молекулярно-биологический анализ функциональной
advertisement
На правах рукописи Сорокин Максим Игоревич МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АСИММЕТРИИ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE В УСЛОВИЯХ СТРЕССА 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук МОСКВА 2014 Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова». Научный руководитель: доктор биологических наук Северин Федор Федорович Официальные оппоненты: Кушниров Виталий Владимирович, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук. Рихванов Евгений Геннадьевич, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологической генетики растений, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» Защита состоится « » октября 2014 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.76 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр. 12, биологический факультет, ауд. 389. С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте http://www.bio.msu.ru. Автореферат разослан « » __________ 2014 года. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук И.А. Крашенинников 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, находясь в экспоненциальной фазе роста, размножаются почкованием, то есть делятся асимметрично. Исходную клетку принято называть материнской, а новообразованную — дочерней. Известно, что материнская клетка дрожжей способна дать ограниченное количество дочерних (Mortimer and Johnston, 1959). При этом с каждым последующим делением размер клетки увеличивается, а последние несколько клеточных циклов проходят значительно дольше предыдущих (Mortimer and Johnston, 1959). Этот феномен был назван репликативным старением дрожжей, а количество дочерних клеток, образованных материнской, ее репликативным возрастом. В последнее время опубликовано много работ, указывающих на сходство репликативного старения дрожжей и старения высших эукариот. Примером является ограничение калорийности питания, увеличивающее как продолжительность жизни высших эукариот, так и репликативную продолжительность жизни (РПЖ) дрожжей. Другим примером является дрожжевой ген SIR2 – NAD+зависимая деацетилаза гистонов, гомолог SIRT1 млекопитающих, который дозо-зависимо продлевает РПЖ дрожжей, а также оказывает влияние на старение высших эукариот (Kaeberlein et al., 2013). Поэтому репликативное старение дрожжей считается моделью для исследования старения высших организмов. Степень разработанности темы. Асимметричное деление приводит к тому, что дочерняя клетка сильно отличается от материнской. Примерами таких отличий является разница в профиле экспрессии некоторых генов между материнской и дочерней клетками (Cosma et al., 2004), а также то, что клеточная стенка дочерней клетки синтезируется de novo (Mortimer and Johnston, 1959). Существует также ряд потенциально токсичных факторов, которые наследуются преимущественно материнскими клетками: карбонилированные белки (Aguilaniu et al., 2003) и экстрахромосомальные рибосомальные кольцевые ДНК (Sinclair et al., 1997). Более того, ранее было показано, что такая асимметрия формируется в результате работы 3 специальной системы, одним из компонентов которой является комплекс белков, называемых полярисомой (Liu et al., 2010). Асимметричное распределение ряда факторов между материнской и дочерней клетками, по-видимому, приводит к тому, что такие факторы накапливаются в материнских клетках с каждым последующим делением, как это было показано для экрДНК (Sinclair et al., 1997) и карбонилированных белков (Aguilaniu et al., 2003). Считается, что именно эти факторы приводят к тому, что репликативная продолжительность жизни дрожжей ограничена (Nystrom, 2014). Интересно, что отсутствие асимметрии деления по этим факторам приводит к снижению репликативной продолжительности жизни до 10-15 делений (Kaeberlein et al., 1999). Однако в экспоненциальной фазе роста культура клеток дрожжей будет более чем на 95% представлена клетками в возрасте от 1 (дочерних клеток) до 5 (материнских клеток, давших 4 дочерних). Отсюда возникает вопрос: какова функция асимметрии деления, если ее отсутствие не сказывается на выживаемости подавляющей фракции клеток дрожжей, находящихся в экспоненциальной фазе роста? В данной работе мы показали, что эффект отсутствия асимметрии деления проявляется в стрессовых условиях. С другой стороны, асимметрия деления приводит не только к тому, что дочерние клетки дрожжей сильно отличаются от материнских, но