Исследование динамики формирования и механизмов регуляции сборки-разборки ядерных и
advertisement
Исследование динамики формирования и механизмов регуляции сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в раннем эмбриогенезе Drosophila melanogaster. Губанова Наталья Владимировна руководитель Киселева Елена Владимировна • Лаборатория морфологии и функций клеточных структур Структурная организация ядерных пор Последовательные этапы сборки ядерных пор in vitro и in vivo (Allen et al., 2000) (Goldberg et al., 1997; Kiseleva et al., 2001) Цитоплазматические и ядерные поры проявляют сходство и различие в строении Ядерные поры в ядерной оболочке ооцита лягушки Цитоплазматические поры (стрелки) в пористых пластинках ооцита лягушки ПЭМ ПЭM Поперечный срез Со стороны цитоплазмы СЭM ПЭM Баскет структуры Продольный срез Со стороны ядра СЭМ ПЭM -просвечивающая ЭМ, СЭМ -сканирующая ЭМ (Морозова К.Н., Киселева Е.В., 2004 ) Схема развития эмбриона Drosophila melanogaster на стадии синцитиальной бластодермы (от момента оплодотворения до бластулы – 2,5 часа) Цель: изучить регуляцию митотической реорганизации ядерных и цитоплазматических пор и их возможное функциональное взаимодействие в эмбрионах дрозофилы на стадии синцитиальной бластодермы Задачи : 1. Провести электронно-микроскопический анализ ультраструктурной динамики ядерной оболочки и пористых пластинок на разных стадиях митоза синцитиальных эмбрионов Drosophila melanogaster линии Canton S 2. С помощью морфометрического анализа оценить количество ядерных и цитоплазматических пор на разных стадиях синцитиального развития дрозофилы. 3. Провести количественную оценку уровня отдельных нуклеопоринов на разных стадиях синцитиальной бластодермы. 4. Изучить распределение нуклеопоринов в мембранной, ядерной и цитоплазматической фракциях синцитиальных эмбрионов дрозофилы. 5. Определить, как влияет на разборку ядерных и цитоплазматических пор инактивация митотической киназы cdk1, вызываемая: - инъекцией циклогексимида в синцитиальные эмбрионы Drosophila melanogaster линии Canton S; - низким уровнем циклинов в png мутантах Drosophila melanogaster линия png172; - нарушением функций cdk1 в термочувствительных мутантах Drosophila melanogaster линии cdk1ts (A171T). 6. Исследовать влияние ингибирования фосфатаз РР1 и РР2 ( субстрат специфичных антагонистов митотической киназы cdk1), на процесс сборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах Drosophila melanogaster линия Canton S. 7. Определить влияние малой ГТФ-азы Ran на процесс сборки ядерных и цитоплазматических пор. Схема развития эмбриона Drosophila melanogaster на стадии синцитиальной бластодермы (от момента оплодотворения до бластулы – 2,5 часа) Схема полузакрытого митоза бластодермальных ядер в синцитиальных эмбрионах дрозофилы (Foe, Alberts, 1983) Ультраструктура цитоплазматических и ядерных пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы Пористые пластинки, содержащие цитоплазматические поры Ядерная оболочка с ядерными порами Ядерные поры имеют ассиметричные периферические отделы, а периферические отделы цитоплазматических пор сходны по морфологии Количественная динамика ядерных и цитоплазматических пор в эмбрионах на разных стадиях синцитиального развития D. melanogaster (Canton S) 21,2 20 миллионы количество пор 25 15 10 5 9,6 7,7 5,9 Цитоплазматические поры 7,4 Ядерные поры 5,7 0,37 2,7 0 7-8 стад. 11 стад. 13 стад. 14Бстад. Нуклеопорины, запасенные в цитоплазматических порах, не могут обеспечить достаточный запас белков, необходимый для сборки новых пор в делящихся ядрах. Относительное количество семи нуклеопоринов в эмбрионах дрозофилы на разных стадиях эмбрионального развития Относительное количество нуклеопоринов в эмбрионе не изменяется в процессе эмбрионального развития нуклеопорины контроль цитозоль Клеточная бластодерма мембраны цитозоль мембраны ядра цитозоль мембраны ядра Эмбрионы 1-13 стадии Эмбрионы 10-14 стадии ядра Синцитиальная бластодерма Распределение нуклеопоринов по ядерной, мембранной и цитоплазматической фракциям, выделенным из синцитиальных и бластодермальных эмбрионов Gp210 (ЭПР/ядра) гистон Н3 (ядра/цитозоль) альфа-тубулин(цитозоль) p270 p205 p150 Nup88 p67 Nup58 В синцитиальном эмбрионе основное количество нуклеопоринов находится в цитозоле Электрофоретическая подвижность белка р150 из цитозоля снижена и восстанавливается после обработки щелочной фосфатазой цитозоль мембраны цитозоль мембраны Эмбрионы 10-14 стадии ядра цитозоль мембраны ядра Эмбрионы 1-13 стадии Клеточная бластодерма ядра Синцитиальная бластодерма р 150 р 150 из мембранной фракции р 150 из цитозоля, инкубированный в отсутствии щелочной фосфатазы р 150 р150 из цитозоля р 150 из цитозоля, после обработки щелочной фосфатазой Можно предположить, что нуклеопорины в цитозоле синцитиального эмбриона фосфорилированы Морфология ядерной оболочки бластодермальных ядер и пористых пластинок, расположенных рядом с ними, на стадии профазы и метафазы Пористые пластинки Метафаза Профаза Ядерная оболочка Ядерные и цитоплазматические поры