Морфология полипов и слизистой оболочки голосовых складок
реклама
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ doi: 10.17116/patol201577130УДК 616.225-006.5-031.81-091.8 Морфология полипов и слизистой оболочки голосовых складок при болезни Рейнке В.П. БЫКОВА, Э.А. КОЧЕСОКОВА, Г.Ф. ИВАНЧЕНКО, И.Д. РОТОВА Лаборатория патологической анатомии ЛОР-органов ФГБУ «НКЦ оториноларингологии» ФМБА России, Москва The morphology of vocal fold polyps and mucosa in Reinke’s edema V.P. BYKOVA, E.A. KOCHESOKOVA, G.F. IVANCHENKO, I.D. ROTOVA Research Clinical Centre for Otorhinolaryngology, Federal Biomedical Agency of the Russian Federation, Moscow Цель исследования — изучение морфогенеза полипов голосовых складок и отека Рейнке на основе клинико-морфологического анализа гистологических и иммуногистохимических данных, характеризующих состояние и механизмы нарушения проницаемости локального микроциркуляторного русла. Материал и методы. Исследованы полипы голосовых складок и тканевые образцы слизистой оболочки голосовых складок при отеке Рейнке, полученные после микрохирургического лечения 31 пациента в возрасте от 23 до 75 лет, 13 мужчин и 18 женщин. Использована широкая панель меченных пероксидазой моно- и поликлональных антител (ДАБ — хромоген), включая дифференцировочные маркеры T- и B-лимфоцитов, толл-подобные рецепторы (TLR2, TLR4, TLR9), костимулирующую молекулу CD80 (B7-1), маркеры ангиогенеза (CD34), сосудистой и тканевой проницаемости — матриксные металлопротеиназы (MMP-1, MMP-9), VCAM-1. Результаты. Установлено, что все типы исследованной полипоидной гиперплазии реализуются через нарушенную проницаемость стенки сосудов микроциркуляции в мембранозной части голосовой складки, называемой пространством Рейнке. Экспрессия молекул CD34, VCAM-1, MMP-1, MMP-9, а также TLR4 и TLR9 была выявлена на эндотелиальных клетках микроциркуляторных сосудов. Одновременно клетки эпителиальной выстилки экспрессировали упомянутые толл-подобные рецепторы и костимулирующую молекулу CD80 (B7-1), которая модулирует активность (через CD28) или аттенуирование (через CTLA-4) T-лимфоцитов, обеспечивая взаимодействие структур врожденного и адаптивного иммунитета. Заключение. Морфогенез полипоидной гиперплазии голосовых складок представляется как результат эпителиально-стромального взаимодействия в условиях неблагоприятных этиологических факторов, таких как высокие голосовые нагрузки, экзогенные интоксикации и вирусные инфекции. Инициатором реактивных изменений пространства Рейнке являются клетки покровного эпителия, несущие сигнальные толл-подобные рецепторы. Ключевые слова: полипы голосовых складок, отек Рейнке, толл-подобные рецепторы, матриксные металлопротеиназы, сосудистая проницаемость. Objective: to investigate the morphogenesis of vocal fold polyps and Reinke’s edema on the basis of clinical and morphological analyses of the histological and immunohistochemical data characterizing the state of the local microcirculatory bed and the mechanisms of its permeability impairment. Subjects and methods. Polyps of the vocal folds and their mucosal tissue samples in Reinke’s edema mucosa, which had been obtained after microsurgical treatment of 31 patients (13 men and 18 women) aged 23 to 75 years, were studied using a wide panel of peroxidase-labeled monoclonal and polyclonal antibodies (DAB chromogen), including T and B cell differentiation markers, Toll-like receptors (TLR2, TLR4, and TLR9), the costimulatory molecule CD80 (B71), and markers for angiogenesis (CD34), vascular and tissue permeability (matrix metalloproteinases (MMP-1 and MMP-9)), and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1). Results. All types of the examined polypoid hyperplasia were ascertained to realize through the impaired permeability of the wall of microcirculatory vessels in the membranous vocal fold portion called Reinke’s space. The expression of molecules, such as CD34, VCAM-1, MMP-1 and MMP-9, as well as TLR4 and TLR9 was revealed on the endothelial cells of microcirculatory vessels. The epithelial lining cells simultaneously expressed the above-mentioned Toll-like receptors and the costimulatory molecule CD80 (B7-1) that modulated T cell lymphocyte activity (through CD28) or attenuation (through CTLA-4), ensuring the interaction of structures of innate and adaptive immunity. Conclusion. The morphogenesis of polypoid hyperplasia of the vocal folds is a result of an epithelial stromal interaction under poor etiological factors, such as high vocal loads, exogenic intoxications, and viral infections. The integumentary lining cells carrying Toll-like receptors initiate reactive alterations in Reinke’s space. Key words: vocal fold polyps, Reinke’s edema, Toll-like receptors, matrix metalloproteinases, vascular permeability. Полипы голосовых складок представляют группу наиболее распространенных форм доброкачественных образований голосовых складок. По данным разных