1 003786 2 Область изобретения

1
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к соединению N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]
акриламиду, которое является необратимым
ингибитором тирозинкиназ. Изобретение также
относится к способу лечения рака, атеросклероза, рестеноза, эндометриоза и псориаза с использованием
соединения
N-[4-(3-хлор-4фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида и к фармацевтической композиции, содержащей соединение N[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид.
Предпосылки создания изобретения
Рак рассматривают как поражение внутриклеточной сигнальной системы или механизма
передачи сигнала. Клетки получают приказы от
многих внеклеточных источников, указывающие им либо пролиферировать, либо не пролиферировать. Целью системы передачи сигнала
является прием этих и других сигналов на поверхности клетки, перевод их внутрь клетки и
затем передача сигналов на ядро, цитоскелет, а
также транспорт и обеспечение синтеза белка.
В самом общем случае причиной рака являются либо серьезные дефекты в этих белках,
когда они мутированы, либо нарушения в регуляции количества белка в клетке, приводящие к
тому, что он образуется в избыточных или недостаточных количествах. Наиболее часто
встречаются ключевые повреждения в клетке,
которые ведут к такому состоянию, при котором
ядро клетки получает сигнал к пролиферации,
когда этот сигнал в действительности отсутствует. Это может осуществляться через множество различных механизмов. Иногда клетка может
начать продуцировать аутентичный фактор роста для своих собственных рецепторов, когда
этого не следует делать, это так называемый
механизм аутокринной петли. Мутации клеточных поверхностных рецепторов, которые обычно передают сигнал внутрь клетки через тирозинкиназы, могут приводить к активации киназы в отсутствии лиганда и прохождению сигнала, которого нет в действительности. Альтернативно, многие поверхностные киназы могут
быть сильно экспрессированы на поверхности
клетки, что приводит к несоответственно сильному отклику на слабый сигнал. Внутри клетки
имеется много уровней, на которых мутация или
сильная экспрессия могут привести к такому же
ложному сигналу, возникающему в клетке, а
также имеется много других видов сигнальных
дефектов, вызывающих рак. Настоящее изобретение относится к раковым заболеваниям, которые запускаются тремя уже описанными механизмами и которые вовлекают клеточные поверхностные рецепторы эпидермального фактора роста рецептора семейства тирозинкиназы
(EGFR). Это семейство состоит из EGF рецептора (также известного как erbB1), erbB2 рецеп-
003786
2
тора и составляющего его активного онкопротеинового мутанта Neu, erbВ3 рецептора и
erbВ4 рецептора. Кроме того, другие биологические процессы, возбуждаемые членами семейства EGF рецепторов, также могут лечиться
соединениями по изобретению, описанными
ниже.
EGFR имеет два важнейших лиганда - эпидермальный фактор роста (EGF) и трансформирующий фактор роста α (TGFα). Кажется, что
рецепторы имеют только второстепенные функции у взрослых людей, но они, несомненно, вовлечены в протекание большей части всех раковых заболеваний, в особенности рака ободочной
кишки и рака молочной железы. Близкородственные рецепторы erbB2 (HER2), erbВ3 (HER3)
и erbB4 (HER4) в качестве главных лигандов
имеют семейство Heregulins, причем недвусмысленно доказано, что сильная экспрессия и
мутация рецептора является главным фактором
риска при плохом прогнозе рака молочной железы. Кроме того, было показано, что все четыре члена этого семейства рецепторов могут образовывать гетеродимерные сигнальные комплексы с другими членами семейства и что это
может привести к синергетической трансформирующей способности, если более одного члена семейства сильно экспрессировано на злокачественное развитие. Было показано, что сильная экспрессия более чем одного члена семейства является относительно общим признаком при
злокачественных заболеваниях человека.
Кроме рака, рестеноз также является болезнью, при которой протекает нежелательная
клеточная пролиферация. Рестеноз включает
пролиферацию васкулярных гладких мускульных клеток. Рестеноз является главной клинической проблемой, связанной с коронарной ангиопластикой и другими медицинскими процедурами. Рестеноз проявляется, в основном, в течение 0-6 месяцев примерно у 30-60% пациентов,
которые подверглись катеторной ангиопластике
для очистки закупоренных коронарных артерий
при попытке вылечить болезнь сердца, обусловленную закупоркой артерий. Появляющийся в
результате рестеноз является причиной значительной заболеваемости пациентов и роста расходов на здравоохранение.
Развитие рестеноза инициируется повреждением кровеносного сосуда, включая артерии и
вены, с последующим высвобождением тромбогенных, вазоактивных и митогенных факторов.
Повреждение эндотелиальных и глубоких сосудов ведет к агрегации тромбоцитов, формированию тромба, воспалению и активации макрофагов и гладких мускульных клеток. Эти события
вызывают выработку и высвобождение факторов роста и цитокинез, которые, в свою очередь,
могут способствовать их собственному синтезу
и высвобождать клетки-мишени. Таким образом, инициируется самовозобновляющийся
процесс, вовлекающий факторы роста, такие как
3
EGF, тромбоцитарный фактор роста (PDGF) или
фактор роста фибробластов (FGFs). Следовательно, было бы полезно иметь необратимые
ингибиторы путей передачи сигнала, особенно
таких тирозинкиназ, как EGF, PDGF, FGF или
src тирозинкиназы.
В настоящее время нет хорошего способа
лечения пролиферативного кожного заболевания псориаза. Его часто лечат с помощью противоопухолевых агентов, таких как метотрексат,
который дает очень серьезные побочные эффекты, и не очень эффективен в предельно допустимых по токсичности дозах, которые могут
использоваться. С тех пор как у 50% трансгенных мышей, которым ввели TGFα, развился
псориаз, существует уверенность, что TGFα
является главным фактором роста, вызывающим
псориаз. Это предполагает, что подходящий
ингибитор передачи сигналов EGFR может быть
использован в качестве противопсориазного
агента, предпочтительно, но не обязательно,
путем местного применения.
Выгода от необратимых ингибиторов тирозинкиназы особенно очевидна при сравнении
с обратимыми ингибиторами, поскольку необратимые ингибиторы могут быть использованы
в пролонгированном подавлении тирозинкиназы, ограниченном только обычным темпом ресинтеза рецептора, также называемым оборачиваемостью.
Информация о роли src тирозинкиназ в
биологических процессах, связанных с раком и
рестенозом, может быть найдена в следующих
документах, которые включены здесь в виде
ссылки.
Бенжамин К.У. и Джон Д.А. Тромбоцитарный фактор роста, стимулирующий фактор роста рецептора, связывающего ассоциацию протеина-2 с src в васкулярных гладких мышечных
клетках (Benjamin C.W. and Jones D.A, PlateletDerived Growth Factor Stimulates Growth Factor
Receptor Binding Protein-2 Association With Src
In Vascular Smooth Muscle Cells, JBC, 1994;
269:30911-30916).
Коваленко М. и др. Селективный тромбоцитарный фактор роста рецептора киназы - блокатор обратной цис-трансформации (Kovalenko
M., et al., Selective Platelet-Derived Growth Factor
Receptor
Kinase
Blockers
Reverse
Cistransformation, Cancer Res, 1994; 54:6106-6114).
Шварц Р.С. и др. Пересмотр хода рестеноза: Альтернативное предложение для клеточных
механизмов (Schwartz R.S., et al., The Restenosis
Paradigm Revisted: An Alternative Proposal for
Cellular Mechanisms, J Am Coll Cardiol 1992;
20:1284-1293).
Либби П. и др. Каскадная модель рестеноза - особый случай протекания атеросклероза
(Libby P., et al., Cascade Model for Restenosis - A
Special Case of Atherosclerosis Progression, Circulation, 1992; 86:47-52).
003786
4
Дополнительная информация о роли EGF
тирозинкиназ в биологических процессах, связанных с раком и рестенозом, может быть найдена в следующем документе, который здесь
приведен в виде ссылки.
