На правах рукописи Сапрыкина Екатерина Сергеевна

Реклама
На правах рукописи
Сапрыкина Екатерина Сергеевна
Комплексная оценка эффективности применения аутогенных клеток стромы
лимфатических узлов и лазерного излучения при коррекции лимфатических
отеков конечностей (экспериментальное исследование)
14.00.15 – патологическая анатомия, 14.00.27 – хирургия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Саратов - 2009
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего
профессионального образования «Самарский государственный медицинский
университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию».
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Колсанов Александр Владимирович;
доктор медицинских наук, профессор Жуков Борис Николаевич.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Степанов Сергей Алексеевич;
доктор медицинских наук, профессор Островский Николай Владимирович.
Ведущая организация: Федеральное
государственное
учреждение
«Институт
хирургии имени А.В. Вишневского Росмедтехнологий».
Защита состоится «
»
2009 года в
часов на заседании диссертационного
совета Д 208.094.01 при ГОУ ВПО Саратовский ГМУ Росздрава по адресу: 410012, г.
Саратов, ул. Большая Казачья, 112.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Саратовский ГМУ
Росздрава.
Автореферат разослан «
»
2009
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
г.
Маслякова Г.Н.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Лимфедема - распространенное социально значимое заболевание. По данным
ВОЗ, данной патологией страдает около 10 % населения. J.Casley-Smith (1980)
считает, что около 300 миллионов человек во всем мире страдают от различных
форм лимфедемы. Основная группа пациентов - женщины молодого и среднего
возраста. Соотношение заболевших женщин и мужчин составляет 3:1 – 5:1 (Заварина
И.К. и соавт., 2006). Число вновь выявленных больных возрастает с каждым годом
(Борисов А.В., 2007; Foldi M. et al., 2005; Warren AG et al., 2008; Garfein E.S. et al.,
2008), причем тенденции к снижению уровня заболеваемости не наблюдается
(Аничков М.Н. и соавт., 1983; Бубнова Н.А., 2008; Clodius L. et al., 1990). Социальная
значимость обсуждаемой темы велика и обусловлена тем, что большинство больных
– это люди трудоспособного возраста (96%), для которых чрезвычайно важна
реабилитация (Любарский М.С. и соавт., 1998; Поташов Л.В. и соавт., 2000; Бубнова
Н.А. и соавт., 1992, 2005;). Пациентам с лимфедемой приходится лечиться долго и,
зачастую, с минимальным эффектом (Богомолов А.Д., 1987; Любарский М.С. и соавт.,
2001).
Эффективность лечения больных лимфедемой, как считают многие авторы,
зависит от адекватной оценки состояния лимфатических коллекторов, лимфатических
узлов и индивидуального подхода к выбору тактики лечения (Савченко Т.В., 1989;
Абалмасов К.Г. и соавт., 2000; Бубнова Н.А. и соавт., 2003, 2006; Olszewski W.L. et al.,
2002; Witte M. H. et al., 2002; Foldi M., 2005).
В настоящее время в мире накоплен достаточно большой опыт лечения
больных с лимфедемой конечностей, разработаны разнообразные диагностические
методики, способные с достаточной степенью достоверности оценить состояние
лимфатического коллектора конечностей, степень функциональных изменений,
возможности их коррекции (Фионик О.В., 2007; Szuba A., Rockson S.G., 1998).
На сегодняшний день известно множество методов лечения больных с
лимфатическими отеками конечностей (медикаментозный, физиотерапевтический,
компрессионный, хирургический). Однако большинство существующих методов
лечения требуют использования специальной дорогостоящей аппаратуры, наличия
высококвалифицированных профильных специалистов, что можно обеспечить лишь в
крупных специализированных научно-исследовательских центрах (Поташов Л.В. и
4
соавт., 2000; Ишенин Ю.М. и соавт., 2005; Фионик О.В., 2008; Campisi C., 1999). При
этом эффективность предлагаемых методов коррекции патологического процесса
остается невысокой (Покровский А.В. и соавт., 2005; Бубнова Н.А., 2008; Posner T.N.,
Smith N.A., 2000; McGuinness C.L., Burnand K.G., 2001). Вопрос об эффективности
лечения лимфедемы и затратах на его проведение является важным для
государственного здравоохранения.
В последнее время низкоинтенсивное лазерное излучение стало объектом
пристального внимания медиков; по мнению многочисленных авторов, оно оказывает
положительное влияние на самые различные биологические процессы. По данным
Т.В. Кончуговой (1995), Г.Е. Брилль, И.О. Бугаевой, Н.В. Богомоловой (2003, 2005),
инфракрасное
лазерное
излучение
оказывает
стимулирующее
влияние
на
генетический аппарат лимфоидных клеток, способствует активации тимоцитов и
лимфоцитов. Литературные данные подтверждают ведущую роль микроциркуляции в
осуществлении биологических эффектов низкоинтенсивного лазерного излучения
(Жуков Б.Н. и соавт., 1985, 1995, 2006; Gourgoulatos Z. еt al., 1989; Lindsberg P.J. et al.,
1989). По данным P.C. Lievens (1988), после лазерного воздействия происходит более
быстрая регенерация лимфатической системы, что дает основной дренирующий и
противоотечный эффекты лазеротерапии.
Современная медицина широко использует биотехнологические методы для
лечения
тяжелых
повреждений
различных
органов.
Использование
культивированных клеток человека и созданных на их основе тканевых конструкций
открывает уникальную возможность применения их в клинической практике.
Применению клеточной и тканевой трансплантации, направленному на коррекцию
лимфооттока, уделяют все большее внимание в современной лимфологии.
На современном этапе вопрос применения клеточных и тканевых технологий в
коррекции лимфатических отеков конечностей еще не достаточно изучен и требует
дополнительных научных исследований. Поиск новых способов и схем лечения
пациентов с лимфедемой конечностей является весьма актуальной задачей в
современной хирургии.
