017967 B1 017967 B1 (11) 017967

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
017967
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2013.04.30
(21)
(51) Int. Cl. C12N 5/02 (2006.01)
C12R 1/91 (2006.01)
Номер заявки
201000377
(22)
Дата подачи заявки
2009.03.17
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИБРОБЛАСТОПОДОБНЫХ КЛЕТОК ИЗ ПУПОЧНОГО
КАНАТИКА НОВОРОЖДЕННОГО
B1
(72)
Изобретатель:
(57)
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения фибробластоподобных клеток из
пупочного канатика новорожденного предусматривает подготовку фрагмента пупочного канатика
человека, гомогенизацию, выделение фибробластоподобных клеток обработкой раствором,
содержащим коллагеназу типа I и коллагеназу типа IV при соотношении ферментов 1:1 в пропорции
гомогената к раствору ферментов 1:5. Способ обеспечивает получение фибробластоподобных
клеток с высоким выходом, прост в осуществлении и позволяет криоконсервировать клетки через
25-30 дней после поступления материала в лабораторию.
Приходько Александр Викторович,
Исаев Артур Александрович, Киселев
Сергей Львович, Лагарькова Мария
Андреевна, Кошелева Настасья
Владимировна, Сабурина Ирина
Николаевна, Мелихова Варвара
Сергеевна (RU)
B1
017967
(56) WO-A-2006019357
RU-C1-0002308957
ROMANOV YURI A. et al. "Searching for
Alternative Sources of Postnatal Human Mesenchymal
Stem Cell: Candidate MSC-Like Cells from Umbilical
Cord", Stem Cells, 2003, Vol. 21, No. l: 105-110, стр.
106
WO-A-2002092794
017967
(31) 2008111708
(32) 2008.03.27
(33) RU
(43) 2010.06.30
(86) PCT/RU2009/000128
(87) WO 2009/120111 2009.10.01
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ
ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ
"ЛАБОРАТОРИЯ КЛЕТОЧНЫХ
ТЕХНОЛОГИЙ" (RU)
017967
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения фибробластоподобных
клеток из пупочного канатика и их применению. Полученные фибробласты могут найти широкое применение в медицинской практике.
В настоящее время пупочный канатик считается источником получения нескольких типов клеток,
среди которых эндотелиальные клетки вены пупочного канатика человека (HUVEC) и фибробласты
(FPC). HUVEC представляют собой модель, широко использующуюся большим количеством исследовательских групп по всему миру. Для фармакологических, фармакокинетических и др. исследований используют эндотелиальные клетки, как правило, нулевого пассажа (не пассированные).
Предшествующий уровень техники
Известен способ получения аллогенных фибробластов из пуповины новорожденного после нормальных родов, для чего подготавливают фрагмент пуповины. Вены пуповины канюлируют с обеих сторон и промывают сначала раствором Хенкса, а затем 0,1%-ным раствором коллагеназы I типа, приготовленным на среде DMEM, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем осуществляют механическое
воздействие на ткани пуповины, собирают отделившиеся клетки, промывая их раствором Хенкса, полученную после механического воздействия и промывания суспензию клеток центрифугируют при 1000
об/мин в течение 5 мин, получая осадок клеток, который ресуспензируют в ростовой среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов
bFGF, ресуспензированный осадок клеток в ростовой среде DMEM переносят в культуральные чашки и
культивируют до формирования монослоя, сменяя ростовую среду DMEM 2 раза в неделю, и при достижении монослоя клетки пересевают в соотношении 1:3. Данный способ описан в RU 2308957, 27.10.2007
и принят нами в качестве ближайшего аналога. К недостаткам способа следует отнести, во-первых, низкий выход получаемых фибробластов, во-вторых, удается получить только фибробласты вены пупочного
канатика, что является ограничением на их дальнейшие дифференцировочные способности и применение.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - культура фибробластоподобных клеток А после 2 пассажа и Б после 4 пассажа;
фиг. 2 - экспрессия виментина в клетках А после 2 пассажа и Б после 4 пассажа;
фиг. 3 - первичная культура клеток HUVEC на 7-й день культивирования;
фиг. 4 - экспрессия коллагена I типа в клетках А после 2 пассажа и Б после 4 пассажа;
фиг. 5 - экспрессия коллагена IV типа в клетках после 4 пассажа.
Раскрытие изобретения
Нами была поставлена задача, разработать простой метод получения фибробластоподобных клеток
из всей ткани пупочного канатика, позволяющий выделить как фибробласты из вены, так и мезенхимальные, дермальные и стромальные фибробласты.