Джонатан Блэй и Морли Д. Холленберг.
Гетерологичная регуляция функции EGF рецептора в культивированных артериальных гладких
мышечных клетках (Jonathan Blay and Morley D.
Hollenberg, Heterologous Regulation Of EGF Receptor Function In Cultured Aortic Smooth Muscle
Cells, Eur J Pharmacol, Mol Pharmacol Sect, 1989;
172(1): 1-7).
Информация о том, что антитела EGF или
EGFR проявляют in vivo противоопухолевую
активность, может быть найдена в следующих
документах, которые здесь включены в виде
ссылки.
Моджтахеди X., Экклс С., Бокс Г., Стайлс
Дж., Дин К. Иммунотерапия человеческих опухолевых ксенотрансплантатов, сильно экспрессирующих EGF рецептор, крысиными антителами, которые блокируют взаимодействие фактор роста-рецептор (Modjtahedi H., Eccles S.,
Box G., Styles J., Dean C. Immunotherapy Of Human Tumour Xenografts Overexpressing The EGF
Receptor With Rat Antibodies That Block Growth
Factor-Receptor Interaction, Br J Cancer, 1993;
67:254-261).
Курачи X., Моришиге К.И., Амемия К.,
Адачи X., Хирота К., Мияке А., Танизава О.
Важность
преобразования
фактор
роста
α/эпидермальный фактор роста рецептора аутокринного механизма роста in vivo на линии
раковых клеток яичников (Kurachi H., Morishige
K.I., Amemiya К., Adachi H., Hirota K., Miyake
A., Tanizawa O. Importance Of Transforming
Growth Factor α/Epidermal Growth Factor Receptor Autocrine Growth Mechanism In An Ovarian
Cancer Cell Line In Vivo, Cancer Res, 1991;
51:5956-5959).
Масуи Х., Морояма Т., Мендельсон Дж.
Механизм противоопухолевой активности у
мышей для антиэпидермального фактора роста
рецептора моноклональных антител различных
изотипов (Masui H., Moroyama Т., Mendelsohn J.
Mechanism Of Antitumor Activity In Mice For
Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies With Different Isotypes, Cancer
Res, 1986; 46:5592-5598).
Родек Ю., Херлин М., Херлин Д., Молтофф К., Аткинсон Б., Варелло М., Степлевски
З., Копровски X. Модуляция роста опухоли моноклональным антителом рецептора эпидермального фактора роста: иммунологически опосредованные
и
эффекторные
клеточнонезависимые эффекты (Rodeck U., Herlyn M.,
Herlyn D., Molthoff С., Atkinson В., Varello M.,
Steplewski Z., Koprowski H. Tumor Growth
Modulation By A Monoclonal Antibody To The
Epidermal Growth Factor Receptor: Immunologi-
5
cally Mediated And Effector Cell-Independent Effects, Cancer Res, 1987; 47:3692-3696).
Гуан E., Зоу Т., Ванг Дж., Хуанг П., Танг
В., Зао М., Чен Й., Сун Й. Торможение роста
человеческого носоглоточного рака у атимических мышей с помощью моноклональных антител рецептора антиэпидермального фактора
роста (Guan E., Zhou Т., Wang J., Huang P., Tang
W., Zhao M., Chen Y., Sun Y. Growth Inhibition
Of Human Nasopharyngeal Carcinoma In Athymic
Mice By Anti-Epidermal Growth Factor Receptor
Monoclonal Antibodies, Internal J Cell Clon, 1989;
7:242-256).
Масуи X., Кавамото Т., Сато Дж. Д., Волф
Б., Сато Г., Мендельсон Дж. Торможение роста
человеческих опухолевых клеток у атимических
мышей с помощью моноклональных антител
рецептора антиэпидермального фактора роста
(Masui H., Kawamoto Т., Sato J.D., Wolf В., Sato
G., Mendelsohn J. Growth Inhibition Of Human
Tumor Cells In Athymic Mice By Anti-Epidermal
Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies,
Cancer Res, 1984; 44:1002-1007).
Кроме того, в следующих документах описана противоопухолевая активность ингибиторов белка тирозинкиназы. Документы включены
здесь в виде ссылки.
Бачданджер Е., Тринкс Ю., Метт X., Риджинасс Ю., Мюллер М., Майер Т., МакГлинн Е.,
Пинна Л.А., Трекслер П., Лидон Н.Б. 4,5Дианилинфталимид: ингибитор белка тирозинкиназы, селективный для эпидермального фактора роста рецептора пути передачи сигнала и
обладающий in vivo сильной противоопухолевой активностью (Buchdunger E., Trinks U., Mett
H., Regenass U., Muller M., Meyer Т., McGlynn
E., Pinna L.A., Traxler P., Lydon N.B. 4,5Dianilinophthalimide: A Protein Tyrosine Kinase
Inhibitor With Selectivity For The Epidermal
Growth Factor Receptor Signal Transduction Pathway And Potent In Vivo Antitumor Activity, Proc
Natl Acad Sci USA, 1994; 91:2334-2338).
Бачданджер Е., Метт X., Тринкс Ю., Риджинасс Ю., Мюллер М., Майер Т., Бейлштейн
П., Вирц Б., Шнейдер П., Трекслер П., Лидон
Н.Б. 4,5-Бис(4-фторанилин)фталимид: селективный ингибитор эпидермального фактора
роста рецептора пути трансдукции сигнала с
высокой in vivo противоопухолевой активностью (Buchdunger E., Mett H., Trinks U., Regenass
U., Muller M., Meyer Т., Beilstein P., Wirz В.,
Schneider P., Traxler P., Lydon N. 4,5-Bis(4FluoroaniIino)Phthalimide: A Selective Inhibitor Of
The Epidermal Growth Factor Receptor Signal
Transduction Pathway With Potent In Vivo Mdd
Antitumor Activity, Clinical Cancer Research,
1995; 1:813-821).
Соединения, являющиеся обратимыми ингибиторами тирозинкиназ, описаны в патентах
US 5457105, 5475001 и 5409930 и публикациях
РСТ WO 95/19774 и WO 95/19970. В них описано соединение, которое имеет структуру, отли-
003786
6
чающуюся от ингибиторов тирозинкиназы, описанных в вышеуказанных документах, и является необратимым ингибитором тирозинкиназ.
В заявке PCT/US 97/05778 (публикационный номер WO 97/38983), которая включена
здесь в виде ссылки, описаны соединения, которые являются необратимыми ингибиторами тирозинкиназ.
Общая формула I, заявленная в заявке
РСТ, охватывает соединение N-[4-(3-хлор-4фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид (здесь «соединение I»), но соединение I специально не описано
в заявке РСТ.
Соединение I имеет следующую химическую структуру
Соединение I
В заявке РСТ в примере 21 описывается
соединение N-[4-[(3-бромфенил)амино]-7-[3-(4морфолино)пропокси]хинозолин-6-ил]акриламид, которое имеет следующую химическую
структуру
Пример 21
Соединение I отличается от примера 21
заместителями фенильного кольца, которое
присоединено к группе хинолина через атом
азота. Фенильное кольцо соединения I замещено
в положении 3 хлором и в положении 4 фтором.
В отличие от него фенильное кольцо соединения в примере 21 по заявке РСТ (здесь пример
21) замещено в положении 3 бромом. Несмотря
на то, что эти два соединения имеют похожую
структуру, соединение I проявляет удивительные и неожиданные свойства in vivo, по сравнению с примером 21 заявки РСТ.
Еще более удивительно и неожиданно, что
соединение I и пример 21 показывают в определенных тестах похожую активность in vitro, но
проявляют значительное различие активности in
vivo.
Краткое изложение изобретения
Настоящее изобретение предлагает соединение
N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид или его фармацевтически приемлемые
соли.
Также предложена фармацевтически приемлемая композиция, содержащая N-[4-(3-хлор-
7
4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид.
