH2PO4, 0.33; KCl, 0.33; NaCl, 2.0; NH4Cl, 0.33; MgCl2×6H2O, 0.33; CaCl2×2H2O, 0.33; Na2SO4, 4.0; раствор микроэлементов SL10, 10 мл; раствор витаминов по Волину, 5 мл; лактат натрия, 2.0; Na2S×9H2O, 0.25. рН среды доводили до 7.2. 43 3.4. Методы контроля чистоты культур Чистоту культур проверяли прямым наблюдением клеток в световой микроскоп Axiostar PLUS (Carl Zeiss, Германия) с фазовым контрастом при увеличении 100×3.5, и по отсутствию роста посторонней микрофлоры на основной среде с добавлением (г/л) пептона, 1.0 и глюкозы, 2.0. 3.5. Микроскопические методы исследования* Морфологию клеток изучали с помощью светового микроскопа Axiostar PLUS (Carl Zeiss, Германия) с фазовым контрастом при увеличении 100×3.5, а также на электронном микроскопе JEM-100В (Jeol, Япония). Негативное контрастирование клеток проводили, обрабатывая разбавленную клеточную суспензию 3% раствором фосфорновольфрамовой кислоты, рН 5.0 или 1% раствором молибденовокислого аммония, рН 7.0. Время окрашивания 3-5 минут при комнатной температуре. Электронно-микроскопические исследования ультратонких срезов проводили по методу Рейндольса (Reynolds, 1963). Клетки фиксировали 2%-ным раствором глутарового альдегида, осаждали, промывали дважды 0.05М какодилатным буфером (рН 7.4) и дофиксировали 1%-ным раствором OsO4 на какодилатном буфере в течение 2 часов при 4 оС. Препарат обезвоживали в серии спиртовых растворов возрастающей концентрации и заливали в смолу Spur. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-3 (LKB, Швеция) и окрашивали 1% раствором уранил-ацетата. Линейные размеры клеток определяли на микрофотографиях с помощью линейки объект-микрометра с учетом увеличения микроскопа и фотоувеличителя. 3.6. Изучение физиолого-биохимических свойств изолятов Оптимальные условия роста выделенных штаммов определяли по оптической плотности (OD) при 600 нм или образованию сероводорода при 660 нм на спектрофотометре Specol 221 (Германия). Время удвоения клеток (td) определяли как время, за которое оптическая плотность или количество серово*За помощь в проведении электронно-микроскопических исследований автор благодарит н.с., к.б.н. Т.Н. Абашину и с.н.с., к.б.н. Н.Е Сузину (ИБФМ РАН). 44 дорода увеличиваются вдвое и рассчитывали по формуле: td=((t1-t0)×lg2)/(lgb1-lgb0), где t1 и t0 – время, при котором измерялся параметр роста b1 и b0, соответственно. Скорость роста рассчитывали по формуле: µ=ln2/td Температурный диапазон роста определяли по удельной скорости роста при -6; -2; 0; 4; 12; 16; 20; 24; 28; 35; 42; 56оС. Диапазон солености – по скорости роста при различных концентрациях NaCl (0, 1, 2, 5, 10, 20, 40, 80, 100 г/л). Влияние pH среды на скорость роста определяли, культивируя клетки при оптимальной температуре и солености на основной среде при различных значениях pH: 7.0; 7.5; 8.0; 8.5; 9.0; 9.5; 10.0; 10.5; 11.0 для штаммов Ki4, Ki5 и Su2; 7.0, 7.4, 7.8, 8.4, 8.8, 9.2, 9.6, 10, 10.5, 11.5 и 12.6 для штамма Su22; 6.5, 7.0, 7.2, 7.5, 8.0 для штамма К3ST. Значения рН регулировали с помощью стерильных буферных систем: для рН 6.5 – Na2HPO4/NaH2PO4 буфер; для рН 7.0-8.0 – HEPES/NaOH; для рН 8.5-10.8 – смесь карбоната и бикарбоната натрия; для рН 11.0-12.0 – карбонат/NaOH буферная система. Окраску по Граму, тесты на оксидазу, каталазу, нитратредуктазу и другие обычные биохимические тесты проводили согласно стандартным методикам (Gerhardt, 1994). Способность штаммов использовать различные субстраты в качестве источника углерода и энергии определяли на основной среде. Штаммы инкубировали 14 суток при оптимальных значениях температуры, солености и рН. Для установления используемых доноров электронов к каждой из культур добавляли субстраты в следующих концентрациях (мМ, если не указано иное): лактат, 20; ацетат, 20; H2+acetate, 20; глицерин, 10; глюкоза, 10; фруктоза, 10; манноза, 10; ксилоза, 10; малат, 10; сукцинат, 10; цитрат, 10; фумарат, 10; пируват, 10; формиат, 10; бутират, 10; метанол, 10; бутанол, 10; этанол, 10; пропионат, 10; гептоноат, 10; капроат, 10; триптон, 10; пептон, 10; триптиказа, 10; казаминовые кислоты (1 г/л) и дрожжевой экстракт (1 г/л). Акцепторы электронов проверяли путем добавления следующих соединений (мМ): сульфат, 45 35; сульфит, 5; тиосульфат, 10; диметилсульфоксид (ДМСО), 10; элементная сера, 51; фумарат, 10; нитрат, 10; Fe(III), 90. Аморфное железо (III) готовили титрованием кислого раствора FeCl3 10 %-ным раствором NaOH до pH 7.0, после чего многократно отмыали от ионов хлора (Lovley et al,. 1993). Все тесты выполняли в трех повторностях и подтверждали тремя пересевами. Способность культур к восстановлению серосодержащих соединений определяли по образованию сероводорода, а не содержащих серу – по оптической плотности. 3.7. Спорообразование Способность выделенных культур к образованию спор проверяли микроскопически и по росту пастеризованных культур. Пастеризацию посевного материала проводили при 80оС в течение 10 минут. 3.8. Аналитические методы 3.8.1. Определение продуктов брожения и окисления* Ацетат, пропионат, бутират, изобутират, валерат, гексаноат и гептаноат определяли методом ВЭЖХ на хроматографе Knauer (Германия) с колонкой Inertsil ODS-3 (5 мкм, 250×4.6 мм; Dr. Maisch GmbHs, Германия) при 210 нм и 35°C со скоростью потока 1 мл/мин. Подвижная фаза – 20 мМ раствор ортофосфорной кислоты. Идентификацию проводили, используя стандартные растворы кислот в концентрации 1 г/л (Sigma-Aldrich, США) по временам удержания. Концентрацию рассчитывали по высоте и площади пиков в программе EuroChom V. 3.05 P5 (Knauer GmbH, Германия). Спирты определяли методом газовой хроматографии на хроматографе Pye Unicum 300 (Великобритания) c пламенно-ионизационным детектором на стеклянной колонке (2м×2мм), заполненной Порапаком QS 80-100 меш (Fluka, Германия) в изократическом режиме при температуре колонки, инъектора и детектора 100, 120 и 170oС, соответственно. В качестве газа-носителя использовали азот со скоростью потока 20 мл/мин. Определение лактата проводили спектрофотометрически по восстановлению нию НАД+ лактатдегидрогеназой, окисляющей лактат в пируват (Hohorst, 1970). * за помощь в определении продуктов метаболизма автор благодарит к.б.н. Автуха А.Н. (ИБФМ РАН). 46 Пробу (0.5 мл), 0.15М гидразин-глициновый буфер (1.5 мл) и 0.1М НАД+ (0.3 мл) помещали в кювету, перемешивали и через 3 мин измеряли поглощение при 360 нм (Е1) на спектрофотометре Specol-221. После этого вносили 0.4Е лактатдегидрогеназы, инкубировали 20 мин при комнатной температуре и измеряли поглощение Е2. Экстинцию, обусловленную содержанием лактата, определяли по разности Е2 и Е1. Калибровочный график строили с использованием стандартных растворов, содержащих от 0 до 120 мг/л лактата. 3.8.2. Определение сероводорода Сероводород определяли по методу, предложенному Cline (1969). Метод основан на связывании Н2S в виде ZnS, который длительное время устойчив по отношению к воздуху. При добавлении кислого раствора N,N-диметил-1,4фенилендиаммонийной соли, Н2S освобождается и реагирует с диамином, образуя восстановленную бесцветную форму метиленовой сини. Последняя окисляется в голубую форму Fe3+, концентрацию которой определяют спектрофотометрически. 0.2 мл пробы помещали в пробирку с 1 мл 2.4% Zn(CH3COO)2×2H2O, добавляли 5 мл дистиллированной воды и 0.5 мл 0.2% N,Nдиметил-1,4 фенилен-диаммоний-дихлорида, растворенного в 20% H2SO4. Затем в пробирку вносили 50 мкл 10% Fe(NH4)(SO4)2×12H2O, доводили объем реакционной смеси дистиллированной водой до 10 мл, перемешивали и оставляли на 10 минут. Экстинкцию образца определяли на спектрофотометре Specol-221 при 660 нм. Для получения калибровочной кривой использовали растворы Na2S известной концентрации. 3.8.3. Определение десульфовиридина, цитохромов и менахинонов Для определения десульфовиридина снимали абсолютный спектр поглощения бесклеточного экстракта и регистрировали пик поглощения при 630 нм (Postgate, 1959). В качестве положительного и отрицательного контроля использовали Desulfovibrio desulfuricans B-1799T и Escherichia coli K-12, соответственно. 47 Состав цитохромов определяли спектрофотометрически по положению максимумов поглощения на спектрах, регистрируемых на двулучевом спектрофотометре Shimadzu UV-160 (Япония) при длинах волн 552, 523 и 420 нм. Получение бесклеточного экстракта: бактериальную культуру анаэробно осаждали при 12000g в течение 10 мин при 4оС, промывали в 400 мл фосфатного буфера (рН 6,7) и ресуспендировали в 10-12 мл фосфатного буфера. Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (Великобритания) в течение 1 мин (процедуру повторяли 20 раз), центрифугировали 20 минут при 12000 g и проверяли супернатант на наличие цитохромов. Анализ состава цитохромов проводили, используя следующие виды спектров: - СО-дифференциальный: препарат, восстановленный дитионитом натрия + СО против восстановленного дитионитом; - абсолютный: восстановленный дитионитом препарат против раствора латекса такой концентрации, чтобы компенсировать поглощение препарата при 600 нм. 3.8.4. Определение ионов двухвалентного железа Метод определения ионов Fe2+ основан на экстракции ионов феррозином, который образует с двухвалентным железом стабильный комплекс (Lovley et al., 1986). 0.5 мл культуральной жидкости помещали в 3 мл 0.1% раствора феррозина, содержащего 50 мМ HEPES, рН 7.0. Через 1 мин измеряли поглощение при 562 нм на спектрофотометре Specol-221. 3.8.5. Анализ жирнокислотного состава клеток* Липиды экстрагировали из биомассы методом кислого метанолиза в смеси 0.4 мл 1.2N HCl - метанол при температуре 80 С в течение 1 часa. Метиловые эфиры жирных кислот и другие липидные компоненты экстрагировали дважды 200 мкл гексана. Экстракт высушивали, обрабатывали 20 мкл N,О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида при 80 С в течение 15 мин для образования триметилсилиловых эфиров гидроксикислот. Пробу реакционной смеси в 2 мкл *-за проведение анализа автор выражает благодарность д.б.н. Г.А. Осипову. 48 анализировали на приборе Шерлок (MIDI Inc. Delawere, США) в автоматическом режиме. Идентификацию веществ, неоднозначно определяемых по времени удерживания на Шерлоке, производили на системе газовый хроматограф – масс спектрометр AG-5973 (Agilent Technologies, США). Разделение осуществляли на капиллярной колонке (25м×0.25мм), покрытой химически связанной метилсиликоновой неподвижной фазой НР-5ms Hewlett-Packard (толщина слоя 0.2 мкм). Хроматографию проводили в режиме программирования температуры от 130 до 320 С со скоростью 5о/мин. Обработка данных выполнялась с помощью стандартных программ приборов. 3.9. Молекулярно-генетические методы 3.9.1. Выделение хромосомной ДНК Хромосомную ДНК из 5 природных образцов донных осадков экстрагировали с помощью Ultra Clean Mega Prep Soil DNA Kit (MO BIO, США). Для выделения ДНК из образцов воды криопэгов, бактерии концентрировали в 10 раз с использованием пористой диафрагмы, ДНК выделяли набором “ГомоСорб” (Синтол, Россия) согласно рекомендациям производителя. Выделение и очистку хромосомной ДНК чистых культур проводили модифицированным методом Мармура (Marmur, 1961). Сырую биомассу ресуспендировали в TE-буфере (10мМ Трис pH 8.0; 1мМ ЭДТА), доведя ОD600 до 1.0. К суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 2-5 мг/мл и инкубировали 30 мин при 37°С на водяной бане. Затем добавляли протеиназу К до конечной концентрации 10-20 мкг/мл и инкубировали 30 мин при 37°С. К суспензии добавляли 20% раствор SDS до конечной концентрации 1-2% и инкубировали 60 мин при 56°С. Затем проводили 3 цикла замораживания при 40оС и оттаивания при +65оС. Далее к раствору добавляли 5М NaCl и 10% ЦТАБ в 0.7М NaCl до конечной концентрации 1М и 1% соответственно. Лизат выдерживали 20 мин при 65оС, добавляли равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку, добавляли равный объем смеси фенола и хлороформа (1:1), перемешивали и 49 центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Верхнюю водную фазу переносили в новую пробирку, экстрагировали с равным объёмом хлороформа и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Для осаждения ДНК из отобранной верхней фазы добавляли 3 объема охлажденного 96% этанола (или 1 объем изопропанола комнатной температуры) и 0.1 объем 3М ацетата калия, тщательно перемешивали и центрифугировали 15 мин при 12000 об/мин. Осадок ДНК промывали последовательно 80% и 96%ным растворами этанола и подсушивали на воздухе. ДНК растворяли в ТЕбуфере. Добавляли раствор РНК-азы до конечной концентрации 50 мкг/мл и инкубировали 1 ч при 37 оС. Повторяли экстракцию смесью фенола-хлороформа. ДНК из раствора осаждали этанолом или изопропанолом как описано выше. Концентрацию ДНК измеряли с помощью NanoPhotometer®P-Class (Implen, Германия). Выделенные препараты ДНК имели типичные соотношения поглощения при 260/280 и 260/230 нм, лежащие в пределах 1.8-2.0 и 1.5-1.8, соответственно. Первое соотношение является показателем на загрязнение белком, второе – полисахаридом. Растворы ДНК хранили при -20оС. 3.9.2 Определение содержания Г+Ц пар в ДНК* Содержание Г+Ц пар в ДНК определяли по температуре плавления ДНК (Mesbah et al., 2011; Owen et al., 1985). ДНК диализовали в течение суток против 1000-кратно превосходящего объема 0.1×SSC буфера (0.15М NaCl; 0.015 М Na3C6H5O7×5.5H2O, pH 7.0) при 4oС при медленном перемешивании на магнитной мешалке. Температуру плавления ДНК определяли на спектрофотометре DU800 Beckman Coulter (Beckman, США) в термостатируемой ячейке при температурах от 60 до 95oС со скоростью нагрева 0.5oС в минуту. Измерения проводили в трех повторностях. В качестве контроля использовали ДНК D. lacustre Z-7951Т с известным составом Г+Ц 57.3±0.5% (Пикута и др., 1998). Расчет вели по формулам: (Г+Ц)%= 56.8+ 2.08 (Tmx–Tmr) и (Г+Ц)%= 57.8 + 2.08 (Tmx–Tmr), *- за проведение анализа автор выражает благодарность с.н.с., к.б.н. Е.В. Арискиной (ИБФМ РАН). 50 где Tmx– температура плавления исследуемого штамма, Tmr – температура плавления контрольного штамма, а 56.8 и 57.8 – процентное содержание Г+Ц в ДНК типового штамма D. lacustre с учетом погрешности (Owen et al., 1985). 3.9.3. ДНК-ДНК гибридизация* ДНК диализовали против 2×SSC как описано выше и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE на льду до получения фрагментов длиной 500-700 п.н. Реакцию гибридизации проводили в соответствии с протоколом Rossello-Mora с соавт. (Rossello-Mora et al., 2011) на спектрофотометре DU800 Beckman Coulter (Beckman, США). 3.9.4. Разработка праймеров in silico Поиск нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и dsrAB СВБ проводили в международной базе данных GenBank. Процедуру выравнивания нуклеотидных (16S рРНК) и аминокислотных (dsrAB) последовательностей осуществляли c помощью программы CLUSTAL W (Larkin et al., 2007). Поиск наиболее консервативных участков, перспективных для конструирования праймеров, проводили вручную. Проверку специфичности праймеров проводили с использованием web-ресурса http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov. Оценку конформации шпилечных структур, образуемых праймерами, силу их связей и температуру плавления осуществляли с помощью программы FastPCR 6.5 (Kalendar et al., 2014). Олигонуклеотиды произведены фирмами Евроген (г. Москва) на синтезаторе Applied Biosystems ABI 3900 (США) и Синтол (г. Москва) на синтезаторе ASM-1000 (Биосет, Россия). 3.9.5 Полимеразная цепная реакция ПЦР с геномной ДНК проводили на амплификаторе Терцик (ДНК-Технология, Россия). Реакционная смесь (25 мкл) содержала: 1×буфер для Taq-полимеразы (Fermentas, Литва); 10 нг ДНК-матрицы; по 50 мкM каждого дНТФ (Fermentas, Литва); по 0.1-0.25 мкМ каждого праймера (Евроген/Синтол, Россия) (Таблица 5); 1.5мM MgCl2 и 1 ед. Taq-полимеразы (Силекс, Россия). Цикл амплификации *- за проведение анализа автор выражает благодарность с.н.с., к.б.н. Е.В. Арискиной (ИБФМ РАН). 