Текст диссертации - НИИ Фармакологии им. В.В.Закусова
реклама
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Печенкина Ирина Геннадьевна ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ СРЕДСТВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИ ТОКСИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЯХ ПЕЧЕНИ В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОЙ ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Козин Сергей Валерьевич Москва - 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 5 Глава 1. Обзор литературы 11 1.1. Токсические гепатиты 11 1.2. Механизм действия тетрахлорметана 13 1.3. Фитоадаптогены как средства неспецифического действия, обладающие гепатопротекторной активностью 17 Глава 2. Материалы и методы исследований 30 2.1. Экспериментальная оценка состояния физической выносливости после введения исследуемых препаратов и на фоне подострой интоксикации тетрахлорметаном 32 2.2.Определение некоторых энзимологических и биохимических показателей в сыворотке крови экспериментальных животных 34 2.3. Определение концентрации восстановленного глутатиона в печени экспериментальных животных 35 2.4. Определение концентрации продуктов ПОЛ в печени экспериментальных животных 35 2.5. Гистологическое и гистохимическое исследование печени экспериментальных животных 37 2.6. Иммуногистохимическое исследование печени мышей 37 2.7. Визуализация результатов 39 2.8. Статистическая обработка результатов 39 Глава 3. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на некоторые показатели состояния экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном в условиях повышенной физической нагрузки 40 3.1. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на продолжительность плавания мышей при подострой интоксикации тетрахлорметаном 3.2. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на динамику массы тела и на относительную массу печени мышей при подострой интоксикации 40 3 тетрахлорметаном на фоне повышенной физической нагрузки 44 3.3. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на некоторые энзимологические и биохимические показатели сыворотки крови мышей при подострой интоксикации тетрахлорметаном на фоне повышенной физической нагрузки 49 3.4. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на концентрацию восстановленного глутатиона и продуктов ПОЛ в ткани печени мышей при подострой интоксикации тетрахлорметаном на фоне повышенной физической нагрузки 52 Глава 4. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на морфологические, гистохимические, иммуногистохимические показатели печени мышей при подострой интоксикации тетрахлорметаном в условиях повышенной физической нагрузки 60 4.1. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на гистоморфологическую картину печени мышей 60 4.2. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на ряд гистохимических показателей печени мышей 68 4.3. Иммуногистохимическое исследование печени мышей при подострой интоксикации тетрахлорметаном в условиях повышенной ФН с использованием антител к NO-синтазе 2 и TNF-α 79 Глава 5. Обсуждение результатов 88 ВЫВОДЫ 103 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОММЕНДАЦИИ 104 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105 4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АЛТ ………… аланинаминотрансфераза АСТ ………… аспартатаминотрансфераза ВГ …………… восстановленный глутатион ДК …………… диеновые конъюгаты ДТНБ……….. 5,5’- дитио-бис (2-нитробензойная кислота) ЛДГ…………. лактатдегидрогеназа МДА ………… малоновый диальдегид ПОЛ ………... перекисное окисление липидов СРО…………. свободнорадикальное окисление ТБК ………… 2-тиобарбитуровая кислота ТРИС .………. трис(гидроксиметил)аминометан ФВ .…………. физическая выносливость ФН ………… физическая нагрузка ФОС………... фосфороорганические соединения ЩФ ………… щелочная фосфатаза 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования. Последнее время в общей структуре заболеваний значительную долю занимают патологии гепатобилиарной системы. Одной из наиболее распространенных причин данных заболеваний являются воздействия гепатотоксических агентов (Шульпекова Ю.О., 2010; Kondo K. et al., 2012; Sarkar C. et al., 2014). К ним относятся многие лекарственные препараты, алкоголь, вещества, загрязняющие окружающую среду и др. Помимо токсических поражений отрицательное влияние на печень могут оказывать также другие неблагоприятные факторы, в частности, интенсивная физическая нагрузка (Davies K.J. et al., 1982; Kan N.-W. et al., 2013; Pettersson J. et al., 2007). В работах ряда авторов (Михайлов С.С., 2004; Huang C.C.et al., 2013; Vina J. et al., 2000; Yoon Mi.Y. et al., 1997) показано, что функциональная нагрузка на печень, а следовательно, и тяжесть ее токсических поражений, увеличивается в условиях повышенной физической нагрузки. Ввиду того, что широкий круг специалистов (спортсмены, военнослужащие, работники сельского хозяйства и промышленности, персонал аварийно-спасательных формирований и т.д.) подвергается воздействию профессиональных экстремальных факторов и не изолированы от контактов с гепатотоксическими веществами, можно предположить, что в формировании патологических процессов в печени участвуют оба этих фактора. В свою очередь, нарушение функциональной сохранности печени снижает физическую работоспособность и выносливость организма, тем самым формируя «порочный круг». В связи с этим, изыскание методов профилактики и лечения токсических поражений печени на фоне повышенной физической нагрузки с одновременным сохранением физической выносливости является актуальной задачей современной медицины и фармакологии в частности. 6 Одним из способов решения данной проблемы является применение ряда фармакологических средств, повышающих неспецифическую резистентность и адаптационные возможности организма, названных Н.В. Лазаревым адаптогенами (Лазарев Н.В. и др., 1959). Среди них особое внимание стоит уделить препаратам растительного происхождения – фитоадаптогенам (женьшень, элеутерококк, родиола розовая и др.). Основными преимуществами этой группы препаратов являются низкая токсичность и высокая безопасность даже при длительном систематическом применении, а также возможность их превентивного использования (Брехман И.И., 1969; Лупандин А.В., 1990; Синяков А.Ф., 1990; Смагулова Т.Б., 2013). В ряде экспериментов, фитоадаптогены доказали свою безопасность и высокую эффективность в отношении различных ядов, обладающих разнонаправленным токсическим действием на организм (Марина Т.Ф., Прищеп Т.П., 1964; Молоковский Д.С., 1990; Alhassan M.S.et al., 2009; Glenn C., Gum S.I. et al., 2007; Feldman S.R., 2011; James L.P.et al., 2003; Wu Y.L. et al., 2009 и др.). В настоящей экспериментальной работе в качестве объектов исследования были выбраны хорошо известные фитоадаптогены (элеутерококк и женьшень), протекторные свойства которых в отношении различных повреждающих агентов были изучены ранее (Брехман И.И., Дардымов И.В., 1966; Водолазский Ю.В., 2000; Дардымов И.В., 1973; Дардымов И.В., 1976; Симонова Н.В., 2004; Park E.J. et al., 2004; Yokozawa T. et al., 2003). Однако до сих пор эти исследования проводились преимущественно в условиях воздействия только одного экстремального фактора. Оценка протекторного действия фитоадаптогенов при сочетанном воздействии направленного гепатотоксического агента, такого как четыреххлористый углерод, на фоне повышенной физической нагрузки не проводилась. Цель исследования - экспериментальное изучение эффективности применения настойки женьшеня и экстракта элеутерококка при токсических поражениях печени в условиях повышенной физической нагрузки. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 7 1.Выявить различия в токсическом действии гепатотоксина на экспериментальных животных в условиях относительного функционального покоя и при повышенной физической нагрузке. 2. Изучить возможность предупреждения CCL4-индуцированных нарушений физической выносливости при курсовом применении настойки женьшеня, экстракта элеутерококка и препарата сравнения - карсила. 3. Изучить гепатопротекторную активность настойки женьшеня и экстракта элеутерококка по сравнению с карсилом (препарат сравнения), по ряду биохимических, энзимологических, гистоморфологических, гистохимических показателей. 4. С помощью иммуногистохимического исследования выявить изменения содержания фермента NO-синтазы 2 и цитокина TNF-α при CCL4-индуцированных поражениях печени на фоне повышенной физической нагрузки и изучить их значение в реализации гепатопротекторного действия исследуемых препаратов. Научная новизна работы: Впервые проведено исследование гепатопротекторного действия настойки женьшеня и экстракта элеутерококка в условиях комплексного воздействия токсического повреждения печени гепатотропным ядом CCL4 и повышенной физической нагрузки на мышах. Физическая нагрузка выступила в роли не только дополнительного повреждающего агента, наряду с гепатотоксином, но и в качестве интегрального показателя состояния здоровья экспериментальных животных. В комплексном исследовании морфологического и функционального состояния печени мышей с оценкой биохимических, энзимологических, гистоморфологических, иммуногистохимических показателей выявлено, что повышенная физическая нагрузка усиливала тяжесть токсического поражения печени экспериментальных животных четыреххлористым углеродом. Ежедневное введение настойки женьшеня 47 мг/кг и экстракта элеутерококка 48,5 мг/кг (в пересчете на сухой остаток) в течение 5 недель оказывало гепотопротекторный эффект в условиях сочетанного воздействия CCL4 и повышенной физической нагрузки сопоставимый с эффектом препарата сравнения - карсила. 8 В иммуногистохимическом исследовании впервые изучено влияние тетрахлорметана, физической нагрузки, исследуемых препаратов на количественный уровень фермента NO-синтазы 2 и цитокина TNF-α в условиях данной экспериментальной модели. Установлено повышенное содержание NOS2 и TNF-α в печени после воздействия CCL4, возрастающее при сочетании с повышенной физической нагрузкой. Показано, что настойка женьшеня и экстракт элеутерококка при курсовом применении в течение 5 недель препятствуют повышению NOS2 и TNF-α в печени. Методология и методы исследования: В соответствии с поставленными задачами были использованы современные информативные подходы. Объектами исследования являлись белые беспородные мыши-самцы. Изучение гепатопротекторных свойств средств растительного происхождения проводилось согласно методическим рекомендациям по доклиническому изучению лекарственных средств (А.Н. Миронов, 2012) с использованием соответствующих методов статистической обработки данных. Научно-практическая значимость: С использованием различных методических подходов получены данные, подтверждающие потенцирование гепатотоксического действия четыреххлористого углерода повышенной физической нагрузкой. Полученные экспериментальные данные о наличии у экстракта элеутерококка и настойки женьшеня гепатопротекторных свойств в отношении комплексного повреждающего действия на печень подострой интоксикации тетрахлорметаном и повышенной физической нагрузки создают основу для дальнейшего исследования с целью расширения показаний их клинического применения. Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения: Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по теме: «Развитие научных и научно-методических основ, базовых и инновационных 9 подходов при разработке, внедрении и применении лекарственных средств»; номер государственной регистрации 01201261653. Положения, выносимые на защиту: 1. При сравнительной оценке динамики массы экспериментальных животных, ряда биохимических, энзимологических, гистоморфологических и гистохимических показателей установлено, что повышенная физическая нагрузка в виде еженедельного плавания до полного утомления с грузом 7 % от массы тела животного увеличивает тяжесть токсических повреждений ткани печени тетрахлорметаном. 2 Ежедневное введение в течение 5 недель настойки женьшеня 47 мг/кг и экстракта элеутерококка 48,5 мг/кг (в пересчете на сухой остаток) в условиях сочетанного воздействия на печень гепатотоксина – CCL4 и повышенной физической нагрузки оказывает выраженный гепатопротекторный эффект, сопоставимый с таковым при применении препарата сравнения – карсила. 3. Экспериментально установлено, что CCL4-индуцированное поражение печени приводит к повышению содержания фермента NOS2 и цитокина TNF-α в печени, а интенсивная физическая нагрузка усугубляет этот процесс. 4. Введение настойки женьшеня 47 мг/кг и экстракта элеутерококка 48,5 мг/кг (в пересчете на сухой остаток) (ежедневно в течение 5 недель) предупреждают накопление как фермента NOS2, так и цитокина TNF-α. Личный вклад автора: Автор провел анализ отечественной и зарубежной литературы по теме диссертационной работы, самостоятельно выполнил экспериментальную часть исследования. При активном участии автора были проведены гистологическое, гистохимическое, иммуногистохимическое исследования ткани печени экспериментальных животных. Непосредственно автором выполнена статистическая обработка, описание и анализ полученных результатов, сформулированы выводы и научно-практические рекомендации. Публикации по основным положениям диссертационной работы подготовлены при активном участии автора. 10 Степень достоверности и апробация результатов: Высокий уровень достоверности результатов работы подтверждается достаточным объемом экспериментальных данных, использованием высокотехнологического оборудования, адекватных современных методов и критериев статистической обработки данных. Основные результаты исследования представлены на научно-практическом семинаре «Использование этно-медицинских практик народов Тувы в создании лекарственных препаратов и биологически активных добавок» (декабрь 2012 г., Москва); на первой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» (ноябрь 2013 г., СанктПетербург); на XX международной научно-практической конференции «Научная дискуссия: Вопросы медицины» (декабрь 2013 г., Москва); на X Международной научно-практической конференции «Современная европейская наука - 2014» (июль 2014 г., Шеффилд); на Международной научно-практической конференции «Роль медицины в развитии общества» (август 2014 г., Уфа); на расширенном заседании лаборатории биологически активных соединений НИИ Фармации ПМГМУ им. И.М. Сеченова (27 октября 2014 г., Москва). Публикации: По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации для публикации научных результатов диссертаций, 4 статьи и 2 тезиса в сборниках материалов российских и международных конференций. Объем и структура работы: Диссертация изложена на 126 страницах печатного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, научно-практических рекомендаций и списка литературы, включающего 91 отечественных и 113 зарубежных источников. Работа содержит 8 таблиц и 32 рисунка. 11 Глава 1. Обзор литературы. 1.1.Токсические гепатиты. На протяжении всей своей жизни человек контактирует с огромным количеством химических соединений, в т.ч. токсическими. При этом одним из наиболее часто поражаемых токсинами органов является печень, поскольку именно она осуществляет основные метаболические и биотрансформационные процессы. Острые и хронические заболевания печени, вызываемые различнымиксенобиотиками, называются токсическими гепатитами (Корсун В.Ф., 2005). Спектр достаточно веществ, широк. приводящих Это к химические развитию токсических соединения, гепатитов, используемые в промышленности и сельском хозяйстве (галогенорганические, фосфороорганические, производные бензола и др.), и различные группы лекарственных средств (противотуберкулезные препараты, нестероидные противовоспалительные средства, антибиотики и т.д.), в том числе и алкоголь. (Амбрушкевич Ю.Г., 2003; Chow J.H, Chow C., 2006; Stephens C., 2014). Лекарственные препараты в 40% случаев являются причиной развития гепатитов у пациентов старше 40 лет. (Ильченко Л.Ю., 2003), а алкогольные гепатиты составляют 60-70 % от всех токсических повреждений печени (Abraham P. et al., 2009). Результаты многочисленных исследований показали, что действие ряда гепатотоксинов различной природы (четыреххлористый углерод, акрилонитрил, лекарственные препараты, алкоголь) основано на свободнорадикальном механизме (Nan J.X. et al., 2003; Karsan H.A., Parekh S., 2012; Sharma, S.K. et al., 2012). Непосредственно сам этанол и образующийся из него ацетальдегид, активные формы кислорода, которые образуются при метаболизме этанола с участием цитохрома Р-450 и в процессе окисления ацетальдегида, гидроксиэтильные радикалы и другие продукты ПОЛ являются ведущими факторами возникновения алкогольных гепатитов (Апросина З.Г., 1996; Терехов А.Ю., 2006). Ряд исследований показали, что при алкогольных гепатитах наблюдается рост продуктов перекисного окисления липидов, что коррелирует с увеличением интенсивности свечения и «быстрой 12 вспышкой» железо-инициируемой хемилюминесценции, а также НАДФ- зависимой хемилюминесценции, определяемых в субклеточных фракциях гепатоцитов (Бушма, М.И, 2003; Kono, H. et al., 2000). С целью экспериментального изучения гепатопротекторного действия лекарственных препаратов применяются различные модели токсического поражения печени. Например, D-галактозамин, являющийся индуктором свободных радикалов, вызывает поражение печени, которое по биохимическим и морфологическим показателям сходно с вирусным гепатитом человека и используется для моделирования острого гепатита у экспериментальных животных (Венгеровский, А.И., 2012; Moravcova, A. et al., 2014). Гепатотоксин аллиловый спирт, моделирующий вирусный гепатит А, окисляется цитозольной и митохондриальной алкогольдегидрогеназой до метаболита акролеина, который в свою очередь интенсифицирует процессы ПОЛ за счет дефицита в гепатоцитах восстановленного глутатиона (Саратиков, А.С. и др., 2005). Для моделирования лекарственных гепатитов наиболее часто используют тетрациклин (Shen, C. et al., 2009; Glenn, C., Feldman S.R., 2011) или парацетамол (ацетаминофен) (Edakkadath, R.S. et al., 2010; Rezende, T.P. et al., 2014). Следует отметить, что при исследовании гепатопротекторных свойств фитоадаптогенов, по нашему мнению, более пристальное внимание следует уделить подострым и хроническим печеночным интоксикациям, поскольку в большинстве случаев токсические вещества попадают в организм человека в небольших количествах и в течение длительного времени (прием лекарственных препаратов, потребление алкоголя, контакт с пищевыми консервантами, химическими веществами, используемыми в промышленности, сельском хозяйстве, быту и т.д.). Однако анализ доступной литературы показал, что в экспериментальных работах преимущественно используются модели острых печеночных интоксикаций, а также недостаточно внимания уделяется направленному изучению гепатопротекторных свойств различных фармакологических агентов, и фитоадаптогенов в частности, в условиях комплексного воздействия на печень нескольких неблагоприятных факторов. 13 1.2. Механизм действия тетрахлорметана Одним из эталонных гепатотропных ядов, широко применяемых для моделирования острых, подострых, хронических токсических гепатитов, является четыреххлористый углерод. CCL4 – токсичное, высоколипофильное соединение, оказывающее направленное повреждающее действие на клетки печени, приводя к развитию жировой дистрофии и колликвационного некроза (Фруентов Н.К., 1956; McCuskey R.S., Sipes I.G., 2010). Установлено, что патогенетическое действие данного яда обусловлено свободнорадикальными продуктами, образующимися в процессе его метаболизма при участии цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системы. Образующиеся химически активные радикалы CCl3∙ и, при наличии кислорода, CCl3OO∙ являются индукторами перекисного окисления липидов мембран клеток. Они взаимодействуют с ненасыщенными жирными кислотами, отнимая у них атом водорода, в результате чего образуются липидные пероксильные радикалы, запускающие каскад цепных реакций с образованием продуктов, обладающих радикальными свойствами (см. рисунок 1). Таким образом реализуется прооксидантное действие CCL4. При этом характерные поражения можно наблюдать в митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, что отражается на активности внутриклеточных ферментов (глюкозо-6-фосфатазы, НАД˙Н2-оксидазы, сукцинатдегидрогеназы, цитохромоксидазы, глутаматдегидрогеназы, АТФазы, альдегиддегидрогеназы), приводит к снижению детоксикационной функции печени, оказывает ингибирующее действие на процессы биосинтеза белка, вызывает разрушение РНК, рибосом, полисом, разобщение процессов окислительного фосфорилирования и тканевого дыхания (Свиридов М.М., 2006; Alhassan A.J. et al., 2009). 14 Рис. 1. Метаболизм CCL4 в печени и каскад реакций ПОЛ (McCuskey R.S., Sipes I.G., 2010). В результате нарушения целостности наружной мембраны гепатоцитов в плазме крови нарастает, а в печени снижается содержание аминотрансфераз (аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза), индикаторов холестаза (щелочная фосфатаза, 5-нуклеозидазы, γ-глутамилтранспептидазы, изоферментов лактатдегидрогеназы, альдолазы), что может приводить к поражению тканевых структур внутренних органов (Zhang Z.F. et. al., 2014). Ряд литературных данных подтверждает, что важным свидетельством стимулирующего влияния CCL4 на процессы перекисного окисления в мембранах гепатоцитов является резкое возрастание образования промежуточных продуктов пероксидации - диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА). 15 Концентрация МДА прямо пропорциональна интенсивности процессов ПОЛ. Снижение уровня МДА и ДК под действием какого-либо исследуемого препарата позволяет судить о его ингибирующем влиянии на процессы перекисного окисления (Дынжинова Е.А., 2007; Al-Harbi N.O. et al., 2014). Контроль свободнорадикальных реакций, протекающих в организме, осуществляется благодаря многоуровневой защитной системе, которая включает в себя ферментативные и неферментативные звенья. Восстановленный глутатион (ВГ) является составной частью как неферментативного звена антирадикальной системы, обезвреживая перекиси и гидроперекиси, которые являются источниками OH˙- радикалов, так и ферментативного звена, выполняя функции кофактора глутатионпероксидазной/глутатионредуктазной системы, тем самым выполняя детоксикационную и антиоксидантную функции (Агарков А.А., 2009; Iskusnykh I.Y. et al., 2013; Senft A.P. et al., 2000). Также ВГ является потенциальным источником цистеина, принимает участие в биохимических превращениях витаминов С, Е, липоевой кислоты, которые сами по себе являются антиоксидантами и оказывают защитное действие в отношении гепатоцитов (Агарков, А.А. и др., 2008; Искусных, И.Ю., 2012; Минаева Л.В., 2007). Обращает на себя внимание тот факт, что при интоксикации четыреххлористым углеродом, являющимся мощным индуктором свободнорадикальных реакций, происходит снижение содержания восстановленного глутатиона в тканях печени, что лишний раз подтверждает направленное повреждающее действие CCL4 на компоненты защитной системы тканей печени (Кулагин О.Н. и др., 2009; Shim J.-Y. et al., 2010; Teare J.P. et al., 1993; Williams A.T., Burk R.F., 1990). Необходимо также обратить внимание на важный регулятор метаболизма, оксид азота (NO), который принимает участие в патогенезе многих заболеваний, в том числе и в патогенезе CCL4-индуцированного токсического гепатита (Близнецова Г.Н. и др., 2005; Степанова Н.А., 2003; Al-Shabanah O. A. et al., 2000). Оксид азота в гепатоцитах продуцируется преимущественно индуцибельной NO-синтазой (iNOS), индукция которой происходит в ответ на воспалительное действие многих цитокинов, синтез которых, в свою очередь, повышается при ге- 16 патотоксическом воздействии тетрахлорметана (Висмонт Ф.И., Степанова Н.А., 2014; Тейлор Б.С. и др., 1998). Характер изменений детоксикационной функции печени при увеличении синтеза оксида азота неоднозначен. Так, свободнорадикальная природа NO обуславливает двоякую роль, которую он играет в развитии патологических процессов. С одной стороны, оксид азота способен активировать каскад свободнорадикальных реакций, а с другой стороны ингибировать их. При этом его защитные свойства связаны с возможностью NO повышать активность антиоксидантных ферментов, предотвращать апоптоз и ослаблять токсикоз печени, вызываемые TNF-α, а также замедлять процессы ПОЛ, выступая в качестве своего рода поглотителя активных форм кислорода. В зависимости от множества факторов (природы, количества повреждающего агента и т.д.) оксид азота будет по-разному влиять на патогенез заболевания (Нарциссов Я.Р., Серая И.П., 2002; Шупик М.А., 2012; Ai G. et al., 2013; Cho Y.K. et al., 2009; Laskin J.D. et al., 2001; Minin E.A. et al., 2006). Кроме того, повышение образования оксида азота при токсическом повреждении печени посредством расширения сосудов и гиперемии позволяет перераспределить пластические ресурсы и кислород для восстановления нарушенных функций, выполняя тем самым адаптационную (в данном случае регенераторную) функцию (Салей А.