В результате проведенной работы был предложен способ получения фибробластоподобных клеток
из пупочного канатика новорожденного, сущность которого заключается в проведении следующих этапов:
1) подготовки фрагмента пупочного канатика;
2) гомогенизации подготовленного фрагмента;
3) обработки гомогената раствором, содержащим ферменты: коллагеназу типа I и коллагеназу типа
IV, при соотношении ферментов 1:1 в пропорции гомогената к раствору ферментов 1:5;
4) фильтрования и центрифугирования фильтрата с получением осадка фибробластоподобных клеток.
Предлагаемый нами способ получения фибробластоподобных клеток позволяет не только повысить
выход фибробластов, тем самым обеспечить эффективное использование дорогостоящего сырья - пупочного канатика, но и получить широкий спектр эмбриональных фибробластоподобных клеток, таких как
мезенхимальные, стромальные и дермальные фибробласты. Широкий спектр выделяемых клеток позволяет в дальнейшем проводить их дифференцировку в клетки мезенхимального ряда, такие как, например,
кардиомиоциты, стромальные фибробласты могут дифференцироваться в дальнейшем под влиянием добавленных факторов в клетки хряща, мышц, кости и др., такие как нейрональные или инсулинпродуцирующие. Эмбриональные дермальные фибробластоподобные клетки могут дифференцироваться
в кератиноциты и фибробласты кожи. Таким образом, предлагаемый способ и полученные клетки могут
быть использованы для получения вышеперечисленных клеток.
Этап подготовки фрагмента пупочного канатика, как частный случай, может предусматривать дополнительное выделение из вены пупочного канатика эндотелиальных клеток. При этом может быть получено 2 и более типов клеток из одного образца.
Способ осуществляют следующим образом.
Пупочный канатик человека получают после нормальных родов в роддомах с добровольного информированного согласия роженицы.
Забор биоматериала осуществляют с соблюдением всех правил асептики и антисептики после про-1-
017967
ведения предварительного обязательного анализа крови на ВИЧ, RW и маркеры гепатита В и С и получения отрицательных анализов на инфицированность.
Противопоказанием к забору материала является инфицированность по одному из агентов.
Вся дальнейшая работа с биоматериалом ведется в лаборатории, которая предназначена только для
работы с человеческим биоматериалом.
Работа с человеческим биоматериалом должна осуществляется в соответствии с рекомендациями
"Инструкции по контролю стерильности консервированной крови, ее компонентов, препаратов консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов". Минздрав № 4-42-4-85 от
17.09.1985 г.
Все работы с биоматериалом проводятся в стерильных условиях ламинарного бокса II-го класса
биологической защиты.
Подготовка фрагмента пупочного канатика обычно предусматривает следующие процедуры.
1. Отмывание его от сгустков крови и слизи в растворе Хенкса.
2. Промывание вены пупочного канатика с помощью шприца раствором Хенкса с добавлением антибиотика и фунгизона.
3. Разрезание пупочного канатика на куски по 2 см длиной. Каждый из полученных кусков разрезают продольно, промывают раствором Хенкса.
Выделение фибробластоподобных клеток из пупочного канатика проводят следующим образом:
1) гомогенизируют подготовленные фрагменты пупочного канатика;
2) переносят полученную массу в пробирки, добавляют смесь рабочих растворов коллагеазы I и
коллагеназы IV (соотношение ферментов 1:1) в пропорции 1:5;
3) ферментируют материал, периодически перемешивая содержимое пробирок. Продолжительность
инкубации зависит от концентрации ферментов в растворе и от их активности;
4) суспензию после ферментирования пропускают через двойное сито для очистки от остатков неферментированных кусков ткани и избытка коллагена;
5) переносят полученную после фильтрования суспензию в центрифужные пробирки и центрифугируют с получением осадка фибробластов.
Целесообразно при подготовке фрагмента пупочного канатика выделить эндотелиальные клетки.
Для этого можно после отмывания пупочного канатика и промывания вены дополнительно провести
слудующие этапы:
1) зафиксировать один край пуповины, заполнить вену раствором фермента (раствор диспазы 2,5
мг/мл). Второй конец также зафиксировать, проверяя герметичность вены;
2) поместить в СО2 инкубатор на 15мин;
3) массировать пуповину для улучшения доступа фермента ко всем участкам венозной стенки;
4) содержимое вены промыть дважды стерильным раствором Хенкса, а затем ростовой средой;
5) полученную суспензию клеток пипетировать и затем центрифугировать с получением осадка эндотелиальных клеток.
Возможность осуществления способа подтверждают следующие примеры его конкретного выполнения.
Пример 1. Получение фибробластоподобных клеток.