Методы лечения пациентов с лимфатическими отеками конечностей постоянно
совершенствуются и пополняются новыми разработками. Большее предпочтение на
современном этапе отдается комбинированному лечению пациентов с указанной
патологией. Данная работа посвящена отработке новой комбинированной методики
5
коррекции
лимфатических
отеков конечностей
в
эксперименте,
что
и
позволило сформулировать цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования
Улучшить результаты коррекции лимфатических отеков конечностей путем
отработки в эксперименте методики применения низкоинтенсивного лазерного
излучения и культуры аутогенных клеток стромы лимфатических узлов.
Задачи исследования
1.
Разработать методику моделирования острого лимфатического отека конечности
в эксперименте.
2.
Провести комплексную оценку эффективности применения низкоинтенсивного
лазерного излучения как самостоятельного метода в коррекции лимфатических
отеков в эксперименте.
3.
Провести комплексную оценку эффективности применения низкоинтенсивного
лазерного излучения при совместном использовании с трансплантацией
культуры аутогенных клеток стромы лимфатических узлов в коррекции
лимфатических отеков в эксперименте.
4.
В
сравнительном
аспекте
оценить
эффективность
применения
низкоинтенсивного лазерного излучения как самостоятельного метода и при
сочетании с культурой аутогенных клеток стромы лимфатических узлов в
коррекции лимфатических отеков в эксперименте.
5.
Изучить морфологические особенности реакции тканей паховой области
экспериментального животного в ответ на трансплантацию культуры аутогенных
клеток стромы лимфатических узлов и лазерное воздействие.
Научная новизна работы
Впервые разработана методика моделирования острого лимфатического отека
конечности в эксперименте путем интраоперационного удаления пакета паховых
лимфатических узлов (Удостоверение на рационализаторское предложение № 372 от
22.12.03,
выданное
ГОУ
ВПО
«Самарский
государственный
медицинский
университет Росздрава»).
Впервые разработан способ хирургической коррекции острого лимфатического
отека
конечности
с
использованием
культуры
аутогенных
клеток
лимфатических узлов (патент РФ на изобретение № 2280461 от 27.07.2006).
стромы
6
Впервые
разработан
способ хирургической
коррекции
острого
лимфатического отека конечности с применением аутогенных клеток стромы в
сочетании
с
лазерным
излучением
(Удостоверение
на
рационализаторское
предложение № 626 от 17.11.08, выданное ГОУ ВПО «Самарский государственный
медицинский университет Росздрава»).
Проведена
комплексная
морфологическая
оценка
новообразованной
соединительной ткани после применения низкоинтенсивного лазерного излучения и
культуры аутогенных клеток стромы лимфатических узлов.
Впервые проведена сравнительная оценка эффективности способов коррекции
лимфатических отеков конечности при использовании низкоинтенсивного лазерного
излучения и при его сочетании с трансплантацией культуры аутогенных клеток
стромы лимфатических узлов.
Изучены морфологические особенности реакции тканей паховой области
экспериментального животного в ответ на трансплантацию культуры аутогенных
клеток стромы лимфатических узлов и лазерное воздействие.
Научно-практическая значимость работы
В
эксперименте
разработана
методика
применения
низкоинтенсивного
лазерного излучения в сочетании с использованием культуры аутогенных клеток
стромы лимфатических узлов для коррекции лимфатических отеков конечностей и
обоснована ее высокая эффективность.
Доказан более выраженный эффект от сочетанного применения культуры
аутогенных клеток стромы лимфатических узлов и низкоинтенсивного лазерного
излучения по сравнению с использованием низкоинтенсивного лазерного излучения в
качестве самостоятельного метода.
На модели лимфатического отека у белых крыс изучены морфологические
особенности реакции тканей паховой области экспериментального животного в ответ
на трансплантацию культуры аутогенных клеток стромы лимфатических узлов и
лазерное воздействие.
Публикации и внедрения
По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 в рецензируемых
научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ; 1 работа - в зарубежной
печати.
Получены
патент
РФ
рационализаторских предложения.
на
изобретение
и
удостоверения
на
2
7
Реализация результатов
Полученные научные результаты исследования используются в работе
сердечно-сосудистого отделения клиники госпитальной хирургии Самарского
государственного медицинского университета; в преподавании курса хирургических
болезней студентам и курсантам кафедр госпитальной хирургии,
оперативной
хирургии и клинической анатомии с курсом инновационных технологий; при
выполнении экспериментов на базе Института экспериментальной медицины и
биотехнологий ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет
Росздрава».
Апробация диссертации
Основные положения работы доложены на межрегиональной научнопрактической конференции с международным участием «Санкт-Петербургские
научные чтения - 2004» (Санкт-Петербург, 2004); Международном конгрессе
Европейской ассоциации банков ткани (Чехия - Прага, 2004); заседании Самарского
областного научного общества хирургов им. В.И. Разумовского, № 819 (2004); II
Всероссийском
симпозиуме
с
международным
участием
«Клинические
и
фундаментальные аспекты тканевой и клеточной терапии» и конференции «Теория и
практика клеточных биотехнологий» (Самара, 2004); II съезде лимфологов России
(Санкт-Петербург, 2005); научной конференции молодых ученых «Аспирантские
чтения» (Самара, 2006, 2007); расширенных заседаниях кафедр госпитальной
хирургии, оперативной хирургии и клинической анатомии с курсом инновационных
технологий (Самара, 2007, 2008); III съезде лимфологов России (Москва, 2008).
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 151 странице машинописного текста,
состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материалов и
методов в эксперименте, результатов собственных исследований, обсуждения
полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы.
Список литературы включает 258 источников, из них 182 отечественных, 76
зарубежных.
Работа иллюстрирована 53 рисунками, 5 диаграммами.
Положения, выносимые на защиту
1.
Применение
низкоинтенсивного
лазерного
излучения
в
качестве
самостоятельного метода коррекции лимфедемы конечностей позволяет добиться
8
регресса экспериментального лимфатического отека за счет открытия резервных
капилляров и стимуляции процесса неоангиогенеза.
2.
Применение низкоинтенсивного лазерного излучения в сочетании с
использованием культуры аутогенных клеток стромы лимфатических узлов позволяет
ускорить процесс регресса экспериментального лимфатического отека и добиться
практически полного его купирования за счет более активного процесса открытия
резервных капилляров и стимуляции процесса неоангиогенеза.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Эксперименты выполнялись на базе Института экспериментальной медицины и
биотехнологий ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет
Росздрава» (директор Института – профессор Л.Т. Волова).