П. и др., 2009; Matei V. et al., 2008). По данным ряда авторов, фактор некроза опухоли - α (TNF-α) также играет важную роль в развитии цитолитического действия CCL4 и оказывает влияние на продукцию оксида азота в клетках Купфера (макрофагов) и гепатоцитах. Ранее было доказано, что тетрахлорметан стимулирует выработку в печени как TNF-α, так и оксида азота (NO) (Bautista et al., 1991; Feder L.S., Laskin L.D., 1994; Tanaka N. et al., 1999; Tipoe, G.L et al., 2006). Однако, как показало исследование L.A. Morio и соав. (Morio L.A. et al., 2001), мыши с нокаутом по гену, который отвечает за биосинтез TNF-α и с блокадой рецептора TNFК1/p55 (через который опосредуются эффекты TNF-α), продемонстрировали меньшую чувствительность к гепатотоксическому действию тетрахлорметана, а подопытные животные с блокированной функцией NO-синтазы в печени (NOS 2) продемонстрировали больший гепа- 17 тотоксический эффект CCL4 по сравнению с контрольными животными (wildtype), что подтверждалось гистологическим исследованием тканей печени и уровнем АЛТ и АСТ в сыворотки крови мышей. Также было обнаружено, что оксид азота может влиять на выработку TNFα, уменьшая его активность, при воздействии на печень различных токсических агентов, в том числе и CCL4 (Гарбузеко Д.В., 2008; Bohlinger I. et al., 1995; Florquin S. et al., 1997; MacMicking J.D. et al., 1997). В свою очередь и фактор некроза опухоли в ряде случаев контролирует активность NO-синтазы в печени, что было продемонстрировано на мышах с нокаутом по гену, который отвечает за биосинтез TNF-α. У таких животных после введения четыреххлористого углерода задерживалась экспрессия NOS 2 по сравнению с контрольной группой. Хотя эти результаты не однозначны и существуют данные, демонстрирующие, что после введения тетрахлорметана трансгенным мышам с блокадой рецептора TNFК1/p55 активность NO-синтазы в печени сходны с таковой у контрольных животных (Jones B.E., Czaja M.J., 1998;Yap G.S. et al., 1998). Таким образом, проведя анализ доступной литературы, можно сделать вывод о том, что четыреххлористый углерод обладает сложным патогенетическим механизмом гепатотоксического действия, затрагивающим многие звенья защитных систем печени. Несмотря на достаточно большое количество публикаций по этой теме, многие вопросы остаются недостаточно изученными. 1.3. Фитоадаптогены как средства неспецифического действия, обладающие гепатопротекторной активностью. Одним из путей решения актуальной задачи современной медицины – разработки действенных и безопасных методов профилактики и лечения токсических поражений печени, является использование лекарственных средств, защищающих печень от воздействия повреждающих факторов и ускоряющих ее восстановление после него – гепатопротекторных препаратов (Корсун В.Ф. и др., 2005; Лебедев В.А., 2014). 18 По современным представлениям фармакологический эффект гепатопротекторного средства может реализовываться с помощью следующих механизмов (Саратиков А.С. и др., 2005): - посредством его антиоксидантного действия – витамины (ретинол, αтокоферол, пантотеновая кислота и др.), средства на основе растительных полифенолов (легалон, силибор, фламин и т.д.), тиолы (цистеин, N - ацетилцистеин); - засчет способствования репарации мембран гепатоцитов – препараты фосфолипидов (эссенциале, липостабил); - через стимуляцию регенерации паренхимы печени (метионин, кальция пангамат, цитидин, оротовая кислота). Для профилактики и лечения печеночных поражений в настоящее время рекомендуются к использованию множество лекарственных средств, в том числе и растительного происхождения. Благодаря своему гепатопротекторному действию они предотвращают и/или нормализуютфункциональные нарушения функционирования печени и способствуют ее структурной сохранности, обладая при этом высокой безопасностью даже при длительном систематическом применении (Абдурахманов Т.М. и др., 1997; Венгеровский А.И. и др., 2004). В ряду растительных средств, с выраженным гепатопротекторным действием, особое место занимают лекарственные препараты, повышающие неспецифическую резистентность и адаптационные возможности организма – фитоадаптогены (экстракты родиолы розовой, элеутерококка, женьшеня, аралии, лимонника и др.) (Лазарев Н.В., 1959). Основным фармакологическим свойством фитоадаптогенов является способность действовать неспецифично и универсально, расширяя границы адаптации человека к экстремальным факторам различной природы (стрессам, различным видам радиаций, резким климатическим изменениям, физическим нагрузкам, интоксикациям отравляющими веществами с различным токсическим механизмом и т.д.) (Брехман И.И., Дардымов И.В., 1966; Саратиков А.С., 1974; Сейфулла Р.Д. и др., 2009). При этом их действие проявляется, в том числе в предохранении тканей от деструкции, антиоксидантном и мембраностабилизирующем действии, 19 оптимизации обменных процессов (Болдогуев В.М., 2011; Большакова И.В. и др., 1997; Левина Л.В., 1991; Саратиков А.С., 1974; Chen T.S. et al., 2008). Также обязательными свойствами фитоадаптогенов являются их высокая безопасность, низкая токсичность, отсутствие привыкания и отрицательного последействия даже при длительном систематическом применении (Брехман И.И., 1969; Крендаль Ф.П. и др., 2007). При их действии положительный эффект осуществляется не за счет стимуляции каких-либо процессов, а за счет оптимизации функций организма. Эти особенности позволяют использовать регулярный прием фитоадаптогенов в качестве превентивной меры при угрозе воздействия неблагоприятного фактора (Резенькова О.В., 2003; Panossian A.G., 2013; Panossian A.G., 2014). В многочисленных экспериментах фитоадаптогены доказали свою безопасность и высокую эффективность в отношении различных ядов, обладающих разнонаправленным токсическим действием на органы и ткани. В том числе обращает на себя внимание их выраженная гепатопротекторная активность, что было доказано в отношении таких опасных ядов, как хлорорганические, фосфороорганические соединения, тетрациклин, алкоголь и др. (Воронова А.В., 2011; Дардымов И.В., 1986; Додонов Н.С., 2007; Козин С.В., 1998; Козин С.В. и др., 2014; Кулагин О.Н. и др., 2009; Kang J.W. et al., 2012). Так в работе Е.В. Крюковской (Крюковская Е.В., 1990) исследовали антитоксическую активность настойки аралии на лягушках при острой интоксикации четыреххлористым углеродом (в дозе 0,1 мл 2,5% масляного раствора CCL4). На основе полученных экспериментальных данных были сделаны выводы о том, что настойка аралии оказывала выраженное профилактическое действие при интоксикации CCL4, усиливали процессы детоксикации, о чем достоверно свидетельствовали задержка сроков угасания и ускорение восстановления рефлексов ЦНС и снижение процента гибели экспериментальных животных. В экспериментах на белых крысах линии Wistar А.С. Туесонова (Туесонова А.С., 2011) доказала, что комплексный фитоадаптоген «Адаптон-6», содержащий шиповник, боярышник, облепиху, астрагал, левзею, ревень, созданный на основе 20 прописи тибетской медицины, после курсового введения достоверно проявлял антитоксическое действие в отношении четыреххлористого углерода (50 % масляный раствор в дозе 0,4 мл/100 г. в течение трех дней). Более подробно остановимся на работе Д.С. Молоковского (Молоковский Д.С., 2004). На модели острой интоксикации четыреххлористым углеродом (2,5 мл/кг) на мышах были проведены исследования целого ряда фитоадаптогенов: препаратов женьшеня как природного, так и биотехнологического происхождения, настоек аралии, заманихи, лимонника, экстрактов корней родиолы и элеутерококка. В результате экспериментов было выявлено, что профилактическое применение препаратов фитоадаптогенов способствует сохранению детоксикационной функции печени, тормозит активацию перекисного окисления липидов, вызванную CCL4, уменьшает выраженность нарушений проницаемости мембран гепатоцитов. Также отмечалась тенденция к повышению гликогена в печени, содержание которого снижалось при действии тетрахлоруглерода. Критериями оценки защитного действия препаратов в отношении печени служили показатели ферментов, характеризующих функцию печени (аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, альдолаза), продолжительность тиопенталового наркоза и содержание малонового диальдегида, гистоморфологическая картина печени. Защитное действие фитоадаптогенов автор связывает с антиоксидантными свойствами этих препаратов, а терапевтическую эффективность – с влиянием на восстановительные биосинтетические процессы в печени. В серии экспериментов при интоксикации различными дозами гепатотоксина CCL4 выраженное защитное действие проявили препараты на основе женьшеня (Karakus E. et al., 2011; Shim, J.-Y. et al., 2010; Bak M.J. et al., 2012). Стоит отметить также исследование антитоксических свойств салидрозида, гликозида родиолы розовой, (в дозах 20, 50 и 100 мг/кг), проводимое Yan-Ling Wu и соавторами (Wu Y.L. et al., 2008), на мышах-самцах при острой интоксикации модельным гепатотоксином парацетамолом (однократное введение в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно). Результаты гистологического и иммуногистохимическо- 21 го анализов показали, что салидрозид препятствует снижению уровня внутриклеточного глутатиона и повреждению гепатоцитов продуктами ПОЛ. В экспериментальных работах (Дардымов И.В., 1986; Крендаль Ф.П. и др., 2007) профилактическое применение препаратов элеутерококка уменьшало последствия острого отравления четыреххлористым углеродом. При этом было выявлено, что антитоксическое действие элеутерококка и других адаптогенов усиливается при курсовом применении и обусловлено его неспецифическими, резистогенными и адаптогенными действиями. Обращает на себя внимание, что свое гепатопротекторное действие фитоадаптогены демонстрировали и в экспериментах, где в качестве модельных ядов использовались вещества, в механизме токсического действия которых поражение печени не являлось основным. Так, в исследованиях А.И. Елькина (Елькин А.И., 1981) при интоксикациях животных рядом отравляющих веществ (анилином, азотистокислым натрием, хлорофосом, несимметричным диметилгидразином) препараты женьшеня, элеутерококка, родиолы розовой нормализовали показатели, характеризующие функцию печени. Более того, их антитоксическое действие автор связывает, в том числе и с защитой гликогенсинтезирующей и обезвреживающей функцией печени. Также можно отметить, что в экспериментальных работах (при интоксикации несимметричным диметилгидразином) защитные свойства родиолы в отношении печени во многом были сходны с таковыми у экстракта элеутерококка, а в ряде случаев превосходили его. Любопытно отметить, что в экспериментальной работе по изучению антитоксических свойств экстракта родиолы и настойки из биомассы культуры ткани родиолы розовой в условиях хронической интоксикации крыс фосфороорганическими инсектицидами (хлорофосом и карбофосом) С.В. Козиным были обнаружены их защитные свойства в отношении печени (Козин С.В., 1998; Козин и др., 2014). Это проявлялось в нормализации ряда биохимических, энзимологических показателей, характеризующих сохранность печени, а также гистоморфологической картины печени. Автор связывает защитное действие препаратов родиолы в 22 отношении изученных фосфорорганических инсектицидов, в том числе и с их гепатопротекторным действием. Таким образом, можно сделать вывод, что протекторное действие, в частности антитоксическое ряда препаратовиз группы фитоадаптогенов, реализуется в том числе, с помощью их гепатопротекторных свойств. Необходимо отметить, что изучение фармакологического действия фитоадаптогенов имеет свои особенности, как то: необходимость длительного применения препаратов для развития максимального терапевтического эффекта (не менее 2-3 недель); необходим подбор адекватной дозы фитоадаптогена, поскольку их кривая «доза-эффект» имеет «куполовидный» характер и неосторожное повышение дозы может привести к снижению или даже утрате эффекта (Дардымов И.В., 1973; Крендаль Ф.П. и др., 2007); также нужно обратить внимание на то, чтобы неблагоприятные воздействия в экспериментальных моделях не были излишне интенсивными, иначе препараты не обнаружат свое фармакологическое действие. Рассмотрим подробнее описанные в доступной литературе экспериментальные модели токсических поражений печени, использующиеся для изучения гепатопротекторных свойств фитоадаптогенов. Так в работе Д.С. Молоковского (Молоковский Д.С., 2004) при изучении нарушений в гепатоцитах и механизмов гепатопротекторных свойств фитоадаптогенов (настойки корней женьшеня, аралии, заманихи, лимонника, препараты из культуры тканей женьшеня, экстракты корней родиолы, элеутерококка, левзеи) использовалась модель острого токсического гепатита, вызванного четыреххлористым углеродом. Деалкоголизированные фитоадаптогены вводили животным внутрижелудочно в идентичных дозах – 12,5-25,0 мл/кг массы животного. Для оценки морфофункциональных нарушений в гепатоцитах на 8-й день после инъекции CCL4 в сыворотке крови крыс определяли концентрации ряда биохимических показателей (γ-глютамилтранспептидазу, щелочную фосфатазу, холинэстеразу, холестерин, триглицериды). Показателем оценки детоксицирующей функции печени служил барбитуратовый тест - о функциональной сохранности печени судили по продолжительности наркотического сна. 23 При изучении профилактического действия фитоадаптогенов препараты вводили превентивно в течение 6-7 дней один раз в сутки внутрижелудочно, CCL4 в дозе 2,5 мл/кг 50 % масляного раствора подкожно. При изучении лечебного гепатопротекторного действия фитопрепаратов четыреххлористый углерод вводился аналогично в дозе 5 мл/кг массы тела животного. После инъекции токсина животные получали фитоадаптогены в течение 6-7 дней. Через 24 часа после последнего введения фитопрепаратов проводили тиопенталовый тест, а также забор крови и печени животных. Интересно также отметить работу Ji-Young Shim и соавторов (Shim J.Y. et al., 2010), в которой при исследовании гепатопротекторной активности водного экстракта женьшеня на мышах-самцах (животные получали экстракт перорально в дозе 100 мг/кг за 24 часа до введения тетрахлорметана) в качестве гепатотоксина использовался четыреххлористый углерод. Гепатотоксин в виде 2,5% раствора на оливковом масле вводили внутрибрюшинно в дозе 1мл/кг массы животного однократно. Через 24 часа после введения CCL4 оценивали уровни активности аспартат- и аланинаминотрансферазы, активности каталазы и супероксиддисмутазы, уровни восстановленного глутатиона, малонового диальдегида в гомогенате тканей печени, гистологические изменения печени, а также уровень воспалительных цитокинов в крови. Также нам представляется перспективным рассмотреть некоторые экспериментальные модели интоксикаций, которые также использовались для изучения протекторных свойств различных растительных лекарственных средств, не относящихся к фитоадаптогенам. Так А.Ю. Тереховым (Терехов А.Ю., 2006) для изучения защитного действия биологически активных веществ из цветков бархатцев распростертых использовались индометациновая и тетрахлоруглеродная модели гепатопатий. Эксперимент проводился на белых беспородных мышах и крысах обоего пола. Модель CCL4-гепатоза воспроизводили путем введения внутрижелудочно через зонд 3 раза через день 50 % масляного раствора CCL4 в вазелиновом масле в дозе 0,15 мл/100г массы животного, либо 50 % масляный раствор CCL4 вводили 24 подкожно 0,4 мл/100г массы 1 раз в сутки в течение четырех дней. Экспериментальная модель острого поражения печени индометацином воспроизводили следующим образом: индометацин в виде водной суспензии в дозе 10 мг/кг массы животного перорально вводили животным троекратно (один раз в сутки каждый день). Оценку функционального состояния печени при остром CCL4-гепатозе и индометациновом поражении проводили по следующим показателям: активность аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, холинэстеразы в сыворотке крови, тимоловой пробе сыворотки крови, содержанию общего и связанного билирубина в сыворотке крови, содержанию холестерина, триглицеридов, фосфолипидов в сыворотке крови и печени, содержанию белка и гликогена в печени, гистологической картине печени животных. В экспериментальных работах, проведенных А.И. Венгеровским (Венгеровский А.И, 1991), изучалась способность гепатозащитных средств – эплира и салсоколлина устранять структурно-метаболические и функциональные нарушения в печени при различных токсических гепатитах. Мыши получали ежедневно в течение шести суток внутрижелудочно изучаемые гепатопротекторы и 1 мл/кг CCL4 в 10 % растворе оливкового масла. В эксперименте на крысах им через зонд вводили изучаемые препараты и в те же сроки один из перечисленных гепатотоксинов: CCL4 – 1,25 мл/кг в 50 % масляном растворе в течение четырех дней; парацетамол – 2500 мг/кг в 25 % суспензии на крахмальной слизи 2 дня; аллиловый спирт – 100 мг/кг в 1 % водном растворе 2 дня; D-галактозамин – 500 мг/кг в 5 % водном растворе 2 дня; гидразин солянокислый – 200 мг/кг в 2 % водном растворе 2 дня. Далее определяли выживаемость животных, динамику массы тела, относительную массу печени, длительность гексеналового сна, бромсульфалеиновую пробу и целый ряд других показателей, характеризующих функциональное состояние печени: гистологическое строение, содержание РНК, белка, гликогена, активность ферментов печени, ультраструктуру гепатоцитов, экскреторную функцию печени, антитоксическую функцию печени, скорость образования продуктов ПОЛ и активность антиоксидантной системы печени, 25 содержание фракций липидов и фосфолипидов печени, содержание липидов, белка, глюкозы, активность ферментов печеночного происхождения в крови. Для изучения фармакотерапии фитопрепаратами (экстракт горечавки бородатой, экстракт зубчатки, желчегонный, антигепатотоксический чай, калефлон) повреждений органов гепатобилиарной системы С.М. Николаев (Николаев С.М., 1988) использовал модель острой интоксикации печени тетрахлоруглеродом. Белым крысам вводили 50 % масляный раствор CCL4 в дозе 4 мл/кг массы животного ежедневно в течение четырех дней. Динамика процессов свободнорадикального окисления липидов печени фиксировалась с помощью метода хемилюминесценции. В экспериментальной работе Surendra Kr. Sharma и соавторов (Sharma S.K. et al., 2012) для изучения гепатопротекторных свойств спиртового экстракта корней винограда культурного (Vitis vinifera L.) использовалась тетрахлоруглеродная модель токсического гепатита. В течение 7 дней однократно ежедневно крысы получали 0,5 мл/кг 50 % масляного раствора CCL4 внутрибрюшинно. На восьмой день проводили забор крови и образцов ткани печени. Функциональное состояние печени после интоксикации оценивали по следующим показателям: активность аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, содержание билирубина в сыворотке крови и по гистологической картине печени животных. Еще одним экспериментальным гепатотоксином является тетрациклин, используемый в работе Н.Ю. Баган (Баган Н.Ю., 1991). Этот антибиотик обладает прямым повреждающим действием на печень и относится к ингибиторам ферментов. В эксперименте крысам внутрижелудочно вводилитетрациклин в виде взвеси на 1 % крахмальном клейстере с помощью шприца и металлического катетера по 0,5 г/кг, ежедневно в течение пяти дней. В качестве второго повреждающего агента использовали четыреххлористый углерод. Животным под кожу вводили 50 % масляный раствор CCL4 в дозе 4 мл/кг массы животного ежедневно в течение четырех дней. 26 Ряд авторов связывают гепатопротекторное действие фитоадаптогенов с их антиоксидантными и мембраностабилизирующими механизмами (Козин С.В. и др., 2014; Крендаль Ф.П. и др., 2007; Резенькова О.В., 2003; Baranova V.S. et al., 2012). Одним из основных патогенетических механизмов развития различных патологий, в том числе токсических поражений печени, является активация перекисных процессов, что приводит к повреждению свободными радикалами мембранных клеточных структур и, соответственно, нарушению клеточных функций (Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И., 1985; Özben T., 1998). Многочисленными экспериментами, проводимыми как на моделях in vitro (Бизунок Н.А., 2001; Большакова И.В. и др., 1997; Большакова И.В. и др., 1997; Винер Б.М. и др., 1992; Воскресенский О.Н. и др., 1986; Гоненко, В.А. и др., 1969; Левина Л.В., 1991; Hong J. et al., 2014; Nan J.X. et al., 2003; Yu C.Y. et al., 2003; Zhu L. et al., 2005 и др.), так и на моделях in vivo (Левина Л.В., 1991; Чехани Н.Р. и др., 2012; Jiang R. et al., 2014; Jiao L. et al., 2014; Hu D. et al., 2012 и др.), была доказана высокая антиоксидантная активность фитоадаптогенов. Их антиоксидантное действие может осуществляться как за счет прямого ингибирования реакций свободнорадикального окисления, так и через активацию эндогенной антиоксидантной системы организма. Так в работе Д.С. Молоковского (Молоковский Д.С., 1990), было выявлено, что препараты женьшеня и других фитоадаптогенов значительно ослабляли и в некоторых случаях полностью предотвращали активацию ПОЛ в печени при CCL4–индуцированном гепатите, что подтверждалось снижением уровня малонового диальдегида в крови экспериментальных животных. В экспериментах при модельных интоксикациях аллоксаном и четыреххлористым углеродом (веществами, обладающими свободнорадикальным механизмом повреждения), по мнению автора, элеутерококк проявил антитоксическое действие, связанное с прямым или косвенным антиоксидантным действием. По мнению И.В. Дардымова (Дардымов И.В. и др., 1973), одним из вероятных способов осуществления защитного действия женьшеня и элеутерококка мо- 27 жет быть как прямое влияние на свободные радикалы, так и опосредованно через увеличение количества НАДФ˙Н (донора водорода). Автор также экспериментально подтвердил антирадикальное действие элеутерококка при профилактическом применении суммы элеутерозидов при интоксикации аллоксаном. Работы зарубежных авторов также подтверждают антиоксидантное действие препаратов на основе женьшеня и элеутерококка. (Hong J. et al., 2014; De Sanctis R. et al., 2004; Yamambe N. et al., 2013; Yokozawa T. et al., 2003). Таким образом, с высокой степенью вероятности можно утверждать, что в гепатопротекторных свойствах при антитоксическом действии фитоадаптогенов большую, если не ведущую роль, играет антиоксидантный механизм. Также в качестве одного из возможных механизмов гепатопротекторного действия фитоадаптогенов при токсических поражениях печени можно предположить их мембраностабилизирующее действие. В частности, в экспериментах по методике А.Н. Ванюшкина (Ванюшкин А.Н. и др., 1994; Ванюшкин А.Н. и др., 1996) изучалось мембранотропное действие фитоадаптогенов. Методика основана на оценке резистентности мембран эритроцитов человека. Опираясь на то, что фитоадаптогены, как было сказано выше, обладают антиоксидантными свойствами, авторы предположили, что они способны проявлять мембраностабилизирующие свойства, что и было экспериментально подтверждено. Таким образом, в зависимости от вида неблагоприятного фактора, воздействующего на организм, адаптогены способны вызывать и поддерживать нужную адаптационную реакцию, обеспечивая резистентность в каждом конкретном случае. Подобная универсальность позволяет использовать фитоадаптогены в том числе и в условиях повышенной физической нагрузки, когда проявляются их актопротекторные свойства. Так, в исследовании Т.Б. Смагуловой (Смагулова Т.Б., 2013) актопротекторных свойств комплексного фитоадаптогенного средства «Фитотон» использовался метод плавания экспериментальных крыс с грузом 7 % от массы тела до полного утомления. Было установлено, что его курсовое введение в дозе 300 28 мг/кг повышает общую физическую выносливость животных. Аналогичные результаты были получены А.С. Тулесоновой при изучении спектра адаптогенной активности растительного препарата «Адаптон-6» (Тулесонова А.С., 2011). В зарубежных публикациях также имеются данные о проведении исследований влияния преимущественно однокомпонентных фитоадаптогенных препаратов (аралии, элеутерококка, женьшеня) на физическую выносливость (Martinez B., Staba E.J., 1984; Qi, B. et al., 2014; Yong X., Jian Z., 2013). Обращает на себя внимание довольно развернутое исследование L.-Z. Huang и соавт. В первой части эксперимента мыши опытных групп получали водно-спиртовой экстракт элеутерококка в дозах 200 и 500 мг/кг ежедневно в течение 9 дней. Через 30 минут после последнего введения препарата проводили принудительное плавание до полного утомления животных с грузом 5 % от массы тела (Huang L.Z. et al., 2011). Во второй части эксперимента мыши получали элеутерозид Е в дозах 10 и 50 мг/кг, режим дозирования и плавания был аналогичен первому эксперименту, за исключением груза для плавания, который составил 7 % от массы тела животного. В результате все исследуемые препараты продемонстрировали достоверные актопротекторные свойства. Изучение актопротекторных и антиоксидантных свойств женьшеня в исследовании J. Voces и соавт. проводилось следующим образом: экстракт женьшеня вводился крысам в дозах 3, 10 и 100 мг/кг ежедневно в течение трех месяцев, после этого животные подвергались интенсивной ФН в виде бега на третбане со скоростью 20 м/мин до полного утомления. Группы крыс, получавших экстракт женьшеня в дозах 10 и 100 мг/кг продемонстрировали большую выносливость по сравнению с контролем (Voces J. et al., 1999). Необходимо отметить также исследование влияния препаратов, применяемых при заболеваниях печени (Г-I, полифитохол, ЛИВ-52), препарата сапарал (тонизирующее средство из корней аралии маньчжурской), а также их комбинаций с сапаралом на работоспособность экспериментальных животных. Все изучаемые препараты повышали работоспособность крыс (как продолжительность плавания, так и длительность бега на третбане), причем гепатопротекторные 29 средства не уступали в этом сапаралу. А при их сочетанном применении наблюдался еще более выраженный актопротекторный эффект (Каплан Е.