авторов, они составляют от 30 до 70% всех причин нарушения голоса [1, 2]. Исторически полипы голосовых складок рассматривались как отечные фибромы и ангиофибромы, что определило попытки классифицировать их в группе доброкачественных опухолей. Однако морфологическая структура этих образований не соответствует гистологическим критериям опухолевого роста, для которого харак- © Коллектив авторов, 2015 Быкова Валентина Павловна — д-р мед. наук, проф., рук. лаб. патологической анатомии; e-mail: [email protected] 30 АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 1, 2015 терна пролиферация клеток определенного типа с формированием тканевого и клеточного атипизма. Современная патологическая анатомия трактует их как «опухолеподобные поражения», морфологическую основу которых составляет локальный отек, связанный с повышенной проницаемостью стенок мелких сосудов и расстройствами местной микроциркуляции. В патогенезе микроциркуляторных расстройств ведущую роль играет повреждение сосудистой стенки, вероятнее всего, гипоксического генеза, вызванное повышенной голосовой нагрузкой (голосовой травмой). Скоплению отечной жидкости в рыхлой соединительной ткани пространства Рейнке способствует также недостаточность отведения тканевой жидкости по слаборазвитым лимфатическим коллекторам. При этом пути оттока лимфы должны преодолеть более плотные ткани голосовой связки и голосовой мышцы, а также «обогнуть» пластинки щитовидного хряща, чтобы соединиться с лимфатическими сосудами под- и надскладочного отделов слизистой оболочки гортани. На сегодняшний день полипы голосовых складок относятся к группе доброкачественных экссудативных поражений голосовых складок, куда также входят отек Рейнке и голосовые узелки [3]. Несмотря на общность морфофункциональных изменений, включающих повреждение сосудов с кровоизлияниями, тромбозами, плазморрагией, выпотом фибрина, интерстициальным отеком и неоангио­ генезом, выраженность которых индивидуально варьирует, гистологически с учетом преобладания тех или иных морфологических признаков полипы голосовых складок разделены на две подгруппы: отечные, или миксоматозные полипы, и ангиоматозные полипы [3, 4]. Особняком стоит подгруппа, известная как отечно-полипозный ларингит, или болезнь Рейнке—Гайека (она же отек Рейнке), имеющий специфическую зону формирования «новообразования», а именно мембранозную часть голосовых складок. Стойкий отек пространства Рейнке напрямую указывает на недостаточность дренажной лимфатической системы мембранозной области голосовых складок. Основными этиологическими факторами с учетом многочисленных исследований, посвященных этой проблеме, по-прежнему считаются чрезмерное перенапряжение голосового аппарата («певческие узелки», «узелки проповедников») и неблагоприятное воздействие различных химических раздражителей на слизистую оболочку верхних дыхательных путей, в том числе табакокурение. Последнее является наиболее частой бытовой интоксикацией, включая пассивное вдыхание табачного дыма, хотя далеко не у всех курящих возникают голосовые узелки и полипы голосовых складок [5]. Изучение роли конституциональных и гормональных факторов (гипотиреоидизм) в патогенезе отека Рейнке все еще остается в сфере интересов клиницистов и патоморфологов [1, 3, 6]. Хотя этиология заболевания в достаточной мере изучена, а подходы к диагностике и лечению в общих чертах определены, тонкие механизмы развития нарушения микроциркуляции в ткани голосовых складок и повышения сосудистой проницаемости остаются до конца не понятыми. В то же время морфогенетический аспект полипоза голосовых складок, способствующий пониманию процесса формирования полипов, необходим для разработки новых подходов к тактике лечения и профилактике голосовых полипов, а также для обеспечения более благоприятного прогноза заболевания у лиц «голосовых» профессий. АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 1, 2015 Целью данного фрагмента работы явилось изучение морфогенеза полипоза голосовых складок на основе комплексного клинического, гистологического и иммуногистохимического исследования оперативно удаленной полипозной ткани при хирургическом лечении голосовых полипов и полипозно-отечного ларингита. Материал и методы Материалом исследования послужили образцы полипозной ткани голосовых складок, полученные эндоларингеальным микрохирургическим способом от 31 пациента (13 мужчин, 18 женщин) в возрасте от 23 до 75 лет, оперированных по поводу полипоза голосовых складок в период с 2008 по 2012 г. Подавляющее большинство составили лица, испытывающие повышенную голосовую нагрузку (педагоги, вокалисты, командный состав и др.). В анамнезе у 19 пациентов имела место бытовая интоксикация (табакокурение), у 7 — производственная химическая вредность. Среди них клинически диагностированы как ангиоматозные полипы голосовой складки — 7 наблюдений, отечно-полипозный ларингит (отек Рейнке) — 7, полип голосовой складки (неуточненная форма) — 