ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ «МИКРОГЕН»
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ «МИКРОГЕН» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ФИЛИАЛ В Г. ПЕРМЬ «ПЕРМСКОЕ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ «БИОМЕД» На правах рукописи РЕНЕВА Лариса Витальевна ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ДОНОРОВ В ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА ПЛАЗМЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук Волкова Л.В. Научный консультант доктор фармацевтических наук Орлова Е.В. Пермь–2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4 ВВЕДЕНИЕ 5 Глава 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Особенности иммунизации доноров при получения специфической плазмы 1.2. Состояние иммунитета у доноров плазмы при многократных плазмодачах 1.3. 1.4. 9 12 Обеспечение качества иммунной плазмы для фракционирования 20 Современные тенденции отбора доноров 26 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 30 Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У АКТИВНЫХ ДОНОРОВ ИММУННОЙ ПЛАЗМЫ ПРИ МНОГОКРАТНЫХ ПЛАЗМАФЕРЕЗАХ 3.1. Оценка активности специфического антителообразования у активных доноров плазмы иммунизированных вакциной против гепатита В 3.2. Оценка антителообразования, у активных доноров, иммунизированных столбнячным анатоксином для доноров 3.3. 45 52 Изучение активности специфического антителообразования у активных доноров плазмы, иммунизированных против клещевого энцефалита 65 Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У АКТИВНЫХ ДОНОРОВ ИММУННОЙ ПЛАЗМЫ ПРИ ИММУНИЗАЦИИ РАЗНЫМИ ВАКЦИНАМИ 4.1. Сравнительная оценка уровня антител к антигенам, использованных для вакцинации доноров 72 3 Глава 5. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ БЕЗОПАСНОСТИ И КАЧЕСТВА ПЛАЗМЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ 5.1. Иммунологические показатели и полимеразная цепная реакция у доноров как критерии вирусной безопасности иммунной плазмы 5.2. Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов венозной крови доноров 5.3. 90 Показатели общего белка и белковых фракций доноров иммунной плазмы 5.4. 82 93 Социологическая оценка кадрового потенциала активных доноров плазмы для фракционирования 106 ОБСУЖДЕНИЕ 118 ВЫВОДЫ 137 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 138 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 139 ПРИЛОЖЕНИЯ 162 4 СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ АГ – антиген АС – анатоксин столбнячный АТ – антитела ВВИГ – внутривенный иммуноглобулин ВМИГ – внутримышечный иммуноглобулин ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения ВГС – вирусный гепатит С ВГВ – вирусный гепатит В ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВКЭ – вирус клещевого энцефалита ГТИ – гемотрансмиссивные инфекции IgА – иммуноглобулин А IgМ – иммуноглобулин М IgG – иммуноглобулин G ИБ – иммунный блот ИЛ-1 – интерлейкин 1 ИЛ-2 – интерлейкин 2 ИЛ-6 – интерлейкин 6 ИФА – иммунноферментный анализ КЭ – клещевой энцефалит HBsAg –повехностный антиген вируса гепатита В ОТ – обратная транскрипция ОЦК – объем циркулирующей крови ПЦР – полимеразная цепная реакция РТГА – реакция торможения гемагглютинации ФНО – фактор некроза опухолей 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Разработка новых иммунобиологических препаратов и обеспечение их безопасности является одним из основных направлений деятельности Всемирной организации здравоохранения [133,222,226]. В настоящее время вопросам иммунного донорства для производства специфических иммуноглобулинов уделяется недостаточно внимания [45,125,140]. Появлению у доноров плазмы скрытых нарушений иммунной системы [46,50,64,65,66], сдвигов в функционировании различных систем организма, нарушений в электрокардиограмме [14], снижении тканевых запасов железа [48,68,69] способствует ухудшение экологической обстановки и экономическая нестабильность. В связи с тем, что оценка состояния иммунной системы доноров в процессе многократных донаций при использовании различных схем иммунизации является актуальной научной задачей, решение которой позволит обеспечить высокое качество донорской плазмы, предназначенной для последующего фракционирования с целью получения препаратов направленных иммуноглобулинов. Цель работы – исследование иммунологических показателей доноров плазмы, используемой в производстве специфических иммуноглобулинов. Задачи исследования 1. Изучить состояние поствакцинального иммунитета у активных доноров иммунной плазмы при многократных плазмаферезах. 2. Провести сравнительную оценку уровня антител к антигенам, использованных для вакцинации, и к посторонним вакцинным антигенам у доноров при иммунизации разными вакцинами. 3. Изучить иммунологические показатели безопасности и качества плазмы для получения специфических иммуноглобулинов. Научная новизна исследования. Впервые проведен комплексный анализ состояния поствакцинального иммунитета доноров плазмы, информативности иммунологических показателей безопасности и качества плазмы 6 для получения специфических иммуноглобулинов. Впервые определена эффективность используемых схем иммунизации при получении специфической плазмы для фракционирования. Показано, что при иммунизации доноров иммунный ответ развивается не только на антигенные детерминанты вводимой вакцины, но и увеличивается уровень антител к другим антигенам. Выявлен половой диморфизм иммунного ответа на столбнячный анатоксин и вакцину клещевого энцефалита, проявляющийся в более выраженном и длительном повышении уровня антител у женщин в сравнении с мужчинами. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление об общефизиологических закономерностях развития поствакцинального иммунитета. В результате проведенных исследований определены наиболее эффективные схемы иммунизации доноров различными видами вакцин и выявлены группы доноров с выраженным иммунным ответом на вакцинацию. Изучена динамика изменения иммунологических показателей доноров плазмы для фракционирования. Разработана и внедрена оптимальная схема отбора доноров для проведения иммунизации с последующими крово- и плазмодачами, апробации донорской крови и отбраковки донорской плазмы ненадлежащего качества, направленная на обеспечение безопасности иммунной донорской плазмы, используемой для производства иммуноглобулинов. На основе обобщения полученных материалов разработаны основные принципы оценки иммунологических показателей доноров плазмы для решения вопроса необходимости и целесообразности проведения иммунизации при получении иммунной донорской плазмы. В производственный процесс получения донорской плазмы для фракционирования внедрен алгоритм действий, направленный на обеспечение качества донорской плазмы при заготовке, карантинном хранении, разработанный лично автором, решены вопросы отбраковки сырья ненадлежащего качества для фракционирования иммунной плазмы. Разработана и внедрена схема отбора доноров для проведения иммунизаций в подразделении филиала ФГУП НПО 7 «Микроген» МЗ РФ в г. Пермь «Пермского НПО «Биомед», осуществляющего заготовку иммунной донорской плазмы. Основные положения, выносимые на защиту 1. Вакцинация доноров для получения иммунной донорской плазмы используемой при производстве специфических иммуноглобулинов должна проводиться с использованием стандартных схем иммунизаций, дающих в отличие от экстренных схем иммунизаций наиболее выраженный и длительный эффект. Существует половой диморфизм иммунного ответа на столбнячный анатоксин и вакцину клещевого энцефалита, проявляющийся в более выраженном и длительном повышении уровня антител у женщин в сравнении с мужчинами. 2. У доноров с низким уровнем антителопродукции целесообразно проведение новых иммунизаций другими видами вакцин. При иммунизации доноров иммунный ответ развивается не только на антигенные детерминанты вводимой вакцины, но и увеличивается уровень антител к другим антигенам. 3. Для обеспечения безопасности и качества донорской плазмы, используемой для производства препаратов крови человека, необходим единый алгоритм действий по решению вопроса о допуске доноров к крово и плазмодаче, включающий апробацию крови с применением современных тест-систем, эпидемиологическое наблюдение за донорами в процессе карантинизации и отбраковке плазмы ненадлежащего качества. Апробация работы и основные публикации. Основные положения работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», Киров, 2010; XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2010; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010 «Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2010; XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2011; ХIII региональной научно-практической конференции студентов и мо- 8 лодых ученых «Химия. Экология. Биотехнология-2011», Пермь, 2011; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», Москва 2011; Всероссийской научнопрактической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», Киров 2012; ХIV региональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Химия. Экология. Биотехнология-2012», Пермь 2012; Х международной научно-практической конференции «Актуальные научные достижения», Прага, 2014; Х международной научно-практической конференции «Перспективы мировой науки», Шеффилд, 2014. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 5 статей в научных журналах, рекомендуемых ВАК РФ. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 163 стр. машинописного текста, содержит 34 таблицы и 25 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 240 источника, из них 158 отечественных и 82 зарубежных. 9 ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Особенности иммунизации доноров, при получении специфической плазмы Еще в первом тысячелетии до нашей эры в Китае был успешно использован метод защиты от оспы путем переноса содержимого оспенных пустул от больных оспой здоровым людям (вариоляция). Этот метод профилактики оспы успешно использовался в Индии, Малой Азии. В конце 18 века Э. Дженнером был введен метод вакцинации - использование возбудителя с невысокой степенью патогенности (коровьей оспы) для создания устойчивости к заражению возбудителем высокой степени патогенности (вирус натуральной оспы) [190]. Во второй половине 19 века Л. Пастер сформулировал идею специфичности действия различных возбудителей, которые являются причиной, а не следствием возникновения различных инфекций и разработал метод аттенуации патогенных свойств микробов с сохранением высокой степени иммуногенности для производства различных видов вакцин [213,214]. В 1886 г. Ценковский с сотрудниками разработал оригинальный метод получения сибиреязвенной вакцины. В России, начиная с 1886 г., были открыты шесть пастеровских станций, которые занимались массовой вакцинацией среди населения, что привело к снижению смертности от инфекционных заболеваний, в том числе от бешенства до 1,1%. С этого времени в России началось развитие вакцинологии как науки в России [99]. Создание активного иммунитета формирующегося в процессе вакцинации, имело большое значение в предотвращении вспышек инфекционных заболеваний, но существовали случаи, при которых использование вакцин не представлялось возможным. В 1890 г. Э. фон Беринг и С. Кизато впервые показали, что сыворотка мышей, иммунизированных столбнячным токсином, может защитить животных от смертельной дозы токсина [163]. В 1891 г., в клинике Берлинского университета, умирающему от дифтерии мальчику впервые была введена антидифтерийная сыворотка, в результате чего мальчик был спасен. А уже через 10 лет после от- 10 крытия сделанного Китозато, в 1900 г., в бактериологической лаборатории г. Пермь, позже преобразованной в бактериологический институт, В. М. Здравосмыслов изготовил первую серию противодифтерийной лошадиной сыворотки, с 1908 г. начался выпуск противоскарлатинозной и противохолерной вакцины с 1911 г. — противодизентерийной вакцины. Лечение больных с помощью иммунных сывороток было крупнейшим достижением прикладной иммунологии, которое определило разработку теоретических основ создания пассивного иммунитета [227]. К сожалению, в полном объеме реализовать потенциальные научные возможности по разработке и производству, как вакцин, так и иммунных сывороток в России удалось лишь в 60-х годах двадцатого века [99,149]. Применение иммунных сывороток с профилактической и лечебной целью получило название - серопрофилактики и серотерапии. В настоящее время увеличение числа вирусных заболеваний, различных осложнений инфекционного происхождения, снижение чувствительности возбудителей к антибактериальной терапии ведет к увеличению потребности в препаратах донорской крови, особенно в препаратах специфических иммуноглобулинов [3,8,9,11,41,51,67,87,88,90,91,2007]. Потребность фармацевтического рынка и практического здравоохранения в препаратах иммуноглобулинов постоянно увеличивается, а сырьевая база для их производства имеет тенденцию к снижению, и как следствие развивается дефицит в препаратах крови человека. [12,34,36,41,43,127]. Потребность отечественного здравоохранения в препаратах специфических иммуноглобулинов столь высока, что не может быть удовлетворена только за счет заготовки иммунной плазмы путем выявления доноров с «естественно» высоким содержанием антибактериальных и противовирусных антител [5,7,49]. Проведение иммунизации населения Российской Федерации в соответствии с календарем профилактических прививок, обеспечивая образование специфического, протективного иммунитета пациента, не решает в полной мере вопроса обеспечения сырьем для производства специфических иммуноглобулинов из плазмы таких доноров. Так при прове- 11 дении иммунизации против клещевого энцефалита, титр АТ к вирусу клещевого энцефалиту (ВКЭ) обеспечивающий защиту должен быть не менее 1:10, а титр АТ у донора, плазма которого может быть использована для производства иммуноглобулина против клещевого энцефалита, должен быть не менее 1:20. Защитным титром АТ от ВГВ после проведенной вакцинации считается титр не менее 0,01 МЕ/мл, в плазме же доноров, которую используют для производства иммуноглобулина от гепатита В должно содержаться не менее 1,0 МЕ/мл т. е. в сто раз больше [106]. Встает вопрос необходимости проведения иммунизации доноров с целью получения иммуноглобулинов направленного действия. В настоящее время разработаны и утверждены несколько специальных схем иммунизаций некоторыми видами вакцин для доноров с целью выработки у них высокого уровня специфических АТ, для того чтобы плазму таких доноров можно было использовать для производства специфических иммуноглобулинов. Для иммунизации доноров используют: Анатоксин столбнячный очищенный адсорбированный жидкий для доноров (АС-анатоксин для доноров) в 1 дозе (1,0 мл) содержащий 40 ЕС столбнячного анатоксина. Вакцина вводится однократно. Интервалы между иммунизациями не менее пяти лет [60]. Вакцину клещевого энцефалита культуральную очищенную концентрированную инактивированную сорбированную суспензию для внутримышечного (в/м) введения. Вакцинация доноров проводится по различным схемам, экстренным и профилактическим [61]. Анатоксин стафилококковый очищенный адсорбированный, суспензия для подкожного (п/к) введения. Курс иммунизации доноров состоит из трех инъекций с интервалом 7 дней, 1 я инъекция - 0 день, вводится 2 дозы анатоксина (1,0 мл), 2 я инъекция проводится через 7 дней после первой, вво- дится 2 дозы анатоксина (1,0 мл), 3я инъекция проводится через 7 дней после второй, вводится 4 дозы анатоксина (2,0 мл). Суммарное количество препарата, вводимое донору за полный цикл иммунизации 4,0 мл (8 доз). Причем, 12 только иммунизация АС-анатоксином для доноров проводится однократно, при иммунизации вакциной КЭ схема иммунизации предусматривает трехкратное введение вакцины с интервалами 0-1-2 месяца с последующей ревакцинацией через год после введения последней дозы вакцины и отдаленные иммунизации, которые проводятся каждые три года. Иммунизация стафилококковым анатоксином предусматривает трехкратное введение анатоксина с интервалами 7 дней [59]. Схем иммунизаций вакциной гепатита В доноров, с целью производства специфического иммуноглобулина против гепатита В не разработано, поэтому для производства специфического иммуноглобулина против гепатита В используют утвержденные МЗ РФ профилактические схемы иммунизации [62]. В связи с вышеизложенным, представляется актуальным исследование антителопродукции, длительности и напряженности поствакцинального иммунитета при иммунизации доноров плазмы для фракционирования различными вакцинами, с использованием различных схем иммунизации доноров. Сравнение активности антителопродукции у доноров, в зависимости от схемы вакцинации с целью определения методов отбора доноров для намеренной иммунизации с учетом потенциальной иммунологической реактивности индивида. Отстранение от иммунизации лиц, ареактивных к определенному антигену, предотвращает неоправданную антигенную (АГ) нагрузку на их организм, сокращает нецелесообразные материальные затраты на проведение иммунизаций. 1.2. Состояние иммунитета у доноров плазмы при многократных плазмодачах Большая потребность современной медицины в специфических препаратах иммуноглобулинов требует разработки новых методов иммунизации, изучения вопроса реактивности донорства, увеличения сроков иммунологической напряженности организма, а следовательно, и повышения специфической активности гипериммунной плазмы для производства специфический 13 иммуноглобулинов [98]. Общефизиологические закономерности функционирования иммунной системы, по которым развивается динамика первичного и вторичного иммунного ответа клеток иммунной системы, сформулированная академиком Здродовским, включает четыре закона: закон силы, закон конкуренции, закон интервалов, закон суммации раздражений [152]. Закон силы звучит: чем больше доза АГ, тем выше титр АТ и больше эффекторных клеток в иммуногеном диапазоне доз. На сверхбольшие дозы АГ формируется, впервые описанная Фелтоном, приобретенная иммунологическая толерантность высокой зоны. Закон конкуренции антигенов: при одновременном взаимодействии нескольких АГ иммунный ответ возникает только на тот, который является оптимальным АГ раздражителем, на остальные АГ ответ слабее. Закон интервалов, говорит о необходимости использования оптимальных интервалов между повторными инъекциями АГ для получения наиболее высокого иммунного ответа при вакцинации. Закон суммации раздражений: чем больше инъекций, тем выше титры АТ. Иммунный ответ при вакцинации обусловлен генетическими факторами, а также реакцией на антиген лимфоидных клеток [30,54,97,99,122,149,152]. В основе вакцинации лежит иммунологический феномен, называемый иммунологической памятью - это способность иммунной системы к ответу более быстрому и эффективному на антиген, с которым организм встречался ранее. Этот ответ, который также называется вторичным, третичным и т.д., зависит от количества вводимого антигена и отличается от первичного ответа. Этот феномен используется во всех программах вакцинации, когда формируется длительно живущая популяция специализированных лимфоцитов памяти, либо имеется персистенция непосредственно уровня антигена, который продолжает рестимулировать АГ- специфические лимфоциты [99,122,150,156]. Известно, что иммунный ответ запускается сразу после введения АГ, но выявить его можно только спустя определенный латентный период. В крови антитела появляются через 7-10 суток. Первичный иммунный ответ 14 характеризуется в ранней фазе преимущественной продукцией иммуноглоулинов (Ig) М обычно они проявляют низкое сродство к антигену, в более поздний период доминирующий изотип антител, продуцируемый в раннем вторичном и последующих ответах, - это IgG, в некоторых случаях IgA и IgE, проявляющие высокое сродство к антигену. Эти антитела продуцируются Вклетками, которые уже переключились с продукции IgM на более зрелые изотипы и экспрессируют IgG, IgA, или IgE на их поверхности так же хорошо, как и высокий уровень молекул МНС класса II. Это позволяет В-клеткам памяти инициировать их взаимодействие со зрелыми Т-хелперами даже при низких дозах антигена [150,152]. Переход от синтеза IgM к синтезу IgG регулируется Т-хелперами, лимфоцитами CD4. К Т-независимым антигенам антитела класса IgG практически не вырабатываются. У некоторых людей антитела не вырабатываются даже после многократной вакцинации. Это состояние известно как первичная вакцинальная недостаточность. Возможно, причина кроется в отсутствии у молекул HLA класса II участков, распознающих данный антиген. При повторном введении антигена иммунный ответ значительно усиливается - за счет клеточного и гуморального иммунитета. Число В-клеток, которые могут отвечать на антиген, увеличивается после прайминга в 5-10 раз, а продуцируемые антитела имеют более высокий аффинитет. Он опосредуется клетками памяти, образовавшимися после первого контакта с антигеном, и характеризуется интенсивной пролиферацией В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Конъюгация с белками превращает полисахариды в Т-зависимые антигены и, следовательно, приводит к образованию клеток памяти при первом контакте с антигеном и усилению иммунного ответа - при повторном. Вторичный иммунный ответ развивается быстро, обычно в течение 4-5 сут, и сопровождается резким повышением титра IgG. Следовательно, бустерная (повторная) иммунизация приводит к синтезу антител с более высоким аффинитетом [99,149,152]. Формирование иммунного ответа на вакцины, по сути, имитирует, естественно, инфекционный процесс и представлено следующими этапами: 15 - захват макрофагами антигенов вакцин, расщепление и представление на клеточной поверхности эпитопов антигенов в комплексе с молекулами МНС класса I и II; - распознование антигенов специфическими Т- и В-лимфоцитами; - активация, дифференцирование и пролиферация Т-клеток: появление регуляторных (Th1, Th2), эффекторных (СД8 - цитотоксические) и Т-клеток памяти; - активация, дифференцирование В-клеток и образование антителопродуцирующих плазматических клеток и В-лимфоцитов памяти; - синтез специфических антител. Образование специфических антител характеризуется 3-мя периодами: Латентный - от введения вакцины до появления выявляемых антител в сыворотке крови составляет от нескольких суток до 2-х недель в зависимости от физико-химических свойств, формы выпуска, дозы, способа введения вакцины и особенностей иммунной системы вакцинируемого; Фаза роста - экспоненциальное увеличение количества АТ в сыворотке крови. Продолжительность - от 4-х дней до 4-х недель. В ответ на столбнячный анатоксин этот период может составить 3 недели, на инактивированные бактериальные вакцины (например, коклюшная) - 2 недели. Фаза снижения - после достижения максимального титра АТ происходит снижение, причем сначала относительно быстро, затем медленно в течение нескольких лет или десятилетий. Длительность фазы снижения зависит от соотношения скорости синтеза антител и их полураспада; так, уровень Ig M-антител снижается быстрее, чем IgG-антител. Когда снижение уровня протективных антител достигает критического, возможно появление заболевания при контакте с инфекцией [30,31,58,105,152]. Это, в свою очередь, требует проведения буферных вакцинаций, ревакцинаций, против таких инфекцией как коклюш, дифтерия, столбняк. Для защиты от некоторых инфекций достаточно очень низких концентраций антител в крови, для защиты от столбняка и гепатита В, достаточно, чтобы концентрация АТ составляла 16 0,01 МЕ/мл, но для производства специфических иммуноглобулинов необходимо, чтобы в крови доноров концентрация АТ была в сто раз выше. Проведенные клинические исследования показали, что в комплексной иммунологической защите организма важное место принадлежит клеточным и гуморальным факторам иммунитета. Доноры, дающие выраженный иммунный ответ на введение антигена, имеют определенные особенности иммунного состояния [104]. Поэтому изучение вопросов взаимосвязи показателей клеточного и гуморального иммунитета с силой иммунного ответа, а также применение иммунологических тестов для отбора лиц на иммунизацию и плазмаферез способствуют рациональному использованию донорских кадров. [49,104,154153]. Вопросам проведения иммунизации доноров с целью выработки у них высокого уровня специфических АТ в зависимости от используемой вакцины, отбора лиц с прогнозируемым достаточным иммунным ответом на проведенную вакцинацию, уделялось большое внимание в восьмидесятых, девяностых годах двадцатого века [49,154]. Проведены исследования по прогнозированию иммунного ответа доноров на вакцину клещевого энцефалита, для отбора активных продуцентов специфических АТ путем определения HLAфенотипа, при комплексной оценке группы крови, резус-фактора, учитывая возраст и пол донора. Иммунный ответ на вакцину клещевого энцефалита прогнозируют на основании значения интегрального показателя активности АТ продукции. Активный иммунный ответ доноров на вакцину против КЭ ассоциирован с антигенами A3, В7, В14 и сочетаниями антигенов А3-В7, A3В15; слабый иммунный ответ - с антигенами А19, В13 и В40 и сочетаниями антигенов В13-В27, А2-В13, А9-В13, А9-В40, A11-B15, А19-В13 [107]. Проведен целый ряд исследований по определению потенциальной иммунологической реактивности индивида на стафилококковый и столбнячный анатоксины при комплектовании групп иммунных доноров [45]. Способ основан на выявлении ассоциативной связи способности индивида к специфической антителопродукции с наличием в его фенотипе определенных тканевых анти- 17 генов [49,107,153]. Данные методы основаны на комплексной оценке ряда показателей, таких как: группа крови, резус-фактор, возраст и пол донора и фенотип определенных тканевых антигенов (HLA-фенотипом). Проведены исследования по изучению влияние вакцины против гепатита В, на изменение показателей иммунного статуса в ближайшие и отдаленные периоды у здоровых подростков и у подростков, с аллергически измененной реактивностью и с рецидивирующими заболеваниями при использовании трехкратной иммунизации по стандартной схеме [101], где были выявлены лишь транзиторные фазовые изменения иммунологических параметров, находящиеся в пределах возрастных колебаний нормы и не приводящие к усугублению имеющихся исходных отклонений (кратковременное повышение уровня общего IgE в 2 раза), которое не отражается на частоте поствакцинальных реакций в этот период, не сопровождается увеличением степени сенсибилизации к неинфекционным аллергенам и обострением аллергического процесса и не оказывает негативного влияния на процессы перекисного окисления липидов. Изучения изменения иммунологических параметров доноров при иммунизации вакциной против гепатита В не проводилось. До сих пор не проводились исследования по сравнительной оценке уровня антител к антигенам, использованных для вакцинации, и к посторонним вакцинным антигенам у доноров при иммунизации разными вакцинами, что является весьма важным в решении вопроса новых иммунизаций доноров с целью получения специфических иммуноглобулинов, поскольку снижение антителопродукции ранее иммунизированных, активных доноров плазмы, происходит раньше, чем в соответствии с инструкцией по применению вакцин может проводиться ревакцинация. В многочисленных экспериментальных работах, выполненных под руководством проф. Сидоровой Е.