Также предложен способ лечения рака,
включающий введение пациенту, имеющему
рак, терапевтически эффективного количества
N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.
В предпочтительном варианте осуществления способа лечения рака рак является раком
молочной железы.
В другом предпочтительном варианте
осуществления способа лечения рака рак является раком ободочной кишки.
Также предложен способ лечения или предупреждения рестеноза, включающий введение
пациенту, имеющему рестеноз или риск возникновения рестеноза, терапевтически эффективного количества N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]
акриламида.
Также предложен способ необратимого
ингибирования тирозинкиназ, включающий
введение пациенту, нуждающемуся в ингибировании тирозинкиназы, ингибирующего количества
N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.
В предпочтительном варианте осуществления способа необратимого ингибирования
тирозинкиназ тирозинкиназа представляет собой EGFR.
В другом предпочтительном варианте
осуществления способа необратимого ингибирования тирозинкиназ тирозинкиназа представляет собой erbВ2.
В еще одном предпочтительном варианте
осуществления способа необратимого ингибирования тирозинкиназ тирозинкиназа представляет собой erbВ4.
Также предложен способ лечения псориаза, включающий введение пациенту, имеющему
псориаз, терапевтически эффективного количества
N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.
Также предложен способ лечения или предупреждения атеросклероза, включающий введение пациенту, имеющему атеросклероз или
риск возникновения атеросклероза, терапевтически эффективного количества N-[4-(3-хлор-4фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.
Также предложен способ лечения эндометриоза, включающий введение пациенту,
имеющему эндометриоз, терапевтически эффективного количества N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.
Также предложен способ ингибирования
секреции VEGF, включающий введение пациенту, нуждающемуся в ингибировании секреции
VEGF, терапевтически эффективного количест-
003786
8
ва N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.
Также предложен способ ингибирования
фосфорилирования тирозина erbВ3, включающий введение пациенту, нуждающемуся в ингибировании фосфорилирования тирозина erbВ3,
терапевтически эффективного количества N-[4(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламида.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предлагает соединение
N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид или его фармацевтически приемлемые
соли.
Соединение I является необратимым ингибитором тирозинкиназ, особенно EGFR тирозинкиназы. Другие тирозинкиназы, которые
могут ингибироваться соединением I, включают
FGFR, PDGFR, c-src, erbB2 и erbВ4. Терапевтически эффективное количество соединения I
может быть введено пациенту, имеющему рак,
или пациенту, имеющему рестеноз или риск
возникновения рестеноза, или пациенту, имеющему псориаз, атеросклероз или риск возникновения атеросклероза, или эндометриоз. Специалисты в данной области могут легко определить
больных раком, рестенозом, псориазом, атеросклерозом или эндометриозом, и пациентов, у
которых есть риск возникновения рестеноза или
атеросклероза. Например, пациентами с риском
возникновения рестеноза являются пациенты,
подвергнувшиеся ангиопластике, шунтированию или трансплантации. Аналогично, пациенты с риском развития атеросклероза включают
пациентов, которые страдают ожирением, едят
очень жирную пищу, имеют высокий уровень
холестерина или имеют гипертензию. Термин
пациент означает животных, таких как собаки,
коты, коровы, овцы, а также включает людей.
Термин рак включает, но не ограничивается этим, следующие виды рака: рак молочной
железы; рак яичников; рак шейки матки; рак
предстательной железы; рак яичка; рак пищевода; глиобластома; нейробластома; рак желудка;
рак кожи, кератоакантома; рак легкого, плоскоклеточный рак, крупноклеточный рак, аденокарцинома; рак костей; рак ободочной кишки,
аденокарцинома, аденома; рак поджелудочной
железы, аденокарцинома; рак щитовидной железы, фолликулярная карцинома, недифференцированная карцинома, папиллярная карцинома; семинома; меланома; саркома; карцинома
мочевого пузыря; карцинома печени и желчных
протоков; карцинома почки; миелоидные нарушения; лимфатические нарушения, лимфогранулематоз, "волосатые" клетки; рак полости рта
и глотки (оральный), губ, языка, рта, глотки; рак
тонкой кишки; рак ободочной и прямой кишки,
толстой кишки, прямой кишки; рак мозга и центральной нервной системы; и лейкемия.
9
Предпочтительными видами рака, для лечения которых может быть использовано соединение I, являются рак молочной железы, рак
ободочной кишки, рак ободочной и прямой
кишки и рак яичников.
Кроме того, соединение I может быть использовано для лечения пациентов, нуждающихся в ингибировании секреции васкулярного
эндотелиального фактора роста (VEGF). В число пациентов, нуждающихся в ингибировании
секреции VEGF, включены те пациенты, у которых обнаружены рак, диабетическая ретинопатия, ревматоидный артрит, псориаз, рестеноз,
атеросклероз, остеопороз, эндометриоз, люди,
подвергнувшиеся эмбриональной имплантации,
или люди, имеющие другие заболевания, в которых важную роль играют ангиогенез или неоваскуляризация.
Соединение по настоящему изобретению
может быть использовано для ингибирования
фосфорилирования тирозина erbВ. Пациенты,
нуждающиеся в ингибировании фосфорилирования тирозина erbВ - это пациенты, имеющие
или рискующие получить заболевания, упомянутые здесь в связи с ингибированием EGFR и
ингибированием секреции VEGF.
Соединение I может быть введено людям
или животным орально, ректально, парентерально (внутривенно, внутримышечно или подкожно), внутриполостно, внутривагинально,
внутрибрюшинно, внутрипузырно, локально
(порошки, мази или капли) или распылением в
нос или рот. Соединение I может быть введено
само по себе или как часть фармацевтически
приемлемой композиции, содержащей фармацевтически приемлемые наполнители.
Композиции, пригодные для парентеральных инъекций, могут включать физиологически
приемлемые стерильные водные или неводные
растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а
также стерильные порошки для получения стерильных инъецируемых растворов и дисперсий.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или связующих включают воду, этанол, полиолы (пропиленгликоль, полиэтиленглиголь, глицерин и
т.п.), их приемлемые смеси, растительные масла
(такие как оливковое масло) и пригодные для
инъекций органические эфиры, такие как этилолеат. Надлежащее жидкое состояние может
быть поддержано, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае
дисперсий, и путем использования поверхностно-активных веществ.
Эти композиции могут также содержать
вспомогательные вещества, такие как консерванты, увлажнители, эмульгаторы и диспергаторы. Предупредить воздействие микроорганизмов можно с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, таких
как, например, парабены, хлорбутанол, фенол,
003786
10
сорбиновая кислота и т.п. Также может быть
желательно включение изотонических агентов,
например, сахара, хлорида натрия и т.п. Пролонгированная абсорбция инъецируемой фармацевтической формы может быть обеспечена
путем использования веществ, предотвращающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия или желатина.
Твердые лекарственные формы для орального введения включают капсулы, таблетки,
пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых
лекарственных формах активное соединение
смешано, по крайней мере, с одним обычным
инертным наполнителем (или носителем), таким
как цитрат натрия или двухзамещенный фосфат
кальция, или с (а) заполнителями или наполнителями, такими как, например, крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннитол и кремниевая
кислота; (b) связующими, такими как, например,
карбоксиметилцеллюлоза, алигнаты, желатин,
поливинилпироллидон, сахароза и гуммиарабик; (с) увлажнителями, такими как, например,
глицерин; (d) дезинтегрирующими агентами,
такими как, например, агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал,
альгиновая кислота, определенный комплекс
силикатов и карбонат натрия; (е) замедлителями
растворения, такими как, например, парафин; (f)
ускорителями абсорбции, такими как, например,
четвертичные аммониевые соединения; (g) смачивающими веществами, такими как, например,
цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (h)
адсорбентами, такими как, например, каолин и
бентонит; и (i) скользящими веществами, такими как, например, тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия или их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы
могут также включать буферные агенты.