и материнские клетки разного репликативного возраста серьезно отличаются друг от друга по ряду параметров. Как оказалось, культура клеток дрожжей дифференцирована по своей устойчивости к тепловому шоку, что связано с концентрацией белка Tsl1p, ответственного за биосинтез трегалозы (Levy et al., 2012). Более того, эти исследователи обнаружили накопление клетками дрожжей Tsl1p уже после первых делений, и это накопление приводило к снижению скорости роста (Levy et al., 2012). Получается, что культура клеток дрожжей дифференцирована с целью разделения рисков (от англ. «bet hedging»): часть клеток делятся быстро, а часть в ущерб скорости удвоения накапливают Tsl1p, на случай резкого повышения температуры. Другие исследователи, используя данные Леви и соавторов (2012) подтвердили преимущества математического моделирования (Hartwell et al., 2014). 4 такой стратегии с помощью Действительно, стратегия разделения рисков – явление встречающееся и среди бактерий (Rainey et al., 2011), и среди растений (Childs et al, 2010). Поэтому изучение этой стратегии с использованием такого детально изученного объекта как пекарские дрожжи, может представлять широкий научный интерес. Более того, разделение рисков у дрожжей в форме возраст-зависимой дифференцировки, тесно связано с репликативным старением, которое, в свою очередь, является экспериментальной моделью старения высших эукариот. Цели и задачи. Целью настоящей работы было усовершенствование дрожжевой модели старения эукариотической клетки. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить характер зависимости устойчивости к различным типам стресса от репликативного возраста дрожжей S. cerevisiae. 2. Найти факторы, которые влияют на характер зависимости стрессоустойчивости от репликативного возраста. 3. Изучить изменения, которые происходят в клетках дрожжей S. cerevisiae на ранних этапах репликативного старения Научная новизна. Впервые было показано, что отсутствие асимметрии деления дрожжей сказывается на выживаемости клеток в стрессовых условиях. В данной работе также было показано, что снижение выживаемости с увеличением репликативного возраста клеток дрожжей, находящихся в стрессовых условиях, начинается уже после 4го деления. Данные представленной работы позволяют предположить, что такое снижение стрессоустойчивости связано с митохондриальной дисфункцией. В ходе данного исследования был получен штамм дрожжей, в котором ген оротидин фосфат декарбоксилазы находится под контролем НО промотора, и с помощью этого штамма было показано, что в старых клетках дрожжей снижена вероятность экспрессии НО, что свидетельствует в пользу того, что в старых клетках дрожжей с меньшей вероятностью происходит спонтанная смена типа спаривания. Теоретическая и практическая значимость работы. Учитывая то, что репликативное старение дрожжей считается моделью старения высших организмов, можно предположить, что данные полученные в ходе представленного исследования 5 могут быть использованы в исследовании процессов старения млекопитающих. Наши данные также свидетельствуют в пользу того, что культура клеток дрожжей, даже находясь в экспоненциальной фазе роста, дифференцирована в следствие асимметричного деления. Это, в свою очередь, может быть полезно многим исследователям, использующим пекарские дрожжи как модельный объект. Методология и методы исследования. В качестве объекта исследования использовали пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae штамм W303. Дрожжи растили на богатой среде содержащей 2% глюкозы, 2% пептона и 1% дрожжевого экстракта. Для получения мутантных штаммов использовали синтетические селективные среды, либо богатую среду с добавлением антибиотика (генетицин 250 мкг/мл). Получение мутантных штаммов дрожжей проводили по стандартному протоколу с использованием полиэтиленгликоля и литий-ацетатного буфера. Генетические конструкции были получены стандартными молекулярно-биологическими методами (ПЦР, рестрикция, лигирование). Клетки E. coli трансформировали электропорацией. Для получения микрофотографий клеток дрожжей использовали флуоресцентный микроскоп Olympus BX51. Почечные рубцы визуализировали с помощью калькофлуора белого. Положения, выносимые на защиту: 1. Клетки S. cerevisiae в культуре, находящейся в экспоненциальной фазе роста, дифференцированы по своей стрессоустойчивости в зависимости от репликативного возраста. 2. Асимметрия деления дрожжей необходима для повышения стрессоустойчивости дочерних клеток S. cerevisiae. 