В. в 1986 г., при исследовании на мышах, было доказано, что введение в организм животного различных АГ (корпускулярных, растворимых, белковых, полисахаридных) на ряду с индукцией синтеза АТ приводит к появлению неспецифических иммуноглобулинов, не реагирующих с введенном АГ, что позволило заключить, что фе- 18 номен образования данных антиген зависимых белков является общей характеристикой гуморального иммунного ответа [2,95,96,159]. Универсальность процесса образования АГ независимых неспецифических иммуноглобулинов, позволило предположить, что они играют определенную роль в иммунном ответе. Изучение механизмов образования АГ независимых неспецифических иммуноглобулинов у людей, иммунизированных разного рода вакцинами до настоящего времени не проводилось. В настоящее время в связи с введение нового понятия плазма для фракционирования и донор плазмы для фракционирования [118], определение групповой и резус принадлежности донорам плазмы для фракционирования не является обязательным, а уж тем более фенотипирование тканевых антигенов. Проведение фенотипирования является весьма дорогостоящей процедурой и скажется на себестоимости препаратов специфических иммуноглобулинов. Поэтому встает вопрос о прогнозировании потенциально высокой иммунологической реактивности донора на разные виды вакцин, с применением наиболее эффективных схем иммунизаций, с учетом проведения регламентированных Приказами МЗ РФ [118] методов исследования для доноров плазмы для фракционирования. Любая процедура, будь то донация крови, или плазмы оказывает влияние на иммунную систему доноров, приводит к изменениям в составе иммунокомпетентных клеток и других параметров иммунитета [46,47,64,155], другое дело, что эти изменения носят транзиторный характер, и как правило, нормализуются к следующей донации крови или плазмы, но в то же время, содержание некоторых субпопуляций лимфоцитов не восстанавливается к моменту следующей кроводачи [167]. Но у активных, постоянных доноров крови имеющих более трех донаций крови в год, и особенно доноров плазмы, имеющих до двадцати донаций плазмы в год, могут возникать изменения иммунологических показателей носящие длительный характер [64,78,187,199]. Особенно в последнее время, при сложившейся довольно сложной социально-экономической ситуации в стране, которая привела к из- 19 менению в структуре донорских кадров. На фоне снижения общего числа доноров и увеличения количества платных доноров, так как все чаще основным мотивом донорства становится материальный фактор [75,76,77,161,234,236]. При этом, как показали социологические исследования, сложившиеся условия способствовали привлечению к донорству лиц с повышенным риском заболеваемости [33,37,39,75,76,161,191,228]. Углубленные исследования перед кроводачей позволили выявить у доноров сдвиги в функционировании различных систем организма: снижение тканевых запасов железа, снижение содержания гемоглобина в крови потенциальных доноров, частота отводов по указанной причине составляет, по данным отечественных и зарубежных исследователей, от 1,25-1,9% до 8,6% и достигает 33-36% в общей структуре медицинских отводов [48,68,69,81,89,137,147]. Нарушения в электрокардиограмме [14]. Есть сведения об угнетении отдельных факторов иммунологической защиты у доноров [29, 47,50,68,179,187], однако этой проблеме в литературе уделяется мало внимания. Между тем, массовые иммунологические исследования, проведенные сотрудниками института иммунологии под руководством академика Петрова в 1995, показали, что скрытые иммунодефицитные состояния и иммунные нарушения весьма широко распространены среди населения. Считается, что этому способствует не только ухудшающаяся экологическая обстановка, но и нестабильность социально-экономической ситуации в стране. Можно полагать поэтому, что и среди доноров существует определенная часть людей со скрытыми (компенсированными) нарушениями иммунной системы [161,179,187,217]. Относительно влияния на систему иммунитета донора многократных и длительных эксфузий крови и ее компонентов нет однозначного мнения. С одной стороны, доказывается безвредность многократного и длительного участия в донорстве [64,81,179,187,217]. С другой стороны, у части доноров крови обнаруживается, например, значительное снижение окислительного метаболизма нейтрофилов [131,217], отклонения в содержании иммуноглобулинов (Ig) [64,72]. Приводятся данные о существенных сдвигах отдельных иммунологических показателей у доноров, 20 длительно подвергающихся процедурам плазмафереза (ПФ). Выявлена тенденция к снижению параметров, характеризующих клеточное звено иммунитета и неспецифическую резистентность организма здоровых людей, за последнее десятилетие [46,48,50,205,217]. К числу факторов повышающих риск развития иммунной недостаточности у доноров относятся: возраст старше 50 лет, воздействие профессиональных вредностей, отсутствие постоянного заработка, регулярные (более 6 раз в течение года) 2-х и 3-х кратные тромбоцитаферезы при которых изменения в иммунограмме наблюдаются значительно чаще, чем у доноров крови и неиммунной плазмы [64,65,81]. Таким образом, изучение состояния системы иммунитета у доноров имеющих многократные донации, разработка методов реабилитации доноров с целью возвращения их в активное донорство имеет первоочередное значение в сохранении донорского потенциала страны. Обеспечение качества иммунной плазмы для фракционирования 1.3. Для биологических медицинских препаратов, получаемых из крови или плазмы человека, исходным материалом являются клетки крови и жидкая часть крови – плазма, поэтому вопрос безопасности лекарственных средств, получаемых из крови или плазмы человека весьма актуален, с 1940-х гг. и на всем протяжении производства и применения компонентов крови, эритроцитарной массы и плазмы стоит весьма остро [11,12,22,23,24,35,37,39,80,82,83,86,103,109,110,123,125,130,138,139,142,168,1 70,172,178,180,186]. Основным сырьем для получения препаратов иммуноглобулинов является плазма для фракционирования, представляющая собой жидкую часть крови из индивидуальных порций, отделенную от форменных элементов центрифугированием или методом плазмафереза в присутствии антикоагулянта, полученную от здоровых доноров, прошедших процедуру карантинизации, и предназначенную для объединения в производственный пул [148,139]. Являясь уникальной биологической субстанцией – живой тканью человеческого организма, плазма крови доноров может содержать раз- 21 личные инфекционные агенты, наиболее опасными из которых признаны бактерии и вирусы. В ходе технологической переработки бактериальное загрязнение легко устраняется, а вирусы, относящиеся к наноструктурам, могут проникать в полупродукты и готовые препараты [55,130,160,169,231,225,233]. Ведущее место среди современных микроорганизмов передающихся гемотрансмиссивным путем занимают вирусы. К наиболее опасным гемотрансмиссивным инфекциям (ГТИ) относят СПИД, вирусные гепатиты С и В [16,80,170,187,239]. В последние годы ухудшение эпидемической ситуации в отношении основных гемотрансмиссивных вирусов, появление новых инфекционных агентов обострили проблему вирусной безопасности препаратов из плазмы крови доноров [33,37,82,106,124,125,146,161,166,189]. Поскольку качество препаратов крови человека определяется всеми этапами производства, от сбора исходного материала крови или плазмы, в т.ч. отбора доноров, качеством контейнеров для сбора крови/плазмы, наборов реактивов для тестов до хранения, транспортирования, процесса переработки, контроля качества и доставки готовой продукции, все операции должны выполняться в соответствии с принятой системой обеспечения качества и требованиями [25,26,102,119]. В сфере здравоохранения одним из первых был создан Технический регламент, посвященный безопасности крови и ее продуктов - «Технический регламент о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно - инфузионной терапии» [112,130]. Одним из главных требований, отечественной и мировой службы крови в последние годы, являются меры по повышению вирусной безопасности препаратов из крови и еѐ компонентов [106,120,130]. Законом РФ обеспечение безопасности донорской крови и ее компонентов, определено в качестве вида основной деятельности организаций службы крови [114,144]. Вопросы обеспечения безопасности сырья при организации производства переработки плазмы и производства препаратов крови являются особенно актуальным. Первый этап безопасности плазмы для фракционирования 22 обеспечивается при заготовке ее от доноров и включает отбор доноров, карантинизацию и исследование на маркеры вирусных инфекций в учреждениях Службы крови. Обязательными тестами при заготовке плазмы крови от доноров являются определение НВsAg, антител к ВГС, антител и антигена р24 к ВИЧ [25,55,102,112,118]. Случаи инфицирования пациентов вирусом гепатита С (ВГС) после применения препаратов ВВИГ привели к активизации исследований, направленных на разработку новых методологических и технологических подходов к повышению вирусной безопасности препаратов [55,123,138,193]. Материальная заинтересованность привела к участию в донорстве малообеспеченных лиц, которые пытаются утаить перенесенные заболевания и реальное состояние здоровья [75,76,154,164,165,191,197,224], что способствует увеличению абсолютного брака крови, а следовательно, и риску передачи вирусных инфекций с препаратами крови человека. Все это диктует необходимость разработки и внедрения в службе крови, как новых методов обследования доноров, так и адекватных организационных мероприятий [166]. В последние годы возникли трудности, связанные с резким ростом выявляемых ГТИ, гепатита В и С, СПИДа, сифилиса [24,169,170,189,191,194,195,196,198,224,237]. Известно, что доноры крови подвержены риску заражения инфекционными агентами пропорционально распространенности заболевания среди населения страны, поэтому изучение ГТИ важно для прогнозирования отвода от донорства. Одним из факторов повышенного риска передачи ГТИ являются, по мнению ряда авторов, первичные доноры – как правило, люди более молодого возраста [121,138,171,178]. Поэтому является необходимым изучение выявляемости маркеров ГТИ у активных доноров, постоянно сдающих кровь более трех раз в год, и у лиц, впервые обратившихся для дачи крови [171]. Порядок медицинского обследования доноров крови и ее компонентов определяет необходимость скрининга при каждой донации поверхностного антигена вируса гепатита В, антител к вирусу гепатита С, ВИЧ-1, ВИЧ-2, си- 23 филису [118]. Алгоритм диагностики ВИЧ- инфекции так же оговорен в нормативных документах и предполагает проведение первичной лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции с помощью иммуноферментных (ИФ) тестсистем, выявляющих одновременно антиген и антитела к ВИЧ, проведение подтверждения полученных положительных результатов исследования, и постановку окончательного лабораторного анализа методом иммунного блота (ИБ) [116]. Диагностика наличия HBsAg и антител к гепатиту С, предусматривает обязательное использование подтверждающих тестов [117]. HBsAg является наиболее значимым серологическим маркером острого и хронического ВГВ, выявление которого свидетельствует с высокой степенью вероятности о присутствии вируса в крови [6,22,23,82,176,201,232]. У некоторых больных после острого ВГВ с самостоятельным разрешением и даже после успешно проведенного противовирусного лечения, а также при хроническом ВГВ может наблюдаться «молчащая» инфекция [138]. Установлено, что она представляет клиническую форму ГВ, способную передаваться через компоненты крови, а диагностика ее основывается на тщательном сборе анамнеза и применении высокочувствительного метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения вирусной ДНК [138,145,193]. Считают, что отрицательные результаты при детекции HBsAg у больных ВГВ могут быть вызваны низким уровнем HBsAg, образованием иммунных комплексов, а также мутациями вируса в S-регионе [123,138,186,193,194,203]. В настоящее время к факторам, способным поддерживать персистенцию вируса в крови при «молчащей» инфекции, относят инфицирование вирусом ГВ моноцитов крови, формирование иммунных комплексов с антителами, ослабленный иммунитет и коинфекцию [193,194]. В свете данных литературы [186,204] можно заключить, что среди доноров, в крови которых не выявляют HBsAg, встречаются случаи инфекции ВГВ [235]. Известно, что при ВГС специфические антитела появляются в среднем через 10-12 недель от момента заражения, а в некоторых случаях сроки их появления могут отодвигаться до 30-50 недель [23,240]. Поэтому при исследовании методами ИФА образ- 24 цов крови, взятой от донора с ранней стадией ВГС, когда АТ еще не выявляются (период, так называемого, «серонегативного окна»), получают, как правило, ложноотрицательный результат. В то же время именно в этот период ВГС наблюдается, выраженная виремия [22,23,70,132,240] и связанная с ней высокая «инфекционная способность» инфицированной крови [23,132,235]. В связи с этим компоненты крови, заготовленные от донора, находящегося в периоде «серонегативного окна», могут являться основным источником заражения реципиента ВГС при гемотрансфузии и применении препаратов крови человека [188,202,235,240]. В связи с высокой частотой заражения реципиентов ВГС при применении внутривенных (в/в) препаратов иммуноглобулинов в 1994 году, необходимость гарантии вирусной безопасности донорской крови и ее препаратов, побудила к введению дополнительных методов исследовании [212,216]. Молекулярно-генетические методы получили широкое распространение в генодиагностике возбудителей наиболее значимых ГТИ: ВИЧ, вирусов гепатитов В и С [172,180,189,195,200]. Одним из наиболее эффективных и достоверных способов обнаружения вирусных нуклеиновых кислот является ПЦР с детекцией флуоресценции в реальном времени. Использование NAT-технологий, в частности метода ПЦР, позволяет выявить РНК ВГС в крови уже через 10-12 дней после заражения, т.е. приблизительно за 60 дней до выявления в ней антител к ВГС серологическими тестами, ДНК ВГВ - через 20-30 дней, а РНК ВИЧ - через 11 дней [168,170,224,229,240]. Таким образом, показано, что скрининг образцов донорской крови с применением ПЦР - тестирования для выявления вирусной РНК (ДНК) позволит снизить риск посттрансфузионной передачи вирусных гепатитов В и С, за счет выявления инфицированных доноров, находящихся в периоде серонегативного окна и доноров с молчащей формой инфекции [145,169,189,218,229,235,238]. Алгоритм апробации донорской крови, при котором скрининг образцов методом ПЦР проводят одновременно с исследованием их в серологических тестах, позволяет не толь- 25 ко повысить инфекционную безопасность препаратов крови человека, но и сократить промежуток времени от момента забора крови до выдачи ее в лечебные учреждения, что особенно важно для сохранения компонентов с ограниченным сроком годности [130]. Один из методов обеспечения вирусологической безопасности препаратов из крови доноров (донорской плазмы) получил название - карантинизация, т.е. хранение заготовленной плазмы с запретом ее использования на протяжении определенного времени. Предпосылкой к организации карантинного хранения плазмы послужило наличие возможности донации крови лицами без клинических и лабораторных признаков гемотрансмиссивных инфекций в период серонегативного «окна» в начальной стадии заболевания [103,110,115,130,142,235]. Эффективность карантинизации зависит от возврата доноров через 6 месяцев после донации для повторного обследования на маркеры гемотрансмиссивных инфекций [22,24,142,146]. Внедрение новых технологий и методов диагностики: карантинизация плазмы, ПЦР - диагностика для заготовки иммунной донорской плазмы позволяют уменьшить опасность гемотрансфузий и снизить риск инфицирования при применении препаратов из крови человека [33,39,80,130,193,206]. Но использование самых современных методов скрининга доноров не снимает риска передачи с препаратами крови человека возбудителей вирусных инфекций. Поэтому методы карантинизации и вирусинактивации являются дополнительной гарантией вирусной безопасности препаратов крови [22,39,80]. Введение в лабораторную практику службы крови обязательного тестирования донорской крови на указанные серологические маркеры ВГВ и вирусного гепатита С (ВГС) позволило значительно снизить риск посттрансфузионной передачи ВГС и ВГВ [33,37,40,121,189,235]. Таким образом, только внедрение целой системы мер, направленных на обеспечение высокого качества донорской плазмы, как сырья, для производства иммуноглобулинов направленного действия, тщательное соблюдение всех этапов предварительного обследования доноров, использование совре- 26 менных методов апробации донорской крови с применение метода карантинизации донорской плазмы, метода ПЦР для исследования минипулов с донорской плазмой позволяет заготовить сырье высокого качества и с высокой степенью вирусной безопасности, снизить затраты по заготовке и отбраковке сырья ненадлежащего качества и обеспечивает высокое качество и безопасность иммунной плазмы для специфических иммуноглобулинов. 1.4. Современные тенденции отбора доноров Все возрастающие потребности отечественного здравоохранения в препаратах крови человека невозможно удовлетворить без должного развития службы крови в Российской Федерации, основным звеном которой является донор [144]. Донорство крови и ее компонентов во всем мире является показателем здоровья нации. Быть донором не только почетно, донорство это акт милосердия, гуманного отношения к больному, одна из важнейших характеристик нравственного и физического здоровья общества. Поэтому привлечение к выполнению донорской миссии большего количества населения является важнейшей задачей [11,12,44,76,93,140,222]. В России состояние донорства в настоящее время является особенно сложным, поскольку за последние 10 лет утрачены многие существовавшие ранее методы поощрения донорства, престиж донорства, механизмы взаимодействия с организациями – источником донорских ресурсов. Уменьшению количества доноров способствуют не только имеющиеся экономические и социальные проблемы, но и рост инфекционных заболеваний, алкоголизм и наркомания, отрицательно влияющие на здоровье населения [44,75,79,133,137,145,169,172,187,221,235,236]. Отрицательную роль в развитии донорства играет незаинтересованность работодателей в участии сотрудников в донорском движении, слабая пропаганда донорства в средствах массовой информации и отсутствие обязательных социальных и государственных программ, стоящих на страже здоровья доноров [140,191]. Проблема кадрового донорства становится все более актуальной как в нашей стране, 27 так и в большинстве развитых стран мира [12,128,129,212,221]. По мировым данным для самообеспечения страны кровью и ее компонентами необходимо иметь 40-60 доноров на 1 тыс. населения. В странах Европейского Союза это количество в среднем составляет 10-15% населения, в России же таковыми являются только 1,6% населения [128,233,222]. В России наблюдается не только снижение количества доноров, но и изменение структуры донорских кадров, так в 2010 г. уменьшилось число платных на 11% и безвозмездных доноров на 7,9%. На 23% сократилось количество первичных доноров, на 40,3% - иммунных доноров, на 44% - доноров клеток крови. Сокращение количества доноров явилось причиной уменьшения числа кроводач и ухудшения обеспечения препаратами крови всех контингентов больных, нуждающихся в этом виде терапии [129]. В то же время, оптимизация управления запасами и клинически эффективное использование препаратов крови позволит сократить нерациональный расход компонентов и препаратов крови и избежать избыточного расхода донорского ресурса [73,17,93,126]. Уменьшение количества доноров ставит перед нами задачу по сохранению имеющегося донорского потенциала, поэтому первоочередной задачей является сохранение здоровья доноров при многократных донациях крови/плазмы. Каждая доза крови и ее компонентов, в том числе иммунная донорская плазма, сданная донором, вызывает целый комплекс изменений в организме доноров и может рассматриваться, как кровопотеря со всеми характерными для нее признаками (транзиторное снижение количества лейкоцитов, эритроцитов и др. клеток крови, белков крови). Потеря необходимых веществ и нарушение процесса их восполнения может привести к развитию глубоких нарушений со стороны организма доноров и как следствие этого отводу их от донорства, а так же снижению качества получаемых препаратов крови человека [78,125]. В 2008 г. появилась новая группа доноров - доноры плазмы для фракционирования. Решение вопроса о необходимости полноценного медицинского освидетельствования доноров плазмы для фракционирования возложено на врача - трансфузиолога отдела комплектования донорских кадров [36,42,118]. 