51 состоял из начальной денатурации ДНК при 94oС – 3 мин; последующие 27 циклов - денатурация 94°С – 30 сек, отжиг праймеров 55-63°С (в зависимости от праймера) – 15 сек, элонгация ДНК при 72°С – 15-100 сек (в зависимости от длины ожидаемого фрагмента). Таблица 5. Праймеры, использованные в работе. Темп. Литературный Праймер Ген - мишень Последовательность (5’-3’) отжига, источник о С 27f 16S рРНК AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG 55 Lane et al., 1991 бактерий 1492r 16S рРНК ACGG(С/Т)TACCTTGTTACGACTT 55 Lane et al., 1991 бактерий AC(C/G)CACTGGAAGCACG DSR1F dsrAB 55 Wagner et al., 1998 GTGTAGCAGTTACCGCA DSR4R dsrAB 55 Wagner et al., 1998 TGACCAACATGCACGGCTCC DSR170f dsrAB 53 наши исследования TGCCTTCTTCCATCCACCA(G/A)T DSR860r dsrAB 53 наши исследования CCCA 16S рРНК рода CTAGAGAGACTGCCCCGGTTA Desulfonatronum Natr_R 16S рРНК рода CTGCAATCCGAACTGTGGTGA Desulfonatronum Natr_F 63 наши исследования 63 наши исследования ПЦР “в реальном времени” (ПЦР-РВ) проводили на амплификаторе АНК32 (Россия). Реакционная смесь (25 мкл) содержала: 1×реакционная смесь “Синтол” 041-0604006 SYBRE Green I (Синтол, Россия); 10 нг ДНК-матрицы; по 0.1мкМ каждого праймера (Евроген/Синтол, Россия) и 1.5мM MgCl2. Для набора праймеров DSR1F/DSR4R использовали следующий температурно-временной режим: начальная денатурация ДНК при 94oС – 5 мин; последующие 40 циклов денатурация 94°С – 30 сек, отжиг праймеров 55°С – 20 сек, элонгация ДНК при 72°С – 2 мин. Для пар праймеров DSR170f/DSR860r и Natr_F/Natr_R применяли следующий температурно-временной режим: начальная денатурация 94 oС – 5 мин; последующие 40 циклов - 63oС – 40 сек, 95oС – 20 сек. В качестве калибровочного стандарта использовали десятикратные разведения геномной ДНК D. arcticus В15Т или D. lacustre Z-7951Т. Начальное количество геномов, вносимых в реакционную смесь, вычисляли исходя из числа клеток бактерий, взятых для выделения ДНК и подсчитанных методом прямого счета (для D. 52 arcticus В15Т) или по размеру генома (3761451 п.н.) (для D. lacustre Z-7951Т). Концентрацию ДНК измеряли на NanoPhotometer®P-Class (Implen, Германия). Результаты анализировали с помощью программного обеспечения, поставляемого с прибором. 3.9.6. Секвенирование Секвенирование нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и dsrAВ проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования “Геном” ИМБ РАН с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDyeTM Terminator v.3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems. 3.9.7. Филогенетический анализ Для поиска в GenBank нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и dsrAВ использовали программу (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). BLAST базы Последовательности данных NCBI выравнивали с помощью программы CLUSTAL W (Larkin et al., 2007). На основе нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК и dsrAВ с использованием пакета программ MEGA6 (Tamura et al., 2013) были построены филогенетические дендрограммы с применением метода “поиска ближайших соседей” (neibourjoining) (Saitou et al., 1987). Полученные нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК штаммов K3SТ, Su2, Ki4, Ki5Т и Su22Т были депонированы в GenBank под номерами KJ739728, EU315115, KC417373, KC417374 и EU315116, соответственно. 53 Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 4.1. Определение численности бактерий в криопэгах полуострова Ямал Количественную оценку общей численности бактерий в образцах воды из трех криопэгов, различающихся соленостью, осуществляли как методом прямого счета (МПС), так и методом ПЦР “в реальном времени” (ПЦР-РВ) с использованием универсальных бактериальных праймеров 27f/1492r на ген 16S рРНК. В результате общая численность бактерий, полученная с помощью ПЦРРВ, составила 5.2×108 и 1.2×107 копий гена 16S pРНК/мл в криопэгах 1Y и 3Y, соответственно. Численность бактерий, полученная методом прямого счета, составила 8.2×108, 4.2×107 и 3.2×106 кл/мл в криопэгах 1Y, 2Y и 3Y, соответственно (Таблица 6). Для определения общего количества СВБ использовали метод предельных разведений (МПР) и ПЦР-РВ с применением стандартной пары праймеров DSR1F/DSR4R (Wagner et al., 1998) на функциональный ген бисульфитредуктазы dsrAВ. Стандартная калибровочная кривая, уравнение реакции и коэффициент корреляции приведены на рисунке 7. Таблица 6. Общая численность бактерий и сульфатредукторов в криопэгах Ямала Общая численность бактерий Криопэг Минерализация, г/л Общая численность СВБ МПС*, кл/мл ПЦР-РВ**, копий гена16S рРНК/мл МПР***, кл/мл ПЦР-РВ, копий гена dsrAВ/мл 1Y 14.6 8.2×108 5.2×108 2×103 6.9×103 2Y 56.23 4.2×107 н.о. 0 0 77.16 6 3Y 3.2×10 1.2×10 7 2 2×10 2.7×102 *МПС - метод прямого счета;**ПЦР-РВ - ПЦР “в реальном времени”;***МПР - метод предельных разведений; н.о. - не определяли. СВБ были обнаружены в криопэгах 1Y и 3Y в количестве 6.9×103 и 2.7×102 копий гена dsrAВ/мл, соответственно. Порядок численности СВБ соответствует данным, полученным МПР: 2×103 и 2×102 кл/мл в криопэгах 1Y и 3Y, соответственно. 54 Рисунок 7. Стандартная калибровочная кривая, построенная с помощью десятикратных разведений геномной ДНК D. arcticus В-15Т. Ст – пороговый цикл. 40 детекция на № цикла Значения Ст 35 30 y = -2,941x + 19,59 25 R2=0,962 20 15 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 Десятикратные разведения Разведение культуры Desulfovibrio sp. геномной ДНК D.arcticus 1 Для оценки эффективности подбора селективных условий для роста сульфатредукторов при разных температурах культивирования в накопительных культурах ямальских криопэгов К1S, К2S и К3S был применен метод ПЦР-РВ. Накопительные культуры выращивали при 6 и 15оС в течение 60 дней. Тотальную ДНК, выделенную из накопительных культур, использовали в ПЦРРВ с праймерами DSR1F/DSR4R на ген dsrAВ. Численность сульфатредукторов рассчитывали по калибровочной кривой, приведенной на Рисунке 7. Анализ полученных данных показал, что численность СВБ в накопительной культуре K1S увеличилась с 103 до 104, а в накопительной культуре K3S – с 102 до 105 копий гена dsrAВ/мл (Таблица 7). Таблица 7. Численность СВБ в накопительных культурах, полученных при различных температурах культивирования Накопительная культура Численность СВБ в воде криопэга, копий гена dsrAВ/мл К1S К2S К3S 6.9×103 0 2.7×102 Численность СВБ в накопительной культуре, копий гена dsrAВ/мл о 6С 15оС 5.8×104 2.7×104 0 0 5 7.9×10 1.9×105 Отсутствие СВБ в образце воды криопэга 2Y и накопительной культуре K2S можно объяснить несколькими причинами: 1) низкой численностью СВБ, не превышающей пороговый уровень чувствительности пары праймеров DSR1F/DSR4R (100 кл/мл) и метода МПР; 2) наличием представителей новых родов СВБ, не амплифицирующихся с данной парой праймеров; 3) созданием 55 неоптимальных селективных условий в накопительной культуре для присутствующих в образце СВБ. Тем не менее, нельзя исключить и полное отсутствие СВБ в образце криопэга 2Y. Психротолерантный сульфатредуктор из арктического криопэга 4.2. Накопительные культуры К1S, K2S и К3S были получены путем стерильного переноса образцов воды криопэгов 1Y, 2Y и 3Y на минеральную среду с лактатом, с последующей их инкубацией при температуре 6 и 15 оС в течение 8 месяцев. Для получения колоний инокулят из максимального разведения переносили на агаризованную среду и инкубировали в течение 4-5 недель. Выросшие колонии были точечные, округлые, блестящие, прозрачные, коричневого цвета, гладкие, выпуклые, с ровными краями, имели однородную структуру и маслянистую консистенцию. В результате пересева отдельных колоний, из накопительной культуры криопэга 3Y был выделен штамм СВБ, обозначенный нами как К3ST. Морфология клеток. Микроскопирование препаратов живых и фиксированных клеток показало, что новый изолят представлен подвижными одиночными вибрионами размером 0.5×2.0 мкм (Рисунок 8 а). Движение осуществлялось за cчет двух монополярных очехленных жгутиков (Рисунок 8 б). По Граму клетки штамма K3ST окрашивались отрицательно. Микроскопические исследования не обнаружили наличие спор. После пастеризации культуры при 80оС в течение 10 минут рост бактерий также не был обнаружен. а б Ч Ж Ж Ж 1 мкм 1 мкм Рисунок 8. Негативно окрашенные клетки штамма K3ST. Ж- жгутик, Ч- чехол жгутика. 56 Влияние температуры, рН и солености. Выделенный штамм способен расти в диапазоне температур от -2 до 36оС c оптимумом при 26oС (Рисунок 9 а) и, по классификации Мориты (Morita, 1975), является психротолерантным. Рост при температуре -2оС сопровождался образованием 2.65 мМ сульфида в течение 35 дней. Штамм K3ST рос в узком диапазоне рН от 6.8 до 7.4, максимальная скорость роста наблюдалась при рН 7.0-7.2. Исследуемый изолят рос в диапазоне NaCl от 5 до 40 г/л. Оптимальным содержанием NaCl для роста было 20 г/л (Рисунок 9 б). 0,025 а скорость роста, ч-1 скорость роста, ч-1 0,017 0,013 0,009 0,005 0,001 -2 б 0,02 0,015 0,01 0,005 0 5 12 19 26 33 Температура, оС 40 0 10 20 30 NaCl, г/л 40 50 Рисунок 9. Влияние температуры (а) и NaCl (б) на скорость роста штамма K3ST. Использование источников углерода и энергии. Штамм K3ST использовал лактат, формиат, пируват, фумарат, аланин, этанол и молекулярный водород в качестве доноров электронов в присутствии сульфата, причем наибольшее образование сульфида (7.9 мМ) наблюдалось при росте на аланине. Помимо сульфата как конечного акцептора электронов штамм K3ST использовал сульфит, тиосульфат и элементную серу. Штамм K3ST способен также восстанавливать цитрат Fe(III) и ЭДТА Fe(III) без видимого роста. Такие акцепторы электронов как ДМСО, аморфная гидроокись Fe(III) и NaNO3 не поддерживали рост штамма К3ST. Генетический и филогенетический анализ. Содержание Г+Ц пар в ДНК штамма K3ST составило 42.3 мол.%. Нами определена почти полная нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК штамма K3ST (1402 н.о.). Филогенетический анализ нуклеотидных 57 последовательностей гена 16S рРНК показал, что новый штамм кластеризуется с бактериями рода Desulfovibrio. На филогенетическом дереве (Рисунок 10) его ближайшим соседом с 97.4% сходства является D. ferrireducens DSM 16995T бактерия, выделенная из донных отложений Арктического шельфа в районе о. Шпицберген (Vandieken et al., 2006). Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК штамма К3ST депонирована в GenBank под номером KJ739728. D. frigidus DSM 17176T (DQ148943) 74 D. ferrireducens DSM 16995T (DQ148944) 98 99 K3ST (KJ739728) 100 D. hydrothermalis AM13T (AF458778) D. bastinii SRL4225T (AY359868) 68 D. portus MSL79T (AB110541) D. aespoeensis Aspo-2T (EU680957) 100 D. profundus 500-1T (FR733706) 68 D. arcticus B15T (DQ296030) D. longus SEBR 2582T (AY359867) D. psychrotolerans JS1T (AM418397) 59 100 D. oxyclinae P1BT (U33316) 0.01 Рисунок 10. Филогенетическое древо, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, показывающее положение штамма K3ST среди представителей рода Desulfovibrio. СВБ, выделенные из арктических экосистем показаны жирным шрифтом. Длина масштабной линейки: 1 замена на 100 нуклеотидов. Учетный номер базы данных GenBank указан в скобках. Дендрограмма построена с использованием метода “neibour-joining”. Данные “bootstrap”-анализа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления. По ряду фенотипических выделенный изолят оказался и физиолого-биохимических близок к представителям уже признаков известных психротолерантных СВБ (Таблица 8). Сравнение штаммов K3ST и D. ferrireducens DSM 16995T показало, что их объединяет способность к росту на лактате, формиате, водороде, фумарате, этаноле и восстановлению сульфата, сульфита и тиосульфата в процессе роста. Оба штамма являются нейтрофилами, умеренными галофилами и способны расти при отрицательных температурах. Кроме того, новый изолят, как и его ближайшие родственники, оказался 58 способен восстанавливать цитрат Fe(III) и ЭДТА Fe(III) без видимого роста. Но, в отличие от D. ferrireducens, штамм K3ST способен использовать пируват и аланин в качестве донора электронов, а также элементную серу как акцептор электронов. Таблица 8. Сравнительная характеристика штамма K3ST с представителями рода Desulfovibrio, выделенными из арктических экосистем Признак K3ST D. ferrireducens DSM 16995T D. frigidus DSM17176T D. arcticus B15T Жгутики монополярное битрихальное Монотрих Монотрих Монотрих Размер, мкм 0.5×2.0 0.7×2.5-5.5 0.7×2.0-5.0 0.4-0.5×3.04.0 6.8-7.4 7.0-7.2 6.3-7.5 7.1-7.5 6.9-7.5 7.1 5.5-8.5 6.7-7.0 -2-36 26 -2-30 23 -2-25 20-23 -2-28 24 5-40 20 7-40 10-25 20-35 20-30 0-20 2 + + + – + – – + + + – – рН пределы оптимум Температура,oС пределы оптимум NaСl, г/л пределы оптимум Доноры электронов/+SO4 Пируват Фумарат Аланин Акцепторы электронов: Тиосульфат Сера аморфное Fe(III) Fe(III) цитрат Fe(III) ЭДТА Г+Ц, мол.% + + – + + – + + – +/– +/– +/– +/– +/– +/– н.д. +/– 42.3 42.0 43.3 55.2 Наши Vandiekenet al., Vandieken et al., Pecheritsyna et Авторы описания исследования 2006а 2006а al., 2012 +/– , восстановление субстрата без роста; н.д.- нет данных. Уровень сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штаммов K3ST и D. ferrireducens DSM 16995T, составивший 97.4%, а также ряд фенотипических отличий свидетельствуют о том, что штамм K3ST является новым психротолерантным видом рода Desulfovibrio, для которого предложено название ‘Desulfovibrio algoritolerans’ sp. nov. 59 4.3. Обнаружение сульфатвосстанавливающих бактерий в содовых озерах Соленое и Сульфатное Для поиска сульфатвосстанавливающих бактерий в щелочных экосистемах нами были исследованы 4 образца донных осадков озера Соленое, отобранных с глубины 0-5, 15-17, 19-21, 23-25, и 1 образец поверхностных донных осадков озера Сульфатное. Из пяти отобранных образцов была выделена тотальная ДНК, которую использовали для обнаружения СВБ методом ПЦР с применением стандартной пары праймеров DSR1F/DSR4R на функциональный ген бисульфитредуктазы dsrAB. В результате были получены ПЦР-фрагменты ожидаемой длины 1900 н.о. из ДНК всех пяти образцов (Рисунок 11 а), что доказывало присутствие сульфатредукторов в донных осадках озер Соленое и Сульфатное. 1 2 3 4 5 6 7 М1 М2 a 2000 н.о. 1500 н.о. 1 2 3 4 5 6 7 б 800 н.о. Рисунок 11. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации фрагментов гена dsrAB с использованием праймеров DSR1F/DSR4R (а) и DSR170f/DSR860r (б): 1 – оз. Соленое (0-5 cм), 2 – оз. Соленое (15-17 см), 3 – оз. Соленое (19-21 см), 4 – оз. Соленое (23-25 см), 5 – оз. Сульфатное (0-5 см), 6 – D. lacustre (положительный контроль), 7 – контрольная ПЦР без ДНК. М1 - маркер молекулярной массы ДНК GeneRuler™ 100+ п.н. (Fermentas, Литва). М2 – маркер молекулярной массы ДНК FastRuler™ 50-1500 п.н. (Fermentas, Литва). Однако при использовании праймеров DSR1F/DSR4R образовывалось большое количество неспецифических продуктов амплификации, что ограничивало применение данной пары праймеров для количественной оценки СВБ методом ПЦР “в реальном времени” с использованием красителя SYBR Green I. В связи с этим, следующий этап работы был направлен на разработку новой пары праймеров для детекции СВБ в щелочных экосистемах, подходящей для ПЦР-РВ. 60 На основании имеющихся в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей гена dsrA СВБ различных филогенетических подгрупп, включая последовательности алкалофильных сульфатредукторов, мы разработали новую пару праймеров DSR170f/DSR860r на ген dsrA. С использованием этой пары праймеров были получены ПЦР-фрагменты гена dsrA ожидаемой длины (740 н.