13, множественные полипы голосовых складок (неуточненная форма) — 4. Весь материал фиксировали в нейтральном формалине, заливали в парафин по общепринятой методике. Для морфологического исследования гистологических срезов толщиной 5—7 мкм, помимо обзорных методов окраски гематоксилином и эозином, применяли специальные (окраска по ван Гизону, альциановым синим, PASреакция). Параллельно проводили иммуногистохимические реакции с использованием диагностических моно- и поликлональных антител к искомым антигенам, определяющим структурную и биохимическую организацию полипа. В работе использовали основные дифференцировочные маркеры T- и B-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8 и CD20, CD79a соответственно, производители «NeoMarkers», «DAKO»), регуляторного корецептора T-лимфоцитов молекулы B7-1 (CD80, Epitomics), макрофагов (CD68, «DAKO»), высокомолекулярных цитокератинов (клон 34βE12, «DAKO»), маркеры толл-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9, «LifeSpan BioSciences»), маркеры эндотелия и матриксных металлопротеиназ, позволяющие оценить ангиогенез (CD34, «EuroDiagnostica»), сосудистую проницаемость и ремоделирование соединительнотканного матрикса (VCAM-1, MMP-1, MMP-9, «BioGenex», «Novocastra», «DAKO»). Исследования выполняли по запатентованным протоколам указанных фирм — производителей антител. Для визуализации реакций использовали готовые тест-системы с универсальными вторичными антителами меченными хромогеном (HRP-polymer Detection system, «BioGenex»). Позитивные результаты гистохимических реакций учитывали при наличии двух негативных (на специфичность реакции и отсутствие активности эндогенной пероксидазы) и одного внутреннего позитивного (на специфичность) контролей. После гистологического исследования все образцы ткани полипов были разделены на 3 группы. 1-ю группу составили 15 наблюдений отечных полипов голосовых складок, среди них 4 образца имели строение переходной формы и квалифицированы как отечно-ангиоматозные полипы, в одном наблюдении отечный полип отличался резко выражен- 31 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ным миксоматозом стромы (миксоидный полип). 2-ю группу составили 11 наблюдений ангиоматозных полипов голосовых складок; в 3-ю группу вошли 5 наблюдений отечнополипозного ларингита (отек Рейнке—Гайека). Результаты и обсуждение Образцы полипов 1-й и наиболее многочисленной группы макроскопически представляли собой полипозно-измененную прозрачную или белесоватую, мягковатой консистенции ткань с локализацией в области желудочковой поверхности одной из голосовых складок (рис. 1, а). Микроскопическая картина выглядела достаточно однообразно. Многослойный плоский эпителий в большинстве наблюдений был несколько истончен с явлениями атрофии. Сосудистая сеть стромы полипа развита слабо, в основном капиллярного и синусоидного типа с отеком эндотелия. Ведущими компонентами патоморфологических изменений стромы полипов были выраженный интерстициальный отек, отек базальной мембраны покровного эпителия, очаговая пролиферация стромальных элементов. Разъединенные тонкие соединительнотканные волокна образовывали тонкопетлистую сеть в виде щелей и полостей, выполненных отечной жидкостью, окрашивающейся эозином в розовый цвет. Отечная жидкость этих скоплений оттесняла волокнистые структуры к периферии, часто по направлению к покровному эпителию, где субэпителиальная соединительная ткань формировала подобие фиброзной капсулы. Подобные «озера» интерстициальной жидкости, не имеющие отграничительной эпителиальной выстилки, принято называть псевдокистами в отличие от истинной кисты, полость которой ограничена эпителием. В одном наблюдении отечного полипа выявлена ретенционная киста, образованная эктазией железистого протока с резко истонченным плоским эпителием и PAS-негативным мелкоглобулярным содержимым. Строма полипов при окраске гематоксилином и эозином обнаруживала базофилию основного вещества, а альциановый синий окрашивал препарат в позитивный голубой цвет, что указывало на накопление гликозаминогликанов (кислых мукополисахаридов), являющихся отражением дистрофических процессов вследствие тканевой гипоксии. Особенно выраженные дистрофические изменения основного вещества обнаружены в миксоматозном полипе в виде резко выраженной базофилии с ослизнением стромы. В четырех наблюдениях выявлена смешанная структура отечного полипа с умеренным ангио­ матозом и микроскопическими признаками расстройства микроциркуляции в виде стаза, тромбоза, диапедезных кровоизлияний, плазморрагий. Отличительной чертой пяти полипов явились реактивные изменения многослойного плоского эпителия в виде дисплазии и ороговения. Практически неизмененный многослойный плоский неороговевающий эпителий мы наблюдали только в 2 случаях отечных полипов. Редкой находкой в группе отечных полипов была и воспалительная инфильтрация, которая присутствовала всего лишь у 5 пациентов и носила характер хронического диффузно-очагового