28 Таким образом, существует возможность допуска к процедуре плазмафереза без выполнения биохимических и иммуногематологических анализов. Следовательно, оценить состояние здоровья данной категории доноров даже косвенно, будет затруднительно. Использование для серологического скрининга образцов крови методик и тест-систем, выявляющих маркеры вирусов при определенном пороговом уровне, предполагает остаточные риски передачи вирусных гемотрансмиссивных инфекций от доноров, находившихся в периоде сероконверсии [39,40,82,83,85,86,139,224,235]. Поэтому изучение иммунологических характеристик состояния здоровья доноров, особенно активных доноров иммунной плазмы, имеющих многократные донации, имеет важное значение в формировании подходов оценки иммунологического состояния здоровья доноров и разработки комплекса мер направленных на сведение к минимуму как негативных последствий многократных донаций для донора, так и производства некачественных препаратов крови человека. Современная служба крови заинтересована не просто в донорах, но в первую очередь — в повторных (активных) донорах, кровь и плазма которых безопаснее в инфекционном отношении, и их донациии проходят без побочных эффектов [191,224]. Одним из механизмов контроля состояния здоровья доноров является мониторинг здоровья донорского контингента. В последние годы число медицинских отводов от донаций значительно возросло. По сведениям разных центров крови, их количество достигает до 30% [85,147,224]. Скорее всего, это является следствием общей тенденции, ухудшения состояния здоровья населения России в целом. Мониторинг здоровья доноров служит сохранению донорского потенциала, что весьма актуально в условиях существующей ограниченности донорских ресурсов. Для решения вопроса эффективной реализации донорского потенциала в стране важно знать социальную характеристику доноров, которая, несмотря на возможные региональные отличия, обусловленные особенностями экономической ситуации, безусловно, имеет общие черты [154]. Опросы и анкетирование доноров являются традиционным инструментом управления донорским потенциалом 29 региона [44,76,191,211], позволяющим оценить, как адекватность рекрутирования доноров, так и удовлетворенность донором самим процессом донации [76,191,211]. В связи с вышеизложенным, представляется актуальным исследование состояния системы иммунитета у доноров имеющих многократные донации, разработка критериев прогнозировании потенциально высокой иммунологической реактивности донора на разные виды вакцин, с применением наиболее эффективных схем иммунизаций, разработка методов реабилитации доноров с целью возвращения их в активное донорство, все это имеет первоочередное значение в сохранении донорского потенциала. Внедрение целой системы мер, направленных на обеспечение высокого качества донорской плазмы, как сырья, для производства иммуноглобулинов направленного действия, тщательное соблюдение всех этапов предварительного обследования доноров, использование современных методов апробации донорской крови, применение метода карантинизации донорской плазмы, позволяет заготовить сырье с высокой степенью вирусной безопасности, снизить затраты по заготовке и отбраковке сырья ненадлежащего качества и обеспечить высокое качество и безопасность иммунной плазмы для специфических иммуноглобулинов. 30 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследование проводились на базе донорского пункта Филиала ФГУП «Микроген» Министерства здравоохранения России в г. Пермь «Пермское НПО «Биомед» (директор Е.В. Орлова). Объектом исследования явились лица, обратившиеся в донорский пункт цеха препаратов крови «Пермского НПО «Биомед»: первичные, активные доноры и доноры резерва. Первичные доноры - лица впервые обратившиеся в донорский пункт для донации крови-\плазмы, доноры резервадоноры имеющие до трех донаций крови-\плазмы в год, активные донорыдоноры имеющие более трех донаций крови-\плазмы в год. Доноры крови доноры, сдающие цельную кровь, максимальным объемом до 450,0 мл. Максимально возможное число донаций крови у доноров женщин – 4 в год, у доноров мужчин – 5 в год. Доноры плазмы - доноры, сдающие плазму крови методом дискретного, прерывистого, ручного афереза и методом автоматического, аппаратного, непрерывного афереза. Максимально возможное число донаций плазмы–20 в год, общим объемом до 12,0 литров [118]. Исследования проводили с 2006 по 2012 гг. в соответствии с нормативными документами [111,112,116,117,118,119,134,135]. В период с 2006 по 2012 гг. было обследовано 50194 донора из них 12542 первичных донора, 37552 активных донора. Среди обследованных доноров, 36284 - доноры крови, 13910 - доноры плазмы. Исследовано 126999 донаций крови и 83463 донации плазмы. При обращении каждый донор давал информированное согласие на проведение обследования и донацию крови-/плазмы, заполнял «Анкету донора» [118]. Медицинское освидетельствование доноров проводилось врачем-трансфузиологом в соответствии с приказом МЗ РФ [118]. Лабораторное обследование доноров включало: 1. Общее клиническое исследование крови на автоматическом гематологическом анализаторе «Астра». 31 2. Определение поверхностного АГ ВГВ (НВsAg) и проведение анализа по подтверждению наличия НВsAg с использованием конфирматорных тестов у всех впервые обратившихся доноров до донации, у каждого активного или донора резерва при каждой донации. 3. Определение АТ к ВГС и проведение анализа по подтверждению наличия АТ к ВГС с использованием конфирматорных тестов у всех впервые обратившихся доноров до донации, у каждого активного или донора резерва при каждой донации. 4. Определение АТ к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 у всех впервые обратившихся доноров до донации, у каждого активного или донора резерва при каждой донации. 5. Качественная полимеразная цепная реакция использовалась для выявления лиц, находящихся в стадии серонегативного «окна» с использованием набора реагентов для одновременного выделения ДНК ВГВ, РНК ВГС, РНК ВИЧ из сыворотки (плазмы) крови для последующего анализа методом ПЦР с детекцией в реальном времени. 6. Определение АТ к Treponеma pallidum, у всех впервые обратившихся доноров до донации, у каждого активного или донора резерва при каждой донации. 7. Определение уровня специфических АТ к вирусу КЭ у всех впервые обратившихся доноров до донации, у каждого активного или донора резерва при каждой донации. 8. Определение уровня специфических АТ к ВГВ у всех впервые обратившихся доноров до донации, у каждого активного или донора резерва при каждой донации. 9. Определение уровня специфических АТ к АС у всех впервые обратившихся доноров до донации, у каждого активного или донора резерва при каждой донации. 32 10. Определение уровня специфических АТ к антиальфастафилолизину у доноров плазмафереза, вакцинированных стафилококковым анатоксином, через 14 дней после первой вакцинации, а затем при каждой донации. 11. Биохимическое исследование крови с определением уровня общего белка, определение белковых фракций крови с использованием прибора для проведения электрофереза белков крови «Астра». 12. Фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови в исследуемых образцах оценивали модифицированным В.Н. Каплиным методом [1996] с использованием в качестве объектов фагоцитоза формалинизированных эритроцитов барана в концентрации 1х109 эритроцитов/мл. На каждого первичного донора заполнялась карта донора резерва (форма 405/У), при наличии трех и более донаций крови/плазм на донора резерва заполнялась карта активного донора (форма 406/У). Допуск донора к донации крови/плазмы осуществлялся на основании приказа [118]. Вакцинация доноров с целью получения необходимого для производства направленных иммуноглобулинов титров специфических антител. Критерии оценки допуска донора к иммунизации: 1. Отсутствие у донора, в результате предварительного исследования, необходимого титра специфических АТ к вирусу КЭ, или к вирусу ГВ, к столбнячному анатоксину, или к антиальфастафилолизину. 2. Отсутствие у донора предыдущих иммунизаций, или ревакцинаций по- сле проведенных иммунизаций. 3. Отсутствие у донора аллергических реакций на предыдущие иммунизации и отсутствие противопоказаний к иммунизации. 4. Соблюдение необходимого интервала между предыдущей иммунизацией в соответствии с инструкцией по применению вакцин. 5. Информированное согласие донора на иммунизацию. Для проведения иммунизации доноров в донорском пункте использовались следующие виды вакцин: 33 1. Для иммунизации доноров против ВКЭ использовали «Вакцину клещевого энцефалита культуральную очищенную инактивированную сухую концентрированную «Энцевир» производства ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН» и производства ФГУП «Микроген» НПО «Вирион» (г. Томск). Вакцинация проводилась в соответствии с инструкцией по применению вакцины № 01-11/216-08 утвержденной главным государственным врачом РФ Г.Г. Онищенко 30.12.2008 г. [61]. Вакцина вводилась внутримышечно (в/м) в дельтовидную мышцу по 0,5мл. (1 доза). Инструкция по применению вакцины с профилактической целью предусматривает использование двух схем иммунизации (стандартная и экстренная), ревакцинацию через 1 год после завершения первичного курса вакцинации и последующие ревакцинации раз в 3 года. 1. По экстренной схеме было вакцинировано 450 доноров. Схема вакцинации обозначалась 0-1, с последующей ревакцинацией проводимой через 1 год, а затем каждые 3 года. 2. По плановой схеме было вакцинировано 5766 доноров. Схема вакцинации обозначалась 0-6, с последующей ревакцинацией через 1 год после окончания цикла иммунизации, а затем каждые 3 года. Иммунный ответ на вакцину клещевого энцефалита оценивали по содержанию в плазме специфических антител к ВКЭ в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с диагностикумом клещевого энцефалита сухим производства НПО «Вирион» (г. Томск), при каждой донации. Активность специфического гуморального иммунитета исследовали в динамике на протяжении периода сохранения необходимого для производства препарата антителопродукции. Среди вакцинированных доноров выделили две группы: первая - доноры со слабым гуморальным ответом с титром АТ-ВКЭ ниже 1:10 и продолжительностью сохранения титров менее 60 дней, вторая - доноры с активным иммунным ответом с титром АТ-ВКЭ не ниже 1:20 и продолжительностью 34 сохранения титра не менее 60 дней. При этом титр 1:10 считали низким, 1:20средним, 1:40 и более - высоким. 2. Для иммунизации доноров против гепатита В, использовали вакцину гепатита В рекомбинантную дрожжевую, суспензию для внутримышечного введения производства ЗАО НПК «Комбиотех» г. Москва, и вакцину «Engerix B–1,0» производства (Бельгия). Вакцинация проводилась в соответствии с инструцией по применению вакцины [62]. Вакцина вводилась в/м в дельтовидную мышцу. Один мл препарата (1 доза) содержал 20 мкг НВsAg. Использовали основные схемы вакцинации: 1. Стандартная, по которой было иммунизировано 929 человек –2 при вивки выполнялись через 1 и 6 месяцев от первой. Схема вакцинации обозначалась 0–1–6 мес. 2. Экстренная, по которой было иммунизировано 30 человек – 2 прививки выполнялись с интервалом 1 месяц между прививками. По этой схеме проводили ревакцинацию через 12 месяцев после последнего введения вакцины. Схема вакцинации обозначалась 0–1–2–12 мес. Уровень антителопродукции контролировался при каждой явке донора на донацию. Группу подлежащих бустер-вакцинации составили 27 человек. В результате вакцинации против гепатита В у привитых доноров вырабатывались антитела к HBs-антигену того субтипа, который содержался в препарате, применяемом для иммунизации. При лабораторном тестировании уровня антителопродукции определяли средние геометрические титры анти-HBs АТ и процент сывороток с высокой концентрацией АТ (1,0-10,0 МЕ/мл) и очень высокой – более 10,0 МЕ/мл, т.е. уровень сероконверсии. Для количественного определения концентраций анти-HBs АТ использовали отечественные диагностические тест-системы, «МикрАТ-HBs», производства ФГУП «НПО «Микроген», г. Н. Новгород в конструкцию которых включены «ау» и «ad» антигенные детерминанты HBs-антигена. Активность специфического гуморального иммунитета исследовали в динамике, на протяжении пе- 35 риода сохранения необходимого для производства иммуноглобулина против гепатита В титра антител. 3. Для иммунизации доноров столбнячным анатоксином использовали Анатоксин столбнячный очищенный адсорбированный жидкий для доноров (АС-анатоксин для доноров) производства Филиала ФГУП «Микроген» МЗ РФ в г. Пермь «Пермское НПО «Биомед». Вакцинация проводилась в соответствии с инструкцией по применению АС № 01-11/59-06 утвержденной главным государственным врачом РФ Г.Г. Онищенко 14.04.2006 г. Вакцина вводилась глубоко подкожно (п/к) в подлопаточную область по 1,0 мл (1 доза) содержащая 40 ЕС столбнячного анатоксина однократно. Уровень антителопродукции к столбняку в сыворотках крови доноров определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), с использованием набора реагентов для выявления антитоксических дифтерийных и столбнячных антител «ИФА анти ДС» производства ФГУП НПО «Микроген», ТУ 9388-031-14237183-2008. Поскольку, в рамках национального календаря профилактических прививок, лечебными учреждениями проводятся вакцинации и ревакцинации вакцинами, в состав которых входит столбнячный компонент, то лицам с известным прививочным анамнезом ревакцинация АС - для доноров, проводились не ранее, чем через 5 лет после предшествующего введения препаратов, содержащих столбнячный компонент. Уровень антителопродукции контролировался при каждой явке донора на донацию. В результате иммунизации АС у привитых доноров вырабатывались антитела к столбнячному анатоксину. При лабораторном исследовании поствакцинального иммунитета определяли средние геометрические титры АТ и процент сывороток с титром АТ (5,0 МЕ/мл) и выше. Для количественного определения концентраций антител использовали отечественные наборы реагентов «ИФА анти ДС» производства ФГУП НПО «Микроген». Активность специфического гуморального иммунитета исследовали в динамике, на 36 протяжении периода сохранения необходимого для производства противостолбнячного иммуноглобулина титра антител. Критерии оценки эффективности проведенной иммунизации 1. Отсутствие побочных действий после проведенной иммунизации. 2. Появление в крови донора после проведенной иммунизции, необхо- димого для производства направленных иммуноглобулинов уровня антителопродукции. 3. Сохранение необходимого для производства направленных иммуног- лобулинов титров специфических антител длительное время. Для проведения социального опроса доноров нами была разработана специальная форма анонимной анкеты, в которой донору предлагалось самому дать ответы на 15 вопросов, и были предложены варианты ответов на некоторые из них. Опрос проведен по следующим вопросам, представленным в табл. 1. Таблица 1. Анкета донора Пол ____________________ Возраст ________________ 1. ПРОФЕССИЯ 1.1 Рабочий 1.2 Служащий 1.3 Студент 1.4 Безработный 2. НАЛИЧИЕ ВРЕДНЫХ ПРИВЫЧЕК 2.1 Курение 2.2 Употребление алкоголя 2.3 Наркотическая, медикаментозная зависимость 3. МАТЕРИАЛЬНАЯ ОБЕСПЕЧЕННОСТЬ 3.1 Хорошая 3.2 Удовлетворительная 3.3 Неудовлетворительная 4. ХАРАКТЕР ПИТАНИЯ 4.1 Хорошее 4.2 Удовлетворительное Да Нет 37 4.3 Недостаточное 5. Частота обращения 5.1 Первичный донор (обратившийся первый раз) 5.2 Донор резерва (сдающий менее 3-х раз в год) 5.3 Активный донор (сдающий более 3-х раз в год) 6. СДАВАЛИ ЛИ ВЫ КОГДА-НИБУДЬ 6.1 Кровь 6.2 Плазму 6.3 Клетки крови 7.ДОНОРСКИЙ СТАЖ 7.1 0-5 7.2 5-10 7.3 10 и более лет 8. БЫЛИ ЛИ ОТВОДЫ ОТ КРОВО и ПЛАЗМОДАЧ Если «ДА» укажите причину отвода 9. ПРОВОДИЛИСЬ ЛИ ВАМ ПРИВИВКИ (какие) 9.1 В донорском пункте 9.2 По месту жительства, работы, учебы 10.СОСТОЯНИЕ ПОСЛЕ КРОВО, ПЛАЗМОДАЧИ 10.1 Хорошее 10.2. Удовлетворительное 10.3. Неудовлетворительное 11.МОТИВЫ, ПОБУДИВШИЕ СТАТЬ ДОНОРОМ 11.1. Материальные 11.2. Альтруистические 11.3. Сочетание мотивов 12.ПОЛУЧЕНИЕ ИНФОРМАЦИИ О ДОНОРСТВЕ 12.1. СМИ 12.2. Медицинская агитация 12.3. Родственники, знакомые, друзья 12.4. Отсутствие знаний о донорстве 12.5. Не уверены в безвредности донорства 12.6. Не осведомлены о противопоказаниях к донорству 13.ПРИЧИНЫ, ПРЕПЯТСТВУЮЩИЕ ДОНОРСТВУ 13.1. Незнание куда обращаться 13.2. Отсутствие времени 13.3. Опасение за свое здоровье 14.ОТНОШЕНИЕ К ДОНОРСТВУ СО СТОРОНЫ РАБОТОДАТЕЛЯ 14.1. Положительное 14.2. Безразличное 38 14.3. Негативное 14.ГОТОВЫ ЛИ ВЫ БЫТЬ ДОНОРОМ В ДАЛЬНЕЙШЕМ 15.ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО УЛУЧШЕНИЮ РАБОТЫ ДОНОРСКОГО ПУНКТА Лабораторные методы исследования Общепринятые клинико-лабораторные исследования (общий анализ крови) выполнялись на базе клинико-биохимической лаборатории донорского пункта «Пермского НПО «Биомед. В общем анализе крови изучали показатели гемоглобина (Нb) (г/л), общего количества лейкоцитов (L) (х10 9/л), проводили с использованием гематологического анализатора «Астра», скорости оседания эритроцитов (СОЭ) (мм/час) с использованием системы «Microvett», у всех впервые обратившихся доноров до донации, у каждого активного или донора резерва при каждой донации. Определение общего количества эритроцитов (ЭР) (х10¹²/л), количества тромбоцитов (Тр) (х10 9/л) и количества ретикулоцитов (Р) х109/л проводили с использованием гематологического анализатора «Астра», подсчет лейкоцитарной формулы капиллярной крови (%) проводили в мазках крови доноров, окрашенных по Романовскому-Гимза, 1 раз в год. В биохимическом исследовании изучали уровень общего белка (г/л), у всех доноров плазмафереза до первой и при каждых последующих донациях плазмы методом плазмафереза. Определение содержания сывороточных иммуноглобулинов: альбумина (г/л), суммы глобулинов, α1-глобулинов, α2глобулинов, ß-глобулинов, γ-глобулинов в % и г/л и коэффициента соотношения альбумина и глобулинов (К А/Г), у каждого донора до первой и через каждых пять плазмодач методом плазмафереза. Содержание белка в сыворотке и плазме крови доноров определяли биуретовым методом, с использованием реагентов для определения концентрации общего белка в сыворотке (плазме) крови «Общий белок – Ольвекс» 39 ТУ 9398-006-44276594-2005 производства ООО «Ольвекс-Диагностикум» г. Санкт-Петербург. Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови на фракции проводили методом, основанным на различной скорости перемещения молекул белка в постоянном электрическом поле в зависимости от соотношения основных, кислотных групп белка, рН и ионной силы буферного раствора, с использованием устройства электрофореза белков сыворотки крови на пленках из ацетата целлюлозы МФАС-ОС-1 (пленка для электрофореза) ТУ 6-55-221-1089 дм, размер 25180 мм с регулируемыми параметрами напряжения, тока и режимов УЭФ-01-«АСТРА» и набора реагентов для определения белковых фракций сыворотки крови «КлиниТест-ЭФ» с использованием красителя «пунцовый С». Определение маркеров ГТИ и сифилиса. Специфические маркеры вирусных инфекций (HBsAg, и антитела к ВГС, антиген и антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2), и антитела к сифилису определяли в сыворотке крови обследуемых, впервые обратившихся доноров до донации, у каждого активного донора или донора резерва при каждой донации, методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) [111] на базе «Пермского НПО «Биомед», с использованием тест-систем, разрешенных к использованию в лабораторной практике [117] и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени на базе ПЦР лаборатории «Пермского НПО «Биомед», с использованием набора реагентов для одновременного выделения ДНК ВГВ, РНК ВГС, РНК ВИЧ из сыворотки (плазмы) крови для последующего анализа методом ПЦР с детекцией в реальном времени [111]. Проведение первичной лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции с помощью набора реагентов, выявляющих одновременно АТ и антиген АГ к ВИЧ, проводилось с использованием тест системы иммуноферментной «ДСИФА-ВИЧ-АГ+АТ», «ДС–ИФА–ВИЧ–АГАТ-СКРИН», «ДС–ИФА–ВИЧ– АГАТ–УНИФ» производства НПО «Диагностические системы», г. Н. Новгород. С 2011 г. для определения маркеров ВИЧ использовались тест-системы с 40 более высокой степенью чувствительности и специфичности по антигену ВИЧ-1 (р24), чувствительностью по р24-5 пг/мл, (регламентированы к использованию тест системы с чувствительности к антигену ВИЧ-1 (р24) чувствительностью по р24-10 пг/мл), тест системы ИФА для идентификации суммарных антител к отдельным белкам ВИЧ-1 gр41еnv, gр120еnv р31роl,ВИЧ-1 группы О gр41еnv, ВИЧ-2 gр36еnv и выявления антигена ВИЧ-1 (р24) чувствительностью по р24-5 пг/мл «ДС-ИФА-ВИЧ-АТ/АГСПЕКТР» производства НПО «Диагностические системы», г. Н. Новгород. Определение РНК ВИЧ проводилось методом ПЦР в реальном времени с использованием набора реагентов для одновременного выделения ДНК ВГВ, РНК ВГС, из сыворотки (плазмы) крови для последующего анализа методом ПЦР с детекцией в реальном времени «РеалБест ДельтаМаг ВГВ/ВГС/ВИЧ» производства ЗАО «Вектор Бест» Россия, г. Новосибирск. Для проведения выявления и количественного определения РНК ВИЧ методом обратной транскрипции вирусной РНК (ОТ-ПЦР) с последующей амплификацией фрагмента к ДНК в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в реальном времени использовался набор реагентов «РеалБест ВИЧ ПЦР», производства ЗАО «Вектор Бест» Россия, г. Новосибирск. Проведение подтверждения результатов, и постановка окончательного лабораторного анализа, проводилось методом иммунного блота в соответствии с нормативными документами [111,112], Центром по борьбе и профилактике СПИД и инфекционных заболеваний по Пермскому краю (Краевой СПИД Центр) методом иммунного блота (главный врач К.М. Хафизов). Для скрининга анти-ВГС использовали набор реагентов: «ИФА-АНТИНСV». Для подтверждения наличия анти-ВГС использовали набор реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-НСV-СПЕКТР-GM», производства «Диагностичесие системы», г. Н. Новгород). Определение РНК ВГС проводилось методом ПЦР в реальном времени с использованием набора реагентов для одновременного выделения ДНК ВГВ, РНК ВГС, из сыворотки (плазмы) крови для последующего анализа методом ПЦР с детекцией в реальном времени «РеалБест 41 ДельтаМаг ВГВ/ВГС/ВИЧ» производства ЗАО «Вектор Бест» Россия, г. Новосибирск. Для проведения выявления и количественного определения РНК ВГС методом обратной транскрипции вирусной РНК с последующей амплификацией фрагмента к ДНК в ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в реальном времени использовался набор реагентов «РеалБест ВГС ПЦР», производства ЗАО «Вектор Бест» Россия, г. Новосибирск. Для скрининга НВsАg использовали набор реагентов: «ДС-ИФАНВsAg» с регламентированной к определению у доноров степенью чувствительности и специфичности по HВsAg-0,1. С 2009 г. для определения HВsAg использовались наборы реагентов с более высокой степенью чувствительности и специфичности по HВsAg-0,01, «ДС-ИФА-НВsAg 0,01» производства НПО «Диагностические системы», г. Н. Новгород. Для подтверждения наличия НВsАg использовали набор реагентов: «ИФА-НВsАg-подтверждающий тест» производства «Диагностичесие системы», г. Нижний Новгород, с 2009г. с использованием набора реагентов «ИФА-HВsAg 0,01 – подтверждающий тест», производства НПО «Диагностические системы» г. Нижний Новгород. Определение ДНК ВГВ проводилось методом ПЦР в реальном времени с использованием набора реагентов для одновременного выделения ДНК ВГВ, РНК ВГС, из сыворотки (плазмы) крови для последующего анализа методом ПЦР с детекцией в реальном времени «РеалБест ДельтаМаг ВГВ/ВГС/ВИЧ» производства ЗАО «Вектор Бест» Россия, г. Новосибирск. Для проведения выявления и количественного определения ДНК ВГВ методом, основанным на амплификации фрагмента ДНК в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в реальном времени, использовался набор реагентов «РеалБест ВГВ ПЦР», производства ЗАО «Вектор Бест» Россия, г. Новосибирск. Для скрининга суммарных антител к бледной трепонеме использовали наборы реагентов предназначенные для качественного выявления антител классов G, M и А к Treponеma pallidum: «РекомбиБест антипаллидум- 42 суммарные антитела» производства «Бектор Бест», г. Новосибирск и «ИФААНТИ-ЛЮИС-СУММАРНЫЕ АНТИТЕЛА», производства «Диагностичесие системы», г. Н. Новгород. Для проведения реакции микропреципитации с кардиолипиновым антигеном использовали набор реагентов: АГ кардиолипиновый для реакции микропреципитации производства «Пермского НПО «Биомед». Фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови в исследуемых образцах оценивали модифицированным В.