о.) с ДНК из пяти исследованных образцов донных отложений озер Соленое и Сульфатное. Полученные ПЦР-фрагменты не содержали неспецифических продуктов амплификации (Рисунок 11 б). Таким образом, новая пара праймеров DSR170f/DSR860r более предпочтительна для детекции СВБ в щелочных экосистемах и подсчета общей численности СВБ методом количественной ПЦР по сравнению с парой праймеров DSR1F/DSR4R. Известно, что представители рода Desulfonatronum могут составлять значительную часть алкалофильного микробного сообщества содовых озер. Для количественной оценки сульфатредукторов этого рода на основе нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий рода Desulfonatronum, имеющихся в базе данных GenBank,нами была разработана пара родоспецифичных праймеров Natr_F/Natr_R, позволяющая амплифицировать фрагменты длиной 164 пар оснований. Разработанная пара праймеров была протестирована на препаратах ДНК, выделенных из филогенетических нейтрофильных подгрупп: и алкалофильных Desulfovibrio desulfuricans СВБ ВКМ различных B-1799Т, Desulfomicrobium baculatum ВКМ В-1378Т, Desulfomicrobium macestii ВКМ B1598Т, Desulfobulbus elongatus DSM 2908Т, Desulfobacterium autotrophicum ВКМ В-1955Т, Desulfosarcina variabilis ВКМ B-1627Т, Desulfohalobium utahense ВКМ В-2384Т, Desulfosporosinus orientis ВКМ В-1628Т, Desulfotomaculum alkaliphilum ВКМ B-2192Т, Desulfonatronovibrio thiodismutans AHT9T, Desulfonatronum lacustre ВКМ B-2475Т, Desulfonatronum sp. ВКМ B-2476, Desulfonatronum sp. ВКМ B-2475, Desulfonatronum buryatense ВКМ B-2477Т, ‘Desulfonatronum zhilinae’ ВКМ B-2744T, Desulfonatronum thioautotrophicum ASO4-1Т, 61 Desulfonatronum cooperativum ВКМ B-2329T и Desulfonatronum thiosulfatophilum ASO4-2Т. Используя пару праймеров Natr_F/Natr_R удалось получить ПЦРфрагменты ожидаемой длины только с представителями рода Desulfonatronum (Рисунок 12). Секвенирование ампликонов показало, что все нуклеотидные последовательности на 99-100% совпадают с депонированными в GenBank последовательностями гена16S рРНК соответствующих сульфатредукторов рода Следовательно, Desulfonatronum. праймеры Natr_F/Natr_R являются специфичными для гена 16S рРНК бактерий рода Desulfonatronum. 1 2 3 4 5 6 7 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 М а б 200 н.о. Рисунок 12. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации фрагментов гена 16S рРНК с использованием праймеров Natr_F/Natr_R (а): 1 – D. thiosulfatophilum, 2 – ‘D. zhilinae’, 3 – D. cooperativum, 4 – D. buryatense, 5 – Desulfonatronum sp. Ki4, 6 – Desulfonatronum sp. Su2, 7 – контрольная ПЦР без ДНК. (б):1 –D. thioautotrophicum, 2 – D. thiodismutans, 3 – D. desulfuricans, 4 – D. baculatum, 5 – D. macestii, 6 – D. elongatus, 7 – D. autotrophicum, 8 – D. variabilis, 9 – D. utahense, 10 – D. orientis, 11 – D. alkaliphilum, 12 – контрольная ПЦР без ДНК. М- маркер молекулярной массы ДНК FastRuler™ 50-1500 п.н. (Fermentas, Литва). Разработанная пара праймеров Natr_F/Natr_R была использована для поиска бактерий рода Desulfonatronum в образцах донных осадков озер Соленое и Сульфатное. ПЦР-фрагменты ожидаемой длины были получены с ДНК из всех пяти исследуемых проб (Рисунок 13). Следовательно, данная пара праймеров может быть использована для скрининга бактерий рода Desulfonatronum в щелочных экосистемах. 1 2 3 4 5 6 7 М Рисунок 13. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации фрагментов гена 16S рРНК с использованием праймеров Natr_F/Natr_R: 1 – оз. Соленое (0-5 cм), 2 – оз. Соленое (15-17 см), 3 – оз. Соленое (1921 см), 4 – оз. Соленое (23-25 см), 5 – оз. Сульфатное (0-5 см), 6 – D. lacustre 200 н.о. (положительный контроль), 7 – контрольная ПЦР без ДНК. М- маркер молекулярной массы ДНК FastRuler™ 50-1500 п.н. (Fermentas, Литва). 62 4.4.Определение численности сульфатредукторов в содовых озерах Количественную оценку численности СВБ в образцах ила содовых озер Соленое и Сульфатное осуществляли методом ПЦР-РВ и методом предельных разведений (МПР). Для подсчета общего числа СВБ и численности бактерий рода Desulfonatronum были использованы разработанные пары праймеров DSR170f/DSR860r на ген dsrA и Natr_F/Natr_R на ген 16S рРНК бактерий рода Desulfonatronum. Стандартные калибровочные кривые, уравнения реакции и коэффициенты корреляции для расчета численности приведены на Рисунке 14. 35 Значение Ст 30 y = -3,4422x + 39,594 R² = 0,9972 25 20 y = -3,3378x + 32,826 R² = 0,9999 15 10 1 2 3 4 5 6 7 Log10 числа копий гена 16S рРНК D. lacustre Z-7951Т Рисунок 14. Стандартные калибровочные кривые, построенные с помощью десятикратных разведений геномной ДНК D. lacustre с использованием праймеров: (●) - Natr_F/Natr_R, (■) – DSR170/DSR860. Ст – пороговый цикл. Общая численность СВБ в донных осадках озера Соленое, определенная методом ПЦР-РВ составила от 7.9×104 до 2.4×106 копий гена dsrA/г. Наибольшее содержание сульфатредукторов выявлено в поверхностном слое ила озера Соленое (2.4×106), тогда как в подповерхностных слоях численность СВБ была на порядок ниже (Таблица 9). Таблица 9. Численность СВБ в образцах донных осадков содовых озер Соленое и Сульфатное. Озеро Глубина отбора, (см) Общее число СВБ, копий гена dsrA/г Численность Desulfonatronum spp., копий гена 16S рРНК/г Численность Desulfonatronum spp. от общего числа СРБ, % Общее число СВБ, кл/г (МПР*) Соленое 0-5 15-17 19-21 23-25 0-5 2.4×106 7.9×104 1.9×105 1.5×105 1.2×105 1.8×106 3.0×104 2.9×104 6.6×104 7.7×103 75 38 15.3 44 6.5 104 105 105 106 104 Сульфатное *МПР- метод предельных разведений Численность бактерий рода Desulfonatronum в донных отложениях озера Соленое составила от 2.9×104 до 1.8×106 копий гена 16S рРНК/г с максимальным 63 количеством этих бактерий в поверхностном слое (75% от общего количества СВБ). В подповерхностных слоях ила озера Соленое численность этих бактерий практически не изменялась и составила 2.9×104-6.6×104 копий гена 16S рРНК/г образца (15-44% от общей численности СВБ). Максимальная общая численность сульфатредукторов, в том числе Desulfonatronum spр., в поверхностном слое донных осадков, возможно, связана с бóльшим количеством органического вещества, попадающего на поверхность донных отложений из водной толщи. В образце поверхностных донных осадков озера Сульфатное общая численность СВБ была определена в количестве 1.2×105 копий гена dsrA/г образца. Численность бактерий рода Desulfonatronum в озере Сульфатное оказалась наименьшей среди исследуемых образцов и составила лишь 6.5% от общей численности сульфатредукторов. Возможно, это связано с преобладанием алкалофильных СВБ других родов, к примеру, Desulfonatronovibrio или Desulfonatronospira. Для сравнения мы использовали микробиологический метод предельных разведений (МПР). Применение этого метода показало, что общая численность СВБ в донных осадках озер Соленое и Сульфатное составила 104-106 и 104 кл/г, соответственно. Данные численности СВБ, полученные МПР, расходятся с численностью, определенной методом ПЦР-РВ, что можно объяснить недостатком метода предельных разведений, позволяющего подсчитывать только культивируемые виды СВБ. Следует отметить, что оценка общей численности СВБ в донных отложениях некоторых солоновато-содовых и гиперсоленых озер Забайкалья методом предельных разведений ранее проводилась (Намсараев и др., 2007; Колосов и др., 2010) и составила от 102 до 107 клеток/мл. Максимальное число сульфатредукторов также содержалось в поверхностном и подповерхностном слоях донных осадков. Полученные нами результаты в очередной раз доказали, что СВБ и, в частности, представители рода Desulfonatronum компонентом микробного сообщества содовых озер. являются активным 64 4.5. Новые анаэробные бактерии содовых озер 4.5.1. Сульфатвосстанавливающие бактерии Накопительные культуры алкалофильных СВБ были получены путем стерильного переноса образцов донных осадков на карбонатную минеральную среду (рН 9.0, 9.5, 9.8) с лактатом или формиатом в качестве субстрата, и инкубацией при температуре 27 или 37оС в течение 14 дней. Накопительные культуры, характеризующиеся максимальным образованием сульфида, пересевали на минеральную среду в серии десятикратных разведений. Для получения колоний инокулят из максимального разведения переносили на агаризованную среду и инкубировали в течение 4-5 недель. Выросшие колонии были точечные, округлые, блестящие, прозрачные, коричневого цвета, гладкие, выпуклые, с ровными краями, имели однородную структуру и маслянистую консистенцию. В результате пересева отдельных колоний с твердой среды в жидкую, были выделены три штамма алкалофильных СВБ, обозначенные нами как Ki4, Ki5Т и Su2. Изоляты Ki4 и Ki5Т выделены из донных осадков озера Соленое, штамм Su2 – из озера Сульфатное. Изучение свойств новых изолятов выполнено в совместных исследованиях с рядом соавторов (Рыжманова и др., 2011; Ryzhmanova et al., 2013). Морфология клеток. Микроскопические исследования показали, что выделенные штаммы представлены подвижными одиночными вибрионами разного размера: штамм Ki4 0.6-0.8×2.0-2.5 мкм, штамм Ki5Т – 0.5-0.7×2.0-2.5 мкм, штамм Su2 – 0.8-0.9×2.3-2.6 мкм (Рисунок 15). Размножение происходило бинарным делением. Клетки штаммов Su2 и Ki5Т часто образовывали короткие цепочки – спириллы с 2-3 клетками в цепи. Подвижность клеток штаммов Su2 и Ki5Т определялась одним полярно расположенным жгутиком (Рисунок 15 б,в). Для клеток штамма Ki4 характерно перитрихиальное жгутикование и наличие боковых пили (Рисунок 15 а). Клетки Ki4 и Ki5Т образовывали везикулы внешних мембран. По Граму клетки всех изолятов окрашивались отрицательно. Микроскопические исследования культур Su2, Ki4, Ki5Т показали отсутствие 65 спор у данных штаммов. После пастеризации культур в течение 10 минут при 80оС рост бактерий также не был обнаружен. ВВМ П Ж ВВМ Ж Ж Ж ВВМ П Ж 1 мкм 1 мкм а б 1 мкм в Рисунок 15. Негативно окрашенные клетки штаммов Ki4 (а), Ki5Т (б), Su2 (в). Ж- жгутик, П- пили, ВВМ-везикулы внешних мембран. Влияние температуры, солености и рН. Все выделенные штаммы представлены мезофилами и способны расти в диапазоне температур от 20 до 40оС. Оптимальной температурой для роста штаммов Ki4 и Su2 является 29oС, для штамма Ki5Т – 34оС. Штамм Ki4 рос в диапазоне рН 7.5-10.0, штамм Ki5Т – 7.5-10.5, штамм Su2 – 8.0-11.5. Максимальные скорости роста наблюдалась при рН 8.9, 9.4 и 10.0 для штаммов Ki4, Ki5Т и Su2, соответственно (Рисунок 16). Исследуемые штаммы росли в широком диапазоне солености среды культивирования: 1-80 г/л NaCl (штамм Ki4), 2-40 г/л NaCl (штамм Ki5Т) и 5-100 г/л NaCl (штамм Su2). Оптимальная концентрация NaCl в среде для роста штаммов Su2 и Ki4 – 10 г/л, для штамма Ki5Т – 5 г/л. Штаммы Ki4 и Ki5Т облигатно нуждались в ионах Na+, эквимолярная замена солей натрия на соответствующие калиевые соли не поддерживала рост. Замена хлорид-иона эквимолярным количеством в среде карбонат-ионов, где рН поддерживался 50 мM глициновым буфером, не влияла на рост штаммов Su2, Ki4 и Ki5Т, хотя подвижность клеток значительно снижалась. 66 Время удвоения,ч-1 120 100 80 Ki5 60 Su2 Ki4 40 20 0 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11,2 pH Рисунок 16. Влияние рН на скорость роста штаммов Ki4, Ki5Т и Su2. Использование источников углерода и энергии. Выделенные штаммы Su2, Ki4 и Ki5Т различались по спектру используемых доноров и акцепторов электронов, но все культуры использовали лактат, этанол и сульфат для роста с образованием ацетата и сульфида. Рост изолятов на формиате сопровождался образованием только сульфида водорода. Измерение CO2 как конечного продукта метаболизма при высоких значениях рН было невозможно ввиду высокого уровня карбонатов в среде. Штаммы Ki4 и Ki5Т способны использовать в качестве донора электронов пируват, а штаммы Ki4 и Su2 - молекулярный водород в присутствии ацетата. Штаммы Ki4 и Ki5Т способны также к ферментации лактата в отсутствии источника серы с образованием ацетата, пропионата и валерата, являясь, таким образом, факультативными бродильщиками. Все штаммы не росли на следующих субстратах: глюкозе, фруктозе, маннозе, ксилозе, ацетате, пропионате, бутирате, фумарате, бензоате, сукцинате, малате, глицерине, метаноле и казаминовых кислотах. Помимо сульфата штаммы Ki4 и Su2 использовали сульфит как конечный акцептор электронов с образованием 3.8 и 4.5 мМ сульфида, соответственно. Штаммы Ki4 и Ki5Т использовали также тиосульфат как акцептор электронов с образованием 16.2 и 18.8 мМ сульфида, соответственно. Штаммы Ki5Т и Su2 восстанавливали аморфную гидроокись Fe(III). Штамм Ki5Т, кроме того, медленно восстанавливал элементную серу с образованием 10.2 мМ сульфида за 67 14 дней в третьем пересеве. ДМСО, фумарат и нитрат как акцепторы электронов не поддерживали рост ни одного из штаммов. Содержание цитохромов, флюоресцирующих пигментов, менахинонов. С помощью дифференциального СО-спектрального анализа цитоплазматической фракции клеток штаммов Su2, Ki4 и Ki5Т были получены два пика при длине волны 523 и 552 нм, свидетельствующие о наличии СО-связывающего цитохрома с в клетках бактерий. Менахинон МК6(Н2) присутствовал в клетках всех штаммов. Десульфовиридин - пигмент характерный для представителей рода Desulfovibrio - не обнаружен. Генетический и филогенетический анализ. Нами определены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и dsrAB алкалофильных изолятов. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показал, что новые штаммы алкалофильных СВБ кластеризуются с бактериями рода Desulfonatronum (Рисунок 17), а их ближайшим соседом является D. lacustre Z-7951Т (99.0-99.6% сходства). На дереве бисульфитредуктаз представители рода Desulfonatronum также представляют собой довольно тесную группу, но штамм Ki5T отделился в отдельную ветвь и, вероятно, представляет новый вид рода Desulfonatronum (Рисунок 18). Липидный анализ. Жирнокислотные профили штаммов Ki4, Ki5Т и Su2 показали, что преобладающими жирными кислотами у штамма Ki4 были C14:0, Ca15, C16:1ω7c и C18:1ω7; у штамма Ki5Т – C14:0, Ca15 и Ci15; а у штамма Su2 – C14:0, Ca15 и C16:1ω7c. Типовой штамм вида D. lacustre Z-7951Т отличался от выделенных бактерий значительным содержанием в клеточных стенках кислот C18:0 и C18:1ω9. ДНК-ДНК гибридизация и нуклеотидный состав ДНК. Содержание Г+Ц пар в ДНК штаммов Ki4, Ki5Т и Su2 составило 56.3±0.5, 48.8±0.5 и 59.6±0.6 мол.%, соответственно. Уровень сходства ДНК типового щтамма D. lacustre Z7951T со штаммами Ki4, Ki5Т и Su2 составил 89, 53 и 79%, соответственно. 68 Ki4 (KC417373) Ki5Т (KC417374) Desulfonatronum lacustre DSM Z-7951T(NR041848) 57 65 Su2 (EU315115) 99 Desulfonatronum thiodismutans DSM 14708T (AF373920) 99 Desulfonatronum thioautotrophicum DSM 21337T (FJ469577) Desulfonatronum thiosulfatophilum DSM 21338T (FJ469578) Desulfonatronum cooperativum DSM 16749T (AY725424) Desulfovibrio alkalitolerans DSM 16529T (AY649785) Desulfothermus naphthae DSM 13418T (X80922) Desulfonauticus submarinus DSM 15269T (AF524933) Desulfohalobium retbaense DSM 5692T(U48244) 100 Desulfonatronospira delicata DSM 19491T(EU296539) Desulfonatronospira thiodismutans DSM 19093T (EU296537) Desulfonatronovibrio hydrogenovorans DSM 9292T (X99234) Desulfonatronovibrio magnus DSM 24400T (GU196831) 100 80 Desulfonatronovibrio thiodismutans DSM 21540T (FJ469579) Desulfotalea arctica DSM 12342T (AF099061) Desulfopila aestuarii DSM 18488T (AB110542) Desulfocapsa sulfexigens DSM 10523T (Y13672) Desulforhopalus singaporensis DSM 12130T (AF118453) Desulfofustis glycolicus DSM 9705T (X99707) Desulfurivibrio alkaliphilus DSM 19089T (NR044206) Desulfocella halophila DSM 11763T (AF022936) Desulfobacterium autotrophicum DSM 3382T (AF418177) Desulfobacter halotolerans DSM 11383T (Y14745) Desulfobotulus alkaliphilus DSM 22078T (FJ788523) Desulfofrigus fragile DSM 12345T (AF099065) Desulfosalsimonas propionicica DSM 17721T (DQ067422) Desulfosarcina variabilis DSM 2060T (M34407) Desulfonema magnum DSM 2077T (U45989) 97 91 100 85 100 76 90 57 99 51 99 100 59 99 99 52 88 78 99 0.02 Рисунок 17. Филогенетическое древо СВБ в пределах Deltaproteobacteria, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. СВБ содовых озер выделены жирным шрифтом. Длина масштабной линейки: 2 замены на 100 нуклеотидов. Учетный номер базы данных GenBank указан в скобках. Дендрограмма построена с использованием метода поиска ближайших соседей (“neibour-joining”). Данные “bootstrap”анализа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления. Su2 Desulfonatronum thiosulfatophilum ASO4-2T 100 Desulfonatronum lacustre Z-7951T (AF418189) Ki5T Desulfonatronum thioautotrophicum ASO3-6 (JQ519396) Desulfonatronum cooperativum Z-7999T Desulfonatronospira thiodismutans AHT8 (JQ519392) Desulfonatronovibrio hydrogenovorans Z-7935T (AF418197) Desulfonatronovibrio halophilus HTR1T (JQ519393) Desulfonatronovibrio thiodismutans AHT9T Desulfonatronovibrio thiodismutans ASO4-5 (JQ519395) 100 100 Desulfonatronovibrio magnus AHT22T (JQ519394) 93 100 99 100 100 96 0.05 Рисунок 18. Филогенетическое древо алкалофильных СВБ содовых озер, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена dsrAB с использованием метода поиска ближайших соседей (“neibour-joining”). Длина масштабной линейки: 5 замен на 100 нуклеотидов. Учетный номер базы данных GenBank указан в скобках. Данные “bootstrap”анализа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления. 