Т.Левина - Инновационные технологии для гематологического

Инновационные технологии для
гематологического анализа
Левина Т., к.б.н.
ООО «Рош Диагностика Рус»
r.Владивосток
Гематология сегодня –
это проточная цитофлюориметрия
1. Размер / объем клеток
- Импедансный метод (Метод Культера)
- Проточная цитометрия - измерение прямого светорассеивания
лазерного луча
2. Внутренняя структура
- Проточная цитометрия - измерение бокового светорассеивания
лазерного луча
3. Содержание нуклеиновых кислот (РНК/ДНК, зрелость и
метаболическая активность клетки):
- Проточная цитофлюориметрия
Гематологические анализаторы X- класса
Флюоресцентное окрашивание нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) концентрация нуклеиновых кислот в клетке прямо пропорциональна
величине флюоресцентного сигнала
Передовая технология–
проточная цитофлюориметрия
РНК/ДНК
содержание
сложность
размер
В настоящий момент только SYSMEX предлагает данную
технологию: дифференциация лейкоцитов методом детекции
нуклеиновых кислот.
Проверенная технология (с 1999 г.)
Для каждой клетки 3 типа параметров:
Преимущества технологии –
преимущества результата
ЭФФЕКТИВНОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕТОК
ТЕХНОЛОГИЯ ДЛЯ :
• подсчета незрелых гранулоцитов
• детекции активированных лимфоцитов
• двойного подсчета тромбоцитов
• детекции гипохромных ретикулоцитов
УЛУЧШЕНИЕ КАЧЕСТВА ПОДСЧЕТА ЛЕЙКОЦИТАРНОЙ
ФОРМУЛЫ
48 ЧАСОВ СТАБИЛЬНОСТИ ОБРАЗЦА ПОСЛЕ ВЗЯТИЯ
ВЫСОКИЙ ДИАПАЗОН ЛИНЕЙНОСТИ
ИНФОРМАЦИЯ О ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
КОСТНОГО МОЗГА
5
Незрелые гранулоциты
Незрелые гранулоциты определяются как
• Метамиелоциты
• Миелоциты
• Промиелоциты
Появляются в крови (патологический левый сдвиг) под
действием инфекционно-воспалительных или
злокачественных (миелопролиферативные
заболевания) процессов
Metamyelocyte
Myelocyte
Promyelocyte
6
Счет IG –
Что конкретно считается?
Количественное определение незрелых
гранулоцитов (IG)
• Подсчет IG является быстрым и точным инструментом
для мониторинга эффективности различных видов терапии
у пациентов с инфекцией или лейкемией.
• Чем раньше увеличиваются значения IG у септических
пациентов, тем меньше шансов на выживание
Синдром системного воспалительного ответа
(SIRS): есть или нет инфекция?
При SIRS присутствие IG может указывать на
инфекцию с начинающимся сепсисом
RET-канал новые диагностические возможности
Все RBC-параметры, включая MCV, MCH, Hypo-R дают нам
историческую информацию об анемии
RET%: информация о количестве вновь образованных RBC
RET-He: информация о качестве вновь образованных RBC
RET-He рассматривается как критерий решения (cut-off = 28 пг ) при
лечении анемии хронических заболеваний
Новые параметры
RET-He
21.9 пг
RET-He
29.6 пг
RET-He
31.3 пг
• RET-He – единственный параметр, позволяющий убедиться в эффективности
терапии железодефицита уже через 3 дня.
!
• RET-He в отличие от биохимических показателей, не зависит от воспалительных
и др. заболеваний.
Новые параметры
Vorwärtsstreulicht
Vorwärtsstreulicht
Слева: Ret-скатерограмма 7-летнего ребенка, страдающего от тяжелого
хронического воспаления кишечника
Справа: 3 дня после терапии r-huEpo + в/в железо. Ретикулоциты (HFR)
как и концентрация в них гемоглобина (RET-He) показывают выраженный
рост
Fluoreszenzlicht
18 November, 2008, Example headline, Page 11, © Roche
Fluoreszenzlicht
Проточная цитофлюориметрия –
подсчёт тромбоцитов
Ситуации, когда импедансный подсчет
тромбоцитов не достаточен:
Псевдотромбоцитопения :
• Гигантские тромбоциты
• Агрегация тромбоцитов
Псевдотромбоцитоз:
• Выраженный микроцитоз
• Фрагменты
Проточная цитофлюориметрия –
подсчёт тромбоцитов
RET канал
Фрагменты эритроцитов
Volume
Норма
RNA content
RNA content
Volume Meassurement
Система флагов:
• Аномальные флаги при патологии лейкоцитов
• Повышенное или пониженное содержание лейкоцитов
• Патологическая WBC-скатерограмма
• Флаги, подозрительные на патологию лейкоцитов
•
•
•
•
•
•
Blasts (бластные клетки)?