Н. Каплиным методом. (1996) с использованием в качестве объектов фагоцитоза формалинизированных эритроцитов барана в концентрации 1х108 эритроцитов/мл. К 0,1 мл цельной гепаринизированной крови добавляли 0,1 мл суспензии формалинизированных эритроцитов барана. Пробы инкубировали при 37 ° С в течение 20 минут. Содержимое пробирки перемешивали, наносили 0,015 мл смеси на обезжиренное стекло и готовили мазок, который фиксировали раствором Майнгрюнвальда, окрашивали по Романовскому-Гимза. Рассчитывали следующие относительные показатели фагоцитарной реакции по отношению ко всем гранулоцитам и моноцитам: процент фагоцитоза, оценивали как количество фагоцитирующих клеток на 100 подсчитанных фагоцитов; фагоцитарное число определяли, как количество объектов фагоцитоза, которое в среднем приходится на 1 из 100 подсчитанных фагоцитов; фагоцитарный индекс вычисляли, как количество объектов фагоцитоза, которое приходится на один фагоцит [157]. Активность специфического гуморального иммунитета исследовали у каждого первичного донора перед донацией и в дальнейшем при каждой донации. Определение в плазме специфических антител к КЭ проводили методом (РТГА) с диагностикумом клещевого энцефалита сухим, производства НПО «Вирион» (г. Томск). Определение в плазме специфических антител к ГВ проводили методом ИФА с использованием тест-системы иммуноферментной «МикрАТ-HBs», ФГУП «НПО «Микроген», г. Н. Новгород. Определение в плазме специфических антител к столбняку проводили методом ИФА 43 с использованием набора реагентов для выявления антитоксических дифтерийных и столбнячных антител «ИФА анти ДС» производства «Пермского НПО «Биомед». Групповую принадлежность доноров определяли, используя стандартные эритроциты человека для определения группы крови по системе АВО (0/I; A/II; В/III) производства Пермская Краевая станция переливания крови и цоликлонов для определения группы крови по системе АВО анти - А и анти В, производства ООО «Медиклон» г. Москва. Резус принадлежность доноров определяли используя универсальный реагент антирезус (Д ) - супер цоликлон для экспресс-метода, производства ООО «Медиклон» г. Москва. Методы статистического анализа Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики, одно- и двухфакторного дисперсионного анализа. 44 ГЛАВА 3 ИЗУЧЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У АКТИВНЫХ ДОНОРОВ ИММУННОЙ ПЛАЗМЫ ПРИ МНОГОКРАТНЫХ ПЛАЗМАФЕРЕЗАХ Потребность отечественного здравоохранения в специфических иммуноглобулинах постоянно возрастает, поскольку, массовое применение антибактериальной терапии привело не только к появлению резистентных к антибактериальной терапии микроорганизмов, но и сопровождается большим количеством осложнений при их применении, таких как дисбактериоз, разного рода аллергическими реакциями и др. Ряд авторов связывает это с изменениями иммунного статуса населения [1,7,15,153]. Применение же специфических иммуноглобулинов лишено осложнений и противопоказаний, свойственных антибактериальным препаратам. Успешное лечение некоторых заболеваний невозможно без применения компонентов крови и препаратов, изготовленных на их основе [4,7,10,18,74,84,88,91,92,98,100,153,207]. Удовлетворение потребности здравоохранения в препаратах плазмы крови остается нерешенной глобальной проблемой, в том числе по причине недостатка плазмы для фракционирования [129,126,127,140]. Основой производства направленных иммуноглобулинов является иммунная плазма, содержащая высокий титр специфических антител. Получить необходимые объемы высокоиммунного сырья проводя отбор донаций, имеющих необходимую активность, используя только скрининг, не удается. В эндемичных районах по клещевому энцефалиту, где массовым образом проводится иммунизация населения от клещевого энцефалита таких, как Урал, Сибирь, Дальний Восток количество лиц имеющих высокий титр антител выше, чем в центральных районах России, но и в данных регионах объемы заготовки такой плазмы не достаточный для покрытия потребностей здравоохранения. Еще сложнее обстоит дело с получением высокоиммунной плазмы с высокой активностью титров к гепатиту В и столбняку. В таких случаях получить необходимые объемы сырья для производства направленных иммуноглобулинов невозможно без прове- 45 дения активной иммунизации доноров. В настоящее время разработана единственная схема иммунизации доноров, это иммунизация стафилококковым анатоксином с целью получения иммунного сырья для производства стафилококкового иммуноглобулина [59]. В связи с вышеизложенным, представляет интерес изучение антителопродукции у доноров вакцинированных различными вакцинами с использованием разных схем иммунизации с целью определения наиболее оптимальной схемы иммунизации доноров, позволяющей получить максимальный по выраженности и длительности антителопродукции иммунный ответ. Определение критериев отбора доноров, для проведения иммунизации, с прогнозированным высоким уровнем антителопродукции с целью получения высокоиммунной плазмы для получения специфических иммуноглобулинов. 3.1. Оценка активности специфического антителообразования у активных доноров плазмы иммунизированных вакциной против гепатита В Целью настоящего исследования явилось изучение антителопродукции, длительности и напряженности поствакцинального иммунитета против гепатита В у активных доноров, плазма которых используется в технологии производства направленных иммуноглобулинов. Было проведено предвакцинальное обследование доноров на наличие анти-HBs в сыворотке крови 27883 доноров иммунной плазмы для фракционирования, за период с 20082012гг. Возраст доноров находился в диапазоне от 18 до 60 лет. По результатам предвакцинального скрининга, для проведения вакцинации, было отобрано 978 доноров, не имеющих в сыворотке крови анти-HBs, из них 47% составляли мужчины и 53% женщины, доноров крови 64%, доноров плазмы 36%. Для характеристики напряженности гуморального иммунитета были выбраны следующие диапазоны концентраций анти-HBs: низкий уровень – до 0,1 МЕ/мл; средний уровень – от 0,1 до 1,0 МЕ/мл; высокий уровень –1,0 до 10,0 МЕ/мл, очень высокий уровень – 10,0 МЕ/мл и более. 46 Установлено, что в группе лиц, вакцинированных по стандартной схеме, через 1 месяц после завершенного курса вакцинации уровень сероконверсии составил 98%. Среднегеометрическая концентрация АТ - 5,6±0,3 МЕ/мл. В этой группе иммунизированных, наибольший удельный вес (53%) составили лица с высокими (1,0-10,0 МЕ/мл) концентрациями АТ, 34,6% - очень высокими, что свидетельствовало о высокой иммуногенности вакцины. В последующем отмечалось снижение числа вакцинированных лиц имеющих высокий уровень АТ, в группе привитых по стандартной схеме начиная с 3-го месяца после завершенного курса вакцинации, а число лиц с наличием низкого и среднего уровня анти-HBs АТ, наоборот, повышалось. Удельный вес лиц, имеющих высокий и очень высокий титр АТ к вирусу гепатита В через 3 месяца составил 68%; через 6 месяцев - 60,1%; через 1 г. - 55%. В результате проведенных исследований установлено, что только 47,3% вакцинированных по стандартной схеме доноров сохраняли высокий титр специфических АТ через 2 г. после проведенной иммунизации; 27,9% сохраняли высокий титр специфических антител через 3 года и только 25% сохраняли высокий титр специфических АТ через 4 года после окончания цикла вакцинации (рис. 1). % 70 60 50 40 % 30 20 10 0 3месяца 6месяцев 1 год 2 года 3 года 4 года Срок наблюдения Рис. 1. Динамика сохранения высоких титров АТ (выше 1,0 МЕ/мл) к гепатиту В у привитых по стандартной схеме вакцинации 47 Таким образом, выявлено статистически значимое (p<0,05) снижение напряженности поствакцинального иммунитета среди иммунизированных, по стандартной схеме вакцинации, доноров. Следующим этапом исследования явилось изучение влияния возраста и пола доноров на выработку АТ к вирусу гепатита В (рис. 2). Анализ результатов эффективности вакцинации доноров различных возрастных групп, свидетельствовал, что высокая эффективность наблюдалась у доноров 20–30 лет, у мужчин - 83,4%, у женщин данного возраста 66,7 (p<0,05). Среди женщин 40-50 лет удельный вес лиц имеющих высокие титры антител составил - 71%. Определение уровня АТ, через месяц после окончания цикла иммунизации показало, что более высокий удельный вес лиц, имеющих высокие титры антител, 70,3% (p<0,05) определялся в возрастной группе 20-30 лет. % 90 80 70 60 50 мужчины женщины 40 30 20 10 0 20-30 лет 30-40 лет 40-50 лет 50-60 лет возраст Рис. 2. Анализ результатов эффективности вакцинации в зависимости от пола и возраста Анализ влияния групповой принадлежности на выработку АТ к вирусу гепатита В показал, что наиболее выраженный иммунный ответ на вакцина- 48 цию, через месяц после окончания цикла иммунизации, наблюдали у женщин, имеющих четвертую группу крови, наименьший - у мужчин третьей группы крови (рис. 3). % 90 80 70 60 50 мужчины 40 женщины 30 20 10 0 первая вторая третья четвертая Группа крови Рис. 3. Влияние групповой принадлежности доноров на выраженность иммунного ответа Динамика изменения уровней АТ против вируса гепатита В при применении экстренной схемы введения вакцины (0–1–2), при которой прививки выполняли с интервалом 1 месяц с последующей однократной ревакцинацией через 12 месяцев, показала, что среди привитых (30 человек) по экстренной схеме после завершения курса иммунизации уровень сероконверсии составил 82,0%. Удельный вес лиц, имеющих высокий и очень высокий титр антител к вирусу гепатита В через 3 месяца после окончания цикла вакцинации составил 62%; через 6 месяцев 34,1%; через 1 год – 23,5%. В структуре вакцинированных доноров по экстренной схеме, наибольший удельный вес приходился на долю лиц со средними (0,1–1,0 МЕ/мл) концентрациями поствакцинальных антител (62,3%), высокие (1,0-10,0 МЕ/мл) концентрации анти-HBs антител имели лишь 11,0%, а очень высокие (10,0 и более) 1,4% доноров, 27,0% имели низкий уровень антител (0,01-0,1 МЕ/мл), а 2,0% не дали ответ на вакцинацию. Экстренная схема вакцинации против гепатита В предусматривала проведение ревакцинации, через год после окончания цикла 49 вакцинации. Группу подлежащих бустер-вакцинации составили 27 человек. При сравнении среднегеометрических концентраций антител к HBsAg у вакцинированных по экстренной схеме отмечено статистически значимое (p˂0,05) снижение концентраций поствакцинальных АТ в зависимости от срока после полного курса иммунизации. В результате проведенных исследований, отмечали снижение удельного веса лиц со средними, высокими, и очень высокими концентрациями АТ. Установлено, что только 37,3% вакцинированных по экстренной схеме доноров сохраняли высокий титр специфических АТ через 2 года после проведенной иммунизации, 18,6% сохраняли высокий титр специфических антител через 3 года и только 12,4 сохраняли высокий титр специфических антител через 4 года после окончания цикла вакцинации (рис. 4). 70 60 50 40 % 30 20 10 0 3месяца 6месяцев 1 год 2 года 3 года 4 года Рис. 4. Динамика сохранения высоких титров (выше 1,0 МЕ/мл) к гепатиту В у привитых по экстренной схеме Через 4 года, после окончания цикла иммунизации отмечено преобладание удельного веса лиц с низкими (0,01–0,1 МЕ/л) уровнями поствакцинальных антител. Таким образом, среди привитых по экстренной схеме через 4 года 93,6% доноров имели низкий уровень АТ против гепатита В, поэтому их плазму нельзя было использовать для производства иммуноглобулина против гепатита В. 50 Сравнительная оценка динамики изменения уровней анти-HBs АТ у доноров при вакцинации по стандартной и экстренной схемам показала, что среди вакцинированных по обеим схемам выявлено увеличение удельного веса лиц с отсутствием высокого и очень высокого уровней АТ и уменьшение доли лиц с высокими титрами в течение времени (рис. 5). 80 70 60 50 профилактическая схема вакцинации 40 экстренная схема вакцинации 30 20 10 0 3месяца 6месяцев 1 год 2 года 3 года 4 года Рис. 5. Сравнительная оценка изменения высоких уровней (более 1,0 МЕ/мл) анти-HBs антител у доноров при вакцинации по стандартной и экстренной схемам Показатели эффективности вакцинации у лиц, иммунизированных по стандартной схеме были статистически значимо выше, среднегеометрическое титра АТ при иммунизации по стандартной схеме 5,6±0,3 МЕ/мл, против 3,4±0,6 МЕ/мл (p<0,01) у иммунизированных по экстренной схеме. Можно предположить, что это связано, по-видимому, с большим интервалом между второй и третьей вакцинациями, а также особенностью течения процесса специфического антителообразования, характеризующегося медленным нарастанием концентраций антител в ответ на введение рекомбинантного HBsAg. По результатам сравнительных наблюдений, отмечено, что через 4 года 75,0% вакцинированных по стандартной схеме и 93,6%, вакцинированных по экстренной схеме не имели необходимого титра АТ (более 1,0 МЕ/мл). У дан- 51 ных лиц определялся низкий уровень АТ, который являлся защитным (протективным), но тем не менее, плазма этих доноров не могла быть использована для производства иммуноглобулина против ВГВ (рис. 5). В целом тенденция снижения уровня антителопродукции была значительно более выражена в группе привитых по экстренной схеме, что подтверждало вывод о необходимости введения дополнительной бустерной дозы вакцины иммунизированным по схеме 0–1–2 мес. и проработке вопроса необходимости дальнейших ревакцинаций, определения частоты проведения ревакцинаций доноров вакцинированных по стандартной схеме с целью получения плазмы с высокими титрами специфических АТ. Кроме того, наблюдали ежегодное статистически значимое снижение средних геометрических титров HBs антител в динамике (3 месяца, 6 месяцев,1 год, 2 года, 3 года 4 года) p<0,01, что составляло по стандартной схеме вакцинации 5,9±0,4 МЕ/мл, 3,8±1,1 МЕ/мл – 1,8±0,4 МЕ/мл, 1,4±0,4 МЕ/мл, 0,6±0,1 МЕ/мл, 0,1±0,1 МЕ/мл против 2,2±0,3 МЕ/мл 1,2±0,4 МЕ/мл, 0,6±0,1 МЕ/мл, 0,4±0,2 МЕ/мл, 0,2±0,1 МЕ/мл, 0,1±0,1 МЕ/мл – по экстренной. Проведенное исследование выявило ежегодное падение уровня антител при использовании обеих схем вакцинации против ВГВ. В связи с чем, возникает вопрос о необходимости ревакцинации лиц, имеющих HBs антитела в недостаточной концентрации для производства специфического иммуноглобулина, ниже 1,0 МЕ/мл, через 3 года после первичного курса иммунизации. В результате проведенного исследования установлено, что экстренная схема вакцинации от ВГВ создает более низкий и менее продолжительный уровень поствакцинальных антител у большей части иммунизированных доноров по сравнению со стандартной схемой вакцинации. Использование стандартной схемы вакцинации позволило получить более выраженный иммунный ответ на вакцинацию особенно у мужчин и женщин, имеющих первую группу крови в возрасте от 20 до 30 лет и у женщин имеющих четвертую группу крови в возрасте 40-50 лет. Мужчины, имеющие 52 третью группу крови в возрасте 40-50 лет, дали наименьший по выраженности и продолжительности иммунный ответ. Установлено, что через три года после проведенной вакцинации с использованием профилактической схемы, количество доноров имеющих титры противогепатитных АТ в концентрации достаточной для использования их плазмы для производства специфического иммуноглобулина уменьшается более чем в 2 раза. 3.2 Оценка антителообразования, у активных доноров, иммунизированных столбнячным анатоксином для доноров Проведенное предвакцинальное обследование 9459 доноров плазмы для фракционирования за период с 2008-2011 гг. (возраст доноров находился в диапазоне от 18 до 60 лет), включало определение в сыворотке крови доноров, АТ к столбнячному анатоксину (АС). При наличии известного прививочного анамнеза, иммунизаций вакцинами, в состав которых входил столбнячный компонент (АДС; АДС-М, АС 20 ЕС) более пяти лет назад, обнаружении в сыворотке крови доноров АТ к столбнячному анатоксину менее 4 МЕ/мл, проводилась иммунизация доноров АС для доноров, которая рассматривалась как ревакцинация. Лица, отобранные для иммунизации, подвергались углубленному комплексному лабораторному исследованию, в соответствии с приказами МЗ РФ. По результатам предвакцинального скрининга для проведения вакцинации АС было отобрано 3838 доноров в возрасте от 26 до 56 лет, из них 48% составляли мужчины и 52% женщины, доноров крови 64%, доноров плазмы 36%. Для характеристики напряженности гуморального иммунитета были выбраны следующие диапазоны концентраций АТ: низкий уровень – от 0,1-3,5 МЕ/мл; средний уровень – от 3,5 до 5,0 МЕ/мл; высокий уровень – 5,0 МЕ/мл и более. Исходный фон АТ у доноров, отобранных для ревакцинации, составил 1,12+0,08 МЕ/мл, табл. 2 53 Таблица 2 Динамика изменения уровня противостолбнячных антител у иммунизированных доноров Время исследования, мес. Исходный фон 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 1 год 1,5 года 2,0 года 2,5 года 3,0 года 3,5 года 4,0 года Уровень антител (МЕ/мл) 1,12+0,08 4,90+0,04*** 4,89+0,04*** 4,61+0,08*** 4,02+0,12*** 3,74+0,14*** 3,54+0,15*** 3,22+0,17*** 3,04+0,21*** 2,99+0,29*** 2,34+0,39** Примечание. ***- p<0,001, **- p<0,01 к исходному фону по апостериорному критерию Дункана Установлено, что в группе доноров, получивших ревакцинацию АС через 1 месяц после иммунизации, среднегеометрическая концентрация антител составляла 4,90+0,04 МЕ/мл. Наблюдали среднегодовое снижений титра АТ в 1,17 раза. Через 4 года после проведенной вакцинации АС титр АТ у доноров снижался более чем в 2 раза. При исследовании уровня сероконверсии среди доноров в зависимости от пола и возраста показано, что уровень сероконверсии составил 74,49%, причем среди мужчин 57,84%, а среди женщин 91,13%, данные по влиянию пола и возраста, иммунизированных на уровень сероконверсии представлены в табл. 3. 54 Таблица 3 Антителопродукция у иммунизированных доноров через 1 месяц после вакцинации в зависимости от возраста и пола Мужчины Высокие % сероконтитры (%) версии 88,89 55,56 94,74 57,89 92,98 61,40 100,00 56,52 Возраст, лет 21-30 31-40 41-50 51-60 Женщины Высокие % сероконтитры (%) версии 100,0 83,33 100,0 92,31 88,89 88,89 100,00 100,0 Как следует из полученных результатов, в общей структуре иммунизированных, наибольший удельный вес, 95,0% составляли лица с высокими (5,0 МЕ/мл и более) концентрациями титра антител, что свидетельствовало о высокой антигенной активности АС для доноров используемого для иммунизации. В последующем отмечалось изменение структуры в группе иммунизированных, число ревакцинированных лиц с наличием высоких уровней АТ снижалось, а с наличием низкого уровня АТ, наоборот, повышалось (табл. 4). Таблица 4 Динамика уровня противостолбнячных антител у иммунизированных доноров Срок исследования Исходный фон 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 1 год 1,5 года 2,0 года 2,5 года 3,0 года 3,5 года 4,0 года Уровень противостолбнячных антител, % Высокий Средний Низкий 0,0 2,86 97,14 95,00 1,43 3,57 93,13 3,82 3,05 77,42 11,29 11,29 52,80 18,40 28,80 44,64 17,86 37,50 33,00 27,00 40,00 28,77 16,44 54,79 23,53 17,65 58,82 22,22 14,82 62,96 7,14 14,29 78,57 55 Таким образом, удельный вес лиц имеющих высокий титр АТ через 1 месяц составил 95,00%, через 3 месяца - 93,13%; через 6 месяцев - 77,42%; через 1 год –52,80%, через 1,5 года –44,64%, через 2 года –33,00%, через 2,5 года –28,77%, через 3 года –23,53%, через 3,5 года –22,22%, через 4 года 7,14%. Снижение уровня АТ обусловлено как особенностями иммунной системы индивидиума, так и продолжительными донациями плазмы [64], динамика сохранения высоких титров представлена на рисунке 6. % 100 80 60 40 3,5 года 2,5 года 1,5 года 6 месяцев 0 1 месяц 20 Рис. 6. Динамика сохранения высоких титров АТ (выше 5,0 МЕ/мл) к столбнячному токсину у иммунизированных доноров При сравнении среднегеометрических концентраций АТ к АС у вакцинированных отмечено статистически значимое снижение концентраций поствакцинальных антител (p<0,001) через 1 год после проведенной иммунизации (рис. 7). 56 МЕ/мл 5 *** 4 3 *** *** *** *** *** *** 2 3,5 года 2,5 года 1,5 года 6 месяцев 0 1 месяц 1 Рис. 7. Динамика уровня противостолбнячных антител у иммунизированных доноров (***- p<0,001 к 1 месяцу после вакцинации по критерию Стьюдента) Таким образом, выявлено статистически значимое снижение напряженности поствакцинального иммунитета среди иммунизированных АС доноров. Изучение влияния пола и возраста иммунизированных доноров на выработку АТ к АС показало, что до иммунизации женщины имели более низкий исходный фон титра АТ - 0,74±0,1 МЕ/мл, против 1,23±0,09 МЕ/мл у мужчин. При проведении двухфакторного дисперсионного анализа в объединенной выборке всех результатов после иммунизации выявлено статистически значимое влияние фактора «пол» (F(1,909)=12,124, p=0,00052; градации фактора: 0 – мужчины, 1 - женщины) и фактора «время после иммунизации (F(6,909)=19.891, p=0,0000; градации фактора: 1 – 1 месяц, 2 – 3 месяца,3 – 6 месяцев, 4 – 12 месяцев, 5 – 18 месяцев, 6 –24 месяца, 7 – 36 месяцев после проведенной иммунизации), в то время как взаимодействие этих факторов статистически не значимо F(6,909)=2,0448, p=0,05737); градации фактора: 1 – 1 месяц, 2 – 3 месяца,3 – 6 месяцев, 4 – 12 месяцев, 5 – 18 месяцев, 6 –24 месяца, 7 – 36 месяцев после проведенной иммунизации (табл. 5, рис. 8). Таким образом, женщины более активно отвечали на иммунизацию и у них наблюдали менее выраженное снижение титра АТ в течение времени. Таблица 5 57 Зависимость уровня антител у иммунизированных доноров от пола и времени с начала иммунизации по данным двухфакторного дисперсионного анализа Эффект Суммы квадратов отклонений от среднего или девиаты (SS) Intercept 9438,748 Пол 16,275 Время 160,201 Пол+Время 16,469 Ошибка 1220,164 (остаточная вариация) Число степеней свободы (df) Дисперсии (MS) F p 1 1 6 6 909 9438,748 16,275 26,700 2,745 1,342 7031,695 12,124 19,891 2,045 0,000000 0,000521 0,000000 0,057369 Влияние фактора «пол» F(1,909)=12,124, p=0,00052; градации фактора: 0 – мужчины, 1 - женщины Фактор «пол» 0 Мужчины 1 Женщины 58 Влияние фактора «время после иммунизации» F(6,909)=19.891, p=0,0000); градации фактора: 1 – 1 месяц, 2 – 3 месяца,3 – 6 месяцев, 4 – 12 месяцев, 5 – 18 месяцев, 6 –24 месяца, 7 – 36 месяцев после проведенной иммунизации 1 3 6 12 18 24 30 месяцев Взаимодействие факторов «пол» и «время после иммунизации» F(6,909)=2,045, p=0,05737 1 2 3 4 5 6 7 Фактор «пол»: 0-male – мужчины; 1-female – женщины Фактор «время после иммунизации»: 1 – 1 месяц, 2 – 3 месяца,3 – 6 месяцев, 4 – 12 месяцев, 5 – 18 месяцев, 6 –24 месяца, 7 – 36 месяцев после проведенной иммунизации Рис. 8. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа зависимости уровня антител у иммунизированных доноров от пола и времени с начала иммунизации. Представлены средние арифметические и доверительный интервал при p=0,05. По оси ординат – титр антител; по оси абсцисс – градации факторов. 59 В более поздние сроки (2,5 года) обнаружено статистически значимое увеличение уровня АТ к АС у женщин по сравнению с мужчинами, p<0,001 по апостериорному критерию Дункана (см. рис. 8). Это подтвердило существование феномена, называемого в литературе иммунологическим половым диморфизмом [71,94,184], который состоит, прежде всего, в более выраженной реакции женского организма на экзогенные инвазивные факторы. Кроме того, у женщин обнаружен более высокий уровень Т-хелперных и меньшее содержание Т-регуляторных клеток, то есть более выраженная активация В-системы иммунитета, что и объясняет вышеупомянутые различия в содержании антител [182,184,185]. Как уже упоминалось [184], кроме антигенной стимуляции, факторами, приводящими к активации иммунной системы, являются изменения гормонального гомеостаза а именно, половые стероидные гормоны, которые влияют на способность зрелых эффекторных клеток к реализации иммунного ответа. Прямое воздействие половых стероидных гормонов на органы и ткани иммунной системы обеспечивается рецепторно-опосредованным путем как рецепторами прогестерона (PRA, PRB), так и эстрогенов (ER–α, ER–β) [181]. В исследованиях [173] было показано, что эстрадиол стимулирует антигенспецифический иммунный ответ, возможно путем угнетения СD8+Т-клеток и, соответственно, активации СD4+Т-клеток, и, впоследствии, регулирует Вклеточную функцию, однако, авторы отмечают дозозависимость влияния эстрогенов на Т-, В-лимфоциты и на иммунную систему в целом, а именно в высоких концентрациях эстрогены блокируют развитие Т-клеток в вилочковой железе, обеспечивают угнетение цитотоксических Т-лимфоцитов и активацию Т-хелперов, под воздействием которых активируется созревание Вклеток и, следовательно, увеличивается продукция антител в ответ на антигенную стимуляцию [184]. Поэтому представляло интерес исследования фазы менструального цикла, в которую была проведена иммунизация доноров женщин, и был получен максимальный титр специфических АТ. Было проведено исследование среди 60 доноров женщин в возрасте от 27 до 50 лет, у ко- 60 торых иммунизация проводилась в различные фазы менструального цикла (табл. 6). Таблица 6 Зависимость иммунного ответа на вакцинацию от фазы менструального цикла Количество доноров (n=60) День менструального цикла 15 11 10 9 15 4-13 14-16 17-23 24-28 менопауза Число (%) женщин с высоким титром АТ (5МЕ/мл) 15 (100,0) 9 (81,8) 7 (70,0) 3 (33,3) 4 (26,6) Полученные нами данные показали, что наибольший иммунный ответ получен при иммунизации в фолликулярную фазу цикла, выраженный – в период овуляции и в раннюю лютеиновую фазы, характеризующиеся высокой продукцией эстрогенов, а наименьший – в менопаузе что согласуется с данными литературы [71,173]. При оценке влияния возраста иммунизированных доноров на выработку АТ показано, что значимых различий у мужчин и женщин одной возрастной группы не выявлено, поэтому мужчины и женщины рассмотрены вместе. Уровень сероконверсии для группы 20-40 лет составил – 70,21%, 41-50 лет – 65,15%, 51-60 лет – 62,96%, что свидетельствует о более выраженном иммунном ответе на иммунизацию у молодых доноров в возрасте до 40 лет (табл. 7). 