69 Таблица 10. Состав жирных кислот штаммов Ki4, Ki5Т, Su2 и D. lacustre Z-7951T ЖК, %* C 14:0 C i14 C 15:0 C i15 C a15 C i15:1 C 16:0 Ci16 C i16:1 C 16:1ω7c C 16:1ω7t C 16:1ω9с C 17:0 C 17:1ω8 C i17:1ω6c C i17:1ω6t C i17:1ω9 C a17:1ω9 C 18:0 C 18:1ω7 C 18:1ω9 D. lacustre Z- Ki4 Ki5Т Su2 13,81 0,69 0,44 2,26 9,90 1,25 4,43 0,24 3,88 18,50 5,20 7,17 0,09 1,69 0,34 2,65 3,96 11,22 1,36 0,51 9,52 14,13 2,25 3,09 0,70 3,46 5,95 3,71 5,08 0,27 1,23 1,51 5,84 7,77 20,53 0,90 0,75 5,84 12,49 1,22 4,07 14,6 0,9 1 4,7 3 0,9 7,7 1,56 24,37 1,2 22,9 0,42 0,54 1 0,8 4,56 9,78 4,85 7,94 7,05 3,11 4,20 2,25 6,16 5,78 3,78 4,5 0,6 10,7 10,1 9,5 7951T *показаны значения ЖК более 1%. Выделенные из содовых озер новые штаммы СВБ близки к представителям уже известных алкалофильных СВБ по ряду фенотипических и физиологобиохимических признаков. Например, как и D. lacustre Z-7951T, все штаммы способны окислять лактат, формиат и этанол, а в качестве акцептора электронов использовать сульфат. Как и D. lacustre, штаммы Ki4 и Su2 могут использовать Н2 в качестве донора электронов, штаммы Ki5Т и Su2 – сульфит в качестве акцептора электронов, а штаммы Ki4 и Ki5Т – тиосульфат. Однако исследуемые бактерии имеют некоторые существенные отличия от D. lacustre Z-7951T (Таблица 11). Новые изоляты способны расти на пирувате (штаммы Ki4 и Su2), а также использовать элементную серу (Ki5Т) и аморфную гидроокись Fe(III) (штаммы Кi5Т и Su2) - нехарактерный для алкалофильных сульфатредукторов акцептор электронов. У изученных штаммов СВБ не обнаружена облигатная 70 зависимость от карбонат-ионов, которая характерна для D. lacustre. Все изученные штаммы являются умеренными галофилами и облигатными алкалофилами, их рост зависит от ионов Na+ и невозможен при рН < 7.5. Таблица 11. Дифференцирующие признаки штаммов Ki4, Ki5Т, Su2 и D. lacustre Z-7951T. Признак Кi4 Размер, мкм ширина длина Жгутики рН пределы оптимум Температура,оС оптимум NaСl, г/л пределы оптимум Доноры электронов/SO4-2 Н2+ ацетат пируват Акцепторы электронов/ лактат сульфит тиосульфат So Fe3+ Ферментация лактата Г+Ц, мол.% Авторы описания Учитывая Кi5Т Su2 D. lacustre Z-7951T 0.6-0.8 2.0-2.5 Перитрих 0.5-0.7 2.0-2.5 Монотрих 0.8-0.9 2.3-2.6 Монотрих 0.7-0.9 2.0-3.0 Монотрих 7.5-10.0 8.9 7.5-10.5 9.4 8.0-11.5 10.0 7.0-10.5 9.5 29 34 29 37-40 1-80 10 2-40 5 2-100 10 0-100 0 + + – + + – + – – + – – + 56.3 Наши исследования + + + + + 48.8 Наши исследования + – – + – 59.6 Наши исследования + + – – – 57.3 Пикута и др., 1998 достаточно высокое сходство нуклеотидных последовательностей гена 16S pPHK штаммов Ki4 и Su2 с D. lacustre Z-7951T (99.3 и 99.6%, соответственно), а также уровень ДНК-ДНК сходства (89 и 79%), мы полагаем, что штаммы Ki4 и Su2 являются новыми штаммами вида D. lacustre. При этом штамм Su2 является первым штаммом вида D. lacustre, способным к восстановлению Fe(III), что расширяет представления о данном виде. В соответствии с низким уровнем ДНК-ДНК сходства штамма Ki5Т с D. lacustre (53%), а также учитывая ряд фенотипических и генотипических отличий, мы предположили, что штамм Ki5Т является представителем нового вида Desulfonatronum buryatense sp.nov. 71 4.5.2. Выделение и характеристика анаэробной алкалофильной протеолитической бактерии В процессе выделения и очистки алкалофильного сульфатредуктора Su2 была обнаружена устойчивая ассоциация этого штамма с палочковидной бактерией. Бактерия-спутник была изолирована путем высева на среду АМ, не содержащую сульфат и лактат, и обозначена как штамм Su22T. Морфология клеток. Микроскопирование препаратов с живыми и фиксированными клетками показало, что новый штамм Su22T представлен неподвижными палочками со слегка заострёнными концами 0.4-0.7×2.0-6.5 мкм (Рисунок 19 а,б). Изолят имеет клеточную стенку грамположительного типа, содержащую S-слой (Рисунок 19 в). Жгутики и пили не были обнаружены. Наличие спор также не было выявлено, хотя в конце логарифмической фазы роста часто наблюдались утолщения в центре клетки (Рисунок 19 а). Пастеризация культуры при 80 оС в течение 20 минут с последующим посевом и инкубированием пастеризованной культуры в оптимальных условиях показала терморезистентность клеток штамма Su22Т. Анализ ультратонких срезов позволил обнаружить в начинающих лизироваться клетках образования, напоминающие проспоры (Рисунок 19 в). Таким образом, полученные результаты не дают однозначного ответа на вопрос о возможности спорообразования новой бактерией. Последующее исследования по подбору условий спорообразования и/или по исследованию генома штамма Su22Т позволят это сделать. а в б 1.0 мкм PS S N Рисунок 19. Морфология клеток штамма Su22Т. S – S-слой, PS –“ проспора”, N – нуклеоид. 72 Генетический и филогенетический анализ. Нами определена почти полная нуклеотидная последовательность (1507 п.н.) гена 16S рРНК штамма Su22Т. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показал, что новый изолят образует отдельную ветвь с A. sibiricum Z-7981Т – единственным видом рода Anoxynatronum – со сходством 98.1%. Дендрограмма на Рисунке 20 демонстрирует положение штамма Su22Т среди представителей второго кластера семейства Clostridiaceae, в основном относящихся к алкалофильным протеолитическим и сахаролитическим бактериям содовых озер. T 81 Tindallia magadiensis Z-7934 (Y15626) 54 ‘Clostridium bogorii’ B8NS1-CT (AJ271457) 99 ‘Clostridium alcaliphilum’ B8NS1-AT (AJ271456) 94 89 99 ‘Clostridium aminovorans’ B7FT-AT (AJ271455) Tindallia californiensis APOT (AF373919) Tindallia texcoconensis IMP-300T (DQ234901) ‘Clostridium elmenteitii’ E2SE1-BT (AJ271453) 100 98 ‘Clostridium alcalibutyricum’ E2SE1-CT (AJ271454) Su22T (EU315116) 100 Anoxynatronum sibiricum Z-7981T (NR_025256) 94 90 Anaerovirgula multivorans SCAT (AB201750) 99 Natronincola ferrireducens Z-0511T (EU878275) 87 Natronincola peptidivorans Z-7031T (EF382661) 100 73 Clostridium formicaceticum DSM 92T (HF679208) Natronincola histidinovorans Z-7940T (Y16716) Alkaliphilus halophilus E2RT (EU627628) Alkaliphilus oremlandii OhILAsT (NR 074435) Alkaliphilus crotonatoxidans B11-2T (AF467248) 100 Alkaliphilus peptidifermentans Z-7036T (EF382660) 100 70 Alkaliphilus transvaalensis SAGM1T (AB037677) Clostridium felsineum DSM 794T (AF270501) 0.02 Рисунок 20. Филогенетическое древо порядка второго кластера семейства Clostridiaceae, построенное на основе анализа генов 16S рРНК. Бактерии, выделенные из содовых озер, показаны жирным шрифтом. Длина масштабной линейки: 2 замены на 100 нуклеотидов. Учетный номер базы данных GenBank указан в скобках. Дендрограмма построена с использованием метода поиска ближайших соседей (“neibour-joining”). Данные “bootstrap”-анализа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления. 73 Культуральные и физиологические особенности. Штамм Su22Т не скорость роста,час-1 содержит каталазу и является оксидазо-положительной бактерией, не способной расти в аэробных условиях. Однако присутствие ≤ 4.5% O2 в газовой фазе не ингибирует роста. Штамм Su22Т мезофил, растет в диапазоне температур от 20 до 40оС с оптимумом 30оС. Изолят способен расти в широком диапазоне рН: от 7.4 до 11.0 с оптимумом 9.6 (Рисунок 21 а). Штамм Su22Т растет в диапазоне NaCl 2-60 г/л, оптимальная концентрация содержания NaCl – 20 г/л (рисунок 21 б). Рост новой бактерии зависит от присутствия карбонатов: их замена на сериновый буфер (pH 9.0) ингибирует рост изолята во втором пересеве. 0,1 0,07 скорость роста, ч-1 а б 0,06 скорость роста, ч-1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 7 8 9 10 11 12 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0 20 40 60 NaCl, г/л pH 80 Рисунок 21. Влияние рН (а) и NaCl (б) на рост штамма Su22Т. Штамм Su22Т не использовал в качестве источника углерода и энергии пируват, пептон, глюкозу, фруктозу, триптиказу, фумарат, маннозу, лактат, формиат, бутират, пропионат, гептоноат, капроат, малат, сукцинат, сорбит, цитрат, метанол или бутанол. Все потребности штамма в макро- и микроэлементах удовлетворялись средой, содержащей только карбонаты, NaCl и дрожжевой экстракт, а выход биомассы был пропорционален концентрации дрожжевого экстракта от 1 до 10 г/л (Таблица 12). Таблица 12. Влияние концентрации дрожжевого культивирования на скорость роста штамма Su22Т Дрожжевой экстракт, г/л 0 1.0 2.5 5.0 7.5 10.0 Прирост* OD600 0 0.02 0.04 0.16 0.17 0.21 экстракта в Скорость роста, ч-1 0 0.0011 0.0043 0.0103 0.0139 0.0185 *разница между OD600, измеренной в нулевой точке и через 72 часов культивирования среде 74 Витамины (Wolin et al., 1963) не заменяли дрожжевой экстракт. Кроме дрожжевого экстракта рост штамма Su22Т наблюдался на триптоне и казеине. Некоторые протеолитические бактерии, выделенные из содовых озер, способны расти на биомассе водорослей, цианобактерий и архей (Garnova et al., 2003; Kevbrin et al., 2013). Была проверена возможность роста штамма Su22Т на автоклавированной биомассе сульфатредуктора штамм Su2, который являлся спутником новой бактерии. В среду, не содержащую дрожжевой экстракт, добавляли отцентрифугированную биомассу сульфатредуктора (2 г сырой биомассы разводили в 10 мл физраствора, дважды автоклавировали и добавляли в среду 0.1 мл полученной смеси на 10 мл среды). Через 48 часов культивирования в оптимальных условиях наблюдали значительный прирост клеток штамма Su22Т - до 3.5×109 кл/мл. Определение спектра аминокислот в супернатанте до и после культивирования штамма Su22Т на среде, содержащей 2 г/л дрожжевого экстракта, показало, что из среды потреблялись лизин, гистидин, аспаргин, треонин, серин, глицин, тирозин и фенилаланин, содержащиеся в дрожжевом экстракте в свободном и связанном состоянии (Таблица 13). Таблица 13. Использование штаммом Su22Т аминокислот и пептидов, входящих в состав дрожжевого экстракта Соединения лизин гистидин аспаргин треонин+серин глутатион глицин аланин валин изолейцин тирозин+фенилаланин аммоний Содержание аминокислот и аммония, мг/л Исходная среда Культуральная жидкость* 35.1 0 7.8 0 34.4 следы 57.6 следы 151.5 26.1 18.8 0 86.3 377.1 78.4 266.6 58.1 189.9 51.8 следы 88.5 1231.7 * - после 72 часов культивирования Увеличение содержания аланина, валина и изолейцина свидетельствует о том, что эти аминокислоты высвобождались из белков и пептидов при 75 использовании их штаммом Su22Т. Следует также отметить значительное образование аммония при росте в этих условиях. Изолят не рос на индивидуальных аминокислотах, а именно лизине, глутамине, аргинине, гистидине, валине, орнитине, урациле, аланине, холине, пролине, цитруллине и серине. Также не наблюдалось роста на парах аминокислот (аланин+глицин, лейцин+пролин, валин+орнитин, гистидин+аргинин, аланин+триптофан, аланин+аспарагин, изолейцин+пролин, валин+глицин), входящих в состав дрожжевого экстракта, что является тестом на реакцию Стикленда. Следовательно, рост штамма Su22Т связан с ассимиляцией неидентифицированных компонентов дрожжевого экстракта. Штамм Su22Т не требовал добавления в среду акцепторов электронов. Тем не менее, добавление в среду серосодержащих акцепторов электронов стимулировало его рост. Элементная сера ингибировала рост референтного штамма A. sibiricum Z-7981Т, тогда как остальные содержащие серу акцепторы электронов также стимулировали его рост. Рост изолята на тиосульфате и элементной сере сопровождался образованием сульфида (1.98 и 3.2 мМ, соответственно). Такие акцепторы электронов, как DMSO, фумарат, Fe(III) и NaNO3 не стимулировали рост штамма Su22Т. При росте на дрожжевом экстракте (2 г/л) штамм Su22Т образовывал аммоний, формиат и ацетат в качестве основных продуктов, а также пропионат в качестве минорного продукта. Изолят не продуцировал водород и этанол. Таким образом, физиологически штамм Su22Т относится к первичным анаэробам, использующим белковые соединения для роста. Липидный анализ. Сравнение профилей жирных кислот штаммов Su22Т и A. sibiricum Z-7981Т показало, что доминирующими соединениями для них являются C16:1ω7c, C16:0 и C16:0a (Таблица 14). В сумме они составили 54.34 и 42.51% от общего количества ЖК для штаммов Su22Т и A. sibiricum Z-7981Т, соответственно. Однако по составу минорных компонентов профили значительно различались. Так, клетки штамма Su22Т содержали насыщенную 76 C12:0 и ненасыщенную C17:1ω9 кислоты, а клетки штамма Z-7981T – C13:0 , C14:1ω5, Ci15, Ca15, C 16:1 OМe, C18:0a, Ci17, Ca17, C17cyc, C19:0, C18:0 10-oxo и C18:0 10-OH. Таблица 14. Состав жирных кислот штамма Su22Т и A. sibiricum Z-7981Т ЖК, % C 12:0 C 13:0 C i14 C 14:1ω7 C 14:1ω5 C 14:1ω3 C 14:0 C 14a Ci15 Ca15 C15:1ω6 C15:1ω4 C16:1 OМe C15:0 C15a C16:1ω9c C16:1ω7c C16:1ω5c C16:0 C16:1a C16:0a Ci17 Ca17 C17:1ω8 C17:1ω9 C17:0 C17cyc C17a C18:1ω9 C18:1ω7c C18:0 C18:1a C18:0a C19:0 C 18:0 10-oxo C 18:0 10-OH ∑CFA, % Su22Т A. sibiricum Z-7981Т 0.26 0 0.35 0 0.55 1.11 5.27 0.18 0 0 1.06 4.02 0 4.51 1.21 3.06 25.39 0.96 18.45 0.67 10.59 0 0 4.45 1.64 7.49 0 1.38 2.23 1.94 2.61 0.39 0.22 0 0 0 100 0 0.27 0.16 0.15 1.52 1.36 5.99 1.01 0.2 0.7 0.44 1.48 1.63 1.82 2.02 2.44 14.00 1.00 11.40 4.78 17.11 0.18 0.80 0.80 0 1.48 0.29 1.61 7.81 2.78 7.88 1.48 2.88 0.20 1.03 1.37 100 ДНК-ДНК гибридизация и нуклеотидный состав ДНК. Содержание Г+Ц пар в ДНК штамма Su22Т составило 46.1±0.5 мол %. Уровень сходства ДНК штамма Su22Т с A. sibiricum Z-7981Т составил 69%. 77 Сравнение фенотипических свойств штамма Su22Т и типового штамма вида A. sibiricum Z-7981Т (Таблица 15) показало, что их объединяет способность к ферментативному росту, использование триптона в качестве донора электронов и тиосульфата в качестве акцептора электронов, а также способность расти на разрушенной микробной биомассе. Оба штамма имеют схожие температурные диапазоны, но различные температурные оптимумы для роста. Они являются облигатными алкалофилами, оптимально растущими при рН 9.5 (Su22Т) и 9.1 (A. sibiricum). В отличие от сахаролитической бактерии A. sibiricum Z-7981Т, штамм Su22Т не сбраживал сахара, пептон, и не рос на отдельных аминокислотах или их парах. Кроме тиосульфата, он восстанавливал элементную серу в процессе роста на дрожжевом экстракте. Таблица 15. Дифференцирующие характеристики штаммов Su22Т и Z-7981Т Признак Размер, мкм ширина длина Подвижность Каталаза pН пределы оптимум Температура, °C диапазон оптимум NaCl, г/л пределы оптимум Доноры электронов: углеводы пируват глутамат цистеин хитин казеин Акцепторы электронов: S˚ Г+Ц, мол.% Авторы описания Таким образом, Su22Т A. sibiricum Z-7981Т 0.4-0.7 2.0-6.5 – – 0.5-0.7 3.8-5.0 + + 7.4-11.0 9.5 7.1-10.1 9.1 20-40 30 25-41 35 2-60 20 2-40 10-20 – – – – – + + + + + + н.д. + 46.1 Наши исследования – 48.4 Garnova et al., 2003 полученные фенотипические и генотипические характеристики новой бактерии убедительно свидетельствуют в пользу того, что 78 она является представителем нового вида рода Anoxynatronum, для которого предложено название ‘Anoxynatronum buryatense’ sp. nov. Протеолитические бактерии содовых озер играют важную роль в функционировании алкалофильных микробных сообществ, обеспечивая субстратами микроорганизмы, участвующие в цикле углерода и азота в этих экосистемах. Мы выделили и описали новую алкалофильную протеолитическую бактерию – спутника сульфатредуктора, выделенного из содового озера Сульфатное. 