Я. и др., 1990). Аналогичные результаты были получены при изучении этой же группой ученых препаратов ЛИВ-52, элеутерококка и их сочетания на белых мышах. Неспецифическое действие этих препаратов оценивалось по длительности бега на третбане, продолжительности плавания в воде и удержания на шесте до полного утомления. Было выявлено достоверное увеличение работоспособности животных, получавших исследуемые препараты, по сравнению с контролем. Мыши, получавшие комбинацию элеутерококка с препаратом ЛИВ-52, продемонстрировали наилучшие результаты по всем показателям. Полученные результаты позволяют говорить о выраженной тенденции гепатопротекторных средств увеличивать физическую выносливость экспериментальных животных. Таким образом, проведя анализ доступной литературы, можно сказать, что большинство работ по изучению фитоадаптогенов проводилось в СССР (в бывших республиках СССР) и в странах Дальнего Востока (Китай, Япония, Корея), т.е. в местах произрастания растений-адаптогенов. Однако несмотря на интерес к данной проблеме со стороны как отечественных, так и зарубежных исследователей, по нашему мнению, необходимо более детальное изучение гепатопротекторного действия фитоадатогенов. Это прежде всего относится к более подробному исследованию его механизмов. А также изучению защитного эффекта фитоадаптогенов при сочетанном воздействии нескольких повреждающих факторов наряду с гепатотоксическими агентами (интенсивная физическая нагрузка, другие ксенобиотики, экстремальные температуры и т.д.), что позволит приблизить экспериментальную модель к реальным условиям. Все вышесказанное и послужило отправной точкой для проведения наших исследований, результаты которых изложены в последующих главах. 30 Глава 2. Материалы и методы исследований Исследования проведены на белых беспородных мышах-самцах массой 2025 гр., полученных из питомника лабораторных животных «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России (Московская обл.). Экспериментальные животные содержались в условиях вивария при 12-часовом световом режиме со свободным доступом к воде и стандартному корму (ГОСТ Р 9.804-2006 и РД-АПК 3.10.07.0209). Все эксперименты проведены в соответствии с правилами лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ № 51000.396 и 51000.4-2008, ГОСТ Р-53434-2009) и Приказом МЗ и СР РФ № 708н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и с соблюдением правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях от 18 марта 1986 года (текст изменен в соответствии с положениями Протокола ETS № 170 от 2 декабря 2005 года). Подопытные мыши были разделены на 7 групп (см. Таблицу 1). В работе были использованы официнальные стандартизованные жидкие (спиртовые) экстракт элеутерококка (серия № 221113) и настойка корней женьшеня (серия № 020913) производства ЗАО «ВИФИТЕХ» (г. Москва). В качестве препарата сравнения согласно рекомендациям научной литературы (под ред. А.Н. Миронова и соавт., 2012) был взят препарат с доказанным гепатопротекторным действием – карсил (производства «Софарма», Болгария, серия № 2450613), в дозе 100 мг/кг. Все препараты, использованные в исследованиях, были приобретены в аптеке г. Москвы. Для исключения влияния алкоголя на организм экспериментальных животных, непосредственно перед введением препараты элеутерококка и женьшеня упаривали на роторном испарителе при 37 °С под вакуумом до сухого остатка, который разводили в дистиллированной воде. Деалкоголизированные экстракт элеутерококка и настойку женьшеня в виде водной взвеси вводили внутрижелудочно через зонд в дозах 48,5 мг/кг и 47 мг/кг (в пересчете на сухой остаток) со- 31 ответственно (доза по объему для обоих жидких препаратов составила 2,5 мл/кг) эффективность выбранных для исследования доз была доказана ранее (Брехман И.И., 1968; Брехман И.И., 1969; Крендаль Ф.П. и др., 2007; Молоковский Д.С., 2004). Животные групп «Элеутерококк», «Женьшень», «Карсил» ежедневно внутрижелудочно получали исследуемые препараты и препарат сравнения (в виде водной взвеси) соответственно в течение двух недель перед началом интоксикации, а также в течение последующих трех недель на фоне введения CCL4. Гепатотоксин (10 % раствор CCL4 на оливковом масле комнатной температуры) вводили мышам внутрижелудочно в дозе 30 мл/кг (в пересчете на масляный раствор) 2 раза в неделю в течение трех недель (6 введений с 3ей по 5ую экспериментальную неделю). Методика подострого поражения печени тетрахлорметаном была разработана нами ранее (Печенкина И.Г., Козин С.В. и др., 2014) на основе методики, рекомендованной руководством по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ (Венгеровский А.И. и др., 2012; Дыгай А.М. и др., 2010; Саратиков, А.С. и др., 2005). Группы «Пассивный Контроль» и «Пассивный Контроль (ФН)» получали внутрижелудочно эквивалентные объемы дистиллированной воды и оливкового масла вместо исследуемых препаратов и токсина соответственно, группы «Активный Контроль (CCL4)» и «Активный Контроль (CCL4+ФН)» - воду и масляный раствор CCL4. На фоне введения препаратов и токсина все группы экспериментальных животных, за исключением групп «Пассивный Контроль» и «Активный Контроль (CCL4)», подвергались еженедельному плаванию до полного утомления с грузом 7 % от массы тела животного при температуре воды 28 °С. На 36-е сутки от начала опыта мышей выводили из эксперимента и проводили забор крови и ткани печени для проведения дальнейших исследований. 32 Таблица 1. Схема проведения экспериментального исследования гепатопротекторного действия препаратов элеутерококка, женьшеня и карсила при подострой интоксикации CCL4 на фоне повышенной физической нагрузки. № группы/ название введение экстракта элеутерококка48,5 мг/кг (в пересчете на сухой остаток) с 1-5 неделю 1.Пассивный Контроль 2. Пассивный Контроль (ФН) 3.Активный Контроль (CCL4) 4. Активный Контроль (CCL4+ФН) 5.Карсил 6.Элеутерококк 7.Женьшень введение настойки женьшеня, 47 мг/кг (в пересчете на сухой остаток) с 1-5 неделю введение карсила, 100 мг/кг с 1-5 неделю введение 10% раствора CCL4,30 мл/кг с 3-5 неделю физическая нагрузка, плавание с 1-5 неделю + ежедневно ежедневно ежедневно 2р/неделю - 2р/неделю + 2р/неделю 2р/неделю 2р/неделю + + + 2.1. Экспериментальная оценка состояния физической выносливости после введения исследуемых препаратов и на фоне подострой интоксикации тетрахлорметаном Общая физическая выносливость - один наиболее адекватных из инте- гральных показателей состояния организма, поскольку при различных патологических воздействиях ее нарушение происходит одним из первых. Таким образом, можно предложить повышение работоспособности экспериментальных животных под действием фитоадаптогенов в качестве показателя увеличения неспецифической сопротивляемости организма (Дардымов В.И., 1986; Крендаль Ф.П. и др., 2007; Сейфулла Р.Д. и др., 2009; Чехани Н.Р. и др., 2014). 33 Для изучения актопротекторного действия адаптогенов исследователи используют различные модификации плавательной нагрузки (плавание животных с грузами различной тяжести и без них, повторное плавание, дозированное и до полного утомления) и бега на третбане. Метод «плавание» является удобным, простым в исполнении и не требует специального оборудования, что послужило его широкому распространению в различных лабораториях (Каркищенко В.Н. и др., 2011; Каркищенко Н.Н. и др., 2013; Huang S.-C. et al., 2009; Shao J.-T. et al., 2013). В данной работе для оценки влияния фитоадаптогенов (экстрактов элеутерококка и женьшеня) на общее состояние здоровья экспериментальных животных при подострой интоксикации CCL4 использовался метод еженедельного плавания мышей до полного утомления с грузом 7 % от массы тела животного (Раднаева Д.Б., 2009; Чубарев В.Н., 1987; Tang W. et al., 2008). При проведении теста животным после взвешивания к корню хвоста прикрепляли груз (свинцовая гирька на резиновом кольце), равный 7 % от массы тела, после чего каждое животное погружали в индивидуальный цилиндр с водой диаметром 20 см, высотой 40 см, с температурой воды 28 °С. Секундомер включался в момент погружения животного в воду. Критерием прекращения плавания являлось погружение животного на дно цилиндра. В этот момент животное быстро извлекали из воды и обсушивали сухим полотенцем. Перед началом введения изучаемых препаратов и воды проводили определение ФВ мышей, в ходе которого для дальнейшего эксперимента отбирались животные, продолжительность плавания которых составила 12-17 минут. Это время предварительного плавания было принято за 100 %, и в дальнейшем продолжительность плавания подопытных животных выражалась в процентах от него. Животные получали физическую нагрузку еженедельно в определенный день недели и время суток, т.е. в течение всего эксперимента, учитывая предварительное плавание, подопытные мыши подвергались принудительному плаванию 6 раз. 34 2.2. Определение некоторых энзимологических и биохимических показателей в сыворотке крови экспериментальных животных Для оценки состояния гепатобилиарной системы организма были использованы следующие энзимологические и биохимические показатели сыворотки крови мышей: активности аланиновой (АЛТ) и аспарагиновой (АСТ) аминотрансфераз, щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ); содержание общего билирубина, общего холестерина. Показатели АЛТ, АСТ, ЩФ содержание общего билирубина, общего холестерина в сыворотке крови определяли на автоанализаторе Siemens-ADVIA 1800 Chemistry System (Германия), активность ЛДГ – на автоанализаторе Olympus AU 680 (США), по соответствующим методикам, предусмотренным фирмамиизготовителями для этого оборудования. 2.3. Определение концентрации восстановленного глутатиона в ткани печени экспериментальных животных Концентрацию восстановленного глутатиона в гомогенатах ткани печени определяли с использованием 5,5'-дитиобис(-2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) по методике G.L. Ellman (Ellman G.L., 1959) с применением раствора сульфосалициловой кислоты для осаждения белка в пробах. Метод основан на спектрофотометрическом определении окрашенного продукта 5-тио,2-нитробензойной кислоты (ТНБ), который образуется при взаимодействии ДТНБ (реактива Эллмана) с кислоторастворимыми тиоловыми группами и имеющего максимум поглощения при длине волны 412 нм. Ход определения К 0,6 мл гомогената ткани печени (ткань гомогенизировали, добавляя охлажденный до температуры 0 °С 0,1 М калий-фосфатный буфер с рН 7,4 в соотношении ткань:буфер - 1:6.) добавляли 0,2 мл 20 % раствора сульфосалициловой кислоты. Пробы центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин. при температуре +2 °С. Затем 0,2 мл полученного супернатанта переносили в пробирки, 35 содержащие 2,55 мл 0,1 М ТРИС-НС1 буфера с 0,01 % этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) со значением рН = 8,5. К полученной смеси добавляли 25 мкл раствора ДТНБ (4 мг коммерческого препарата ДТНБ («Sigma-Aldrich», США) в 1 мл абсолютного метанола). После развития окраски (2-3 минуты) пробы фотометрировали на спектрофотометре CARY 100 Scan («Varian», США) против дистиллированной воды при длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Расчет содержания восстановленного глутатиона проводили по калибровочной кривой. Для этого из коммерческого препарата ВГ («Sigma- Aldrich», США) готовили стандартные растворы в диапазоне концентраций от 0,02 до 2,0 ммоль/л, из них отбирали пробы для определения содержания восстановленного глутатиона по описанной выше методике. Далее по полученным значениям экстинкции строили калибровочную кривую, по которой проводили расчет концентрации восстановленного глутатиона и выражали в мкмоль/г ткани печени. 2.4. Определение концентрации продуктов ПОЛ в ткани печени экспериментальных животных 2.4.1. Определение концентрации малонового диальдегида в ткани печени экспериментальных животных Определение содержания продуктов перекисного окисления липидов в ткани печени мышей проводили с помощью спектрофотометрического теста с тиобарбитуровой кислотой. Метод основан на измерении спектра поглощения комплекса, образующегося между 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) и водорастворимыми продуктами ПОЛ, в частности с малоновым диальдегидом (МДА) (Гаврилов В.Б. и др., 1987). Ход определения К 0,4 мл гомогената ткани печени (250 мг ткани гомогенизировали, добавляя 2,25 мл охлажденного физиологического раствора (+4°С) и 0,01 мл 0,08 М раствора ионола в этаноле) последовательно добавляли 0,01 мл 0,08 М раствора ионола, 3 мл 2% о-фосфорной кислоты и 1 мл 0,8% ТБК. Пробирки каждый раз 36 тщательно встряхивали для перемешивания их содержимого. Далее пробирки закрывали пробками и помещали в кипящую водяную баню (при температуре +100 о С) на 1 час. Затем пробы охлаждали и приливали по 4 мл н-бутанола для экстра- гирования окрашенного комплекса ТБК с МДА. После интенсивного встряхивания, плотно закрывали с помощью пленки «Parafilm» и оставляли на 20 минут при комнатной температуре для экстракции окрашенного комплекса. Полученные образцы центрифугировали в течение 20 мин при 1500 об/мин. Оптическую плотность опытных проб измеряли на спектрофотометре CARY 100 Scan («Varian», США) против чистого бутанола в кюветах с длиной оптического пути 1 см при двух длинах волн – 532 нм и 580 нм. Расчет концентрации МДА проводили по разнице оптических плотностей Е532-Е580 и выражали в мкмоль/г ткани. 2.4.2. Определение концентрации диеновых конъюгатов в ткани печени экспериментальных животных Концентрацию диеновых конъюгатов в гомогенатах ткани печени определяли по методике И.Д. Стальной (Стальная И.Д., 1977), в модификации С.И. Глушкова (Глушков С.И., 2006). Суть метода заключается в экстракции ДК из исследуемого материала и измерении их концентрации по характерному спектру поглощения с максимумом при длине волны 233 нм. Ход определения К 0,5 мл гомогената ткани печени (ткань гомогенизировали, добавляя охлажденный до температуры 0 °С 0,1 М калий-фосфатный буфер с рН = 7,4 в соотношении ткань:буфер - 1:6), разведенного 5 мМ ТРИС-НС1 буфером с рН = 7,6 в соотношении - 1:19, добавляли 4,5 мл экстрагирующей смеси гептан : изопропиловый спирт (1:1). После тщательного перемешивания смеси давали отстояться, затем отбирали 0,5 мл гептановой (верхней) фазы и добавляли к ней 2,5 мл этилового спирта (96°). Оптическую плотность раствора определяли в кювете с длиной оптического пути 1см против этилового спирта с гептаном (5:1) на спектрофотометре CARY 100 Scan («Varian», США) при длине волны 233 нм. Концентрацию ДК выражали в мкмоль/г ткани. 37 2.5. Гистологическое и гистохимическое исследование ткани печени экспериментальных животных Кусочки печени экспериментальных животных фиксировали забуференным 10 % раствором формалина. После отмывки формалина из фиксированного материала вырезали небольшие кусочки и помещали в специальные кассеты, которые закладывали в автоматы для гистологической проводки (вакуумный инфильтрационный процессор TISSUE-TEK® VIP™ 6). После ряда стандартных процедур материал заливали жидким парафином, охлаждали и получали парафиновые блоки. С каждого блока с помощью микротома готовили 2-3 среза толщиной 3-4 мкм. Гистологические срезы были окрашены следующими гистологическими и гистохимическими методами с соблюдением стандартных методик: гематоксилином и эозином (Maynard R. et al., 2014), 0,1 % сулемовым раствором бромфенолового синего (Елисеев В.Г. и др., 1967; Hornatowska J., 2005), а также была проведена ШИК-реакция (Cooksey C., Dronsfield A., 2009). 2.6. Иммуногистохимическое исследование ткани печени экспериментальных животных 2.6.1. Объекты исследования NO-синтаза (NOS) – фермент, катализирующий реакцию образования оксида азота (NO), высокоэффективного регулятора метаболизма, используя в качестве субстрата преимущественно аминокислоту L-аргинин. Описано три основные изоформы NO-синтаз: две конститутивные формы – нейрональная и эндотелиальная (NOS1 и NOS3) и макрофагальная (NOS2), являющаяся индуцибельной. В гепатоцитах белок iNOS2 экспрессируется в ответ на ряд физиологических и патофизиологических воздействий на печень (Тейлор Б.С. и др., 1998; Bhatt K.H. et al., 2011; Guo, J.Y. et al., 2011). TNF-α (фактор некроза опухоли-α, кахектин) – плейотропный провоспалительный цитокин, синтезирующийся макрофагами, лимфоцитами, нейтрофилами на ранних стадиях воспаления и некроза тканей. Существует β-форма (TNF- β, 38 лимфотоксин). Обе формы участвуют в формировании иммунного и воспалительного ответов, обладают цитотоксическим и цитолитическим действием в отношении некоторых опухолевых клеток. TNF-α также обладает способностью стимулировать макрофаги и эндотелий сосудов к выработке оксида азота (NO) при различных патологических состояниях (Lee D., Lau A., 2011; Liu W.H., Chang L.S., 2012). В рамках иммуногистохимического исследования для оценки уровня экспрессии изучаемых белков использовали моноклональные мышиные антитела NOS2 (C-11) (Santa Cruz Biotecnology™, USA) и TNF-α (52B83) (Santa Cruz Biotecnology ™, USA). Ход определения Иммуногистохимическое исследование осуществляли на срезах толщиной 3-4 мкм с готовых парафиновых блоков, содержащих исследуемые образцы ткани, с использованием полимерно-протеиново-пероксидазного метода с использованием систем визуализации: iVIEW DAB Detection Kit™ (Ventana™, USA); DAB NOVOLINK™ (Novocastra™, UK) и концентратов первичных моноклональных мышиных антител: NOS2 (C-11) (Santa Cruz Biotecnology™, USA), TNF-α (52B83) (Santa Cruz Biotecnology ™, USA) по соответствующим методикам, предусмотренным фирмами-изготовителями. Рабочие растворы в разведении 1:200 приготавляли из жидких концентратов NOS2 (C-11) (Santa Cruz Biotecnology™, USA), TNF-α (52B83) (Santa Cruz Biotecnology ™, USA), предварительно разведенных в 1000 мкл AntiBody Diluent (Ventana™ и Novocastra™). После депарафинизации и обезвоживания в целях блокирования эндогенной пероксидазы срезы обрабатывали 0,3 % Н2О2 в течение 20 минут, далее промывали в дистиллированной воде и с целью демаскировки антигенных детерминант подвергали температурной обработке в буферном растворе с рН = 6,0 (Epitope Retrieval Solutions pH=6, Novocastra™ и ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana™) в течение 30 минут при t = 98 °С. После отмывания в буферном растворе (Buffer Solution и Reaction Buffer (10x), Ventana™ USA, Novocastra™ UK) 3 раза по 5 минут наносились рабочие разведения концентратов первичных антител NOS2 (C-11), TNF-α (52B83). Инкубацию с первичными антителами проводили в течение 30 минут 39 при комнатной температуре. После инкубации с первичными антителами срезы промывали в отмывочном буферном растворе, предварительно приготовленном из концентрата Bond Wash Solution (10x) Concentrate и Reaction Buffer (10x) (Novocastra™ и Ventana™ USA) 3 раза по 5 минут, затем наносили систему детекции полимерно-протеинового-пероксидазного комплекса NOVOLINK™ (Novocastra™, UK) и iVIEW DAB Detection Kit™ (Ventana™, USA) в течение 30 минут при комнатной температуре. Выявление антигенных эпитопов осуществляли с помощью хромогена, 3'3-диаминобензидина из набора Ultra View Universal DAB Detection Kit и DAB Enhancer (Novocastra™, UK). Исследование проводили с помощью иммуностейнеров: BenchMark ULTRA™ (Ventana™, USA) и Leica BOND-MAX™ (Novocastra™, UK) с применением Covertile™ технологии (Leica Biosystems™). (исследования по гистоморфологии и иммуногистохимии проведены совместно с к.м.н. Булановым Д.В. на базе гистологической лаборатории Европейского медицинского центра). 2.7. Визуализация результатов Полученные препараты анализировали с помощью светового микроскопа Nikon Eclipse 50i, микрофотосъемку проводили фотокамерой Scan Scope Aperio при объективе ×100, ×200, ×400. Фотографии обрабатывались в программе Aperio Image Scope версия 11.1.2.760. 2.8. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Exсel 2010». В каждой группе рассчитывали средние арифметические значения показателя и стандартную ошибку среднего. Приведенные в тексте и таблицах значения представляли в виде M±m. Достоверность различий с соответствующими контрольными группами оценивали по t-критерию Стъюдента, (р≤0,05), за исключением бальной оценки морфологических признаков патологии печеночной ткани, где проверка достоверности отличий результатов проводилась непараметрическим методом с использованием U-критерия Уилкоксона-МаннаУитни (р ≤ 0,05) (Герасимов А.Н., 2007). 40 Глава 3. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на некоторые показатели состояния экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном в условиях повышенной физической нагрузки 3.1. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на продолжительность плавания мышей при подострой интоксикации тетрахлорметаном В данной экспериментальной работе изучение физической выносливости проводили на мышах по их способности выполнять нагрузку до отказа. Для этого был использован показатель продолжительности плавания животных с грузом 7 % от массы тела животного до полного утомления (Раднаева Д.Б., 2009; Чубарев В.Н., 1987; Tang W. et al., 2008). На протяжении всего эксперимента (5-ти недель) животные, не получавшие тетрахлорметан (группа «Пассивный Контроль (ФН)»), демонстрировали неоднозначные отклонения от первоначального уровня продолжительности плавания: на 1-й неделе эксперимента наблюдалось повышение изучаемого показателя на 9 % (р≤0,05), на 2-й, 3-й, 4-й – происходило его снижение на 12 %, 24 %, 16 % соответственно (р≤0,05). Однако к 5-й недели этот показатель достоверно не отличался от исходного (100 %). Введение тетрахлорметана мышам уже после одной недели интоксикации привело к резкому достоверному снижению продолжительности плавания до 33,5±6,2 % по сравнению с группой «Пассивный Контроль (ФН)». И это снижение продолжалось на протяжении всего периода введения CCL4 и составило к 5-й неделе эксперимента 29,7±7,0 % (см. таблицу 2, рис. 2). Начиная уже с 1-й недели эксперимента опытные группы мышей, получавшие исследуемые препараты (настойку женьшеня и экстракт элеутерококка), показали достоверное (р≤0,05) увеличение продолжительности плавания более чем на 20 % по сравнению с группой «Пассивный Контроль (ФН)», продемонстрировав хорошо изученное ранее актопротекторное действие (Козин С.В., 1998; Молоковский Д.С., 2004; Петунова А.Н., 2004; Рябов А.Н., 2008; Huang LZ et al., 2011; 41 Lee FT et al., 2009). Ко 2-й неделе этот эффект был наиболее выраженным (134,1±6,0 % и 139,6±7,0 %, для животных групп «Элеутерококк» и «Женьшень» соответственно). При этом продолжительность плавания мышей, получавших препарат сравнения – карсил, не имела значимого различия с группой «Пассивный Контроль (ФН)». Таблица 2. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на физическую выносливость мышей при подострой интоксикации CCL4 на фоне повышенной физической нагрузки. Время от начала эксперимента, недели Продолжительность плавания в % от исходного значения, M±m, n=12 Пассивный Активный Карсил Элеутерококк Женьшень Контроль Контроль (ФН) (CCL4+ФН) 1 109,0±3,1 108,6±4,0 108,7±6,2 120,7±5,0* 122,1±6,2* 2 88,4±4,2 84,9±5,0 90,1±7,9 134,1±6,0* 139,6±7,0* 3 75,6±6,0 33,5±6,2* 60,4±8,6** 74,5±7,0** 82,3±7,7** 4 83,6±7,1 38,0±7,1* 78,8±8,7** 112,7±7,5*,**,# 118,3±8,5*,**,# 5 93,4±8,9 29,7±7,0* 63,3±6,1*,** 75,9±8,7** 83,5±8,6** Примечание: * - достоверное отличие от группы «Пассивный Контроль (ФН)» (р≤0,05); ** - достоверное отличие от группы «Активный Контроль (CCL4+ФН)» (р≤0,05); # - достоверное отличие от группы «Карсил» (р≤0,05); - жирным шрифтом выделены результаты, полученные на фоне введения CCL4. Курсовое введение исследуемых фитоадаптогенов при интоксикации тетрахлорметаном полностью предупреждало CCL4-индуцированное снижение физической работоспособности экспериментальных животных. Более того, после двух недель введения гепатотоксина на фоне применения препаратов 42 Рис. 2. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на продолжительность плавания мышей при подострой интоксикации CCL4. Примечание: результаты с 3-й по 5-ю неделю получены на фоне введения CCL4. 43 элеутерококка и женьшеня было зафиксировано достоверное (р≤0,05) увеличение продолжительности плавания мышей (112,7±7,5 % и 118,3±8,5 % для животных, получавших экстракт элеутерококка и настойку женьшеня соответственно, при 38,0±7,1% в группе «Активный Контроль (CCL4+ФН)». При этом необходимо отметить, что данные показатели были достоверно (р≤0,05) выше, чем у препарата сравнения – карсила (78,8±8,7 %). И хотя эти показатели к концу периода интоксикации значительно снижались до 75,9±8,7 % для животных, получавших элеутерококк и 83,5±8,6 % - женьшень, они не имели статистически значимых различий с группой «Пассивный Контроль (ФН)» (93,4±8,9 %) и значительно превышали (р≤0,05) таковые у мышей группы «Активный Контроль(CCL4+ФН)» (29,7±7,0 %). Лечебно-профилактическое применение препарата сравнения - карсила в значительной степени предупреждало CCL4-индуцированное снижение ФВ. Так, на 1-й и 2-й неделе введения тетрахлорметана продолжительность плавания мышей составила 60,4±8,6 % и 78,8±8,7 %, уступая по этим показателям животным групп «Элеутерококк» и «Женьшень». И хотя к концу эксперимента этот показатель животных группы «Карсил» достоверно не отличался (р≤0,05) от таковых у мышей, получавших фитоадаптогены, все же имелась тенденция к его более низкому значению (63,3±6,1 %). Таким образом, как исследуемые фитоадаптогены, так и препарат сравнения, проявили достоверное защитное действие при подострой интоксикации тетрахлорметаном, которое проявлялось в предупреждении CCL4-индуцированных нарушений физической работоспособности мышей. Следует отметить, что это защитное действие в отношении ФВ в большей степени проявили препараты элеутерококка и женьшеня, чем карсил. Это не противоречит общеизвестному факту, что фитоадаптогены кроме гепатопротекторных свойств обладают и собственно актопротекторным действием (в отличие от карсила). 