Left Shift (левый сдвиг)?
Atypical Lympho (атипичные лимфоциты)?
Abn Lympho/Blasts (патол. Лимф./Бласты)?
RBC Lyse Resistance (лизис-резистентные эритроциты)?
NRBC (нормобласты)?
Дифференцировка и IP сообщения
по DIFF каналу
Информация каждого флага
Дополнительная полуколичественная система флагов (Qflag):
Изменение чувствительности флага к индивидуальным
требованиям каждой лаборатории
Лаконичное сообщение о статусе здоровья пациента для каждого
флага
Строгая индикация
патологии IG.
Незначительная
индикация патологии
для Левого сдвига
Концепция Sysmex
Мировой лидер в области производства и продаж гематологических
анализаторов, реагентов и программного обеспечения. Ежегодный
запуск новых продуктов
Уникальная технология дифференцировки лейкоцитов – метод
проточной цитофлуориметрии (все анализаторы Х-класса)
Все анализаторы X-класса - схожие функции, характеристики,
технологии, аналогичные реагенты и системы флагов. Отличия - число
каналов, скорость и способ загрузки проб
Расширенный набор параметров (Мастера)
XT-4000i
XE-2100 &
XT-2000i & XT-1800i
XS-1000i & XS-800i
Гематологические анализаторы Sysmex
XE-2100
CBC + Diff + Ret +
IPF + NRBC +HPC
BF
XT-4000i
XT-2000i
CBC + Diff + Ret
CBC + Diff (5 Part)
XT-1800i
XS-800i/1000i
CBC + Diff (3 Part)
KX-21N
100
BF
Body Fluid Analysis
250
750
[Samples
[Samples/Day]
19
Гематологический анализатор XS-800i/1000i
•
Полноценный 5 Diff гематологический анализатор
26 параметров (включая IG), 3 гистограммы,
1 скатерограмма
Производительность
Ручной или с закрытыми пробирками: 60 образцов/час
Автоматический (автосэмплер): 20 образцов/23 мин
Очень низкий объем аспирации во всех режимах что
особенно важно для педиатрических образцов:
Капиллярная
Венозная
Автосэмплер
20 мкл
20 мкл
20 мкл
Педиатрия, перинатальные центры, онкологические и
гематологические клиники, больницы широкого профиля и
поликлиники, женские консультации, родильные дома, частные
центры репродукции, клиники
Меню на русском языке
Гематологический анализатор XT- 2000i/1800i
44 и 26 параметров (вкл. расширенное
меню RET (XT-2000i), IG)
5 и 2 скатерограммы, 2 гистограммы
Производительность
80 проб/час в любом выбранном
режиме в т.ч. RET
Объём образца:
85 мкл - из открытой пробирки
150 мкл - в автоматическом режиме
40 мкл- капиллярный метод
Память - 10 000 образцов (вкл. графики)
Меню на русском языке
Гематологический анализатор ХЕ-2100
51 параметр, 7 скатерограмм, 2
гистограммы
(вкл. NRBC, расширенное меню RET,
IG, HPC, IPF)
Самая быстрая система в мире: 150
проб/час.
Объём образца:
130 мкл из открытой пробирки
200 мкл в автоматическом режиме
Память - 10 000 образцов (вкл. графики)
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ХЕ-2100
• NRBC (нормобласты)
•
ХЕ-2100 позволяет осуществить точный подсчет нормобластов,
который важен для правильного определения количества
лейкоцитов, особенно в грубо патологических образцах. Помимо
этого, точное определения количества нормобластов важно при
многих клинических ситуациях: содержание нормобластов может
быть использовано как дополнительный диагностический метод
для выявления миелодиспластического синдрома.
Фракция незрелых тромбоцитов (IPF) - отражает состояние
костномозгового тромбоцитопоэза
В норме составляет - 1,0-10,3%
IPF повышается при ДВС-синдроме, идиопатической
тромбоцитопенической пурпуре, регенерации костномозгового
гемопоэза после химиотерапии
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ХЕ-2100
Гемопоэтические Клетки-предшественники (HPC)коррелируют с содержанием CD34+ клеток:
Выбор оптимального времени для афереза,
Мониторинг приживления клеток после трансплантации,
Оценка восстановления стволовых клеток после их
обработки в банках пуповинной крови
Позволяет минимизировать число дорогостоящих
определений СD34+.