Экспериментальный раздел работы выполнен на 48 беспородных половозрелых
белых лабораторных крысах. Масса животных - 150-200 г. Отбор в серии наблюдения
был случайным.
На первом этапе проводили наблюдение за серией экспериментальных
животных (n=3), не подвергая их какому-либо воздействию, с целью изучения макрои микроскопических особенностей строения паховых лимфатических узлов и
окружающих
тканей
в
норме,
особенностей
расположения
лимфатических
коллекторов. Опытным животным проводили хромолимфографию с подсчетом общей
площади лимфатических сосудов в полях зрения микропрепарата.
На втором этапе моделировали острый лимфатический отек конечности в
эксперименте. После создания модели острого лимфатического отека (на 84-е сутки
после удаления паховых лимфатических узлов) выводили опытных животных (n=3)
из эксперимента. В дальнейшем этим животным было проведено морфологическое
исследование мягких тканей оперированной конечности с целью изучения характера
изменений в тканях в процессе формирования лимфатического отека конечности.
На третьем этапе экспериментальные животные с созданной моделью острого
лимфатического отека конечности были разделены на 3 серии.
За животными 1-й серии (контрольной) (n=14) после моделирования
лимфатического отека конечности наблюдали в течение всего эксперимента.
9
У животных 2-й серии (n=14) проводили
излучением
без
введения
культуры
воздействие
аутогенных
клеток
лазерным
стромы
паховых
лимфатических узлов.
В 3-й серии (n=14) животным после моделирования лимфатического отека
вводили культуру аутогенных клеток стромы паховых лимфатических узлов и
осуществляли контактное воздействие низкоинтенсивным лазерным излучением на
паховую область оперированной конечности.
Максимальная длительность эксперимента составляла 7 месяцев.
Итак, для изучения возможности применения низкоинтенсивного лазерного
излучения и аутогенных клеток стромы лимфатических узлов в коррекции
лимфедемы
конечностей
всем
экспериментальным
животным
выполняли
моделирование лимфатического отека конечности с последующей коррекцией его
различными способами. Моделирование острого лимфатического отека конечности у
животных осуществляли путем удаления паховых лимфатических узлов единым
блоком с окружающей жировой клетчаткой.
Для
морфологического
микроскопическое
оперированной
подтверждения
исследование
конечности.
В
иссеченного
условиях
наличия
сектора
отека
мягких
операционной
проводили
тканей
бедра
экспериментальному
животному давали эфирный наркоз, затем проводили иссечение послойного сектора
мягких тканей на уровне средней трети бедра оперированной конечности.
Иссеченный фрагмент помещали в 10%-ный нейтральный формалин на 24 часа. Далее
материал обезвоживали, обезжиривали и заливали в парафин в гистологическом
автомате по общепринятой методике (Меркулов Г.А., 1961). С парафиновых блоков
готовили несколько срезов толщиной 5 мкм на 10-15 предметных стеклах.
Для
окрашивания
микропрепаратов
применяли
растворы
красителей,
приготовленные по общепринятым прописям (Пирс Э., 1962; Лилли Р.Д., 1969;
Сапожников А.Г., Доросевич А.Е., 2000): гематоксилин и эозин, пикрофуксин по
Ван-Гизон, кислотный орсеин, применяли методику импрегнации серебром.
Гистологические срезы выполняли в поперечном направлении. В препаратах
определяли количество лимфатических сосудов, расширение и деформацию
лимфатических
сосудов
лимфогистиоцитарного
и
характера,
капилляров,
фиброз
клеточную
клетчатки,
инфильтрацию
увеличение
количества
фибробластов и развитие клеточного и внеклеточного склероза, высчитывали общую
10
площадь лимфатических сосудов в полях зрения при помощи окулярной тест-сетки
Автандилова.
Для подтверждения наличия отека оперированной конечности и для выявления
динамики
отека
выполняли
следующие
методы
обследования:
волюметрия
конечности и измерение окружности конечности на уровне средней трети бедра.
Для оценки лимфатического русла конечности экспериментальному животному
проводили хромолимфографию (определение характера распространения красителя
по тканям) путем введения красящего вещества (1%-ная метиленовая синь) в объеме
0,1 мл инсулиновым шприцем в 1-й межпальцевой промежуток задней лапы.
Для
морфологического
подтверждения
увеличения
числа
активно
функционирующих лимфатических капилляров и образования новых лимфатических
сосудов и капилляров проводили микроскопическое исследование иссеченного
сектора мягких тканей бедра оперированной конечности животным 2-й и 3-й серий.
Для изучения морфологической картины новообразованной ткани выполняли
гистологическое исследование. Обращали внимание на ее структуру, измеряли
линейные размеры клеток в двух взаимно перпендикулярных направлениях.
Гистологические срезы толщиной 5-7 мкм изучали светооптически и
телеметрически с помощью камеры CCD KOCOM KCC-31OPD и светового
микроскопа Nicom ALPHAPHOT-2 YS2-11 (Japan).
Удаленные лимфатические узлы при моделировании лимфатического отека
конечности
использовали
для
получения
культуры
клеток стромы.
Клетки
выращивали в культуральных флаконах Сorning (производство США) объемом 25 см2
при 37°С в присутствии 5% СО2 в средах МЕМ и RPMI-1640 с добавлением 10%-ной
фетальной
бычьей
сыворотки
(ООО
«Биолот»).
В
работе
использованы
инвертированный микроскоп Биолам П-2-1, термостаты и СО2-инкубаторы фирмы
Sanyo (Incubator MIR-262), ламинарный бокс (БАВп-01 «Ламинар-С») с вертикальным
потоком воздуха II класса защиты.
Полученную культуру клеток стромы лимфатических узлов вводили животным
3-й серии (n=14) после моделирования лимфатического отека конечности и его
стабилизации. Во всех случаях доза клеток в водимой суспензии составляла 300
тысяч клеток в 0,2 мл 0,9%-ного стерильного раствора хлорида натрия (по методике
Г.В. Яровенко, В.В. Россинской, 2005, 2006, 2007). Трансплантацию суспензии
аутогенных клеток стромы паховых лимфатических узлов проводили инъекционным
11
путем подфасциально в паховую область оперированной конечности и на 10-е
сутки после введения культуры клеток контактно воздействовали низкоинтенсивным
лазерным излучением (длина волны - 830 нм).