4.6. Восстановление Fe(III) сульфатвосстанавливающими бактериями в щелочных условиях Большинство железоредуцирующих бактерий являются нейтрофилами (Straub et al., 2001; Lovley et al., 2004; Заварзина и др., 2012). До недавнего времени восстановление аморфного и слабокристаллического оксида железа в содовых озерах считалось невозможным из-за низкой доступности Fe(III) при щелочной реакции среды (Ye et al. 2004). Однако, некоторые алкалофильные бактерии, выделенные из содовых озер, оказались способны восстанавливать как растворимые, так и плохо растворимые соединения железа (Zavarzina et al., 2006; Zhilina et al., 2009 a,b). Нами впервые выделены два штамма СВБ (штамм Кi5T и Su2), способные использовать аморфную гидроокись Fe(III) как акцептор электронов во время роста при рН 9.5-10.0. Восстановление аморфного гидроксида Fe(III) сопровождалось образованием 3.54 (Su2) и 3.12 (Кi5T) молей Fe(II) на 1 моль потребленного лактата в третьем пересеве. Как было показано для штамма Su2 (Рисунок 22), процесс восстановления железа сопровождался накоплением ацетата и увеличением численности клеток от единичных до 108 кл/мл. Таким образом, это первое описание алкалофильной железоредукции, осуществляемой сульфатвосстанавливающими бактериями. Экологическую роль этого феномена в содовых озерах следует исследовать более детально. Возможно, эта способность генетически закрепилась в исследуемых бактериях во времена доминирования цикла железа и позволила адаптироваться к окружающей среде без сульфата. Fe (II), мM Лактат, ацетат, мM 79 Время, ч Рисунок 22. Образование ионов двухвалентного железа и ацетата при окислении лактата штаммом Su2. (▲) – лактат; (●)– ацетат; (■) – Fe(II) 4.7. Новые виды анаэробных бактерий Диагноз Desulfovibrio algoritolerans sp. nov. Desulfovibrio algoritolerans [al.go.ri’to’le.rans. L. masc. n.algor -oris, cold, coldness; N.L. neut. adj. algoritolerance, L. pres. part. tolerans tolerating; N.L. part. adj. algoritolerans cold-tolerating). Клетки представляют собой грамотрицательные неспоровые подвижные одиночные вибрионы размером 0.5×2.0 мкм. Движение осуществляется за cчет двух монополярных очехленных жгутиков. Строгий анаэроб. Каталазо- отрицательная бактерия. Использует лактат, формиат, водород, этанол, фумарат, аланин и пируват в качестве доноров электронов в присутствии сульфата. Использует сульфат, сульфит, тиосульфат, элементную серу, Fe(III) цитрат и Fe(III) ЭДТА как акцептор электронов в присутствии лактата. Психротолерантная бактерия, растет в диапазоне температур от -2 до 36оС (оптимум 26оС). Нейтрофил, растет при рН 6.8-7.4 (оптимум 7.0-7.2). Умеренный галофил, растет в диапазоне NaCl от 5 до 40 г/л (оптимум 20 г/л). Облигатно зависит от ионов Na+. Содержание Г+Ц в ДНК 42.3 мол %. Типовой штамм K3ST (=ВКМ B-2877T= DSM 100341T) выделен из арктического криопэга (полуостров Ямал, Россия). Номер нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК в GenBank KJ739728. 80 Диагноз Desulfonatronum buryatense sp.nov. Desulfonatronum buryatense [bu.ry.at.en’se NL. neut. adj. buryatense, of or belonging to Buryatia region, referring to the region of isolation]. Клетки представляют собой грамотрицательные неспоровые подвижные вибрионы размером 0.5-0.7×2.0-2.5 мкм с одним полярным жгутиком. Клетки встречаются одиночно или образуют короткие спириллы. Размножаются бинарным делением. Строгий анаэроб. Каталазо-отрицательная бактерия. Использует лактат, формиат, этанол и пируват как донор электронов и источник углерода в присутствии сульфата. Использует сульфат, сульфит, тиосульфат, аморфную гидроокись Fe(III) и элементную серу как акцептор электронов в присутствии лактата. Способен к сбраживанию лактата в отсутствии сульфата. Мезофил, растет в диапазоне температур от 20 до 40 оС (оптимум 34оС). Облигатный алкалофил, растет при рН 7.5-10.5 (оптимум 9.4). Умеренный галофил, растет в диапазоне NaCl от 2 до 40 г/л (оптимум 5 г/л). Облигатно зависит от ионов Na+, зависимость от карбонатных ионов не обнаружена. Доминирующие жирные кислоты клеточных стенок (>10%) C14:0 и Ca15. Доминирующий изопреноидный хинон МК-6(Н2). Содержание Г+Ц в ДНК 48.8 мол.%. Типовой штамм Ki5T (= ВКМ В-2477T = DSM 26308T) выделен из донных осадков содового озера Соленое (Кяхтинский район, Бурятия, Россия). Номер нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК в GenBank КС417373. Диагноз Anoxynatronum buryatense sp.nov. [bu.ry.at.en’se NL. neut. adj. buryatense, of or belonging to Buryatia region, referring to the region of isolation]. Клетки представляют собой неподвижные палочки со слегка заострёнными концами размером 0.4-0.7×2.0-6.5мкм. Размножаются бинарным делением. Клеточная стенка грамположительного типа, содержащая S-слой. Каталазоотрицательная и оксидазо-положительная бактерия. Аэротолерантна, присутствие ≤ 4.5% O2 в газовой фазе не ингибирет рост. Осуществляет ферментативный метаболизм. В качестве источника углерода использует 81 дрожжевой экстракт, триптон, казеин и разрушенную микробную биомассу. Не сбраживает сахара, пептон, пируват, фумарат, лактат, формиат, глутамат, пропионат, хитин, цитрат, метанол, бутанол, индивидуальные аминокислоты или пары аминокислот. При росте на дрожжевом экстракте восстанавливает элементную серу и тиосульфат с образованием сульфида. Мезофил, растет в диапазоне температур 20-40оС (оптимум 30оС). Облигатный алкалофил, растет в диапазоне рН 7.4-11.0 (оптимум 9.6). Умеренный галофил, растет в диапазоне NaCl от 2 до 60 г/л (оптимум 20 г/л). Доминирующие жирные кислоты клеточных стенок (>10%) C16:1ω7c, C a16:0, C16:0. Содержание Г+Ц в ДНК 46.1 мол. %. Типовой штамм Su22Т (=ВКМ B-2510T = CECT 8731T) выделен из донных отложений содового озера Сульфатное (Селенгинский район, Бурятия, Россия). Номер нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК в GenBank EU315116. 82 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Сульфатвосстанавливающие бактерии являются важным звеном микробных сообществ современных осадков Мирового океана, а также наземных экосистем, характеризующихся Диссимиляционное высокими восстановление концентрациями сульфатов в процессах сульфатов. образования минералов широко известный биогеохимический процесс, в результате которого сера выводится из ее глобального круговорота. Нами впервые проведена оценка численности СВБ с помощью ПЦР-РВ в двух экстремальных экосистемах – в криопэгах полуострова Ямал и донных осадках содовых озер Соленое и Сульфатное (Южная Бурятия). Численность сульфатредукторов составила 7.9×104-2.4×106 копий гена dsrA/г в донных осадках содовых озер, и 2.7×102-6.9×103 копий гена dsrAВ/мл в криопэгах. Представители рода Desulfonatronum присутствовали во всех исследованных образцах донных отложений содовых озер и составили 6.5-75% от общей численности СВБ. Донные осадки содовых озер Соленое и Сульфатное стали источником выделения трех штаммов галоалкалофильных сульфатредукторов. Применение методов полифазной таксономии убедительно показало, что один из выделенных штаммов (Ki5T) представляет новый вид Desulfonatronum buryatense sp. nov. и является первой СВБ, способной к восстановлению Fe(III) в щелочных условиях. Новое свойство для представителей алкалофильных сульфатредукторов – способность использовать трехвалентное железо в качестве акцептора электронов – экспериментально подтверждено и для нового представителя вида D. lacustre штамма Su2. Новая протеолитическая бактерия ‘Anoxynatronum buryatense’ Su22T характеризуется способностью к росту на клетках сульфатредуктора, выделенного из этого же места обитания, что определяет экофизиологическую роль нового вида как поставщика аминокислот, ацетата и формиата в трофическую цепь алкалофильных микробных сообществ содовых озер. 83 Из арктического криопэга выделен новый психротолерантный галофильный сульфатредуктор, являющийся представителем нового вида ‘Desulfovibrio algoritolerans’ sp. nov. и характеризующийся способностью восстанавливать Fe(III) и ростом при отрицательных температурах. Новый изолят из криопэга может представлять интерес как источник холодоактивных ферментов, используемых в производстве бытовых моющих средств, в очистке сточных вод, в пищевой промышленности и в молекулярной биологии, а также как компонент искусственно создаваемых сообществ, способных к биодеградации загрязняющих природу веществ в холодном климате. Галоалкалофильные штаммы D. buryatense Ki5T и ‘A. buryatense’ Su22T также могут найти применение в биоремедиации окружающей среды и удалении соединений серы из сточных вод, характеризующихся высокими значениями рН. Наличие S-слоя у штамма Su22T открывает перспективы его исследования и определения возможности применения в бионанотехнологии: в нанолитографии, а также для создания ультрафильтрующих мембран. Таким образом, сочетание микробиологических и молекулярно- биологических методов позволило не только количественно оценить СВБ в исследованных эконишах, но и расширить знание о видовом разнообразии и метаболическом потенциале СВБ содовых озер и криопэгов. Выделены новые представители родов Desulfonatronum, Desulfovibrio и Anoxynatronum обладающие уникальными свойствами. Дальнейшее изучение этих свойств, расшифровка геномов новых бактерий и их анализ позволят оценить общие для прокариот и специфические для этих бактерий механизмы адаптации к соответствующим условиям среды. 84 ВЫВОДЫ: 1. Впервые проведена оценка численности сульфатвосстанавливающих бактерий в донных осадках cодовых озер Соленое и Сульфатное (Южная Бурятия) и криопэгах полуострова Ямал методом ПЦР “в реальном времени”. Численность СВБ в донных осадках содовых озер составила 10 4-106 копий гена dsrA/г, в криопэгах – 102-103 копий гена dsrAВ/мл. 2. Применение разработанных праймеров на ген 16S рРНК рода Desulfonatronum позволило оценить распространение и численность СВБ этого рода в природных образцах содовых озер, составившую 6.5-75% от общего числа СВБ. 3. Психротолерантный галофильный сульфатредуктор, выделенный из арктического криопэга, является представителем нового вида ‘Desulfovibrio algoritolerans’ sp. nov. (К3ST= ВКМ В-2877T= DSM 100341T) и характеризуется способностью восстанавливать Fe(III) и расти при отрицательных температурах. 4. Из донных осадков содовых озер выделены и охарактеризованы 4 новых штамма галоалкалофильных анаэробов, относящихся к родам Desulfonatronum (штаммы Ki4, Ki5T и Su2) и Anoxynatronum (Su22T). Штамм Ki5T (=ВКМ В2477T=DSM 26308T) является представителем нового вида Desulfonatronum buryatense sp. nov. Протеолитическая бактерия штамм Su22T представляет собой новый вид ‘Anoxynatronum buryatense’ sp. nov. (=ВКМ В-2510T=CECT 8731T). 5. Впервые обнаружена способность использовать Fe(III) в качестве акцептора электронов в условиях высокой щелочности представителями алкалофильных сульфатредукторов. среды (рН 9.5-10.0) 85 Список сокращений ДМСО – диметилсульфоксид ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ОМ – общая минерализация МПР – метод предельных разведений МПС – метод прямого счета ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция “в реальном времени” РНК – рибонуклеиновая кислота мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота н.о. – нуклеотидный остаток рРНК – рибосомная рибонуклеиновая кислота СВБ – сульфатвосстанавливающие бактерии ЦТАБ – цетилтриметиламмонийбромид ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота Dsr – бисульфитредуктазa АМР – аденозинмонофосфат Apr – аденозин-5’-фосфосульфатредуктаза APS – аденозин-5’-фосфосульфат ATP – аденозинтрифосфат CARD-FISH – катализируемое осаждение метки с флуоресцентной гибридизацией in situ FISH – флуоресцентная гибридизация in situ MAR-FISH – микроавторадиография c флуоресцентной гибридизацией in situ MIMS – мультиизотопная визуализирующая масс-спектрометрия OD – оптическая плотность Raman-FISH – Раман микроспекторскопия с флуоресцентной гибридизацией in situ SDS – додецилсульфат натрия SIP (stable isotope probing) – мечение стабильными изотопами 86 Список литературы 1. Бонч-Осмоловская Е.А., Заварзин Г.А., Герасименко Л.М., Венецкая С.Л. Исследование терминальных процессов анаэробной деструкции нагонных масс кладофоры в озере Сиваш // Микробиология. -1988. -Т.57. -№ 2. -С.312-319. 2. Герасименко Л.М., Заварзин Г.А. Реликтовые цианобактериальные сообщества / Проблемы доантропогенной эволюции биосферы. -1993. -М.: Наука. -C.222-254. 3. Герасименко Л.М., Дубинин А.В., Заварзин Г.А. Алкалофильные цианобактерии содовых озер Тувы и их экофизиология // Микробиология. 1996. -Т.65. -№ 6. -С.844-849. 4. Гиличинский Д. А., Хлебникова Г.М., Звягинцев Д. Г., ФедоровДавыдов Д.Г., Кудрявцева Н.Н. Микробиологические характеристики при изучении осадочных пород криолитозоны / Известия АН СССР. Cерия геологическая. -1989. -Т.6. -C.103-115. 5. Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Курылова А.В., Заварзина Д.Г., Жилина Т.Н. Активность сульфатредуцирующих бактерий в донных осадках содовых озер Юго-Восточного Забайкалья // Микробиология. -1999. -Т.68. -№ 5. -С.664-670. 6. Горленко В.М. Аноксигенные фототрофные бактерии содовых озер / Труды Института микробиологии им СН Виноградского. -2007. -М.: Наука. -C.225257. 7. Дзюба А.А., Тулохонов А.К., Абидуева Т.И., Гребнева П.И. Распространение и химизм соленых озер Прибайкалья и Забайкалья // География и природные ресурсы. -1997. -№ 4. -С.65-71. 8. Дубинин А.В., Герасименко Л.М., Заварзин Г.А. Экофизиология и видовое разнообразие цианобактерий содового Микробиология. -1995. -Т.64. -№ 6. -С.845-849. озера Магади // 87 9. Жилина Т.Н. Хемотрофные анаэробы микробных сообществ содовых озер / Труды Института микробиологии им СН Виноградского. -2007. -М.: Наука. C.158-255. 10. Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П. Halonatronum saccharophilum gen.nov., sp.nov. новая галоалкалофильная бактерия порядка Haloanaerobiales из озера Магади // Микробиология. -2001а. -Т.70. -№ 1. -С.77-85. 11. Жилина Т.Н., Гарнова Е.С., Турова Т.П. Amphibacillus fermentum sp.nov., Amphibacillus tropicus sp.nov. новые алкалофильные и факультативно анаэробные сахаролитические бациллы из озера Магади // Микробиология. 2001б. -Т.70. -№ 6. -С.825-837. 12. Жилина Т.Н., Кевбрин В.В., Турова Т.П., Лысенко А.М., Кострикина Н.А., Заварзин Г.А. Clostridium алкалофильный целлюлозолитик из alkalicellum sp. содового озера nov.- облигатно Прибайкалья // Микробиология. -2005a. -Т.74. -№ 5. -С.642-653. 13. Жилина Т.Н., Заварзина Д.Г., Колганова Т.В., Турова Т.П., Заварзин Г.А. “Candidatus Contubernalis alkalaceticum” - облигатно синтрофная алкалофильная бактерия, анаэробно окисляющая ацетат в бинарной культуре с Desulfonatronum cooperativum // Микробиология. -2005б. -Т.74. № 6. -С.800-809. 14. Жилина Т.Н., Заварзина Д.Г., Колганова Т.В., Лысенко А.М., Турова Т.П. Alkaliphilus peptidofermentans sp. nov новая алкалофильная бактерия из содового озера, сбраживающая пептиды и восстанавливающая Fe (III) // Микробиология. -2009a. -Т.78. -№ 4. -С.496-505. 15. Жилина Т.Н., Заварзина Д.Г., Осипов Г.А., Кострикина Н.А., Турова Т.П. Natronincola ferrireducens sp. nov. и Natronincola peptidovorans sp. nov. новые анаэробные алкалофильные пептолитические и железоредуцирующие бактерии из содовых озер // Микробиология. -2009б. -Т.78. -№ 4. -С.506-518. 16. Жилина Т.Н., Заварзина Д.Г. Ацетатная метабиотическая система в анаэробном микробном сообществе содовых озер / Проблемы эволюции 88 биосферы. Серия “Геобиологические процессы в прошлом”. -2013а. -М.: ПИН РАН. -C.119-143. 17. Жилина Т.Н., Заварзина Д.Г., Кевбрин В.В., Колганова Т.В. Описание Methanocalculus natronophilus sp. nov., алкалофильной гидрогенотрофной метанобразующей археи из содового озера, и создание нового семейства Methanocalculaceae // Микробиология. -2013б. -Т.82. -№ 6. -С.681-690. 18. Заварзин Г.А. Эпиконтинентальные содовые водоемы как предполагаемые реликтовые биотопы формирования наземной биоты // Микробиология. 1993. -Т.62. -№ 5. -С.789-800. 19. Заварзин Г.А. Образование содовых условий как глобальный процесс / Труды Института микробиологии им СН Виноградского. -2007а. -М.: Наука. -C.8-57. 20. Заварзин Г.А. Алкалофильные микробные сообщества / Труды Института микробиологии им СН Виноградского. -2007б. -М.: Наука. -C.58-87. 21. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Пикута Е.В. Вторичные анаэробы в галоалкалофильных сообществах озер Тувы // Микробиология. -1996. -Т.65. -№ 4. -С.546-553. 22. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие // Микробиология. -1999. Т.68. -№ 3. -С.579-599. 23. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н. Содовые озера - природная модель древней биосферы континентов // Природа. -2000. -№ 2. -С.45-55. 24. Заварзина Д.Г., Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Кострикина Н.А., Турова Т.П., Заварзин Г.А. Geoalkalibacter ferrihydriticus gen. nov., sp. nov., первый алколафильный представитель семейства Geobacteraceae, выделенный из содового озера // Микробиология. -2006. -Т.75. -№ 6. -С.775785. 25. Заварзина Д.Г., Жилина Т.Н. Анаэробные сообщества содовых озер как аналоги палеоконтинентальной микробиоты докембрия / Ранняя 89 колонизация суши. Серия “Геобиологические процессы в прошлом”. -2012. М.: ПИН РАН. -C.69-91. 26. Заварзина Д.Г. Железоредукторы содовых озер - реликты “железного века”? // Природа. -2013. -№ 9. -С.59-67. 27. Захарюк А.Г. Распространение и активность алкалофильных сульфат- и железоредуцирующих бактерий в содовых озерах Забайкалья: автореф. дис. канд. биолог. наук: 03.00.07. -Улан-Удэ, 2010. -22 c. 28. Исаченко Б.Л. Хлоридные, сульфатные и содовые озера Кулундинской степи и биогенетические процессы в них / Избранные Труды. -1951. -Т.2. M.: -C.143-162. 29. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Лысенко А.М., Троценко Ю.А. Новые метанотрофные изоляты из щелочных озёр Южного Забайкалья // Микробиология. -1999. -Т.68. -№ 5. -С.677-685. 30. Кевбрин В.В., Заварзин Г.А. Влияние соединений серы на рост галофильной гомоацетатной бактерии Acetohalobium arabaticum // Микробиология. -1992. -Т.61. -№ 5. -С.812-817. 31. Кевбрин В.В., Лысенко А.М., Жилина Т.Н. Физиология алкалофильного метаногена Z-7936, нового штамма Methanosalsus zhilinaeae, выделенного из озера Магади // Микробиология. -1997. -Т.66. -№ 3. -С.315-320. 32. Кевбрин В.В., Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Разложение целлюлозы алкалофильным анаэробным сообществом // Микробиология. -1999. -Т.68. № 5. -С.686-695. 33. Колмакова О.В. Современные методы определения видоспецифичных биогеохимических функций бактериопланктона / Журнал Сибирского федерального университета. Биология. -2013. -Т.6. -C.73-95. 34. Колосов Р.В., Захарюк А.Г., Козырева Л.П., Бурюхаев С.П. Распространение сульфатредуцирующих бактерий в содово-соленых озерах Забайкалья // Вестник Бурятского университета. -2010. -Т.4., -С.96-98. 35. Компанцева Е.И., Комова А.В., Краузова В.И., Колганова Т.В., Пантелеева А.Н. Несерные пурпурные бактерии в слабо- и 90 среднеминерализованных содовых озерах южного забайкалья и северовосточной монголии. // Микробиология.- 2009. -T. 78, № 2. -C.281-288. 36. Намсараев Б.Б., Намсараев З.Б. Микробные процессы круговорота углерода и условия среды обитания в щелочных озерах Забайкалья и Монголии / Труды Института микробиологии им СН Виноградского. -2007. -М.: Наука. -C.299-322. 37. Печерицына С. А., Щербакова В.А., Холодов А.Л., Акимов В.Н., Абашина Т.Н., Сузина Н.Е., Е.М. Р. Микробиологический анализ криопэгов Варандейского полуострова на побережье Баренцева моря // Микробиология. -2007. -Т.76. -№ 5. -С.694-701. 38. Пикута Е.В., Лысенко Desulfonatronovibrio А.М., hydrogenovorans Жилина в Т.Н. содовых Распространение озерах Тувы // Микробиология. -1997. -Т.66. -№ 2. -С.262-268. 39. Пикута Е.В., Жилина Т.Н., Заварзин Г.А., Кострикина Н.А., Осипов Г.А., Рейни Ф.А. Desulfonatronum lacustre gen. nov., sp. nov. - новая алкалофильная сульфатвосстанавливающая бактерия, использующая этанол // Микробиология. -1998. -Т.67. -№ 1. -С.123-131. 40. Разумов А.С. Микробиальный планктон воды / Труды Всесоюзн гидробиологического общества. -1962. -Т.12. -М.: АН СССР. -C.60-188. 41. Рыжманова Я.В., Вайнштейн М.Б., Щербакова В.А. Анаэробные бактерии содовых озер Южного Забайкалья // Вестник уральской медицинской академической науки. -2011 г. -№ 4/1(38). -С. 86. 42. Скляров Е.В., Склярова О.А., Меньшагин Ю.В., Данилова М.А. Минерализованные озера Забайкалья и Северо-Восточной Монголии: особенности распространения и рудогенерирующий потенциал // География и природные ресурсы. -2011. -№ 4. -С.29-39. 43. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Особенности биологии галоалкалофильных метанотрофов // Микробиология. -2002. -Т.71. -№ 2. С.149-159. 91 44. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Экстремофильные метанотрофы /Ред. Гальченко В.Ф. -ОНТИ ПНЦ РАН, -Пущино. -2008. -205 с. 45. Adamczyk J., Hesselsoe M., Iversen N., Horn M., Lehner A., Nielsen P.H., Schloter M., Roslev P., Wagner M. The isotope array, a new tool that employs substrate-mediated labeling of rRNA for determination of microbial community structure and function // Applied and environmental microbiology. -2003. -V.69. № 11. -p.6875-6887. 46. Alazard D., Badillo C., Fardeau M.-L., Cayol J.-L., Thomas P., Roldan T., Tholozan J.-L., Ollivier B. Tindallia texcoconensis sp. nov., a new haloalkaliphilic bacterium isolated from lake Texcoco, Mexico // Extremophiles. 2007. -V.11. -№ 1. -p.33-39. 47. Alazard D., Joseph M., Battaglia-Brunet F., Cayol J.-L., Ollivier B. Desulfosporosinus acidiphilus sp. nov.: a moderately acidophilic sulfate-reducing bacterium isolated from acid mining drainage sediments // Extremophiles. -2010. -V.14. -№ 3. -p.305-312. 48. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiological reviews. -1995. -V.59. -№ 1. -p.143-169. 49. Baena S., Perdomo N., Carvajal C., Díaz C., Patel B.K. Desulfosoma caldarium gen. nov., sp. nov., a thermophilic sulfate-reducing bacterium from a terrestrial hot spring // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2011. -V.61. -№ 4. -p.732-736. 50. Ballot A., Kotut K., Novelo E., Krienitz L. Changes of phytoplankton communities in Lakes Naivasha and Oloidien, examples of degradation and salinization of lakes in the Kenyan Rift Valley // Hydrobiologia. -2009. -V.632. № 1. -p.359-363. 51. Barton L.L., Fauque G.D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria // Advances in applied microbiology. -2009. -V.68. p.41-98. 92 52. Behrens S., Lösekann T., Pett-Ridge J., Weber P.K., Ng W.-O., Stevenson B.S., Hutcheon I.D., Relman D.A., Spormann A.M. Linking microbial phylogeny to metabolic activity at the single-cell level by using enhanced element labeling-catalyzed reporter deposition fluorescence in situ hybridization (ELFISH) and NanoSIMS // Applied and environmental microbiology. -2008. -V.74. -№ 10. -p.3143-3150. 53. Ben-Dov E., Brenner A., Kushmaro A. Quantification of sulfate-reducing bacteria in industrial wastewater, by real-time polymerase chain reaction (PCR) using dsrA and apsA genes // Microbial ecology. -2007. -V.54. -№ 3. -p.439-451. 54. Beyerinck W. Ueber Spirillum desulfuricans als ursache von sulfatreduction // Centralbl Bakt II Abt. -1895. -p.1-9, 49-59, 104-114. 55. Blazejak A., Schippers A. Real-time PCR quantification and diversity analysis of the functional genes aprA and dsrA of sulfate-reducing prokaryotes in marine sediments of the Peru continental margin and the Black Sea // Frontiers in microbiology. -2011. -V.2. -article 253. 56. Blum J.S., Bindi A.B., Buzzelli J., Stolz J.F., Oremland R.S. Bacillus arsenicoselenatis, sp nov, and Bacillus selenitireducens, sp nov: two haloalkaliphiles from Mono Lake, California that respire oxyanions of selenium and arsenic // Archives of Microbiology. -1998. -V.171. -№ 1. -p.19-30. 57. Boetius A., Ravenschlag K., Schubert C.J., Rickert D., Widdel F., Gieseke A., Amann R., Jørgensen B.B., Witte U., Pfannkuche O. A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane // Nature. -2000. -V.407. -№ 6804. -p.623-626. 58. Boone D.R., Bryant M.P. Propionate-degrading bacterium, Syntrophobacter wolinii sp. nov. gen. nov., from methanogenic ecosystems // Applied and environmental microbiology. -1980. -V.40. -№ 3. -p.626-632. 59. Brandis-Heep A., Gebhardt N.A., Thauer R.K., Widdel F., Pfennig N. Anaerobic acetate oxidation to CO2 by Desulfobacter postgatei // Archives of Microbiology. -1983. -V.136. -№ 3. -p.222-229. 93 60. Bryantseva I., Gorlenko V.M., Kompantseva E.I., Imhoff J.F., Süling J., Mityushina L. Thiorhodospira sibirica gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic purple sulfur bacterium from a Siberian soda lake // International journal of systematic bacteriology. -1999. -V.49. -№ 2. -p.697-703. 61. Castro H.F., Williams N.H., Ogram A. Phylogeny of sulfate-reducing bacteria // FEMS Microbiology Ecology. -2000. -V.31. -№ 1. -p.1-9. 62. Cavicchioli R., Charlton T., Ertan H., Omar S.M., Siddiqui K., Williams T. Biotechnological uses of enzymes from psychrophiles // Microbial biotechnology. -2011. -V.4. -№ 4. -p.449-460. 63. Cline J.D. Spectrophotometric determination of hydrogen sulfide in natural waters // Limnology and Oceanography. -1969. -V.14. -№ 3. -p.454-458. 64. Coleman M.L., Hedrick D.B., Lovley D.R., White D.C., Pye K. Reduction of Fe(III) in sediments by sulphate-reducing bacteria // Nature. -1993. -V.361. -№ 6411. -p.436-438. 65. Cypionka H. Oxygen Respiration by Desulfovibrio Species // Annual Reviews in Microbiology. -2000. -V.54. -№ 1. -p.827-848. 66. Dadheech P.K., Glöckner G., Casper P., Kotut K., Mazzoni C.J., Mbedi S., Krienitz L. Cyanobacterial diversity in the hot spring, pelagic and benthic habitats of a tropical soda lake // FEMS Microbiology Ecology. -2013. -V.85. -№ 2. -p.389-401. 67. Daly K., Sharp R.J., McCarthy A.J. Development of oligonucleotide probes and PCR primers for detecting phylogenetic subgroups of sulfate-reducing bacteria // Microbiology. -2000. -V.146. -№ 7. -p.1693-1705. 68. Dannenberg S., Kroder M., Dilling W., Cypionka H. Oxidation of H2, organic compounds and inorganic sulfur compounds coupled to reduction of O 2 or nitrate by sulfate-reducing bacteria // Archives of Microbiology. -1992. -V.158. -№ 2. p.93-99. 69. Dar S.A., Kuenen J.G., Muyzer G. Nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis approach to determine the diversity of sulfate-reducing bacteria in 94 complex microbial communities // Applied and environmental microbiology. 2005. -V.71. -№ 5. -p.2325-2330. 70. Dar S.A., Yao L., van Dongen U., Kuenen J.G., Muyzer G. Analysis of diversity and activity of sulfate-reducing bacterial communities in sulfidogenic bioreactors using 16S rRNA and dsrB genes as molecular markers // Applied and environmental microbiology. -2007. -V.73. -№ 2. -p.594-604. 71. Deming J.W. Psychrophiles and polar regions // Current opinion in microbiology. -2002. -V.5.-№ 3. -p.301-309. 72. Deplancke B., Hristova K., Oakley H., McCracken V., Aminov R., Mackie R., Gaskins H. Molecular ecological analysis of the succession and diversity of sulfate-reducing bacteria in the mouse gastrointestinal tract // Applied and environmental microbiology. -2000. -V.66. -№ 5. -p.2166-2174. 73. Devereux R., Delaney M., Widdel F., Stahl D. Natural relationships among sulfate-reducing eubacteria // Journal of Bacteriology. -1989. -V.171. -№ 12. p.6689-6695. 74. Devereux R., Kane M.D., Winfrey J., Stahl D.A. Genus-and group-specific hybridization probes for determinative and environmental studies of sulfatereducing bacteria // Systematic and applied microbiology. -1992. -V.15. -№ 4. p.601-609. 75. Dilling W., Cypionka H. Aerobic respiration in sulfate-reducing bacteria // FEMS Microbiology Letters. -1990. -V.71. -№ 1. -p.123-127. 76. Duckworth A.W., Grant W.D., Jones B.E., Steenbergen R. Phylogenetic diversity of soda lake alkaliphiles // FEMS Microbiology Ecology. -1996. -V.19. № 3. -p.181-191. 77. Elferink S.J.O., Akkermans-van Vliet W., Bogte J.J., Stams A.J. Desulfobacca acetoxidans gen. nov., sp. nov., a novel acetate-degrading sulfate reducer isolated from sulfidogenic granular sludge // International journal of systematic bacteriology. -1999. -V.49. -№ 2. -p.345-350. 78. Fauque G., LeGall J., Barton L. Sulfate-reducing and sulfur-reducing bacteria / Variations in autotrophic life. -New York: Academic Press, -1991. - p.271-337. 95 79. Fauque G. Ecology of sulfate-reducing bacteria / Sulfate-Reducing Bacteria. Springer, -1995. -p.217-241. 80. Fauque G., Ollivier B. Anaerobes: the sulfate-reducing Bacteria as an example of metаbolic diversity // Microbial Diversity and Bioprospecting. -2004. -V.17. p.169-176. 81. Fossing H., Jørgensen B.B. Measurement of bacterial sulfate reduction in sediments: evaluation of a single-step chromium reduction method // Biogeochemistry. -1989. -V.8. -№ 3. -p.205-222. 82. Foti M., Sorokin D.Y., Lomans B., Mussman M., Zacharova E.E., Pimenov N.V., Kuenen J.G., Muyzer G. Diversity, activity, and abundance of sulfatereducing bacteria in saline and hypersaline soda lakes // Applied and environmental microbiology. -2007. -V.73. -№ 7. -p.2093-2100. 83. Foti M.J., Sorokin D.Y., Zacharova E.E., Pimenov N.V., Kuenen J.G., Muyzer G. Bacterial diversity and activity along a salinity gradient in soda lakes of the Kulunda Steppe (Altai, Russia) // Extremophiles. -2008. -V.12. -№ 1. p.133-145. 84. Freeman W.M., Walker S.J., Vrana K.E. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential // Biotechniques. -1999. -V.26. -p.112-125. 85. Garnova E.S., Zhilina T.N., Tourova T.P., Lysenko A.M. Anoxynatronum sibiricum gen. nov., sp. nov. alkaliphilic saccharolytic anaerobe from cellulolytic community of Nizhnee Beloe (Transbaikal region) // Extremophiles. -2003. -V.7. -№ 3. -p.213-220. 86. Geets J., Borremans B., Diels L., Springael D., Vangronsveld J., van der Lelie D., Vanbroekhoven K. DsrB gene-based DGGE for community and diversity surveys of sulfate-reducing bacteria // Journal of microbiological methods. -2006. -V.66. -№ 2. -p.194-205. 87. Gilichinsky D., Rivkina E., Shcherbakova V., Laurinavichuis K., Tiedje J. Supercooled water brines within permafrost-an unknown ecological niche for microorganisms: a model for astrobiology // Astrobiology. -2003. -V.3. -№ 2. p.331-341. 96 88. Gilichinsky D., Rivkina E., Bakermans C., Shcherbakova V., Petrovskaya L., Ozerskaya S., Ivanushkina N., Kochkina G., Laurinavichuis K., Pecheritsina S. Biodiversity of cryopegs in permafrost // FEMS Microbiology Ecology. -2005. -V.53. -№ 1. -p.117-128. 89. Glud R.N., Holby O., Hoffman F., Canfield D. Benthic mineralisation and exchange in Arctic sediments (Svalbard, Norway) // Marine Ecology Progress Series. -1998. -V.173. -p.237-251. 90. Gorlenko V., Tsapin A., Namsaraev Z., Teal T., Tourova T., Engler D., Mielke R., Nealson K. Anaerobranca californiensis sp. nov., an anaerobic, alkalithermophilic, fermentative bacterium isolated from a hot spring on Mono Lake // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2004. -V.54. -№ 3. -p.739-743. 91. Grant W., Jones B. Alkaline environments / Encyclopedia of microbiology. 2th edn. In: Lederberg J. (ed).V.1. -New York: Academic Press, -2000. - p.126-133. 92. Harmsen H.M., Wullings B., Akkermans A.L., Ludwig W., Stams A.M. Phylogenetic analysis of Syntrophobacter wolinii reveals a relationship with sulfate-reducing bacteria // Archives of Microbiology. -1993. -V.160. -№ 3. p.238-240. 93. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome research. -1996. -V.6. -№ 10. -p.986-994. 94. Hines M.E., Evans R.S., Genthner B.R.S., Willis S.G., Friedman S., RooneyVarga J.N., Devereux R. Molecular phylogenetic and biogeochemical studies of sulfate-reducing bacteria in the rhizosphere of Spartina alterniflora // Applied and environmental microbiology. -1999. -V.65. -№ 5. -p.2209-2216. 95. Höfle M., Kirchman D.L., Christen R., Brettar I. Molecular diversity of bacterioplankton: link to a predictive biogeochemistry of pelagic ecosystem // Aquatic Microbial Ecology. -2008. -V.53. -№ 1. -p.39. 96. Horikoshi K. Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology // Microbiology and Molecular Biology Reviews. -1999. -V.63. -№ 4. -p.735-750. 97 97. Ito T., Nielsen J.L., Okabe S., Watanabe Y., Nielsen P.H. Phylogenetic identification and substrate uptake patterns of sulfate-reducing bacteria inhabiting an oxic-anoxic sewer biofilm determined by combining microautoradiography and fluorescent in situ hybridization // Applied and environmental microbiology. 