В стерильных условиях ламинарного бокса перекладывают привезенный пупочный канатик (фрагмент 7-10 см) из контейнера в отечественную чашку Петри с раствором Хенкса (фирмы ПанЭко или аналогичный) с добавлением антибиотика и фунгизона. Отмывают материал от сгустков крови и слизи в
растворе Хенкса (фирмы ПанЭко или аналогичный), меняя раствор три раза. Определив расположение
вены пупочного канатика, расширяют ее края стерильным пинцетом и вводят в вену носик шприца объемом 2 мл с раствором Хенкса. Дважды промывают вену стерильным раствором Хенкса (фирмы ПанЭко
или аналогичный) с добавлением антибиотика и фунгизона. Разрезают пупочный канатик на куски по 2
см длиной. Каждый из полученных кусков разрезают продольно, промывают раствором Хенкса и измельчают гомогенизатором до однородной массы. Переносят полученную массу в 2 центрифужные пробирки по 15 мл (или 1 центрифужную пробирку по 50 мл) и добавляют смесь 0,075% рабочих растворов
коллагеазы I и коллагеназы IV (1:1) в пропорции 1:5. Для получения рабочих растворов ферменты разводят в жидкой ростовой среде DMEM без сыворотки и глутамина (фирмы ПанЭко или аналогичный).
Ферментируют материал в течение 8-10 ч при 37°С, периодически перемешивая содержимое пробирок. Степень полноты обработки ферментами определяют по изменению вязкости суспензии, инкубирование необходимо прекратить после значительного увеличения вязкости. Момент резкого возрастания
вязкости суспензии определяют визуально.
Суспензию после ферментирования пропускают через двойное сито для очистки от остатков неферментированных кусков ткани и избытка коллагена. Промывают пробирку и сито раствором Хенкса
(фирмы ПанЭко или аналогичный). Переносят полученную после фильтрования суспензию в новые 15
мл центрифужные пробирки (или 50 мл центрифужную пробирку) и центрифугируют 8 мин, 1000
об/мин, g=90. В результате получают осадок фибробластоподобных клеток.
Пример 2. Последовательное получение эндотелиальных и фибробластоподобных клеток.
-2-
017967
Проводят этапы, как описано в примере 1. Дополнительно после промывания вены пупочного канатика фиксируют один край пуповины корнцангом, аккуратно придерживая образец, заполняют вену раствором фермента (раствор диспазы 2,5 мг/мл). Для получения раствора фермент разводят ростовой средой без сыворотки и глутамина. Второй конец также фиксируют, проверяя герметичность вены. Помещают образец в отечественную чашку Петри и переносят в СО2 инкубатор на 15 мин. Каждые 5 мин пуповину массируют для улучшения доступа фермента ко всем участкам венозной стенки. Через 15 мин
образец переносят в ламинар, снимают корнцанги, а содержимое вены промывают дважды стерильным
раствором Хенкса (фирмы ПанЭко или аналогичной), а затем ростовой средой. Полученную суспензию
клеток пипетируют и затем центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Получают осадок эндотелиальных клеток.
Оставшийся после выделения эндотелиальных клеток фрагмент пупочного канатика перекладывают в
новую стерильную чашку Петри с раствором Хенкса ( фирмы ПанЭко или аналогичной) с добавлением
антибиотика и фунгизона. Отмывают в растворе Хенкса, меняя раствор два раза. Разрезают пупочный канатик на куски по 2 см длиной. Далее проводят выделение фибробластов, как описано в примере 1.
Следует отметить, что продолжительность обработки ферментами зависит от концентрации ферментов в растворе, от активности ферментных препаратов различных производителей и ряда других факторов. Примечательным является то, что обработку прекращают в момент визуально определяемого резкого возрастания вязкости суспензии.
Пример 3. Культивирование фибробластов и эндотелиальных клеток.
Осадки клеток, полученные после центрифугирования, ресуспендируют в ростовой среде, подсчитывают количество выделенных клеток с помощью камеры Горяева. Помещают полученные суспензии в
чашки Петри Greiner или Corning.
Для культивирования фибробластоподобных клеток, выделенных из пупочного канатика, может
быть использована любая пригодная для этого ростовая среда, например следующего состава: жидкая
среда DMEM/F12 1:1 (фирмы ПанЭко или аналогичной), сыворотка Fetal Clone 1-10% (фирма Hyclone
или аналогичная), 1X ITS (фирма Hyclone или аналогичная), bFGF 1 нг/мл (фирмы Chemicon или аналогичной), гепарин 5 U/мл (фирмы ПанЭко или аналогичной), гентамицин 50 мг/мл (фирмы ПанЭко или
аналогичной). Все компоненты вносят из расчета на 1 л среды DMEM/F12.
Для культивирования эндотелиальных клеток, выделенных из вены пупочного канатика, может
быть использована любая пригодная для этого ростовая среда, например следующего состава: среда 199
с солями Эрла (фирмы ПанЭко или аналогичной), сыворотка Fetal Clone 1-20% (фирма Hyclone или аналогичная), антибиотик 1% (фирмы ПанЭко или аналогичной), эпидермальный фактор роста 2,5 нг/мл
(фирмы Chemicon или аналогичной), раствор HEPES (фирмы ПанЭко или аналогичной), 7% раствор
NaHCO3 (фирмы ПанЭко или аналогичной).