В эксперименте после моделирования лимфатического отека конечности
животным 3-й серии на 10-е сутки после введения культуры клеток и животным 2-й
серии проводили контактное воздействие (излучатель соприкасается с кожным
покровом) инфракрасным низкоинтенсивным лазерным излучением в паховой
области оперированной конечности. С этой целью был использован лазерный аппарат
АЛ – 01 «Семикон», мощностью 30 мВт, длиной волны - 830 нм (инфракрасный
диапазон). Режим работы - непрерывный, экспозиция - 3 минуты, курс воздействия 10 сеансов; частота – через день (Б.Н. Жуков, Н.А. Лысов, 1993).
Статистическая
обработка
результатов
выполнена
при
помощи
пакета
статистической обработки STATISTICA 6 ©StatSoft, Inc. (2001), с использованием
программ Microsoft Excel Vista, Biostat.
Первой
методикой,
примененной
к
массиву
данных,
была
программа
описательной статистики. Были изучены средние величины в группах наблюдения,
величины среднего квадратического отклонения. Нормальность распределения
наблюдений оценивалась по методикам Шапиро-Вилка, Колмогорова-Смирнова.
Достоверность сравнения результатов в группах наблюдения подтверждена методами
параметрической статистики - t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони для
множественных сравнений с контрольной группой.
Для интегральной оценки выраженности уменьшения отёка и скорости её
развития применили методику вычисления площади под кривой объёма конечности
(area under curve, AUC).
Выявленные закономерности и связи изучаемых параметров между группами и
признаками были значимыми при вероятности безошибочного прогноза Р = 95% и
более.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе эксперимента проводили наблюдение за серией животных
(n=3), не подвергая их какому-либо воздействию. Выявили, что состояние опытных
крыс в ходе всего эксперимента не менялось, было удовлетворительным.
На 42-е, 74-е, 103-и сутки было выведено по одному животному на каждый
срок. Проводили морфологическое исследование, в ходе которого выявили, что
12
макро- и микроскопическая картины у всех животных были схожими. При
макроскопическом исследовании получено: в паховых областях обеих конечностей
рядом с бедренными сосудами визуализировался пакет паховых лимфатических узлов
серовато-розового цвета, окруженных жировой клетчаткой в количестве 2-4, округлой
формы размером 0,2 до 0,6 см.
При микроскопическом исследовании у экспериментальных животных
обнаружено, что лимфатические узлы имеют хорошо выраженную капсулу,
представленную фибробластами, коллагеновыми и эластическими волокнами; каркас
состоит
из
нежных
ретикулярных
волокон.
Внутрь
от
капсулы
отходят
соединительно тканные перегородки (трабекулы), связанные с капсулой. В структуре
узла определяли хорошо различимые корковое и мозговое вещества, мякотные тяжи
и синусы. На срезах узла, проведенных через ворота, определяли периферическое,
более плотное корковое вещество, состоящее из лимфатических узелков, а также
центральное более светлое мозговое вещество, образованное мозговыми тяжами и
синусами. Наиболее многочисленной формой из клеточных элементов, которыми
представлены лимфатические узлы, являются лимфоциты и макрофаги. В структуре
узла определяется также развитая сеть трабекулярных сосудов и сосудов мякотных
тяжей.
В ходе эксперимента была приведена хромолимфография. Через 30 секунд
после инъекции витального красителя в 1-й межпальцевой промежуток происходило
контрастирование поверхностных лимфатических коллекторов. Через 1 минуту после
введения красителя прокрашивались глубокие коллекторы. Через 1,5 минуты
наблюдалось прохождение красителя в лимфатические узлы (появление красителя в
синусах узлов). Далее краситель перемещался по выносящим лимфатическим сосудам
на переднюю брюшную стенку и через 4,5 минуты уже визуально не определялся.
После
исследование.
выполнения
хромолимфографии
Осуществляли
забор
сектора
производили
мягких
тканей
морфологическое
конечности
с
лимфатическими узлами.
При исследовании в синусах лимфатических узлов определяли следы
красителя. Визуализировали лимфатические сосуды со следами красителя в мягких
тканях конечности и жировой ткани, окружающей лимфатические узлы.
При выполнении подсчета общей площади лимфатических сосудов в полях
зрения этот показатель составил 503±13,8 мкм2 .
13
На втором этапе эксперимента у серии животных (n=3) моделировали
острый лимфатический отек конечности путем удаления паховых лимфатических
узлов.
Через 4 суток после удаления паховых лимфатических узлов отмечали
нарастание отека; показатели отека составили, по данным измерения окружности
оперированной конечности, 1,3±0,026 см; по данным волюметрии, - 4,8±0,078 мл
(р<0,05). Максимальных цифр показатели отека достигали в среднем на 20-е сутки
(по данным измерения окружности оперированной конечности и данным волюметрии
1,6±0,04 см и 6,0±0,03 мл, р<0,05, соответственно), после чего происходило
уменьшение отека со стабилизацией его к 42-м суткам (показатели, по данным
измерения окружности оперированной конечности и данным волюметрии, - 1,2±0,01
см и 4,5±0,1 мл, р<0,05, соответственно). Контрольные измерения на более поздних
сроках эксперимента (84-е сутки) подтверждают стабилизацию отека и сохранность
его на прежних цифрах (рис.1).
7
6
5
6,04
4,81
4,51
4,5
4
окружность конечности (см)
волюметрия конечности (мл)
3
2
1,3
1,62
4 сутки
20 сутки
1,24
1,2
1
0
42 сутки
84 сутки
Рис. 1. Динамика отека оперированной конечности в зависимости от срока
эксперимента (по данным измерения окружности конечности и волюметрии).