61 Таблица 7 Динамика противостолбнячных антител (МЕ/мл) у иммунизированных доноров в зависимости от возраста Срок исследования Исходный фон 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 1 год 1,5 года 2,0 года 2,5 года 3,0 года Возраст, лет 21-40 (1) 1,14+0,15 4,89+0,08 4,78+0,12 4,64+0,15 4,27+0,19 4,17+0,21 3,53+0,26 3,04+0,41 2,64+0,51 41-50 (2) 1,10+0,11 4,87+0,06 4,96+0,02 4,62+0,11 3,99+0,16 3,67+0,19 3,53+0,20 3,40+0,22 3,12+0,27 51-60 (3) 1,13+0,18 5,0+0,02 4,92+0,08 4,54+0,19 3,73+0,28 3,27+0,34 3,59+0,36 3,20+0,50 2,96+0,38 При исследовании динамики сохранения высоких уровней АТ показано, что за первый год снижение титра АТ у лиц в возрасте 21-40 лет, происходит в 1,15 раза в возрасте 41-50 лет в 1,23 раза и в 1,34 раза у лиц в возрасте 51-60 лет. До 1,5 лет высокий титр АТ сохранялся у 60% лиц в возрасте 21-40 лет, 40,74% лиц в возрасте 41-50 лет и 30,43% лиц в возрасте 51-60 лет. Через 2 года среди лиц 21-40 лет высокий титр АТ сохранялся у 37,5%, и у лиц 41-50 и 51-60 лет 30,0% и 30,43% соответственно, а через 3 года среди лиц 21-40 лет высокий титр АТ сохранялся лишь у 18,18%. Лица в возрасте 41-50 и 51-60 лет в своих возрастных группах имеют большее число высокоиммунных доноров 20,69% и 23,53% соответственно. В среднем, в 1,17 раза происходило ежегодное снижение титра АТ, причем у лиц в возрасте 21-40 лет в первый год титр АТ снижался меньше, чем у лиц более старших возрастных групп, а затем более быстро (табл. 8). Таблица 8 62 Динамика сохранения высоких титров АТ в зависимости от возраста (%) Срок исследования Возраст, лет 21-40 (1) 0,0 95,74 88,64 76,92 63,16 60,00 37,50 31,25 18,18 Исходный фон 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 1 год 1,5 года 2,0 года 2,5 года 3,0 года 41-50 (2) 0,0 92,42 95,24 78,69 51,61 40,74 30,00 28,57 20,69 51-60 (3) 0,0 100,0 95,83 75,00 40,00 36,84 30,43 36,36 23,53 Анализ влияния групповой и резус принадлежности иммунизированных доноров на выработку АТ показал, что наименее выраженный иммунный ответ через 1 месяц после иммунизации наблюдался у доноров женщин второй группы крови и мужчин четвертой группы крови. Наибольший иммунный ответ на вакцинацию обнаружен у женщин первой и третьей групп крови и мужчин первой и второй групп крови. Сравнительный анализ влияния групп крови на уровень выработки АТ представлен в табл. 9. Таблица 9 Динамика уровня противостолбнячных антител (МЕ/мл) у иммунизированных доноров в зависимости от группы крови Срок исследования Группа крови I II Исходный 1,14+0,11 1,08+0,16 фон 1 месяц 4,88+0,07 4,97+0,03 3 месяца 4,88+0,08 4,94+0,04 6 месяцев 4,56+0,13 4,64+0,12 1 год 3,93+0,17 4,02+0,21 1,5 года 3,62+0,23 3,74+0,23 2,0 года 3,61+0,23 3,32+0,26 3,0 года 3,46+0,23 3,16+0,23 Примечание. Уровень сероконверсии в 1 группе – 60%, в 4 – 71,43%. III IV 1,10+0,18 1,14+0,28 4,85+0,10 4,83+0,11 4,60+0,19 4,24+0,29 4,03+0,28 3,77+0,33 3,44+0,30 – 66,67%, во 2 4,87+0,13 4,92+0,08 4,81+0,19 4,10+0,40 3,76+0,42 3,49+0,49 3,18+0,33 – 68,42%, в 3 63 При изучении длительности сохранения высоких титров АТ в зависимости от групп крови, показано, что высокий титр АТ до трех лет сохраняется у доноров женщин первой и третьей групп крови и доноров мужчин четвертой группы крови, обобщенные данные по донорам представлены в табл. 10. Таблица 10 Динамика сохранения высоких титров АТ у иммунизированных доноров в зависимости от группы крови (%) Срок наблюдения (месяц) Группа крови I II III IV Исходный фон 1 3 6 12 18 24 36 0,0 95,24 94,92 76,36 49,12 47,92 34,09 33,24 0,0 97,37 94,29 71,43 52,78 40,63 26,67 22,30 0,0 92,00 87,50 81,82 61,90 42,86 38,89 32,86 0,0 92,86 92,31 91,67 54,55 45,45 37,50 31,15 При изучении динамики изменения титра АТ в зависимости от резус принадлежности доноров достоверных различий не выявлено (табл. 11). Таблица 11 Динамика уровня противостолбнячных антител (МЕ/мл) у иммунизированных доноров в зависимости от резус фактора Срок исследования Резус фактор 64 Отрицательный Положительный 0,95+0,19 4,84+0,16 5,0+0,01 5,0+0,01 3,70+0,48 3,30+0,55 3,23+0,51 3,12+0,52 1,13+0,08 4,91+0,04 4,88+0,05 4,58+0,08 4,05+0,12 3,79+0,14 3,54+0,15 3,36+0,14 Исходный фон 1 месяц 3 месяца 6 месяцев 1 год 1,5 года 2,0 года 3,0 года Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что уровень сероконверсии после проведенной иммунизации АС для доноров, составил 74,49%, причем среди мужчин он составил 57,84%, а среди женщин 91,13%, что свидетельствует о высокой иммуногенности АС используемого при иммунизации доноров с целью получения плазмы для фракционирования для производства иммуноглобулина против столбняка. Наибольший иммунный ответ на вакцинацию дали женщины первой и третьей групп крови и мужчины первой и второй групп крови в возрасте от 20 до 40 лет, но только 33% ревакцинированных АС анатоксином доноров сохранили высокий титр специфических антител через два года после проведенной иммунизации; 23,53% сохраняли высокий титр специфических антител через 3 года и только 4,14 % сохраняли высокий титр специфических антител через 4 года после иммунизации проведенное исследование выявило ежегодное падение уровня АТ у иммунизированных доноров в 1,17 раза. 3.3. Изучение активности специфического антителообразования у активных доноров плазмы, иммунизированных против клещевого энцефалита В России во второй половине XX века ареал КЭ расширился, сложились благоприятные условия для повышения эпидемиологического потен- 65 циала природных очагов инфекции, что соответствует 5-10 тыс. случаев заболеваний КЭ в год, треть заболевших составляют дети [53,108]. Практически повсеместное распространение природных очагов КЭ на территории нашей страны указывает на необходимость создания эффективных мер профилактики и терапии этого заболевания [27,57,108]. В случаях, требующих быстрого создания защитного барьера (при заражении клещами), применяется серопрофилактика специфическим иммуноглобулином. Важнейшей характеристикой препаратов иммуноглобулина против вируса КЭ является содержание в них специфических антител, которое определяет эффективность препарата как лечебного средства и зависит от наличия соответствующих антител в исходном сырье - плазме крови доноров [49,56,84,127]. Поэтому проблема его производства имеет государственную значимость. В связи с чем, нами проведено исследование уровня антителопродукции, длительности и напряженности пост вакцинального иммунитета к клещевому энцефалиту у доноров плазмы для фракционирования, вакцинированных вакциной клещевого энцефалита, и являющихся активными донорами в течение длительного времени. За 5 лет с 2006-2010 г. было обследовано 15618 доноров, из них 9486 доноров крови и 6132 доноров плазмы, в возрасте от18 до 63 лет, из них 34% составляли мужчины и 66% женщины. Проведенное исследование показало, что донации с содержанием антител к ВКЭ в плазме не менее 1:20 составляет 36 %. Среди доноров, в плазме которых определяются антитела к ВКЭ в титре 1:20 и выше, 44,6% составляют доноры вакцинированные в донорском пункте, 35,5% доноров имели вакцинации против КЭ в анамнезе по месту жительства или работы.19,9% отрицают наличие вакцинации от КЭ, но при этом у 27,8% из них были случаи укусов клещей, 42,4% снимали с себя не присосавшихся клещей после посещения леса (рис. 9). 19,9% 44,6% 66 Рис. 9. Наличие вакцинаций от КЭ у доноров При скрининге первичных доноров выявлено, что 8,8% имеют титр 1:20 и более, 36,7% 1:10 и 54,5% не имеют титров к ВКЭ (рис. 10). 8,8% 36,7% 54,5% 1:20 и выше 1:10 отсутствуют Рис. 10. Анализ скрининга АТ к ВКЭ у первичных доноров В результате исследования сделан вывод, что при использовании серологического скрининга плазмы не иммунизированных от КЭ доноров не удается заготовить необходимый для производства иммуноглобулина объем иммунного сырья. Поэтому необходимо проведение иммунизации доноров вакциной КЭ с целью обеспечения сырьевой базы производства. В связи с этим, была проведена оценка эффективности схем иммунизации и повторных ревакцинаций, проводимых через один и три года от момента окончания цикла иммунизации. На вакцинацию по 1- й схеме активной выработкой антител ответили 63,8% донора, иммунизация по 2- й схеме вызвала активный иммунный ответ у 72,4% доноров. Длительность циркуляции АТ была прямо пропорциональ- 67 на величине титра. Продолжительность сохранения титра в случае выявления у доноров низких титров АТ-ВКЭ - в среднем составила 8 недель, в случае средних титров -16-17 недель, высоких титров -28-31 недель. В результате ревакцинации активными антителопродуцентами оказались при 1- й схеме иммунизации 74,2% донора, при второй - 85,2% доноров. Положительный иммунный ответ на повторную ревакцинацию наблюдали у 81,8% доноров и у 85,1% доноров соответственно для иммунизации по схеме 1 и схеме 2 (рис. 11). % Рис. 11. Анализ эффективности различных схем иммунизаций и ревакцинаций от КЭ (р>0,05 по сравнению с группой иммунизированных по второй схеме иммунизации) Поскольку различия в иммунном ответе доноров, вакцинированных по схемам 1 и 2, не были статистически значимы, предпочтение было отдано стандартной схеме вакцинации, которая позволяла заготовить иммунную плазму на 8,6% больше. Многолетняя практика иммунизации свидетельствует, что определенная часть привитых лиц не отвечает активной антителопродукцией на введение АГ. Действительно, при использовании 2 -й схемы иммунизации у 5766 доноров, у 1407 человек (24,2%) отметили слабый иммунный ответ (1:10), 185 человек (3,2%) не дали ответа на вакцинацию, активной выработкой антител ответили 4175 (72,4%) доноров (1:20-1:640). У 530 доно- 68 ров, иммунизированных вакциной КЭ, проанализировали зависимость активности гуморального иммунитета от пола, возраста, групповой (АВО), резус принадлежности. В соответствии с возрастом доноры - активные антител продуценты (с титром антител 1:20 и выше) были разделены на 4 возрастные группы: I - от 20 до 30 лет (226 человек), II - от 31 до-40 лет (246 человек), III - от 41 до-50 лет старше (51 человек), IV - от 51 до-60 лет (7 человек). В выделенных группах процент активно ответивших на вакцину КЭ доноров составил 73,4% (166 человек), 72,4% (178 человек), 66,6% (34 человека), 57,1% (4 человека), соответственно в первой, второй, третьей и четвертой группах. Доля доноров со слабым иммунным ответом составила 26,6% (60 человек), 27,6% (68 человек), 33,4% (24 человека) и 42,9% (3 человека) соответственно (рис. 12). % 80 70 60 50 40 30 титр АТ к ВКЭ 1:20 и выше 20 титр АТ к ВКЭ 1:10 10 0 20-30 31-40 41-50 51-60 возраст доноров (лет) Рис. 12. Соотношение доноров ответивших на вакцинацию против КЭ в зависимости от возраста (%) Среди 66% вакцинированных женщин активно на вакцину КЭ ответили 78,2%, среди 34% мужчин – (54,5%). Расчеты показали, что у женщин чаще ответная реакция на вакцину КЭ была выше, чем у мужчин (р<0,05), поскольку у женщин гуморальная, составляющая иммунного ответа более выражена, чем у мужчин (длительнее продолжительность иммунного ответа, более низкий порог для его развития, а также выше пик антител), так называемый иммунологический половой диморфизмом [71,94,184]. 69 Среди вакцинированных с разной активностью иммунного ответа рассчитали частоту встречаемости групп крови (АВО) и антигена D системы Резус. Произведенные расчеты не позволили установить ассоциацию активности иммунного ответа с наличием эритроцитарных АГ. Таким образом, в результате проведенного нами исследования выявлена наиболее эффективная стандартная схема иммунизации вакциной КЭ. При изучении иммунного ответа доноров на вакцину КЭ удалось выявить признаки (возраст и пол индивида), ассоциирующиеся с разной активностью иммунного ответа. Наибольший эффект иммунизации может быть достигнут при вакцинации женщин молодого возраста от 20 до 40 лет. Доноры мужчины в возрасте 50 лет и старше дают наименьший иммунный ответ на иммунизацию вакциной КЭ. Длительность циркуляции антител ВКЭ была прямо пропорциональна величине титра. Опыт иммунизации доноров показал, что у 24,4% вакцинированных доноров титр антител к вирусу КЭ не достигает 1:20 в РТГА, а 3,2% доноров не дают ответа на вакцинацию. Привлекать этих доноров к намеренной вакцинации нецелесообразно (рис. 13). 3,2% 24,4% 72,4% титр 1:20 и выше титр 1:10 отсутствие титров 70 Рис.13. Ответ доноров на иммунизацию вакциной КЭ (%) Произведенные расчеты не позволили установить ассоциацию активности иммунного ответа с наличием эритроцитарных антигенов. Таким образом, полученные данные показали, что использование только серологического скрининга доноров не позволяет получить необходимое количество иммунного сырья с достаточно высоким уровнем противоэнцефалитных АТ. Наиболее эффективной схемой иммунизации доноров вакциной КЭ является стандартная, при этом длительность циркуляции антител ВКЭ прямо пропорциональна величине титра. Показана зависимость величины иммунного ответа на вакцину КЭ от возраста и пола донора, так наибольший эффект иммунизации достигнут при вакцинации женщин в возрасте от 20 до 40 лет. 71 ГЛАВА 4 ИЗУЧЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У АКТИВНЫХ ДОНОРОВ ИММУННОЙ ПЛАЗМЫ ПРИ ИММУНИЗАЦИИ РАЗНЫМИ ВАКЦИНАМИ Получение сырья для производства специфических иммуноглобулинов процесс не только длительный, но и весьма сложный. Он включает не только отбор доноров по критериям вирусной безопасности, но и по критериям возможности использования их плазмы в производстве направленных иммуноглобулинов. Данными критериями являются наличие в плазме доноров иммунной плазмы для фракционирования необходимого уровня общего белка не менее 50 г/л, в соответствии с рекомендациями Совета Европы, и необходимого титра АТ, а если АТ в необходимой концентрации отсутствуют, то возможность проведение иммунизации. Вопрос возможности проведения той или иной иммунизации решается только после тщательного сбора анамнеза, в том числе прививочного и предварительного определения титров специфических антител. После принятия решения о необходимости иммунизации и дачи донором информированного согласия на проведение иммунизации проводится иммунизация. Как известно иммунная реакция на введение вакцин развивается в три фазы, они характерны как для образования АТ, так и для формирования клеточного иммунитета [174]. Первая фаза – латентная, длительностью в несколько суток, интервал между введением АГ в организм и появлением АТ, цитотоксических клеток и эффекторов ГЗТ. Вторая фаза - фаза роста, ее продолжительность от 4-х дней до 4-х недель, в эту фазу происходит накопление АТ и иммунокомпетентных клеток в крови. Третья фаза-фаза снижения иммунитета, происходит сначала быстро, а затем медленно, в течение нескольких лет, или даже десятилетий [99,151,174]. Наиболее быстро происходит снижение уровней АТ классов IgM и IgА, титр АТ класса IgG снижается медленее. Чем быстрее снижается иммунитет, тем чаще необходимо вводить бустерные дозы вакцины для поддержания напряженного иммунитета, обеспечивающего наличие высоких титров поствакцинальных АТ 72 необходимых для производства направленных иммуноглобулинов [122,174]. Приобретенный поствакцинальный иммунитет обладает двумя уникальными признаками, специфичностью и иммунологической памятью, именно благодаря иммунологической памяти удается искусственно формировать длительный иммунитет [52,122,174]. 4.1. Сравнительная оценка уровня антител к антигенам, использованных для вакцинации доноров При иммунизации вакциной против КЭ с использованием профилактической, экстренной схем иммунизации, первая ревакцинация проводится через год после последней вакцинации, отдаленные ревакцинации проводятся каждые три года. Продолжительность сохранения титра АТ при проведении вакцинации в случае выявления у доноров низких титров АТ к ВКЭ - в среднем 8 недель, в случае средних титров -16-17 недель, высоких титров -28-31 недель. В результате первой ревакцинации вакциной против КЭ активными антителопродуцентами оказались 74,2% донора и 85,2% доноров. Положительный иммунный ответ на повторную ревакцинацию наблюдали уже у 81,8% доноров и у 85,1% доноров, соответственно иммунизированных по 1ой и 2 - ой схемам соответственно. При иммунизации доноров вакциной против гепатита В, с использованием, как стандартной, так и экстренной схем иммунизации наблюдали ежегодное статистически значимое снижение среднегеометрических титров антиHBs антител в динамике наблюдения (3 месяца, 6 месяцев,1 год, 2 года, 3 года 4 года), что составляло по стандартной схеме вакцинации 5,9±0,4 МЕ/мл, 3,8±1,1 МЕ/мл – 1,8±0,4 МЕ/мл, 1,4±0,4 МЕ/мл, 0,6±0,1 МЕ/мл, 0,1±0,1 МЕ/мл против 2,2±0,3 МЕ/мл 1,2±0,4 МЕ/мл, 0,6±0,1 МЕ/мл, 0,4±0,2 МЕ/мл, 0,2±0,1 МЕ/мл, 0,1±0,1 МЕ/мл – по экстренной. По результатам сравнительных наблюдений, показано, что через 4 года 75,0 % вакцинированных против гепатита В по стандартной схеме и 93,6 %, вакцинированных по экстренной схеме уже не имели необходимого титра антител (более 1,0 МЕ/мл). Установлено, что через три года после проведенной вакцинации с использованием профи- 73 лактической схемы, количество доноров имеющих титры противогепатитных АТ в концентрации достаточной для использования их плазмы для производства специфического иммуноглобулина уменьшается более чем в 2 раза (рис. 14). При изучении длительности сохранения высоких титров АТ к столбнячному анатоксину, показано что удельный вес лиц, имеющих высокий титр АТ через 1 месяц составил 95,00%, через 3 месяца - 93,13%; через 6 месяцев 77,42%; через 1 год –52,80%, через 2 года –33,00%, через 3 года –23,53%, через 4 года 7,14% (рис.14). % 100 90 80 70 60 яК на ци 3 ре ва кц и (в то р ая ва я да (п ер 4 го д го 1 вакцинация вакциной гепатита В вакцинация АС Э) да го да го 2 КЭ ) ия на ц ре ва кц и 6 3 м м ес яц ев ес яц а ес яц м 1 ис хо дн ый ти тр АТ 50 40 30 20 10 0 вакцинация вакциной КЭ Рис.14. Сравнительная оценка динамики изменения высоких титров АТ при иммунизации различными видами вакцин Снижение антителопродукции ранее иммунизированных, активных доноров плазмы, обусловлено, как индивидуальными особенностями иммунной системы донора, так и «вымыванием» специфических АТ из организма донора в процессе частых в среднем- 11,5 донаций плазмы в год с изъятием 6,78 литров плазмы ежегодно. Поэтому снижение специфических АТ после иммунизации у доноров происходит раньше, чем в соответствии с инструк- 74 цией по применению вакцин может проводиться ревакцинациия. В наименьшей степени это затрагивает доноров, иммунизированных вакциной КЭ, поскольку при данной вакцинации предусмотрены повторные ревакцинации, первая через 1 год после окончания цикла иммунизации, последующие отдаленные ревакцинации проводятся каждые три года, но как быть с донорами, иммунизированными АС и у которых титр АТ к столбнячному анатоксину снизился и составил менее 5 МЕ/мл. Следующая ревакцинация АС у них, возможна только через 5 лет, а их число значительно, через 2,5 года 60% женщин и 73% мужчин не имеют необходимого титра АТ. Среди доноров иммунизированных вакциной против гепатита В, снижение антителопродукции еще более выражено, через год после окончания цикла вакцинации 45% иммунизированных с использованием профилактической схемы и 76,5% лиц с использованием экстренной схемы иммунизации не имели необходимого титра специфических АТ. В связи с чем, вопрос иммунизации таких лиц в интервалах между ревакцинациями, проводимыми в соответствии со схемами применения вакцин, другими видами вакцин стоит весьма остро. В связи с этим следующим этапом исследования явилась оценка иммунологических показателей доноров имеющих в анамнезе предыдущие иммунизации вакцинами КЭ, ГВ, АС. Иммунизация АС доноров, приводила к увеличению и антителопродукции к ВКЭ у ранее вакцинированных против КЭ доноров в 3,5 раза уже через месяц после проведенной иммунизации, в течение времени титр АТ к ВКЭ, несколько снижался, но тем не менее в течении полутора лет титр АТ к ВКЭ сохранялся на достаточно высоком уровне. В результате проведенного анализа выявлены: сильная степень линейной связи между увеличением антителопродукции к столбнячному анатоксину и ВКЭ (r=0,73), p<0,01) по критерию Стьюдента. Линейную связь между иммунизацией АС и увеличением антителопродукции к ВГВ выявить не удалось p>0,05 (рис.15) log2 обратных титров антител 75 Рис.15. Изменение титров АТ при иммунизации АС В интервалах между ревакцинациями доноров АС, составляющими не менее 5 лет, и при снижении уровня АТ к столбнячному анатоксину менее 4,0 МЕ/мл, и при отсутствии в анамнезе вакцинаций против ВГВ, доноры вакцинировались вакциной против ВГВ. При иммунизации доноров против ВГВ была выявлена слабая обратная линейная связь (r=-0,5) между увеличением антителопродукции к ВГВ и увеличением титров АТ к ВКЭ у ранее иммунизированных против КЭ доноров. Линейную связь между увеличением антителопродукции против ВГВ и увеличением титров АТ к столбнячному анатоксину у ранее иммунизированных доноров выявить не удалось (r=0,42, p>0,05) (рис.16). log2 обратных титров антител 76 Рис. 16. Изменение титров АТ при иммунизации вакциной против гепатита В При иммунизации доноров вакциной против КЭ линейную связь между увеличением антителопродукции к ВКЭ и увеличением титров АТ к столбнячному анатоксину и ВГВ у ранее иммунизированных доноров выявить не log2 обратных титров антител удалось (r=0,41, r=0,49 соответственно, p>0,05) (рис.17). Рис.17. Изменение титров АТ при иммунизации вакциной против КЭ 77 В результате проведенного анализа оценки иммунного ответа доноров, имевших в анамнезе иммунизации вакцинами, в состав которых входил столбнячный компонент (АС, АДСМ и др.) и вакциной против КЭ, стафилококковым анатоксином выявлены: сильная степень линейной связи между увеличением антителопродукции к стафилококковому токсину и АС (r=0,89, p<0,01). Линейную связь между увеличением антителопродукции к стафилококковому log2 обратных титров антител анатоксину и ВКЭ (r=0,33, p>0,05), выявить не удалось (рис.18). Рис.18. Изменение титров АТ при иммунизации стафилококковым анатоксином Данный эффект нами связан в том числе и с использованием в вакцинных препаратах гидрооксида алюминия в качестве адъюванта. Воздействие адъювантов на иммунный ответ, как известно, в основном обусловлено двумя их свойствами: способностью удерживать антиген в том месте, где он экспонируется лимфоцитам (эффект «депо») и способностью вызывать синтез цитокинов, регулирующих лимфоцитарные функции. Таким образом, адъювант способен не только вызывать мощный иммунный ответ на различные антигены, но и эффективно управлять им, избирательно воздействуя на лимфоциты Тh1 (клеточный иммунный ответ), Тh2 (гуморальный иммунный 78 ответ), цитотоксический Т-клеточный ответ, а также неспецифический иммунитет. Действие адъюванта зависит от исходного иммунного статуса, предшествующего вакцинации. Адъювант меняет динамику развития иммунитета, ускоряя развитие и повышая уровень иммунитета, увеличивая длительность сохранения иммунитета. Адъювант усиливает иммуногенность антигенов в несколько раз, а некоторых растворимых белковых антигенов, таких как столбнячный - до ста раз. Неспецифическое иммуностимулирующее действие адъюванта ведет к увеличению продукции клетками организма соответствующих цитокинов, экспрессии молекул взаимодействия и усилению реакции со стороны лимфатических узлов, активируя систему комплемента, стимулируя пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность Т- и В - клеток, образование цитокинов, усиливая синтез АТ [207]. Наиболее широкое применение в медицине и ветеринарии получили соли алюминия. Обычно антиген смешивают с гелями А1(ОН)3 или А1Р04 [223]. Антиген адсорбируется на них посредством ионного взаимодействия. Минеральные адъюванты позволяют обеспечить более длительный процесс поступления антигенов (депонирующий эффект) [207, 215]. Данные адъюванты приводят к активации фагоцитов и запуску некоторых воспалительных реакций [177, 192]. Применение алюминиевых квасцов для адсорбции белков позволяет продлить гуморальный ответ. При внутримышечном введении описанные вещества способствуют накоплению плазматических клеток в области депо. Столбнячный анатоксин, адсорбированный на квасцах, вызывает выработку иммуноглобулина Е, благодаря минимальным побочным эффектам данный метод успешно применяют для вакцинации людей столбнячным анатоксинам [207, 223]. Известно, что многие сорбированные вакцины обладают достаточной антигенностью уже при первичной иммунизации людей. На сегодняшний день в медицинской практике большинство вакцин содержит гидроксид алюминия [210], который в первую очередь, индуцирует иммунный ответ Th2-типа и благодаря высокой способности к сорбции выполняет функцию антигенного депо, а также неспецифически 79 усиливает фагоцитоз [158]. Доза адсорбированной вакцины может содержать 0,85 – 1,3 мг гидроксида алюминия. Содержание гидрооксида алюминия в вакцинных препаратах используемых для иммунизации доноров представлено в табл. 12. Таблица 12 Содержание гидрооксида алюминия в вакцинных препаратах, используемых для иммунизации доноров № п/п 1. 