Твердые композиции подобного типа могут также применяться в качестве заполнителей
в мягких и твердых желатиновых капсулах, с
использованием таких наполнителей, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п.
Твердые лекарственные формы, такие как
таблетки, драже, капсулы, пилюли и гранулы
могут быть изготовлены с покрытием или оболочкой, такими как кишечно-растворимое покрытие и другие, хорошо известные в данной
области техники. Они могут содержать контрастные вещества, а также могут включать такие
композиции, что они высвобождают активное
вещество в определенной части кишечного
тракта в замедленном действии. Примерами
герметизирующих композиций, которые могут
использоваться, являются полимерные вещества
и воски. Активное вещество может быть также в
микроинкапсулированной форме, в том числе,
если подходят, с одним или более из вышеперечисленных наполнителей.
11
Жидкие лекарственные формы для орального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Кроме активного соединения
жидкие дозированные формы могут содержать
инертные разбавители, обычно используемые в
данной области, такие как вода или другие растворители, солюбизирующие вещества и эмульгаторы, такие как, например, этиловый спирт,
изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, припиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, в частности хлопковое масло,
масло земляного ореха, масло из зародышей
кукурузы, оливковое масло, касторовое масло и
кунжутное масло, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные
эфиры жирных кислот и сорбита или смеси этих
веществ и т.п.
Кроме таких инертных разбавителей, композиция может также включать вспомогательные вещества, такие как увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие вещества, подсластители, вкусовые добавки и отдушки.
Суспензии, кроме активного соединения,
могут содержать суспендирующие вещества,
такие как, например, этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбитол и
сложные эфиры сорбита, микрокристаллическая
целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит,
агар-агар и трагакант или их смеси и т.п.
Композиции для ректального введения
предпочтительно представляют собой суппозитории, которые могут быть изготовлены путем
смешения соединений по настоящему изобретению с подходящими не раздражающими наполнителями или носителями, такими как масло
какао, полиэтиленгликоль или воск для суппозиториев, которые находятся в твердом состоянии при обычных температурах, но становятся
жидкими при температуре тела и, следовательно, плавятся в прямой кишке или вагинальной
полости и высвобождают активный компонент.
Лекарственные формы для местного введения включают мази, порошки, аэрозоли и
средства для ингаляции. Активный компонент
смешивают в стерильных условиях с физиологически приемлемым носителем и, если требуется, с любыми консервантами, буферными веществами или пропеллентами. Офтальмические
составы, глазные мази, порошки и растворы
также входят в объем настоящего изобретения.
Термины «фармацевтически приемлемые
соли, эфиры, амиды и пролекарства», используемые здесь, относятся к тем солям по карбоксильной группе, солям амнокислотного присоединия, эфирам, амидам и пролекарствам соединения по настоящему изобретению, которые
являются в объеме известных медицинских заключений пригодными для использования в
контакте с тканями пациентов, не имеют чрезмерной токсичности, не вызывают раздражений,
003786
12
аллергических реакций и т.п. и соответственно
обладают приемлемым соотношением выгода/риск и эффективностью при намеченном использовании, а также к цвиттерионным формам,
где это возможно, соединений по изобретению.
Термин «соли» относится к относительно нетоксичным, неорганическим и органическим
кислотно-аддитивным солям соединений по
настоящему изобретению. Эти соли могут быть
получены in situ в ходе конечного выделения и
очистки соединения или путем отдельной реакции очищенного соединения в его свободной
основной форме с подходящей органической
или неорганической кислотой и выделения образовавшейся соли. Указанные соли включают
гидробромиды, гидрохлориды, сульфаты, бисульфаты, нитраты, ацетаты, оксалаты, валераты, олеаты, пальмитаты, стеараты, лаураты, бораты, бензоаты, лактаты, фосфаты, тозилаты,
цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, тартраты, нафтилаты, мезилаты, глюкогептаноаты,
лактобионаты, лаурилсульфонаты и т.п. Они
могут включать катионы щелочных и щелочноземельных металлов, таких как натрий, литий,
калий, кальций, магний и т.п., а также нетоксичные аммониевые, четвертичные аммониевые
катионы и катионы аминов, включая, но не ограничиваясь ими, аммоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин, этиламин и
т.п. (см., например S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 1977; 66:1-9, который включен здесь в качестве ссылки).
Примеры фармацевтически приемлемых
нетоксичных эфиров соединений по настоящему
изобретению включают сложные С1-С6алкиловые эфиры, в которых алкильная группа представляет собой прямую или разветвленную
цепь. Приемлемые эфиры также включают
сложные С5-С7циклоалкиловые эфиры, а также
сложные арилалкиловые эфиры, такие как, но не
только, бензиловый эфир. Предпочтительны
сложные С1-С4алкиловые эфиры. Сложные эфиры соединения по настоящему изобретению
могут быть получены обычными методами.
Примеры фармацевтически приемлемых
нетоксичных амидов соединения по настоящему
изобретению включают амиды, полученные из
аммиака, первичных С1-С6алкиламинов и вторичных C1-С6диалкиламинов, в которых алкильные группы представляют собой прямую
или разветвленную цепь. В случае вторичных
аминов, амины могут быть также в форме 5- или
6-членных гетероциклов, содержащих один
атом азота. Предпочтительны амиды, полученные из аммиака, первичных C1-С3алкиламинов и
вторичных С1-С2диалкиламинов. Амиды соединения по изобретению могут быть получены
обычными методами.
Термин «пролекарство» относится к соединениям, которые быстро трансформируются
in vivo, давая исходное соединение вышеука-
13
занных формул, например, путем гидролиза в
крови. Всестороннее обсуждение этого приведено в Т. Higuchi and V. Stella "Pro-drags as
Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S.
Symposium Series и в Bioreversible Carriers in
Drug Design. Ed Edward B. Roche, American
Pharmaceutical Association and Pergamon Press,
1987, оба источника включены здесь в качестве
ссылки.
Соединение по настоящему изобретению
может быть введено пациенту при уровнях доз в
интервале от примерно 0,1 до примерно 1000 мг
в день. Для среднего взрослого человека,
имеющего вес тела около 70 кг, достаточной
является доза в интервале от около 0,01 до 100
мг на килограмм веса тела в день. Однако используемая индивидуальная доза может варьироваться. Например, доза может зависеть от
ряда факторов, включая потребности пациента,
условия лечения и фармацевтическую активность используемого соединения. Определение
оптимальных доз для конкретного пациента хорошо известно специалистам в данной области.
Соединение по настоящему изобретению
может существовать в несольватированных, а
также в сольватированных формах с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими
как вода, этанол и т.п. В общем, сольватированные формы считаются эквивалентными несольватированным формам для целей настоящего
изобретения.
Подразумевается, что соединение I получают либо синтетически, либо биологически,
например, путем метаболизма.
Следующие примеры иллюстрируют частные варианты осуществления изобретения и
никоим образом не ограничивают описание,
включая формулу изобретения.
Примеры
Соединение I может быть синтезировано
следующим образом.
N-[4-(3-Хлор-4-фторфениламино)-7-(3морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид.
Стадия А. 4-[(3-Хлор-4-фторфенил)амино]-7-фтор-6-нитрохиназолин.
Порошкообразный 4-хлор-7-фтор-6-нитрохиназолин (J. Medm. Chem., 1996; 39:918) (82,77
г, 363,7 ммоль) добавляли порциями в течение
10 мин к механически перемешиваемому раствору 3-хлор-4-фторанилина (53,183 г, 365,3
ммоль) и N,N-диметиланилина (88,5 г, 730
ммоль) в изопропаноле (1,09 л) в токе азота на
ледяной бане. В конце добавления ледяную баню убирали и смесь перемешивали при 25°С в
течение 6 ч. Затем смесь снова охлаждали на
ледяной бане и при перемешивании добавляли
по каплям воду (200 мл), а затем водный раствор Na2CO3 (10% мас./об., 200 мл). Через 10
мин смесь фильтровали на воронке Бюхнера и
твердый остаток промывали разбавленным раствором NaHCO3 (насыщенный/5, 2×100 мл), во-
003786
14
дой (2×100 мл) и изопропанолом (2×100 мл).
