На правах рукописи Витвицкий Виктор Марьянович 03.01.02 – биофизика
реклама
На правах рукописи Витвицкий Виктор Марьянович ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ В КАЧЕСТВЕ ПЕРЕНОСЧИКОВ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2014 Работа выполнена в НИИ по биологическим испытаниям химических соединений Министерства Медицинской Промышленности СССР, в Гематологическом научном центре РАМН и в Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Фазоил Иноятович. Официальные оппоненты: доктор биологических наук, зав. отделом нанолекарств НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Ипатова Ольга Михайловна. доктор биологических наук, в.н.с., Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Новиков Кирилл Николаевич. доктор биологических наук, зав. лабораторией биохимии с группой иммунологии НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина, Хрипач Людмила Васильевна. Ведущее учреждение: Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН Защита состоится « 10 » марта 2015 г. в 14 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 002.252.01 при ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН по адресу: 117997, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1, кор. 1 (ФНКЦ ДГОИ). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУН «Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии» РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Косыгина д. 4. Автореферат разослан «____» ________ __________г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук 2 И.С. Николаева ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Использование переносчиков для транспорта лекарственных препаратов в организме является перспективным направлением в современной фармакологии и медицине. Переносчик может защитить препарат от быстрого (преждевременного) разрушения, инактивации или выведения из организма, предотвратить или уменьшить нежелательные иммунные реакции на введение препарата. В случае медленного высвобождения связанного (ассоциированного) с переносчиком препарата его концентрация в организме может длительно поддерживаться на необходимом уровне. Одним из важнейших результатов, ожидаемых от использования переносчиков, является избирательная доставки препарата в клетки и органы-мишени. Так или иначе, использование переносчиков может существенно изменить фармакокинетику препарата, понизить необходимую дозу или пиковую концентрацию, изменить распределение препарата в тканях организма, что, в свою очередь, может существенно повысить эффективность препарата и снизить его токсичность. Особый интерес представляет использование переносчиков для противоопухолевых препаратов. Исключительно высокая эффективность современных антибиотиков обусловлена тем, что они подавляют метаболические системы микроорганизмов, отсутствующие в клетках организмахозяина и, в результате, практически не влияют на нормальные клетки организма. Метаболизм опухолевых клеток принципиально не отличается от метаболизма нормальных клеток организма. В связи с этим, противоопухолевые препараты обладают весьма низкой избирательностью и, как следствие, высокой токсичностью по отношению к нормальным клеткам и тканям. Использование переносчиков может существенно повлиять на избирательность противоопухолевых препаратов и тем самым, повысить их терапевтическую эффективность. Таким образом, разработка переносчиков для лекарственных препаратов, и, в особенности, для противоопухолевых препаратов является актуальной задачей современной фармакологии и медицины. В качестве переносчиков фармакологических препаратов могут использоваться различные макромолекулы, микро- и наночастицы или капсулы (липосомы), а также клетки. Среди клеток наибольший интерес, как потенциальные переносчики лекарственных препаратов, представляют эритроциты. Эти клетки доступны в больших количествах. Процедуры введения в них, или присоединения к ним, различных веществ достаточно просты и эффективны (DeLoach J.R., 1989; Hamidi M.A. et al, 2007; Muzykantov V.R., 2010). Несомненными достоинствами эритроцитов являются идеальная биосовместимость и способность к длительной (порядка 100 дней) циркуляции в организме. Весьма существенно то, что разрушение эритроцитов в организме является естественным процессом и не приводит к каким-либо побочным 3 эффектам. Возможность использования в качестве переносчиков аутологичных эритроцитов сводит к минимуму риск инфицирования пациента. Относительно несложные методы обработки позволяют получать эритроциты-переносчики, которые селективно захватываются органами ретикулоэндотелиальной системы (Zocchi E. et al, 1987; Jordan J.A. et al, 1996), а также клетками иммунной системы (Chiarantini L. et al, 1992; Magnani M. et al, 1996). Эритроциты-переносчики могут применяться для коррекции ферментопатий (Bax B.E. et al, 2007, 2013), для удаления из крови токсичных соединений (Pei L. et al, 1995; Kosenko E.A. et al, 2008; Kaminsky Y.G. et al, 2012), для генной терапии (Byun H.M. et al, 2004; Fraternale A. et al, 2009) и для решения многих других задач (Hamidi M. et al, 2007; Muzykantov V. R., 2010; Magnani M. et al, 2012). Одними из наиболее перспективных и актуальных противоопухолевых препаратов для введения