3. Старые клетки дрожжей хуже приспособлены к такой смене условий, как повышение температуры и недостаток питательных веществ. 4. Делеция генов ретроградной сигнализации RTG1 и RTG3 приводит к снижению стрессоустойчивости репликативно старых клеток. 5. В репликативно старых клетках S. cerevisiae снижена экспрессия НО промотора, по сравнению с репликативно молодыми. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: Биология - наука XXI века. 14 международная пущинская 6 школа-конференция, (Пущино, 2010); Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010», (Москва, 2010); Microbial stress from molecules to systems, (Бельджирате, Италия, 2012); 9th International Meeting on Yeast Apoptosis, (Рим, Италия, 2012); 3-ий съезд микологов в России, (Москва, 2012); Рецепторы и внутриклеточная сигнализация, (Пущино, 2013). Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований, анализе результатов. Основные результаты получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Публикации По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых международных журналах, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ, 1 статья в рецензируемом международном журнале и 5 материалов отечественных и международных конференций. Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 108 страницах машинописного текста и включают 53 рисунка и 4 таблицы. Диссертация состоит из разделов: “Введение”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы исследования”, “Результаты и их обсуждение”, “Заключение”, “Выводы”, “Список использованной литературы”, который содержит 1 отечественный и 75 иностранных источников. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Устойчивость клеток дрожжей к стрессу в зависимости от репликативного возраста В то время как многие исследователи изучают репликативное старение, т.е. выживаемость клеток с более чем 20 рубцами, мы решили проверить стрессоустойчивость клеток на ранних репликативных возрастах (Рисунок 1): более 95% культуры клеток дрожжей, находящейся в экспоненциальной фазе роста, составляют клетки с репликативными возрастами от 1 (дочерние клетки) до 5 рубцов (4 почечных рубца и один рубец рождения). В качестве первого из использованных нами стрессорных 7 воздействий мы выбрали кислотный стресс (180 мМ уксусной кислоты, при рН среды 3,5). Этот выбор обусловлен тем, что уксусная кислота может рассматриваться как физиологический индуктор стресса: известно, например, что она накапливается в культуре клеток дрожжей, находящейся в стационарной фазе роста. Мы показали, что наименее устойчивы к стрессу клетки с одним почечным рубцом (дочерние клетки) или клетки с более чем 5-ью рубцами (Рисунок 1). Возможно, такая зависимость объясняется тем, что у дочерних клеток соотношение поверхности к объему выше, чем у материнских, и это приводит к большим энергетическим затратам на поддержание ионной асимметрии на плазматической мембране. Таким образом снижаются затраты энергии на транскрипционный ответ клетки на стресс, что делает клетку более чувствительной. Снижение выживаемости клеток с 5-ью почечными рубцами и более, возможно, связано с тем, что в этих клетках после нескольких делений накопились факторы репликативного старения: экстрахромосомальные рибосмальные ДНК (экрДНК) и окисленные белки, которые в силу своей токсичности являлись дополнительным стрессом для клеток. Рисунок 1. Устойчивость клеток дрожжей дикого типа и штамма с делецией SIR2 к уксусной кислоте (180 мМ, рН = 3,5, 2 часа) в зависимости от репликативного возраста. Для того чтобы проверить предложенные гипотезы, объясняющие полученную нами зависимость стрессоустойчивости от репликативного возраста, мы получили 8 штамм с делетированным геном SIR2. Как известно, Sir2p участвует в формировании асимметрии между материнской и дочерней клетками: делеция SIR2 приводит к тому, что дочерние клетки наследуют карбонилированные белки (Aguilaniu et al., 2003), а материнские быстрее накапливают экрДНК. Однако делеция SIR2 приводит к снижению репликативной продолжительности жизни до 10-15 (Kaeberlein et al., 1999), т.