2. 3. 4. Наименование вакцины Анатоксин стафилококковый Содержание алюминия гидрооксида 0,9-1,3 мг/мл Анатоксин столбнячный до 1,1мг/мл Вакцина гепатита В Вакцина клещевого энцефалита 0,5 мг/мл 0,3-0,5мг/доза Эффект >АТ к АС (r=0,89) >АТ к ВКЭ (r=0,73) - Таким образом, видно, что вакцина, содержащая в своем составе большую концентрацию гидрооксида алюминия в качестве адъюванта, стафилококковый анатоксин и столбнячный анатоксин, дает не только наиболее выраженный иммунный ответ на вводимую вакцину, но и увеличивает антителопродукцию в целом. В результате проведенных исследований выявили изменение иммунного ответа доноров, имевших ранее в анамнезе иммунизации вакцинами, в состав которых входил столбнячный компонент (АС, АДСМ и др.), вакциной против КЭ, или вакциной против ВГВ, при последующих иммунизациях не только на вводимую вакцину, но и увеличение антителопродукции в целом, а именно, выявлены сильные степени линейной связи между увеличением антителопродукции к столбнячному токсину и ВКЭ (r=0,73), между увеличением антителопродукции к стафилококковому анатоксину и столбнячному анатоксину (r=0,89, p<0,01). Зависимости между увеличением антителопродукции к ВГВ и увеличением титров АТ к ВКЭ (r=-0,5) и между увеличением ан- 80 тителопродукции к столбнячному анатоксину и ВГВ, антителопродукции к ВКЭ и увеличением титров АТ к столбнячному анатоксину и ВГВ выявить не удалось. 81 ГЛАВА 5 ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ БЕЗОПАСНОСТИ И КАЧЕСТВА ПЛАЗМЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Качество плазмы для фракционирования регламентировано нормативными документами [25,26,102,111,112,119,148] и контролируется по таким показателям, как: подлинность, цветность, рН, стерильность, уровень белка, отсутствие маркеров ГТИ HBsAg, АТ к ВГС, АТ к ВИЧ-1, ВИЧ-2 и АГ ВИЧ1, АТ к Treponema pallidum контролируется в ИФА. Отсутствие РНК ВИЧ, ДНК ВГВ, РНК ВГС в минипулах плазмы [116,117]. Так же регламентированы требования к упаковке, маркировке, условиям хранения, транспортировки и сроку годности [112]. Обеспечение инфекционной безопасности донорской плазмы является одним из основных показателей качества плазмы для фракционирования [38,40,226,233]. Изучение иммунологических показателей крови доноров характеризующих ее безопасность в отношении маркеров ГТИ, имеет первоочередное значение при производстве препаратов на основе донорской плазмы, поскольку сопряжено с высоким риском их инфицирования, ведь исходным материалом для них является жидкая часть крови – плазма, которая может содержать различные инфекционные агенты [219], ведущее место среди которых занимают вирусы и наиболее опасными, конечно же, являются ВИЧ, вирусы вызывающие ВГВ и ВГС [28,37,80,110,162,202,226]. Изучение социальной характеристики донорского контингента с целью привлечения в донорство наиболее социально значимых категорий населения (студенты, военнослужащие, и др.), формирование у них приверженности к активному участию в донорском движении, так же является одним из механизмов обеспечения качества, поскольку плазма активных доноров является наиболее безопасной в отношении возбудителей ГТИ [76,106,110]. Поиск путей формирования приверженности к регулярному, безвозмездному донорству является предметом научной и практической работы коллег из различных регионов 82 нашей страны и других стран мира [44,75,76,212,221]. Донорская плазма, используемая в производстве специфических иммуноглобулинов должна быть безопасна с точки зрения наличия возбудителей инфекционных заболеваний, которые могут передаваться при использовании препаратов крови человека, в этом отношении отбор доноров и скрининг донорской крови на наличие маркеров ГТИ имеет первоочередное значение. 5.1. Иммунологические показатели и полимеразная цепная реакция у доноров как критерии вирусной безопасности иммунной плазмы Для медицинских препаратов, получаемых из крови или плазмы человека, исходным материалом являются клетки крови и жидкая часть крови – плазма, поэтому лекарственные средства, получаемые из них, обладают рядом особенностей, связанных с природой исходного материала, а именно, содержат биологические агенты, прежде всего вирусы, распространяющие различные заболевания [32,39,80,85,86,110,121,123,142145,155,160,169,170, 172,187,202,220,226,239]. Изменение структуры донорских кадров в последние годы, материальная заинтересованность доноров, привела к участию в донорстве малообеспеченных лиц, которые пытаются утаить перенесенные заболевания и реальное состояние здоровья, что способствует увеличению абсолютного брака крови, и риску передачи вирусных инфекций при использовании компонентов и препаратов крови человека [33,235,224]. Задачей настоящего исследования явилось изучение серологических показателей крови доноров иммунной плазмы на наличие маркеров к ГТИ, с применением современных высокочувствительных тест-систем для ИФА и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), и разработка критериев отбора доноров для донации, решение вопросов временного и абсолютного отвода доноров от донорства на основании полученных результатов исследования. Для решения поставленной задачи проведена оценка серологических показателей крови доноров иммунной плазмы на наличие маркеров ГТИ за 6 83 лет, с 2006 по 2011 гг., исследования проводились на базе донорского пункта «Пермского НПО Биомед». Полученные результаты анализа показали, что в течение шести лет исследования (2006-2011 гг.), доля выявления маркеров ВГВ снизилась в 3 раза, среди доноров крови от 0,2 % в 2006 г. до 0,07% в 2009 г., среди доноров плазмы от 0,03 % в 2006 г. до 0,02% в 2009 г. Использование с 2009 г. тест системы «ДС-ИФА-НВsAg 0,01» с детекцией по НВsAg 0,01, для определения всех возможно инфицированных донаций и в тоже время для минимизации брака вследствие ложноположительных результатов, позволило уменьшить количество ложноположительных результатов исследований в 1,7 раза (табл. 13). Таблица 13 Динамика показателей скрининга НВsAg у доноров крови и плазмы Год 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Количество обследованных доноров 18814 16075 18147 20883 20949 18191 2006 2007 2008 2009 2010 2011 11302 11569 14632 14361 9451 9459 Доноры крови НачальноПодтверждающий реактивный метод метод Абс. 70 28 36 26 20 26 6 5 15 5 4 3 % Абс. 0,37 38 0,17 17 0,98 11 0,12 15 0,09 18 0,14 18 Доноры плазмы 0,05 4 0,04 3 0,10 7 0,03 1 0,04 3 0,03 2 % 0,2 0,11 0,06 0,07 0,08 0,09 0,03 0,02 0,05 0,01 0,03 0,02 Ложноположительные результаты Абс. % 32 0,17 11 0,06 25 0,92 11 0,05 2 0,01 8 0,05 2 2 8 4 1 1 0,02 0,02 0,05 0,02 0,01 0,01 Следующим этапом исследования явилась оценка показателей скрининга АТ к ВГС у доноров за период 2006-2011 гг. При оценке динамики выявления АТ к ВГС у доноров крови и плазмы так же как и при выявлении маркеров ВГВ, отмечено снижение выявления маркеров ВГС среди доноров крови в 2,3 раза от 0,9% в 2006 г. до 0,4% в 2011 г., среди доноров плазмы в 84 1,9 раза от 0,15 % в 2006 г. до 0,08% в 2011 г. С 2006 г. отмечали ежегодное уменьшение количества выявленных ВГС позитивных донаций среди доноров крови и плазмы в 1,4 и 1,7 раза соответственно. Исключение составил 2010 г., в течение которого наблюдали увеличение позитивных донаций по сравнению с 2009 г., в 1,2 раза среди доноров крови и в 1,9 раз среди доноров плазмы. Наблюдали ежегодное снижение числа ложноположительных результатов при определении маркеров ВГС в 1,1 раза. Наибольшее количество ложноположительных результатов среди доноров крови, наблюдали в 2010 г., что составило 0,38%. Среди доноров плазмы ситуация была более стабильна, в среднем количество ложноположительных результатов за период 2006-2010 гг. составило 0,11%, и только в 2011 г., так же как и среди доноров крови, наблюдали самое низкое количество ложноположительных результатов, всего 0,02%, в 2,5 раза ниже, чем за период 2006-2010 гг. (табл. 14). Таблица 14 Динамика показателей скрининга АТ к ВГС у доноров крови и плазмы Год 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Количество обследованных доноров 18814 16075 18147 20883 20949 18191 2006 2007 2008 2009 2010 2011 11302 11569 14632 14361 9451 9459 Доноры крови НачальноПодтверждающий Ложноположиреактивный метод метод тельные результаты Абс. % Абс. % Абс. % 244 1,29 186 0,99 58 0,3 152 0,9 105 0,65 47 0,25 94 0,5 70 0,38 24 0,12 124 0,6 93 0,44 31 0,16 182 0,9 109 0,52 73 0,38 85 0,47 73 0,4 12 0,07 Доноры плазмы 36 0,3 19 0,15 17 0,15 30 0,25 17 0,12 13 0,13 42 0,28 21 0,14 21 0,14 24 0,16 12 0,08 12 0,08 29 0,3 14 0,15 15 0,15 9 0,1 8 0,08 1 0,02 85 Выявления маркеров ВИЧ среди доноров крови, за исследуемый период увеличилось в 1,1 раза с 0,37 % в 2006 г. до 0,42% в 2009 г. С 2010 г. количество маркеров ВИЧ среди доноров крови снизилось в 1,9 раза и достигло 0,2% от числа обследованных доноров. Наблюдали уменьшение выявления маркеров ВИЧ среди доноров плазмы в 2 раза, от 0,06 % в 2006 г. до 0,03% в 2011 г. Анализ ложноположительных результатов при проведении скрининга на определение маркеров ВИЧ показал, что число полученных ложноположительных результатов исследований, при определении маркеров ВИЧ, среди доноров крови с 2006 по 2009 гг. в среднем составило 0,28%. Наименьшее число ложноположительных результатов при определении маркеров ВИЧ среди доноров крови наблюдали в 2010 г. и составило всего 0,01%. Среди доноров плазмы количество ложноположительных результатов с 2006 по 2010 гг. составило 0,06%. Самое низкое количество ложноположительных результатов, 0,01% отмечали в 2011 г. (табл. 15). Таблица 15 Результаты скрининга маркеров ВИЧ у доноров крови и плазмы Год 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Количество обследованных доноров 18814 16075 18147 20883 20949 18191 2006 2007 2008 2009 2010 2011 11302 11569 14632 14361 9451 9459 Доноры крови НачальноПодтверждающий Ложноположиреактивный метод метод тельные результаты Абс. % Абс. % Абс. % 152 0,8 71 0,37 81 0,43 130 0,8 60 0,37 70 0,43 140 0,77 69 0,38 71 0,39 176 0,8 88 0,42 88 0,38 45 0,21 42 0,2 3 0,01 44 0,24 36 0,2 8 0,04 Доноры плазмы 14 0,12 7 0,06 7 0,06 10 0,08 4 0,03 6 0,05 24 0,16 12 0,08 12 0,08 16 0,11 8 0,05 8 0,06 15 0,16 8 0,08 7 0,08 4 0,04 3 0,03 1 0,01 86 Применение высокочувствительных методов ИФА в большинстве случаев обеспечивает высокий уровень безопасности препаратов крови человека, но существует опасность донации крови и плазмы донором в период серонегативного окна при наличии отрицательных результатов серологического тестирования на маркеры ГТИ с использованием методов ИФА. В связи с этим, для повышения безопасности плазмы для фракционирования препаратов крови человека, в лабораторную практику введен метод дополнительного обследования, NAT-тестирования (метод исследования нуклеиновых кислот (НК) на наличие РНК ВГС, РНК ВИЧ, ДНК ВГВ в минипулах донорской плазмы для фракционирования. [118]. Применение ПЦР позволяет выявить и своевременно отвести от донации вирусоносителей, в крови которых не обнаружены серологические маркеры ГТИ [195,200,206,208]. При исследовании 14901 образцов доноров крови методом ПЦР в 135 случаях было зарегистрировано нарастание флуоресцентного сигнала, свидетельствовавшего о наличие в образце крови вирусной НК. Дискриминаторное исследование этих образцов выявило в 97 образцах РНК HCV, в 21образце ДНК HBV и в 17 образцах РНК HIV табл. 16. Таблица 16 Анализ положительных результатов при проведении скрининга доноров крови Маркер ВГВ ВГС ВИЧ Количество исследований 14901 14901 14901 Положительные образцы в подтверждающем тесте ВГВ и ВГС – в ИФА, ВИЧ иммунный блот Абс. % 21 0,14 269 1,8 19 0,13 Положительные образцы в ПЦР Абс. 21 97 17 % 0,14 0,65 0,11 Практически во всех случаях, положительные результаты, полученные в ПЦР, совпадали с положительными результатами, полученными в ИФА. Только при исследовании трех серонегативных в ИФА образцов донорской 87 крови был получен положительный результат при исследовании, проведенном методом ПЦР. В двух образцах выявлена РНК ВГС. В одном образце выявлена РНК ВИЧ. К сожалению, в дальнейшем проследить изменения в ИФА и ПЦР у данных доноров не представилось возможным, поскольку на повторные исследования доноры не явились. Сравнительный анализ частоты выявления маркеров ГТИ у доноров крови и плазмы показал, что среди активных доноров маркеры ВГВ выявляются в 7 раз реже, ВГС в 5,5, а ВИЧ в 8,4 раза реже, чем у доноров крови, среди которых около 40% составляют доноры резерва. Наибольшее количество ложноположительных результатов, в настоящее время наблюдается при определении маркеров ВГВ (НВsAg), второе место по количеству ложноположительных результатов занимают маркеры ВИЧ, наименьшее число ложноположительных результатов наблюдали при определении маркеров ВГС: 35,1%, 20,8% и 17,45% соответственно. До настоящего времени, в Российской Федерации отсутствовали нормативные документы, регламентирующие трактовку полученных сомнительных или неопределенных результатов исследований, отсутствовал алгоритм верификации ложноположительных результатов скрининга маркеров ГТИ. Оставалось не ясным, какие результаты, и на каком этапе исследований являлись основанием для выбраковки крови, и что самое важное не решены вопросы временного и постоянного отвода доноров от донорства [80,103]. Поэтому, нами в 2006 г. был разработан и успешно внедрен в работу донорского пункта «Алгоритм действий по выбраковке донорской крови и плазмы при заготовке и в процессе карантинизации». В данном алгоритме оговорены вопросы выбраковки донорской крови и плазмы при заготовке, до поступления на карантинизацию, в процессе карантинного хранения, а также вопросы временного и абсолютного отвода доноров от донорства (приложение №1). В 2009 г. вышли в свет рекомендации ВОЗ «Скрининг донорской крови на гемотрансмиссивные инфекции» [226], в 2011 г. вышли в свет Методические рекомендации [55] «Порядок проведения входного контроля на вирусную 88 безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров», приведенные в данном документе рекомендации по проведению апробации донорской крови и приему решения о взятии донации в работу полностью соответствовали положениям разработанного нами алгоритма. В «Алгоритм действий по выбраковке донорской крови и плазмы при заготовке и в процессе карантинизации» вошли основные и частные положения. 1. Основные положения алгоритма разработаны на основании Приказа МЗ РФ № 193 от 07.05.2003 г. и изменений внесенных в приказ от 19.03.2010 г. [115]. 2. Частные положения оговаривают трактовку результатов апробации донорской крови и принятие решения в отношении донора при получении сомнительных, или неопределенных результатов исследования, рассматривают вопросы медицинского отвода доноров при получении первичных положительных результатов исследования на маркеры различных ГТИ и сифилиса. При получении первично реактивного образца, проводили повторный анализ в дубле того же образца в той же системе. Если два последующих исследования отрицательные, то донацию брали в работу, полученная плазма поступала на карантинизацию. В случае всех трех положительных результатов, или двух из трех положительных результатов, донацию браковали, образец исследовали в подтверждающем тесте. При отрицательном результате подтверждающего теста, донора отводили до получения отрицательных результатов скрининга, после чего донор вновь мог быть допущен к крово или плазмодаче. В случае получения неопределенного результата подтверждающего теста – донор отводился от донорства на 6 месяцев, вся плазма этого донора находящаяся на карантинизации, браковалась, изымалась, и уничтожалась. По истечении 6 месяцев донор, после получения отрицательного результата скрининга допускался к донации. При повторном положительном результате донор отводился от донорства на 12 месяцев, а при получении по- 89 вторного положительного результата через 12 месяцев донор снимался с донорского учета. При получении положительного результата подтверждающего теста донор снимался с донорского учета, информация передавалась в региональные органы Роспотребнадзора, донор направлялся на консультацию (приложение №1). Разработанный алгоритм направлен на предотвращение попадания в производство даже подозрительной плазмы, и в то же время, на сохранение донорских кадров (отстранение донора от крово, плазмодач на 6-12 месяцев и только после получения повторных положительных или сомнительных результатов донор снимался с донорского учета). Анализ полученных результатов позволяет заключить, что при исследовании образцов донорской крови на маркеры ГТИ методами ИФА с использованием тест-систем с более высокой степенью чувствительности и специфичности, таких как «ДС-ИФА-НВsAg 0,01» с детекцией по НВsAg 0,01, и «ДС-ИФА-ВИЧ-АТ/АГ-СПЕКТР» с чувствительностью по р24-5 пг/мл, позволяет уменьшить период серонегативного окна до минимума. Наблюдение разночтимых результатов полученных в ИФА и ПЦР, подтверждает необходимость тестирования образцов донорской крови одновременно двумя методами. Таким образом, тщательное соблюдение всех этапов предварительного обследования доноров, использование современных методов апробации донорской крови с применением современных тест систем, обладающих высокой степенью чувствительности и специфичности позволяет произвести отбор доноров и заготовить донорскую кровь и плазму высокого качества и с высокой степенью вирусной безопасности, снизить затраты по заготовке и отбраковке сырья ненадлежащего качества и обеспечить высокое качество и безопасность сырья для производства препаратов крови человека. 90 5.2. Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов венозной крови доноров Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов венозной крови - показатель неспецифического клеточного иммунитета. Клеточные неспецифические механизмы защиты организма от АГ обеспечиваются способностью лейкоцитов неспецифически фагоцитировать любые АГ и являются одним из главных компонентов врождѐнного иммунитета [97,122]. Они обеспечивают первую линию в защите организма от инфекции. В основе защитной функции лейкоцитов лежит фагоцитарный процесс, заключающийся в их способности распознавать, поглощать, убивать и переваривать чужеродные клетки. К фагоцитам относят преимущественно нейтрофилы и макрофаги. Нейтрофилы после фагоцитирования АГ и формирования фагосомы за счет находящихся в цитоплазме гранул, содержащих бактериостатические и бактерицидные вещества: лизоцим, коллагеназа, катионные белки, гликопротеины, усиливающие фагоцитоз, лактоферрин, транскобаламин, сериновые протеазы, азуроцидин, миелопероксидаза, дефензимы, катепсины, лизоцим и др., разрушают АГ и обеспечивают защиту организма в основном от пиогенных бактерий [158]. Макрофаги тканей представляют собой способные к фагоцитозу клетки, которые являются потомками моноцитов крови. На долю моноцитов приходится 2-9% от общего количества лейкоцитов периферической крови. Время пребывания моноцитов в крови варьирует от 36 до 104 часов, после чего они переходят в периферические ткани, где превращаются в неподвижные клетки – гистиоциты или тканевые макрофаги. Цитоплазма моноцитов содержит различное количество азурофильных гранул, представляющих собой первичные лизосомы клетки [122]. В результате активации макрофагов, увеличивается их размер, усиливаются обменные процессы, начинается выработка ряда биологически активных веществ, таких как: простагландины, интерфероны, интерлейкины, ФНО-, и ряд других гуморальных факторов. Макрофаги способны эффективно бороться с бактериями, вирусами и простейшими, которые могут существовать внутри клеток хозяина. Фагоцитоз 91 нейтрофилами и макрофагами различных АГ структур складывается из следующих этапов: распознавание рецепторными участками плазмолеммы нейтрофила или макрофага АГ компонентов и связанная с этим процессом адгезия (прикрепление) антигена на поверхности фагоцитирующей клетки, инвагинация мембраны нейтрофила или макрофага вокруг чужеродной частицы, образование фагосомы, образование фаголизосомы, уничтожение бактерий и разрушение захваченного материала. Осуществляется в результате двух типов механизмов кислородзависимого механизма связанного с активацией гексомонофосфатного шунта и кислороднезависимого механизмов обеспечивающегося многообразными факторами: лизоцим, лактоферрин, катионные белки, интерферон и ряд других веществ, содержащихся в гранулах нейтрофилов и макрофагов [149,151,158]. Как высокочувствительный индикатор нормы и патологии, характеристики фагоцитов служат полезным инструментом не только иммунологической, но и общеклинической диагностики [149,151,157,158]. Традиционным методом оценки стадии поглощения является подсчет в окрашенных препаратах числа частиц, захваченных нейтрофилами и моноцитами (фагоцитарный индекс) и подсчет количества частиц захваченных одной клеткой (фагоцитарное число) [149]. Процентное содержание способных к фагоцитозу нейтрофилов от общего их количества (фагоцитарная активность) у взрослых, здоровых людей в возрасте от 18 до 45 лет составляет 69-99% но, несомненно, помимо возраста необходимо учитывать такие факторы, как пол, фазу овуляции у женщин, и нормы функционирования иммунной системы сложившиеся в регионе [13,157]. В Пермском крае в 2002 г., на основании более чем десятилетнего иммунологического мониторинга клинически здоровых детей и взрослых, был создано справочнометодическое пособие для врачей «Основные показатели иммунограммы детей и взрослых Пермской области» [13]. Определение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа имеет значение в комплексной диагностике как первичных, так и вторичных иммунодефицитных состояний [122,150,158]. 92 Поэтому представляло интерес изучение фагоцитарной активности лейкоцитов у активных доноров плазмы для фракционирования. Исследование проводилось в утренние часы, натощак, перед проведением процедуры п/фереза. В исследовании участвовали 102 донора – мужчины и 86 донораженщины в возрасте от 18 до 60 лет. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови проводили у активных доноров до иммунизации (табл. 17) и через месяц после проведения иммунизации (табл. 18). Фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови в исследуемых образцах оценивали модифицированным В.