умеренно или слабовыраженного серозного воспаления. Только в одном случае наблюдали обострение воспалительного процесса, документируемое наличием в отечной ткани сегментоядерных лейкоцитов. В 4 наблюдениях исследуемой группы выявлены эпителиальные клетки с признаками вирусного поражения в виде койлоцитов (в основном крупные 32 клетки плоского эпителия полигональной формы с четкими границами, часто с гиперхромными увеличенными ядрами, обильной цитоплазмой и ее перинуклеарным просветлением — halo). Интересно, что признаки обострения воспаления присутствовали именно в полипе с койлоцитозом покровного эпителия. Во 2-й группе наблюдений полиповидные образования, локализованные на одной из голосовых складок, макроскопически представляли эластичную несколько плотноватой консистенции ткань на широком основании, пестрой окраски (розового или ярко-красного цвета). Микроскопически на первый план выступали сосудистые изменения. Основную массу полипа составляли кавернозно расширенные или щелевидные тонкостенные сосуды с характерной причудливой извитостью контуров. Во всех наблюдениях присутствовали расстройства кровообращения. В просвете большинства сосудов определялись стазы крови и тромбы. Характерными находками были диапедезные кровоизлияния, а также выход в интерстиций плазменных белков с формированием плотных белковых масс. Часто наблюдались отложения в строму пигмента гемосидерина, в таких участках отмечались клеточная реакция и признаки склерозирования. В 8 из 11 ангиоматозных полипов выявлены реактивные изменения покровного многослойного эпителия в виде умеренного акантоза, гиперплазии базального и парабазального слоев с формированием гипер- и паракератоза и появлением зернистого слоя, клетки которого содержали кератогиалин (см. рис. 1, г). В трех полипах обнаружена дисплазия покровного эпителия II и III степени. Койлоциты были обнаружены в покровном эпителии трех полипов, причем в двух из них наблюдались явные специфические признаки герпетической инфекции со спонгиозом эпителия, формированием интраэпителиальных и субэпидермальных пузырей, выполненных серозной жидкостью с примесью лимфоидных клеток и сегментоядерных лейкоцитов (см. рис. 1, в). Как таковую воспалительную инфильтрацию в строме полипов мы наблюдали только в четырех полипах, в трех из них отмечено обострение воспаления, причем в двух при наличии признаков герпетического поражения тканей полипа. 3-ю группу составили 5 наблюдений хронического отеч­ но-полипозного ларингита (болезнь Рейнке—Гайека), присланных для гистологического исследования в виде фрагментов слизистой оболочки голосовых складок, которая имела диффузную отечность или была представлена сливающимися полиповидными образованиями, располагавшимися (по клиническим данным) по краю одной или обеих голосовых складок (см. рис. 1, б). Гистологически покровный эпителий выглядел несколько утолщенным и отечным. В 4 наблюдениях эти изменения были связаны с его реактивной трансформацией и проявлялись в виде гиперкератоза, появления слоя кератогиалина, в одном случае в сочетании с дисплазией I—II степени, в другом наблюдении с явлениями акантоза многослойного плоского эпителия. В строме полипов также наблюдался выраженный отек на фоне немногочисленных расширенных, переполненных отечной жидкостью, содержащей лимфоидные клетки, тонкостенных лимфатических сосудов. На фоне интерстициального отека в одном из тканевых образцов были обнаружены субэпидермальные и интраэпидермальные пузыри, заполненные прозрачным содержимым с единичными лейкоцитами, что в сочетании с выраженным койлоцитозом указывало АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 1, 2015 а б в г д е Рис. 1. Морфология полиповидных гиперплазий голосовых складок. а — отечный полип левой голосовой складки (эндоларингоскопия); б — асимметричный отек голосовых складок при болезни Рейнке—Гайека (эндоларингоскопия); в — субэпидермальный пузырь при серозном воспалении в ангиоматозном полипе. ×200; г — гиперкератоз покровного эпителия ангиоматозного полипа у молодого вокалиста с 7-летним стажем курильщика; д — CD3-позитивные лимфоциты в эпителиальном покрове отечного полипа. Иммунопероксидазный метод; е — экспрессия молекулы CD80 (B7-1) на эпителиоцитах покровного эпителия. Иммунопероксидазный метод. в, г — окраска гематоксилином и эозином; д, е — ДАБ-гематоксилином Майера; г—е — ×400. АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 1, 2015 33 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ на возможную вирусную природу этих изменений, вероятно герпетическую. Очаговое скопление койлоцитов в покровном эпителии определялось еще в двух образцах полипозно-измененной слизистой оболочки. Воспалительные изменения в тканевых образцах присутствовали у 2-х пациентов и носили характер хронического диффузно-очагового слабовыраженного серозного воспаления. Четкие признаки обострения воспалительного процесса в виде неравномерно рассредоточенной в отечной