в эритроциты являются L-аспарагиназа и антрациклиновые антибиотики. Фармакологический препарат L-аспарагиназа является бактериальным белком, осуществляющим гидролиз аспарагина. L-аспарагиназа широко используется в клинической практике для лечения лейкозов (острых лимфобластных лейкозов). При введении пациентам аспарагиназы уровень аспарагина в крови резко падает, что приводит к гибели лейкозные клетки, неспособные синтезировать аспарагин самостоятельно из-за низкого уровня аспарагинсинтетазы. Препарат аспарагиназа обладает высокой иммуногенностью. В результате, он очень быстро выводится из организма и часто вызывает у пациентов нежелательные иммунные реакции, включая аллергию и анафилактический шок (Shepherd G.M., 2003; van den Berg H., 2011; Avramis V.I., 2012). Введение аспарагиназы в эритроциты позволит снизить контакт препарата с иммунной системой пациента, что должно увеличить время его циркуляции в организме, предотвратить иммунные реакции у пациентов и, в конечном итоге, повысить эффективность терапии. Антрациклиновые антибиотики являются наиболее эффективными и широко используемыми современными противоопухолевыми препаратами. Их применение, однако, ограничено высокой токсичностью (в том числе кардиотоксичностью), приводящей к серьезным нежелательным побочным эффектам (Weiss R.B., 1992; Minotti G. et al, 2004). Предполагается, что использование переносчиков может повысить избирательность антрациклиновых антибиотиков (например, за счет направленного транспорта препаратов в клетки и органы–мишени) и, тем самым, повысить их терапевтическую эффективность. В настоящее время в клинической практике используются липосомальные формы даунорубицина (дауносом) и доксорубицина (доксил), которые применяются при лечении целого ряда онкологических заболеваний. Основным преимуществом липосомальных форм антрациклиновых антибиотиков является низкая кардиотоксичность, поскольку их противоопухолевая активность в большинстве случаев оказывается такой же, как и у стандартных форм антрациклиновых антибиотиков. Основным препятствием к 4 повышению дозы липосомальных форм антрациклиновых антибиотиков (и, тем самым к повышению противоопухолевой активности) является развитие тяжелого ладонно-подошвенного синдрома. Предпринимались попытки использовать в качестве переносчиков доксорубицина эритроциты, обработанные глютаровым альдегидом. Однако, в связи с высокой миелотоксичностью полученных препаратов (Tonetti M. et al, 1992; Matherne C. M. et al, 1994), работы в этом направлении были прекращены. В то же время, возможность использования интактных эритроцитов в качестве переносчиков антрациклиновых антибиотиков до настоящего времени практически не рассматривалась. В нашей работе исследовалась возможность использования эритроцитов в качестве переносчиков противоопухолевого ферментативного препарата Lаспарагиназы, а также противоопухолевых антрациклиновых антибиотиков даунорубицина и доксорубицина. Цель работы. Разработка и исследование эритроцитарных форм противоопухолевых препаратов L-аспарагиназы, даунорубицина и доксорубицина. Задачи исследования. 1. Освоение технологии включения ферментативных препаратов в эритроциты человека с использованием модельного объекта – люциферазы из светляков Luciola mingrelica. 2. Выяснение возможности транспорта аспарагина через клеточную мембрану эритроцитов человека. 3. Исследование функциональной полноценности и стабильности противоопухолевого ферментативного препарата L-аспарагиназы, введенного в эритроциты. 4. Исследование связывания антрациклиновых антибиотиков даунорубицина и доксорубицина с эритроцитами, а также влияния этих антибиотиков на биохимические и физиологические параметры эритроцитов in vitro. 5. Проверка терапевтической активности эритроцитов, нагруженных даунорубицином на мышиных моделях. 6. Исследование фармакокинетики и переносимости эритроцитарных форм даунорубицина и доксорубицина у больных с лимфопролиферативными заболеваниями. Научная новизна. В работе впервые показана возможность введения в эритроциты люциферазы из светляков Luciola mingrelica Введение в эритроциты люциферазы дает возможность непрерывной регистрации уровня АТФ в клетках без их разрушения. Впервые исследована кинетика транспорта аспарагина через клеточную мембрану эритроцитов человека. Показана возможность использования 5 нагруженных L-аспарагиназой человеческих эритроцитов для разрушения аспарагина во внеклеточной среде. Предложен способ хранения нагруженных L-аспарагиназой эритроцитов. Впервые исследована кинетика связывания антрациклиновых антибиотиков: даунорубицина и доксорубицина, с эритроцитами. Показана возможность получения нагруженных антрациклиновыми антибиотиками эритроцитов путем инкубации эритроцитов в изотонической среде, содержащей антибиотик. Исследована противоопухолевая активность нагруженных даунорубицином эритроцитов на мышиных моделях. Впервые исследована фармакокинетика и переносимость эритроцитарных форм даунорубицина и доксорубицина у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями. Научно-практическое значение. Полученные результаты указывают на перспективность использования нагруженных различными препаратами эритроцитов для решения как фундаментальных, так и практических