Морфологическое исследование мягких тканей оперированной конечности
экспериментального животного, проведенное на 84-е сутки исследования с целью
подтверждения наличия отека, показало увеличение числа лимфатических сосудов и
их дилатацию, наличие клеточной инфильтрации лимфогистиоцитарного характера и
развитие клеточного и внеклеточного склероза. Также отмечался умеренный фиброз
клетчатки с расширением лимфатических сосудов. Описанные изменения в тканях
характерны для лимфатического отека.
Выполняли подсчет общей площади лимфатических сосудов в полях зрения
микропрепарата. Выявлено, что во всех сериях животных, у которых производили
14
удаление паховых лимфатических узлов с формированием модели лимфостаза, этот
показатель составил 540,22±14,4 мкм2.
Сравнение полученного показателя с
показателем у животных в норме (503±13,8 мкм2) свидетельствует о статистически
значимом увеличении (р<0,05).
Таким образом, использование методики удаления паховых лимфатических
узлов
позволяет
в
эксперименте
создать
эффективную
модель
острого
лимфатического отека.
На третьем этапе эксперимента за животными 1-й (контрольной) серии в
ходе всего эксперимента вели регулярное наблюдение с контролем уровня отека
оперированной конечности. Показатели отека стабильно оставались на одном уровне
и, по данным измерения окружности конечности на всех сроках эксперимента,
составляли в среднем 1,2±0,01 см (р<0,05), а по данным волюметрии, – 4,5 ±0,1 мл
(р<0,05).
При морфологическом исследовании, проведенном на 18-е, 28-е, 42-е, 74-е,
103-и сутки у экспериментальных животных 1-й серии, в паховой области
оперированной конечности отмечали заживление первичным натяжением.
При выполнении хромолимфографии экспериментальным животным 1-й серии
контрастирования глубоких лимфатических коллекторов получить не удалось, что
свидетельствует о нарушении дренирующей функции лимфатической системы
конечности.
При морфологическом исследовании сектора мягких тканей оперированной
конечности после выполнения хромолимфографии отмечали большое количество
лимфатических сосудов со следами красителя в мягких тканях конечности, их
дилатацию, наличие клеточной инфильтрации лимфогистиоцитарного характера,
увеличение количества фибробластов и развитие клеточного и внеклеточного
склероза.
Также
лимфатических
наблюдали
сосудов.
умеренный
Описанная
фиброз
клетчатки
морфологическая
с
картина
расширением
типична
для
лимфатического отека конечности.
При выполнении подсчета общей площади лимфатических сосудов в полях
зрения микропрепарата выявлено, что в 1-й серии животных данный показатель
составил 540,22±14,4 мкм2, что достоверно отличается от показателя у животных в
норме (503±13,8 мкм2). Зафиксировано статистически значимое увеличение, р<0,05.
15
Таким
образом,
лимфатический отек, сформировавшийся у животных 1-й
серии самостоятельно не купировался в ходе эксперимента. Показатели асимметрии
неизменно
оставались
на
одном
уровне.
Увеличение
числа
активно
функционирующих лимфатических сосудов, обнаруженное в ходе эксперимента
скорее всего носит компенсаторный характер.
За животными 2-й серии (экспериментальные животные с созданной моделью
лимфатического отека) вели регулярное наблюдение с контролем уровня отека
оперированной конечности путем измерения окружности оперированной конечности
и данным волюметрии. Показатели отека стабильно оставались на одном уровне.
Асимметрия составляла, по данным измерения окружности оперированной
конечности, на уровне средней трети бедра - 1,2±0,01 см (р<0,05), а по данным
волюметрии, - 4,6±0,1 мл (р<0,05).
Через 10 суток от начала третьего этапа эксперимента опытным животным
2-й
серии
начали
проводить
контактное
воздействие
инфракрасным
низкоинтенсивным лазерным излучением на паховую область оперированной
конечности.
На 18-е сутки от начала третьего этапа эксперимента (после 5 сеансов
воздействия низкоинтенсивным лазерным излучением) наблюдали уменьшение отека
на 19,8%. Показатели асимметрии составили: по данным измерения окружности
оперированной конечности, - 0,97±0,048 см (р<0,05), асимметрия, по данным
волюметрии, - 3,61±0,18 мл (р<0,05).
На 28-е сутки у животных 2-й серии зафиксировали уменьшение отека на 27,2%;
показатели асимметрии составили, по данным измерения окружности оперированной
конечности, - 0,87±0,04 см (р<0,05), асимметрия, по данным волюметрии, - 3,27±0,16
мл (р<0,05).
К 42-м суткам у животных 2-й серии отмечали уменьшение отека на 39,7%;
асимметрия по данным измерения окружности оперированной конечности составила
0,77±0,03 см (р<0,05); асимметрия, по данным волюметрии, - 3,0±0,14 мл (р<0,05).
На 56-е сутки показатель регресса отека у животных 2-й серии составил 53%;
асимметрия, по данным измерения окружности оперированной конечности, 0,72±0,03 см (р<0,05); асимметрия, по данным волюметрии, - 2,79±0,12 мл (р<0,05).
При дальнейшем наблюдении за животными 2-й серии (74-е и 103-и сутки
эксперимента) показатели асимметрии оставались на прежнем уровне: по данным
16
измерения окружности оперированной конечности, - 0,72±0,03 см (р<0,05);
асимметрия, по данным волюметрии, -2,79±0,12 мл (р<0,05).
На 74-е и 103-и сутки эксперимента микроскопическая картина была
аналогична полученной ранее.
Таким образом, использование низкоинтенсивного лазерного излучения в
качестве монотерапии у животных 2-й серии (с созданной моделью лимфатического
отека конечности)
приводит к уменьшению отека оперированной конечности, и
максимальный показатель регресса отека составил 53% (рис.2).
% регресса
Динамика отека
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
53
19,8
0
10
суток
18
21
22
28
34,7
29
27,2
32
35
53
53
53
53
39,7
42
56
60
74
94
103
сутки
Рис. 2. Динамика отека конечности у животных 2-й серии эксперимента.
При
выполнении
коллекторов
удалось
хромолимфографии
получить
у
всех
контрастирование
животных
2-й
лимфатических
серии,
но
сеть
контрастированных сосудов была выражена незначительно, что свидетельствует о
частичном
восстановлении
дренирующей
функции
лимфатической
системы
конечности; далее краситель перемещался по выносящим лимфатическим сосудам на
переднюю брюшную стенку.