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ХЕ-2100
• IRF (immature reticulocyte fraction / фракция незрелых
ретикулоцитов)
•
ХЕ-2100 предоставляет информацию не только об
абсолютном количестве ретикулоцитов, но также и о
содержании незрелых ретикулоцитов – параметра,
характеризующего эритропоэтическую активность костного
мозга. Доказано, что содержание незрелых ретикулоцитов
является прогностическим параметров супрессии или же
восстановления активности эритрона.
Гематологические анализаторы Sysmex
CBC + Diff + Ret +
IPF + NRBC +HPC
XE-2100
BF
XT-2000i
CBC + Diff + Ret
XT-4000i
CBC + Diff (5 Part)
XE-2100D
XT-1800i
XS 800i/1000i
CBC + Diff (3 Part)
KX-21N
100
BF
Body Fluid Analysis
250
750
[Samples
[Samples/Day]
26
XT- 4000i –
новый анализатор экспертного класса
Технические характеристики
Измеряемые
параметры
73 параметра
3 скатерограммы
2 гистограммы
Диагностические
40
Исследовательские
33
XT- 4000i – новый анализатор
экспертного класса
ПАРАМЕТРЫ
СBC
WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC,
PLT, RDW-SD, RDW-CV, MPV, P-LCR, PDW,
PCT, PLT-О
О
% MicroR – микроциты, %
% MacroR – макроциты, %
% Hypo-He – гипохромные эритроциты, %
% Hyper-He – гиперхромные эритроциты, %
XT- 4000i –
новый анализатор экспертного класса
ПАРАМЕТРЫ
DIFF
NEUT (%, #), LYMPH (%, #), MONO (%, #),
EO (%, #), BASO (%, #), IG (%, #), HFL (%, #)
RET
RET(%, #), HFR, MFR, LFR, IRF,
RET-He – содержание гемоглобина в
ретикулоците
D-He - Дельта-Гемоглобин
RPI – индекс продукции ретикулоцитов
FRC (%, #) – фрагменты (шизоциты)
BF - новые диагностические возможности
Параметры режима биологических жидкостей:
Диагностические параметры:
лейкоциты
• WBC-BF =
• PMN (% and #) = полиморфноядерные клетки:
нейтрофилы + базофилы + эозинофилы
• MN (% and #) =
мононуклеары:
лимфоциты + моноциты
эритроциты
• RBC-BF =
Дополнительные параметры:
• HF-BF (% and #) = высокофлуоресцирующие клетки
(клетки с
высоким содержание РНК в
цитоплазме)
общий цитоз
• TC-BF =
• EO (% and #) =
количество эозинофилов
18 November, 2008, Example headline, Page 30, © Roche
30
Синовиальная жидкость
Воспаление?:
WBC >2x109/л,
(%PMN >75%)
Отсутствие воcпаления:
остеоартриты,
травматические артриты
Воспаление: септические
артриты, подагра,
аутоиммунные артриты
Плевральная жидкость
• WBC >1x109/л: экссудат;
WBC <1x109/л: транссудат
• WBC >10x109/л: плеврит, опухоль
• NEUT >10x109/л: бактериальная
пневмония, острый плеврит, эмпиема,
туберкулез
• LYMPH >50%: лимфома, туберкулез
• EO >10%: гемоторакс, пневмоторакс,
асбестоз, паразиты
Асцитная жидкость
• PMN ≥0.25x109/л: Бактериальный
перитонит
Перитонеальный диализ
Бактериальный перитонит?:
WBC >0.1-0.2х109/л (PMN!)