задач. Показана высокая перспективность использования эритроцитов в качестве переносчиков противоопухолевого препарата L-аспарагиназы и антрациклиновых антибиотиков. Работа фактически открывает новое направление в разработке эритроцитарных форм антрациклиновых антибиотиков. На основании полученных результатов предложена исключительно простая методика приготовления эритроцитов, нагруженных антрациклиновыми антибиотиками. На мышиных моделях показано, что противоопухолевая активность эритроцитарных форм даунорубицина остается неизменной, а токсичность снижена по сравнению со стандартной формой (раствором) антибиотика. Введение эритроцитов, нагруженных даунорубицином или доксорубицином пациентам с лимфопролиферативными заболеваниями приводит к снижению пиковых концентраций и увеличению времени циркуляции антибиотиков в крови. Эритроцитарные формы антрациклиновых антибиотиков переносятся пациентами лучше, чем стандартные формы. Это открывает возможности для повышения эффективности терапии за счет повышения доз антибиотиков, изменения протоколов введения препаратов и т.п. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Введенная в эритроциты L-аспарагиназа быстро разрушает поступающий в эти клетки аспарагин, что делает эритроцит перспективным переносчиком противоопухолевого препарата L-аспарагиназы. 2. Антрациклиновые антибиотики достаточно быстро связываются эритроцитами в изотонической среде, что позволяет легко получать нагруженные этими антибиотиками эритроциты как в лабораторных, так и в клинических условиях. 3. Исследования на мышиных моделях показывают, что эритроцитарные формы даунорубицина сохраняют высокую противоопухолевую активность и в то же 6 время обладают меньшей, по сравнению со стандартной формой этого антибиотика, токсичностью. 4. Введение эритроцитарных форм даунорубицина и доксорубицина пациентам с лимфопролиферативными заболеваниями приводит к снижению пиковых концентраций, увеличению времени циркуляции антибиотиков в крови и к увеличению площади под фармакокинетической кривой. 5. Эритроцитарные формы даунорубицина и доксорубицина переносятся пациентами лучше, чем стандартные формы этих антибиотиков. Апробация работы. Работа прошла апробацию 9 июня 2014 г. на заседании межлабораторного семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН. Материалы диссертации были представлены на отечественных и международных научных конференциях, включая: Fourth International Meeting of the International Society for the Use of Resealed Erythrocytes as Carriers and Bioreactors, Urbino, Italy, September 5-7, 1991. Fifth Conference of the International Society for the Use of Resealed Erythrocytes, October 14-17, 1993, San Antonio, Texas, USA. Sixth Meeting of the International Society for the Use of Resealed Erythrocytes, Irsee, Germany, July 25-28, 1996. Лабораторная Диагностика и Химиотерапия, Москва, 9-11 сентября 1998 г. Трансфузиология и Служба Крови, Москва, 17-19 ноября 1998 г. Acute Leukemias VIII Prognostic Factors and Treatment Strategies, Munster, Germany, February 27–March 03, 1999. Fourth Congress of the European Haematology Association, Barcelona, Spain, June 9-12, 1999. 10th International Congress of Biorheology and 3rd International Conference of Clinical Hemorheology, Pecs, Hungary, July 18-22, 1999. International Conference on Biorheology & School for Young Scientists, Sofia, Bulgaria, October 18-22, 2000. Молекулярные, Мембранные и Клеточные Основы Функционирования Биосистем, Минск, Белоруссия, 2000 г. Биохимическая Физика на Рубеже Столетий, Москва, 2000 г. Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии, Санкт-Петербург, 6-8 июня, 2000 г. IV Ежегодная Российская Онкологическая Конференция, Москва, 21-23 ноября, 2000 г. XIII Meeting of the European Association for Red Cell Research, Barcelona, Spain, March, 31-April, 03, 2001. 7 15th Meeting of the European Association for Red Cell Research, Murten, Switzerland, April 21–25, 2005. International Seminar “The Red Blood Cells as Vehicles for Drugs”, Lyon, France, January 28, 2011. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ, в том числе 21 статья в периодических научных изданиях, 2 статьи в сборнике материалов международной научной конференции, глава в книге, авторское свидетельство СССР и патент Российской Федерации. Личное участие автора в получении результатов. Автор лично участвовал в разработке методов включения ферментативных препаратов в эритроциты. Автором лично были спланированы, проведены и обработаны все эксперименты, связанные с исследованием транспорта люциферина и кинетики люциферазы в эритроцитах, а также все эксперименты по исследованию транспорта аспарагина в эритроциты. Автор лично участвовал в планировании, проведении и обработке результатов экспериментов с хранением эритроцитов, нагруженных аспарагиназой. Автор принимал непосредственное участие в планировании, проведении и обработке результатов экспериментов, направленных на исследование кинетики связывания антрациклиновых антибиотиков с эритроцитами, а также в исследованиях терапевтической активности эритроцитов, нагруженных даунорубицином, на мышиных моделях. Автор лично участвовал в разработке, создании и испытаниях устройства для исследования фильтруемости эритроцитов. Также, автор принимал непосредственное участие в планировании, обработке результатов и обсуждении клинических исследований, направленных на изучение фармакокинетики антрациклиновых антибиотиков у пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями при введении им эритроцитов, нагруженных даунорубицином или доксорубицином. Под руководством автора выполнены и успешно защищены две кандидатские диссертации, посвященные исследованию кинетики связывания антрациклиновых антибиотиков с эритроцитами, исследованию повреждающих эффектов антрациклиновых антибиотиков на эритроциты и клиническому исследованию фармакокинетики эритроцитов, нагруженных даунорубицином и доксорубицином. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 282 страницах машинописного текста, включая 45 рисунков, 25 таблиц и 369 библиографических ссылок. 8 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении показана актуальность исследуемой темы, обозначены основные направления исследований и проблемы в данной области, сформулированы цели и задачи работы, а также дана общая характеристика работы. Глава 1 посвящена обзору литературных данных по теме диссертации. Глава 2 посвящена описанию экспериментов с человеческими эритроцитами, нагруженными люциферазой из светляков Luciola mingrelica. Люцифераза вводилась в эритроциты путем обратимого осмотического лизиса (DeLoach J.R., 1989). После введения люциферазы в эритроциты наблюдается люминесценция клеток, уровень которой зависит от концентрации люциферина в суспензии клеток и от концентрации АТФ в клетках (Рис. 1, 2). Показано, что люциферин распределяется равномерно между эритроцитами и средой. Транспорт люциферина через клеточную мембрану эритроцитов является обратимым и осуществляется путем простой диффузии. Показана принципиальная возможность непрерывной регистрации уровня АТФ в эритроцитах, нагруженных люциферазой (Рис. 2). Рис. 1. Кинетика люминесценции суспензии эритроцитов, нагруженных люциферазой после добавления люциферина. В измерительной ячейке находилось 1,2 мл суспензии эритроцитов с гематокритом 5% при температуре 37 оС. Раствор люциферина с концентрацией 100 мкМ был добавлен в количестве 10 мкл– 1; 20 мкл– 2; 40 мкл– 3; 60 мкл– 4; 80 мкл– 5; 100 мкл– 6. 9 Рис. 2. Влияние внутриклеточной концентрации АТФ на интенсивность люминесценции эритроцитов, нагруженных люциферазой. Клетки инкубировались при следующих условиях: 1 - с глюкозой без люциферина, 2 – с глюкозой и люциферином, 3 – без глюкозы (истощение), 4 – после добавления глюкозы к истощенным эритроцитам. А-интенсивность люминесценции; В-концентрация АТФ в клетках; С-относительные значения (белые символы соответствуют интенсивности люминесценции, черные – концентрации АТФ). Стрелкой отмечен момент добавления глюкозы к истощенным эритроцитам. Гематокрит суспензии 8%, 37оС. 10 Глава 3 посвящена исследованиям, связанным с разработкой эритроцитов, нагруженных противолейкозным ферментативным препаратом L-аспарагиназой. В нашей работе впервые показана способность эритроцитов человека транспортировать аспарагин из среды в клетки, что необходимо для эффективного функционирования эритроцитов-переносчиков аспарагиназы. Исследована кинетика транспорта аспарагина. Показано, что скорость накопления аспарагина в эритроцитах пропорциональна его концентрации в среде (Рис 3). Зависимость скорости транспорта от концентрации аспарагина в среде может быть описана уравнением Михаэлиса-Ментен с параметрами Kм=2,50 мМ, и Vмакс=0,24 ммоль/ч л клеток. Был исследован транспорт аспарагина в эритроцитах, нагруженных бактериальной Lаспарагиназой. Аспарагиназа вводилась в эритроциты путем обратимого осмотического лизиса (DeLoach J.R., 1989). В таких эритроцитах вместо аспарагина накапливается аспарагиновая кислота, что говорит, во-первых, о быстрой переработке поступающего в клетки аспарагина заключенной в них аспарагиназой, и, во-вторых, о сохранении нормального транспорта аспарагина в эритроцитах после Рис. 3. Накопление аспарагина в нативных эритроцитах человека при 37 оС в среде с различными концентрациями аспарагина: 1-0; 2-0,18 мМ; 3-0,35 мМ; 4-0,71 мМ; 53,54 мМ. Гематокрит-10%. 11 Рис. 4. Изменения концентрации аспарагина (1) и аспарагиновой кислоты (2) в эритроцитах (A, C) и в инкубационной среде (B, D), в ходе инкубации эритроцитов, нагруженных аспарагиназой, в среде, содержащей аспарагин. A, B-использованный при введении аспарагиназы в эритроциты лизирующий раствор содержал 600 МЕ/л аспарагиназы. Гематокрит суспензии в ходе инкубации-40%. C, D- использованный при введении аспарагиназы в эритроциты лизирующий раствор содержал 6,5 МЕ/л аспарагиназы. Гематокрит суспензии в ходе инкубации-37%. Пунктирной линией показано изменение концентрации аспарагина в среде, расчитанное при условии постоянства суммы концентраций аспарагина и аспарагиновой кислоты в суспензии. 