44 3.2. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на динамику массы тела и на относительную массу печени экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном на фоне повышенной ФН Показатель динамики массы является еще одним важным интегральным показателем, характеризующим состояние здоровья экспериментальных животных (Валика В.В. и др., 2014; Козин С.В., 1998; Huang L.Z. et al., 2011; Zhang Y. et al., 2006). В связи с этим, в ходе эксперимента по изучению гепатопротекторного действия препаратов женьшеня и элеутерококка при подострой интоксикации тетрахлорметаном мы проводили еженедельное взвешивание мышей. Подопытных животных взвешивали перед началом эксперимента, и эта масса была принята за 100 %, в дальнейшем динамика массы мышей выражалась в процентах от первоначальной. Последующие взвешивания проводили еженедельно, в определенный день недели и время суток (см. таблицу 3, рис. 2). В группе «Пассивный Контроль» на протяжении всего эксперимента наблюдалась стабильная прибавка в массе мышей. На последней неделе эксперимента при взвешивании было выявлено, что за 5 недель животные в условиях относительного функционального покоя прибавили в массе в среднем на 27 % от первоначальной. Однако у животных группы, находящейся в условиях повышенной ФН («Пассивный Контроль (ФН)»), наблюдалась устойчивая тенденция к замедлению прироста массы тела и к 4-й неделе это показатель имел достоверное отличие (р≤0,05) от мышей, не получавших ФН. Введение тетрахлорметана привело к достоверному (р≤0,05) снижению массы тела мышей, начиная с первой недели введения гепатотоксина. Отрицательная динамика данного показателя сохранялась в течение последующих двух недель эксперимента. Необходимо отметить что, сочетание ФН с интоксикацией тетрахлорметаном достоверно (р≤0,05) вело к более выраженному снижению массы экспериментальных животных, достигая к концу эксперимента 87,62±1,02 % и 90,28±0,80 % для групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4) соответственно. 45 Таблица 3. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на динамику массы мышей при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной физической нагрузки. Время от начала эксперимента, недели 1 Масса животных в % от исходного значения, M±m, n=12. Пассивный Контроль Пассивный Контроль (ФН) Активный Контроль (CCL4) Активный Контроль (CCL4+ФН) Карсил Элеутерококк Женьшень 104,67±0,61 104,40±0,55 105,64±0,44 105,08±0,31 105,81±0,51 105,13±0,60 104,83±0,38 2 112,17±0,81 110,20±0,72 111,38±0,72 109,43±0,60 112,51±0,80 111,03±0,63 111,07±0,64 3 117,94±1,29 114,67±1,02 103,8±0,76* 101,35±0,75* 109,04±0,86*,** 106,5±0,71*,** 107,02±0,61*,** 4 122,61±1,09# 117,92±1,07 97,14±0,79*,## 94,71±0,89* 104,26±1,07*,** 99,93±0,90*,** 101,62±0,81*,** 5 126,92±1,43# 121,88±1,21 90,28±0,80*,## 87,62±1,02* 99,50±1,02*,** 96,87±0,95*,** 97,40±0,82*,** Примечание: * - достоверное отличие от групп «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный Контроль» (р≤0,05); ** - достоверное отличие от групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4 ) (р≤0,05); # - достоверное отличие от группы «Пассивный Контроль (ФН)» (р≤0,05); ## - достоверное отличие от группы «Активный Контроль (CCL4+ФН) (р≤0,05); - жирным шрифтом выделены результаты, полученные на фоне введения CCL4. 46 Рис. 3. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на динамику массы мышей при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной физической нагрузки. Примечание: результаты с 3-й по 5-ю неделю получены на фоне введения CCL4. 47 Ежедневное введение как изучаемых препаратов (настойки женьшеня и экстракта элеутерококка), так и препарата сравнения (карсил), хотя и не полностью, но в значительной мере, предупреждало снижение массы тела мышей при интоксикации CCL4 на фоне повышенной ФН, причем и элеутерококк, и женьшень по этому действию не уступали препарату сравнения - карсилу (97,40%, 96,87% и 99,50% для групп мышей, получавших женьшень, элеутерококк и карсил соответственно, к 5-й неделе эксперимента). Одним из важнейших показателей состояния гепатобилиарной системы при экспериментальных исследованиях на моделях печеночной патологии является относительная масса печени подопытных животных (Венгеровский А.И. и др., 2012). Забор печени и ее взвешивание проводились сразу после выведения мышей из опыта на 36-е сутки эксперимента. Относительная масса печени рассчитывалась как отношение массы печени к массе тела мыши, в процентах. В данном эксперименте значимого влияния ФН в виде еженедельного плавания до полного утомления в течение 5-ти недель на изучаемый показатель выявлено не было: различий в относительной массе печени мышей групп «Пассивный Контроль и «Пассивный Контроль (ФН)» не наблюдалось (см. таблицу 4). Подострая интоксикация четыреххлористым углеродом вызывала у мышей групп «Активный Контроль (CCL4)» и «Активный Контроль (CCL4+ФН)» достоверное (р≤0,05) повышение относительной массы печени по сравнению с группами «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный Контроль» почти в 2 раза, что обусловлено не только направленным токсическим действием CCL4 на печень, но и его отрицательным влиянием на массу тела экспериментальных животных (см. таблицу 4). При этом наблюдалось достоверное (р≤0,05) увеличение относительной массы печени мышей, получавших CCL4 на фоне повышенной ФН, по сравнению с группой «Активный Контроль (CCL4)», находившихся в условиях относительного функционального покоя, что свидетельствует о выраженной тенденции повышенной ФН потенцировать действие гепатотоксина CCL4. 48 Таблица 4. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на относительную массу печени при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной физической нагрузки, M±m, n=12. Группа экспериментальных животных фактическая масса печени, г относительная масса печени, % Пассивный Контроль Масса тела мыши в конце эксперимента, г 28,06±0,56 1,53±0,08 5,46±0,27 Пассивный Контроль (ФН) 26,83±0,39 1,44±0,07 5,35±0,22 Активный Контроль (CCL4) 20,77±1,39* 2,09±0,06* 10,07±0,12*,# Активный Контроль (CCL4+ФН) Карсил 20,03±1,49* 2,22±0,07* 11,04±0,10* 22,28±1,66*,** 1,66±0,05*,** 7,45±0,07*,** Элеутерококк 21,92±1,92*,** 1,66±0,06*,** 7,57±0,10*,** Женьшень 22,54±1,40*,** 1,67±0,04*,** 7,42±0,08*,** Примечание: * - достоверное отличие по сравнению с группами «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный Контроль» (р≤0,05); ** - достоверное отличие по сравнению с группами «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» (р≤0,05); # - достоверное отличие по сравнению с группой «Активный Контроль (CCL4+ФН)» (р≤0,05); Хотя применение протекторных средств (настойки женьшеня, экстракта элеутерококка и карсила) полностью не предупреждало повышение относительной массы печени, но значительно и достоверно (р≤0,05) снижало его. Аналогичное действие продемонстрировал и препарат сравнения – карсил: в группах животных «Женьшень», «Элеутерококк» не было отмечено достоверных отличий данного показателя от его значений в группе «Карсил». Таким образом, на основании полученных экспериментальных данных можно сделать вывод о том, что исследуемые препараты женьшеня и элеутерококка оказали положительное влияние как на динамику массы тела, так и на относительную массу печени мышей при подострой интоксикации тетрахлорметаном в условиях интенсивной физической нагрузки. 49 3.3. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на некоторые энзимологические и биохимические показатели сыворотки крови экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном на фоне повышенной ФН На 36-е сутки от начала эксперимента по изучению гепатопротекторных свойств изучаемых препаратов женьшеня и элеутерококка при подострой интоксикации четыреххлористым углеродом в условиях интенсивной физической нагрузки нами было проведено исследование сыворотки крови мышей по некоторым энзимологическим и биохимическим показателям. В ходе эксперимента было установлено, что у животных, не получавшихтетрахлорметан, еженедельное плавание до полного утомления, приводило к достоверному (р≤0,05) повышению активности ЛДГ (218,9±7,40 ед./л и 260,3±12,18 ед./л для групп «Пассивный Контроль» и «Пассивный Контроль (ФН)» соответственно). По показателям АЛТ и АСТ наблюдалась лишь подобная тенденция (р>0,05) (см. таблицу 5). Влияние повышенной ФН на остальные изучаемые показатели выявлено не было. Подострая интоксикация экспериментальных животных четыреххлористым углеродом на фоне относительного функционального покоя привела к значительному повышению как энзимологических, так и биохимических показателей сыворотки крови мышей по сравнению с группой, не получавшей гепатотоксин: АЛТ в 28 раз, АСТ в 9 раз, ЩФ в 4 раза, ЛДГ в 2,5 раза, общего билирубина в 4 раза, холестерина более чем в 2 раза. Важно обратить внимание на то, что сочетание ФН с интоксикацией тетрахлорметаном достоверно (р≤0,05) вело к более выраженным, чем у затравленных, но не плававших мышей, нарушениям показателей сыворотки крови: АЛТ 1533,2±33,71 ед./л и 1407,2±38,97 ед./л, АСТ - 1266,7±41,29 ед./л и 1166,7±29,19 ед./л и ЛДГ - 612,4±13,53 ед./л и 536,0±16,57 ед./л для групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» соответственно. 50 Таблица 5. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на некоторые энзимологические и биохимические показатели сыворотки крови мышей при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной физической нагрузки, M±m, n=12. Показатели Аланин аминотрансфераза, ед./л Аспартат аминотрансфераза, ед./л Щелочная фосфатаза, ед./л Лактатдегидрогеназа, ед./л Общий билирубин, мкмоль/л Холестерин, ммоль/л Пассивный Контроль Пассивный Контроль (ФН) Активный Контроль (CCL4) Активный Контроль (CCL4+ФН) Карсил Элеутерококк Женьшень 51,1±1,24 55,4±1,86 1407,2±38,97*,## 1533,2±33,71* 637,4 ±11,9*,** 722,1±26,98*,**,^ 703,7±27,17*,** 136,3±4,28 147,5±4,25 1166,7±29,19*,## 1266,7±41,29* 569,5±13,71*,** 619,9±22,04*,** 613,1±17,64*,** 110,0±9,22 109,3±8,47 481,8±29,75* 479,2±28,66* 293,5±9,57*,** 373,6±13,73*,**,^ 350,6±14,44*,**,^ 218,9±7,40# 260,3±12,18 536,0±16,57*,## 612,4±13,53* 368,8±20,03*,** 411,5±18,27*,** 408,9±19,85*,** 5,9±0,4 5,6±0,38 22,5±0,87* 22,3±0,88* 10,9±1,17*,** 13,9±1,09*,** 13,7±1,04*,** 2,82±0,15 2,43±0,12 5,86±0,42* 6,01±0,32* 3,7±0,31*,** 4,8±0,26*,**,^ 4,4±0,30*,**,^ Примечание: * - достоверное отличие от групп «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный Контроль» (р≤0,05); ** - достоверное отличие от групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» (р≤0,05); # - достоверное отличие от группы «Пассивный Контроль (ФН)» (р≤0,05); ## - достоверное отличие от группы «Активный Контроль (CCL4+ФН)» (р≤0,05); ^ - достоверное отличие от группы «Карсил» (р≤0,05); 51 Применение фитоадаптогенов (настойки женьшеня и экстракта элеутерококка) при подострой интоксикации CCL4 на фоне повышенной ФН продемонстрировало выраженное защитное действие в отношении изучаемых энзимологических и биохимических показателей сыворотки крови мышей. Так, у мышей группы «Элеутерококк» АЛТ составила 722,1±26,98 ед./л, АСТ – 619,9±22,04 ед./л, ЩФ – 373,6±13,73 ед./л, ЛДГ – 411,5±18,27 ед./л, общий билирубин – 13,9±1,09 ед./л, холестерин – 4,8±0,26 ед./л. Показатели экспериментальных животных группы «Женьшень»: АЛТ - 703,7±27,17 ед./л, АСТ – 613,1±17,64 ед./л, ЩФ – 350,6±14,44 ед./л, ЛДГ – 408,9±19,85 ед./л, общий билирубин – 13,7±1,04 ед./л, холестерин – 4,4±0,30 ед./л. В аналогичных условиях препарат сравнения – карсил, также продемонстрировал гепатопротекторный свойства по всем изучаемым показателям. В ряде случаев было зафиксировано достоверное отличие активностей показателей сыворотки крови мышей из группы «Карсил» и из групп «Элеутерококк» и «Женьшень». Так, в группе «Элеутерококк» активность АЛТ была выше на 13%, ЩФ – на 27%, холестерина – на 30%, а в группе «Женьшень» - ЩФ и холестерин на 19% по сравнению с показателями группы «Карсил». Следует отметить, что эти различия не носили принципиального характера, что подтвердилось остальными использованными в эксперименте тестами. 52 3.4. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на концентрацию восстановленного глутатиона и продуктов ПОЛ в ткани печени экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном на фоне повышенной ФН По данным ряда авторов отрицательное влияние на печень могут оказывать различные неблагоприятные факторы, в том числе повышенная физическая нагрузка, приводя к увеличению продукции свободных радикалов и снижению активности эндогенной антиоксидантной системы (Huang C.C. et al., 2013; Kan N.W. et al., 2013; Pettersson J. et al., 2007). Это приобретает особый интерес при сочетанном воздействии с гепатотоксином, в основе патологического действия которого лежит свободнорадикальный механизм (Венгеровский А.И., 2002; Cho, Y.K. et al., 2009; Karakus, E. et al., 2011). Проведенное в рамках наших исследований определение концентраций ВГ и продуктов ПОЛ в ткани печени подопытных мышей дало возможность проследить основные тенденции изменения работы антиоксидантной и детоксикационной функций печени при подострой интоксикации тетрахлорметаном на фоне повышенной ФН, а также влияние на эти процессы курсовое применение изучаемых фитоадаптогенов и препарата сравнения – карсила. 3.4.1. Определение концентрации восстановленного глутатиона в ткани печени В данном эксперименте прослеживается лишь тенденция к снижению уровня ВГ в ткани печени у группы мышей, находившихся в условиях повышенной ФН в виде еженедельного плавания до полного утомления в течение 5-ти недель («Пассивный Контроль (ФН)»). При введении экспериментальным животным тетрахлорметана наблюдалось истощение уровня ВГ в гепатоцитах. Его концентрация в группах, получавших гепатотоксин, снижалась более чем в 2 раза и составила 5,90±0,14 и 2,35±0,14 мкмоль/г ткани для групп «Пассивный Контроль» и «Активный Контроль (CCL4)» 53 и 5,51±0,16 и 1,77±0,18 мкмоль/г ткани для групп «Пассивный Контроль (ФН)» и «Активный Контроль (CCL4+ФН)» соответственно (см. таблицу 6). К уменьшению концентрации ВГ может приводить его расходование на обезвреживание свободных радикалов, образующихся в процессе метаболизма гепатотоксина, наиболее активно протекающее в ткани печени (Iskusnykh I.Y. et al., 2013). При этом необходимо отметить, что в группе «Активный Контроль (CCL4+ФН)» (сочетанное действие CCL4 и интенсивной ФН) наблюдалось предельное истощение изучаемого эндогенного антиоксиданта (1,77±0,18 мкмоль/г ткани) (рис. 3). Курсовое введение препаратов как элеутерококка, так и женьшеня в условиях комплексного воздействия на печень CCL4 и повышенной ФН достоверно (р≤0,05) повышало содержание ВГ в ткани печени, практически не уступая препарату сравнения - карсилу (4,28±0,17, 4,32±0,20 и 4,63±0,14 мкмоль/г ткани соответственно). 3.4.2. Определение концентрации продуктов перекисного окисления липидов в ткани печени экспериментальных животных Поскольку в наших исследованиях одним из повреждающих факторов являлась повышенная ФН, представлял большой интерес как она влияет на процессы ПОЛ в данных экспериментальных условиях. Было выявлено, что еженедельное плавание до полного утомления в течение 5-ти недель достоверно (р≤0,05) приводило к увеличению интенсивности процессов ПОЛ о чем свидетельствовала более высокая концентрация ДК 22,24±1,04 нмоль/г ткани в группе «Пассивный Контроль (ФН)» по сравнению с группой «Пассивный Контроль» - 18,27±0,74 нмоль/ г ткани и МДА - 40,48±1,49 мкмоль/г ткани и 36,09±0,70 мкмоль/г ткани соответственно. 54 Таблица 6. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на концентрацию восстановленного глутатиона и продуктов ПОЛ в ткани печени экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном. в условиях повышенной физической нагрузки, M±m, n=12. Показатели Восстановленный глутатион, мкмоль/г ткани Малоновый диальдегид, мкмоль/г ткани Диеновые конъюгаты, нмоль/г ткани Пассивный Контроль Пассивный Контроль (ФН) Активный Контроль (CCL4) Активный Контроль (CCL4+ФН) Карсил Элеутерококк Женьшень 5,90±0,14 5,51±0,16 2,35±0,14*,## 1,77±0,18* 4,63±0,14*,** 4,28±0,17*,** 4,32±0,20*,** 36,09±0,70# 40,48±1,49 81,62±1,38*,## 89,32±2,18* 56,15±1,94*,** 58,18±2,45*,** 58,78±2,59*,** 18,27±0,74# 22,24±1,04 53,97±1,51*,## 60,02±2,33* 33,21±2,06*,** 35,73±2,66*,** 34,68±2,31*,** Примечание: * - достоверное отличие от групп «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный Контроль» (р≤0,05); ** - достоверное отличие от групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» (р≤0,05); # - достоверное отличие от группы «Пассивный Контроль (ФН) (р≤0,05); ## - достоверное отличие от группы «Активный Контроль (CCL4+ФН)» (р≤0,05). 55 Рис. 4. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на концентрацию ВГ в ткани печени экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном в условиях повышенной физической нагрузки. 56 Как известно, в основе гепатотоксического действия четыреххлористого углерода лежит процесс гиперактивации свободнорадикальных процессов, что ведет к увеличению интенсивности ПОЛ в тканях. При этом маркерами повышения активности протекания процессов свободнорадикального окисления в тканях служит накопление продуктов ПОЛ – диеновых конъюгатов и малонового диальдегида (Edakkadath R.S. et al., 2010; Khan R.A. et al., 2012; Rafikul I. et al., 2012). В ходе эксперимента интоксикация CCL4 вызывала активацию процессов ПОЛ, о чем свидетельствовало накопление как начальных продуктов ПОЛ – ДК, так и конечных – МДА. Так, у животных, находившихся в условиях относительного функционального покоя и получавших тетрахлорметан («Активный Контроль (CCL4)»), отмечался значительный рост значений показателей ДК и МДА по сравнению с группой «Пассивный Контроль» почти в 3 и 2,3 раза, соответственно (см. таблицу 6). Сочетанное воздействие на организм мышей четыреххлористого углерода и повышенной ФН (группа «Активный Контроль (CCL4+ФН)») приводило к интенсификации CCL4-индуцированного ПОЛ, что было продемонстрировано достоверным (р≤0,05) повышением концентраций и ДК, и МДА (60,02±2,33 нмоль/г ткани и 89,32±2,18 мкмоль/г ткани соответственно) по сравнению с группой ««Активный Контроль (CCL4)» (53,97±1,51 нмоль/г ткани и 81,62±1,38 мкмоль/г ткани соответственно). Введение изучаемых фитоадаптогенов в значительной степени предупреждало гиперактивацию ПОЛ, о чем достоверно (р≤0,05) свидетельствовало снижение концентраций ДК и МДА по сравнению с показателями животных, не получавших протекторные препараты. Так, для элеутерококка показатели ДК и МДА составили 33,21±2,06 нмоль/г ткани и 58,18±2,45 мкмоль/г ткани соответственно, а для женьшеня – 34,68±2,31 нмоль/г ткани и 58,78±2,59 мкмоль/г ткани соответственно. Они не имели достоверных отличий этих же показателей от препарата сравнения – карсила (33,21±2,06 нмоль/г ткани и 56,15±1,94 мкмоль/г ткани соответственно) (рис.4,5). 57 Таким образом, в результате проведенных исследований было выявлено, что интоксикация тетрахлорметаном приводила к активации перекисных процессов в печени экспериментальных животных. Об этом свидетельствовало: снижение содержания в ней ВГ, который является одним из компонентов антиоксидантной и детоксикационной систем печени, а также активации накопления продуктов ПОЛ – ДК и МДА. Сочетанное воздействие ФН и CCL4 усугубляло CCL4-индуцированные перекисные процессы в печени мышей (см. таблицу 6). Применение экстракта элеутерококка, настойки женьшеня и препарата сравнения – карсила приводило к значительному снижению интенсивности перекисных процессов в печени экспериментальных животных, получавших четыреххлористый углерод на фоне повышенной ФН. 58 Рис. 5. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на концентрацию МДА в ткани печени экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном в условиях повышенной физической нагрузки. 59 Рис. 6. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на концентрацию ДК в ткани печени экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном в условиях повышенной физической нагрузки. 60 Глава 4. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на морфологические, гистохимические, иммуногистохимические показатели печени мышей, при подострой интоксикации тетрахлорметаном в условиях повышенной физической нагрузки 4.1. Влияние препаратов элеутерококка и женьшеня на гистоморфологическую картину ткани печени экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном на фоне повышенной физической нагрузки В рамках исследования защитного действия фитоадаптогенов (элеутерококка и женьшеня) при подостром поражении печени CCL4 на фоне интенсивной физической нагрузки нами была проведена оценка гистоморфологической картины печени подопытных животных. Для объективного сравнения морфологических изменений ткани печени экспериментальных животных была использована бальная шкала оценки ряда признаков патологии печеночной ткани по методике профессора А.Б. Шехтера: № 1 2 3 4 5 6 7 Признак патологии печеночной ткани изменение общей структуры печени полнокровие центральных вен и сосудов триад расширение полнокровия межбалочных капилляров изменение ядер гепатоцитов изменение (вакуолизация) цитоплазмы гепатоцитов изменение количества купферовских клеток воспалительная инфильтрация стромы Каждый пункт оценивался по 6-ти бальной системе: отсутствие изменений слабовыраженные изменения умеренно выраженные изменения выраженные изменения сильно выраженные изменения максимально выраженные изменения 0 1 2 3 4 5 61 Изучение гистоморфологической картины печени подопытных животных группы «Пассивный Контроль (ФН)» показало, что в целом архитектоника печени у мышей, получавших ФН, сохранена, печеночные балки имели тробекулярную структуру и печеночная ткань практически не отличалась от таковой у группы «Пассивный Контроль», за исключением небольших участков с зернистой и просветленной цитоплазмой гепатоцитов (см. рисунки 7 а,б, 8 а,б). Проведенное морфологическое исследование ткани печени мышей, получавших тетрахлорметан на фоне интенсивной ФН (группа «Активный Контроль(CCL4+ФН)») позволило выявить, что имелся ряд выраженных изменений общей структуры печени по сравнению с мышами, не получавшими тетрахлорметан (рисунки 7 а,б, 8 а,б , 10 а,б). Наблюдались признаки компенсаторноприспособительных реакций печени на токсическое воздействие в виде формирования нодулей, участков мелкоузловой перестройки печеночной паренхимы. При этом сохранялись зоны альтерации, которые характеризовались вакуольной дистрофией, изменениями ядер гепатоцитов, увеличением количества купферовских клеток и их гиперплазией. Следует отметить выраженное, но неравномерное полнокровие центральных вен и сосудов триад, полнокровие печеночных синусов с участками заболачивания эритроцитами. Расширение и полнокровие межбалочных капилляров более выраженное по сравнению с группой животных, не получавших ФН («Активный Контроль(CCL4)») (рисунок 9 а,б). Наблюдались рассеянные инфильтраты, представленные лимфоцитами и значительным количеством сегментоядерных лейкоцитов. Наблюдался массивный цитолиз, без образования фиброзных изменений стромы. Преимущественно в центральной части паренхимы наблюдалась крупнокапельная вакуолизация цитоплазмы гепатоцитов, что обусловлено патологическим механизмом действия гепатотоксина. Следует обратить внимание, что морфологическая картина печени мышей из группы «Активный Контроль(CCL4)» характеризовалась менее выраженными изменениями по сравнению с контрольной группой, получавшей ФН («Активный Контроль(CCL4+ФН)»). 62 а б Рис. 7. Гистоморфологическая картина печени животных, не получавших ФН (группа «Пассивный Контроль»); (окрашивание гематоксилин/эозин). а– увеличение 200, б- увеличение 400. а б Рис. 8. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших ФН (группа «Пассивный Контроль (ФН)»); (окрашивание гематоксилин/эозин). а – увеличение 200, б - увеличение 400. 63 а б Рис. 9. Гистоморфологическая картина печени животных при подострой интоксикации CCL4 без ФН (группа «Активный Контроль(CCL4)»; (окрашивание гематоксилин/эозин). а – увеличение 200, б - увеличение 400. а б Рис. 10. Гистоморфологическая картина печени животных, при подострой интоксикации CCL4 на фоне ФН (группа «Активный Контроль(CCL4+ФН)»; (окрашивание гематоксилин/эозин). а – увеличение 200, б - увеличение 400. 64 а б Рис. 11. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших карсил (препарат сравнения), при подострой интоксикации CCL4 на фоне ФН (группа «Карсил»); (окрашивание гематоксилин/эозин). а – увеличение 200, б - увеличение 400. а б Рис. 12. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших элеутерококк, при подострой интоксикации CCL4 на фоне ФН (группа «Элеутерококк»); (окрашивание гематоксилин/эозин). а – увеличение 200, б - увеличение 400. 65 а б Рис. 13. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших женьшень, при подострой интоксикации CCL4 на фоне ФН (группа «Женьшень»); (окрашивание гематоксилин/эозин). а – увеличение 200, б - увеличение 400. Таким образом, можно сказать, что у групп мышей, получавших CCL4, в печени развивался подострый, субтотальный, паренхиматозно-интерстициальный токсический гепатит с частичной узелковой трансформацией. На гистологических препаратах печени животных, получавших препарат сравнения – карсил, на фоне введения CCL4, отсутствовали многие изменения, наблюдаемые в ткани печени у контрольных групп: сохранялась общая структура печени, лишь местами наблюдалась некоторая тенденция к микронодулярности ткани; значительно менее выраженной была вакуольная дистрофия; большинство ядер гепатоцитов сохраняли нормальную морфологию; отсутствовали изменения количества и морфологии купферовских клеток; интенсивность процесса клеточной инфильтрации очагов воспаления была значительно ниже (рисунок 11 а,б). 66 В результате изучения морфологической картины печени у животных, получавших экстракт элеутерококка при подострой интоксикации CCL4 на фоне повышенной ФН, были выявлены следующие отличия от контрольных групп: общая структура печени после воздействия оставалась значительно более сохранной, однако вакуольная дистрофия была более выраженной по сравнению с печенью животных, принимавших карсил; имела место слабо выраженная тенденция к микронодулярности; полнокровие центральных вен, сосудов триад и межбалочных капилляров было незначительным, расширения межбалочных капилляров не наблюдалось; ядра гепатоцитов характеризовались присутствием минимальных изменений; сохранялась зернистость цитоплазмы гепатоцитов; присутствующая вакуолизация была слабо выраженной и мелкокапельной; наблюдалась умеренная гиперплазия купферовских клеток и некоторое увеличение их количества; воспалительная инфильтрация практически отсутствовала (рисунок 12 а,б). Сравнение микропрепаратов печени мышей, получавших настойку женьшеня при интоксикации CCL4 в условиях интенсивной ФН, с микропрепаратами контрольных групп позволило выявить следующее: морфологическая структура печени по сохранности сопоставима с таковой у мышей, получавших препарат сравнения – карсил, однако локально наблюдалась более выраженная воспалительная инфильтрация; тенденция к микронодулярности отсутствовала; центральные вены и сосуды триад умеренно полнокровны; зернистость цитоплазмы гепатоцитов сохранена, а их ядра характеризуются отсутствием морфологических изменений, присутствуют небольшие участки с признаками мелкокапельной вакуолизации; количество купферовских клеток в норме (рисунок 13 а,б). Данные, представленные в таблице 7, свидетельствуют о том, что лечебнопрофилактическое применение элеутерококка и женьшеня в значительной степени уменьшало выраженность CCL4-индуцированных изменений в печени мышей. При этом гепатопротекторной эффект женьшеня сопоставим с таковым у карсила. 67 Таблица 7. Бальная оценка морфологических признаков патологии печеночной ткани мышей в исследовании гепатопротекторного действия препаратов элеутерококка, женьшеня, карсила при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной физической нагрузки. № животного 1 2 3 4 Пассивный Контроль 5 5 4 4 Группы животных \ сумма балов по семи признакам, n=4#. Пассивный Активный Активный Карсил Элеутерококк Контроль Контроль Контроль (ФН) (CCL4) (CCL4+ФН) 6 5 4 5 14 16 15 15 р1 ≤ 0,05* р1 ≤ 0,05## 19 17 19 18 р1 ≤ 0,05* 7 6 8 7 р1 ≤ 0,05* р2 ≤0,05** 13 12 8 9 р1 ≤ 0,05* р2 ≤0,05** Женьшень 12 9 7 8 р1 ≤ 0,05* р2 ≤0,05** Примечание: * - достоверное отличие от животных групп «Пассивный Контроль (ФН) » и «Пассивный Контроль» (р≤0,05); ** - достоверное отличие от животных групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» (р≤0,05); ## - достоверное отличие от животных, получавших физическую нагрузку, группа «Активный Контроль (CCL 4+ФН)» (р≤0,05); Достоверность отличий результатов бальной оценки морфологических признаков патологии печеночной ткани оценивалась с помощью Uкритерия Уилкоксона-Манна-Уитни (р ≤ 0,05). # - рандомизированный выбор животных из каждой группы проводился с использованием генератора случайных чисел («Microsoft Exсel 2010» 68 Таким образом, исходя из полученных результатов исследования, можно сделать вывод, что изучаемые препараты элеутерококка и женьшеня показали достоверные гепатопротекторные свойства в случае подострого поражения, вызванноговведением CCL4 на фоне повышенных физических нагрузок у мышей. Об этом свидетельствовали результаты гистоморфологического исследования печеночной паренхимы подопытных животных, которые коррелируют с данными, полученными в ходе исследований других показателей, характеризующих функциональное состояние печени в целом. Полученные результаты гистоморфологического исследования ткани печени мышей в данных экспериментальных условиях опубликованы совместно с Козиным С.В. и Булановым Д.В. (Печенкина И.Г. и др., 2014). 4.2. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на ряд гистохимических показателей тканей печени экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном в условиях повышенной физической нагрузки 4.2.1. Гистохимическое изучение содержания гликогена в ткани печени мышей в ходе исследования гепатопротекторного действия элеутерококка и женьшеня В качестве критерия функциональной сохранности печени и интенсивности протекания биоэнергетических процессов использовалось содержание гликогена в ткани печени, оценка которого проводилась по реакции Шифф-йодной кислотой (ШИК-реакции) (Cooksey C., Dronsfield A., 2009; Kierman J.A., 2008). Гистохимическое изучение содержания гликогена в печени мышей выявило значимые отличия между экспериментальными группами животных. Так, в группе «Пассивный Контроль», находившейся в условиях относительного функционального покоя, наблюдалось достаточно однородное насыщенно-малиновое (ШИК-позитивное) окрашивание, что свидетельствовало о сохранности печеночной паренхимы и высоком содержании в ней гликогена. В группе мышей, полу- 69 чавших ФН («Пассивный а Контроль (ФН)»), отмечены б Рис. 14. Гистоморфологическая картина печени животных, не получавших ФН (группа «Пассивный Контроль»);(ШИК-реакция). а– увеличение 200, б- увеличение 400. а б Рис. 15. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших ФН (группа «Пассивный Контроль (ФН)»);(ШИК-реакция). а– увеличение 200, б- увеличение 400. 70 участки с менее ярким окрашиванием цитоплазмы гепатоцитов, наличие которых обусловлено расходом гликогена на выполнение плавательной нагрузки (см. рисунки 14 а,б, 15 а,б ). Обращает на себя внимание то, что во всех опытных группах, получавших CCL4, утрата гликогена гепатоцитами происходила неравномерно: участки с наименьшим содержанием гликогена были расположены преимущественно в центролобулярном отделе печеночных долек. Это соотносится с имеющимися данными о механизме гепатотоксического действия четыреххлористого углерода: в этих зонах цитохром P450-зависимые монооксигеназы проявляют наибольшую активность, что приводит к повышению синтеза гепатотоксических метаболитов тетрахлорметана (Венгеровский А.И., 2002; Omar M.E. et al., 2005). На микрофотографиях зоны дегликогенизации имеют бледно-розовое окрашивание, в отличие от гепатоцитов с нормальным содержанием гликогена, имеющих ярко-малиновое окрашивание, которое тем интенсивнее, чем больше гликогена содержится в гепатоците. При изучении ткани печени контрольных животных, получавших гепатотоксин CCL4 на фоне относительного функционального покоя (группа «Активный Контроль (CCL4)») было обнаружено, что в данном случае в участках дегликогенизации гепатоциты центральной зоны печеночной дольки имели зернистую, сильно вакуолизированную цитоплазму. В то время как периферические гепатоциты содержали значительно больше гликогена. Четко прослеживалась тенденция постепенного изменения интенсивности окрашивания печеночных долек от бледно-розового в центральных участках, соответствующих зоне максимального повреждения, до ярко-малинового в периферических, наиболее сохранных участках печеночной паренхимы (см. рисунок 16 а,б).На фоне повышенной физической нагрузки, интоксикация CCL4 (группа «Активный Контроль (CCL4+ФН)») приводила к более выраженной, по сравнению с группой «Активный Контроль (CCL4)», дезорганизации цитоплазмы и снижению содержания в ней гликогена. При этом на препаратах печени просматривались обширные зоны дегликогенизации, которые характеризовались бледно-розовом окрашиванием при проведении ШИК-реакции (см. рисунок 17 а,б). 71 а б Рис. 16. Гистоморфологическая картина печени животных при подострой интоксикации CCL4 без ФН (группа «Активный Контроль (CCL4)»); (ШИКреакция). а – увеличение 200, б - увеличение 400. а б Рис. 17. Гистоморфологическая картина печени животных, при подострой интоксикации CCL4 на фоне ФН (группа «Активный Контроль (CCL4+ФН)»); (ШИК-реакция). а – увеличение 200, б - увеличение 400. 72 а б Рис. 18. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших карсил, при подострой интоксикации CCL4 на фоне ФН (группа «Карсил»);(ШИК-реакция). а – увеличение 100, б - увеличение 200. 73 а б Рис. 19. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших элеутерококк, при подострой интоксикации CCL4 на фоне ФН (группа «Элеутерококк»); (ШИК-реакция). а – увеличение 100, б - увеличение 200. а б Рис. 20. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших женьшень, при подострой интоксикации CCL4 на фоне ФН (группа «Женьшень»); (ШИК-реакция). а – увеличение 100, б - увеличение 200. 74 Изучение микропрепаратов ткани печени мышей, получавших карсил при подострой интоксикации CCL4 на фоне интенсивной ФН (группа «Карсил»), дало следующие результаты: в ткани печени по-прежнему присутствуют участки повреждения паренхимы, однако выраженной вакуолизации (как в случае контрольных групп) не наблюдалось; цитоплазма гепатоцитов в целом гомогенна и присутствуют зоны с достаточно высоким содержанием гликогена (ярко-розовое окрашивание). Необходимо отметить тот факт, что в центральных зонах печеночных долек, наиболее подверженных гепатотоксическому действию тетрахлорметана, присутствуют островки сохранной печеночной ткани, которые имеют яркое ШИКпозитивное окрашивание за счет присутствия в них большого количества гликогена (см. рисунок 18 а,б). У подопытных животных, получавших элеутерококк на фоне введения гепатотоксина при повышенной ФН (группа «Элеутерококк»), повреждения печеночной ткани достаточно выраженные - с зонами дезорганизации, «комковатости», цитоплазмы гепатоцитов и участками утраты гликогена, что обусловлено комплексным гепатотоксическим воздействием CCL4 и ФН. Как и у мышей, получавших препарат сравнения - карсил, у данной экспериментальной группы наблюдались зоны с сохранной паренхимой, насыщенной гликогеновыми включениями, расположенными преимущественно в периферических отделах долек (см. рисунок 19 а,б). При изучении препаратов печени мышей, получавших женьшень при интоксикации CCL4 на фоне повышенной ФН, было отмечено характерное нарастание дегенеративных изменений гепатоцитов от периферии к центральным участкам печеночной паренхимы, и соответствующее снижение интенсивности малинового окрашивания гликогеновых включений (см. рисунок 20 а,б). Однако по сравнению с контрольными группами картина печени мышей, получавших женьшень, демонстрировала достоверные гликогенсберегающие и гепатопротекторые свойства. 75 Таким образом, во всех группах экспериментальных животных, получавших CCL4 на фоне повышенной ФН, отмечалась неравномерная утрата гликогена гепатоцитами, преимущественно в центральной зоне печеночной дольки. Применение исследуемых фитоадаптогенов (элеутерококка и женьшеня) и препарата сравнения – карсила в значительной степени способствовало сохранению гликогена в гепатоцитах, а также уменьшению поврежденных участков печеночной ткани, что подтверждалось изменением интенсивности малинового окрашивания. 4.2.2. Гистохимическое изучение содержания суммарных белков в ткани печени мышей в ходе исследования гепатопротекторного действия элеутерококка и женьшеня Для визуализации общего белка, содержащегося в ткани печени экспериментальных животных, был использован метод окрашивания сулемовым раствором бромфенолового синего (Елисеев В.Г. и др., 1967; Hornatowska J., 2005). Данная методика позволила оценить степень белковой дистрофии ткани печени при введении исследуемых фитоадаптогенов (элеутерококка и женьшеня) и препарата сравнения – карсила, при подострой интоксикации тетрахлорметаном на фоне интенсивной ФН. Оценить степень изменения содержания суммарного белка позволяет интенсивность окраски бромфеноловым синим, которая прямо коррелирует с количеством белка в тканях (чем больше белка, тем интенсивнее окрашивание). В группе «Пассивный Контроль» наблюдалось достаточно однородное насыщенно-синее окрашивание, что свидетельствовало о сохранности печеночной паренхимы и высоком содержании в ней белка. 76 Рис. 21. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших ФН (группа «Пассивный Контроль (ФН)»); (окрашивание бромфеноловым синим); увеличение 200. Гистохимическая картина печени мышей группы «Пассивный Контроль (ФН)» не имела достоверных отличий от таковой в группе «Пассивный Контроль» (см. рисунок 21). Изучение по этому показателю ткани печени животных групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» выявило существенное негативное влияние подострой интоксикации тетрахлорметаном на гистохимическую картину микропрепаратов печени мышей: наблюдалась обширная вакуолизация печеночной паренхимы, а также низкое содержание белка в некротизированных перипортальных зонах (бледно-голубое окрашивание). При этом не было отмечено достоверной разницы между мышами, получавшими CCL4 в условиях относительного функционального покоя (группа «Активный Контроль (CCL4)»), и животными, подвергнувшимися сочетанному воздействию гепатотоксина и повышенной ФН (группа «Активный Контроль (CCL4+ФН)») (см. рисунок 22). 77 Рис. 22. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших CCL4 на фоне ФН; (группа «Активный Контроль (CCL4+ФН)») (окрашивание бромфеноловым синим); увеличение 200. Во всех группах мышей, получавших протекторные препараты в условиях подосторой интоксикации тетрахлорметаном при повышенной ФН (см. рисунки 23, 24, 25), также наблюдалась вакуолизация печеночной паренхимы, обусловленная воздействием четыреххлористого углерода, однако она была значительно менее выраженная по сравнению с контрольными группами. Содержание белка в тканях печени мышей, получавших настойку женьшеня, приближалось к таковому у животных, которым вводили препарат сравнения - карсил (участки насыщенно-синего окрашивания печеночной паренхимы). 78 Рис. 23. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших карсил, CCL4 на фоне ФН; (окрашивание бромфеноловым синим); увеличение 200. Рис. 24. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших экстракт элеутерококка, CCL4 на фоне ФН; (окрашивание бромфеноловым синим); увеличение 200. 79 Рис. 25. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших настойку женьшеня, CCL4 на фоне ФН; (окрашивание бромфеноловым синим); увеличение 200. Таким образом, во всех группах экспериментальных животных, получавших CCL4, отмечалась белковая дистрофия печеночной паренхимы. Важно отметить, что физическая нагрузка в объеме использованной экспериментальной модели не оказала существенного влияния на содержание белка в тканях печени мышей. Применение исследуемых фитоадаптогенов (элеутерококка и женьшеня) в значительной степени способствовало сохранению белка в гепатоцитах, а также уменьшению поврежденных участков печеночной ткани, причем женьшень по этим свойствам практически не уступает карсилу, что подтверждается изменением интенсивности синего окрашивания. 4.3. Иммуногистохимическое исследование печени мышей при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной ФН с использованием антител к NO-синтазе 2 и TNF-α В рамках иммуногистохимического исследования нами была проведена качественная и полуколичественная оценка содержания фермента NOS2 и цитокина TNF-α в ткани печени экспериментальных животных по интенсивности коричне- 80 вого окрашивания хромогеном комплексов антиген-антитело, локализованных в цитоплазме гепатоцитов. При иммуногистохимической (ИГХ) реакции с антителами к NOS2 и TNF-α иммунопозитивное окрашивание было ассоциировано с цитоплазматическим компартментом гепатоцитов, что согласуется с имеющимися экспериментальными данными, свидетельствующими о локализации NOS2 и TNF-α в цитозоле клеток и отсутствием их в ядерном компартменте. Для достоверности полученных результатов применяли внутренние позитивные контроли антигенов (иммунопозитивное окрашивание синусоидов портальных трактов, эндотелия сосудов, лимфоидных клеток). В ткани печени у интактных животных, находившихся в состоянии относительного функционального покоя, слабовыраженное ИГХ-окрашивание наблюдалось в основном в контрольных зонах портальных трактов, эндотелии и лимфоидных клетках и только в малых группах дискретно расположенных гепатоцитов отмечалось слабое коричневое окрашивание цитозоля (рис. 26 а,б). В интактной группе мышей, получавших ФН, (группа «Пассивный Контроль (ФН)»), наблюдались зоны, с умеренным иммунопозитивным окрашиванием к NOS2 и TNF-α (см. рисунок 27 а,б). Необходимо отметить, что в каждой из контрольных групп «Активный Контроль (CCL4)» и «Активный Контроль (CCL4+ФН)»), получавших тетрахлорметан, было зафиксировано появление в ткани печени обширных участков с сильными повреждениями печеночной паренхимы, часто - с исходом в балонную (вакуольную) дистрофию с настолько сильной деструкцией цитоплазмы, что изучаемые белки, локализующиеся в цитозоле, тоже оказывались разрушенными и не визуализировались. Причем, как видно на микрофотографиях, ядра гепатоцитов сохранны, а действие токсина направлено на разрушение цитоплазматического компартмента клетки. Этим может быть обусловлено то, что в группах, получавших тетрахлорметан, в которых казалось бы, должно быть максимальное иммунопозитивное окрашивание как цитокина TNF-α, так и фермента NOS2, но из-за тотального разрушения цитоплазмы не было отмечено ожидаемого интенсивного 81 окрашивания, за исключением небольших групп гепатоцитов, локализованных по ходу центральной вены, с сохранившейся цитоплазмой и поэтому, имеющих насыщенно-коричневый цвет (см. рисунки 28 а,б, 29 а,б). Совместное воздействие интенсивной ФН и тетрахлорметана в группе «Активный Контроль (CCL4+ФН)» вызвало более тяжелые по сравнению с контрольной группой «Активный Контроль (CCL4)» некробиотические изменения гепатоцитов с полной деструкцией цитозоля. Были выявлены лишь единичные небольшие группы клеток с сохраненной цитоплазмой. Если бы сочетанное воздействие ФН и четыреххлористого углерода не приводило бы к столь сильным деструктивным изменениям гепатоцитов, то возможно мы бы зафиксировали тотальное насыщенно-коричневое окрашивание. На препаратах печени группы «Активный Контроль (CCL4)» цитоплазма гепатоцитов выглядела более сохранной и характеризовалась неоднородным ИГХокрашиванием с закономерным снижением интенсивности в зонах с глубокими дистрофическими изменениями. В пределах печеночной дольки просматривался отчетливый градиент окрашивания гепатоцитов по NOS2 и TNF-α с максимальной интенсивностью в центральных отделах печеночной дольки (с выраженной коричневой окраской) и умеренно-выраженной интенсивностью окрашивания в периферических участках дольки. В каждой контрольной группе интенсивность ИГХ-окрашивания для TNF-α была больше, чем наблюдаемая для NOS2, что соответствовало менее насыщенной окраски гепатоцитов, полученной при использовании антител к NOS2. 82 а б Рис. 26. Гистоморфологическая картина печени животных, не получавших ФН (группа «Пассивный Контроль»); (иммуногистохимическая реакция); увеличние 200 а – уровень фермента NOS2 , б- уровень цитокина TNF-α . а б Рис. 27. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших ФН (группа «Пассивный Контроль (ФН)»); (иммуногистохимическая реакция); увеличение 200 а – уровень фермента NOS2 , б- уровень цитокина TNF-α . 83 а б Рис. 28. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших CCL4 (группа «Активный Контроль (CCL4)»);(иммуногистохимическая реакция); увеличение 200 а –уровень фермента NOS2 , б- уровень цитокина TNF-α . а б Рис. 29. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших CCL4 на фоне ФН (группа «Активный Контроль (CCL4+ФН); (иммуногистохимическая реакция); увеличение 200 а – уровень фермента NOS2 , б- уровень цитокина TNF-α . 84 а б Рис. 30. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших препарат сравнения, карсил, CCL4 на фоне ФН (группа «Карсил»); (иммуногистохимическая реакция); увеличение 200 а – уровень фермента NOS2 , б- уровень цитокина TNF-α . а б Рис. 31. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших экстракт элеутерококка, CCL4 на фоне ФН (группа «Элеутерококк»); (иммуногистохимическая реакция); увеличение 200 а – уровень фермента NOS2 , б- уровень цитокина TNF-α . 85 а б Рис. 32. Гистоморфологическая картина печени животных, получавших настойку женьшеня, CCL4 на фоне ФН (группа «Женьшень»); (иммуногистохимическая реакция); увеличение 200 а – уровень фермента NOS2 , б- уровень цитокина TNF-α . Как видно из полученных результатов, иммунопозитивное окрашивание и фермента NOS2, и цитокина TNF-α в гепатоцитах мышей, получавших препарат сравнения - карсил при подострой интоксикации CCL4 на фоне повышенной ФН, значительно менее выражено (см. рисунок 30 а,б). Преимущественно в центральных зонах долек были выявлены немногочисленные поврежденные гепатоциты со слабым окрашиванием цитоплазмы. Выраженная вакуолизация цитоплазмы гепатоцитов, характерная для контрольных групп, в данном случае отсутствует. Изучение микропрепаратов ткани печени мышей, получавших экстракт элеутерококка при интоксикации CCL4 на фоне повышенной ФН, показало, что в отличие от контрольных групп, в данном случае не наблюдается тотальных повреждений паренхимы печени. Присутствие наиболее интенсивного ИГХ- окрашивания отмечено в центральных зонах печеночных долек с тенденцией к снижению интенсивности на периферических участках (рисунок 31 а,б). Это обу- 86 словлено, по-видимому, направленным цитолитическим действием CCL4 в первую очередь на центролобулярную зону. Иммуногистохимическая картина печени экспериментальных животных, получавших настойку женьшеня на фоне введения CCL4 при повышенной ФН, во многом сходна с таковой у мышей, получавших элеутерококк: наблюдалось мозаичное окрашивание цитоплазмы гепатоцитов - от насыщенно коричневых участков в центральных зонах до бледного, едва различимого окрашивания на периферии, что свидетельствовало о корреляции между интенсивностью окрашивания при иммуногистохимической реакции с антителами к NOS2 и TNF-α и механизмом действия гепатотоксина (рисунок 32 а,б). Таким образом, во всех группах экспериментальных животных, получавших CCL4, отмечалось неравномерное повышение интенсивности иммунопозитивного окрашивания NOS2 и TNF-α в цитоплазме гепатоцитов, преимущественно в центральной зоне печеночной дольки, вплоть до ее глубоких некробиотических изменений, наблюдаемых в группах «Активный Контроль (CCL4)» и «Активный Контроль (CCL4+ФН)» (см. таблицу 8). Это свидетельствовало об увеличении содержания фермента NOS2 и цитокина TNF-α под действием CCL4 и интенсивной ФН. В ходе данного исследования было обнаружено, что участки печеночной ткани, иммунопозитивные по NOS 2, оказывались колокализованными с TNF-αиммунопозитивными зонами. Основываясь на литературных данных, свидетельствующих о взаимосвязи и взаиморегуляции изучаемых белков (Guo J.Y., 2011; Morio L.A., 2001; Tipoe G.L., 2006) можно предположить присутствие данной взаимозависимости и в проводимом эксперименте. Обращает на себя внимание зависимость, наблюдаемая во всех опытных образцах, между участками иммунопозитивного окрашивания NOS2 и TNF-α, которая позволяет высказать предположение об их взаимосвязи или даже взаиморегуляции. 87 Таблица 8. Результаты И.Г.Х.-исследования содержания NOS2 и TNF-α в сохранных гепатоцитах в исследовании гепатопротекторного действия препаратов элеутерококка, женьшеня, карсила при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной физической нагрузки. Группа животных Пассивный Контроль Пассивный Контроль (ФН) Активный Контроль(CCL4) Активный Контроль (CCL4+ФН) Карсил Элеутерококк Женьшень Фактор некроза NO-синтаза 2 (NOS2) % сохранных опухоли-α (TNF-α) # гепатоцитов Оценка по полуколичественной шкале 100 +* +* 100 ++ ++ 30 ++++ ++++ 10 ++++ ++++ 90 80 80 ++ +++ ++ ++ +++ ++ Примечание: Полуколичественная шкала оценки иммуногистохимической реакции: 0 – негативное окрашивание;+* - позитивный внутренний контроль; + - слабое окрашивание; ++ - умеренное окрашивание; +++ - выраженное окрашивание; ++++ - максимально выраженное окрашивание (Тюренков И.Н. и др., 2012). # - процентная шкала визуальной оценки сохранных клеток (Allred D.C., 2008). Применение исследуемых фитоадаптогенов (элеутерококка и женьшеня) в значительной степени способствовало снижению содержания фермента NOS2 и цитокина TNF-α, а также сохранению цитоплазматического компартмента гепатоцитов, что в очередной раз свидетельствует о гепатопротеторном действии изучаемых препаратов. При этом следует отметить, что их гепатозащитное действие по данным иммуногистохимического анализа приближается к эффективности препарата сравнения, карсила. 