синхронно разбираются в процессе митоза Морфология ядерной оболочки бластодермальных ядер и пористых пластинок, расположенных рядом с ними, на стадии телофазы Ядерные и цитоплазматические поры синхронно собираются на стадии телофазы Морфология оболочки желточных ядер и расположенных вблизи них пористых пластинок на стадии метафазы Поры в оболочке желточных ядер и цитоплазматические поры в центре эмбриона, частично разбираются в метафазе Морфология пористых пластинок и их расположение в эмбрионе на разных стадиях синцитиального развития В процессе синцитиального развития происходит увеличение размеров пористых пластинок и изменение их локализации Циклин зависимая регуляция активности митотической киназы cdk1 Сборка веретена Циклин В cdk1 Y Циклин В cdk1 T P Циклин В Конденсация хромосом cdk1 Y T P P Y T Фосфорилирование нуклеопоринов, разборка ядерной оболочки P Деградация циклина Циклин В cdk1 Y T Y Циклин В cdk1 cdk1 Синтез циклина T Y T (модифицировано, из лекции Л.В.Омельянчука) Влияние инактивации cdk1,вызываемой инъекцией циклогексимида, на разборку ядерных и цитоплазматических пор Инъекция циклогесимида в синцитиальные эмбрионы дрозофилы ингибирует разборку ядерных и цитоплазматических пор Восстановление активности cdk1, при одновременной инъекции циклогексимида и недеградируемой формы циклина В (GST циклин В), на разборку ядерных и цитоплазматических пор Цитоплазматические поры разбираются при одновременной инъекции циклогексимида и недеградируемой формы циклина В (GST циклин В) Влияние инактивации и активации cdk1на сборку цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы 7,73 количество пор миллионы 9 8 7 6 5 4 3 2 1,22 0,41 1 0 1 буфер 2 циклогексимид (инактивация cdk1) Циклогексимид 3 + GST циклин В (активация cdk1) Инъекция циклогексимида в синцитиальные эмбрионы вызывает увеличение количества цитоплазматических пор Влияние снижения уровня митотических циклинов в png мутантах на сборку ядерных и цитоплазматических пор 16 количество пор миллионы 14 12,1 12 10 8 6 4 0,73 2 0 buf. inj. Инъекция буфера Инъекция cycl.B inj. GST циклина В В эмбрионах png мутантов, собираются гигантские стопки пористых пластинок. Инъекция GST-циклина В вызывает разборку ядерных и цитоплазматических пор. Влияние инактивации cdk1 в термочувствительных мутантах cdk1ts количество пор миллионы миллионы 6 4,66 4,66 5 4 3 2 0,86 0 0,86 0,87 1 0 Cdk1ts при 200С Cdk1ts при 300С Canton S при 300С Инактивация cdk1 в термочувствительных мутантах cdk1ts вызывает сборку ядерных и цитоплазматических пор Инъекция окадаевой кислоты - специфического ингибитора фосфатаз РР1 и РР2А - блокирует сборку ядерных и цитоплазматических пор Сборка/разборка ядерных и цитоплазматических пор в эмбрионе на стадии синцитиальной бластодермы (окраска пор с помощью WGA-FITC) Прижизненная конфокальная микроскопия Снимки эмбриона после инъекции окадаевой кислоты и WGA Модель регуляции митотической реорганизации ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы Дефосфорилированные нуклеопорины в составе собранной ядерной поры Фосфорилированные нуклеопорины или их комплексы Фрагмент мембраны Ядерная оболочка Cборка/разборка ядерных, а также цитоплазматических пор, в синцитиальных эмбрионах дрозофилы регулируется динамическим равновесием между действием митотической киназы cdk1 и действием фосфатаз, чувствительных к окадаевой кислоте. Влияние малой ГТФ-азы Ran на сборку ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы В опытах in vitro, показано, что RanГТФ необходим для сборки ядерных пор (Hughes et al., 1998 ) Инъекция мутантной формы малой ГТФ-азы Ran (RanT24N) с последующей инъекцией циклогексимида, не влияет на сборку цитоплазматических пор, но ингибирует формирование ядерной оболочки и сборку ядерных пор Выводы 1. Впервые установлено, что цитоплазматические поры в синцитиальных эмбрионах дрозофилы содержат лишь небольшую часть нуклеопоринов, и не играют существенной роли в сборке ядерных пор. При этом основная часть белков пор присутствует в растворенном виде в цитозоле. 2. Обнаружено, что митотическая киназа cdk1 и циклин В регулируют процесс разборки ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. 3. Установлено, что сборка ядерных и цитоплазматических пор регулируется фосфатазами и ингибируется окадаевой кислотой, блокирующей действие этих ферментов. Предложена модель митотической реорганизации ядерных и цитоплазматических пор в синцитиальных эмбрионах дрозофилы. 4. Показано, что активность cdk1 снижена в центральной области синцитиальных эмбрионов, что, возможно, вызывает полиплоидизацию желточных ядер. 5. Продемонстрировано, что малая ГТФ-аза Ran участвует в формировании ядерной оболочки и ядерных пор и не оказывает влияние на сборку цитоплазматических пор. Это предполагает существование отличий в механизмах формирования этих структур. Благодарность Автор выражает благодарность научному руководителю работы Е.В.Киселевой, а также Е.А.Онищенко за проведенные молекулярно-биологические исследования и выполнение микроинъекций в эмбрионы дрозофилы.