12 включения в них аспарагиназы (Рис 4). Полученные результаты указывают на принципиальную возможность использования эритроцитов человека в качестве переносчиков L-аспарагиназы при лечении лейкозов. Человеческие эритроциты, нагруженные аспарагиназой, являются достаточно стабильным продуктом. При хранении в растворе Эритронаф с добавлением глюкозы в течение 7 дней в них сохраняется исходная активность аспарагиназы, поддерживается достаточно высокий уровень АТФ и приемлемый для переливания пациентам уровень свободного гемоглобина. В главе 4 приведены результаты исследования взаимодействия эритроцитов с противоопухолевыми антрациклиновыми антибиотиками – даунорубицином и доксорубицином, а также результаты проверки терапевтической активности эритроцитов, нагруженных даунорубицином на мышиных моделях. Мы обнаружили, что в изотонической среде, содержащей даунорубицин или доксорубицин, человеческие и мышиные эритроциты могут достаточно быстро связывать эти антибиотики (Рис. 5). Скорость связывания и количество связанного антибиотика существенно зависят от температуры (Рис. 5). При температуре ниже 10оС связывание антибиотиков с эритроцитами практически отсутствует. Рис. 5. Кинетика связывания антрациклиновых антибиотиков в суспензии эритроцитов человека в изотонической среде при различной температуре. Адаунорубицин, гематокрит суспензии 33%; В-доксорубицин, гематокрит суспензии 50%. 13 Полученные результаты указывают на возможность приготовления нагруженных антрациклиновыми антибиотиками эритроцитов путем простой инкубации клеток в изотонической среде, содержащей антибиотик. Наши исследования также показывают, что антрациклиновые антибиотики могут вызывать повреждение эритроцитов. Длительная инкубация эритроцитов при высоких концентрациях антрациклиновых антибиотиков может приводить к значительному выходу гемоглобина и калия в среду, что указывает на разрушение клеток. Кроме того, при взаимодействии эритроцитов с антрациклиновыми антибиотиками возрастает объем и ухудшается деформируемость (фильтруемость) этих клеток. Не обнаружено влияния антрациклиновых антибиотиков на уровень АТФ в эритроцитах. Надо отметить, однако, что заметное повреждение эритроцитов наблюдается только при концентрациях антибиотиков, превышающих терапевтические уровни. Исследование терапевтической активности нагруженных даунорубицином эритроцитов проводилось на двух мышиных опухолевых моделях – асцитной опухоли Р388 и эритробластного лейкоза, индуцированного вирусом Раушера. В экспериментах с опухолью Р388 терапевтическая (противоопухолевая) активность даунорубицина оценивалась по увеличению продолжительности жизни животных. В экспериментах с эритробластным лейкозом, индуцированным вирусом Раушера, противоопухолевая активность оценивалась по подавлению спленомегалии, а токсичность по снижению веса животных. В обоих случаях одинаковые дозы даунорубицина, вводимого в стандартной форме (раствор) или в форме нагруженных антибиотиком эритроцитов демонстрировали примерно одинаковую противоопухолевую активность. В то же время токсичность нагруженных даунорубицином эритроцитов была значительно ниже, чем токсичность раствора антибиотика (Табл. 1). В главе 5 приведены результаты клинических исследований фармакокинетики и переносимости даунорубицина и доксорубицина после введения эритроцитов, нагруженных этими антибиотиками, пациентам с лимфопролиферативными заболеваниями. Исследования проводились на базе клиники Гематологического Научного Центра РАМН. Экспериментальные протоколы были одобрены Ученым Советом ГНЦ РАМН (протокол № 62 от 24 ноября 1994 г. и № 92 от 11 ноября 1997 г.). Цель исследования и возможные риски были разъяснены пациентам и от каждого из них заранее было получено письменное согласие на участие в исследованиях. В клинических исследованиях с эритроцитарной формой даунорубицина (ЭФДА) участвовало 26 пациентов с резистентными формами и рецидивами острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) и острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ). Из них 14 14 Таблица 1. Сравнение противоопухолевой активности и токсичности различных доз даунорубицина, введенных в виде раствора антибиотика (стандартная форма) или в виде суспензии человеческих эритроцитов, нагруженных даунорубицином (ЭНДА), на мышах с эритробластным лейкозом, индуцированным вирусом Раушера. Животные получали две внутривенные инъекции препарата. Первая инъекция сделана на девятый день после введения вируса, а вторая через четверо суток после первой. Через сутки после второй инъекции животные забивались. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Вес селезенки Условия Раствор антибиотика Человеческие ЭНДА Перед введением антибиотика Нелеченые животные Нормальный контроль Число Изменение погибших, и веса тела полное Доля от (г) число нормы животных Доза на инъекцию (мг/кг веса) (мг) 10 111±15 0,8 -4,2±1,0 0/8 20 87±9 0,6 -6,4±0,6 0/8 30 48±5 0,3 -6,8±0,4 1/8 10 194±14 1,3 -1,4±0,4 0/8 20 154±14 1,1 -3,6±0,4 0/8 30 111±9 0,8 -3,9±0,4 0/8 - 342±80 2,3 - 0/4 - 877±47 6,0 +3,0±0,4 0/8 - 146±8 1,0 +0,6±0,2 0/8 15 было вовлечено как в фармакокинетические исследования, так и в клинические исследования переносимости разных форм даунорубицина. Остальные 12 пациентов участвовали только в клинических исследованиях переносимости разных форм даунорубицина. Нагруженные даунорубицином эритроциты (ЭФДА) готовили путем инкубации аутологичной крови пациентов с раствором антибиотика. Даунорубицин вводился больным в стандартных дозах 45 или 60 мг/м2 в курсах химиотерапии по программам 7+3 в случае ОМЛ или