жидкости инфильтрации сегментоядерными нейтрофильными и эозинофильными лейкоцитами были выявлены в наблюдении с микроскопической картиной вирусного поражения ткани предположительно герпетической природы. В строме всех образцов в той или иной степени встречались явления фиброматоза, чаще в виде формирующихся соединительнотканных тяжей и очагового склероза. Анализ гистологических данных показал, что независимо от принадлежности к той или иной клинико-морфологической группе общим ведущим компонентом описанных полиповидных гиперплазий, несмотря на некоторые специфические различия в микроскопическом строении, явились микроциркуляторные расстройства в области пространства Рейнке с нарушением проницаемости стенок сосудов, развитием диффузного интерстициального отека и лимфостаза. Наличие периваскулярных плазморрагий и диапедезных кровоизлияний в образцах 1-й группы (переходная форма — отечно-ангиоматозные полипы) указывает на то, что строгую границу между ангиоматозным и отеч­ ным полипом, с одной стороны, и болезнью Рейнке—Гайека — с другой провести нельзя и различия между ними определяются скорее степенью локальной васкуляризации, т.е. развитием очагов ангиоматоза, чем степенью порозности сосудистой стенки. Этот факт указывает на общность патогенетических механизмов нарушения сосудистой проницаемости и микроциркуляторных расстройств и закономерно ставит вопрос о ведущей роли воспаления в их развитии. Полученные нами гистологические данные не отрицают участия воспаления в развитии полиповидных гиперплазий и даже подтверждают в определенной части наблюдений серозный (не гнойный) его характер, возможно вирусной природы (койлоцитоз, морфологические признаки герпесвирусной инфекции). Однако в подавляющем большинстве исследованных полиповидных гиперплазий голосовых складок признаков текущего воспаления с лейкоцитарной реакцией найдено не было. Возможное объяснение этому феномену, приближенное к пониманию механизмов развития микроциркуляторных расстройств, было получено нами после выполнения иммуногистохимического исследования, результаты которого приводятся суммарно для всех трех групп. Иммуногистохимическое фенотипирование лимфоидных клеток показало, что немногочисленные лимфоциты в составе субэпителиальной ткани, а также среди интраэпителиальных мононуклеарных клеток являются CD3-позитивными T-клетками (см. рис. 1, д) в основном хелперного типа (CD4+). Клетки супрессорно-цитотоксической популяции (CD8+) встречались как единичные главным образом в наблюдениях с признаками вирусной инфекции. Лимфоциты с фенотипом B-клеток (CD20+, CD79a+) встречались в очаговых субэпителиальных скоплениях, где при окраске гематоксилином и эозином присутствовали немногочисленные плазматические клетки. Преобладание тканевого отека, рассредоточенность клеток воспаления и общая скудость клеточной реакции не 34 позволили дать количественную оценку представительства отдельных популяций. В то же время следует особо отметить, что в случаях с реактивными гиперпластическими изменениями покровного эпителия, где присутствовали интраэпителиальные лимфоциты, нам удалось наблюдать не описанный ранее феномен экспрессии клетками нелимфоидной пограничной ткани одного из ключевых протеинов, участвующих в иммуномодулирующих процессах. Так, клетки эпителия базального и супрабазального слоев иногда до уровня середины шиповатого слоя обнаруживали четкую цитоплазматическую экспрессию CD80 (B7-1) молекулы (см. рис. 1, е). Как известно, этот протеин является наиболее эффективной костимулирующей молекулой при презентации антигена T-клеткам. Молекула служит лигандом для двух белков на поверхности T-клеток: CD28 и CTLA-4, связывание с которыми модулирует активацию (CD28) или торможение активности (CTLA-4) T-лимфоцитов. Данный протеин впервые был обнаружен на активированных B-лимфоцитах, затем было показано, что он обеспечивает костимулирующий сигнал, необходимый для активации и выживания T-лимфоцитов. Он конститутивно экспрессируется на интердигитирующих клетках, моноцитах, B-лимфоцитах и, вероятно, на других антигенпрезентирующих клетках [7, 8]. Обнаружение экспрессии молекулы CD80(B7-1) на эпителиоцитах слизистой оболочки гортани при ее полипозе открывает новую грань функциональной значимости клеток эпителиального покрова в процессах эпителиально-стромальных взаимоотношений, в частности при организации реактивных процессов. «Заинтересованность» покровного эпителия в развитии реактивного состояния слизистой оболочки голосовой складки проявлялась также в виде мембранной экспрессии толл-подобных рецепторов TLR2 и TLR4 и эндосомальной экспрессии TLR9 эпителиоцитами базального и супрабазального слоев эпителиального покрова полипов (рис. 2, а, б). Кроме того, четкую экспрессию TLR9 обнаруживали клетки эндотелия микрососудистого русла (см. рис. 2, в). Выявление этих рецепторов указывало на участие механизмов врожденного иммунитета в распознавании патогенассоциированных молекулярных