88 Глава 5. Обсуждение полученных результатов. В процессе жизнедеятельности современный человек контактирует с большим количеством токсических ксенобиотиков (пищевые консерванты, продукты бытовой химии, лекарственные препараты, алкоголь и др.). Одним из наиболее часто поражаемых при воздействии токсинов органов является печень, поскольку именно в ней осуществляются основные метаболические процессы, направленные на их биотрансформацию, в ходе которых из ряда токсикантов зачастую образуются еще более опасные вещества (Teschke R. et al., 2014). Анализ научной литературы позволяет утверждать, что большое количество как отечественных, так и зарубежных научных публикаций посвящено актуальной проблеме патологического воздействия различных ксенобиотиков на печень. Однако в доступных источниках отсутствуют сведения о комплексном воздействии на печень нескольких неблагоприятных факторов. В связи с этим нам представилось актуальным изучить влияние на печень одновременного воздействия гепатотоксина и повышенной физической нагрузки, а также экспериментально обосновать эффективность применения фармакологических препаратов неспецифического действия при сочетании этих неблагоприятнах факторов. В качестве таких средств нами были выбраны для исследования классические фитоадаптогены женьшень и элеутерококк. Как известно из многочисленных научных работ, они обладают гепатопротекторными свойствами и повышают физическую работоспособность (Дардымов И.В., 1976; Крендаль и др., 2007; Пивоварова А.С. и др., 2003; Саратиков А.С., 1974; Huang L.Z. et al., 2011; Murthy H.N. et al., 2014). В результате исследований было установлено, что в течение первых двух недель у мышей, получавших препараты элеутерококка и женьшеня, наблюдалось значительное повышение ФВ по сравнению с исходным уровнем продолжительности плавания (100%). При этом животные, получавшие настойку женьшеня, продемонстрировали несколько большую физическую работоспособность. На фоне введения CCL4 мыши всех экспериментальных групп показали резкое снижение ФВ. Однако продолжительность плавания животных, получав- 89 ших экстракты элеутерококка и женьшеня, была достоверно (р≤0,05) выше по сравнению с контрольной группой, не получавшей протекторные препараты. Дальнейшее введение фитоадаптогенов привело к возрастанию времени плавания мышей – до 112,7% у группы, получавшей элеутерококк и до 118,3% у группы, получавшей женьшень, тем самым предупреждая снижение работоспособности, вызванное введением CCL4. К концу эксперимента на фоне продолжающегося введения гепатотоксина хотя и наблюдалось снижение показателя ФВ, но он был достоверно выше, чем в группе животных, получавших только тетрахлорметан. Необходимо отметить, что продолжительность плавания животных, получавших фитоадаптогены, была значительно выше, чем в группе препарата сравнения – карсила, достигая к 4-й недели эксперимента достоверного (р≤0,05) отличия от группы «Карсил». Таким образом, в данном эксперименте физическая нагрузка выступила в качестве интегрального показателя общего состояния здоровья экспериментальных животных в то же время, позволяя элеутерококку и женьшеню продемонстрировать на фоне подострой интоксикации четыреххлористым углеродомих хорошо изученные актопротекторные свойства (Козин С.В., 1998; Молоковский Д.С., 2004; Петунова А.Н., 2004; Рябов А.Н., 2008; Huang LZ et al., 2011; Lee FT et al., 2009). Обращает на себя внимание тот факт, что само по себе еженедельное плавание до полного утомления в данном эксперименте привело к снижению прироста массы тела мышей, которое хорошо прослеживалось в группах «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный Контроль», достигнув уже к 4-й недели достоверных отличий (117,92% и 122,61% соответственно). Уже с 1-ой недели введения CCL4 достоверно снижалась масса тела мышей. Причем в группе «Активный Контроль (CCL4+ФН)», подвергшейся комплексному воздействию гепатотоксина и интенсивной физической нагрузки, эти изменения были достоверно более выраженными по сравнению с группой «Активный Контроль (CCL4)» и к концу 5-й недели эксперимента массы мышей составили 90,28% и 87,62% от первоначального уровня соответственно, что наряду с результатами исследований показателей, характеризующих функцию печени, свиде- 90 тельствуют о потенцирующем влиянии повышенной ФН на действие гепатотоксина CCL4. Введение изучаемых протекторных препаратов достоверно предупреждало снижение массы тела мышей на фоне интоксикации тетрахлорметаном, причем оба изученных фитоадаптогена не отличались от препарата сравнения - карсилу (96,8%, 97,40% и 99,50% для групп «Элеутерококк», «Женьшень», «Карсил» соответственно). Наряду с показателем динамики массы тела мы оценили один из важнейших показателей состояния гепатобилиарной системы экспериментальных животных – относительную массу печени мышей (Венгеровский А.И. и др., 2012). Направленное токсическое действие тетрахлорметана на печень и его отрицательное влияние на массу тела экспериментальных животных привело к практически двукратному повышению относительной массы печени мышей по сравнению с группами, не получавшими гепатотоксин («Пассивный Контроль» и «Пассивный Контроль (ФН)»). При этом нами впервые экспериментально было показано, что сочетание ФН с гепатотоксином в группе «Активный Контроль (CCL4+ФН)» приводит к более выраженной отрицательной динамике изучаемого показателя по сравнению с группой ««Активный Контроль (CCL4)», не получавшей повышенную нагрузку. Во всех группах, получавших протекторные препараты («Женьшень», «Элеутерококк», «Карсил») в условиях данного эксперимента, наблюдалось уменьшение CCL4-индуцированной гипертрофии печени. В рамках изучения ряда энзимологических и биохимических показателей сыворотки крови мышей было обнаружено, что повышенная ФН влияет на уровень активности ЛДГ, биомаркера повреждения тканей, что является свидетельством наибольшей чувствительности данного показателя к воздействию ФН. Так активность ЛДГ в группах, не получавших физическую нагрузку («Пассивный Контроль» и «Активный Контроль (CCL4)»), составила 218,9 ед./л и 536,0 ед./л соответственно и достоверно (р≤0,05) отличалась от таковой у групп, получавших ФН («Пассивный Контроль (ФН)» и «Активный Контроль (CCL4+ФН)») - 260,3 91 ед./л и 612,4 ед./л соответственно. Также наблюдалась тенденция к увеличению активности ферментов АЛТ (55,4 ед./л и 51,1 ед./л соответственно) и АСТ (147,5 ед./л и 136,3 ед./л соответственно) у группы мышей, получавшей повышенную ФН («Пассивный Контроль (ФН)»), по сравнению с группой, находившейся в условиях относительного функционального покоя («Пассивный Контроль»). Одним из наиболее специфичных признаков, свидетельствующих о поражении печени различными токсическими агентами, является повышение активности АЛТ (Саратиков, А.С. и др., 2001; Stephens, C. et al., 2014; McCuskey, R.S. et al., 2010). Нами было продемонстрировано, что подострая интоксикация тетрахлорметаном приводила к резкому повышению активностей не только АЛТ, но и всех остальных изучаемых показателей (АСТ, ЩФ, ЛДГ, общий билирубин, холестерин). Причем в группе «Активный Контроль (CCL4+ФН)», получавшей CCL4 на фоне повышенной ФН, активности АЛТ, АСТ и ЛДГ достоверно выше по сравнению с группой «Активный Контроль (CCL4)», что свидетельствует о значительно более выраженных нарушениях функций печени. Применение фитоадаптогенов (настойки женьшеня и экстракта элеутерококка) при сочетанном воздействии подострой интоксикации CCL4 и повышенной ФН продемонстрировало выраженное защитное действие в отношении изучаемых энзимологических и биохимических показателей сыворотки крови мышей, что коррелирует с имеющимися данными научной литературы (Крендаль Ф.П. и др., 2007; Bak, M.J. et al., 2012; Murthy, H.N. et al., 2014; Shim, J.-Y. et al., 2010) Как известно, значимым звеном в гепатотоксическом механизме действия тетрахлорметана является активация процессов ПОЛ, что приводит к нарушению функционирования различных биохимических систем и негативно сказывается на морфологическом и функциональном состоянии печени (Агарков, А.А., 2009; Alhassan, A.J. et al., 2009; Khan, R.A. et al., 2012; Rezende, T.P. et al., 2014). В ходе эксперимента нами было выявлено, что интоксикация CCL4 вызывала активацию процессов ПОЛ и снижение активности эндогенной антиоксидант- 92 ной системы организма, что проявлялось в изменении уровня таких показателей как: восстановленный глутатион, малоновый диальдегид, диеновые конъюгаты. При введении мышам тетрахлорметана наблюдалось резкое уменьшение уровня ВГ в ткани печени, который является одним из компонентов защитной антиоксидантной системы организма. Его концентрация в группах, получавших тетрахлорметан, снижалась более чем в 2 раза, что может быть вызвано расходованием ВГ на обезвреживание свободных радикалов, образующихся в процессе метаболизма гепатотоксина, наиболее активно протекающее в ткани печени (Iskusnykh I.Y. et al., 2013). При этом отмечался значительный рост ДК и МДА, являющихся продуктами ПОЛ. Необходимо обратить внимание на ряд литературных данных, свидетельствуют о том, что экстремальные факторы различной природы, в том числе, повышенная физическая нагрузка, увеличивают интенсивность протекания свободнорадикальных процессов в ткани печени (Kan, N.-W. et al., 2013; Mikami, T et al., 2004; Venditti, P. et al., 1999). Это нашло подтверждение и в настоящем исследовании. Еженедельное плавание мышей до полного утомления с грузом 7 % от массы тела животного (группа «Пассивный Контроль (ФН)») приводило к достоверному повышению концентраций МДА и ДК в ткани печени по сравнению с животными, содержавшимися в условиях относительного функционального покоя («Пассивный Контроль»). При этом наблюдалась тенденция к снижению содержания ВГ в ткани печени мышей в условиях повышенной ФН. Сочетанное воздействие на печень тетрахлорметана и повышенной ФН, как и следовало ожидать, приводило к более выраженным повреждениям печени, в связи с чем наблюдалось предельное истощение восстановленного глутатиона и значительный рост продуктов ПОЛ в ткани печени экспериментальных животных (1,77±0,18 мкмоль/г ткани и 2,35±0,14 мкмоль/г ткани для групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)»соответственно). Многочисленные экспериментальные данные убедительно свидетельствуют о высокой антиоксидантной активности фитоадаптогенов (Большакова И.В. и др., 1997; Чехани Н.Р. и др., 2012; Hong J. et al., 2014; Hu D. et al., 2012 Jiao L. et al., 93 2014; Nan J.X. et al., 2003), что также нашло подтверждение в ходе нашего исследования. Так, лечебно-профилактическое введение элеутерококка и женьшеня при интоксикации CCL4 на фоне повышенной ФН, в значительной степени предупреждало гиперактивацию ПОЛ, о чем достоверно свидетельствовало снижение концентраций ДК и МДА по сравнению с показателями животных, не получавших протекторные препараты. Также необходимо отметить, что применение как элеутерококка, так и женьшеня, несмотря на воздействие на печень двух патологических факторов, повышало содержание ВГ в ткани печени, практически не уступая по силе действия препарату сравнения, карсилу (4,28, 4,32 и 4,63 мкмоль/г ткани соответственно). Опираясь на данные научной литературы и результаты собственных исследований, можно с уверенностью утверждать, что антиоксидантные свойства играют важнейшую роль в гепатопротекторном действии элеутерококка и женьшеня (Бизунок Н.А., 2001; Дардымов И.В. и др., 1973; Крендаль Ф.П. и др., 2007; Murthy H.N. et al., 2014; Shim J.-Y. et al., 2010). В рамках исследования защитного действия фитоадаптогенов (элеутерококка и женьшеня) при подостром поражении печени CCL4 на фоне повышенной физической нагрузки нами была проведена оценка морфологической картины печени подопытных животных. Изучение морфологической картины печени у мышей, получавших ФН (группа «Пассивный Контроль (ФН)»), показало, что в целом архитектоника печени сохранена и печеночная ткань практически не отличается от таковой у животных, находившихся в условиях относительного функционального покоя («Пассивный Контроль»), за исключением небольших участков с зернистой и просветленной цитоплазмой гепатоцитов, что коррелирует с литературными данными (Huang, K.C., 2013; Praphatsorn P. et al., 2010). В серии работ по изучению гистоморфологической картины ткани печени экспериментальных животных установлено, что введение тетрахлорметана приводит к структурно-функциональным изменениям ткани печени различной степени выраженности (Терехов, А.Ю., 2006; Alhassan A.J. et al., 2009; Sharma S.K. et 94 al., 2009). В настоящей работе подострая интоксикация мышей 10 % масляным раствором четыреххлористого углерода в дозе 30 мл/кг (в пересчете на масляный раствор) 2 раза в неделю в течение трех недель приводила к возникновению патологических изменений ткани печени. Так, в группе экспериментальных животных, получавших гепатотоксин и не подвергавшихся ФН (группа «Активный Контроль (CCL4)») наблюдались признаки компенсаторно-приспособительных реакций печени на токсическое воздействие в виде формирования нодулей, участков мелкоузловой перестройки печеночной паренхимы. При этом зоны альтерации, характеризовались вакуольной дистрофией, изменениями ядер гепатоцитов, увеличением количества купферовских клеток и их гиперплазией. В рамках настоящей работы нами впервые было проведено морфологическое исследование ткани печени мышей, подвергшихся комплексному воздействию двух патологических факторов - действию гепатотоксина и повышенной ФН. Полученные результаты убедительно свидетельствуют о наличии более выраженных структурных изменений в печени животных, подвергшихся совместному действию обоих факторов, по сравнению с контрольной группой, находившейся в условиях относительного функционального покоя. Так, при воздействии и гепатотоксина, и ФН, в печени животных было отмечено появление рассеянных инфильтратов, представленных лимфоцитами и значительным количеством сегментоядерных лейкоцитов; наблюдался массивный цитолиз (без образования фиброзных изменений стромы); было отмечено появление крупнокапельной вакуолизации цитоплазмы гепатоцитов (преимущественно в центральной части паренхимы), что, вероятно, обусловлено патологическим механизмом действия гепатотоксина (Терехов, А.Ю., 2006; Morio, L.A. et al., 2001). Таким образом, у групп мышей, получавших CCL4, в печени развивался подострый субтотальный паренхиматозно-интерстициальный токсический гепатит с частичной узелковой трансформацией. Данные научной литературы и результаты наших исследований показали, что курсовое применение элеутерококка и женьшеня в значительной степени со- 95 кращало выраженность CCL4-индуцированных изменений ткани печени экспериментальных животных (Karakus E. et al., 2011; Shim, J.-Y. et al., 2010). Так у животных, получавших экстракт элеутерококка при подострой интоксикации тетрахлорметаном на фоне повышенной ФН, общая структура печени значительно более сохранна: ядра имеют минимальные изменения, сохраняется зернистость цитоплазмы гепатоцитов, вакуолизация мелкокапельная, слабовыраженная, гиперплазия купферовских умеренная, а воспалительная инфильтрация практически отсутствует. Морфологическая структура печени мышей, получавших настойку корней женьшеня, по сохранности практически сопоставима с таковой у мышей, получавших препарат сравнения – карсил: ядра гепатоцитов обычного гистологического строения, зернистость цитоплазмы сохранена, присутствуют лишь небольшие участки с мелкокапельной вакуолизацией, количество купферовских клеток в норме. То есть по своему гепатопротекторному действию женьшень сопоставим с карсилом. Следует, однако, отметить отсутствие тенденции к микронодулярности в случае применения женьшеня. На основании всего вышесказанного можно сделать вывод о том, что исследуемые фитоадаптогены обладают выраженными гепатопротекторными свойствами, которые проявляются в условиях комплексного воздействия на печень двух патологических факторов – гепатотоксина и повышенной ФН. Основываясь на литературных данных о негативном влиянии тетрахлорметана на протекание биоэнергитических процессов в печени (Крендаль Ф.П. и др., 2007; Omar, M.E. et al., 2005), мы предположили присутствие изменений ряда биохимических показателей в ткани печени мышей в условиях сочетанного воздействия тетрахлорметана и повышенной ФН. Для проверки данной гипотезы нами была проведена гистохимическая оценка содержания гликогена (по ШИКреакции) и суммарных белков (с помощью окрашивания сулемовым раствором бромфенолового синего) в ткани печени. В результате было обнаружено, что у животных в условиях относительного функционального покоя (группа «Пассивный Контроль») сохраняется целостность печеночной паренхимы и высокое со- 96 держание гликогена в ткани, о чем свидетельствует однородное насыщенномалиновое (ШИК-позитивное) окрашивание. В ткани печени мышей, получавших ФН (группа «Пассивный Контроль (ФН)»), присутствуют светлые участки с менее ярким окрашиванием цитоплазмы гепатоцитов, наличие которых обусловлено, по всей видимости, расходом гликогена на выполнение плавательной нагрузки. Обращает на себя внимание то, что у всех животных, получавших CCL4, происходила неравномерная утрата гликогена гепатоцитами: участки с наибольшими повреждениями расположены преимущественно в центролобулярном отделе печеночных долек, что коррелирует с данными о механизме гепатотоксического действия четыреххлористого углерода. В этих зонах цитохром P-450зависимые монооксигеназы проявляют наибольшую активность и, соответственно, максимально продуцируют гепатотоксические метаболиты тетрахлорметана (Венгеровский А.И., 2002; Omar M.E. et al., 2005). На фоне интенсивной физической нагрузки и интоксикации CCL4 в группе «Активный Контроль (CCL4+ФН)» наблюдалась более выраженная по сравнению с группой «Активный Контроль (CCL4)» дезорганизация цитоплазмы и снижение содержания гликогена в гепатоцитах, что, согласно результатам проведенного нами плавательного теста, негативно сказывалось на способности животных выполнять физическую работу. Курсовое применение исследуемых фитоадаптогенов (элеутерококка и женьшеня) приводило к уменьшению поврежденных участков печеночной ткани, а также в значительной степени способствовало сохранению гликогена в гепатоцитах, что подтверждалось увеличением интенсивности ШИК-позитивного окрашивания по сравнению с животными, не получавшими протекторные препараты, и позволяет нам судить о гликоген-сберегающих свойствах исследуемых препаратов. Согласно мнению ряда авторов, химически активные радикалы, образующиеся в результате метаболизма CCL4, оказывают ингибирующее действие на процессы биосинтеза белка в печени за счет дезорганизации эндоплазматического ретикулума, разрушения РНК, рибосом, полисом (McCuskey R.S., 2010). С целью 97 оценки степени белковой дистрофии ткани печени при подострой интоксикации тетрахлорметаном на фоне повышенной ФН и при введении исследуемых фитоадаптогенов (элеутерококка и женьшеня), препарата сравнения – карсила, нами было проведено гистохимическое исследование препаратов ткани печени с использованием метода окрашивания бромфеноловым синим. Данное исследование позволило выявить обширную вакуолизацию печеночной паренхимы и значительно более низкое содержание белка в некротизированных перипортальных зонах в печени животных экспериментальных групп при интоксикации тетрахлорметаном (группы «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)»), по сравнению с группами мышей, не получавших гепатотоксин. Данное гистохимическое исследование не выявило значимого влияния повышенной ФН на изучаемый показатель в группах «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный Контроль», а также «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)». Изучаемые фитоадаптогены продемонстрировали достоверные протекторные свойства в отношении белковой дистрофии, вызванной интоксикацией тетрахлорметаном, что визуализировалось более интенсивным синим окрашиванием микропрепаратов ткани печени по сравнению с микропрепаратами групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)». С помощью одного из наиболее специфичных современных аналитических методов - иммуногистохимического исследования, нами была проведена оценка содержания фермента NOS2 и цитокина TNF-α в ткани печени мышей. Как полагают некоторые исследователи (Тейлор Б.С. и др., 1998; Bhatt K.H. et al., 2011; Guo, J.Y. et al., 2011; Lee D., Lau A., 2011; Liu W.H., Chang L.S., 2012), данные белки играют значимую роль в патогенезе CCL4-индуцированного поражения печени. Так в исследовании L.A. Morio и соав. (Morio L.A. et al., 2001) с помощью вестерн-блоттинга было зафиксировано повышение уровня TNF-α мРНК и экспрессии NOS2 в ткани печени мышей при однократном введении 0,3 мл/кг масля- 98 ного раствора CCL4. Экспериментальные животные с нокаутом по гену, который отвечает за биосинтез TNF-α и с блокадой рецептора TNFК1/p55 (через который опосредуются эффекты TNF-α), продемонстрировали меньшую чувствительность к гепатотоксическому действию тетрахлорметана, а подопытные животные с блокированной функцией NOS 2 в печени показали больший гепатотоксический эффект CCL4 по сравнению с контрольными животными (wild-type), что подтверждалось гистологическим исследованием ткани печени и уровнем АЛТ и АСТ в сыворотки крови мышей. Вместе с тем, в современной научной литературе отсутствуют сведения о влиянии сочетанного воздействия повышенной ФН и тетрахлорметана на уровень фермента NOS 2 и цитокина TNF-α в печени, а также не была изучена роль этих белков в гепатопротекторном действии фитоадаптогенов. Это обусловило проведение нами соответствующей серии экспериментов в рамках настоящей исследовательской работы. Результаты иммуногистохимического исследования свидетельствуют о том, что подострая интоксикация тетрахлорметаном приводит к сильным повреждениям печеночной паренхимы с исходом в балонную дистрофию с деструкцией цитоплазмы (в группах мышей, не получавших протекторные препараты), при которой изучаемые белки разрушаются и не визуализируются иммуногистохимически. При этом ядра гепатоцитов не претерпивают видимых изменений, то есть действие токсина направлено на разрушение только цитоплазматического компартмента клетки, что свидетельствует о его выраженном цитолитическом действие. По-видимому, отсутствие ИГХ-окрашивания в рассматриваемом случае обусловлено тотальным разрушением всего цитоплазматического компартмента клетки. В группе «Активный Контроль (ФН+CCL4)» были зафиксированы еще более глубокие некробиотические повреждения печеночной паренхимы с полной деструкцией цитозоля, в связи с чем иммунопозитивная реакция к NOS 2 и TNF-α была слабовыраженной. Результаты иммуногистохимического анализа свидетельствуют об усилении направленного цитолитического действия тетрахлорметана под действием интенсивной ФН. Интересно, что в данном эксперименте ФН в ви- 99 де еженедельного плавания с грузом сама по себе (группа «Пассивный Контроль (ФН)») приводит к явному увеличению интенсивности иммунопозитивного окрашивания NOS2 и TNF-α в перипортальных зонах. Имеются лишь несколько работ, указывающих на то, что под влиянием интенсивной ФН происходит увеличение концентрации TNF-α в плазме крови экспериментальных животных (Huang, K.C. et al., 2013; Tidball, J.G. et al., 2005), что может объяснить полученные результаты. Однако данный вопрос остается открытым и нуждается в более тщательном изучении. Б.В. Дубовик и соавт. продемонстрировали ингибирующее действие женьшеня и элеутерококка (в дозе 1 мл/кг) в отношении липополисахаридиндуцируемой продукции фактора некроза опухолей-α у мышей (Дубовик, Б.В. и др., 1998). В последствии полученные результаты были подтверждены работами зарубежных ученых (Gong X. et al. 2013; Pomari E. et al., 2014; Zhao J. et al.,2014). Так в исследовании Kim D.H. и соавт.(Kim D.H. et al., 2013) с помощью вестерн блоттинга и анализа EMSA (электрофоретического анализа изменения мобильности) было показано ингибирующее действие гинсенозида Rd на активность транскрипционного фактора NF-κB, принимающего участие в продукции провоспалительных цитокинов (в том числе TNF-α), а также индуцибельной NO-синтазы в ответ на введение мышам липополисахаридов. Схожие результаты были получены Lee S.M. (Lee S.M., 2014) при изучении противовоспалительных свойств гинсенозидов: Rg5, Rz1, Rk1 на культуре клеток HepG2 (клетки гепатокарциномы человека). Результаты исследования Park E.J. и соавт. (Park E.J. et al., 2004) также экспериментально продемонстрировали выраженное противовоспалительное действие элеутерококка, которое проявлялось в снижении уровня провоспалительных цитокинов (в т.ч. TNF-α) в сыворотке крови мышей при D- галактозамин/липополисахарид – индуцированном поражении печени. Нами впервые было выявлено, что лечебно-профилактическое применение фитоадаптогенов (элеутерококка и женьшеня) в условиях комплексного воздействия на печень двух патологических факторов – подострой интоксикации CCL4 и повышенной ФН, способствовало значительному снижению уровней NOS2 и 100 TNF-α и сохранению цитоплазматического компартмента гепатоцитов. Показано, что гистоморфологические картины при иммуногистохимическом исследовании ткани печени экспериментальных животных, получавших настойку женьшеня и экстракт элеутерококка на фоне введения CCL4 при повышенной ФН, во многом сходны: наблюдалось мозаичное окрашивание цитоплазмы гепатоцитов - от насыщенно коричневых участков в центральных зонах до бледного, едва различимого окрашивания на периферии. Основываясь на полученных данных, можно предположить, что интенсивность ИГХ-окрашивания в случае использования антител к NOS2 и TNF-α хорошо сопоставима со степенью повреждения ткани печени под действием тетрахлорметана, а картина ИГХ-окрашивания в рассматриваемом случае отражает механизмы действия данного гепатотоксина. Таким образом, во всех группах экспериментальных животных, получавших CCL4, отмечалось неравномерное повышение интенсивности иммунопозитивного окрашивания NOS2 и TNF-α в цитоплазме гепатоцитов. Это свидетельствует об увеличении содержания фермента NOS2 и цитокина TNF-α в ткани печени под действием CCL4 и интенсивной ФН. Обращает на себя внимание зависимость, наблюдаемая во всех опытных образцах, между участками иммунопозитивного окрашивания NOS2 и TNF-α, которая позволяет высказать предположение об их взаимосвязи или даже взаиморегуляции. Применение исследуемых фитоадаптогенов (элеутерококка и женьшеня) в значительной степени способствовало снижению содержания фермента NOS2 и цитокина TNF-α, а также сохранению цитоплазматического компартмента гепатоцитов, что убедительно свидетельствует о гепатопротеторном действии изучаемых препаратов, которое приближается по эффективности к препарату сравнения – карсилу. Учитывая данные литературы и опираясь на полученные нами результаты иммуногистохимического исследования, можно предположить, что ингибирующее действие изучаемых фитоадаптогенов на различные звенья воспалительного процесса вносит значительный вклад в их гепатопротекторные свойства. 