2002. -V.68. -№ 1. -p.356-364. 98. Itoh T., Suzuki K.-i., Nakase T. Thermocladium modestius gen. nov., sp. nov., a new genus of rod-shaped, extremely thermophilic crenarchaeote // International journal of systematic bacteriology. -1998. -V.48. -№ 3. -p.879-887. 99. Itoh T., Suzuki K.-i., Sanchez P.C., Nakase T. Caldivirga maquilingensis gen. nov., sp. nov., a new genus of rod-shaped crenarchaeote isolated from a hot spring in the Philippines // International journal of systematic bacteriology. -1999. -V.49. -№ 3. -p.1157-1163. 100. Janssen A.J., Lens P.N., Stams A.J., Plugge C.M., Sorokin D.Y., Muyzer G., Dijkman H., Van Zessen E., Luimes P., Buisman C.J. Application of bacteria involved in the biological sulfur cycle for paper mill effluent purification // Science of the total environment. -2009. -V.407. -№ 4. -p.1333-1343. 101. Jeanthon C., L'Haridon S., Cueff V., Banta A., Reysenbach A.-L., Prieur D. Thermodesulfobacterium hydrogeniphilum sp. nov., a thermophilic, chemolithoautotrophic, sulfate-reducing bacterium isolated from a deep-sea hydrothermal vent at Guaymas Basin, and emendation of the genus Thermodesulfobacterium // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2002. -V.52. -№ 3. -p.765-772. 102. Jones B.E., Grant W.D., Duckworth A., Schumann P., Weiss N., Stackebrandt E. Cellulomonas bogoriensis sp. nov., an alkaliphilic cellulomonad // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2005. V.55. -№ 4. -p.1711-1714. 103. Kalendar R., Lee D., Schulman A.H. FastPCR software for PCR, in silico PCR, and oligonucleotide assembly and analysis / DNA Cloning and Assembly Methods. Methods in Molecular Biology. In: Valla S. and Lale R. (eds.). Humana Press, -2014. -V.1116. -p.271-302. 98 104. Karr E.A., Sattley W.M., Rice M.R., Jung D.O., Madigan M.T., Achenbach L.A. Diversity and distribution of sulfate-reducing bacteria in permanently frozen Lake Fryxell, McMurdo Dry Valleys, Antarctica // Applied and environmental microbiology. -2005. -V.71. -№ 10. -p.6353-6359. 105. Kevbrin V.V., Zhilina T.N., Rainey F.A., Zavarzin G.A. Tindallia magadii gen. nov., sp. nov.: an alkaliphilic anaerobic ammonifier from soda lake deposits // Current Microbiology. -1998. -V.37. -№ 2. -p.94-100. 106. Kevbrin V., Boltyanskaya Y., Garnova E., Wiegel J. Anaerobranca zavarzinii sp. nov., an anaerobic, alkalithermophilic bacterium isolated from Kamchatka thermal fields // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2008. -V.58. -№ 6. -p.1486-1491. 107. Kevbrin V., Boltyanskaya Y., Zhilina T., Kolganova T., Lavrentjeva E., Kuznetsov B. Proteinivorax tanatarense gen. nov., sp. nov., an anaerobic, haloalkaliphilic, proteolytic bacterium isolated from a decaying algal bloom, and proposal of Proteinivoraceae fam. nov // Extremophiles. -2013. -V.17. -№ 5. p.747-756. 108. Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations // Trends in molecular medicine. -2002. -V.8. -№ 6. -p.257-260. 109. Klemps R., Cypionka H., Widdel F., Pfennig N. Growth with hydrogen, and further physiological characteristics of Desulfotomaculum species // Archives of Microbiology. -1985. -V.143. -№ 2. -p.203-208. 110. Kniemeyer O., Musat F., Sievert S.M., Knittel K., Wilkes H., Blumenberg M., Michaelis W., Classen A., Bolm C., Joye S.B. Anaerobic oxidation of shortchain hydrocarbons by marine sulphate-reducing bacteria // Nature. -2007. V.449. -№ 7164. -p.898-901. 111. Knittel K., Boetius A., Lemke A., Eilers H., Lochte K., Pfannkuche O., Linke P., Amann R. Activity, distribution, and diversity of sulfate reducers and other bacteria in sediments above gas hydrate (Cascadia Margin, Oregon) // Geomicrobiology Journal. -2003. -V.20. -№ 4. -p.269-294. 99 112. Knoblauch C., Jørgensen B.B., Harder J. Community size and metabolic rates of psychrophilic sulfate-reducing bacteria in Arctic marine sediments // Applied and environmental microbiology. -1999а. -V.65. -№ 9. -p.4230-4233. 113. Knoblauch C., Sahm K., Jørgensen B.B. Psychrophilic sulfate-reducing bacteria isolated from permanently cold Arctic marine sediments: description of Desulfofrigus oceanense gen. nov., sp. nov., Desulfofrigus fragile sp. nov., Desulfofaba gelida gen. nov., sp. nov., Desulfotalea psychrophila gen. nov., sp. nov. and Desulfotalea arctica sp. nov // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -1999b. -V.49. -№ 4. -p.1631-1643. 114. Könneke M., Kuever J., Galushko A., Jørgensen B.B. Desulfoconvexum algidum gen. nov., sp. nov., a psychrophilic sulfate-reducing bacterium isolated from a permanently cold marine sediment // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2013. -V.63. -№ 3. -p.959-964. 115. Krienitz L., Bock C., Kotut K., Luo W. Picocystis salinarum (Chlorophyta) in saline lakes and hot springs of East Africa // Phycologia. -2012. -V.51. -№ 1. p.22-32. 116. Krienitz L., Dadheech P.K., Kotut K. Mass developments of the cyanobacteria Anabaenopsis and Cyanospira (Nostocales) in the soda lakes of Kenya: ecological and systematic implications // Hydrobiologia. -2013. -V.703. -№ 1. -p.79-93. 117. Kuhnigk T., Branke J., Krekeler D., Cypionka H., König H. A feasible role of sulfate-reducing bacteria in the termite gut // Systematic and applied microbiology. -1996. -V.19. -№ 2. -p.139-149. 118. Lane D. 16S/23S rRNA sequencing / Nucleic acid techniques in bacterial systematics. In: Stackebrandt E., Goodfellow M. (eds). -New York: John Wiley and Sons, -1991. - p.125-175. 119. Langendijk P., Kulik E., Sandmeier H., Meyer J., Van der Hoeven J. Isolation of Desulfomicrobium orale sp. nov. and Desulfovibrio strain NY682, oral sulfate-reducing bacteria involved in human periodontal disease // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2001. -V.51. № 3. -p.1035-1044. 100 120. Larkin M.A., Blackshields G., Brown N., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R. Clustal W and Clustal X version 2.0 // Bioinformatics. -2007. -V.23. -№ 21. -p.2947-2948. 121. Lechene C., Hillion F., McMahon G., Benson D., Kleinfeld A., Kampf J., Distel D., Luyten Y., Bonventre J., Hentschel D., Park K., Ito S., Schwartz M., Benichou G., Slodzian G. High-resolution quantitative imaging of mammalian and bacterial cells using stable isotope mass spectrometry // Journal of Biology. -2006. -V.5. -№ 6. -p.7-20. 122. Loubinoux J., Bronowicki J.-P., Pereira I.A., Mougenel J.-L., Le Faou A.E. Sulfate-reducing bacteria in human feces and their association with inflammatory bowel diseases // FEMS Microbiology Ecology. -2002. -V.40. -№ 2. -p.107-112. 123. Lovley D.R., Phillips E.J.P. Organic matter mineralization with reduction of ferric iron in anaerobic sediments // Applied and Environmental Microbiology. 1986. -V.51. -№ 4. -p.683-689. 124. Lovley D.R., Roden E.E., Phillips E.J.P., Woodward J.C. Enzymatic iron and uranium reduction by sulfate-reducing bacteria // Marine Geology. -1993. -V.113. -№ 1. -p.41-53. 125. Lovley D.R., Phillips E.J. Reduction of chromate by Desulfovibrio vulgaris and its c3 cytochrome // Applied and environmental microbiology. -1994. -V.60. -№ 2. -p.726-728. 126. Lovley D.R., Holmes D.E., Nevin K.P. Dissimilatory Fe (III) and Mn (IV) reduction // Advances in microbial physiology. -2004. -V.49. -p.219-286. 127. Loy A., Lehner A., Lee N., Adamczyk J., Meier H., Ernst J., Schleifer K.-H., Wagner M. Oligonucleotide Microarray for 16S rRNA Gene-Based Detection of All Recognized Lineages of Sulfate-Reducing Prokaryotes in the Environment // Applied and environmental microbiology. -2002. -V.68. -№ 10. -p.5064-5081. 128. Lücker S., Steger D., Kjeldsen K.U., MacGregor B.J., Wagner M., Loy A. Improved 16S rRNA-targeted probe set for analysis of sulfate-reducing bacteria by fluorescence in situ hybridization // Journal of microbiological methods. -2007. -V.69. -№ 3. -p.523-528. 101 129. Ma Y., Xue Y., Grant W., Collins N., Duckworth A., van Steenbergen R., Jones B. Alkalimonas amylolytica gen. nov., sp. nov., and Alkalimonas delamerensis gen. nov., sp. nov., novel alkaliphilic bacteria from soda lakes in China and East Africa // Extremophiles. -2004. -V.8. -№ 3. -p.193-200. 130. Madigan M.T., Clark D.P., Stahl D., Martinko J.M. Brock Biology of Microorganisms 13th edition. Benjamin Cummings, 2010. - 1155 p. 131. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // Journal of molecular biology. -1961. -V. 3. -№. 2. -p.208-218. 132. Mathrani I.M., Boone D.R., Mah R.A., Fox G.E., Lau P.P. Methanohalophilus zhilinae sp. nov., an alkaliphilic, halophilic, methylotrophic methanogen // International journal of systematic bacteriology. -1988. -V.38. -№ 2. -p.139-142. 133. Mesbah N.M., Hedrick D.B., Peacock A.D., Rohde M., Wiegel J. Natranaerobius thermophilus gen. nov., sp. nov., a halophilic, alkalithermophilic bacterium from soda lakes of the Wadi An Natrun, Egypt, and proposal of Natranaerobiaceae fam. nov. and Natranaerobiales ord. nov // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2007. -V.57. -№ 11. p.2507-2512. 134. Mesbah N. M., Whitman W. B., Mesbah M. Determination of the G+C content of prokaryotes // In Methods in Microbiology, Taxonomy of Prokaryotes. -2011. Т. 38. -С. 299-324. 135. Meyer B., Kuever J. Molecular analysis of the diversity of sulfate-reducing and sulfur-oxidizing prokaryotes in the environment, using aprA as functional marker gene // Applied and environmental microbiology. -2007. -V.73. -№ 23. -p.76647679. 136. Miller J., Wakerley D. Growth of sulphate-reducing bacteria by fumarate dismutation // Journal of general microbiology. -1966. -V.43. -№ 1. -p.101-107. 137. Minz D., Flax J.L., Green S.J., Muyzer G., Cohen Y., Wagner M., Rittmann B.E., Stahl D.A. Diversity of sulfate-reducing bacteria in oxic and anoxic regions of a microbial mat characterized by comparative analysis of dissimilatory sulfite 102 reductase genes // Applied and environmental microbiology. -1999. -V.65. -№ 10. -p.4666-4671. 138. Miyatake T., MacGregor B.J., Boschker H.T. Linking microbial community function to phylogeny of sulfate-reducing Deltaproteobacteria in marine sediments by combining stable isotope probing with magnetic-bead capture hybridization of 16S rRNA // Applied and environmental microbiology. -2009. V.75. -№ 15. -p.4927-4935. 139. Mori K., Kim H., Kakegawa T., Hanada S. A novel lineage of sulfate-reducing microorganisms: Thermodesulfobiaceae fam. nov., Thermodesulfobium narugense, gen. nov., sp. nov., a new thermophilic isolate from a hot spring // Extremophiles. -2003. -V.7. -№ 4. -p.283-290. 140. Morita R.Y. Psychrophilic bacteria // Bacteriological reviews. -1975. -V.39. -№ 2. -p.144. 141. Murray R., Doetsch R., Robinow C. Methods for General and Molecular Bacteriology. In: Gerhardt P., Murray R.G.E., Wood W.A., Krieg N.R. (eds). Washington DC: American Society for Microbiology, 1994. -791p. 142. Mußmann M., Ishii K., Rabus R., Amann R. Diversity and vertical distribution of cultured and uncultured Deltaproteobacteria in an intertidal mud flat of the Wadden Sea // Environmental microbiology. -2005. -V.7. -№ 3. -p.405-418. 143. Muyzer G., Stams A.J. The ecology and biotechnology of sulphate-reducing bacteria // Nature Reviews Microbiology. -2008. -V.6. -№ 6. -p.441-454. 144. Neretin L.N., Schippers A., Pernthaler A., Hamann K., Amann R., Jørgensen B.B. Quantification of dissimilatory (bi) sulphite reductase gene expression in Desulfobacterium autotrophicum using real‐time RT‐PCR // Environmental microbiology. -2003. -V.5. -№ 8. -p.660-671. 145. Newman D.K., Kennedy E.K., Coates J.D., Ahmann D., Ellis D.J., Lovley D.R., Morel F.M. Dissimilatory arsenate and sulfate reduction in Desulfotomaculum auripigmentum sp. nov // Archives of Microbiology. -1997. V.168. -№ 5. -p.380-388. 103 146. Nilsen R.K.R., Beeder J., Thorstenson T., Torsvik T. Distribution of thermophilic marine sulfate reducers in north sea oil field waters and oil reservoirs // Applied and environmental microbiology. -1996. -V.62. -№ 5. p.1793-1798. 147. Ollivier B., Cayol J.L., Fauque G. Sulphate-reducing bacteria from oil fields environments and deep-sea hydrothermal vents / Sulphate-Reducing Bacteria: Environmental and Engineered Systems. -2007. -p.305-328. 148. Oremland R.S., Boone D.R. NOTES: Methanolobus taylorii sp. nov., a New Methylotrophic, Estuarine Methanogen // International journal of systematic bacteriology. -1994. -V.44. -№ 3. -p.573-575. 149. Owen R., Pitcher D. Current methods for estimating DNA base composition and levels of DNA-DNA hybridization // Society for Applied Bacteriology Technical Series. -1985. -№ 20. -p.67-93. 150. Pecheritsyna S.A., Rivkina E.M., Akimov V.N., Shcherbakova V.A. Desulfovibrio arcticus sp. nov., a psychrotolerant sulfate-reducing bacterium from a cryopeg // International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2012. -V.62. -№ 1. -p.33-37. 151. Pikuta E.V., Hoover R.B., Bej A.K., Marsic D., Whitman W.B., Cleland D., Krader P. Desulfonatronum thiodismutans sp. nov., a novel alkaliphilic, sulfatereducing bacterium capable of lithoautotrophic growth // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2003a. -V.53. -№ 5. -p.1327-1332. 152. Pikuta E.V., Hoover R.B., Bej A.K., Marsic D., Detkova E.N., Whitman W.B., Krader P. Tindallia californiensis sp. nov., a new anaerobic, haloalkaliphilic, spore-forming acetogen isolated from Mono Lake in California // Extremophiles. -2003b. -V.7. -№ 4. -p.327-334. 153. Pikuta E.V., Itoh T., Krader P., Tang J., Whitman W.B., Hoover R.B. Anaerovirgula multivorans gen. nov., sp. nov., a novel spore-forming, alkaliphilic anaerobe isolated from Owens Lake, California, USA // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2006. -V.56. -№ 11. -p.2623-2629. 104 154. Pikuta E.V., Hoover R.B., Bej A.K., Marsic D., Whitman W.B., Krader P. Spirochaeta dissipatitropha sp. nov., an alkaliphilic, obligately anaerobic bacterium, and emended description of the genus Spirochaeta Ehrenberg 1835 // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2009. -V.59. № 7. -p.1798-1804. 155. Plugge C.M., Zhang W., Scholten J.C., Stams A.J. Metabolic flexibility of sulfate-reducing bacteria // Frontiers in microbiology. -2011. -V.2. -article 81. 156. Podar M. and Reysenbach A-L. New opportunities revealed by biotechnological explorations of extremophiles. Current Opinion in Biotechnology. -2006. -V.17. p.250-255. 157. Postgate J. Sulphate reduction by bacteria // Annual Reviews in Microbiology. 1959. -V.13. -№ 1. -p.505-520. 158. Priscu J.C., Christner B.C. Earth’s icy biosphere / Microbial Diversity and Bioprospecting. In: Bull A.T. (ed). ASM Press, Washington. -2004. -p.130-145. 159. Purdy K., Nedwell D., Embley T. Analysis of the sulfate-reducing bacterial and methanogenic archaeal populations in contrasting Antarctic sediments // Applied and environmental microbiology. -2003. -V.69. -№ 6. -p.3181-3191. 160. Rabus R., Hansen T. A., Widdel F. Dissimilatory sulfate-and sulfur-reducing prokaryotes / The prokaryotes. -Springer, New York. -2006. -р.659-768. 161. Radajewski S., Ineson P., Parekh N.R., Murrell J.C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology // Nature. -2000. -V.403. -№ 6770. -p.646-649. 162. Ravenschlag K., Sahm K., Knoblauch C., Jørgensen B.B., Amann R. Community structure, cellular rRNA content, and activity of sulfate-reducing bacteria in marine Arctic sediments // Applied and environmental microbiology. 2000. -V.66. -№ 8. -p.3592-3602. 163. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy // The Journal of cell biology. -1963. -V.17. -№ 1. -p.208212. 105 164. Rivkina E., Friedmann E., McKay C., Gilichinsky D. Metabolic activity of permafrost bacteria below the freezing point // Applied and environmental microbiology. -2000. -V.66. -№ 8. -p.3230-3233. 165. Rivkina E., Laurinavichius K., McGrath J., Tiedje J., Shcherbakova V., Gilichinsky D. Microbial life in permafrost // Advances in Space Research. 2004. -V.33.-№ 8. -p.1215-1221. 