Смесь сушили на воздухе, а затем в вакууме над
P2O5 при 75°С в течение 12 ч, получили 4-[(3хлор-4-фторфенил)амино]-7-фтор-6-нитрохиназолин (110,71 г, 90,4%) в виде твердого горчично-желтого вещества.
1
Н ЯМР (ДМСО-d6): δ 10,44 (с, 1Н, NH),
9,51 (д, J=8,0 Гц, 1H, Н-5), 8,67 (с, 1Н, Н-2), 8,07
(дд, J=2,7, 6,8 Гц, 1H, Н-2'), 7,79 (д, J=12,4 Гц,
1Н, Н-8), 7,74 (ддд, J=2,7, 4,2, 9,0 Гц, 1-Н, Н-6'),
7,43 (т, J=9,2 Гц, 1Н, Н-5').
Стадия Б. 4-[(3-Хлор-4-фторфенил)амино]7-[3-(4-морфолино)пропокси]-6-нитрохиназолин.
Раствор триметилсиланолата калия (57,73
г, 0,43 моль) в диметилсульфоксиде (ДМСО)
(150 мл) добавляли по каплям в течение 50 мин
к ярко-желтой кашице 4-[(3-хлор-4-фторфенил)
амино]-7-фтор-6-нитрохиназолина (50,503 г, 150
ммоль) и 3-(4-морфолино)пропан-1-ола (32,67 г,
225 ммоль) в ДМСО (250 мл), энергично перемешивали в токе N2 при температуре водяной
бани 25°С. Немедленно появлялся насыщенный
красный цвет, и в конце добавления реакционная смесь была вязкой смесью насыщенного
красно-черного цвета. Через 6 ч реакционную
смесь медленно выливали на перемешиваемую
смесь лед-вода (4 л), содержащую насыщенный
раствор Na2СО3 (150 мл). После отстаивания в
течение 13 ч оранжево-красную кашицу собирали фильтрованием на воронке Бюхнера. Осадок
промывали разбавленным раствором NaOH
(0,05М, 500 мл; 0,02М, 500 мл), разбавленным
раствором NaHCO3 (насыщенный/5, 500 мл) и
водой (2×500 мл), сушили на воздухе в течение
4 ч, а затем в течение ночи в вакуумном сушильном шкафу при 50°С над P2O5, получили 4[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[3-(4-морфолино)пропокси]-6-нитрохиназолина (62,47 г, 89%
уточненный) в виде твердого яркого оранжевожелтого вещества.
1
Н ЯМР (ДМСО-d6): δ 10,11 (с, 1Н, NH),
9,18 (с, 1Н, Н-5), 8,65 (с, 1Н, Н-2), 8,15 (дд, J=
2,4, 6,8 Гц, 1Н, Н-2'), 7,79 (ддд, J=2,7, 4,3, 9,0 Гц,
1Н, Н-6'), 7,45 (т, J=9,0 Гц, 1Н, Н-5'), 7,44 (с, 1Н,
Н-8), 4,32 (т, J=6,1 Гц, АrOСН2), 3,57 (т, J=4,5
Гц, 4Н, Н-2 морфолино), 2,45 (т, J=6,5 Гц, 2Н,
NCH2), 2,34 (ушир. с. 4Н, Н-3 морфолино), 1,93
(пентет, J=6,5 Гц, 2Н, Н-2 пропокси).
Стадия С. 6-Амино-4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[3-(4-морфолино)пропокси]хиназолин.
Раствор 4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7[3-(4-морфолино)пропокси]-6-нитрохиназолина
(62,9 г, 136,2 ммоль) в тетрагидрофуране (ТГФ)
(1200 мл) гидрировали над никелем Ренея (20 г)
при давлении 50 psi (фунтов на кв.дюйм) и температуре 23°С в течение 17,67 ч. Затем добавили
никель Ренея (20 г) и смесь гидрировали еще
4,33 ч в тех же самых условиях. Реакционную
смесь фильтровали через целит, растворитель
15
отгоняли при пониженном давлении, получили
6-амино-4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[3-(4морфолино)пропокси]хиназолин (57,81 г, 97,6%
уточненный) в виде твердого вещества бледнозеленоватого цвета.
1
Н ЯМР (ДМСО-d6): δ 9,40 (с, 1Н, NH),
8,38 (с, 1Н, Н-2), 8,20 (дд, J=2,5, 7,0 Гц, 1Н, Н2'), 7,79 (ддд, J=2,5, 4,5, 9,0 Гц, 1Н, Н-6'), 7,40 (с,
1Н, Н-5), 7,40 (т, J=9,1 Гц, 1Н, Н-5'), 7,08 (с, 1Н,
Н-8), 5,38 (ушир.с, NH2), 4,19 (т, J=6,1 Гц,
АrOСН2), 3,58 (т, J=4,4 Гц, 4Н, Н-2 морфолино),
2,49 (т, J=7,0 Гц, 2Н, NCH2), 2,36 (ушир.с, 4Н,
Н-3 морфолино), 1,97 (пентет, J=6,5 Гц, 2Н, Н-2
пропокси).
Стадия D. N-[4-(3-Хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6ил]акриламид.
Изобутилхлорформиат (27,2 г, 0,20 моль)
добавляли по каплям в течение 10 мин к раствору акриловой кислоты (14,4 г, 0,20 моль) и триэтиламина (40,48 г, 0,40 моль) в ТГФ (800 мл)
при перемешивании в токе азота при 0°С. Через
10 мин белую кашицу доводили на охлаждающей бане до температуры -25°С и перемешивали в токе азота в течение 20 мин. По каплям в
течение 1,33 ч добавляли 6-амино-4-[(3-хлор-4фторфенил)амино]-7-[3-(4-морфолино)пропокси]хиназолин (43,19 г, 0,100 моль) в ТГФ (500
мл). Охлаждающая баня была отрегулирована
на температуру -20°С, и через 2,33 ч реакционную смесь "гасили" добавлением воды (100 мл)
за один прием. Через 20 мин реакционную смесь
выливали на раздробленный лед (2 кг) и постепенно разбавляли водой (5 л). Смесь отстаивали
16 ч и фильтровали на воронке Бюхнера. Осадок
промывали водой (2x1 л), сушили на воздухе в
течение 18 ч, затем в вакуумном сушильном
шкафу над Р2О5 при 60°С в течение 16 ч, получили
сырой
N-[4-(3-хлор-4-фторфенил)
амино]-7-[3-(4-морфолино)пропокси]хиназолин6-ил]акриламид (35,76 г, 73% не уточненный) в
виде твердого зеленовато-желтого вещества. Из
маточника затем выпадал осадок, который отфильтровывали на воронке Бюхнера, промывали
водой (1 л) и сушили на воздухе в течение 14 ч,
получили сырой продукт (4,73 г, 10% не уточненный) в виде твердого зеленовато-желтого
вещества. Перекристаллизацией этого вещества
из ДМСО извлекли 55% его в виде неполного
гидрата цвета бледно-желтого и хаки, т.пл.
186,5-188,5°С.
Вычислено для С24Н25Н5О3СlF ⋅ 0,85 Н2О:
С, 57,61; Н, 5,37; N, 13,97%.
Найдено: С, 57,51; Н, 5,26; N, 13,88%.