паттернов (PAMPs) возможной бактериальной и вирусной инфекции. Как известно, взаимодействие толл-подобных рецепторов с их лигандами — консервативными молекулами бактерий и вирусов, определяющих их выживаемость и патогенность, — приводит к созданию временного сигнального пути, который активирует нуклеарные транскрипционные факторы типа NF-kappa B и реализуется продукцией различных провоспалительных и иммуномодулирующих цитокинов [9]. В наших наблюдениях наиболее четкой была экспрессия TLR9 в образцах с гистологическими признаками вирусной инфекции. В случаях с умеренным присутствием в экссудате нейтрофильных лейкоцитов столь же четко выявлялась экспрессия TLR4, который распознает присутствие граммнегативной бактериальной флоры (см. рис. 2, б). Что касается маркера клеток моноцитарно-макрофагального ряда CD68, то экспрессия данной молекулы выявлена на макрофагах, концентрирующихся вокруг отложения гемосидерина. При исследовании механизмов развития стромального отека и для четкой визуализации стенок сосудов и эндотелия мы использовали иммуногистохимическое выявление СD34-антигенов, а также молекул адгезии эндотелия сосудов VCAM-1. По полученным данным, характерный для АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 1, 2015 а б в г д е Рис. 2. ИГХ-характеристика полипозных гиперплазий голосовых складок. Иммунопероксидазный метод. Окраска ДАБ-гематоксилином Майера. а — экспрессия TLR9-эпителиоцитами базального и супрабазального слоев. ×200; б — экспрессия TLR4-клетками эпителия и воспалительного инфильтрата при болезни Рейнке. ×200; в — TLR9 в эндотелии сосудов микроциркуляции, тангенциальный срез. ×400; г — эндотелиальная экспрессия CD34 по контуру расширенных сосудов. ×100; д — ангиогенез в строме ангиоматозного полипа, экспрессия CD34. ×100; е — экспрессия MMP-9 стромальными элементами и эндотелием микрососудов ангиоматозного полипа. ×200. АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 1, 2015 35 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ всех групп отек эндотелия и его базальной мембраны, указывающий на нарушение их проницаемости, сопровождался экспрессией молекулы VCAM-1, которая была неоднозначной по уровню выраженности (степени окрашивания) и вовлеченности разных участков стенки микрососудов. Использование маркера CD34 позволяло визуализировать очертания кровеносного микроциркуляторного русла и лимфатических сосудов с явлениями лимфостаза и отличать их от артефициальных «структур» интерстициального отека в виде щелей, полостей, «озер», образованных разволокнением и расхождением коллагеновых и ретикулярных волокон под давлением отечной жидкости (см. рис. 2, г, д). Так, отсутствие экспрессии CD34-антигенов по контуру лимфатического «озера» свидетельствовало в пользу интерстициального отека с выраженной дезорганизацией соединительнотканного матрикса. Определение экспрессии молекулы CD34 оказалось особенно полезным при оценке состояния лимфатического русла полипа, поскольку эндотелиальная выстилка с экспрессией VCAM-1 могла отсутствовать в силу повреждения. Васкуляризация стромы отечных полипов и фрагментов ткани голосовых складок при отеке Рейнке—Гайека по сравнению с ангиоматозными полипами была развита слабо и представлена в основном сосудами капиллярного и синусоидного типов, которые зачастую трудно дифференцировать при рутинном окрашивании гематоксилином и эозином от лимфатических коллекторов, если они не заполнены клетками красной крови. Иммуногистохимическое исследование с использованием маркеров CD34 и VCAM-1 позволило получить максимально точное представление о реальном наличии этих структур и дифференцировать их от вышеупомянутых имитирующих сосуды структур интерстициального отека. Можно предположить, что в формировании столь значительных нарушений микроциркуляции в тканях полипов, неизбежно ведущих к гипоксии, дистрофии тканей и, следовательно, к формированию фиброза, присутствуют механизмы, отвечающие за процессы ремоделирования соединительнотканного матрикса. В настоящее время уже известно, что матриксные металлопротеиназы (MMP) играют значительную роль не только в норме в ходе эмбриогенеза, физиологической регенерации, но и при патологических процессах [10, 11]. Известно, что ММP-9 — желатиназа, экспрессию которой мы изучали, обладает способностью разрушать трехспиральные структуры коллагена IV и V типов. Поскольку коллаген IV типа является основной составляющей базальных мембран эпителиев и эндотелиальной выстилки микрососудов, активность ММP-9 рассматривается как один из ведущих факторов, регулирующих проницаемость базальных мембран для жидкостных и форменных элементов крови, лимфы и перемещения тканевой жидкости. При иммуногистохимическом исследовании мы наблюдали экспрессию ММР 1-го и 9-го типов на эндотелиальных клетках, фибробластах, клетках воспалительной инфильтрации, а также при экстрацеллюлярной локализации (см. рис. 2, е). В частности, позитивная реакция на желатиназу