RACOP в случае ОЛЛ. Согласно этим программам даунорубицин вводится один раз в сутки в течение первых трех дней курса. Кинетика концентрации даунорубицина в крови и плазме пациентов, получаемая в фармакокинетических исследованиях, аппроксимировалась суммой двух экспонент в соответствии со следующим уравнением: С=Cb+A1exp(-t/T1)+A2exp(-t/T2) Здесь С – концентрация даунорубицина в крови или в плазме в момент времени t после завершения введения антибиотика, Сb – предел чувствительности метода измерения (фоновая флюоресценция образца), A1 и A2 – коэффициенты, T1 и T2 – постоянные времени первой и второй экспонент соответственно (характерные времена удаления даунорубицина из кровотока). Предварительные исследования in vitro показали, что даунорубицин хорошо связывается с эритроцитами больных и практически не влияет на их деформируемость (фильтруемость) при терапевтических концентрациях. При введении пациентам ЭФДА наблюдалось снижение пиковых концентраций даунорубицина в крови и в плазме и более медленное выведение его из циркуляции по сравнению со стандартной формой (раствором) антибиотика (Рис. 6). В результате значительно увеличивалась площадь под фармакокинетической кривой. Средние значения фармакокинетических параметров даунорубицина, полученные при исследовании ЭФДА приведены на Рис. 7. Переносимость ЭФДА во всех случаях была хорошей. Не было отмечено непосредственных реакций у больных на введение препарата. Частота возникновения неспецифических, негематологических побочных эффектов была заметно ниже в случае введения эритроцитарной формы даунорубицина (Рис. 8). Ни у кого из пациентов не было отмечено клинических и эхокардиографических признаков кардиотоксичности. В клинические исследования эритроцитарной формы доксорубицина (ЭФДО) было включено 18 больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями, находящихся в 3-й или 4-й стадии, с рецидивами, с плохой переносимостью или резистентностью к стандартной химиотерапии. Эритроцитарная форма 16 Концентрация даунорубицина (нг/мл) 100000 100000 10000 10000 1000 1000 100 100 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 10 0 24 48 72 96 120 144 168 192 Время (ч) Рис. 6. Кинетика концентрации даунорубицина в плазме пациента в ходе трех последовательных введений раствора (белые кружки) и эритроцитарной формы (черные кружки) даунорубицина. Моменты введения даунорубицина отмечены стрелками. Даунорубицин вводился в дозе 60 мг/м2 в ходе курса химиотерапии 7+3. Курс химиотерапии с использованием эритроцитарной формы даунорубицина проводился через 21 день после курса химиотерапии с использованием стандартной формы (раствора) даунорубицина. На вставке показана кинетика концентрации доксорубицина в течение двух часов после первого введения раствора и эритроцитарной формы даунорубицина. 17 Постоянная времени быстрой фазы выведения даунорубицина - T1, (ч) Кровь Плазма A 25 20 15 p<0,01 p<0,03 10 5 0 3.0 Раствор ЭФДА Раствор ЭФДА 2 2 60 мг/м 45 мг/м Кровь Плазма Постоянная времени медленной фазы выведения даунорубицина - T2, (ч) Пиковая концентрация, (мкг/мл) Площадь под кривой, (отн. ед.) 30 D 2.5 2.0 p<0,01 1.5 1.0 0.5 0.0 Раствор ЭФДА 0.8 0.7 Кровь Плазма B 0.6 0.5 0.4 p<0,02 0.3 0.2 0.1 0.0 14 12 Раствор ЭФДА Кровь Плазма C 10 8 p<0,02 6 4 2 0 Раствор ЭФДА Рис. 7. Значения фармакокинетических параметров даунорубицина, полученные при введении пациентам стандартной (раствор) и эритроцитарной (ЭФДА) форм антибиотика. А-пиковые концентрации при разных дозах антибиотика; В, С – постоянные времени быстрой и медленной фаз выведения даунорубицина из кровотока; D – относительные значения площади под фармакокинетической кривой. Площади сравнивались у пациентов, получивших одинаковую дозу даунорубицина в виде раствора и эритроцитарной формы. Приведены средние значения, стандартная ошибка среднего и статистическая значимость различий (p) между данными, полученными для стандартной и эритроцитарной форм даунорубицина. 18 Частота побочных эффектов, (%) 100 Раствор даунорубицина ЭФДА 80 60 40 20 0 То ш т но а Р т во а т ть ея ия ль ти с р ц а о о а м б и пе аб Д я то л о а С С л н Г о ол в А Рис. 8. Частота возникновения неспецифических побочных эффектов у пациентов, получавших стандартную (раствор, n=15) и эритроцитарную (n=10) формы даунорубицина. доксорубицина готовилась на основе аутологичной крови пациентов (АК-ЭФДО), аутологичных эритроцитов пациентов (АЭ-ЭФДО) или донорских эритроцитов (ДЭЭФДО). Доксорубицин вводили пациентам в стандартной дозе 25 или 50 мг/м2 в курсах химиотерапии по программам CHOP или ABVD. Согласно этим программам, доксорубицин вводится один раз в первый день курса химиотерапии. Как и в случае даунорубицина, введение пациентам эритроцитарной формы доксорубицина приводило к снижению пиковых концентраций антибиотика в крови и плазме, а также к увеличению времени его циркуляции в кровотоке (Рис.9, Табл. 2). У шести пациентов, получивших одинаковую дозу доксорубицина как в стандартной форме, так и в виде ЭФДО, пиковая концентрация антибиотика в крови и в плазме после введения ЭФДО составила в среднем соответственно 466 % (p<0.001) и 4010 % (p<0.002) от пиковой концентрации, полученной после введения стандартной формы. 