1
Н ЯМР (ДМСО-d6): δ 9,81 (с, 1Н, NH),
9,63 (с, 1Н, NH), 8,87 (с, 1Н. Н-5), 8,54 (с, 1Н, Н2), 8,15 (дд, J=2,5, 7,0 Гц, 1Н, Н-2'), 7,81 (ддд,
J=2,7, 4,4, 9,0 Гц, 1Н, Н-6'), 7,43 (т, J=9,1 Гц, 1Н,
Н-5'), 7,30 (с, 1Н, Н-8), 6,72 (дд, J=10,1, 17,0 Гц,
1Н, Н-2 акрилоил), 6,32 (дд, J=9,0, 17,0 Гц, 1Н,
Н-3 акрилоил), 5,83 (дд, J=1,9, 10,1 Гц, 1Н, Н-3
003786
16
акрилоил), 4,27 (т, J=6,2 Гц, АrOСН2), 3,58 (т,
J=4,4 Гц, 4Н, Н-2 морфолино), 2,48 (т, J=7,1 Гц,
2Н, NСН2), 2,36 (ушир.с, 4Н, Н-3 морфолино),
2,00 (пентет, J=6,5 Гц, 2Н, Н-2 пропокси).
Масс-спектр APCI 489,2 (9), 488,2 (35),
487,2 (26), 486,2 (100).
Соединение примера 21 заявки РСТ номер
PCT/US 97/05778 может быть синтезировано
следующим образом.
Пример 21. N-[4-[(3-Бромфенил)амино]-7[3-(4-морфолино)пропокси]хиназолин-6-ил]
акриламид.
Металлический натрий (27,6 ммоль, 0,63 г)
добавили к раствору 3-морфолинопропан-1-ола
(22,0 ммоль, 3,20 г) в ТГФ (60 мл) в токе N2.
Полученную суспензию перемешивали при
20°С в течение 2 ч и затем с помощью катетера
вводили в раствор 4-[(3-бромфенил)амино]-7фтор-6-нитрохиназолина (J. Med. Chem.,
1996(36):918) (2,0 г, 5,51 ммоль) в ТГФ (50 мл) в
токе азота. Раствор затем кипятили с обратным
холодильником в течение 24 ч, затем разбавляли
водой и экстрагировали EtOAc. Объединенные
органические экстракты сушили над безводным
Na2SO4, концентрировали при пониженном давлении и хроматографировали на оксиде алюминия, меняя элюент с ЕtOАс/гексан (1:1) на
МеОН/СН2Сl2/ЕtOАс (2:3:5), получили 4-[(3бромфенил)амино]-7-[(3-морфолино)пропилокси]-6-нитрохиназолин (1,75 г, 65%) в виде
желтого порошка, т.пл. (МеОН) 216-220°С.
1
Н ЯМР [(CD3)2SO]: δ 10,12 (с, 1Н, NH),
9,24 (с, 1Н, ароматический) 8,69 (с, 1Н, ароматический), 8,19 (т, J=1,8 Гц, 1Н, Н-2'), 7,88 (дт,
JД=7,8 Гц, JТ=1,4 Гц, 1Н, Н-6'), 7,49 (с, 1Н, ароматический), 7,38 (т, J=8,0 Гц, 1Н, Н-5'), 7,34
(дт, JД=8,1 Гц, JT=1,4 Гц, 1Н, Н-4'), 4,35 (т, J= 6,2
Гц, 2Н, СН2СН2СН2О), 3,58 (т, J=4,6 Гц, 4Н, метилен морфолина), 2,45 (т, J=7,0 Гц, 2Н,
NCH2CH2CH2), 2,37 (ушир. с, 4Н, метилен морфолина), 1,94 (квинтет, J=6,6 Гц, 2Н,
СН2СН2СН2).
13
С ЯМР: δ 157,76, 157,26, 153,76, 153,21,
140,32, 138,86, 130,37, 126,38, 124,26, 121,70,
121,13, 120,72, 110,11, 107,88, 67,87, 66,13 (х2),
54,42, 53,28 (х2), 25,30.
Вычислено для C21H22BrN5O4 ⋅ 0,75 Н2О: С,
50,3; Н, 4,7; N, 14,0%.
Найдено: С, 50,3; Н, 4,4; N, 13,8%.
Свежепромытый (1Н HCl, затем дистиллированной водой) порошок железа (12 ммоль,
0,686 г) добавили порциями в кипящий раствор
вышеописанного нитрохиназолина (1,50 г, 3,07
ммоль) в ЕtOН/Н2О (2:1, 80 мл), содержащий
ледяную уксусную кислоту (2,0 мл). Полученную суспензию нагревали до кипения при энергичном перемешивании в течение 20 мин, затем
охлаждали, подщелачивали добавлением концентрированного NH3 и фильтровали через слой
целита. Слой целита промывали EtOH, фильтрат
концентрировали при пониженном давлении,
17
разбавляли водой и экстрагировали EtOAc.
Объединенные органические экстракты сушили
над безводным Na2SO4, концентрировали при
пониженном давлении и хроматографировали
на оксиде алюминия класса III, меняя элюент с
СН2Сl2/ЕtOАс (1:1) на МеОН/ЕtOАс (2:98), получили 6-амино-4-[(3-бромфенил)амино]-7-[(3морфолино)пропилокси]хиназолин (1,08 г, 77%)
в виде бледно-коричневого порошка, т.пл.
(ЕtOAc/гексан) 158-160°С.
1
Н ЯМР [(CD3)2SO], (400 МГц): δ 9,37 (с,
1Н, NH), 8,40 (с, 1Н, ароматический), 8,24 (т, J=
1,9 Гц, 1Н, Н-2'), 7,86 (ддд, J=8,2, 0,8, 1,8 Гц, 1Н,
Н-6'), 7,42 (с, 1Н, ароматический), 7,30 (т, J=8,1
Гц, 1H, Н-5'), 7,21 (ддд, J=8,2, 1,0, 1,9 Гц, 1Н, Н4'), 7,09 (с, 1Н, ароматический), 5.36 (с, 2Н,
NH2), 4,20 (т, J=6.2 Гц, 2Н, СН2СН2СН2О), 3,59
(т, J=4,6 Гц, 4Н, метилен морфолина), 2,50 (т, J=
7,3 Гц, 2Н, NCH2CH2CH2), 2,39 (ушир. с, 4Н,
метилен морфолина), 1,99 (квинтет, J=6,7 Гц,
2Н, СН2СН2СН2).
13
С ЯМР: δ 154,88, 151,94, 150,19, 144,84,
141,94, 138,50, 130,16. 124,66, 123,02, 121,09,
119,65, 110,42, 106,37, 100,81, 66,45, 66,14 (х2),
54,77, 53,29 (х2), 25,50.
Вычислено для C21H24BrN5O2 ⋅ 0,25 Н2О: С,
54,5; Н, 5,3; N, 15,1%.
Найдено: С, 54,6; Н, 5,5; N, 15,0%.
К перемешиваемому раствору вышеописанного 6-аминохиназолина (0,5 г, 1,09 ммоль),
акриловой кислоты (6 моль, 6,54 ммоль, 449
мкл) и Et3N (избыток, 2,0 мл) в ДМФ (20 мл) в
токе азота добавили гидрохлорид 1-(3диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида
(EDCl ⋅ HCl) (3 моль, 3,27 ммоль, 627 мг). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 15 мин, затем доводили до комнатной температуры и перемешивали еще 2 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученный остаток разбавляли насыщенным
NaHCO3 и неоднократно экстрагировали EtOAc.
Объединенные органические экстракты промывали солевым раствором, сушили над безводным Na2SO4 и концентрировали при пониженном давлении. Хроматографировали на оксиде
алюминия класса III, меняя элюент с
ЕtOАс/гексан (9:1) на МеОН/ЕtOАс (2:98), получили N-[4-[(3-бромфенил)амино]-7-[(3-морфолино)пропилокси)хиназолин-6-ил]акриламид
(329 мг, 59%) в виде порошка кремового цвета,
т.пл. (ЕtOАс/Еt2О/гексан) 170-172°С.