прослеживалась местами по ходу базальной мембраны сосудов микроциркуляции. При обсуждении итогов проведенного исследования особого внимания в структуре полипов голосовых складок заслуживает оценка состояния покровного многослойного плоского неороговевающего эпителия. Боле чем в половине всех наблюдений — 18 (58%), найдены изме- 36 нения эпителиального пласта в виде его утолщения не столько за счет отека, сколько в результате гиперплазии эпителиоцитов и развития патологического ороговения в форме гипер- и паракератоза с появлением зернистого слоя клеток, содержащих кератогиалин. В 6 наблюдениях из 18 выявлена дисплазия эпителия I и III степени, в 3 случаях — явления акантоза. Данные морфологические изменения наблюдались преимущественно у курящих пациентов и/или регулярно контактирующих с химическими вредностями, при этом испытывающих перенапряжение голосовой функции. Таким образом, можно констатировать, что табакокурение и/или вдыхание химических раздражителей лицами голосоречевых профессий, испытывающих голосовое напряжение, усугубляет течение заболевания, способствуя развитию кератоза покровного эпителия и появлению его дисплазии. Это обстоятельство ставит вопрос об онкологической настороженности в отношении лиц, страдающих полипозом голосовых складок, поскольку кератоз и дисплазия эпителия рассматриваются как предраковые процессы. Известно, что подобные гиперпластические изменения плоского эпителия могут возникать в условиях хронического воспаления, в частности при длительно текущем ларингите [7]. Тем не менее до сих пор вопрос о роли воспаления в формировании полипов остается открытым. Одной из причин нарушений микроциркуляции в тканях полипа, по мнению С.А. Карпищенко [2], является воспаление бактериальной природы. Очевидно, в фокусе данного исследования находились только сами полипы, а участки окружающей ткани голосовых складок были редкой находкой и оценить их было сложно. Для всех исследованных групп характерно, что воспалительная инфильтрация имела характер диффузно-очагового хронического неспецифического серозного, а не гнойного воспаления. Иммуногистохимическое фенотипирование эффекторных клеток инфильтрата (CD3, CD79a, CD68) подтвердило серозный характер экссудации, а продуктивный компонент в некоторых наблюдениях присутствовал как признак организации очагов кровоизлияний в ангиоматозных полипах. Преимущественно серозный характер экссудации указывает скорее на вирусную, чем бактериальную инфекцию, что согласуется с выявлением в 10 наблюдениях койлоцитов в составе покровного эпителия полипов или в случайно попавших фрагментах «здоровой» ткани голосовой складки, а также с морфологическими признаками герпетической инфекции в виде субэпидермальных пузырей и интраэпидермального акантолиза. Косвенным подтверждением вирусного присутствия является также высокая экспрессия клетками плоского эпителия и эндотелия сосудов микроциркуляции в полипах толл-подобного рецептора 9 (TLR9), который распознает вирусную ДНК, имеющую частые повторы CpG-мотива, [12, 13]. Широко известно, что эпителий респираторного тракта наиболее подвержен цитопатическому влиянию вирусов, особенно часто у иммуноcкомпрометированных пациентов. Показано, что вирусы, в частности семейства герпесвирусов, такие как цитомегаловирус, вызывают нарушение микроциркуляции крови, часто проявляющиеся в виде тромботической микроангиопатии [14]. По данным нашего исследования, в 40% полипов с гистологическими признаками вирусного повреждения тканей имелись выраженные расстройства микроциркуляции в виде тромбозов с плазматическим пропитыванием стенок сосудов, диапедезных кровоизлияний, в ряде случаев в сочетании с приАРХИВ ПАТОЛОГИИ, 1, 2015 знаками герпетической инфекции. Подобные нарушения проницаемости с развитием диапедеза, интерстициального отека и лимфостаза находят объяснение в наблюдавшейся нами экспрессии ММР 1-го и 9-го типов, которые активируются провоспалительными цитокинами, действующими на неактивный предшественник металлопротеиназ, и участвуют в деградации протеогликанов и коллагена [11]. Способность этих цинкзависимых эндопептидаз разрушать все типы белков внеклеточного матрикса проявляется также тем, что, участвуя в процессинге хемокинов и цитокинов, они осуществляют их деградацию, влияя тем самым на миграцию лейкоцитов и степень воспалительной реакции [15]. Авторы отдают себе отчет в том, что использованная в работе панель ИГХ-маркеров явно недостаточна для построения патогенетической цепи событийных последовательностей в морфогенезе полипоза голосовых складок. Скорее она только намечает некоторые направления дальнейших исследований. Однако полученные результаты неоспоримо свидетельствуют в пользу того, что любое патогенетическое построение для объяснения морфогенеза полипоза голосовых складок будет упираться в эпителиально-стромальные взаимодействия. Эпителий как пограничная ткань, непосредственно обращенная во внешнюю среду и первой принимающая на