American Journal of Reproductive Immunology 2011

American Journal of Reproductive Immunology 2011
Early View (Articles online in advance of print)
John Wiley & Sons A/S
A Possible Mechanism of Autoimmune-Mediated infertility in Women with Endometriosis
Возможный аутоиммунный механизм бесплодия у женщин
с эндометриозом
Junko Inagaki1, Lin Hao2, Mikiya Nakatsuka3,4, Tatsuji Yasuda1, Yuji Hiramatsu2,3, Yehuda Shoenfeld5,6,
Eiji Matsuura1
1Department of Cell Chemistry, Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences,
Okayama, Japan;
2Obstetrics and Gynecology, Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences,
Okayama, Japan;
3Department of Obstetrics and Gynecology, Okayama University Hospital, Okayama, Japan;
4Graduate School of Health Sciences, Okayama University, Okayama, Japan;
5Department of Medicine ‘B’ and Zabludowicz Center for Autoimmune Diseases, Chaim Sheba Medical Center Tel-Hashomer
and Sackler Faculty of
Medicine, Tel-Aviv University, Tel-Aviv, Israel;
6Incumbent of the Laura Schwarz-Kipp Chair for Research of Autoimmune Diseases, Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel
Актуальность темы
y Нарушения
репродуктивной
функции
у
женщин
такие
как
привычный
выкидыш,
преэклампсия и бесплодие признаны серьезной проблемой здравоохранения. Только в 30%
случаев после оплодотворения
эмбрионов
происходят
наблюдаются успешные беременности. Потери 10 %
в результате нарушения имплантации. Частота резорбции
имплантированных эмбрионов в пределах 7-14 дней после имплантации составляет около
30%, спонтанное прерывание беременности до 28 недели гестации - 10-25%.
y Аутоиммунный фактор рассматривается как возможная причина развития нарушений
репродуктивной функции. В научной литературе часто сообщается об ассоциации аутоантител
к фосфолипидам, ядерным антигенам и
антигенам щитовидной железы с привычным
невынашиванием беременности и бесплодием. При эндометриозе встречается множество
аутоантител против эндометрия, яичников, сперматозоидов, фосфолипидов, гистонов и
других.
y Авторами представленной статьи ранее была показана значительная ассоциация аутоантител к
ламинину-111
эндометриозом.
с
привычными
потерями
беременности
I
триместра,
бесплодием
и
Ламинины
y семейство
экстрацеллюлярных
матриксных
гликопротеинов,
представленных
преимущественно в базальных мембранах
y имеют гетеротримерные молекулы, состоящие из α, β и γ цепей, идентифицированы 15
различных изоформ
Ламинины
y играют значительную роль в процессах клеточной адгезии, миграции, пролиферации,
дифференцировке, ангиогенезе, опухолевом метастазировании, в поддержании тканевой
архитектуры
y ламинин-111 (α1, β1 и γ1) – наиболее охарактеризованная изоформа, синтезируется в
течение эмбриогенеза и имеет важное значение на этапах раннего эмбрионального
развития и имплантации
y С-терминальный глобулярный G-домен α1 цепи ламинина-111 является наиболее
важной частью молекулы в осуществлении ее биологических функций.
Цель исследования
y Охарактеризовать
специфичность
связывания
анти-ламинин-111
аутоантител у бесплодных пациенток с эндометриозом и исследовать
влияние этих аутоантител на развитие эмбриона in vitro.
Задачи исследования
y Проанализировать иммунореактивность IgG анти-ламинин-111 аутоантител против
целой молекулы ламинина-111, рекомбинантного домена G α1 цепи ламинина-111 и
синтетических AG пептидов у пациенток с бесплодием, ассоциированным с
эндометриозом, с помощью метода ИФА
y Оценить специфичность определения анти-ламинин-111 аутоантител в ИФА путем
ингибирования их связывания избытком антигена
y Исследовать влияние анти-ламинин-111 аутоантител на эмбриональное развитие in
vitro, в частности, на прикрепление и рост мышиных бластоцист.
Исследуемые группы
y Пациентки с бесплодием, ассоциированным с эндометриозом (n=45, средний возраст
31,9 лет, от 23 до 45 лет).
Диагноз эндометриоза поставлен по результатам лапароскопического или
лапаротомического, магнитного резонансного и патоморфологического исследований.
Выраженность заболевания оценивалась согласно пересмотренной классификации
Американского Общества по Репродуктивной Медицине
y Контрольная группа здоровых небеременных женщин (n=39, средний возраст 29,6 лет,
от 22 до 41 года)
Статистический анализ
Проводилось одномоментное исследование.
Для
оценки
корреляции
рекомбинантному
титров
антител
к
целой
молекуле
ламинина-111,
G-домену α1 цепи и синтетическим пептидам ламинина-111
использовался коэффициент корреляции Пирсона.
P < 0,05 рассматривался как статистически значимый
Результаты исследования
У 12 из 45 (26,7%) бесплодных женщин с эндометриозом
в сыворотке крови методом ИФА были
выявлены аутоантитела к целой молекуле ламинина-111, у 4 из них – аутоантитела к G домену α1 цепи.
Наблюдалась выраженная корреляция между связыванием антител с целой молекулой и G доменом. Был
изучен профиль связывания аутоантител с AG пептидами и идентифицированы иммунодоминантные
эпитопы G домена.
Рис 1. Перекрестная реактивность анти-ламинин-111
аутоантител к рекомбинантному G домену α1 цепи
ламинина-111.