При морфологическом исследовании на всех сроках эксперимента в паховой
области оперированной конечности новообразованной ткани обнаружить не удалось,
хотя отмечалась хорошая васкуляризация мягких тканей оперированной конечности.
Данные подсчета общей площади лимфатических сосудов в полях зрения
микропрепарата у всех животных 2-й серии на 18-е, 21-е, 28-е, 42-е, 74-е, 103-и сутки
эксперимента были суммированы. Выявлено, что после 5 сеансов (18-е сутки
исследования)
воздействия
низкоинтенсивным
лазерным
излучением
данный
показатель увеличился на 18,9% и составил 598±19,5 мкм2; на 28-е сутки (после 10
сеансов
воздействия
низкоинтенсивным
лазерным
излучением)
показатель
17
увеличился на 29,8% и составил 653±20,8 мкм2
(зафиксировано
статистически
значимое увеличение показателя по сравнению с нормой, р<0,05); на 42-е сутки
показатель увеличился на 31,4% и составил 661±22,4 мкм2 (зафиксировано
статистически значимое увеличение показателя по сравнению с нормой, р<0,05); на
более поздних стадиях эксперимента описанный показатель не претерпевал значимых
изменений и оставался примерно на одном уровне. Динамика данного показателя
свидетельствует в пользу того факта, что при воздействии низкоинтенсивным
лазерным излучением происходит увеличение числа функционирующих сосудов и
капилляров. Данные изменения наступали за счет начала функционирования
резервных капилляров, развивающегося по механизмам срочной адаптации, а также за
счет более пролонгированного процесса, связанного с новообразованием капилляров,
который
относится
к
механизмам
долговременной
адаптации
системы
микроциркуляции (рис.3).
680
661
665
661
653
660
18-е сутки
640
28-е
42-е
620
598
74-е
600
103-и
580
560
1
Рис. 3. Динамика показателя общей площади лимфатических сосудов в полях зрения
микропрепарата конечности у животных 2-й серии в зависимости от срока
эксперимента.
У животных 3-й серии через 10 суток после трансплантации культуры клеток
стромы паховых лимфатических узлов в паховую область оперированной конечности
был отмечен незначительный регресс отека оперированной конечности. По данным
измерения окружности оперированной конечности на уровне средней трети бедра и
данным волюметрии, показатель регресса отека составил от 7% до 13%: асимметрия
по данным измерения окружности оперированной конечности - 1,085±0,02 см
(р<0,05); асимметрия по данным волюметрии - 4,025±0,16 мл (р<0,05).
На данном этапе эксперимента животным 3-й серии начали проводить
контактное воздействие инфракрасным низкоинтенсивным лазерным излучением на
18
паховую
область
оперированной конечности.
Время
воздействия
-
3
минуты, количество сеансов – 10, частота – через день.
На 18-е сутки от начала третьего этапа эксперимента у животных 3-й серии
(после 5 сеансов воздействия низкоинтенсивным лазерным излучением) отмечали
уменьшение отека на 34%. Показатели асимметрии составили: по данным измерения
окружности оперированной конечности - 0,79±0,03 см (р<0,05), асимметрия по
данным волюметрии - 3,69±0,14 мл (р<0,05).
На 28-е сутки (после 10 сеансов воздействия низкоинтенсивным лазерным
излучением) у животных 3-й серии отмечали уменьшение отека на 56%; показатели
асимметрии
составили:
по
данным
измерения
окружности
оперированной
конечности, - 0,52±0,026 см (р<0,05); асимметрия по данным волюметрии - 1,98±0,09
мл (р<0,05).
К 42-м суткам после введения культуры клеток регресс отека у животных 3-й
серии достиг следующих показателей: асимметрия, по данным измерения окружности
оперированной конечности, составила 0,16±0,008 см (р<0,05); асимметрия, по данным
волюметрии - 0,46±0,02мл (р<0,05).
На 56-е сутки после введения культуры клеток у животных 3-й серии отмечали
почти полное купирование отека (96%). Асимметрия, по данным измерения
окружности оперированной конечности, - 0,09±0,004 см (р<0,05); асимметрия по
данным волюметрии, - 0,23±0,01мл (р<0,05). При дальнейшем наблюдении за
животными 3-й серии показатели отека неизменно оставались на одном уровне.
При морфологическом исследовании
в паховой области оперированной
конечности обнаружили наличие новообразованной ткани в виде 1-3 небольших, не
четко оформленных отдельных образований округлой
формы, беловато-желтого
цвета в сочетании с тканью, визуально напоминающую рыхлую соединительную
ткань со множеством соединительнотканных перемычек. Размер образований
колебался от 0,1 см (на ранних сроках эксперимента - 18-е, 28-е сутки) до 0,3 см (на
более поздних сроках - 42-е, 74-е сутки). Микроскопически образование представляло
собой конгломерат рыхлой волокнистой ткани, состоящий из коллагеновых и
небольшого количества ретикулярных волокон разной степени зрелости; в структуре
визуализировалось большое количество кровеносных капилляров и сосудов, а также
лимфатических сосудов и капилляров синусоидного типа со слабо выраженной,
плохо визуализируемой базальной мембраной, пронизывающих новообразованную
19
соединительную
ткань.
Какой-либо органоспецифичности не зафиксировано.
Отмечалась хорошая васкуляризация мягких тканей оперированной конечности.
Описанная картина наблюдалась как на ранней стадии эксперимента, так и на более
поздних стадиях
(74-е, 103-и сутки).
Таким образом, можно заключить, что после пересадки культуры клеток
стромы паховых лимфатических узлов в сочетании с низкоинтенсивным лазерным
излучением в паховой области происходит неогенез соединительной ткани. В
новообразованной ткани дифференцировки слоев не отмечается.
В то же время
наблюдается богатая васкуляризация паховой области оперированной конечности.
Новообразованные сосуды, визуализируемые на данной стадии эксперимента, имеют
более крупный просвет и более разветвленную сеть, чем у животных 2-й серии на
этом же этапе эксперимента.