1
Н ЯМР [(CD3)2SO]: δ 9,78 (с, 1Н, CONH),
9,62 (с, 1Н, NH), 8,89 (с, 1Н, ароматический),
8,56 (с, 1Н, ароматический), 8,18 (т, J=1,9 Гц,
1Н, Н-2'), 7,88 (ушир.д, J=8,2, Гц, 1Н, Н-6'), 7,34
(т, J=8,1 Гц, 1Н, Н-5'), 7,30 (с, 1Н, ароматический), 7,27 (ддд, J=7,9, 1,4, 0,8 Гц, 1Н, Н-4'), 6,72
(дд, J=17,0, 10,2 Гц, 1Н, СН2СНСО), 6,33 (дд, J=
17,0, 1,9 Гц, 1Н, СН2СНСО), 5,83 (дд, J=10,2, 1,9
Гц, 1Н, СН2СНСО), 4,27 (т, J=6,3 Гц, 2Н,
СН2СН2СН2О), 3,58 (т, J=4,6 Гц, 4Н, метилен
003786
18
морфолина),
2,48
(т,
J=7,1
Гц,
2Н,
NCH2CH2CH2), 2,38 (ушир. с, 4H, метилен морфолина), 1,99 (квинтет, J=6,7 Гц, 2Н,
СН2СН2СН2).
13
С ЯМР: δ 163,49, 156,68, 154,96, 153,92,
149,19, 141,20, 131,58, 130,19, 127,16, 126,95,
125,52, 123,97, 121,03, 120,52, 116,78, 108,80,
107,28, 66,96, 66,14 (х2), 54,54, 53,28 (х2), 25,31.
Вычислено для С24Н26ВrN5О3 ⋅ 0,5 Н2О: С,
55,3; Н, 5,2; N, 13,4%.
Найдено: С, 55,3; Н, 4,9; N, 13,3%.
Сравнительные исследования
Культура ткани.
Клетки человеческого плоскоклеточного
рака А43l и клетки MDA-MB-453 были получены из Американской Коллекции Типовых Культур (American Type Culture Collection, Rockvill,
MD) и хранились в виде монослоев в dMEM
(модифицированная
питательная
среда
Dulbecco)/F12, 50:50 (Gibco/BRl, Bethesda, MD),
содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки выращивали при температуре
37°С в увлажненной атмосфере, содержащей в
воздухе 5% СO2.
Очистка эпидермального фактора роста
рецептора тирозинкиназы.
Человеческий EGF рецептора тирозинкиназы (EGFR) выделяли из клеток человеческого
плоскоклеточного рака A431 следующим способом. Клетки выращивали в среде dMEM/F12
(Gibco/BRL, Betesda, MD), содержащей 10%
эмбриональной телячьей сыворотки. Примерно
109 клеток лизировали в 2 объемах буфера, содержащего 20 мМ Hepes, рН 7,4, 5 мМ EGTA,
1% Triton Х-100, 10% глицерина, 0,1 мМ ортованадата натрия, 5 мМ фторида натрия, 4 мМ
пирофосфата, 4 мМ бензамида, 1 мМ DTT, 80
мкг/мл апротинина, 40 мкг/мл леупептина и 1
мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF).
После центрифугирования при 25000 х g в течение 10 мин, надосадочную жидкость перенесли
в колонку с «быстрой» Q сефарозой (Pharmacia
Biotech., Inc., Piscataway, NJ) и элюировали с
линейным градиентом от 0,1 до 0,4 М NaCl в 50
мМ Hepes, 10% глицерина, рН 7,4. Активные
фракции энзимов объединяли, разделяли на
аликвоты и хранили при температуре -100°С.
Фибробластный фактор роста рецептора
(FGFR), тромбоцитарный фактор роста (PDGF),
инсулин и c-src тирозинкиназы были получены
методами, хорошо известными для специалистов в данной области. Например, см. Fry, et al.,
«Strategies For The Discovery Of Novel Tyrosine
Kinase Inhibitors With Anticancer Activity, Anticancer Drug Design, 1994; 9:331-351, которая
включена здесь в виде ссылки.
Исследования тирозинкиназы.
Исследования энзима для определений IС50
проводили в 96-луночных фильтровальных
планшетах (Millipore MADVN6550, Millipore,
Bedford, MA). Общий объем был 0,1 мл и со-
19
держал 20 мМ Hepes, pH 7,4, 50 мкМ ванадата
натрия, 40 мМ хлорида магния, 10 мкМ АТР,
содержащей 0,5 мкКи [32Р]АТР, 20 мкг полиглутаминовой кислоты/тирозина (Sigma Chemical
Co., St.Louis, МО), 10 нг EGF рецептора тирозинкиназы и подходящий разбавитель для ингибитора. Все компоненты, за исключением АТР,
добавляли в лунки и планшет инкубировали при
встряхивании в течение 10 мин при 25°С. Реакцию начинали путем добавления [32Р]АТР, и
планшет инкубировали при 25°С в течение 10
мин. Реакцию завершали добавлением 0,1 мл
20% трихлоруксусной кислоты (ТСА). Планшет
выдерживали при 4°С, по меньшей мере, в течение 15 мин, до выпадения субстрата в осадок.
Лунки затем 5 раз промывали 0,2 мл 10% ТСА и
введение 32Р определяли бета-счетчиком Wallac.
Исследования с использованием доменов внутриклеточных киназ PDGF, FGF, инсулиновых
рецепторов, а также и c-src, проводили так же,
как описано для EGF рецептора, за исключением того, что в реакцию вводили 10 мМ хлорида
магния.
Исследования EGF- и Heregulin-зависимого фосфорилирования тирозина.
Клетки человеческого плоскоклеточного
рака A431 или клетки MDA-MB-453 выращивали в 6-луночных планшетах примерно до 80%
слияния и затем инкубировали в среде без сыворотки в течение 18 ч. Клетки подвергали воздействию различных концентраций либо соединения I, либо соединения примера 21 в течение
2 ч, а затем стимулировали либо 100 нг/мл EGF
(A431), либо 10 нг/мл герегулина (MDA-MB453) в течение 5 мин. Получали экстракты клеток и снижение фосфотирозина определяли методом вестерн-блоттинга.
Метод вестерн-блоттинга.
Экстракты получали лизированием монослоев в 0,2 мл кипящего буфера Лаемли (2%
додецилсульфата
натрия,
5%
бетамеркаптоэтанола, 10% глицерина и 50 мМ Трис,
рН 6,8) и затем лизаты нагревали до 100°С в
течение 5 мин. Белки из лизата отделяли электрофорезом в полиакриламидном геле и электрофоретически переносили на нитроцеллюлозу. Мембрану промывали один раз [10 мМ Трис,
рН 7,2, 150 мл NaCl, 0,01% азида натрия] (TNA)
и оставляли на ночь в TNA, содержащем 5%
бычьего сывороточного альбумина и 1% яичного альбумина. Мембрану блотировали в течение
2 ч с антителом антифосфотирозина (UBI, Lake
Placid, NY, 1 мкг/мл в блокирующем буфере) и
затем дважды промывали TNA, один раз TNA,
содержащим 0,05 Твин-20 и 0,05% nonidet P-40,
и дважды TNA. Мембраны затем инкубировали
в течение 2 ч в блокирующем буфере, содержащем 0,1 мкКи/мл [125I]протеина А, и затем вновь
промывали, как описано выше. После чего
блоттинги высушивали, загружали в пленочную
кассету и подвергали пленки воздействию X-AR
рентгеновских лучей в течение I-7 дней. Диапа-
003786
20
зон интенсивности определяли лазерным денситометром.
Данные табл. 1 показывают, что пример 21
и соединение I имели примерно одинаковую
активность по отношению к очищенному EGF
рецептору тирозинкиназы, EGF-опосредованному рецептору аутофосфорилирования и
Heregulin-опосредованному фосфорилированию
тирозина in vitro.