101 Таким образом полученные результаты исследований позволяют сделать ряд выводов о том, что: повышенная ФН потенцирует гепатотоксическое действие тетрахлорметана, о чем свидетельствуют ряд проведенных нами тестов (снижение прироста массы тела мышей, повышение относительной массы печени мышей, изменения активностей некоторых энзимологических и биохимических показателей, а также показателей, характеризующих антиоксидантную функцию печени, нарушения морфологической структуры ткани печени, снижение содержания гликогена и общего белка в ткани печени мышей, повышение содержания фермента NOS2 и цитокина TNF-α). При курсовом введении препараты женьшеня и элеутерококка в дозах 47 мг/кг и 48,5 мг/кг соответственно (в пересчете на сухой остаток) в эксперименте на мышах проявили достаточно выраженные гепатопротекторные свойства, сопоставимые с действием эталонного гепатопротектора растительного происхождения – карсила, что подтверждалось нормализацией изучаемых показателей. Причем, по влиянию на показатель физической выносливости экспериментальных животных исследуемые фитоадаптогены превосходили препарат сравнения – карсил, что согласуется с хорошо известными их актопротекторными свойствами. Рассматривая возможные механизмы гепатопротекторного действия фитоадаптогенов, нельзя обойти вниманием их ранее изученное антиоксидантное действие, которое подтвердилось в нашем исследовании. Так, в условиях подострой интокискации тетрахлорметаном на фоне повышенной физической нагрузки препараты женьшеня и элеутерококка достоверно снижали уровни ДК, МДА, сохраняли ВГ в ткани печени. В качестве еще одного пути реализации гепатопротекторных свойств фитоадаптогенов была рассмотрена их способность сохранять запасы гликогена и белка в ткани печени в условиях сочетанного воздействия гепатотоксина и повышенной ФН, что подтверждалось результатами собственного гистохимического исследования ткани печени и данными научной литературы. В рамках представляемой работы было проведено изучение содержания фермента NOS2 и цитокина TNF-α в кани печени с помощью иммуногистохими- 102 ческого исследования. По данным научной литературы одним из патогенетических механизмов CCL4-индуцированных поражений печени является увеличение содержания NOS2 и TNF-α в ткани печени, что подтвердилось результатами проведенных нами исследований. Применение изучаемых препаратов в значительной мере снижало уровни этих белков. Таким образом было выявлено значимое звено в механизме гепатопротекторного действия препаратов женьшеня и элеутерококка. 103 ВЫВОДЫ 1. Физическая нагрузка в виде еженедельного плавания до полного утомления с грузом 7 % от массы тела животного потенцировала повреждающее действие тетрахлорметана в дозе 30 мл/кг в отношении печени. Это проявлялось в более выраженных CCL4-индуцированных изменениях на фоне повышенной физической нагрузки, а именно в снижении динамики массы тела, повышении относительной массы печени, нарушениях морфологической структуры печеночной ткани, изменениях некоторых биохимических и энзимологических показателей сыворотки крови, а также показателей, характеризующих работу антиоксидантной системы печени у мышей. 2. Ежедневное введение настойки женьшеня 47 мг/кг и экстракта элеутерококка 48,5 мг/кг (в пересчете на сухой остаток) в течение 5 недель предупреждало CCL4-индуцированное нарушение физической работоспособности. Защитное действие в отношении физической выносливости препаратов женьшеня и элеутерококка выше, чем у препарата сравнения карсила. 3. Настойка женьшеня 47 мг/кг и экстракт элеутерококка 48,5 мг/кг при ежедневном введении в течение 5 недель оказывали гепатопротекторный эффект в условиях сочетанного воздействия гепатотоксина CCL4 и повышенной физической нагрузки по ряду биохимических, энзимологических, гистоморфологических, гистохимических, иммуногистохимических показателей сравнимый с эффектом карсила. 4. Подострая интоксикация CCL4 (в дозе 30 мл/кг в течение трех недель) сопровождалась увеличением содержания фермента NO-синтазы 2 и цитокина TNF-α в ткани печени. Применение исследуемых фитоадаптогенов (женьшеня (47 мг/кг) и элеутерококка (48,5 мг/кг) в пересчете на сухой остаток) и препарата сравнения – карсила (100мг/кг), приводило к значительному снижению уровня этих белков. На основании полученных данных можно сде- 104 лать вывод о том, что влияние на содержание NO-синтазы 2 и TNF-α является одним из механизмов гепатопротекторного действия изучаемых препаратов. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Полученные экспериментальные данные о наличии у экстракта элеутерококка и настойки женьшеня гепатопротекторных свойств в условиях воздействия гепатотоксического соединения и повышенной физической нагрузки могут быть использованы для дальнейшего исследования с целью расширения показаний их клинического применения. Изученные препараты могут быть рекомендованы в качестве лечебно-профилактических средств лицам, чья жизнь и трудовая деятельность связана с контактами с гепатотоксическими веществами в условиях повышенной физической нагрузки. 105 Список литературы 1. Абдурахманов, Т.М. Антиоксидантное и анаболическое действие при- родных адаптогенов: Докл. на 5 науч.-практ. конф. по апитерапии «пчелы и ваше здоровье». / Т.М. Абдурахманов, Ш.М. Омаров, Э.Н. Агаева и др.// Апитерапия сегодня. – 1997. - №5. – С. 113-114 2. Абрамова Ж.И. Человек и противоокислительные вещества. / Ж.И. Абрамова, Г.И. Оксенгендлер. – Л.: НАУКА. – 1985. – 232 с. 3. Агарков, А.А. Применение ионообменной хроматографии для очистки глутатионредуктазы из печени крысы в условиях нормы, при токсическом гепатите и введении тиоктовой кислоты. / А.А. Агарков, Т.Н. Попова, А.В. Семенихина // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2008. – Т. 8, № 5. – С. 835-841. 4. Агарков, А.А. Регуляция активности глутатионредуктазы из печени крысы при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.01.04. / А.А. Агарков. - Воронеж, 2009. – 24 с. 5. Амбрушкевич, Ю.Г. Предрасположенность к гепатотоксичности эта- нола: роль процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы печени: автореф. дис. … канд. биол. наук: 14.00.20. / Ю.Г. Амбрушкевич. Минск, 2003. – 22с. 6. Апросина, З.Г. Хронические диффузные заболевания печени (совре- менные тенденции) / З.Г. Апросина // Клинич. фармакология и терапия. - 1996. Т. 5, № 1. — С. 14—18. 7. Баган Н. Ю. Функционально-биохимическая характеристика и экспе- риментальная фармакотерапия тетрациклиновых поражений печени: Автореф. дис. канд. мед. наук.— Киев, 1991.— 28 с. 8. Баган Н. Ю. Функционально-биохимическая характеристика и экспе- риментальная фармакотерапия тетрациклиновых поражений печени: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.25. / Н.Ю. Баган. — Киев, 1991.— 28 с. 106 9. Бизунок, Н.А. Влияние фитоэкстрактов женьшеня, солодки и эхина- цеи на окислительный метаболизм фагоцитов. / Н.А. Бизунок // Труды молодых ученых: Сб. науч. работ. – Минск. – 2001. – С. 59-62. 10. Близнецова, Г.Н. Влияние L-аргинина и ингибиторов NO-синтазы на образование оксида азота и нитрозотиолов при токсическом повреждении печени. / Г.Н. Близнецова, С.С. Артемьева, М.И. Рецкий // Биомедицинская химия. – 2005. – Т. 51, вып. 6. – С. 656-661. 11. Болдогуев, В.М. Адаптогенное действие растительного средства «Адаптофит-28»: автореф. дисс. … канд. мед. наук.: 14.03.06. / В.М. Болдогуев. – Улан-Удэ, 2011. – 22 с. 12. Большакова, И.В. Антиоксидантные свойств ряда экстрактов лекар- ственных растений. / И.В. Большакова, Е.Л. Лозовская, И.И. Сапежинский // Биофизика. – 1997. - №2. – С. 480-483. 13. Большакова, И.В. Антиоксидантные свойств ряда экстрактов лекар- ственных растений. / И.В. Большакова, Е.Л. Лозовская, И.И. Сапежинский // Биофизика. – 1997. - №2. – С. 480-483. 14. Большакова, И.В. Фотосенсибилизирующие и фотопротекторные свойства экстрактов группы лекарственных растений. / И.В. Большакова, Е.Л. Лозовская, И.И. Сапежинский // Биофизика. – 1997. - №4. – С. 926-932. 15. Брехман, И.И. Элеутерококк. / И.И. Брехман. – Л.: Наука. – 1968. – 16. Брехман, И.И. Адаптогены растительного происхождения – фармако- 186 с. логические средства повышения работоспособности и сопротивляемости организма. / И.И. Брехман // Фармакология двигательной активности. – М. – 1969. – С. 9-26. 17. Брехман, И.И. Стимулирующее действие индивидуальных гликозидов элеутерококка. / И.И. Брехман, И.В. Дардымов // Материалы III конференции ЦНИЛ Томского мед. ун-та. – Томск, 1966. – Вып. 3. – С. 91. 107 18. Бушма, М.И. Роль антиоксидантной системы печени в предрасполо- женности крыс к гепатотоксическому действию этанола. / М.И. Бушма и др. // Эксперим. и клинич. фармакология. — 2003. - Т.66, № 1. - С. 60-63. 19. Валика, В.В. Доклиническое исследование гепатопротекторной эф- фективности нового комбинированного препарата Neamon-hepa. / В.В. Валика, С. Б. Парий, Л. Г. Руснак, А. И. Унгуряну, Е. С. Николай, М. П. Тодираш // Фармакология и лекарственная токсикология. – 2014. - № 1. – С. 40-47. 20. Ванюшкин, А.Н. Использование мембраностабилизирующего эффекта некоторых адаптогенов для оценки их биологической активности и качества. / А.Н. Ванюшкин, Ф.П. Крендаль, С.В. Козин, С.Х. Халиуллина // Всерос. науч. конф. «Актуал. пробл. создания нов. лекарств. средств». - СПб. -1996. – С. 125. 21. Ванюшкин, А.Н. Мембраностабилизирующий эффект фитоадаптоге- нов как показатель их адаптогенной активности. / А.Н. Ванюшкин, Ф.П. Крендаль, С.В. Козин, Л.В. Левина // Тез. докл. 7-го Всерос. симпоз. «Экологофизиологические проблемы адаптации». – М. – 1994. – С. 43. 22. Венгеровский А.И. Эффективность и механизм действия гепатопро- текторов при экспериментальном токсическом поражении печени: автореф. дисс. … докт. мед. наук: 14.00.25. / А.И. Венгеровский. - М., 1991. – 40 с. 23. Венгеровский, А.И. Влияние гепатопротекторов, содержащих поли- фенолы, на метаболизм и функции поджелудочной железы и печени при экспериментальном остром панкреатите. / А.И. Венеровский, М.Е. Мозжелин и др. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. – 2004. – № 1. – С. 29–32. 24. Венгеровский, А.И. Методические рекомендации по изучению гепа- топротективной активности лекарственных средств. / А.И. Венгеровский, В.В. Удут, Д.В. Рейхарт, А.М. Дыгай // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, - 2012. – С. 710-718. 108 25. Венгеровский, А.И. Фармакологические подходы к регуляции функ- ций печени. / А.И. Венгеровский // Бюллетень сибирской медицины. – 2002. - № 1. – С. 25-29. 26. Винер, Б.М., Гукасов В.М., Крендаль Ф.П., Левина Л.В. Исследование антиоксидантной активности некоторых фитоадаптогенов. / Б.М. Винер, В.М. Гукасов, Ф.П. Крендаль, Л.В. Левина // Вопросы хемилюминесценции. – М. – 1992. – Т.3. - №1. – С. 1-4. 27. Висмонт, Ф.И. NO - зависимые механизмы регуляции детоксикацион- ной функции печени и формирования прооксидантно-антиоксидантного состояния организма у крыс с токсическим поражением печени. / Ф.И. Висмонт, Н.А. Степанова // Кислород и свободные радикалы: материалы Республиканской научно-практической конференции / Под ред. В.В. Зинчука. – Гродно: ГрГМУ, 2014. – 228 с. 28. Водолазский, Ю.В. Изыскание и фармакологическое изучение стресс протекторов на основе растительного сырья Европейской территории РФ: автореф. дис. … канд. биол. наук: 16.00.04. / Ю.В. Водолазский. – Воронеж, 2000. – 22 с. 29. Воронова, А.В. Разработка и стандартизация комплексного раститель- ного средства, рекомендуемого при алкогольной интоксикации: автореф. дис. … канд. фарм. наук: 14.04.02. / А.В. Воронова. – Улан-Удэ, 2011. – 23 с. 30. Воскресенский, О.Н. Влияние элеутерококка и женьшеня на развитие свободнорадикальной патологии. / О.Н. Воскресенский, Т.А. Девяткина и др. // Новые данные об элеутерококке: Материалы Второго международного симпозиума по элеутерококку (Москва, 1984г.). – Владивосток: ДВНЦ АН СССР. – 1986. – С. 101-104. 31. Гаврилов, В.Б. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой. / В.Б. Гаврилов, А.Р. Гаврилова, Л.М. Мажуль // Вопросы мед. химии. – 1987. - № 1. – С. 118 – 122. 109 32. Гарбузеко, Д.В. Механизмы компенсации структуры и функции пече- ни при ее повреждении и их практическое значение. / Д.В. Гарбузеко // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. – 2008. – Т. 18, № 6. – С. 14-21. 33. Герасимов, А.Н. Медицинская статистика. / А.Н. Герасимов. – М.: МИА. – 2007. – 488 с. 34. Глушков, С. И. Нарушения системы глутатиона и их роль в патогенезе острых интоксикаций ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия: дис. ... д-ра мед. наук: 14.00.20, 03.00.04 / С.И.Глушков. - СПб. - 2006. 451с. 35. Гоненко, В.А. Исследование гликозидов женьшеня на эритроцитарной радиомиметической модели. / В.А. Гоненко, И.И. Брехман, И.В. Дардымов // Материалы итоговой научной сессии ВНИИКФ за 1967г. – М. – 1969. – С. 367. 36. Дардымов, И.В. Женьшень, элеутерококк (К механизму биологиче- ского действия). / И.В. Дардымов; Отв. ред. И.И. Брехман. – М.: Наука. – 1976. – 181 с. 37. Дардымов, И.В. К механизму действия гликозидов элеутерококка / И.В. Дардымов, Г.Н. Бездетко, В.М. Воропаев, И.И. Брехман, С.Е. Ли // Биохимические исследования на Советском Дальнем Востоке. – Владивосток. – 1973. – С. 141-145. 38. Дардымов, И.В. Механизмы действия препаратов женьшеня и элеуте- рококка: дис. … д-ра мед. наук: 14.00.25. / И.В. Дардымов. – Владивосток. – 1986. – 324 с. 39. Додонов, Н.С. Влияние флавоноидов на перекисное окисление липи- дов и активность антиоксидантных систем при токсическом поражении печени: автореф. дис. … канд. фарм. наук: 15.00.02. / Н.С. Додонов. – Самара, 2007. – 23 с. 40. Дубовик, Б.В. Ингибирующий эффект адаптогенов на индуцируемое эндотоксином освобождение фактора некроза опухолей. / Б.В. Дубовик, И.Е. Ефремова, М.К. Кевра и др.// Материалы 5 Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». – Москва. – 1998. – С. 364. 110 41. Дыгай, А.М. Способ терапии экспериментального хронического токсиче- ского гепатита: пат. 2392000 Рос. Федерация: МПК А61К38/47 А61Р1/16 / А.М. Дыгай, Г.Н. Зюзьков, В.В. Жданов; заявитель и патентообладатель ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. - № 2295971; заявл. 04.02.09; опубл. 20.06.10, Бюл. № 17. 42. Дынжинова, Е.А. Фармакологическая активность и фармакотерапев- тическая эффективность гепатопротекторного растительного средства при остром токсическом гепатите: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.25. / Е.А. Дынжинова. – Улан-Удэ, 2007. – 21 с. 43. Елисеев, В. Г. Основы гистологии и гистологической техники. / В.Г. Елисеев // Под ред. Субботина М.Я., Афанасьева Ю.И., Котовского Е.Ф. - М.: Медицина, -1967. - 268 с. 44. Елькин А.И. Сравнительное изучение некоторых фармакологических и антитоксических свойств препаратов, полученных из родиолы розовой, элеутерококка, женьшеня и аралии маньчжурской: автореф. дисс. … канд. мед. наук: 14.00.25. / А.И. Елькин. – Л., 1981. - 22 с. 45. Ильченко, Л.Ю. Поражения печени у токсикоманов. / Л.Ю. Ильченко и др. // Гепатология — 2003. - № 2. - С. 22 - 26. 46. Искусных, И.Ю. Экспрессия глутатионпероксидазы и глутатионре- дуктазы при оксидативном стрессе различной этиологии: автореф. дисс. … канд. биол. наук: 03.01.04. / И.Ю. Искусных. – Воронеж, 2012. – 22 с. 47. Каплан, Е.Я. Оптимизация адаптивных процессов организма. / Е.Я. Каплан, О.Д. Цыренжапова, Л.Н. Шантанова. – М.: Наука. – 1990. – 94 с. 48. Каркищенко, В.Н. Разработка методики оценки физической выносли- вости мелких лабораторных животных для изучения адаптогенной активности некоторых лекарственных препаратов. / В.Н. Каркищенко, Г.Д. Капанадзе, С.Е. Деньгина и др. // Биомедицина. – 2011. - № 1. – С. 72-74. 49. Каркищенко, Н.Н. Очерки спортивной фармакологии. Том 1. Векторы экстраполяции. / Под редакцией Н.Н. Каркищенко и В.В. Уйба. М., СПб.: Айсинг, - 2013. - 288с. 111 50. Козин, С.В. Гепатопротекторный компонент в защитном действии препаратов родиолы розовой при хронической интоксикации ФОС. / С.В. Козин, Ф.П. Крендаль, С.В. Грецкий, Л.В. Левина // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». – 2014. - № 2. – С. 12-18. 51. Козин, С.В. Изучение эффективности препаратов родиолы розовой при хронических интоксикациях фосфорорганическими инсектицидами: дисс. … канд. биол. наук: 14.00.25 / С. В. Козин. – М. – 1998. – 175 с. 52. Корсун, В.Ф. Лекарственные растения в гепатологии. / В.Ф. Корсун, С.М. Николаев, Т.Д. Даргаева и др. / Под ред. В.Ф. Корсуна. – М.: Русский врач, 2005. – 274с. 53. Крендаль, Ф.П. Сравнительная характеристика препаратов из группы фитоадаптогенов – женьшеня, элеутерококка и родиолы розовой. / Ф.П. Крендаль, С.В. Козин, Л.В. Левина / Под ред. С.В. Грачева. - М.: ПРОФИЛЬ. - 2007. – 392 с. 54. Крюковская Е.В. Исследование фармакологической активности ара- лии маньчжурской и оценка биологической активности ее препаратов: дисс. … канд. биол. наук: 14.00.25. / Е.В. Крюковская.– М. – 1990. – 215 с. 55. Кулагин, О.Н. Гепатопротекторная активность некоторых фитопре- паратов, содержащих фенилпропаноиды. / О.Н. Кулагин, В.А. Куркин, А.А. Царева, Н.А. Додонова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – 2009. – Т. 11, № 1 (6). – С. 1297-1299. 56. Лазарев, Н.В. Состояние неспецифически повышенной сопротивляе- мости. / Н.В. Лазарев, Е.И. Люблина, М.А. Розин // Патол. физиол. экспер. терапия. – 1959. – Т.3. - №4. – С. 16-21. 57. Лебедев, В.А. Центральные эффекты полипренолсодержащих препа- ратов: дисс. … канд. биол. наук: 14.03.06. / В.А. Лебедев. – СПб. – 2014. – 142 с. 58. Левина, Л.В. Фармакологическое исследование препарата из биомас- сы культура ткани родиолы розовой: дис. … канд. биол. наук: 14.00.25. / Л.В. Левина. – М. – 1991. – 192 с. 112 59. Лупандин, А.В. Применение адаптогенов в спортивной практике / А.В. Лупандин // Современные проблемы медицины: Материалы XXIV Всесоюзного конгресса по спортивной медицине. – М. – 1990. – С. 56-61. 60. Марина, Т.Ф. Фармакология золотого корня. / Т.Ф. Марина, Т.П. Прищеп // Изв. СО АН СССР. Сер. Биол. – мед. наук. – 1964. - №4. – Вып.1. – С.49-55. 61. Минаева, Л.В. Экспериментальная оценка роли изменений системы глутатиона в реализации побочных цитотоксических эффектов повторного введения циклофосфана: дис. … канд. мед. наук: 14.00.20, 03.00.04 / Л.В. Минаева. – СПб. – 2007. – 178 с. 62. Михайлов, С.С. Спортивная биохимия: Учебник для вузов и колле- джей физической культуры. / С.С. Михайлов. – 2-е изд., доп. – М.: Советский спорт, 2004. – 220 с. 63. Молоковский, Д.С. О некоторых механизмах повышения резистент- ности организма при применении препаратов женьшеня и других фитоадаптогенов: дис. … канд. биол. наук: 14.00.25. / Д.С. Молоковский. – Л. – 1990. – 192 с. 64. Молоковский, Д.С. Патогенетические основы применения адаптоген- ных фитопрепаратов и их биологическая активность при различных патологических состояниях: автореф. дис. … д-ра мед. наук: 14.00.16., 14.00.25. / Д.С. Молоковский. – СПб., 2004. – 36 с. 65. Нарциссов, Я.Р. Современные представления о биологической роли оксида азота. / Я.Р. Нарциссов, И.П. Серая // Успехи современной биологии. – 2002. - № 3. – С. 249-257. 66. Николаев С.М. Экспериментальная фармакотерапия фитопрепаратами повреждений органов гепатобилиарной системы: дисс. …докт. мед. наук: 14.00.25. / С.М. Николаев. – Улан-Удэ. – 1988. – 251 с. 67. Петунова, А.Н. Адаптогенные свойства и механизм действия расти- тельного средства Пентафитон: авторе. дис. … канд. мед. наук: 14.00.25. / А. Н. Петунова. – Улан-Удэ, 2004. – 28 с. 113 68. Печенкина, И.Г. Гистоморфологическая оценка гепатопротекторного действия фитоадаптогенов при токсическом поражении печени мышей четыреххлористым углеродом на фоне интенсивной физической нагрузки / И.Г. Печенкина, С.В. Козин, Д.В. Буланов // Вестник ВолгГМУ. – 2014. – Вып. 2 (50). – С. 7881. 69. Пивоварова, А.С. Исследование взаимодействия комбинаций препа- ратов лекарственных растений тонизирующего действия. / А.С. Пивоварова, Е.Е. Лесновская // Растительные ресурсы. – 2003. – Т. 39. - № 1. – С.94-101. 70. Раднаева, Д.Б. Адаптогенные свойства и механизм действия расти- тельного средства «сок каллизии душистой»: автореф. дис…. канд. мед. наук: 14.00.25. / Д.Б. Раднаева. - Улан-Удэ, 2009. – 21 с. 71. Резенькова, О.В. Изучение влияния экстракта солодки голой на про- цессы адаптации организма: дис. … канд. биол. наук: 03.00.13. / О.В. Резенькова. – Ставрополь, 2003. – 175 с. 72. Рябков, А.Н. Сравнительная экспериментальная оценка актопротек- торного эффекта препаратов из биомасс клеточных культур полисциаса папоротниколистного и женьшеня в условиях плавательного теста. / А.Н. Рябков // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. – 2008. - №2. - С. 108-114. 73. Салей, А.П. Роль оксида азота в регуляции гемодинамических показа- телей и метаболических функций печени. / А.П. Салей, Г.А. Вашанов, М.Ю. Мещерякова // Вестник ВГУ, серия: химия, биология, фармация. – 2009. - №2. – С. 129-135. 74. Саратиков, А.С. Золотой корень (Родиола розовая). Изд. 2-е, перераб. и доп. – Томск. – 1974. – 158 с. 75. Саратиков, А.С. Методические указания по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ. /А.С. Саратиков, И.В. Маркова, А.И. Венгеровский // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. 2-е изд., перераб. и доп. / Под общ. ред. член.- 114 корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева. М.: ОАО «Изд. «Медицина», - 2005. – 832 с. (683-691стр) 76. Свиридов, М.М. Каталитические свойства 6- фосфоглюконатдегидрогеназы из печени крысы в норме и при токсическом гепатите. / М.М. Свиридов, А.В. Семенихина, Т.Н. Попова // Биомедицинская химия. – 2006. – Т. 52, вып. 5. – С. 479-488. 77. Сейфулла, Р.Д. Биологически активные вещества и индивидуальная чувствительность к ним спортсменов. / Р. Д. Сейфулла, Е. А. Рожкова, Г. З. Орджоникидзе // Вестн. спорт. науки : науч.-информ. изд. - 2009. - № 5. - С. 32-35. 78. Симонова, Н.В. Эффективность элеутерококка на фоне ультрафиоле- тового облучения при адаптации к холоду: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.25. / Н.В. Симонова. – Владивосток, 2004. – 24 с. 79. Синяков, А.Ф. Стимуляторы жизни / А.Ф. Синяков. – М.: Молодая гвардия. – 1990. – 190 с. 80. Смагулова, Т.Б. Адаптогенное действие растительного средства «Фи- тотон»: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.03.06. / Т.Б. Смагулова. – Улан-Удэ, 2013. – 22 с. 81. Стальная, И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасы- щенных высших жирных кислот. / И.Д.Стальная // Современные методы в биохимии. М.: Медицина, - 1977. - С.63-64. 82. Степанова, Н.А. Роль монооксида азота в регуляции детоксикацион- ной функции печени и температуры тела при эндотоксиновой лихорадке: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.16. / Н.А. Степанова. – Минск, 2003. – 23 с. 83. Тейлор, Б.С. Индуцибельная синтаза оксида азота в печени: регуляция и функции. / Б.С. Тейлор, Л.Х. Аларсон, Т.Р. Биллиар // Биохимия. – 1998. – Т. 63, вып. 7. – С. 905-923. 84. Терехов, А.Ю. Изучение защитного действия биологически актив- ных веществ из цветков бархатцев распростертых при экспериментальных токсических поражениях печени: дисс. … канд. фарм. наук: 14.00.25. / А.Ю. Терехов. – Пятигорск. – 2006. – 191 с. 115 85. Тулесонова, А. С. Адаптогенное действие растительного средства «Адаптон-6»: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.03.06. / А. С. Тулесонова. Улан-Удэ, 2011. – 17 с. 86. Тюренков, И.Н. Влияние мексидола и сулодексида на уровень специ- фических маркеров развития эндотелиальной дисфункции у животных с экспериментальным сахарным диабетом. / И.Н. Тюренков, А.В. Воронков, А.А. Слиецанс, Г.Л. Снигур // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2012. – Т. 75, № 5. – С. 14-16. 87. Фруентов, Н.К. Понижение чувствительности организма к болезне- творному раздражению под влиянием женьшеня. / Н.К. Фруентов. - Л., 1956. - 96 с. 88. Чехани, Н.Р. Влияние природных полифенольных соединений на фи- зическую выносливость и процессы восстановления у мышей. / Н.Р. Чехани, Л.А. Павлова, С.В. Козин, Ю.О. Теселкин // Вестник РГМУ. – 2014. - №1. – С. 61-64. 89. Чубарев, В.Н. Изучение фармакологических свойств препарата из биомассы культуры ткани женьшеня: автореф. дис. … канд. биол. наук: 14.00.25 / В.Н. Чубарев. - Купавна, 1987. - 22 с. 90. Шульпекова, Ю.О. Лекарственные поражения печени. / Ю.О. Шуль- пекова // Врач. – 2010. - № 7. – С. 10-13. 