е. не сказывается на выживаемости большей части культуры клеток. Однако, мы показали, что отсутствие Sir2p в стрессорных условиях приводит к тому, что выживание дочерних клеток (более 50% дрожжевой культуры) значительно снижается, в то время как выживаемость материнских повышается (Рисунок 1). Так как известно, что формирование асимметрии мать-дочка является актинзависимым, мы также решили проверить как будет влиять ингибитор полимеразации актина – цитохалазин Д – на выживаемость дочерних клеток. Мы показали, что действительно, ингибирование полимерзации актина приводит к такому же эффекту, что и делеция sir2 – дочерние клетки более чувствительны как к кислотному стрессу, так и к тепловому шоку. Таким образом, наши данные говорят о том, что система, поддерживающая асимметрию деления необходима для увеличения стрессоустойчивости дочерних клеток. Далее мы решили проверить нашу гипотезу о том, что дочерние клетки более чувствительны к стрессу из-за размера. Действительно, известно, что размер клеток с возрастом увеличивается. Однако полученное нами снижение стрессоустойчивости в возрастах от 3 до 5, видимо говорит о том, что фактор размера является определяющим лишь для дочерних клеток. Для поверки выдвинутой гипотезы, мы предварительно синхронизовали культуру клеток дрожжей нокодазолом (10 мкг/мл) в течение двух часов. Этим мы достигли того, что размер дочерних клеток при отделении от материнских был выше, чем в контроле. Затем мы отмыли нокодазол, подождали 15 минут до завершения клеточного цикла и поместили дрожжи на 47°С на 30 минут. Как видно из рисунка 2 синхронизация нокодазолом привела к увеличению стрессоустойчивости дочерних клеток по сравнению с асинхронной культурой, что подтверждает выдвинутую гипотезу. 9 Рисунок 2. Синхронизация культуры клеток нокодазолом приводит к увеличению стрессоустойчивости дочерних клеток. Затем мы решили проверить, будет ли сохраняться подобная зависимость выживания клеток от возраста при других стрессах. Согласно теста Краскала-Уоллиса, существует статистически достоверная разница в выживании клеток разных репликативных возрастов при стрессах, вызванных уксусной кислотой, тепловым и осмотическим шоком. Однако, если в качестве стресса использовать бутанол, менадион или этанол, то достоверного различия между клетками разных репликатвных возрастов нет. Способность клеток выкачивать пропидий йодид – это не единственный критерий стрессоустойчивости. Другим таким критерием является способность давать новую почку после стресса. Мы поставили следующий эксперимент: синхронизовали клетки нокодазолом, окрасили клеточную стенку конканавалином А, конъюгированным с флуоресцентным красителем, потом отмыли нокодазол, подождали 10 минут, чтобы клетки смогли завершить деление. После этого клетки подвергли мягкому стрессу – 42°С в течение 30 минут и поместили в нормальные условия (30°С). Через полтора часа мы окрасили клетки калькофлуором белым, а т.к. клеточная стенка синтезируется de novo, мы смогли отличить новообразовавшиеся дочерние клетки и посчитать почечные рубцы на материнских. Мы показали, что за это время наибольшую почку в среднем дали клетки возраста 2 (Рисунок 3). То, что клетки с возрастом 1 медленнее образуют почку в 10 данном эксперименте – ожидаемый результат, потому что известно, что первый клеточный цикл всегда длиннее последующих. Но столь раннее снижение стрессоустойчивости, выраженное в том, что клетки с возрастом 3-5 дали меньшую почку, чем клетки с возрастом 2, еще раз свидетельствует в пользу того, что снижение жизнеспособности клеток дрожжей с репликативным возрастом происходит раньше, чем принято считать. Рисунок 3. Образование новой почки после мягкого стресса (30 минут, 42°С) клетками дрожжей разных репликативных возрастов через 90 минут после стресса. Масштабная метка – 5 мкм. Характеристика изменений клеточных органелл S. cerevisiae в течение первых нескольких клеточных циклов Затем мы продолжили охарактеризовывать ранневозрастные изменения в клетках дрожжей. В 2011 году Лам и соавторы показали, что морфология митохондрий клеток дрожжей претерпевает серьезные изменения уже после 6-8 делений, и это связано с увеличением в клетках уровня различных АФК (Lam et al., 2011). Мы решили более подробно изучить этот феномен. Для этого мы окрасили клетки липофильным катионом 11 – тетраметилродамином, который копится в митохондриях в зависимости от потенциала. При этом клетки экспрессировали митохондриально-направленный GFP. Часть клеток имела ярко выраженную гетерогенную окраску по потенциалу (рисунок 4Б). При этом с возрастом доля таких клеток увеличивалась (рисунок 4А). Мы решили, что, возможно, именно дисфункция митохондрий приводит к раннему снижению стрессоустойчивости клеток дрожжей во время репликативного старения. А