В ходе эксперимента всем животным 3-й серии на данном этапе эксперимента
была приведена хромолимфография.
Были получены следующие результаты: через 30 секунд после инъекции
витального красителя происходило контрастирование поверхностных лимфатических
коллекторов.
Через
1
минуту
после
введения
красителя
происходило
контрастирование глубоких коллекторов, а также новообразованных лимфатических
сосудов, которые представляют собой развитую разветвленную сеть, окружающую
новообразованную соединительную ткань. Далее краситель перемещался по
выносящим лимфатическим сосудам на переднюю брюшную стенку и через 4,5
минуты уже визуально не определялся.
В ходе эксперимента после выполнения хромолимфографии производили
морфологическое исследование. Осуществляли забор сектора мягких тканей
оперированной конечности с новообразованной тканью. Были получены следующие
результаты: в структуре новообразованной ткани красителя выявлено не было, но он
определялся в сосудах, ее пронизывающих. Визуализировалось большое количество
новообразованных лимфатических сосудов со следами красителя в мягких тканях
конечности.
Данные подсчета общей площади лимфатических сосудов в полях зрения
микропрепарата у всех животных 3-й серии на 18-е, 21-е, 28-е, 42-е, 74-е, 103-и сутки
эксперимента были суммированы. Выявлено, что после 5 сеансов (18-е сутки
исследования)
воздействия
низкоинтенсивным
лазерным
излучением
данный
20
показатель
увеличился
на
25,6%
и составил 632±21,1 мкм2,; на 28-е сутки
(после 10 сеансов воздействия низкоинтенсивным лазерным излучением) показатель
увеличился на 38% и составил
695±23,7 мкм2
(зафиксировано статистически
значимое увеличение показателя по сравнению с нормой, р<0,05); на 42-е сутки
показатель увеличился на 40,7% и составил 708±24,9 мкм2; на более поздних стадиях
эксперимента описанный показатель не претерпевал значимых изменений и оставался
примерно на одном уровне (рис.4). Динамика данного показателя говорит в пользу
того факта, что у животных 3-й серии происходит активный процесс новообразования
функционирующих сосудов и капилляров.
708
720
715
713
695
700
680
общая площадь 660
лимфатич.
640
сосудов
18-е сутки
28-е
632
42-е
74-е
620
103-и
600
580
1
сутки
Рис. 4. Динамика показателя общей площади лимфатических сосудов в полях зрения
микропрепарата конечности у животных 3-й серии в зависимости от срока
эксперимента.
Таким образом, применение культуры клеток стромы лимфатических узлов,
вводимой инъекционным путем в сочетании с воздействием низкоинтенсивным
лазерным излучением, позволяет добиться почти полного регресса лимфатического
отека конечности (96%), созданного в эксперименте через 56 суток после
трансплантации культуры клеток, в то время как использование низкоинтенсивного
лазерного излучения в качестве самостоятельного метода приводит к регрессу отека
оперированной конечности только на 53% (рис.5).
Благодаря стимулирующему влиянию низкоинтенсивного лазерного излучения
на лимфоидную ткань и
наличию в паховой области оперированной конечности
культуры клеток стромы паховых лимфатических узлов, процесс неоагиогенеза в 3-й
серии экспериментальных животных реализуется в такой короткий срок (56 суток). К
этому сроку происходит формирование тканевого конгломерата, состоящего из
коллагеновых и ретикулярных волокон, пронизанного выраженной новообразованной
21
сетью кровеносных и лимфатических сосудов и капилляров. Полученные в
ходе эксперимента данные позволяют нам предположить, что именно этот
новообразованный тканевой конгломерат берет на себя дренирующую функцию.
Вопрос
влияния
низкоинтенсивного
лазерного
излучения
на
процесс
дифференцировки клеток стромы лимфатических узлов требует дальнейшего
изучения.
% регресса
Динамика отека
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
90,8
86
96
96
53
53
96
96
96
53
53
53
65
56
40
34
19,8 22
10
0
10
суток
0
0,1
27,2 29
0
0,2
21
Серия 2
34,7 39,7
0,1
32
0,1
42
Серия 1
Серия 3
0
0,2
0
60
0
0,1
94
сутки
Рис.5. Динамика регресса отека у экспериментальных животных 1-й, 2-й, 3-й
серий.
ВЫВОДЫ
1.
Разработанная модель острого лимфатического отека конечности позволяет
изучать течение данного патологического процесса у экспериментальных животных и
оценивать эффективность различных способов коррекции.
2.
Разработан новый комбинированный метод коррекции лимфатического отека
конечности, основанный на использовании низкоинтенсивного лазерного излучения и
трансплантации культуры аутогенных клеток стромы лимфатических узлов и
низкоинтенсивного лазерного излучения в качестве самостоятельного метода.
3.
Применение
низкоинтенсивного
лазерного
излучения
(аппарат
АЛ-01
«Семикон», длина волны 830 нм, мощность 30 мВт, количество сеансов – 10, частота
воздействия через 1 день) в качестве самостоятельного метода при экспозиции 3
минуты позволяет добиться регресса экспериментального лимфатического отека на
53% к 56-м суткам от начала воздействия.
4.
Контактное
воздействие
низкоинтенсивного
лазерного
излучения
(с
указанными характеристиками) при экспозиции 3 минуты в сочетании с пересадкой
22
аутогенных
клеток
стромы лимфатического узла позволяет добиться
практически полного регресса экспериментального лимфатического отека конечности
(96%) к
5.
56-м суткам.
При использовании низкоинтенсивного лазерного излучения в качестве
самостоятельного метода регресс отека наступает в большей степени за счет начала
функционирования резервных капилляров, находившихся ранее в неактивном
состоянии.
6.
При использовании низкоинтенсивного лазерного излучения в сочетании с
применением аутогенных клеток стромы лимфатических узлов практически полного
купирования
лимфатического
отека
позволяет добиться
активного
процесса
неоангиогенеза лимфатических сосудов и капилляров.
Низкоинтенсивное лазерное воздействие вызывает дифференцировку клеток
стромы паховых лимфатических узлов крысы и приводит к новообразованию
соединительной ткани.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1.