91. Шупик, М.А. Взаимодействие сигнальной системы оксида азота со сфингомиелиновым циклом и пероксидным окислением при проведении токсического сигнала фактора некроза опухоли альфа в условиях ишемии-реперфузии печени: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.01.02. / М.А. Шупик. – М., 2012. – 24 с. 92. Abraham, P. Alcoholic hepatitis. / P. Abraham, S.K. Acharya, D. Ama- rapurkar et al. – Elsevier, India, - 2009. – 106 p. 93. Ahn, J.Y. The immunomodulator ginsan induces resistance to experimental sepsis by inhibiting Toll-like receptor-mediated inflammatory signals. / J.Y. Ahn, I.S. Choi, J.Y. Shim, E.K. Yun et al. // Eur. J. Immunol. – 2006. – Vol. 36, - P. 37-45. 94. Ai, G. Hepatoprotective evaluation of the total flavonoids extracted from flowers of Abelmoschus manihot (L.) Medic: in vitro and in vivo studies. / G. Ai, Q. 116 Liu, W. Hua, Z. Huang, D. Wang // J. Ethnopharmacol. – 2013. – Vol. 146. № 3, - P. 794-802. 95. Al-Harbi, N.O. Carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in rat is re- versed by treatment with riboflavin. / N.O. Al-Harbi, F. Imam, A. Nadeem et. al. // Int. Immunopharmacol. – 2014. – Vol. 21. № 2. – P. 383-388. 96. Alhassan, A.J. Ideal hepatotoxicity model in rats using carbon tetrachloride (CCL4). / A.J. Alhassan, M.S. Sule, S.A. Aliyu, M.D. Aliyu // Bayero Journal of Pure and Applied Sciences. – 2009. – Vol. 2. № 2. – P. 185-187. 97. Allred, D.C. Problems and solutions in the evaluation of hormone receptors in breast cancer. / D.C. Allred // J. Clin. Oncol. – 2008. – Vol. 26. № 15. – P. 24332435. 98. Al-Shabanah, O. A. Protective effect of aminoguanidine, a nitric oxide synthase inhibitor, against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice. / O.A. Al-Shabanah, K. Alam, M.N. Nagi et al. // Life Sci. – 2000. – Vol. 66, - P. 265–270. 99. Bak, M.J. Antioxidant and hepatoprotective effects of the red ginseng es- sential oil in H2O2 – treated HepG2 cells and CCL4- treated mice. / M.J. Bak, M. Jun, W.-S. Jeong // Int. J.Mol. Sci. – 2012. – Vol. 13, - P. 2314-2330. 100. Baranova, V.S. The antiradical activity of plant extracts and healthful preventive combinations of these extracts with the phospholipid complex. / V.S. Baranova, I.F. Rusina, D.A. Guseva et al. // Biomed. Khim. – 2012. – Vol. 58. № 6. – P. 712-726. 101. Bautista, A.P. (1991). Tumor necrosis factor-α stimulated superoxide anion generation by perfused rat liver and Kupffer cells. / A.P. Bautista, A. Schuler, Z. Spolarics, J.J. Spitzer // Am. J. Physiol. – 1990. – Vol. 261, - P. 891–895. 102. Bhatt, K.H. Role of mitogen-activated protein kinases in peptidoglycaninduced expression of inducible nitric oxide synthase and nitric oxide in mouse peritoneal macrophages: extracellular signal-related kinase, a negative factor. / K.H. Bhatt, A. Sodhi, R. Chakraborty // Clin. Vaccine Immunol. – 2011. – Vol. 18, - P. 994-1001. 103. Bohlinger, I. Interleukin-1 and nitric oxide protect against tumor necrosis factor-a-in- duced liver injury through distinct pathways. / I. Bohlinger, M. Leist, J. Barsig, S. Uhlig et al. // Hepatology. – 1995. – Vol. 22, - P. 1829-1837. 117 104. Chen, T.S. Antioxidant evaluation of three adaptogen extracts. / T.S. Chen, S.Y. Liou, Y.L. Chang // Am J Chin Med. - 2008. – Vol.36. № 6. - Р. 1209-17. 105. Cho, Y.K. Deleterious effects of silymarin on the expression of genes controlling endothelial nitric oxide synthase activity in carbon tetrachloride-treated rat livers. / Y.K. Cho, J.W. Yun, J.H. Park, H.J. Kim et al. // Life Sciences. – 2009. – Vol. 85, - P. 281-290. 106. Chow, J.H. The encyclopedia of hepatitis and other liver disesases. / J.H. Chow, C. Chow. – Facts On File, Inc., N.-York, U.S.A., - 2006. – 372 p. 107. Cooksey, C. Fuchsine or magenta: the second most famous aniline dye. A short memoir on the 150th anniversary of the first commercial production of this well known dye. / C. Cooksey, A. Dronsfield // Biotech Histochem. - 2009 – Vol. 84. №4. P. 179-83. 108. Davies, K.J. Free radicals and tissue damage produced by exercise. / K.J. Davies, A.T. Quintanilha, G.A. Brooks, L. Parcker // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1982. – Vol. 107, - P. 1198-1205. 109. De Sanctis, R. In vitro protective effect of Rhodiola rosea extract against hypochlorous acid-induced oxidative damage in human erythrocytes. / R. De Sanctis, R. De Bellis, C.Scesa et al. // Biofactors. - 2004. – Vol.20. №3. - Р. 147-59. 110. Edakkadath, R.S. Carotenoid lutein protects from paracetamol -, carbon tetrachloride - and ethanol-induced hepatic damage. / R.S. Edakkadath, P.F. Alikkunihi, C.P. Korengath, K. Ramadassan // Journal of Pharmacy and Pharmacology. – 2010. – Vol. 62, Iss. 8. – P. 1054-1060. 111. Ellman, G.L. Tissue sulfliydryl groups. / G.L.Ellman // Arch. Biochem. Bio- phys. - 1959. - Vol.82. № l. - P.70-77. 112. Feder, L. S. Regulation of hepatic endothelial cell and macrophage proliferation and nitric oxide production by GM-CSF, M-CSF, and IL-1β following acute endotoxemia. / L.S. Feder, D.L. Laskin // J. Leukocyte Biol. – 1994. – Vol. 55, - P. 507– 513. 118 113. Florquin, S. The protective role of endogenously synthesized nitric oxide in staphylo- coccus enterotoxin-B induced shock in mice. / S. Florquin, Z. Arnraoui, C. Dubois et al. // J. Exp. Med. – 1994. – Vol. 180, - P. 1153–1158. 114. Glenn, C. Letter: Tetracycline-induced hepatotoxicity. / C. Glenn, S.R. Feldman // J. Dematol. online. – 2011. – Vol. 17. №12. – P. 14-20. 115. Gong, X. Hepatoprotective effects of syringing on fulminant hepatic failure induced by D-galactosamine and lipopolysaccharide in mice. / X. Gong, L. Zhang, R. Jiang et al. // J. of Applied Toxicology. – 2013. – Vol. 112, - P. 34-41. 116. Gum, S.I. The potent protective effect of wild ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) against benzo[alpha]pyrene-induced toxicity through metabolic regulation of CYP1A1 and GSTs . / S.I. Gum, S.J. Jo, S.H. Ahn et al. // J Ethnopharmacol. - 2007. – Vol.112. № 3. - Р. 568-76. 117. Guo, J.Y. Ischemic postconditioning attenuates liver warm ischemia- reperfusion injury through Akt-eNos-NO-HIF pathway. / J.Y. Guo, T. Yang, X.G. Sun et al. // J. of Biomedical Science. – 2011. – Vol. 18, - P. 79-91. 118. Hong, J. In vitro antioxidant and antimicrobial activities of flavonoids from Panax notoginseng flowers. / J.Hong, J.Y.Hu, J.H. Liu et al. // Nat. Prod. Res. – 2014. – Vol. 28. № 16. – P. 1260-1266. 119. Hornatowska, J. Visualisation of pectins and proteins by microscopy. / J. Hornatowska – STFI-Packforsk report. № 87. – 2005. – 21 p. 120. Hu, D. Deoyschizandrin isolated from the fruits of Schisandra chinensis ameliorates Aβ1-42 – induced memory impairment in mice. / D. Hu, C. Li, N. Han et al. // Planta Med. – 2012. – Vol. 78. № 12. – P. 1332-1336. 121. Huang, C.C. Ganoderma tsugae hepatoprotection against exhaustive exercise –induced liver injury in rats. / C.C.Huang, W.C. Huang, S.C. Yang, C.C. Chan, W.T. Lin // Molecules. – 2013. – Vol. 18, - P. 1741-1754. 122. Huang, K.C. Effects of Freshwater Clam Extract Supplementation on time to exhaustion, muscle damage, pro/anti-inflammatory cytokines and liver injury in rats after exhaustive exercise. / K.C. Huang, W.T. Wu, F.L. Yang, Y.H. Chiu et al. // Molecules. – 2013. – Vol. 18, - P. 3825-3838. 119 123. Huang, L.Z. Antifatigue activity of the liposoluble fraction from Acantopanax senticosus. / LZ Huang, BK Huang, О Liang et al. // Phytother. Res. – 2011. – Vol. 25. № 6. – P. 940-943. 124. Huang, S.-С. Attenuation of Long-Term Rhodiola rosea supplementation on exhaustive swimming-evoked oxidative stress in the rat. / S.-С. Huang, F.-T. Lee, T.-Y. Kuo et al. // Chinese Journal of Physiology. – 2009. – Vol. 52. № 5. - P. 316-324. 125. Hwang, J. Dietary saturated and monounsaturated fats protect against acute acetaminophen hepatotoxicity by altering fatty acid composition of liver microsomal membrane in rats. / J. Hwang, Y.-H. Chang, J.-H. Park et al. // Lipids Health Dis. – 2011. – Vol. 10, - P. 184-197. 126. Iskusnykh, I.Y. Expression of glutathione peroxidase and glutathione reductase and level of free radical processes under toxic hepatitis in rats. / I.Y. Iskusnykh, T.N. Popova, A.A. Agarkov et al. // Journal of Toxicology. – 2013. – Vol. 1, - P. 1-9. 127. James, L.P. Acetaminophen-induced hepatotoxicity. / L.P. James, P.R. Mayeux, J.A. Hinson // Drug metabolism and disposition. – 2003. – Vol. 32. №12. – P. 1499-1506. 128. Jiang, R. Chemical composition and cytotoxic, antioxidant and antibacterial activities of the essential oil from ginseng leaves. / R. Jiang, L. Sun, Y.Wanfg et al. // Nat. Prod. Commun. – 2014. – Vol. 9. № 6. – P. 865-868. 129. Jiao, L. Antioxidant activities of the oligosaccharides from the roots, flowers, leaves of Panax ginseng. / L. Jiao, B. Li, M. Wang et al. // Carbohydr. Polym. – 2014. – Vol. 106, - P. 293-298. 130. Kan, N.-W. Hepatoprotective effects of Ixora parviflora extract against exhaustive exercise-induced oxidative stress in mice. / N.-W. Kan, W.-C. Huang, W.-T. Lin, C.-Y. Huang et al. // Molecules. – 2013. – Vol. 18, - P. 10721-10732. 131. Kang, J.W. Protective effects of HV-P411 complex against Dgalactosamine-induced hepatotoxicity in rats. / J.W. Kang, S.J.Kim, H.Y.Kim et al. // Am. J. Chin. Med. – 2012. – Vol. 40. № 3. – P. 467-480. 120 132. Karakus, E. Protective effect of Panax ginseng against serum biochemical changes and apoptosis in liver of rats treated with carbon tetrachloride. / E. Karakus, A. Karadeniz, N. Simsek et al. // J. Hazard Mater. – 2011. – Vol. 195, - P. 208-213. 133. Karakus, E. Protective effect of Panax ginseng against serum biochemical changes and apoptosis in liver of rats treated with carbon tetrachloride. / E. Karakus, A. Karadeniz, N. Simsek et al. // J. Hazard Mater. – 2011. – Vol. 195, - P. 208-13. 134. Karsan, H.A. Management of alcoholic hepatitis: Current concepts. / H.A. Karsan, S. Parekh // J. Hepatol. – 2012. – Vol. 4. № 12. – P. 335-341. 135. Khan, R.A. CCL4 – induced hepatotoxicity: protective effect of rutin on p53, CYP2E1 and the antioxidative status in rat. / R.A. Khan, M.R. Khan, S. Sahreen // BMC Complementary and Alternative Medicine. – 2012. – Vol. 12, - P. 178- 190. 136. Kiernan, J.A. Histological and histochemical Methods: theory and practice. 4th ed. / J.A. Kiernan. - Bloxham, UK: scion, - 2008. - P. 293-296. 137. Kim, D.H. Ginsenoside Rd inhibits the expressions of iNOS and COX-2 by suppressing NF-κB in LPS-stimulated RAW264.7 cells and mouse liver. / D.H. Kim, J.H. Chung, J.S. Yoon et al. // J. Ginseng Res. – 2013. – Vol.37 (1). – P. 54-63. 138. Kitts, D.D. Efficacy and safety of ginseng. / D.D. Kitts, C. Hu // Public Health Nutrition. – Vol. 3. № 4A. – P. 473-485. 139. Kondo, K. Enhancement of APAP-induced chronic hepatotoxicity in restricted fed rats: nonclinical approach to APAP-induced chronic hepatotoxicity in susceptible patients. / K.Kondo, N. Yamada,Y. Suzuki et al. // J. of Toxicological Sciences. – 2012. - Vol.37. №5. – P.911-929. 140. Kono, H. NADPH oxidase-derived free radicals are key oxidants in alcohol-induced liver disease. / H. Kono, I. Rusin, M. Yin, E. Gabele et al. // J. Clin. Invest. – 2000. – Vol. 106, - P. 867-872. 141. Kono, H. NADPH oxidase–derived free radicals are key oxidants in alcohol-induced liver disease. / H. Kono, I. Rusin, M. Yin, E. Gabele et al. // The Journal of Clinical investigation. – 2000. – Vol. 7, - P. 867-872. 121 142. Laskin, J.D. Prooxidant and antioxidant functions of Nitric Oxide in liver toxicity. / J.D. Laskin, D.E. Heck, C.R. Gardner, D.L. Laskin // Antioxidants & Redox signaling. – 2001. – Vol. 3. № 2, - P. 261-271. 143. Lebensztein, D.M. Hepatotoxicity caused by montelukast in a paediatric patient. / D.M. Lebensztein, M. Klusek, M. Uscinowicz et al. // Prz. Gastroenterol. – 2014. – Vol. 9. № 2. – P. 121-123. 144. Lee, D. Effects of Panax giseng on Tumor Necrosis Factor-α-Mediated inflammation: mini-review. / D. Lee, A. Lau // Molecules. – 2011. – Vol. 16, - P. 28022816. 145. Lee, F.T. Chronic Rhodiola rosea extract supplementation enforces exhaustive swimming tolerance / FT Lee, TY Kuo, SY Liou, CT Chien // Am J Chin Med. 2009. - Vol. 37. №3. - Р. 557-72. 146. Lee, S.M. Anti-inflammatory effects of ginsenosides Rg5, Rz1, Rk1: inhibition of TNF-α-induced NF-κB, COX-2 and iNOS transcriptional expression. / S.M. Lee // Phytotherapy Research. – 2014. – Vol. 12, - P. 21-26. 147. Liu, W.H. Suppression of Akt/Foxp3-mediated miR-183 expression blocks Sp1-mediated ADAM17 expression and TNF- α-mediated NFκB activation in piceatannol-treated human leukemia U937 cells. / W.H. Liu, L.S. Chang // Biochem. Pharmacol. – 2012. – Vol.84, - P.670-680. 148. Liu, Y. Animal models of chronic liver diseases. / Y. Liu, C. Meyer, C.Xu, H. Weng et al. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2012. – Vol. 304, - P. 449-468. 149. MacMicking, J. D. Identification of nitric oxide synthase as a protective locus against tuberculosis. / J.D. MacMicking, R.J. North, R. LaCourse et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1997. – Vol. 94, - P. 5243–5248. 150. Martinez, B. The physiological effects of aralia, panax, eleutherococcus on exercised rats. / B. Martinez, E.J. Staba // Japan. J. Pharmacol. – 1984. – Vol. 35, - P. 79-85. 151. Matei, V. Three-day tetrahydrobiopterin therapy increases in vivo hepatic NOS activity and reduces portal pressure in CCL4 cirrhotic rats. / V. Matei, A. Rodri- 122 guez, R. Deulofeu, H. Garcia-Caldero et al. // J. of Hepatology. – 2008. – Vol. 49, - P. 192-197. 152. Maynard, R. Histological Techniques. An Introductions for Beginners in Toxicology. / R. Maynard, N. Downes, B. Finney – Royal Society of Chemistry Books, 2014. – 200 p. 153. McCuskey, R.S. Comprehensive Toxocology. Introduction to the liver and its response to toxicants. 2nd ed. / R.S. McCuskey, I.G. Sipes. – Elsevier Ltd. UK. – 2010. – P. 4343-4473. 154. Mikami, T. Endurance exercise training inhibits activity of plasma GOT and liver caspase-3 of rats exposed to stress by induction of heat shock protein 70. / T. Mikami, S. Sumida, Y. Ishibashi, S. Ohta // J. Appl. Physiol. – 2004. – Vol. 96, - P. 1776-1781. 155. Minin, E.A. L-arginine-NO-cGMP signaling following acute liver injury in the rat. / E.A. Minin, I.B. Buchwalow, M. Wellner et al. // Experimental and Toxicologic pathology. – 2006. – Vol. 57, - P. 161-171. 156. Moravcova, A. Antioxidative effect of epigallocatechin gallate against Вgalactosamin-induced injury in primary culture of rat hepatocytes. / A. Moravcova, Z. Cervinkova, O. Kucera et al. // Acta Medica. – 2014. – Vol. 57. № 1. – P. 3-8. 157. Morio, L.A. Distinct roles of TNF-α and NO in acute liver injury induced by carbon tetrachloride in mice. / L.A. Morio, H. Chiu, K.A. Sprowles, P. Zhou et al. // Toxicology and Applied Pharmacology. – 2001. – Vol. 172, - P. 44-51. 158. Murthy, H.N. Hepatoprotective activity of ginsenosides from Panax ginseng adventitious roots against carbon tetrachloride treated hepatic injury in rats. / H.N. Murthy, V.S. Dandin, K.Y. Paek // J. of Ethnopharmacology . – 2014. – Vol. 159, - P. 442-446. 159. Nakamura, S. Bioactive constituents from Chinese natural medicines. / S. Nakamura, X. Li, H. Matsuda, K. Ninomiya et al. // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). – 2007. – Vol. 55. № 10. – P. 1505-1511. 123 160. Nan, J.X. Protective effect of Rhodiola sachalinensis extract on carbon tetrachloride-induced liver injury in rats. / J.X. Nan, Y.Z. Jiang, E.J. Park et al. // J. of Ethnopharmacology. – 2003. – Vol. 84, - P. 143-148. 161. Omar, M.E. Effect of pentoxifylline on hepatic injury caused in the rat by administration of carbon tetrachloride or acetaminophen. / M.E. Omar, Abdel Salam, Ayman R. Baiuomy et al. // Pharmacological Reports. – 2005. – Vol. 57, - P. 596-603. 162. Özben, T. Free radicals, oxidative stress and antioxidants: pathological and physiological significance. / T. Özben. // Series A: Life Sciences. Vol. 296. – Plenum Press, N.-York. – 1998. – P. 65-68. 163. Pannossian, A.G. 18 years with Phytomedicine. / A.G. Panossian // Phytomedicine. – 2014. – Vol. 21. № 6. – P. 781-782. 164. Pannossian, A.G. Adaptogens in mental and behavioral disorders. / A.G. Panossian // Psyhiatr. Clin. North. Am. – 2013. – Vol. 36. № 1. – P. 49-64. 165. Park, E.J. Water-soluble polysaccharide from Eleutherococcus senticosus stems attenuates fulminant hepatic failure induced by D-galactosamine and LPS in mice. / E.J. Park, J.-X. Nan, Y.Z. Zhao et al. // Basic& Clinical Pharmacology& Toxicology.- 2004. – Vol.94, - P. 298-304. 166. Park, E.J. Water-Soluble Polysaccharide from Eleutherococcus senticosus stems attenuates fulminant hepatic failure induced by d-galactosamine and lipopolysaccharide in mice. E.J. Park, J.X. Nan, Y.Z. Zhao et al. \\ Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. - 2004. – Vol. 94, - Р. 298–304. 167. Pettersson, J. Muscular exercise can cause highly pathological liver function tests in healthy men. / J. Pettersson, U. Hindorf, P. Persson, T. Bengtsson et al. // British J. of Clinical Pharmacology. – 2007. – Vol. 65. № 2. – P. 253-259. 168. Pomari, E. Effect of plant extracts on H2 O2-induced inflammatory gene expression in macrophages. / E. Pomari, B. Stefanon, M. Colitti // J. of Inflammatory Research. – 2014. – Vol. 7, - P. 103-112. 169. Ponmari, G. NF-κB activation and proinflammatory cytokines mediated protective effect of Indigofera caerulea Roxb. on CCL4 induced liver damage in rats. / G. Ponmari, A. Annamali et al.// Int.Immunopharmacology. – 2014. – Vol.25, - P. 1-9. 124 170. Praphatsorn, P. Effects of intense exercise on biochemical and histological changes in rat liver and pancreas. / P. Praphatsorn, D. Thong-Ngam et al. // Asian Biomedicine. – 2010. – Vol. 4, №4. – P. 619-625. 171. Qi, B. Anti-fatigue effacts of proteins solated from panax quinquefolium. / B. Qi, L. Liu, H. Zhang et al. // J. Ethnopharmacol. – 2014. – Vol. 153. № 2. – P. 430434. 172. Radad, K Use of ginseng in medicine with emphasis on neurodegenerative disorders. / K. Radad, G. Gille, L. Liu, W.D. Rausch // J. Pharmacol. Sci. – 2006. – Vol. 100, - P. 175-186. 173. Rafikul, I. Antioxidant and hepatoprotective activity of an ethanol extract of Syzygium jambos (L.) leaves. / I. Rafikul, P. Shahnaj, I. Ekramul // Drug Discoveries & Therapeutics. – 2012. – Vol. 6. №4. – P. 205-211. 174. Rezende, T.P. Protective effects of Baccharis dracunculifolia leaves extract against carbon tetrachloride- and acetaminophen-induced hepatotoxicity in experimental animals. / T.P. Rezende, B.J. Aarestrup et al. // Molecules. – 2014. – Vol. 19. № 7. – P. 9257-72. 175. Sarkar, C. Evaluation of hepatoprotective activity of vasicinone in mice. / C. Sarkar, S. Bose, S. Banerjee // Indian J. Exp. Biol. – 2014. – Vol. 52. №7. – P. 705711. 176. Senft, A.P. Determining glutathione and glutathione disulfide using the fluorescence probe o-phthalaldehyde. / A.P. Senft, T.P. Dalton, H.G. Shertzer // Analytical Biochemistry. – 2000. – Vol. 280, - P. 80-86. 177. Shao, J.-T. Anti-fatigue effect of Gracilaria eucheumoides in mice. / J.-T. Shao, M.-Y. Wang, L.-B. Zheng // Experimental and therapeutic medicine. – 2013. – Vol. 6, - P. 1512-1516. 178. Sharma, S.K. Hepatoprotective activity of Vitis vinifera root extract against carbon tetrachloride-induced liver damage in rats. / S.K. Sharma, N. Vasudeva, S. Vasudeva // Acta Poloniae Pharmaceutica – Drug Research. – 2012. – Vol. 69. № 5. – P. 933-937. 125 179. Shen, C. Gel entrapment culture of rat hepatocytes for investigation of tetracycline-induced toxicity. / C. Shen, Q. Meng, E.Schmelzer, A. Bader // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 2009. – Vol. 218. № 2. – P. 178-87. 180. Shim, J.-Y. Protective action of the immunomodulator ginsan against carbon tetrachloride-induced liver injury via control of oxidative stress and the inflammatory response. / J.-Y. Shim, M.H. Kim, H.-D. Kim et al. // Toxicology and Applied Pharmacology. – 2010. – Vol. 242, - P. 318-325. 181. Sixun, G. Effects of eleutheroside B and eleutheroside E on activity of cytochrome P450 in rat liver microsomes. / G. Sixun, Y. Liu, Z. Lin, S. Tai et al. // BMC Complementary and Alternative Medicine. – 2014. – Vol. 14. № 1. – P. 1-7. 182. Stephens, C. Mechanisms of drug-induced liver injury. / C. Stephens, R.J. Andrade, M.I. Lucena // Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. – 2014. – Vol. 14. № 4. – P. 286-92. 183. Tanaka, N. Nitric oxide increases hepatic arterial blood flow in rats with carbon tetra-chloride-induced acute hepatic injury. / N. Tanaka, K. Tanaka, Y. Nagashima et al. // Gastroenterology. – 1999. – Vol. 117, - P. 173–180. 184. Tang, W. The anti-fatigue effect of 20(R)-ginsenoside Rg3 in mice by intranasally administration. / W. Tang, Y. Zhang et al. // Biological & Pharmaceutical Bulletin. – 2008. – Vol. 31, - P. 2024–2027. 185. Teare, J.P. Automated spectrophotometric method for determining oxidized and reduced glutathione in liver. / J.P. Teare, N.A. Punchard, J.J. Powell et al. // Clin. Chem. – 1993. – Vol. 39. № 4. – P. 686-689. 186. Teschke, R. Drug and herb induced liver injury: Council for international organizations of medical sciences scale for causality assessment. / R. Teschke, A. Wolff, C. Frenzel et al. // World J. Hepatol. – 2014. – Vol. 6. № 1. – P. 17-32. 187. Tidball, J.G. Inflammatory processes in muscle injury and repair. / J. G. Tidball // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. – 2005. – Vol. 288, - P. 345– 353. 188. Tipoe, G.L. Inhibitors of inducible nitric oxide (NO) synthase are more effective than an NO donor in reducing carbon-tetrachloride induced acute liver injury. / 126 G.L. Tipoe, T.M. Leung, E. Liong et al. // Histol. Histopathol. – 2006. – Vol. 21, - P. 1157-1165. 189. Tung, N.H. Pharmacological effects of ginseng on liver functions and diseases: a mini review. / N.H. Tung, T. Uto, O. Morinaga, Y.H. Kim, Y. Shoyama // Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. – 2012. – Vol. 2012, - P. 1-7. 190. Venditti, P. Effect of exercise duration on characteristics of mitochondrial population from rat liver. / P. Venditti, P. Masullo, S.D. Meo // Arch Biochem. Biophys. – 1999. – Vol. 368, - P. 112-120. 191. Vina, J. Free radicals in exhaustive physical exercise: Mechanism of production and protection by antioxidants. / J. Vina, M. C. Gomez-Cabrera, A. Lloret et al. // IUBMB Life. – 2000. – Vol. 50, - P. 271-277. 192. Voces, J. Effects of administration of the standardized Panax ginseng extract G115 on hepatic antioxidant function after exhaustive exercise. / J. Voces, A.I. Alvarez, L. Vila et al. // Comparative Biochemistry and Physiology Part C. – 1999. – Vol. 123, - P. 175-184. 193. Williams, A.T. Carbon tetrachloride hepatotoxicity: an example of free radical-mediated injury. / A.T. Williams, R.F. Burk // Semin. Liver Dis. – 1990. – Vol.10, - P. 279–284. 194. Wu, Y.L. Hepatoprotective effects of salidroside on fulminant hepatic fail- ure induced by D-galactosamine and lipopolysaccharide in mice. / Y.L. Wu, L.H.Lian, Y.Z. Jiang, J.X. Nan // J Pharm Pharmacol. - 2009. – Vol. 61. № 10. - Р. 1375-82. 195. Wu, Y.L. Protective effects of salidroside against acetaminophen-induced toxicity in mice. / Y.L. Wu, D.M. Piao, X.H. Han et al. // J. Pharm. Pharmacol. – 2008. – Vol. 31. № 8. – P. 1523-1529. 196. Yamambe, N. Increase in antioxidant and anticancer effects of ginsenoside Re-lysine mixture by Maillard reaction. / N. Yamambe, Y.J.Kim, S. Lee et al. // Food Chem. - 2013. – Vol.138.№ 2-3. - Р. 876-83. 197. Yokozawa, T. Protective effects of Acanthopanax Radix extract against endotoxemia induced by lipopolysaccharide. / T. Yokozawa, D.H. Rhyu, C.P. Chen // Phytother. Res. - 2003. - Vol.17, - Р. 353–357. 127 198. Yong, X. Evaluation of anti-fatigue activity of total saponins of radix notoginseng. / X. Yong, Z. Jian // Indian J. Med. Res. – 2013. – Vol. 137. №1. – P. 151-155. 199. Yoon, Mi Y. Potentiation of acetaminophen hepatotoxicity by acute physical exercise in rats. / Mi Y.Yoon, Su N.Kim, Young C. Kim // Research Communications in Molecular Pathology and Pharmacology. – 1997. – Vol. 96. №1. – P. 35-44. 200. Yu, C.Y. Intraspecific relationship analysis by DNA markers and in vitro cytotoxic and antioxidant activity in Eleutherococcus sentocosus. / C.Y. Yu, S.H. Kim, J.D. Lim, M.J. Kim et al. // Toxicol. in vitro. – 2003. – Vol. 17. № 2. – P. 229-236. 201. Zhang, Y. Anti-fatigue activity of a triterpenoid-rich extract from Chinese bamboo shavings (Caulis bamfusae in taeniam). / Y. Zhang, X. Yao, B. Bao // Phytotherapy Research. – 2006. – Vol. 20, - P. 872–876. 202. Zhang, Z.F. Hepatoprotective activity of Gentana veitchiorum Hemsl. against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in mice. / Z.F. Zhang, Y. Liu, L.Y.Lu, P. Luo // Chin. J. Nat. Med. – 2014. – Vol. 12. № 7. – P. 488-494. 203. Zhao, J. Ginsenosides Rg1from Panax ginseng: a potential therapy for acute liver failure patients. / J. Zhao, Z. Shi, S. Liu et al. // Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. – 2014. – Vol. 5, - P. 1-8. 204. Zhu, L. Prevention of Rhodiola astragalus membranaceus compounds against simulated plateau hupoxia brain injury in rat. / L. Zhu, Z.Y. Shi, X.M. Wu et al. // Space Med. Eng. - 2005. – Vol. 18. №4. – P. 303-305.