19 Рис. 9. Фармакокинетика доксорубицина в крови пациента после внутривенного введения стандартной (раствора) и эритроцитарной (АЭ-ЭФДО) форм антибиотика в дозе 25 мг/м2. A-кинетика изменения концентрации доксорубицина, B-площадь под фармакокинетической кривой. 20 Таблица 2. Значения характерных времен быстрой (Т1) и медленной (Т2) фаз снижения уровня доксорубицина в крови и в плазме пациентов после внутривенного введения стандартной (раствор) и эритроцитарных форм антибиотика. Приведены средние значения, стандартная ошибка среднего значения и статистическая значимость различий между стандартной и эритроцитарными формами доксорубицина (p). Кровь Форма введения доксорубицина Число пациентов Число введений T1, (ч) p T2, (ч) p Плазма АКАЭДЭЭФДО ЭФДО ЭФДО 9 6 7 9 9 8 16 9 0,16±0,06 0,29±0,05 0,49±0,13 1,07±0,35 <0,05 <0,04 <0,02 7,3±2,0 15,8±6,6 28,6±6,8 48,4±8,8 <0,11 <0,02 <0,0002 Раствор 21 Раствор 9 9 0,1±0,0 5,5±1,3 АКАЭДЭЭФДО ЭФДО ЭФДО 6 7 9 8 16 9 0,36±0,07 0,58±0,19 0,69±0,13 <0,002 <0,05 <0,0002 16,8±7,3 19,4±3,9 39,9±11,2 <0,08 <0,02 <0,04 Увеличение времени циркуляции доксорубицина приводило к увеличению площади под кривой зависимости концентрации антибиотика от времени (Рис. 9). Сравнение этих площадей у пациентов, получивших одну и ту же дозу доксорубицина как в стандартной форме, так и в виде ЭФДО показывает, что после введения ЭФДО площадь под кривой была в среднем выше в 4,81,4 раза для крови (n=9, p<0,04) и в 6,41,5 раза для плазмы (n=8, p<0,02). Переносимость ЭФДО во всех случаях была хорошей. Не было отмечено непосредственных реакций у больных на введение препарата. Типичные для цитостатической терапии токсические эффекты, такие как тошнота, рвота, мукозит, алопеция были значительно менее выражены, при введении ЭФДО, по сравнению со стандартной формой доксорубицина. Не было отмечено продолжительной или тяжелой миелосупрессии. Ни в одном из случаев введения ЭФДО не было отмечено каких-либо признаков кардиотоксичности. Более того, использование ЭФДО оказалось единственной возможностью введения доксорубицина двум пациенткам, одна из которых страдала мерцательной аритмией, а у другой стандартная форма антибиотика вызывала сильную пароксизмальную тахикардию и сердечную боль. Введение ЭФДО не вызывало у этих пациенток никаких негативных последствий. В заключении делается общая оценка полученных результатов, обсуждаются наиболее перспективные направления в использовании эритроцитов в качестве переносчиков биологически активных препаратов. 22 ВЫВОДЫ 1. Впервые показана возможность введения в эритроциты люциферазы из светляков Luciola mingrelica. Это открывает возможность непрерывной регистрации уровня АТФ в неразрушенных клетках. 2. Впервые исследована кинетика транспорта аспарагина внутрь эритроцитов человека. 3. Показано, что введенная в эритроциты аспарагиназа эффективно перерабатывает поступающий в клетки аспарагин в аспарагиновую кислоту. Это открывает возможность использования эритроцитов в качестве переносчиков аспарагиназы в организме. 4. Предложена методика, позволяющая хранить нагруженные аспарагиназой эритроциты до семи дней. 5. Обнаружена способность человеческих и мышиных эритроцитов связывать антрациклиновые антибиотики в изотонической среде. 6. Разработано устройство для исследования реологических параметров эритроцитов, нагруженных антрациклиновыми антибиотиками. 7. Противоопухолевая активность нагруженных даунорубицином эритроцитов продемонстрирована на мышиных моделях. 8. Введение эритроцитов, нагруженных даунорубицином и доксорубицином, больным с лимфопролиферативными заболеваниями приводит к снижению пиковых концентраций, увеличению времени циркуляции и увеличению площади под концентрационной кривой для этих антибиотиков по сравнению с введением их стандартной формы (раствора). 9. При введении эритроцитарных форм даунорубицина и доксорубицина пациентам токсические эффекты оказываются менее выраженными, по сравнению со стандартной формой (раствором) этих антибиотиков, что открывает возможности для лечения пациентов с плохой переносимостью антрациклиновых антибиотиков, а также для повышения терапевтической дозы антибиотиков. 23 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Жаботинский А.М., Пичугин, А.В. (1985) Проницаемость человеческих эритроцитов для аспарагина. Биохимия, 50 (№ 10), 1733-1737. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Жаботинский А.М., Пичугин А.В., Синауридзе Е.И. (1989) Регистрация АТФ в эритроцитах с помощью введенной в клетки люциферазы. Известия академии наук СССР. Серия биологическая, № 6, 813-821. Аграненко В.А., Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Кияткин А.Б., Жаботинский А.М., Маркова Н.А., Синауридзе Е.И. (1990) Способ консервирования фармакоцитов с включенной L-аспарагиназой: А. с. № 1777887 (СССР). Заявка № 4856882. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Костына М.А., Лисовская И.