Моделирование острого лимфатического отека конечностей в эксперименте
осуществляют путем удаления пакета паховых лимфатических узлов. Созданную
модель лимфатического отека конечности можно рекомендовать к использованию в
научно-исследовательских лабораториях с целью детального изучения нарушения
лимфооттока и отработки новых методов коррекции данного состояния.
2.
Разработанный способ коррекции лимфатических отеков конечностей в
эксперименте за счет использования низкоинтенсивного лазерного излучения
(аппарат АЛ-01 «Семикон», длина волны - 830 нм, мощность - 30 мВт, количество
сеансов – 10, с частотой воздействия через 1 день, экспозиция – 3 минуты)
и
культуры аутогенных клеток стромы лимфатических узлов может быть использован
в хирургической практике.
3.
Низкоинтенсивное лазерное излучение с указанными характеристиками
оказывает стимулирующее влияние на неоангиогенез и приводит к открытию
резервных капилляров. Можно рекомендовать использование лазерного воздействия
в коррекции лимфатических отеков конечностей.
4.
С целью повышения эффективности коррекции лимфатических отеков
конечности целесообразно сочетанное применение низкоинтенсивного лазерного
23
излучения
с
указанными характеристиками
и
культуры
аутогенных клеток стромы лимфатических узлов, вводимой инъекционным путем в
паховую область конечности.
5.
Методика трансплантации культуры аутогенных клеток стромы лимфатических
узлов
в сочетании с применением низкоинтенсивного лазерного излучения с
указанными характеристиками является простой и безопасной при выполнении, что
позволяет рекомендовать ее для использования в клинической практике.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Использование
аутогенных
стромальных
клеток
в
лечении
острого
лимфатического отёка конечностей / Б.Н.Жуков, Г.В. Яровенко, В.В. Россинская,
Е.С. Сапрыкина // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии: Материалы
научной конференции с международным участием. Выпуск 3-4. - Томск, 2004. - С.
40-41.
2. Применение культуры аутогенных стромальных клеток для коррекции острого
лимфатического отека конечностей / Б.Н. Жуков, Г.В. Яровенко, Л.Т. Волова, Е.С.
Сапрыкина// Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и
практика клеточных биотехнологий: Материалы II всероссийского симпозиума с
международным участием. - Самара, 2004.- С.127-129.
3. Сапрыкина, Е.С. Новые подходы в лечении острого лимфатического отека
конечностей
/ Г.В. Яровенко, Е.С. Сапрыкина // Санкт-Петербургские научные
чтения: Материалы VI научно-практической конференции с международным
участием. – СПб., 2004.- С. 211-212.
4. Новые подходы в лечении острых лимфатических отеков конечностей в
эксперименте / Л.Т. Волова, Г.В. Яровенко, В.В. Россинская, Е.С. Сапрыкина //
Материалы Международного конгресса Европейской Ассоциации банков тканей. Прага, 2004.- С.164.
5. Аутогенные ретикулярные клетки в восстановлении лимфатического оттока при
периферических отеках / Б.Н. Жуков, Г.В. Яровенко, В.В. Россинская, Е.С.
Сапрыкина // Материалы II съезда лимфологов России. –СПб., 2005.- С.112-113.
6. Клеточные технологии в восстановлении периферического лимфатического оттока
/ Б.Н. Жуков, Г.В. Яровенко, В.В. Россинская, Е.С. Сапрыкина // Трудные и
нестандартные ситуации в хирургии. Новые технологии в медицине: Материалы
конференции. – Ижевск, 2006.- С. 116-118.
24
7. Сапрыкина, Е.С. Методика создания
модели
нарушения
периферического
лимфатического оттока на экспериментальных животных /Е.С. Сапрыкина //
Аспирантские чтения – 2006: Труды межвузовской конференции молодых ученых.
Приложение к межвузовскому журналу «Аспирантский вестник Поволжья». Самара, 2006.- С. 73-74.
8. Аутологичная трансплантация культуры клеток стромы лимфатических узлов для
купирования вторичной лимфедемы в эксперименте / Л.Т. Волова, Г.В. Яровенко,
В.В. Россинская, Е.С. Сапрыкина // Стволовые клетки и перспективы их
использования в здравоохранении: Материалы научной конференции. – М., 2007.С. 37-38.
9. Сапрыкина, Е.С. Возможности использования ткани лимфатических узлов для
получения культуры стромальных клеток / Б.Н. Жуков, Г.В. Яровенко, Е.С.
Сапрыкина // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. – М., 2007.- С. 128.
10. Сапрыкина, Е.С. Экспериментальное обоснование новой методики лечения
лимфатических отеков конечностей / Е.С. Сапрыкина // Аспирантские чтения –
2007: Труды межвузовской конференции молодых ученых Приложение к
межвузовскому журналу «Аспирантский вестник Поволжья». – Самара, 2007.- С.
273-275.
11. Лазерное излучение с применением культуры клеток стромы лимфатических
узлов в коррекции экспериментальной лимфедемы / Б.Н. Жуков, А.В. Колсанов,
Г.В. Яровенко, Е.С. Сапрыкина // Инновационные технологии в трансплантации
органов,
тканей
и
клеток:
Материалы
Всероссийской
конференции
с
международным участием. – Самара, 2008. - С. 170-172.
12. Новый подход к лечению лимфатических отеков нижних конечностей / Б.Н.
Жуков, А.В. Колсанов, Г.В. Яровенко, Е.С. Сапрыкина//
Морфологические
ведомости.- 2008.- №8. - C. 158-164.
Изобретения
1. Пат. 2280461 Способ лечения острого и хронического лимфатического отека
конечностей / Г.В. Яровенко, Б.Н. Жуков, Л.Т. Волова, В.В. Россинская, Ю.Л. Кецко,
Ю.Г. Кутырева; Е.С. Сапрыкина (РФ ГОУ ВПО «Самарский государственный
медицинский университет Росздрава»). - №2004114675; Заявл. 13.05.2004; Опубл.
27.07.2006. Бюл. №21.
25
Подписано в печать 14.04.09 г. Объем – 1 печ. л.. Тираж 100. Заказ №
Отпечатано в типографии по адресу:
Скачать