Б Рисунок 4. (А) Доля клеток с гетерогенным митохондриальным трансмембранным потенциалом в зависимости от возраста. Ожидаемое значение – это доля клеток с гетерогенной окраской TMR во всей культуре. Разница между ожидаемыми и полученными значениями достоверна по критерию хи-квадрат. (Б) Примеры клеток дрожжей с гетерогенной окраской по TMR. Масштабная метка – 5 мкм. Поиск генов, связанных с ранним снижением стрессоустойчивости клеток дрожжей Мы решили, что если есть гетерогенность по митохондриальному потенциалу, то часть митохондрий, возможно, функционирует неправильно. По этой причине мы решили проверить как делеция генов, влияющих на функцию митохондрий, будет 12 сказываться на выживаемости клеток дрожжей разных возрастных классов. В качестве таких генов мы выбрали RTG1 и RTG3 – гены ретроградной сигнализации, продукты которых активируются в том случае, если митохондрии функционируют неправильно. Действительно, старые клетки штамма Δrtg3 и Δrtg1 значимо менее устойчивы к тепловому шоку, чем дикий тип (Рисунок 5). Более того, ни делеция RTG1, ни делеция RTG3 не оказывала влияния на выживаемость репликативно молодых клеток. Получается, что старым клеткам в большей степени необходима система ретроградной сигнализации в условиях стресса. Рисунок 5. Зависимость от репликативного возраста выживаемости при тепловом шоке (47°С, 30 минут) клеток дрожжей с делецией генов ретроградной сигнализации RTG1 или RTG3. Мы также показали, что молодые клетки штамма Δmca1 (c делетированным геном дрожжевой метакаспазы) значительно устойчивее к уксусной кислоте, чем соответствующие клетки дикого типа. Этому могут быть следующие объяснения: (1) известно, что делеция метакаспазы приводит к задержкам в клеточном цикле, что, в свою очередь, приводит к увеличению размера клеток (Motizuki et al., 1995). Действительно, такой же эффект наблюдался при синхронизации клеток нокодазолом; (2) известно, что дрожжевая метакаспаза участвует в растворении белковых агрегатов, которые образуются в ходе жизнедеятельности клеток (Lee et al., 2010). Возможно делеция метакаспазы приводит к повышенному содержанию таких агрегатов в клетках, что 13 является мягким стрессом, не приводящим к гибели клеток, но активирующем другие защитные системы, т.е. является своего рода гормезисом (предварительным мягким стрессом), который, в свою очередь, и повышает устойчивость уже к более серьезному кислотному стрессу. В старых же клетках эффекта гормезиса (предадаптации) не наблюдается, видимо из-за того, что в силу асимметрии деления в них накопилось уже слишком много агрегатов белков, которые являются уже не мягким, а серьезным дополнительным стрессом вместе с уксусной кислотой. Мы решили проверить, действительно ли предварительный мягкий стресс будет повышать устойчивость репликативно молодых клеток, но не старых, к сильному стрессу. Для этого мы использовали прединкубацию клеток при 37°С в течение 30 минут, после чего клетки переносили на 47°С. Такой предварительный мягкий стресс положительно сказывался на выживаемости клеток всех возрастных классов, однако репликативно старые клетки не достигали того уровня выживаемости, которого достигали, например, дочерние (рисунок 6). Также мы подтвердили, что и в случае теплового шока делеция метакаспазы приводит к повышению выживаемости дочерних клеток и не оказывает достоверного влияния на более старые клетки. Рисунок 6. Зависимость выживаемости под действием теплового шока (47°С, 30 минут) от репликативного возраста клеток дрожжей: ● с делецией гена mca1; инкубировавшихся при 37°С, 30 мин; ▲ контрольных клеток. 14 ♦ клеток предварительно Исходя из наших данных можно сделать вывод о том, что старые клетки хуже приспособлены к такой смене условий, как резкая смена температуры, и это, возможно, связано с функциональным состоянием митохондрий. Предварительный мягкий тепловой шок – не единственный пример воздействия, которое способствует повышению устойчивости к последующему стрессу. Мы также показали, что обработка клеток дрожжей прооксидантами (менадион и додецилтрифенилфосфоний) приводит к увеличению стрессоустойчивости культуры клеток, подвергнутых воздействию метилметансульфоната (ММС, рисунок 7). Более того, ингибитор синтеза белка – актиномицин Д, отменял спасительный эффект прооксидантов на клетки дрожжей, что говорит о АФК-зависимом транскрипционном ответе клетки (Рисунок 7). В данном случае выживаемость измерена по колонияобразующим единицам (КОЕ). Рисунок 7. Зависимость выживаемости клеток дрожжей под действием 5 мМ ММС в присутствии прооксидантов (С12-ТРР 10 мкМ, менадион 5 мкМ) от наличия ингибитора синтеза белка актиномицина D (10 мкг/мл). *p-value < 0.05 при сравнении с соответствующей пробой без актиномицина. Способность к дифференцировке клеток дрожжей в зависимости от репликативного возраста Очевидно, выживаемость не является единственным параметром, который может характеризовать приспособленность клеток к перемене условий. Так, например, 15 известно, что если диплоидные клетки дрожжей поместить на бедную среду, содержащую только агар и ацетат калия, часть клеток будет образовывать споры. И мы решили проверить, будут ли различия между клетками дрожжей разных репликативных возрастов по способности образовывать споры. Для этого мы продержали на бедной среде диплоидные клетки дрожжей в течение трех дней и окрасили их калькофлуором белым. Во-первых, мы показали, что при такой окраске на споре сохраняются почечные рубцы, таким образом мы можем определить репликативный возраст соответствующей материнской клетки, образовавшей данную спору (Рисунок 12). Во-вторых, мы показали, что доля клеток, образовавших спору на бедной среде увеличивается с репликативным возрастом (Рисунок 8). Рисунок 8. Зависимость спорообразования диплоидными клетками дрожжей от репликативного возраста (слева), микрофотографии спор дрожжей, окрашенных калькофлуором белым (справа). Клетки растили 3 дня на KAc чашке. Масштабная метка – 5 мкм. *p-value < 0.05 согласно тесту Кендалла. Получается, что отсутствие питательных веществ в среде в большей степени сказывается на репликативно старых клетках. Это, с одной стороны, является еще одним 16 свидетельством того, что старые клетки хуже приспособлены к перемене условий. С другой стороны, спорообразование – это способ дифференцировки в ответ на изменение условий. Исходя из этого, можно предположить, что репликативное старение клеток – это не просто снижение выживаемости с увеличением числа пройденых делений, а возраст-зависимая дифференцировка клеток. Такая дифференцировка приводит к появлению групп клеток, по разному приспособленных к определенным условиям. Получение и описание штамма, в котором оротидин 5’-фосфат декарбоксилаза находится под контролем НО промотора Одним из важнейших следствий асимметрии деления является то, что в дочерней клетке дрожжей в течение первого клеточного цикла нет экспрессии эндонуклеазы НО, отвечающей за спонтанную смену типа спаривания. За это отвечают специальные транскрипционные факторы, специфично наследуемые дочерней клеткой, в частности Ash1p. В это же время в материнских клетках возможна экспрессия НО-эндонуклеазы. Чтобы охарактеризовать НО промотор, а также для того, чтобы создать условия для деления исключительно дочерних клеток (чтобы обогатить ими культуру), мы решили поставить ген URA3 под его контроль. URA3 кодирует оротидин 5’-фосфат декарбоксилазу – фермент, необходимый для биосинтеза урацила. URA3 используется как ауксотрофный маркер: без него клетки не будут расти на среде не содержащей урацила. Более того, данный маркер можно использовать и для негативной селекции: известно, что Ura3p конвертирует 5-фтор-оротовую кислоту (5-FOA, для клеток не токсичен) в токсичный для клеток 5-фтор-урацил. Мы получили штамм дрожжей HO-URA3, в котором в котором URA3 находится по контролем НО-промотора, т.е. не экспрессируется в дочерних клетках. Действительно, при росте на 5-FOA данный штамм образует нитевидные микроколонии (т.е. делятся в основном дочерние клетки), а на среде без урацила часть клеток образует округлые микроколонии (т.е. делятся в основном материнские клетки). В то же время W303 с ауксотрофией по урацилу образует обычные микроколонии на среде с 5-FOA и не растет 17 на среде без урацила, а W303 без такой ауксотрофии – наборот (Рисунок 13). Распределение количества клеток в микроколониях приведено на рисунке 9. Как видно из рисунка 9 часть клеток не делится и присутствует в группах из 1-4 клеток. Действительно, при росте на 5-FOA часть клеток штамма HO-URA3 будет материнскими клетками, в которых идет экспрессия с НО промотора. Часть же клеток, возможно, получили Ura3p в результате того, что данный белок за счет диффузии унаследовался дочерней клеткой, ведь экспрессия с НО промотора может начаться уже при прохождении второго клеточного цикла. Исходя из полученных результатов можно, видимо, сделать вывод о том, что (1) часть дочерних клеток не наследует достаточно Ura3p, чтобы при росте на 5-FOA был остановлен клеточный цикл, и поэтому продолжает делиться; (2) не во всех материнских клетках экспрессируется Ura3p с НО промотора, потому что не все колонии имеют полностью нитевидную морфологию – некоторые колонии «ветвятся» и содержат более 50 клеток уже после 18 часов роста на 5-FOA. 45 40 Доля (%) 35 30 W303 URA3 HO-URA3 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 > Клеток в микроколонии Рисунок 9. Распределение количества клеток в микроколонии при росте на среде с 5-FOA штаммов W303 URA3 и HO-URA3. 