Л. (1991) Способ определения деформируемости эритроцитов и устройство для его осуществления: Патент РФ № 2052194 (РФ). Заявка № 5014940. Vitvitsky V.M., Ataullakhanov F.I., Sinauridze E.I. (1992) ATP monitoring in human red blood cells with luciferase introduced intracellularly. Advances in experimental medicine and biology, 326, 149-156. Sinauridze E.I., Vitvitsky V.M., Pichugin A.V., Zhabotinsky A.M., Ataullakhanov F.I. (1992) A new chemotherapeutic agent: L-asparaginase entrapped in red blood cells. Advances in experimental medicine and biology, 326, 203-206. Ataullakhanov F.I., Vitvitsky V.M., Kovaleva V.L., Mironova S.B. (1992) Rubomycin loaded erythrocytes in the treatment of mouse tumor P388. Advances in experimental medicine and biology, 326, 209-213. Атауллаханов Ф.И., Баташева Т.В., Витвицкий В.М., Комарова С.В. (1993) Влияние обработки глютаровым альдегидом на выход рубомицина и гемоглобина из нагруженных рубомицином мышиных эритроцитов. Биотехнология, № 2, 40-43. Лисовская И.Л., Витвицкий В.М., Атауллаханов Ф.И., Волкова Р.И., Кульман Р.А., Гончаров И.Б., Аграненко В.А. (1993) Фильтрационное исследование деформируемости эритроцитов. Гематология и трансфузиология, 38 (№ 2), 12-15. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий В.М., Лисовская И.Л., Тужилова Е.Г. (1994) Анализ геометрических параметров и механических свойств эритроцитов методом фильтрации через мембранные ядерные фильтры. I. Математическая модель. Биофизика, 39 (№ 4), 672-680. Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И., Тужилова Е.Г., Витвицкий В.М. (1994) Анализ геометрических параметров и механических свойств 24 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. эритроцитов методом фильтрации через мембранные ядерные фильтры. II. Экспериментальная проверка математической модели. Биофизика, 39 (№ 5):864-871. Ataullakhanov F.I., Kulikova E.V., Vitvitsky V.M. (1994) Doxorubicin binding by human erythrocytes. Advances in the biosciences, 92, 163-168. Ataullakhanov F.I., Batasheva T.V., Bukhman V.M., Komarova S.V., Oreshkina T.D., Vitvitsky V.M. (1994) Treatment of Rausher virus induced murine erythroblastic leukemia with rubomycin loaded erythrocytes. Advances in the biosciences, 92, 177-183. Атауллаханов Ф.И., Баташева Т.В., Витвицкий В.М. (1994) Влияние температуры, концентрации даунорубицина и гематокрита суспензии на связывание даунорубицина эритроцитами человека. Антибиотики и химиотерапия, 39 (№ 9-10), 26-29. Ataullakhanov F.I., Kulikova E.V., Vitvitsky V.M. (1996) Reversible binding of anthracycline antibiotics to erythrocytes treated with glutaraldehyde. Biotechnology and applied biochemistry, 24, 241-244. Ataullakhanov F.I., Kulikova E.V., Vitvitsky V.M. (1997) Binding of daunorubicin and doxorubicin to erythrocytes treated with glutaraldehyde. In: Erythrocytes as drug carriers in medicine, U. Sprandel and J.L. Way (eds.) Plenum Press: New York, pp. 143-148. Ataullakhanov F. I., Isaev V. G., Kohno A.V., Kulikova E. V., Parovichnikova E. N., Savchenko V. G., Vitvitsky V.M. (1997) Pharmacokinetics of doxorubicin in patients with lymphoproliferative disorders after infusion of doxorubicin-loaded erythrocytes. In: Erythrocytes as drug carriers in medicine, U. Sprandel and J.L. Way (eds.) Plenum Press: New York, pp. 137-142. Куликова Е.В., Витвицкий В.М., Кохно А.В., Исаев В.Г., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г., Атауллаханов Ф.И. (1998) Введение эритроцитов, нагруженных доксорубицином, больным с лимфопролиферативными заболеваниями. Гематология и трансфузиология, 43 (№ 4), 26-29. Скороход А.А., Витвицкий В.М., Кульман Р.А., Атауллаханов Ф.И. (1999) Повреждающее воздействие рубомицина и доксорубицина на эритроциты человека in vitro. Вопросы онкологии, 45 (№ 4), 374-379. Исаев В.Г., Гармаева Т.Ц., Скороход А.А., Паровичникова Е.Н., Тюрина Н.Г., Кучер Р.А., Витвицкий В.М., Атауллаханов Ф.И., Савченко В.Г. (1999) Применение иммобилизованных форм даунорубицина у больных острыми лейкозами. Терапевтический архив, 71 (№ 10), 32-37. Vitvitsky V.M. (2002) Erytrocytes as carriers of anthracycline antibiotics in vitro and in vivo. In Erythrocyte engineering for grug delivery and targeting, Magnani M. (ed.) Eurekah.com/Landes Bioscience:Georgetown, pp. 99-108. 25 22. 23. 24. 25. 26. Skorokhod O.A., Garmaeva T.Ts., Vitvitsky V.M., Isaev V.G., Parovichnikova E.N., Savchenko V.G., Ataullakhanov F.I. (2004) Pharmacokinetics of erythrocyte-bound daunorubicin in patients with acute leukemia. Medical science monitor, 10, PI55-PI64. Сарбаш В.И., Тихонова А.Г., Вуймо Т.А., Дербов А.Л., Александрович Ю.Г., Бутылин А.А., Витвицкий В.М., Атауллаханов Ф.И. (2007) Эритроциты – носители лекарственных препаратов. Российский химический журнал, 51 (№ 1), 143-149. Skorokhod O., Kulikova E.V., Galkina N.M., Medvedev P.V., Zybunova E.E., Vitvitsky V.M., Pivnik A.V., Ataullakhanov F.I. (2007) Doxorubicin pharmacokinetics in lymphoma patients treated with doxorubicin-loaded eythrocytes. Haematologica, 92, 570-571. Атауллаханов Ф.И., Бутылин А.А., Витвицкий В.М., Лисовская И.Л., Мартынов М.В., Мовшев Б.Е., Молодцов М.И., Пантелеев М.А., Сарбаш В.И., Синауридзе Е.И., Шурхина Е.С. (2008) Физическая биохимия крови: от описания к пониманию. Гематология и трансфузиология, № 5, 42-49. Godfrin Y., Horand F., Franco R., Dufour E., Kosenko E., Bax B.E., Banz A., Skorokhod O.A., Lanao J. M., Vitvitsky V., Sinauridze E., Bourgeaux V., Gunter K.C. (2012) International seminar on the red blood cells as vehicles for drugs. Expert opinion on biological therapy, 12, 127-133. 26