Н. Каплиным методом [1996] с использованием в качестве объектов фагоцитоза формалинизированных эритроцитов барана. Рассчитывали следующие относительные показатели фагоцитарной реакции по отношению к нейтрофилам: процент фагоцитоза оценивали как количество фагоцитирующих клеток на 100 подсчитанных фагоцитов; фагоцитарное число определяли как количество объектов фагоцитоза, которое в среднем приходится на 1 из 100 подсчитанных фагоцитов; фагоцитарный индекс вычисляли как количество объектов фагоцитоза, которое приходится на один фагоцит; фагоцитарная активность, процентное содержание способных к фагоцитозу нейтрофилов от общего их количества [157]. Таблица 17 Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови активных доноров плазмы до иммунизации Показатель Норма Доноры мужчины женщины мужчины женщины Фагоцитарное число ней- 0,6-1,17 0,84-1,27 0,85±0,22 1,1±0,07 1,51-1,98 1,54-2,01 1,72±0,24 40,0-62,5 52,0-68,0 56,3±0,64 57,8±0,82 трофилов венозной крови Фагоцитарный индекс ней- 1,6±0,08 трофилов % фагоцитоза нейтрофилов Фагоцитарная активность 69-99% 84,0±11,3% 93 Изменения фагоцитарной активности нейтрофилов, как у доноров мужчин, так и у доноров женщин через месяц после проведения иммунизации статистически не значимы p>0,05. Таблица 18 Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови активных доноров плазмы после иммунизации Показатель Норма Доноры мужчины женщины мужчины женщины Фагоцитарное число ней- 0,6-1,17 0,84-1,27 1,36±0,12 1,11±0,22 1,51-1,98 1,54-2,01 1,84±0,24 40,0-62,5 52,0-68,0 57,1±0,18 57,82±0,12 трофилов венозной крови Фагоцитарный индекс ней- 1,5±0,04 трофилов % фагоцитоза нейтрофилов Фагоцитарная активность 69-99% 84,4±14,6% У активных доноров плазмы для фракционирования, каковыми являются здоровые мужчины и женщины в возрасте от 18-60 лет, изменения фагоцитарной активности нейтрофилов, после проведения иммунизаций носят транзиторный характер. 5.3 Показатели белкового обмена доноров иммунной плазмы Потребность отечественного здравоохранения в препаратах крови человека не только не уменьшается, но неизменно растет и такие препараты как «Альбумин» и специфические иммуноглобулины имеют одно из приоритетных значений при оказании медицинской помощи пациентам с тяжелыми заболеваниями, сопровождающимися потерей белка и иммунодефицитами. Плазма, полученная от здорового донора, в соответствии с рекомендациями Совета Европы должна содержать не менее 50 г/л общего белка [139,233]. Содержание общего белка в донации плазмы зависит от уровня белка в сыворотке крови донора [78,106]. Одной из первоочередных задач отечественного здравоохранения при производстве препаратов из крови человека является 94 обеспечения их безопасности, эффективности и в то же время обеспечение сохранения здоровья доноров [40,137,199]. Поскольку для производства иммуноглобулинов направленного действия и альбумина большое значение имеет исходный уровень сывороточного белка, соотношение белковых фракций в крови доноров плазмы для фракционирования. Представляло интерес исследовать уровень плазменных белков у первичных доноров и активных доноров плазмы для фракционирования, в зависимости от таких факторов как: пол, возраст, частота донаций, объем плазмодач, социальный статус. Были обследованы 2990 доноров плазмы для фракционирования в возрасте от 18 до 60 лет, из них 1404 первичных донора и 1586 активных доноров, том числе 1677 мужчин и 1313 женщин (табл. 19). Исследования проводили в соответствии с приказом МЗ РФ № 364 от 14.09.2001 г. и приказом МЗ РФ № 175н от 16.04.2008 г., которые включали определение уровня общего белка и его фракций: альбумина, суммы глобулинов, α1-глобулинов, α2-глобулинов, ß-глобулинов, γ-глобулинов. Таблица 19 Абсолютное количество обследованных мужчин и женщин различных возрастных групп среди первичных и активных доноров плазмы Активные доноры Возраст, лет Мужчины Женщины Всего 18-20 65 91 156 21-30 286 104 390 31-40 169 143 312 41-50 260 221 481 50-60 130 117 247 18-60 910 676 1586 Первичные доноры Мужчины Женщины Всего 221 247 468 247 221 468 130 104 234 104 39 143 65 26 91 767 637 1404 Показано, что среди первичных доноров, обратившихся в донорский пункт впервые, наибольшее количество доноров 66,6% представлено молодежью в возрасте от 18 до 30 лет, и если число первичных доноров в возрасте от 18 до 20 и от 20 до 30 лет составляет 33,3%, то с возрастом количество первичных доноров уменьшается. Среди лиц от 31 до 40 лет в 2, а от 41 до 95 50 лет в 4 раза , а в возрасте от 50 до 60 лет в 6 раз меньше первичных доноров, чем среди молодежи. Наибольшее количество женщин, как среди первичных, так и среди активных доноров наблюдается в возрастной группе от 18 до 20 лет (17,59%), что на 2% больше, чем первичных доноров мужчин этой возрастной группы, в старших возрастных группах большее количество первичных доноров составляют мужчины. Среди активных доноров, в отличие от первичных доноров, наибольшее количество - это доноры, более старших возрастных групп 30,3% доноры в возрасте от 41 до 50 лет (табл.20). Таблица 20 Соотношение мужчин и женщин различных возрастных групп среди первичных и активных доноров плазмы (%) Активные доноры Возраст, лет Мужчины Женщины Всего 18-20 4,10 5,74 9,84 21-30 18,03 6,56 24,59 31-40 10,66 9,02 19,67 41-50 16,39 13,93 30,33 51-60 8,20 7,38 15,57 18-60 57,38 42,62 100,0 Первичные доноры Мужчины Женщины Всего 15,74 17,59 33,33 17,59 15,74 33,33 9,26 7,41 16,67 7,41 2,78 10,19 4,63 1,85 6,48 54,63 45,37 100,0 При изучении социальных групп, которым принадлежат доноры плазмы, выявлено преобладание лиц рабочих специальностей, как среди активных, так и среди первичных доноров 31,97 и 37,96% соответственно. Студенты занимают второе место среди первичных доноров и треть среди активных доноров 32,41 и 13,93% соответственно. Группа безработных доноров занимает третье место среди как активных, так и первичных доноров, что является показателем материальной заинтересованности значительной части доноров (таб. 21). 96 Таблица 21 Соотношение различных социальных групп среди первичных и активных доноров плазмы плазмы (%) Активные доноры Первичные доноры Социальный статус Мужчины Женщины Всего Мужчины Женщины Всего Рабочий 25,41 6,56 31,97 20,37 17,59 37,96 Служащий 7,38 20,49 27,87 7,41 2,78 10,19 Студент 4,10 9,84 13,93 12,96 19,44 32,41 Безработный 20,49 5,74 26,23 13,89 5,56 19,44 Итого 57,38 42,62 100,00 54,63 45,37 100,00 При исследовании белкового состава сывороток крови установлено, что содержание общего белка и белковых фракций у первичных доноров обоего пола соответствовало нормальным показателям. При этом обнаружены корреляции ряда показателей от пола: альбумин (0,20), глобулин (0,20), коэффициент А/Г (0,21), гамма-глобулины (0,19). Обнаружены статистически значимые отличия уровня альбумина и суммы глобулинов у мужчин и женщин. Средний уровень альбумина у мужчин составил 60,73±0,37%, у женщин-59,64±0,36%, сумма глобулинов- 39,27±0,37% и 40,36±0,36%, соответственно. Следует отметить, что разница содержания глобулинов наблюдалась за счет более высокого значения у женщин α2 и γ – глобулинов (табл. 22). 97 Таблица 22 Показатели уровня общего белка и его фракций у первичных доноров плазмы в зависимости от пола Показатели Мужчины Женщины Общий белок, г/л 75,31±0,57 74,85±0,61 Альбумины, % 60,73±0,37 59,64±0,36* Альбумины, г/л 45,73±0,3 44,64±0,26* Глобулины, % 39,27±0,37 40,36±0,36* Глобулины, г/л 29,64±0,28 30,21±0,26* Коэффициент (А/Г) 1,56±0,02 1,49±0,02* α1-глобулины, % 2,92±0,05 2,90±0,05 α1-глобулины, г/л 2,2±0,04 2,17±0,04 α2-глобулины, % 8,54±0,18 8,83±0,13 α2-глобулины, г/л 6,45±0,13 6,23±0,1 β-глобулины, % 11,38±0,17 11,35±0,15 β-глобулины, г/л 8,59±0,13 8,49±0,12 γ-глобулины, % 16,43±0,28 17,28±0,30* γ-глобулины, г/л 12,4±0,21 12,93±0,15* Примечание. * - р<0,05 по критерию Манна-Уитни по сравнению с группой мужчин. Обнаружены корреляции ряда показателей от возраста первичных доноров: статистически значимые отличия уровня α1-глобулина у первичных доноров плазмы возрасте 18-30 и 41-60 лет, 2,83±0,04 и 3,08±0,08 соответственно, увеличение уровня β-глобулина (0,46) с возрастом у первичных доноров плазмы 10,99±0,12, 11,83±0,26, 12,43±0,25 (табл. 23). 98 Таблица 23 Показатели уровня общего белка и его фракций у первичных доноров плазмы в зависимости от возраста Показатели Возраст (лет) 18-30 (1) 31-40 (2) 41-60 (3) Общий белок, г/л 75,25±0,51 75,27±0,77 74,34±1,29 Альбумины, % 60,63±0,33 59,88±0,60 59,06±0,57 Альбумины, г/л 45,62 ±0,24 45,07±0,45 41,54±0,4 Глобулины, % 39,37±0,33 40,12±0,60 40,94±0,57 Глобулины, г/л 29,62±0,24 30,19±0,45 28,79±0,4 Коэффициент (А/Г) 1,55±0,02 1,50±0,04 1,45±0,03 α1-глобулины, % 2,83±0,04 3,03±0,07 3,08±0,08*1-3 α1-глобулины, г/л 2,13±0,03 2,28±0,05 2,16±0,05*1-3 α2-глобулины, % 8,52±0,12 8,63±0,028 9,30±0,37 α2-глобулины, г/л 6,41±0,1 6,49±0,022 6,53±0,26 1-2 β-глобулины, % 10,99±0,12 11,83±0,26* 12,43±0,25*1-3 β-глобулины, г/л 8,26±0,08 8,9±0,18*1-2 8,74±0,21 γ-глобулины, % 17,03±0,27 16,6±0,50 16,14±0,34 γ-глобулины, г/л 12,81±0,23 12,49±0,37 11,35±0,23 Примечание: * - р<0,05 по критерию Крускала-Уоллиса к группе 18-30 лет. Обнаружены корреляции ряда показателей от социального статуса доноров, так у доноров студентов отмечался самый низкий уровень βглобулина 10,83±0,17, (0,21) и самый высокий уровень γ-глобулина 17,52±0,36 (0,22) в отличии от других социальных групп доноров (таб. 24) Таблица 24 Показатели уровня белка и его фракций у первичных доноров плазмы в зависимости от социального статуса Показатели Общий белок, г/л Альбумины, % Альбумины, г/л Глобулины, % Глобулины, г/л Коэффициент (А/Г) α1-глобулины, % α1-глобулины, г/л α2-глобулины, % α2-глобулины, г/л β-глобулины, % β-глобулины, г/л γ-глобулины, % γ-глобулины, г/л Примечание. ** - Рабочий (1) 75,30±0,59 60,48±0,44 45,54±0,33 39,52±0,44 29,75±0,33 1,54±0,03 Социальный статус Служащий Студент (2) (3) 76,02±1,39 74,59±0,75 59,83±0,53 60,08±0,48 45,48±0,4 44,81±0,35 40,17±0,53 39,92±0,48 30,53±0,4 29,77±0,34 1,52±0,03 1,49±0,03 Безработный (4) 75,08±1,12 60,26±0,66 45,24±0,5 39,74±0,66 29,83±0,5 1,53±0,04 2,93±0,06 2,89±0,13 2,83±0,05 3,01±0,07 0,72±0,04 2,19±0,09 2,11±0,03 2,25±0,05 8,69±0,20 8,18±0,28 8,74±0,17 8,75±0,32 6,54±0,15 6,17±0,23 6,63±0, 09 6,56±0,23 2-3 11,51±0,17 12,21±0,40 10,83±0,17** 11,55±0,26 2-3 8,66±0,12 9,27±0,36 8,07±0,12** 8,66±0,23 16,39±0,34 16,89±0,51 17,52±0,36 16,42±0,47 12,72±0,31 12,83±0,47 13,06±0,31 12,32±0,35 р<0,01 по критерию Крускала-Уоллиса к служащим. Дан- ный эффект скорее всего обусловлен возрастными особенностями группы «Студенты». В сводной таблице представлены данные по содержанию уровня общего белка, альбумина и суммы глобулинов в зависимости от социального статуса и пола у первичных доноров (табл. 25). 100 Таблица 25 Показатели уровня белка и его фракций у первичных доноров плазмы в зависимости от социального статуса и пола Статус Пол Рабочий (1) Служащий (2) Студент (3) Безработный (4) мужчины женщины мужчины женщины мужчины женщины мужчины женщины Общий белок (г/л) 76,12±0,80 74,20±0,85 75,00±1,57 78,73±2,73 75,34±1,30 74,10±0,92 74,09±1,31 77,55±1,99 Показатели Альбумины Глобулины (%) (%) 60,97±0,68 39,03±0,68 59,83±0,55 40,17±0,55 60,27±0,57 39,73±0,57 58,65±1,08 41,35±1,08 60,69±0,77 39,31±0,77 59,68±0,62 40,32±0,62 60,59±0,83 39,41±0,83 59,43±1,02 40,58±1,02 К (А/Г) 1,58±0,04 1,50±0,03 1,52±0,04 1,42±0,06 1,56±0,05 1,49±0,04 1,55±0,05 1,47±0,06 Таблица 26 Показатели уровня глобулиновых фракций белка у первичных доноров плазмы в зависимости от социального статуса и пола Группы Рабочий (1) Служащий (2) Студент (3) Безработный (4) мужчины женщины мужчины женщины мужчины женщины мужчины женщины α1глобулины 2,97±0,09 2,91±0,09 2,88±0,13 2,93±0,38 2,82±0,11 2,83±0,06 2,98±0,08 3,09±0,13 Показатели (%) α2βглобулины глобулины 8,58±0,30 11,33±0,28 8,85±0,27 11,72±0,20 7,79±0,27 12,02±0,51 9,21±0,12 12,73±0,59 8,62±0,33 10,85±0,27 8,82±0,17 10,82±0,22 8,83±0,43 11,63±0,33 8,56±0,39 11,36±0,43 γглобулины 16,14±0,45 16,68±0,54 17,05±0,52 16,48±1,43 17,03±0,66 17,86±0,42 15,97±0,57 17,57±0,71 Дисперсионный анализ Крускала-Уоллиса не выявил достоверных различий между 8 группами. При сравнении отдельно по мужчинам (4 группы) – нет отличий, по женщинам (4 группы) - р<0,05 по β-глобулину 1) между студентами и рабочими, 2) между студентами и служащими. Следующим этапом исследований явилась оценка белковых показателей активных доноров в зависимости от пола табл. 27. 101 Таблица 27 Показатели уровня белка и его фракций у активных доноров плазмы Показатели Мужчины Женщины Общий белок, г/л 73,40±0,50 72,79±0,56 Альбумины, % 60,60±0,38 58,88±0,43** Альбумины, г/л 44,48±0,27 42,92±0,31** Глобулины, % 39,40±0,38 41,12±0,43** Глобулины, г/л 28,91±0,27 29,91±0,31** Коэффициент (А/Г) 1,55±0,02 1,45±0,03** α1-глобулины, % 2,85±0,05 2,98±0,04 α1-глобулины, г/л 2,09±0,03 2,16±0,31 α2-глобулины, % 8,46±0,12 8,96±0,15* α2-глобулины, г/л 6,21±0,09 6,51±0,11* β-глобулины, % 12,01±0,17 12,15±0,20 β-глобулины, г/л 2,71±0,01 8,83±0,17 γ-глобулины, % 16,07±0,29 17,03±0,37* γ-глобулины, г/л 11,78±0,09 12,38±0,31* Примечание. **- р<0,005, * - р<0,05 по критерию Манна-Уитни в сравнении с группой мужчин. При исследовании биохимических показателей крови в группе активных доноров плазмы обнаружены корреляции ряда показателей от пола: у мужчин доноров отмечался более высокий уровень альбумина 60,60±0,38 (0,26) и более низкий уровень глобулинов 39,40±0,38 (0,26), по сравнению с донорами женщинами 58,88±0,43, 41,12±0,43 соответственно и как следствие более высокий уровень коэффициента А/Г у доноров мужчин по сравнению с донорами женщинами (0,26). Среди фракций глобулина, у доноров женщин наблюдался более высокий уровень α2 (0,22) и γ- глобулина (0,19). Полученные данные аналогичны результатам, полученным при сравнении первичных доноров плазмы. Обнаружены корреляции ряда показателей от возраста активных доноров плазмы: уменьшение уровня альбумина - 60,95±0,45, 59,77±0,97 и 59,08±0,44 (0,25), увеличение уровня глобулинов - 39,04±0,45, 39,04±0,45 и 40,92±0,44, и соответственно уменьшение коэффициента (А/Г) с возрастом 1,57±0,03, 1,50±0,06 и 1,46±0,03 (0,25), увеличение показателей β-глобулина 102 у активных доноров более старшего возраста 11,62±0,19, 12,23±0,55 и 12,34±0,18 (0,22) (табл. 28). Таблица 28 Показатели уровня общего белка и его фракций у активных доноров плазмы в зависимости от возраста Показатели Возраст, лет 18-30 (1) 31-40 (2) Общий белок, г/л 72,55±0,55 73,28±1,32 Альбумины, % 60,95±0,45 59,77±0,97 Альбумины, г/л 44,21±0,29 44,11±0,71 Глобулины, % 39,04±0,45 39,04±0,45 Глобулины, г/л 28,32±0,29 28,6±0,38 Коэффициент (А/Г) 1,57±0,03 1,50±0,06 α1-глобулины, % 2,90±0,06 2,87±0,11 α1-глобулины, г/л 2,1±0,04 2,1±0,08 α2-глобулины, % 8,66±0,14 8,44±0,35 α2-глобулины, г/л 6,28±0,11 6,18±0,31 β-глобулины, % 11,62±0,19 12,23±0,55 β-глобулины, г/л 8,35±0,08 8,87±0,49 γ-глобулины, % 15,87±0,36 16,69±0,86 γ-глобулины, г/л 11,51±0,3 12,22±0,68 Примечание: * - р<0,05 по критерию Крускала-Уоллиса. 41-60 (3) 73,53±0,59 59,08±0,44*1-3 43,44±0,32*1-3 40,92±0,44*1-3 30,08±0,32*1-3 1,46±0,03*1-3 2,93±0,05 2,15±0,02 8,79±0,16 6,54±0,08 12,34±0,18*1-3 9,07±0,09*1-3 16,85±0,34 15,84 Анализ показателей уровня белка, альбумина, глобулинов и его фракций у активных доноров плазмы в зависимости от социального статуса представлен в табл. 29. 103 Таблица 29 Показатели уровня белка и его фракций у активных доноров плазмы в зависимости от социального статуса Социальный статус Показатели Рабочий Служащий Студент Безработный (1) (2) (3) (4) Общий белок, г/л 73,38±0,65 74,06±0,55 72,66±0,84 72,14±0,73 Альбумины, % 59,82±0,55 58,55±0,55 60,55±0,48 60,95±0,57*2 Альбумины, г/л 43,89±0,4 43,37±0,41 44,0±0,35 43,97±0,42*2 Глобулины, % 40,18±0,55 41,45±0,55 39,45±0,48 39,04±0,57*2 Глобулины, г/л 29,48±0,30 30,78±0,41 28,67±0,35 28,17±0,42*2 К (А/Г) 1,51±0,03 1,43±0,03 1,54±0,03 1,58±0,04*2 α1-глобулины, % 2,91±0,07 2,84±0,06 3,00±0,09 2,92±0,07*2 α1-глобулины, г/л 2,13±0,03 2,11±0,05 2,180,07 2,11±0,05 α2-глобулины, % 8,69±0,19 8,66±0,19 8,88±0,21 8,56±0,19 α2-глобулины, г/л 6,38±0,17 6,43±0,18 6,46±0,19 6,18±0,08 β-глобулины, % 12,27±0,24 12,30±0,26 11,28±0,26 12,00±0,24 β-глобулины г/л 9,01±0,19 9,14±0,19 8,2±0,22 8,66±0,20 γ-глобулины, % 16,31±0,40 17,65±0,43 16,28±0,51 15,56±0,46*2 γ-глобулины, г/л 11,97±0,3 13,11±0,32 11,84±0,50 11,23±0,41*2 Примечание: * - р<0,05 по критерию Крускала-Уоллиса в сравнении с группой «Студенты». В сводной таблице представлен анализ показателей уровня белка, альбумина, суммы глобулинов у активных доноров плазмы в зависимости от социального статуса и пола доноров (табл. 30). 104 Таблица 30 Показатели уровня белка, альбумина, суммы глобулинов у активных доноров плазмы в зависимости от социального статуса и пола Статус Пол Общий белок (г/л) мужчины 73,57±0,75 Рабочий (1) женщины 72,61±1,31 Служащий мужчины 74,18±1,61 (2) женщины 74,01±0,87 Студент мужчины 75,20±1,06 (3) Женщины 71,60±0,96 Безработный 72,55±4,31 Мужчины (4) Женщины 70,69±1,26 Показатели Альбумины Глобулины (%) (%) 60,22±0,58 39,78±0,58 58,27±1,47 41,73±1,47 59,46±1,19 40,54±1,19 58,22±0,61 41,78±0,61 61,29±0,96 38,71±0,96 60,25±0,55 39,75±0,55 2 61,33±3,18* 38,67±3,18*2 ж ж 59,60±1,20 40,40±1,20 К (А/Г) 1,53±0,04 1,42±0,09 1,48±0,07 1,41±0,04 1,59±0,07 1,52±0,04 1,60±0,20 *2ж 1,49±0,08 В сводной таблице представлен анализ показателей фракций глобулинов у активных доноров плазмы в зависимости от социального статуса и пола доноров (табл. 31). Таблица 31 Показатели уровня белковых фракций глобулинов у активных доноров плазмы в зависимости от социального статуса и пола Группы Рабочий (1) Служащий (2) Студент (3) Безработный (4) Мужчины Женщины Мужчины Женщины Мужчины Женщины Мужчины Женщины α1глобулины 2,86±0,08 3,14±0,08 2,69±0,15 2,89±0,21 2,94±0,24 3,02±0,09 2,88±0,42 3,05±0,10 Показатели (%) α2βглобулины глобулины 8,53±0,20 12,18±0,26 9,33±0,43 12,62±0,60 8,20±0,44 12,13±0,50 8,83±0,21 12,36±0,30 8,77±0,26 11,15±0,66 8,93±0,28 11,33±0,26 8,42±0,92 11,94±1,40 9,05±0,58 12,23±0,49 γглобулины 16,22±0,45 16,64±0,91 17,51±0,66 17,70±0,54 15,85±0,55 16,46±0,69 15,42±2,56 16,07±1,06 Причем дисперсионный анализ Крускала-Уоллиса не выявил достоверных различий между мужчинами (4 группы) и женщинами (4 группы) по отдельности. 105 По результатам корреляционного и регрессионного анализа взаимосвязи исследуемых показателей среди доноров плазмы установлено, что такие характеристики как, содержание общего белка у активных доноров плазмы, имеющих в среднем 11,5 плазмодач в год ниже, чем у первичных доноров 73,14±0,37 г/л и 75,10±0,42 г/л соответственно, а уровень ß-глобулина выше, чем у первичных доноров 12,07±0,13% и 11,37±0,11% соответственно. Установлено, что такие характеристики как содержание альбумина, суммы глобулинов, в частности α2-глобулин и γ- глобулин, у женщин являются возраст зависимыми. У мужчин такой вывод сделан в отношении большинства показателей, за исключением - γ глобулина. Наиболее выраженная связь отмечена для уровня ß-глобулина, с возрастом этот показатель увеличивался. Проведен анализ содержания белковых фракций сыворотки крови в зависимости от социального статуса. Установлено, что уровень общего белка у женщин-служащих и мужчин студентов выше, чем в других группах, а особенно в сравнении с безработными. Наибольшее значение альбумина и наименьшее суммы глобулинов, в том числе α1-глобулинов, отмечено у студентов (мужчин и женщин) и α2-глобулинов у мужчин служащих. Содержание ßглобулинов оказалось выше у служащих и самым низким у студентов, наибольший уровень γ-глобулинов отмечен у служащих и наименьший у безработных мужчин. По результатам исследования установлено, что частота и объем плазмодач хотя и оказывали влияние на показатели белкового состава сыворотки крови у активных и первичных доноров плазмы в отношении уменьшения уровня общего белка 73,14±0,37 г/л и 75,10±0,42 г/л и повышения уровня ß-глобулина 12,07±0,13% и 11,37±0,11% соответственно, но не выходили за границы установленных возрастных норм по данным показателям. Таким образом, в результате проведенного анализа можно сделать заключение о том, что частота и объем заготовки плазмы на показатели белкового состава сыворотки крови доноров не оказывали существенного влияния, а наиболее перспективными для донорства плазмы для фракционирования 106 являются женщины и мужчины служащие и мужчины студенты в возрасте до 30 лет. 5.4 Социологическая оценка кадрового потенциала активных доноров плазмы для фракционирования Для решения вопроса эффективной реализации донорского потенциала, важно знать социальную характеристику доноров [44,75,76,77,79,161,212,221]. Изучение структуры, оценка состояния здоровья донорского контингента, составление психологического портрета, мониторинг доноров, анализ причин медицинских отводов, мотиваций доноров к активному, безвозмездному донорству, оценка удовлетворенностью донора процессом донации несомненно важны для решения вопроса эффективной реализации донорского потенциала [44,75,76,77,79,161,221,230]. В связи с этим нами был проведен комплексный анализ социального портрета доноров с целью получения иммунной плазмы для фракционирования высокого качества, используемой в производстве направленных иммуноглобулинов с применением традиционных инструментов управления донорским потенциалом, опросы и анкетирование доноров. В данной главе представлены материалы социальной характеристики доноров «Пермского НПО «Биомед». Несмотря на сложную ситуацию, связанную с привлечением доноров, в Пермском НПО «Биомед», с 2007 по 2010 гг., отмечалось увеличение количества доноров крови на 30%, что составило 4874 человек. С 2006 по 2009 год отмечалось увеличение и количества доноров плазмы на 3053 человека. И если в 2007 г. количество доноров плазмы увеличилось на 2% по сравнению с 2006 г., то в 2008 увеличение количества доноров достигло 26% по сравнению с 2007 г. Уменьшение числа доноров плазмы наблюдалось с 2009г., и если за 2009г. оно составило лишь 2%, то в 2010 количество доноров плазмы снизилось уже на 34% за год. С 2011 г. уменьшилось и 107 количества доноров крови, на 13%, по сравнению с 2010 г., что составило 2758 человек и что соответствовало показателю 2008 г. Анализ распределения доноров по половому признаку показал, что большую часть доноров крови составили женщины - 53%, при этом доля мужчин - 47% . Среди доноров плазмы большая часть представлена мужчинами - 72%, доля женщин составила 28%. Необходимо учесть, что 32% доноров имели смешанные донации, как крови, так и плазмы. В соответствии с возрастом все доноры были разделены на 6 возрастных групп. Структура доноров крови в соответствии с возрастным признаком представлена на рис. 19. % 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 женщин ы мужчины возраст 18-20 21-30лет 31-40 лет лет 41-50 лет 51-60 старше лет 60 Рис. 19. Половозрастная структура доноров крови в % Из полученных результатов следует, что основная часть доноров крови, 63%, представлена людьми в возрасте от 31 года до 50 лет. В возрастных группах от 31 года и старше преобладали женщины, а в группе от 18 до 30 лет количество мужчин и женщин практически одинаково. Структура доноров плазмы в соответствии с возрастным признаком представлена на рис. 20. 108 % 30 25 20 женщины 15 мужчины 10 5 возраст 0 18-20 лет 31-40 лет 51-60 лет Рис. 20. Возрастная структура доноров плазмы в % Основная часть доноров плазмы, представлена людьми в возрасте от 21 года до 50 лет, их доля составила 68,8%. Во всех возрастных группах преобладали мужчины. Из полученных данных видно, что среди доноров крови преобладают женщины (53%) в возрасте от 31-50 лет, среди доноров плазмы мужчины (72%) в возрасте от 21 до 50 лет. Анализ доноров старшей возрастной категории показал, что среди доноров крови, лиц в возрасте старше 60 лет (0,3%) это женщины, среди доноров плазмы доноров старше 60 лет, как правило, нет. Следующим этапом исследования явилась оценка профессиональной принадлежности в зависимости от пола и возраста (табл. 32). 