18 Если наша гипотеза верна, то при росте на 5-FOA культура клеток дрожжей штамма НО-URA3 должна обогатиться клетками с 1-2 рубцами. Для того, чтобы это проверить мы поместили клетки в жидкую среду с 5-FOA и без и посчитали распределение почечных рубцов в момент через 18 часов (при этом начальные концентрации клеток были выбраны так, чтобы на момент подсчета культура клеток находилась в экспоненциальной фазе роста). Мы показали, что в таких условиях происходит обогащение культуры клетками с двумя почечными рубцами (Рисунок 10). 60 Доля клеток (%) 50 40 HO-URA3 + 5-FOA 30 HO-URA3 20 10 0 1 2 3 4 ≥5 Рубцы Рисунок 10. Распределение репликативных возрастов при росте на среде с 5-FOA штамма HOURA3. Отличие возрастного распределения при добавлении 5-FOA от контроля достоверно согласно критерию хи-квадрат (p-value < 0,01). Обратив внимание на то, что часть материнских клеток, вероятно, продолжает делиться на среде с 5-FOA мы решили проверить не зависит ли вероятность того, что клетка продолжит деление в таких условиях, что означало бы пониженное содержание Ura3p в таких клетках, от репликатвиного возраста. Для этого мы синхронизовали клеточный цикл культуры клеток, используя (1) нокодазол (М фаза) или (2) дрожжевой ферромон альфа-фактор (G1 фаза), затем поместили клетки в среду, содержащую 5-FOA на 1 час, и посмотрели на то, клетки каких репликативных возрастов продолжили деление и дали почку. В качестве дополнительного контроля клетки во время 19 синхронизации были также окрашены FITC-ConA, а перед перемещением в среду с 5FOA FITC-ConA отмыли от клеток вместе с альфа-фактором или нокодазолом. Это было сделано для того, чтобы можно было определить именно новообразованные почки, потому что известно, что клеточная стенка дрожжей синтезируется de novo. Мы продемонстрировали, что в случае с синхронизацией нокодазолом, значительно чаще дают почки клетки с 4-5 рубцами. Вообще при такой синхронизации более корректно анализировать пары клеток (материнская клетка возраста 2 с дочерней, материнская клетка возраста 3 с дочерней и т.д.), потому что перед добавлением 5-FOA эти клетки имели общую цитоплазму, поэтому Ura3p скорее всего был распределен в парах равномерно, тем более, что синхронизация проводилась в течение двух часов. Поэтому мы проанализировали дочерние и материнские клетки по отдельности, причем дочерние разделили в зависимости от возраста материнской (Рисунок 11). Мы показали, что клетки с пятью и более рубцами образуют в среднем большую почку, чем клетки с 3 рубцами (Рисунок 11). Рисунок 11. Размер почки, образованной на среде с добавлением 5-FOA в течение одного часа, от репликативного возраста клеток дрожжей штамма HO-URA3, предварительно синхронизованных нокодазолом. Более того, дочерние клетки от клеток с пятью и более рубцами, исходя из графика, также давали большую почку, однако это различие не достигло статистической 20 достоверности, что, по-видимому, связано с тем, что первый клеточный цикл дрожжей дольше последующих по другим причинам (см. обзор литературы). Но эта тенденция свидетельствует в пользу того, что при такой синхронизации Ura3p наследуется равномерно между материнской и дочерней клетками. Полученный результат, возможно, также говорит о том, что в культуре клеток дрожжей активация НО промотора проходит не в равной степени между клетками разных репликативных возрастов: клетки с пятью и более рубцами, видимо, менее склонны к его активации. Cмена типа спаривания необходима для того, чтобы в гаплоидной культуре клеток дрожжей могли появиться диплоидные клетки, которые имеют ряд преимуществ перед гаплоидными. Возможно, полученный нами эффект объясняется тем, что при попадании споры на субстрат, богатый питательными веществами, и при отсутствии клеток противоположного типа спаривания, наиболее выгодной стратегией является быстрая диплоидизация культуры