166. Ryzhmanova Y.V., Nepomnyashchaya Y.N., Abashina T.N., Ariskina E.V., Troshina O.Yu., Vainshtein M.B., Shcherbakova V.A. New sulfate-reducing bacteria isolated from Buryatian alkaline brackish lakes: description of Desulfonatronum buryatense sp. nov. // Extremophiles. -2013. V.17. -p.851-859. 167. Roesler C.S., Culbertson C.W., Etheridge S.M., Goericke R., Kiene R.P., Miller L.G., Oremland R.S. Distribution, production, and ecophysiology of Picocystis strain ML in Mono Lake, California // Limnology and Oceanography. 2002. -V.47. -№ 2. -p.440-452. 168. Rossello-Mora R., Urdiain M., Lopez-Lopez A. DNA-DNA Hybridization / Methods in Microbiology. In: Rainey F., Oren A. (eds). V.38. -2011. -p.325-347. 169. Sagemann J., Jørgensen B., Greeff O. Temperature dependence and rates of sulfate reduction in cold sediments of Svalbard, Arctic Ocean // Geomicrobiology Journal. -1998. -V.15. -№ 2. -p.85-100. 170. Sahm K., Knoblauch C., Amann R. Phylogenetic affiliation and quantification of psychrophilic sulfate-reducing isolates in marine arctic sediments // Applied and environmental microbiology. -1999. -V.65. -№ 9. -p.3976-3981. 171. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular biology and evolution. -1987. -V.4. -№ 4. -p.406425. 172. Sánchez-Andrea, Stams A.J., Amils R., Sanz J.-L. Enrichment and isolation of acidophilic sulfate-reducing bacteria from Tinto River sediments // Environmental microbiology reports. -2013. -V.5. -№ 5. -p.672-678. 173. Sattley W.M., Madigan M.T. Temperature and nutrient induced responses of Lake Fryxell sulfate-reducing prokaryotes and description of Desulfovibrio 106 lacusfryxellense, sp. nov., a pervasive, cold-active, sulfate-reducing bacterium from Lake Fryxell, Antarctica // Extremophiles. -2010. -V.14. -№ 4. -p.357-366. 174. Schauder R., Eikmanns B., Thauer R.K., Widdel F., Fuchs G. Acetate oxidation to CO2 in anaerobic bacteria via a novel pathway not involving reactions of the citric acid cycle // Archives of Microbiology. -1986. -V.145. -№ 2. -p.162-172. 175. Schink B., Stams A.J. Syntrophism among prokaryotes / The Prokaryotes. In: Rosenberg E., DeLong E.F., Lory S., et al. (eds). -Berlin: Springer, -2013. -p.471493. 176. Scholten J., Joye S., Hollibaugh J., Murrell J. Molecular analysis of the sulfatereducing and archaeal community in a meromictic soda lake (Mono Lake, California) by targeting 16S rRNA, mcrA, apsA, and dsrAB genes // Microbial ecology. -2005. -V.50. -№ 1. -p.29-39. 177. Seitz H.-J., Cypionka H. Chemolithotrophic growth of Desulfovibrio desulfuricans with hydrogen coupled to ammonification of nitrate or nitrite // Archives of Microbiology. -1986. -V.146. -№ 1. -p.63-67. 178. Shi T., Reeves R., Gilichinsky D., Friedmann E. Characterization of viable bacteria from Siberian permafrost by 16S rDNA sequencing // Microbial ecology. -1997. -V.33. -№ 3. -p.169-179. 179. Sonne-Hansen J., Ahring B.K. Thermodesulfobacterium hveragerdense sp. nov. and Thermodesulfovibrio islandicus sp. nov., two thermophilic sulfate-reducing bacteria isolated from a Icelandic hot spring // Systematic and applied microbiology. -1999. -V.22. -№ 4. -p.559-564. 180. Sørensen K.B., Canfield D.E., Oren A. Salinity responses of benthic microbial communities in a solar saltern (Eilat, Israel) // Applied and environmental microbiology. -2004. -V.70. -№ 3. -p.1608-1616. 181. Sorokin D., Gorlenko V., Namsaraev B., Namsaraev Z., Lysenko A., Eshinimaev B., Khmelenina V., Trotsenko Y., Kuenen J.G. Prokaryotic communities of the north-eastern Mongolian soda lakes // Hydrobiologia. -2004. V.522. -№ 1-3. -p.235-248. 107 182. Sorokin D.Y., Tourova T.P., Henstra A.M., Stams A.J., Galinski E.A., Muyzer G. Sulfidogenesis at extremely haloalkaline conditions by Desulfonatronospira thiodismutans gen. nov., sp. nov., and Desulfonatronospira delicata sp. nov., a novel lineage of the Deltaproteobacteria from hypersaline soda lakes // Microbiology. -2008a. -V.154. -№ 5. -p.1444-1453. 183. Sorokin D.Y., Tourova T., Mußmann M., Muyzer G. Dethiobacter alkaliphilus gen. nov. sp. nov., and Desulfurivibrio alkaliphilus gen. nov. sp. nov.: two novel representatives of reductive sulfur cycle from soda lakes // Extremophiles. 2008b. -V.12. -№ 3. -p.431-439. 184. Sorokin D.Y., Rusanov I.I., Pimenov N.V., Tourova T.P., Abbas B., Muyzer G. Sulfidogenesis at extremely haloalkaline conditions in soda lakes of Kulunda Steppe (Altai, Russia) // FEMS Microbiology Ecology. -2010a. -V.73. -№ 2. p.278-290. 185. Sorokin D.Y., Detkova E., Muyzer G. Propionate and butyrate dependent bacterial sulfate reduction at extremely haloalkaline conditions and description of Desulfobotulus alkaliphilus sp. nov // Extremophiles. -2010b. -V.14. -№ 1. -p.7177. 186. Sorokin D.Y., Kuenen J.G., Muyzer G. The microbial sulfur cycle at extremely haloalkaline conditions of soda lakes // Frontiers in microbiology. -2011а. -V.2. article 44. 187. Sorokin D., Tourova T., Kolganova T., Detkova E., Galinski E., Muyzer G. Culturable diversity of lithotrophic haloalkaliphilic sulfate-reducing bacteria in soda lakes and the description of Desulfonatronum thioautotrophicum sp. nov., Desulfonatronum thiosulfatophilum sp. nov., Desulfonatronovibrio thiodismutans sp. nov., and Desulfonatronovibrio magnus sp. nov // Extremophiles. -2011b. V.15. -№ 3. -p.391-401. 188. Sorokin D., Panteleeva A., Tourova T., Kaparullina E., Muyzer G. Natronoflexus pectinivorans gen. nov. sp. nov., an obligately anaerobic and alkaliphilic fermentative member of Bacteroidetes from soda lakes // Extremophiles. -2011c. -V.15. -№ 6. -p.691-696. 108 189. Sorokin D.Y., Tourova T.P., Panteleeva A.N., Muyzer G. Haloalkaliphilic heterotrophic sulfate-reducing bacteria from soda lakes and description of Desulfonatronobacter acidivorans gen. nov., sp. nov., and Desulfobulbus alkaliphilus sp. nov // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2012a. -V.62. -p.2107-2113. 190. Sorokin D.Y., Tourova T.P., Panteleeva A.N., Kaparullina E.N., Muyzer G. Anaerobic utilization of pectinous substrates at extremely haloalkaline conditions by Natranaerovirga pectinivora gen. nov., sp. nov., and Natranaerovirga hydrolytica sp. nov., isolated from hypersaline soda lakes // Extremophiles. 2012b. -V.16. -№ 2. -p.307-315. 191. Sorokin D.Y., Berben T., Melton E.D., Overmars L., Vavourakis C.D., Muyzer G. Microbial diversity and biogeochemical cycling in soda lakes // Extremophiles. -2014a. -V.18. -№ 5. -p.791-809. 192. Sorokin D.Y., Gumerov V.M., Rakitin A.L., Beletsky A.V., Damsté J., Muyzer G., Mardanov A.V., Ravin N.V. Genome analysis of Chitinivibrio alkaliphilus gen. nov., sp. nov., a novel extremely haloalkaliphilic anaerobic chitinolytic bacterium from the candidate phylum Termite Group 3 // Environmental microbiology. -2014b. -V.16. -p.1549-1565. 193. Sorokin D.Y., Abbas B., Tourova T.P., Bumazhkin B.K., Kolganova T.V., Muyzer G. Sulfate-dependent acetate oxidation under extremely natron-alkaline conditions by syntrophic associations from hypersaline soda lakes // Microbiology. -2014c. -V.160. -№ 4. -p.723-732. 194. Stadnitskaia A., Muyzer G., Abbas B., Coolen M., Hopmans E., Baas M., Van Weering T., Ivanov M., Poludetkina E., Sinninghe Damsté J. Biomarker and 16S rDNA evidence for anaerobic oxidation of methane and related carbonate precipitation in deep-sea mud volcanoes of the Sorokin Trough, Black Sea // Marine Geology. -2005. -V.217. -№ 1. -p.67-96. 195. Steinsbu B.O., Thorseth I.H., Nakagawa S., Inagaki F., Lever M.A., Engelen B., Øvreås L., Pedersen R.B. Archaeoglobus sulfaticallidus sp. nov., a thermophilic and facultatively lithoautotrophic sulfate-reducer isolated from black 109 rust exposed to hot ridge flank crustal fluids // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2010. -V.60. -№ 12. -p.2745-2752. 196. Steven B., Leveille R., Pollard W.H., Whyte L.G. Microbial ecology and biodiversity in permafrost // Extremophiles. -2006. -V.10.-№ 4. -p.259-267. 197. Straub K. L., Benz M., Schink B. Iron metabolism in anoxic environments at near neutral pH // FEMS microbiology ecology. -2001. -V.34. -№ 3. -p.181-186. 198. Stubner S. Quantification of Gram-negative sulphate-reducing bacteria in rice field soil by 16S rRNA gene-targeted real-time PCR // Journal of microbiological methods. -2004. -V.57. -№ 2. -p.219-230. 199. Takai K., Moser D.P., Onstott T.C., Spoelstra N., Pfiffner S.M., Dohnalkova A., Fredrickson J.K. Alkaliphilus transvaalensis gen. nov., sp. nov., an extremely alkaliphilic bacterium isolated from a deep South African gold mine // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2001. -V.51. № 4. -p.1245-1256. 200. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 // Molecular biology and evolution. -2013. -V.30. -№ 12. -p.2725-2729. 201. Tarpgaard I.H., Boetius A., Finster K. Desulfobacter psychrotolerans sp. nov., a new psychrotolerant sulfate-reducing bacterium and descriptions of its physiological response to temperature changes // Antonie van Leeuwenhoek. 2006. -V.89. -№ 1. -p.109-124. 202. Tebo B.M., Obraztsova A.Y. Sulfate-reducing bacterium grows with Cr (VI), U (VI), Mn (IV), and Fe (III) as electron acceptors // FEMS Microbiology Letters. 1998. -V.162. -№ 1. -p.193-198. 203. Teske A., Ramsing N.B., Habicht K., Fukui M., Küver J., Jørgensen B.B., Cohen Y. Sulfate-reducing bacteria and their activities in cyanobacterial mats of Solar Lake (Sinai, Egypt) // Applied and environmental microbiology. -1998. V.64. -№ 8. -p.2943-2951. 110 204. Tindall B.J. Prokaryotic life in the alkaline, saline, athalassic environment / Halophilic bacteria. In: Rodriguez-Valera F. (ed).V.1. -Boca-Raton: CRC press, 1988. -p.31-67. 205. Trotsenko Y.A., Khmelenina V.N. Aerobic methanotrophic bacteria of cold ecosystems // FEMS Microbiology Ecology. -2005. V.53. -№ 1. -p.15-26. 206. Vandieken V., Knoblauch C., Jørgensen B.B. Desulfotomaculum arcticum sp. nov., a novel spore-forming, moderately thermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from a permanently cold fjord sediment of Svalbard // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2006a. -V.56. -№ 4. p.687-690. 207. Vandieken V., Knoblauch C., Jørgensen B.B. Desulfovibrio frigidus sp. nov. and Desulfovibrio ferrireducens sp. nov., psychrotolerant bacteria isolated from Arctic fjord sediments (Svalbard) with the ability to reduce Fe (III) // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2006b. -V.56. -№ 4. p.681-685. 208. Vatsurina A., Badrutdinova D., Schumann P., Spring S., Vainshtein M. Desulfosporosinus hippei sp. nov., a mesophilic sulfate-reducing bacterium isolated from permafrost // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2008. -V.58. -№ 5. -p.1228-1232. 209. Wagner M., Roger A.J., Flax J.L., Brusseau G.A., Stahl D.A. Phylogeny of dissimilatory sulfite reductases supports an early origin of sulfate respiration // Journal of Bacteriology. -1998. -V.180. -№ 11. -p.2975-2982. 210. Wall J.D., Krumholz L.R. Uranium reduction // Annual Review of Microbiology. -2006. -V.60. -p.149-166. 211. Wallrabenstein C., Hauschild E., Schink B. Pure culture and cytological properties of Syntrophobacter wolinii // FEMS Microbiology Letters. -1994. V.123. -№ 3. -p.249-254. 212. Webster G., Watt L.C., Rinna J., Fry J.C., Evershed R.P., Parkes R.J., Weightman A.J. A comparison of stable isotope probing of DNA and phospholipids fatty acids to study prokaryotic functional diversity in sulfate- 111 reducing marine sediment enrichment slurries // Environmental microbiology. 2006. -V.8. -№ 9. -p.1575-1589. 213. Widdel F. Sulphate-reducing bacteria and their ecological niches // Society for Applied Bacteriology Symposium Series. -1986. -V.60. -p.157-184. 214. Widdel F. The genus Desulfotomaculum / The Prokaryotes. In: Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., et al. (eds). -New York: Springer, -2006. -p.787-794. 215. Wolin E.A., Wolin M.J., Wolfe R.S. Formation of methane by bacterial extracts // Journal of Biological Chemistry. -1963. -V.238. -№ 8. -p.2882-2886. 216. Wood H.G., Ragsdale S.W., Pezacka E. The acetyl-CoA pathway of autotrophic growth // FEMS Microbiology Letters. -1986. -V.39. -№ 4. -p.345-362. 217. Worakit S., Boone D.R., Mah R.A., Abdel-Samie M.-E., El-Halwagi M.M. Methanobacterium alcaliphilum sp. nov., an H2-utilizing methanogen that grows at high pH values // International journal of systematic bacteriology. -1986. -V.36. -№ 3. -p.380-382. 218. Woyke T., Teeling H., Ivanova N.N., Huntemann M., Richter M., Gloeckner F.O., Boffelli D., Anderson I.J., Barry K.W., Shapiro H.J. Symbiosis insights through metagenomic analysis of a microbial consortium // Nature. -2006. -V.443. -№ 7114. -p.950-955. 219. Ye Q., Roh Y., Carroll S.L., Blair B., Zhou J., Zhang C.L., Fields M.W. Alkaline anaerobic respiration: isolation and characterization of a novel alkaliphilic and metal-reducing bacterium // Applied and environmental microbiology. -2004. -V.70. -№ 9. -p.5595-5602. 220. Zavarzin G., Zhilina T. Anaerobic chemotrophic alkaliphiles / Journey to diverse microbial worlds. In: Seckbach J. (ed). Springer Netherlands, -2000. p.191-208. 221. Zavarzina D., Tourova T., Kolganova T., Boulygina E., Zhilina T. Description of Anaerobacillus alkalilacustre gen. nov., sp. nov. - Strictly anaerobic diazotrophic bacillus isolated from soda lake and transfer of Bacillus arseniciselenatis, Bacillus macyae, and Bacillus alkalidiazotrophicus to Anaerobacillus as the new combinations A. arseniciselenatis comb. nov., A. 112 macyae comb. nov., and A. alkalidiazotrophicus comb. nov // Microbiology. 2009. -V.78. -№ 6. -p.723-731. 222. Zavarzina D.G., Zhilina T.N., Kuznetsov B.B., Kolganova T.V., Osipov G.A., Kotelev M.S., Zavarzin G.A. Natranaerobaculum magadiense gen. nov., sp. nov., an anaerobic, alkalithermophilic bacterium from soda lake sediment // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2013. -V.63. № 12. -p.4456-4461. 223. Zhang T., Datta S., Eichler J., Ivanova N., Axen S.D., Kerfeld C.A., Chen F., Kyrpides N., Hugenholtz P., Cheng J.-F. Identification of a haloalkaliphilic and thermostable cellulase with improved ionic liquid tolerance // Green Chemistry. 2011. -V.13. -№ 8. -p.2083-2090. 224. Zhilina T.N., Zavarzin G.A. Alkaliphilic anaerobic community at pH 10 // Current Microbiology. -1994. -V.29. -№ 2. -p.109-112. 225. Zhilina T.N., Zavarzin G.A., Detkova E.N., Rainey F.A. Natroniella acetigena gen. nov. sp. nov., an extremely haloalkaliphilic, homoacetic bacterium: a new member of Haloanaerobiales // Current Microbiology. -1996. -V.32. -№ 6. p.320-326. 226. Zhilina T., Zavarzin G., Rainey F., Pikuta E., Osipov G., Kostrikina N. Desulfonatronovibrio hydrogenovorans gen. nov., sp. nov., an alkaliphilic, sulfate-reducing bacterium // International journal of systematic bacteriology. 1997. -V.47. -№ 1. -p.144-149. 227. Zhilina T.N., Detkova E.N., Rainey F.A., Osipov G.A., Lysenko A.M., Kostrikina N.A., Zavarzin G.A. Natronoincola histidinovorans gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic acetogenic anaerobe // Current Microbiology. -1998. V.37. -№ 3. -p.177-185. 228. Zhilina T.N., Appel R., Probian C., Brossa E.L., Harder J., Widdel F., Zavarzin G.A. Alkaliflexus imshenetskii gen. nov. sp. nov., a new alkaliphilic gliding carbohydrate-fermenting bacterium with propionate formation from a soda lake // Archives of Microbiology. -2004. -V.182. -№ 2-3. -p.244-253. 113 229. Zhilina T.N., Zavarzina D.G., Kuever J., Lysenko A.M., Zavarzin G.A. Desulfonatronum cooperativum sp. nov., a novel hydrogenotrophic, alkaliphilic, sulfate-reducing bacterium, from a syntrophic culture growing on acetate // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2005. -V.55. № 3. -p.1001-1006. 230. Zhilina T.N., Zavarzina D.G., Panteleeva A.N., Osipov G.A., Kostrikina N.A., Tourova T.P., Zavarzin G.A. Fuchsiella alkaliacetigena gen. nov., sp. nov., an alkaliphilic, lithoautotrophic homoacetogen from a soda lake // International journal of systematic and evolutionary microbiology. -2012. -V.62. -№ 7. p.1666-1673.