Спинномозговая жидкость
• Нормальные значения
• Лейкоциты
• до 5 WBC/мкл у взрослых
• до 20 WBC/мкл у новорожденных
• Эритроциты
• отсутствуют
Ликвор – сложный материал для анализа
Ликвор – ценная жидкость малого объема:
• Взятие сложно и болезненно
• Общий объем в теле мал (~150 ml)
• Прозрачная бесклеточная жидкость, в норме
цитоз менее 5 клеток / µl
Время критично:
• Инфекции угрожают жизни и лечение должно быть
начато БЫСТРО (в течение часов)
• Влияние результата анализа на клиническое решение велико
• Т.к. клетки погибают быстро (в течение часа) образец должен быть
проанализирован быстро
36
Анализ ликвора сегодня: вручную
1. Визуальная оценка образца – проверка взятия
• Только информация о контаминации кровью
2. Счетная камера Фукса-Розенталя – для подсчета
• Длительно по времени
• Осуществляется только опытным персоналом
• Воспроизводимость разнится
(зависит от количества клеток и уровня навыков)
3. Цитоцентрифуга – для оценки морфологии
• Возможно повреждение клеток
• Клетки выглядят иначе, чем в мазке крови
• Осуществляется только опытным персоналом
37
Результаты испытаний:
Автоматический подсчет vs счетной камеры
• Результаты обоих методов сопоставимы
• Оба метода способны различить нормальное и патологическое
содержание клеток
• Отрицательная и положительная прогностическая значимость
сравнима с таковой для счетной камеры
• Чувствительность = 99%
• Специфичность = 79%
38
Анализ ликвора завтра: автоматически
Автоматизация может помочь в
• Стандартизации метода
• Улучшении воспроизводимости
• и качества результата
39
• Размер клеток не имеет значения при подсчете
лейкоцитов в DIFF канале;
• Остатки разрушенных клеток (дебрис) не
оказывают влияния на анализ, т.к.:
• Клетки не содержащие нуклеиновых кислот,
например, эритроциты не окрашиваются
• Нет влияния устойчивых к лизису
эритроцитов
• Не клеточные компоненты, например,
пузырьки воздуха не определяются
Содержание
РНК/ДНК
Преимущества проточной цитофлюориметрии
гранулярность
дебрис
• Фоновый счет всегда очень низок, что крайне
важно для анализа образцов с низким цитозом!
40
Технические аспекты анализа биологических
жидкостей
Доступность
• 24 часа в день
• при доступности опытного
персонала
Воспроизводимость
• Великолепная
• Не зависит от
оператора
• Может быть
хорошей/великолепной в
специализированных лабораториях
• Зависит от персонала
Время
анализа
• ~ 1 минута
• зависит от исполнителя
• всегда несколько минут
41
MN
PM
N
Экран:
Экран диагностические
параметры
42
HF
TC
WBC
Экран:
Экран исследовательские параметры
43
Некоторые примеры:
Панкреатит - асцит
• Асцитная жидкость содержит кровь, носит признаки воспаления,
большая часть клеток - нейтрофилы (~ 80%)
44
Некоторые примеры:
вирусный менингит - ликвор
• Присутствуют как мононуклеары, так и полиморфноядерные
лейкоциты
• Реактивные лимфоциты указывают на иммунный ответ
45
BF - новые диагностические возможности
XT-4000i
• Объём пробы всего 85 мкл
•Доступен 24 часа/день
•Время выполнения анализа – 1 мин
•Выполняется немедленно после поступления образца в
лабораторию, т.к. не требуется предварительная
пробоподготовка и специальное обучение персонала
Рутинные исследования в гематологии
Staining
47
Автоматизация рутинных исследований в
гематологии
Staining
48
Автоматизация рутинных исследований в гематологии
Станция приготовления и окраски мазков SP-1000i
Качество мазков, приготовленных ручным методом
Мазок приготовленный на SP-1000i
Основные преимущества
• Полностью автоматизированный процесс для приготовления и окраски
стандартизированных мазков
• Высокое качество мазков за счёт автоматической корректировки HCT, 8
уровней
• Высокая производительность: 120 мазков в час
• Нет контакта оператора с кровью
• Положительные образцы идентифицируются при считывании штрихкода
• Штрих-код идентификации печатается на стекле
• Гибкие протоколы окрашивания: 7 протоколов
Автоматизация гематологического анализа
XE-Alpha N
Автоматизация рутинных исследований в гематологии
Staining
54
Можете вы найти то, что я увидел?
55
Автоматизированная цифровая микроскопия
сегодня
CellaVision DM96
CellaVision DM1200
56
Мазки для DM96 / DM1200
Подготовленные автоматически
SP-1000i
Подготовленные п/автоматически
HemaPrep
Подготовленные вручную
57
Современные тенденции в гематологии
Современные информационные технологии позволяют
хранить графические данные
Фотографии клеток крови сохраняются для:
•
•
•
•
Пересмотра
Приложений телегематологии (E-mail, Server)
Документации в истории болезни пациента
Образовательных целей
Уменьшение количества ручной микроскопии
Решение: Автоматизированная цифровая микроскопия
58
Почему автоматизированная цифровая
микроскопия?
Стандартизация и автоматизация дифференцировки клеток
В комбинации с автоматизацией подготовки и окраски мазка цифровая
микроскопия улучшает качество дифференцировки
Подсчет на большое число клеток (определяется пользователем)
Неограниченное время хранения графических результатов
дифференцировки
Оптимально для подсчета образцов с цитопенией
Оптимизация рабочих потоков в лаборатории
Наличие телегематологических приложений
59
``````
60
We Innovate Healthcare