клеток. В качестве контроля мы решили повторить вышеописанный эксперимент, но в качестве агента, который синхронизует клетки использовать ферромон дрожжей – альфафактор. Дело в том, что, с одной стороны, обработка альфа-фактором в течение двух часов приводит к тому, что клетки синхронизуются в G1 стадии клеточного цикла, с другой стороны, известно, что в первый клеточный цикл после такой синхронизации отсутствует экспрессия НО (Nasmyth et al, 1987). Таким образом, полученный ранее эффект с синхронизацией нокодазолом должен отсутствовать при синхронизации альфа фактором. В данном случае нет необходимости анализировать пары клеток, потому что синхронизация проходит в G1 стадии клеточного цикла, поэтому мы их анализировали по отдельности. Действительно, достоверная разница между материнскими клетками (возраста 2-5) в данном эксперименте отсутствовала. При этом была обнаружена достоверная разница между дочерними клетками (возраст 1) и материнскими возраста 2, что, видимо, объясняется тем, что первый клеточный цикл дрожжей дольше последующих. Данные, приведенные на рисунках 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 получены соискателем самостоятельно. Данные полученные на рисунке 7 получены соискателем совместно со Смирновой Е. Данные полученные на рисунке 1 получены совместно с Кнорре Д. 21 ВЫВОДЫ 1) Система по поддержанию асимметрии деления пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae необходима для повышения устойчивости к стрессу дочерних клеток. Дочерние клетки менее устойчивы к стрессу, чем материнские, в силу своего меньшего размера. Делеция гена SIR2 приводит к ещё большему снижению стрессоустойчивости дочерних клеток. 2) Снижение устойчивости к стрессу материнских клеток дрожжей в ходе репликативного старения происходит уже после четвертого деления: клетки становятся менее устойчивы к тепловому и осмотическому шоку. Делеция генов, отвечающих за ретроградную сигнализацию, ещё больше снижает стрессоустойчовость клеток с более чем 4 рубцами. 3) Репликативно старые клетки значительно хуже приспособлены к смене условий, чем молодые. Предварительный мягкий стресс с меньшей эффективностью помогает репликативно старым клеткам при последующем сильном стрессе, и инкубация диплоидных клеток на бедной среде приводит к споруляции в первую очередь репликативно старых клеток. 4) Был получен штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в котором ген оротидин фосфат декарбоксилазы находится под контролем НО промотора. С помощью этого штамма было показано, что экспрессия НО снижена в клетках с более чем 4 рубцами. 22 СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ 1. Knorre D.A., Kulemzina I.A., Sorokin M.I., Kochmak S.A., Bocharova N.A., Sokolov S.S., Severin F.F. Sir2-dependent daughter-to-mother transport of the damaged proteins in yeast is required to prevent high stress sensitivity of the daughters // Cell Cycle. 2010. V. 9. P. 45014505. 2. Knorre D.A., Smirnova E.A., Markova O.V., Sorokin M.I., Severin F.F. Prooxidants prevent yeast cell death induced by genotoxic stress // Cell Biol Int. 2011. V. 35. P. 431-435. Статья в рецензируемом международном журнале Sorokin M.I., Knorre D.A., Severin F.F. Early manifestations of replicative aging in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Microbial Cell. 2014. V. 1. P. 37-42. Тезисы докладов 1. Сорокин М.И., Смирнова Е.А., Кнорре Д.А., Северин Ф.Ф. Прооксиданты предотвращает индуцированную генотокисческим стрессом гибель клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.// Биология - наука XXI века. 14 международная пущинская школа-конференция. Пущино (Россия). 2010. № 1. С. 61-62 2. Сорокин М.И. Прооксиданты предотвращают индуцированную генотоксическим стрессом гибель клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010». Москва (Россия). 2010. 3. Knorre D.A., Sorokin M.I., Severin F.F. Pattern of stress resistances of yeast cells depends on their replicative age. // Microbial stress from molecules to systems. Бельджирате (Италия). 2012. P. 104. 4. Knorre D.A., Sorokin M.I., Severin F.F. Replicative aging of yeast cells as possible mechanism of differentiation. // 9th International Meeting on Yeast Apoptosis. Рим (Италия). 2012. P. 43. 5. Сорокин М.И., Кнорре Д.А., Северин Ф.Ф. Функциональная асимметрия при клеточном делении Saccharomyces cerevisiae в условиях стресса. // Современная микология в России. Москва (Россия). 2012. № 3. С. 98. 23