Эндотелиальные клетки высевают в плотности 5⋅103 клеток/см2, а фибробластоподобные клетки в
плотности 10 тыс. клеток/см2.
Культивируют клетки в стандартных условиях при 37°С и 5% СО2, со сменой среды каждые 2-3
дня. Культуры пассируют при достижении клетками 70-80% конфлюентности. Перед пассированием
сливают среду, 3 раза промывают чашку раствором Версена (фирмы ПанЭко или аналогичной). На 4-7
мин заливают содержимое чашки 0,25% раствором трипсина. Полученную суспензию клеток, равномерно перемешав, распределяют на новые чашки Петри Greiner или Corning в плотности 8-15 тыс. клеток/см2. Первое пассирование проводят через 12-14 дней после посадки. В дальнейшем удвоение количества фибробластоподобных клеток происходит каждые 48-72 ч. Соответственно, начиная со второго пассажа, между пассажами проходит 2-3 суток.
Фибробластоподобные клетки в культуре растут только в прикрепленном к поверхности культуральной посуды (чашки Петри или культуральные флаконы) состоянии. На всех сроках культивирования сохраняют диплоидный кариотип и высокую пролиферативную активность в течение 4-6 пассажей (фиг. 1).
Культивируемые фибробластоподобные клетки, полученные из пупочного канатика человека, экспрессируют виментин, коллаген I и IV типа (фиг. 2, 4, 5), α-актин и др. (хондроитин сульфат, эластин,
фибронектин, кератин 18, кератин 19, гепарин сульфат), не экспрессируют CD45, CD11b, CD14, имеют
низкую экспрессию антигенов гистосовместимости.
Как правило, используют эндотелиальные клетки вены пупочного канатика нулевого пассажа (не
пассированные). Эндотелиальные клетки характеризуются ростом в культуре только в прикрепленном к
поверхности культуральной посуды (чашки Петри или культуральные флаконы) состоянии и имеют характерный для эндотелиоцитов фенотип (фиг. 3).
Пример 4. Криоконсервация фибробластов.
После достижения культурой фибробластоподобных клеток четвертого пассажа клетки замораживают в криопробирках по 10 млн. Чтобы полностью исключить риск возможного инфицирования бактериальными и вирусными агентами перед криоконсервацией часть клеток подвергается тщательному бактериологическому и вирусологическому контролю (выходной инфекционный контроль), остальные замораживают. Тестирование проводится на
-3-
017967
стерильность клеток в отношении бактерий;
стерильность клеток в отношении микроскопических грибов;
наличие в клетках ДНК вируса гепатита В;
наличие в клетках РНК вируса гепатита С;
наличие в клетках провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека 1-го типа;
наличие в клетках провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека 2-го типа;
наличие в клетках ДНК вируса простого герпеса 1-го типа;
наличие в клетках ДНК вируса простого герпеса 2-го типа;
наличие в клетках ДНК цитомегаловируса;
наличие в клетках ДНК токсоплазмы;
наличие в клетках ДНК микоплазмы.
Для замораживания из чашек Петри с конфлюентной монослойной культурой отбирают конденсированную среду. Культуру клеток троекратно отмывают раствором Версена и трипсинизируют при 37°С,
5% CO2 10 мин. Полученную в результате суспензию гомогенизируют и осуществляют подсчет клеток с
помощью камеры Горяева. Гомогенат центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, клетки ресуспендируют в среде для замораживания (сыворотка пуповинной крови человека Феталклон 1 + 7% диметилсульфоксида) в концентрации 10 млн клеток в 1 мл среды для
замораживания. Клеточную суспензию переносят в 2-мл криопробирки с помощью 5-мл пипетки. Криопробирки маркируют согласно установленному образцу. Клеточный материал подвергается программному замораживанию в специальной установке до -80° и переносится затем на хранение в дюары с жидким азотом в криохранилище. С 7-10 см пуповины можно на 4-м пассаже получить до 200 млн фибробластоподобных клеток. Получение и криоконсервирование 200 млн фибробластоподобных клеток можно
осуществить примерно через 25-30 дней после поступления материала в лабораторию.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного, предусматривающий подготовку фрагмента пупочного канатика человека, выделение фибробластоподобных
клеток обработкой раствором коллагеназы типа I и центрифугированием, отличающийся тем, что подготовленный фрагмент пупочного канатика гомогенизируют, а обработку гомогената проводят раствором,
содержащим коллагеназу типа I и коллагеназу типа IV при соотношении ферментов 1:1 в пропорции гомогената к раствору ферментов 1:5.
Фиг. 1
Фиг. 2
-4-
017967
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-5-