Сыворотки бесплодных пациенток с эндометриозом
(n=45) исследованы на антитела в ИФА. Пунктирные
линии показывают величины “cutoff”, рассчитанные
как mean OD + 3SD для здоровых небеременных
женщин (n=39)
Результаты исследования
Отрицательная контрольная сыворотка не показала
специфического связывания с AG пептидами. Две
положительные сыворотки имели сходные профили
связывания по нескольким AG пептидам. Самое
выраженное связывание антител наблюдалось с AG73,
который обладает значительной биологической
активностью в отношении прикрепления клеток.
Выраженное связывание антител также отмечалось с
пептидами AG75, AG76 и AG77, которые имеют
важное значение для клеточного разрастания.
Рис 2. Профиль связывания анти-ламинин-111 аутоантител с
AG пептидами у бесплодных пациенток с эндометриозом.
ИФА выполнен с сывороткой здоровой женщины (a) и с
положительными сыворотками бесплодных пациенток с
эндометриозом (b) и (c). Каждый AG пептид пронумерован на
панели.
Результаты исследования
Выявлена значительная корреляция между связыванием
антител с пептидами AG26, AG73 и G доменом.
Специфичность определения анти-ламинин-111 антител
в ИФА была подтверждена ингибированием связывания
антител избытком антигена: целой молекулы ламинина111, рекомбинантного G домена α1 цепи или AG пептидов.
Рис 3A. Связывание антител из сывороток пациенток с
эндометриозом (n=45) в ИФА при иммобилизации на
твердой фазе рекомбинантного G домена α1 цепи
ламинина-111 (a, b), пептида AG26 (a, c) или пептида
AG73 (b, c)
Результаты исследования
Так как выраженность ингибирования пептидами
AG26 (36,5%), AG73(35,2%) или рекомбинантным G
доменом (23,9%) была значительно ниже, чем целой
молекулой ламинина-111 (80%), авторы предположили,
что анти-ламинин-111 аутоантитела являются
поликлональными и индуцируются множеством
эпитопных структур на целой молекуле и/или G домене.
Рис 3B. Конкурентный анализ связывания анти-ламинин-111
аутоантител к целой молекуле ламинина-111. Анти-ламинин-111
антитела были предварительно инкубированы в течение 2 часов с
интактными молекулами ламинина-111, рекомбинантным G
доменом, пептидами AG25, 26, 47, 73, 76 или 5 негативными
контрольными пептидами (AG106, 107, 109, 110 и 112), а затем
исследованы на связывание с интактными молекулами ламинина111 методом ИФА. Результаты представлены в процентах
связывания.
Результаты исследования
Рис. 4A Влияние анти‐ламинин‐111 антител на
прикрепление и рост мышиных бластоцист. Прикрепление и рост бластоцист оценивали
через 24 и 72 часа от начала
культивирования с анти‐ламинин‐111 аутоантителами. Бластоцисты были
культивированы:
y с 10% фетальной бычьей сывороткой(a), y с моноклональными анти‐ламинин‐111 антителами (AK8) (b),
y с поликлональными анти‐ламинин‐111 антителами (c),
y с контрольным IgG из сыворотки здоровых
женщин (d), y c IgG из сыворотки пациентки с
эндометриозом (e),
y с аффинно‐очищенными анти‐ламинин‐111 IgG от пациентки с эндометриозом (f), в конечной концентрации 20 мкг/мл.
Результаты исследования
Рис. 4B. Влияние анти-ламинин-111 аутоантител на прикрепление (▓) и рост (▒) бластоцист.
Прикрепление и рост бластоцист оценивали через 24 и 72 часа от начала культивирования с
антителами. Данные представляют mean±SEM по крайней мере пяти различных экспериментов.
Было проанализировано не менее 30 эмбрионов в каждой группе. Величины, обозначенные *
значительно отличаются от величин полученных для бластоцист в контрольной культуре (10%
FBS); **p<0.05; ***p< 0.0001
Выводы
y Анти-ламинин-111 аутоантитела у бесплодных пациенток с эндометриозом
являются
поликлональными
и
связывают
несколько
биологически
функциональных областей молекулы ламинина-111
y Анти-ламинин-111 аутоантитела ингибируют разрастание трофобласта in vitro
y Анти-ламинин-111 аутоантитела могут иметь важное патогенетическое
значение при ранних репродуктивных нарушениях, включая бесплодие,
ассоциированное с эндометриозом.
Основные публикации по теме исследования
Inagaki J, Matsuura E, Nomizu M, Sugiura-Ogasawara M, Katano K, Kaihara K, Kobayashi K,Yasuda T,
Aoki K: IgG anti-laminin-1 autoantibody and recurrent miscarriages. Am J Reprod Immunol 2001; 45:232–
238.
y Inagaki J, Sugiura-Ogasawara M, Nomizu M, Nakatsuka M, Ikuta K, Suzuki N, Kaihara K, Kobayashi K,
Yasuda T, Shoenfeld Y, Aoki K, Matsuura E: An association of IgG antilaminin-1 autoantibodies with
endometriosis in infertile patients. Hum Reprod 2003; 18:544–549.
y Matalon ST, Blank M, Matsuura E, Inagaki J, Nomizu M, Levi Y, Koike T, Shere Y, Ornoy A, Shoenfeld Y:
Immunization of naive mice with mouse laminin-1 affected pregnancy outcome in a mouse model.
Am J Reprod Immunol 2003; 50:159–165.
y Kondo A, Inagaki J, Kobayashi K, Tsukamoto H, Yamamoto D, Nakatsuka M, Suzuki N, Nomizu M,
Amano S, Matsubayashi H, Yasuda T, Lopez LR, Shoenfeld Y, Makino T, Matsuura E: Characterization of
a murine anti-laminin-1 monoclonal antibody (AK8) produced by immunization with mouse-derived
laminin-1. Clin Dev Immunol 2005; 12:67–73.
y