Таблица 1
Соединение
Пример 21
Соединение I
HeregulinEGF-опосреEGF рецепопосредовандованный
тор тирозинное фосфорирецептор
киназы IС50, аутофосфолирование
нМ
рилирования тирозина IС50,
нМ
IC50, нM
3,6
5,3
6,4
2,0
2,9
9,0
Исследование ингибирования опухоли in vivo
Человеческий плоскоклеточный рак А43l
был размножен in vivo серийной трансплантацией. Такая модель опухоли была выбрана для
этих исследований из-за известной зависимости
ее роста от EGF рецептора и ее чувствительности на ранней стадии к терапии моноклональным антителом in vivo. В этом эксперименте
голым мышам, весящим 18-22 г, имплантировали подкожно 30 мг фрагмента опухоли А43l в
область правой подмышечной впадины в день 0.
Опухолям позволяли вырасти до массы 100-150
мг, в это время животных - носителей опухоли
рандомизировали и распределяли по обработанным клеткам. Животных обрабатывали перорально в течение 15 последовательных дней
изотионатными солями примера 21 и соединения I в воде. Изотионатные соли могут быть
получены титрованием соединений в растворе 2
экв. изотионовой кислоты. Обработка была основана на усредненном весе группы. Контрольные животные получали воду. Оценка по эксперименту основана на задержке роста опухоли,
Т-С, определенной как разница, в днях, за которые леченная и контрольная опухоли достигали
оценочного размера 750 мг. Данные могут быть
также представлены в виде процента ингибирования роста опухоли, определенного как задержка роста опухоли, разделенная на время
лечения, принятое за 100%. Более значительные
задержка роста опухоли и значение ингибирования роста опухоли указывают на более высокую активность соединений. Статистические
исследования были проведены с использованием JMP for Macintosh (SAS Institute, Inc., Саrу,
NC).
Испытуемое
соединение
Пример 21
Пример 21
Соединение I
Соединение I
Доза,
мг/кг
Задержка роста
опухоли, дни
18
5
18
5
18,4
25,7
41,3
53,2
Ингибирование
роста опухоли,
%
123
171
275
355
21
Значения для соединения I существенно
отличаются от значений для примера 21 и основаны на времени, требуемом для того, чтобы
каждая опухоль достигла 750 мг, р<0,05, t-тест
Стьюдента.
Исследования секреции VEGF
Васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF), который также известен как фактор
васкулярной проницаемости (VPF), считают
главным стимулятором ангиогенеза для большинства видов рака. Существует много индукторов секреции VEGF опухоли и два наиболее
мощных - это эпидермальный фактор роста
(EGF) и трансформирующий фактор роста альфа, при этом оба являются лигандами для EGF
рецептора (EGFR).
Ингибирование секреции VEGF приводит
к антиангиогенному эффекту и может привести
к уменьшению опухоли, так как даже частичное
ингибирование секреции VEGF может привести
к деструкции вновь сформированных незрелых
кровеносных сосудов в опухолях (Benjamin L.E.
and Keshel E., Conditional switching of VEGF
expression in tumors: iduction of endothelial cell
shedding and regression of hemangioblastoma-like
vessels by VEGF whithdrawal. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1997; 94:8761-8766).
Мы сравнили два ингибитора EGFR тирозинкиназы, соединение I и пример 21, по их эффективности в отношении опухолевых клеток
А43l. По отношению к опухолям А43l in vivo
соединение I неожиданно вызвало более значительную противоопухолевую реакцию (Т-С = 53
дня), чем пример 21 (Т-С = 26 дней). Смотрите
результаты, изложенные выше. Далее мы проверяли влияние обоих соединений на секрецию
VEGF на A431. Неожиданно соединение I превзошло пример 21 в ингибировании секреции
VEGF из клеток А43l in vitro. 0,5 мкМ соединения I блокировали секрецию VEGF, стимулированную EGF или TGF-α. В отличие от него, 0,5
мкМ примера 21 ингибировали секрецию VEGF
почти на том же самом уровне, какой наблюдали для 0,1 мкМ соединения I. 0,1 мкМ соединения I ингибировали EGF-стимулированную секрецию VEGF на 63% и 0,5 мкМ ингибировали на 86%. В отличие от него, 0,1 мкМ
примера 21 ингибировали EGF-стимулированную секрецию VEGF на 48% и 0,5 мкМ примера
21 ингибировали EGF-стимулированную секрецию VEGF на 57%. Похожие результаты были
получены при использовании для стимуляции
секреции VEGF TGF-α вместо EGF. 0,5 мкМ
соединения I ингибировали стимулированную
TGF-α секрецию VEGF более чем на 80%, в то
время как та же концентрация примера 21 ингибировала секрецию VEGF на 57%. Соединение I
также проявило способность ингибировать основной уровень секреции VEGF из клеток A431,
в то время как пример 21 был неэффективным.
003786
22
Методики.
Клетки человеческого плоскоклеточного
рака A431, полученные из Американской Коллекции Типовых Культур (Rockville, MD), культивировали в среде Dulbecco's MEM/F12
(DMEM/F12), пополненной 10% эмбриональной
бычьей сыворотки. Перед обработкой лекарством и фактором роста клетки промывали три
раза DMEM/F12 без сыворотки. Клетки в течение 2 ч подвергали воздействию соединения I
или примера 21 с указанной концентрацией,
после чего добавляли 10 нг/мл либо EGF, либо
TGF-α. После 48 ч инкубации при 37°С, среду
удаляли и хранили замороженный продукт при 70°С. Исследования VEGF ELISA (Intergen, Co.,
Purchase, NY) проводили на образцах сред, следуя заводским инструкциям. Результаты этого
исследования приведены ниже в табличной
форме.
Обработка
Среда без сыворотки (SF)
SF+0,1 мкМ
соединения I
SF+0,5 мкМ
соединения I
SF+0,1 мкМ
пример 21
SF+0,5 мкМ
пример 21
SF+10 нг/мл EGF
SF+EGF+0,1 мкМ
соединения I
SF+EGF+0,5 мкМ
соединения I
SF+EGF+0,1 мкМ
пример 21
SF+EGF+0,5 мкМ
пример 21
SF+TGF-α
SF+TGF+0,1 мкМ
соединения I
SF+TGF+0,5 мкМ
соединения I
SF+TGF+0,1 мкМ
пример 21
SF+TGF+0,5 мкМ
пример 21
Секреция VEGF
(пг/105 клеток ± SE)
Процент
ингибирования
490±32
280±41
43
250±46
49
600±37
0
440±110
10
3980±85
1490±170
63
560±29
86
2070±160
48
1710±65
57
4034±190
1976±37
51
766±75
81
3065±161
24
1734±21
57
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение N-[4-(3-хлор-4-фторфениламино)-7-(3-морфолин-4-илпропокси)хиназолин-6-ил]акриламид или его фармацевтически
приемлемые соли.
2. Фармацевтически приемлемая композиция, включающая соединение по п.1.
3. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, имеющему рак, терапевтически
эффективного количества соединения по п.1.
4. Способ по п.3, где рак является раком
ободочной кишки.
5. Способ лечения или предупреждения
рестеноза или атеросклероза, включающий введение пациенту, имеющему рестеноз или атеро-
23
003786
склероз или риск возникновения рестеноза или
атеросклероза, терапевтически эффективного
количества соединения по п.1.
6. Способ необратимого ингибирования
тирозинкиназ, включающий введение пациенту,
нуждающемуся в ингибировании тирозинкиназ,
ингибирующего количества соединения по п.1.
7. Способ по п.6, где тирозинкиназа представляет собой EGFR, erbB2, erbB4.
8. Способ ингибирования фосфорилирования тирозина erbВ3 или секреции VEGF, вклю-
24
чающий введение пациенту, нуждающемуся в
ингибировании фосфорилирования тирозина
erbВ3 или секреции VEGF, терапевтически эффективного количества соединения по п.1.
9. Способ лечения псориаза или эндометриоза, включающий введение пациенту, имеющему псориаз или эндометриоз, терапевтически
эффективного количества соединения по п.1.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6