себя ее агрессивное воздействие, является инициатором реакций врожденного иммунитета, организуя с помощью толлподобных рецепторов и их сигнальных путей немедленный воспалительный ответ через продукцию провоспалительных цитокинов. Эпителий, экспрессируя костимулирующую молекулу CD80 (B7-1), инициирует активность клеток адаптивного иммунитета для участия в эффекторных функциях иммунной системы. Включение активности ММР, напрямую связанных с провоспалительными цитокинами, является мощным фактором дезорганизации и организации межклеточного матрикса, включая базальные мембраны, регулятором процессов ангиогенеза, сосудистой проницаемости и репарации [11]. Не исключено, что картина редуцированного серозного воспаления (серозный отек с минимумом нейтрофильных лейкоцитов или их отсутствием), наблюдаемая при полипозе голосовых складок, является результатом антицитокиновой активности ММР [15]. Заключение Комплексное гистологическое и иммуногистохимическое исследование полипов голосовых складок, а также анализ анамнестических данных пациентов показал, что морфогенез полипоза голосовых складок достаточно сложен и основан на эпителиально-стромальном взаимодействии. В процессе формирования полиповидных гиперплазий значительную роль играют разнообразные нарушения микроциркуляции, причиной которых являются и анатомическая особенность строения пространства Рейнке— Гайека, и хроническая экзогенная интоксикация (табакокурение, контакт с химическими реагентами), особенно в сочетании с повышенными голосовыми нагрузками. Определенную роль, однако, требующую дальнейшего исследования, играет цитопатическое действие вирусной инфекции как возможный пусковой механизм нарушений микроциркуляции, в первую очередь проявляющихся повышенной проницаемостью сосудов и интерстициальным отеком в результате дезорганизации протеогликанов и коллагена в составе базальных мембран и межклеточного матрикса при участии ММР. В качестве основного активатора ММР, по-видимому, выступают провоспалительные цитокины, продукция которых определяется сигналами с толлподобных рецепторов клеток покровного эпителия слизистой оболочки голосовых складок. Участие авторов: Концепция и дизайн: В.П.Б., Г.Ф.И. Сбор материала и обработка: Э.А.К., И.Д.Р. Статистическая обработка: Э.А.К. Текст: Э.А.К., И.Д.Р. Редактирование: В.П.Б. Конфликт интересов отсутствует. ЛИТЕРАТУРА 1. Василенко Ю.С., Быкова В.П., Антонова Н.А., Кочетыгов Д.М. Клинико-морфологическая характеристика доброкачественных опухолеподобных образований голосовых складок. Вестник оториноларингологии. 1999; 1: 24—7. 2. Карпищенко С.А. Воспалительные заболевания голосовых складок. Consilium medicum. 2004; 10: 792—8. 3. Дайхес Н.А., Быкова В.П., Пономарев А.Б., Давудов Х.Ш. Клиническая патология гортани. М.: Медицинское информационное агентство; 2009. 156 с. 4. Краевский Н.А., Смольянников А.В., Саркисов Д.С., ред. Патологоанатомическая диагностика опухолей человека. Руководство для врачей. т. 1. М.: Медицина; 1993. 560 с. 5. Быкова В.П., Калинин Д.В., Орехов О.О., Кочесокова Э.А. Клинико-морфологические параллели при полиповидных образованиях голосовых складок. В кн.: 50-летие Городской клинической больницы №67: сборник научных трудов. М.; 2009: 54—5. 6. Dikkers F.G., Nikkels P.G. Lamina propria of the mucosa of the vocal folds. Laringoscope. 1999; 109 (10): 1684—9. 7. Peach R.J. еt al. Both extracellular immunoglobulin-like domains of CD80 contain residieus critical for binding T cell surface receptors CTLA-4 and CD28. J. Biol. Chem. 1995; 270 (36): 21181—7. 8. Chang T.T., Kuchroo V.K., Sharpе A.H. Role of the B7- CD28/ CTLA-4 pathway in autoimmune disease. Curr. Dir. Autoimmun. 2002; 5: 113—30. АРХИВ ПАТОЛОГИИ, 1, 2015 9. Akira S., Takeda K. Toll-like receptor signalling. Nat. Rev. Immunol. 2004; 4: 499—511. 10. Švagždys S., Lesauskaitė V. Matrikso metalo proteinazės: piktybinių navikų augimo ir plitimo mechanizmai. (Matrix metalloproteinases: the mechanisms of invasion and metastatic development of malignant tumours). Medicinos Teorija Ir Praktika. 2007; 13 (2): 132—8. 11. Фомина В.С. Роль системы матриксных металлопротеиназ в патогенезе профессиональных заболеваний органов дыхания: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М.; 2010. 24 c. 12. Medzhitov R., Janeway C.A. Jr. Advances in immunology: innate immunity. N. Engl. J. Med. 2000; 343: 338—44. 13. Pasare C., Medzhitov R. Toll-like receptors: linking innate and adaptive immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 2005; 560: 11—8. 14. Ротова И.Д. Гистологическая и иммуногистохимическая диагностика цитомегаловирусной инфекции в пункционных биоптатах аллотрансплантированных почек: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М.; 2007. 15. Van Lint P., Libert C. Chemokine and cytokine processing by maytrix metalloproteinases and its effect on leukocyte migration and inflammation. J. Leukocyte Biol. 2007; 82 (6): 1375—81. Поступила 02.07.2014 37