109 Таблица 32 Сравнительный анализ принадлежности доноров по полу, возрасту и профессии Пол/возраст безработный женский 14,59 18-20 0,27 21-30 2,16 31-40 4,86 41-50 3,51 51-60 3,51 61 и старше 0,27 мужской 11,62 18-20 1,08 21-30 1,62 31-40 2,70 41-50 4,59 51-60 1,62 итог 26,22 (профессия) Показатель (%) Профессия рабочий служащий 27,30 10,00 0,54 5,68 0,54 9,46 4,05 7,57 4,32 4,05 1,08 30,00 4,05 0,81 6,22 1,08 10,27 2,16 8,65 0,27 4,05 0,54 57,30 14,05 Общий итог (пол/возраст) студент 1,35 0,81 0,54 1,08 0,81 0,27 2,43 53,24 1,62 8,92 18,38 15,41 8,65 0,27 46,78 1,89 9,73 15,14 13,78 6,22 100,00 При оценке профессиональной принадлежности доноров в зависимости от пола и возраста установлено, что в группе рабочих доминировали мужчины и женщины в возрасте от 31 до 40 лет (10,27% и 9,46% соответственно). Среди безработных большая часть представлена женщинами в возрасте от 31 до 40 лет и мужчинами от 41 до 50 лет (4,86% и 4,59% соответственно). Среди служащих женщины и мужчины в возрасте от 31 до 40 лет составляли 4,05% и 2,16% соответственно. Самое небольшое количество доноров - 2,43% составили студенты, среди которых, основное количество представлено женщинами и мужчинами в возрасте 18 - 20 лет, что составляет по 0,81% каждой группы. Из представленных данных видно (табл. 30), что среди доноров женщин в каждой возрастной группе большее количество занимают лица рабочих специальностей, эта тенденция сохраняется и среди доноров мужчин, за 110 исключением возрастной группы от 18 до 20 лет, в ней большая часть представлена безработными - 1,08% против 0,81 % рабочих и студентов. Поскольку наиболее безопасной при производстве, как компонентов, так и препаратов крови человека считается плазма безвозмездных доноров, нами проведен сравнительный анализ количества и соотношения платных и безвозмездных донаций (табл. 33). Таблица 33 Сравнительный анализ количества и соотношений платных и безвозмездных донаций за период 2006-2011гг. Год Доноры крови, чел. Количество донаций 2006 2007 2008 2009 2010 2011 18814 16075 18147 20883 20949 18191 2006 2007 2008 2009 2010 2011 11302 11569 14632 14361 9451 9459 Платных Безвозмездных 18394 420 15683 392 17882 265 20640 243 20633 316 17970 221 Доноры плазмы, чел. 10926 376 11183 386 14416 216 14145 216 9264 187 9229 230 Соотношение количества безвозмездных и платных доноров 1:44 1:40 1:67 1:85 1:65 1:81 1:29 1:29 1:67 1:65 1:50 1:40 Представленные результаты показали, что максимальное количество доноров участвующих в безвозмездных донациях отмечалось в период 2006 и 2007гг., 420 и 392 доноров крови и 376 и 386 доноров плазмы соответственно. Среди доноров крови в этот период приходилось на одну безвозмездную донацию от 40 до 44 платных донаций, среди доноров плазмы на одну безвозмездную донацию приходилось 29 платных донаций. Полученные данные показали что доноров участвующих в безвозмездных донациях среди доно- 111 ров плазмы в 1,5 раза больше, чем среди доноров крови. Начиная с 2008 г., количество безвозмездных донаций, как крови, так и плазмы уменьшилось в среднем в 2 раза, что свидетельствует в большей степени о материальной заинтересованности доноров. Для проведения социального опроса доноров нами была разработана специальная форма анонимной анкеты, в которой донору предлагалось самому дать ответы на 15 вопросов, и были предложены варианты ответов на некоторые из них (см. глава 2). В мотивации донорства важны как моральные, так и материальные факторы. Донорам было предложено самостоятельно оценить свое материальное состояние как хорошее, удовлетворительно или неудовлетворительное и отметить мотивы, которыми они руководствовались (табл. 34), ведь не секрет, что сдача крови является для многих доноров дополнительным заработком. Таблица 34 Структура доноров по уровню материального состояния и мотивам для донорства Материальное состояние неудовлетворительное удовлетворительное хорошее Общий итог Мотивы для донорства Альтруи Материа Сочетание стические льные мотивов 8% 6% 5% 28% 28% 5% 8% 12% 10% 44% 46% Общий итог 14% 61% 25% 100% Полученные результаты показали, что в целом, 46% доноров сдавали кровь из-за сочетания как материальных, так и альтруистических мотивов, 44% признали, что ими движет материальный интерес, и лишь 10% опрошенных сдавали кровь из альтруистических соображений. Таким образом, отмечалось преобладание материального стимула над альтруистическим, не смотря на то, что 61% доноров имело удовлетворительное материальное со- 112 стояние, при этом 46 % доноров отмечали важность льгот и социального статуса нагрудного знака «Почетный донор России». Отмечаемые большинством доноров, хорошее самочувствие в процессе и после донации, комфорт во время донации, устойчиво взаимосвязаны и положительно коррелируют с намерением продолжать и в дальнейшем донорскую практику, поэтому был задан вопрос о том, что, по мнению доноров, необходимо сделать для улучшения работы в донорском пункте. Так, 46% опрошенных доноров ответили, что хотели бы повышения компенсации за питание и сданную кровь, 8% были недовольны процессом ожидания. Необходимость в горячем питании, дополнительных местах отдыха, после процедуры кроводачи, отметили 2%, 44% респондентов не заполнили графу предложения. Анализ полученных результатов показал, что у доноров сформирована высокая приверженность к донорству - 80 % из числа опрошенных доноров плазмы и 76% доноров крови практикуют донации не реже 4-5 раз в год. Поскольку наиболее рациональным при производстве препаратов из крови человека считается привлечение активных (постоянных) доноров нами проведена оценка продолжительности донорского стажа, на основании анализа карт доноров. Были выделены 3 группы: первая группа - лица с донорским стажем от 0 до 5 лет; вторая группа от 5 до 10 лет и третья группа 10 лет и более. Самая многочисленная группа среди доноров крови - это лица с донорским стажем до 5 лет, она представляет 62% от числа всех доноров. В ее состав входили: все первичные доноры, которые составили 9% от всех респондентов; 11% - доноры резерва (имеющие до 3-х донаций в год) и 41% - активные доноры. Из 21% доноров со стажем от 5 до 10 лет, 2% представлены донорами резерва - и 19 % - активными донорами. Доноры с донорским стажем более 10 лет представлены донорами резерва - 2% и активными донорами - 16 %, что в совокупности составило 18 %. В целом, первичные доноры составили 9% от всей массы доноров, 15% - это доноры резерва, 76% актив- 113 ные доноры. Таким образом, основными донорами крови являлись люди сдающие кровь более 3х раз в год, но менее 5 лет подряд (рис. 21). 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% стажболее 10 стаж 0-5 лет стаж 5-10 лет лет общий итог по частоте донаций активныйдонор 41% 19% 16% 76% донор резерва 11% 2% 2% 15% первичный донор 9% 0% 0% 9% Рис. 21. Распределение донорского стажа по частоте донаций Среди доноров плазмы самая многочисленная группа представлена донорами со стажем от 5 до 10 лет (49%), в ее состав вошли: доноры резерва 5% и активные доноры - 44% . На втором месте среди доноров плазмы - лица являющиеся донорами более 10 лет, эта группа составляет 35%, из них 32% активные доноры и только 3% - доноры резерва. Первичные доноры представлены только в группе имеющей длительность донорского стажа до 5 лет (10%). В целом контингент доноров плазмы представлен активными донорами - 80%, первичными - 10% и донорами резерва - 10%. Таким образом, количество первичных доноров, как среди доноров крови, так и среди доноров плазмы не превышает 10%. Доноры плазмы име- 114 ют более длительный донорский стаж, 84% доноров плазмы являются таковыми более 5 лет, из них 76% это активные доноры, имеющие более 4-х донаций плазмы ежегодно. Для оценки эффективности и доступности информации о том кто может быть донором, где можно сдать кровь и что, для этого необходимо, был задан вопрос об источнике информации о донорстве (рис. 22). 13% 29% 58% родственники, знакомые, друзья средства массовой информации медицинская агитация Рис. 22. Источник информации о донорстве Из полученных данных видно, что 58% респондентов узнали о возможности сдачи крови и плазмы от родственников, знакомых и друзей. Для 29% источником информации стала медицинская агитация, 13% узнали о донорстве из средств массовой информации. Одним из критериев оценки донорского потенциала является полноценность питания и наличие вредных привычек у доноров, поэтому при анкетировании был задан вопрос о собственной оценке полноценности питания и наличии вредных привычек (рис. 23). 115 1% 29% хорошее 70% удовлитворитель ное недостаточное Рис. 23. Изучение характера питания доноров Более половины доноров ответили, что не имели вредных привычек 55,7%, курят - 40,8% , 3,5% употребляют алкоголь, курят. Нами был проведен анализ причин, которые могут препятствовать донорам в выполнении донорской функции (рис. 24). 14% 7% 52% 27% не существует препятствий нехватка времени незнание куда обращаться опасались за свое здоровье Рис. 24. Сравнительный анализ причин, препятствующих донорству Полученные результаты показали, что более чем у половины доноров 52%, не существовало препятствий для донорства, 27% сообщили о нехватки времени, а 14% не знали куда обращаться, 7% опасались за свое здоровье, и в связи с этим не спешили быть донорами. Оценка отношения работодателей к выполнению донорской функции их работниками (рис. 25) показала следующее: 47% опрошенных ответили, 116 что их работодатели положительно относятся к донорству, на безразличное отношение указали 19% ответивших, и 5 % сообщили, что сдача крови вызывала у их работодателей негативное отношение. Группы положительного и отрицательного отношения состояли только из рабочих и служащих. Таким образом, у 5% респондентов, отрицательное отношение начальства может явиться преградой к сдаче крови. Так как 29% доноров не имели работы, то отношение их работодателей соответственно являлось безразличным. 50% 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% студенты служащие рабочие безработные безразличное негативное положительное Рис. 25. Отношение работодателя к выполнению донорской функции его работником Проведенные исследования кадрового потенциала доноров показали, что чаще всего, активным донором крови является работающая женщина в возрасте от 31 года до 50 лет, имеющая удовлетворительное материальное состояние, хорошо питающаяся, не имеющая вредных привычек, являющаяся активным донором, но сдающая кровь менее 5 лет. Ею движет сочетание материального и альтруистического стимулов. Активным же донором плазмы является работающий мужчина в возрасте от 31 года, с удовлетворительным материальным состоянием, хорошо питающийся, но курящий, являющийся активным донором и сдающий плазму более 5 раз в год, в течение менее 5 лет, им движет материальный стимул. 117 Проведенные исследования кадрового потенциала доноров крови и плазмы «Пермского НПО «Биомед», на основе индивидуального учета доноров в разрезе социальной структуры с использованием традиционных инструментов управления донорским потенциалом: опросы и анкетирование доноров позволяют акцентировать внимание на наиболее важных факторах, влияющих на состав донорских кадров, правильно организовать работу по привлечению наиболее социально значимых категорий потенциальных доноров: студентов, рабочих, военнослужащих, рабочих промышленных предприятий, которые в дальнейшем могут стать активными, донорами крови, плазмы используемой для производства препаратов крови. 118 ОБСУЖДЕНИЕ В связи с сохраняющимся дефицитом донорских кадров в Российской федерации, обусловленным как экономическими, социальными, так и организационным проблемами в стране, вопрос обеспечения лечебных учреждений высокоэффективными препаратами крови человека стоит весьма остро. Производство препаратов на основе донорской плазмы, затруднено не только уменьшением числа доноров, наличием у доноров большого количества противопоказаний к донорству, но и снижением уровня специфических АТ, у иммунизированных доноров. Выходом из сложившегося положения может служить практика частых донаций активных (регулярных) доноров плазмы для фракционирования, которая может привести к увеличению заготовки донорской плазмы, сокращению брака в процессе заготовки и карантинного хранения плазмы. Поэтому важным вопросом является изучение факторов влияющих на состояние здоровья доноров, изучение иммунного статуса активных доноров в процессе многократных донаций плазмы сочетающихся с иммунизаций с использованием различных вакцин, с целью обеспечения безопасности и высокого качества плазмы для фракционирования иммуноглобулинов, являющихся обладающим незаменимым средством иммуномодулирующим, неотложной иммуннокоррекции антипролиферативным и противовоспалительным действием. В связи с этим нами было проведено изучение специфической активности АТ, длительности и напряженности пост вакцинального иммунитета у активных доноров, иммунизированных в донорском пункте. Для исследования напряженности и длительности гуморального иммунитета против гепатита В у активных доноров, была проведена оценка таких показателей, как пол, возраст, групповая и резус принадлежность, сроки прошедшие от момента иммунизации и различные схемы вакцинации. С 2008-2012 гг., по результатам предвакцинального скрининга, для проведения вакцинации против ВГВ было отобрано 978 доноров, в возрасте от 26 до 56 119 лет, из них 47% составили мужчины и 53% женщины, доноров крови 64%, доноров плазмы 36%. При проведении иммунизации использовали две схемы: стандартная - предусматривающая введение вакцины в 0-1-6 месяц от начала иммунизации и экстренная, при которой вводили вакцину в 0-1-2 месяц от начала иммунизации с последующей однократной ревакцинацией через 12 месяцев. Для характеристики напряженности гуморального иммунитета были выбраны следующие диапазоны концентраций анти-HBs антител: низкий уровень – до 0,1 МЕ/мл; средний уровень – от 0,1 до 1,0 МЕ/мл; высокий уровень –1,0 до 10,0 МЕ/мл, очень высокий уровень –10,0 МЕ/мл и более. В результате проведенного исследования установлено, что в группе вакцинированных по стандартной схеме через 1 месяц после завершенного курса вакцинации среднегеометрическая концентрация АТ составила 5,6±0,1 МЕ/мл, уровень сероконверсии 98%, у лиц, иммунизированных по экстренной схеме уровень сероконверсии составил 82,0 %. При использовании стандартной схемы вакцинации наибольший удельный вес (53,4%) составили лица с высокими (1,0-10,0 МЕ/мл) и очень высокими 10,0 МЕ/мл и более концентрациями АТ- 34,6%. В структуре вакцинированных по экстренной схеме, наибольший удельный вес приходился на долю лиц со средними (0,1–1,0 МЕ/мл) концентрациями поствакцинальных АТ - 62,3%, удельный вес лица с высокими (1,0-10,0 МЕ/мл) и очень высокими (10,0 МЕ/мл) и более концентрациями АТ составил лишь 13%. В последующем отмечено изменение структуры в группе привитых по стандартной схеме. Число доноров с высокими уровнями АТ снижалось, начиная с 3-го месяца после завершенного курса вакцинации, а при наличии низкого и среднего уровня антиHBs АТ отмечалось повышение. При сравнении среднегеометрических концентраций АТ у вакцинированных по стандартной схеме отмечено статистически значимое снижение концентраций поствакцинальных АТ (p<0,05) в зависимости от срока после полного курса иммунизации. Удельный вес лиц, имеющих высокий и очень высокий титр АТ против ВГВ, иммунизированных с использованием профилактической схемы через 3 месяца составил 68 %, че- 120 рез 6 месяцев 60,1%, и 55 %через 1 год против 62 %; 34,1 %; 23,5 % у лиц, иммунизированных по экстренной схеме. В результате проведенных исследований установлено, что удельный вес лиц имеющих высокий титр АТ, при использовании стандартной схемы иммунизации, через 2 года составил 47,3% , через 3 года - 27,9 % и через 4 года 25 % против 37,3 %, 18,6 % и 12,4 % при использовании экстренной схемы иммунизации. Наблюдали ежегодное статистически значимое снижение средних геометрических титров HBs антител в динамике (3 месяца, 6 месяцев,1 год, 2 года, 3 года 4 года) p<0,01, что составляло по стандартной схеме вакцинации 5,9±0,4 МЕ/мл, 3,8±1,1 МЕ/мл – 1,8±0,4 МЕ/мл, 1,4±0,4 МЕ/мл, 0,6±0,1 МЕ/мл, 0,1±0,1 МЕ/мл против 2,2±0,3 МЕ/мл 1,2±0,4 МЕ/мл, 0,6±0,1 МЕ/мл, 0,4±0,2 МЕ/мл, 0,2±0,1 МЕ/мл, 0,1±0,1 МЕ/мл – по экстренной. Таким образом, низкий уровень АТ против ВГВ через 4 года среди привитых по экстренной схеме имели - 93,6 %, а с использованием профилактической схемы - 75% доноров. Анализ результатов эффективности вакцинации доноров, различных возрастных групп свидетельствует, что самая высокая эффективность отмечалась у лиц в возрасте 20-30 лет - 70,3% (p<0,05), среди мужчин -83,4% и 66,7% у женщин (p<0,05). При изучении влияния групповой принадлежности иммунизированных на выработку АТ против ВГВ показано, что наиболее выраженный иммунный ответ на вакцинацию дают мужчины первой и женщины четвертой групп крови, наименьший иммунный ответ на вакцинацию наблюдался у мужчин третьей группы крови. Показатели эффективности вакцинации у лиц, иммунизированных по стандартной схеме были статистически значимо выше, чем у иммунизированных по экстренной схеме. Можно предположить, что это связано, повидимому, с большим интервалом между второй и третьей вакцинациями, а также особенностью течения процесса специфического антителообразования, характеризующегося медленным нарастанием концентраций антител в ответ на введение рекомбинантного HBsAg. В целом тенденция снижения уровня антителопродукции была значительно более выражена в группе 121 привитых по экстренной схеме, что подтверждает вывод о необходимости введения дополнительной бустерной дозы вакцины иммунизированным по схеме 0–1–2 мес. и проработке вопроса необходимости дальнейших ревакцинаций, определения частоты проведения ревакцинаций у доноров вакцинированных по профилактической схеме с целью получения плазмы с высокими титрами анти HBsAg АТ через 3 года после первичного курса иммунизации. В результате проведенного исследования установлено, что экстренная схема вакцинации против ВГВ создает более низкий и менее продолжительный уровень поствакцинальных антител у большей части иммунизированных доноров по сравнению со стандартной схемой вакцинации. Установлено, что через три года после проведенной вакцинации с использованием профилактической схемы, количество доноров имеющих титры противогепатитных АТ в концентрации достаточной для использования их плазмы для производства специфического иммуноглобулина уменьшается более чем в 2 раза. Для исследования напряженности и длительности гуморального иммунитета активных доноров, иммунизированных АС для доноров, с целью получения иммунной донорской плазмы используемой в технологии производства специфического иммуноглобулина, было проведено изучение специфической активности АТ, длительности и напряженности пост вакцинального иммунитета к столбнячному анатоксину после проведения ревакцинации АС для доноров. По результатам предвакцинального скрининга 9459 доноров, за период с 2008-2011гг, для проведения ревакцинации АС было отобрано 3838 доноров в возрасте от 26 до 56 лет, из них 48% составляли мужчины и 52% женщины, доноров крови - 64%, доноров плазмы - 36%. В результате проведенного исследования было установлено, что в группе доноров получивших ревакцинацию АС через 1 месяц после иммунизации, среднегеометрическая концентрация антител составила 4,90+0,04 МЕ/мл. Уровень сероконверсии составил 74,49%, причем среди мужчин 57,84%, а среди женщин 91,13%. В общей структуре иммунизированных, наибольший удельный вес, 95,0% составили лица с высокими (5,0 МЕ/мл и более), что свидетельствовало о высокой антигенной 122 активности АС используемого для иммунизации доноров. Изучение длительности циркуляции АТ в кровеносном русле активных доноров, имеющих многократные донации, показало, что удельный вес лиц, имеющих высокий титр АТ к АС через 1 месяц составил 95,00%, через 3 месяца - 93,13%; через 6 месяцев - 77,42%; через 1 год –52,80%, через 1,5 года –44,64%, через 2 года –33,00%, через 2,5 года –28,77%, через 3 года –23,53%, через 3,5 года –22,22%, через 4 года 7,14%. При сравнении среднегеометрических концентраций АТ у ревакцинированных отмечено статистически значимое снижение концентраций поствакцинальных антител (p<0,001) через 1 год после проведенной иммунизации. Снижение уровня АТ обусловлено как особенностями иммунной системы индивидиума, так и продолжительными донациями плазмы (Ионова, 1991). Среднегодовое снижений титра АТ составляло 1,13 раза, через 4 года после проведенной вакцинации титр АТ у доноров снижался более чем в 2 раза. При изучении влияния пола и возраста иммунизированных доноров на выработку АТ показано, что не смотря на более низкий исходный фон титра АТ у женщин 0,74±0,1 МЕ/мл, против 1,23±0,09 МЕ/мл у мужчин, женщины более активно отвечают на иммунизацию и у них наблюдается менее выраженное снижение титра АТ в течение времени. При проведении двухфакторного дисперсионного анализа в объединенной выборке всех результатов после иммунизации выявлено статистически значимое влияние фактора «пол» (F(1,909)=12,124, p=0,00052), и фактора «время после иммунизации (F(6,909)=19.891, p=0,0000). В более поздние сроки (2,5 года) обнаружено статистически значимое увеличение уровня АТ к АС у женщин по сравнению с мужчинами, p<0,001 по апостериорному критерию Дункана, что подтвердило существование такого феномена, как иммунологический половой диморфизм. Проведенное исследование среди 60 доноров женщин в возрасте от 27 до 50 лет, у которых иммунизация проводилась в различные фазы менструального цикла показало, что наибольший иммунный ответ на проводимую иммунизацию был получен у женщин, иммунизированных в фолликулярную, 123 выраженный – в период овуляции и в раннюю лютеиновую фазы, характеризующиеся высокой продукцией эстрогенов, а наименьший – в менопаузе, что согласуется с данными проведенных исследований [73,175]. При оценке влияния возраста иммунизированных доноров на выработку АТ показано, что значимых различий у мужчин и женщин одной возрастной группы не выявлено. Уровень сероконверсии для группы 20-40 лет составил – 70,21%, 41-50 лет – 65,15%, 51-60 лет – 62,96%, что свидетельствует о более выраженном иммунном ответе на иммунизацию у молодых доноров в возрасте до 40 лет. При исследовании динамики сохранения высоких уровней АТ показано, что за первый год снижение титра АТ у лиц в возрасте 21-40 лет, происходит в 1,15 раза в возрасте 41-50 лет в 1,23 раза и в 1,34 раза у лиц в возрасте 51-60 лет. До 1,5 лет высокий титр АТ сохранялся у 60% лиц в возрасте 21-40 лет, 40,74% лиц в возрасте 41-50 лет и 30,43% лиц в возрасте 51-60 лет. Через 2 года среди лиц 21-40 лет высокий титр АТ сохранялся у 37,5%, и у лиц 41-50 и 51-60 лет 30,0% и 30,43% соответственно, а через 3 года среди лиц 21-40 лет высокий титр АТ сохранялся лишь у 18,18%. Лица в возрасте 41-50 и 51-60 лет в своих возрастных группах имеют большее число высокоиммунных доноров 20,69% и 23,53% соответственно. Анализ влияния групповой и резус принадлежности иммунизированных доноров на выработку АТ показал, что наименее выраженный иммунный ответ через месяц после иммунизации наблюдался у доноров женщин второй группы крови и мужчин четвертой группы крови. Таким образом, проведенное исследование выявило ежегодное падение уровня АТ к АС у иммунизированных активных доноров в 1,19 раза, и показало, что через 4 года только 4,14 % ранее иммунизированных доноров имели титр АТ к столбнячному токсину необходимый для производства специфического иммуноглобулина. Наибольший иммунный ответ на вакцинацию был получен у женщин первой и третьей групп крови и мужчин первой и второй групп крови в возрасте от 20 до 40 лет. Но только 33% из них сохранили высокий титр специфических АТ через два года после проведенной иммунизации, 23,53% сохраняли высокий титр специфических АТ через 3 года и только 4,14 124 % сохраняли высокий титр специфических АТ через 4 года после иммунизации. Исследование уровня специфической активности поствакцинальных антител, длительности и напряженности поствакцинального иммунитета к клещевому энцефалиту у доноров плазмы для фракционирования, вакцинированных вакциной клещевого энцефалита, и являющихся активными донорами в течение длительного времени, проводилось с 2006-2010г. Было обследовано 15618 доноров, из них 9486 доноров крови и 6132 доноров плазмы, в возрасте от18 до 63 лет. Проведенное исследование показало, что среди первичных доноров только 8,8% имеют титр АТ 1:20 и более, что явно недостаточно для получения необходимого объема иммунного сырья для производства специфического иммуноглобулина. В связи с чем, была проведена оценка эффективности двух профилактических схем иммунизации и повторных ревакцинаций, проводимых через один и три года от момента окончания цикла иммунизации в том и другом случаях. По первой схеме было вакцинировано 450 доноров. Схема вакцинации обозначалась 0-1-2. По второй схеме было вакцинировано 5721 донор. Схема вакцинации обозначалась 0-6. Активной выработкой АТ (титр АТ 1:20 и более) по 1 – й схеме ответили 63,8% донора, по 2- й схеме -72,4% доноров. Длительность циркуляции АТ к ВКЭ была прямо пропорциональна величине титра. Продолжительность сохранения титра в случае выявления у доноров низких титров АТ-ВКЭ - в среднем 8 недель, в случае средних титров -16-17 недель, высоких титров -28-31 недель. В результате ревакцинации активными антителопродуцентами оказались при 1 схеме иммунизации 74,2 % донора, при второй - 85,2% доноров. Положительный иммунный ответ на повторную ревакцинацию наблюдали у 81,8% доноров и у 85,1% доноров соответственно при иммунизации по схеме 1 и схеме 2. Различия в иммунном ответе доноров, вакцинированных по схемам 1 и 2, не были статистически значимы, как в случае первичной иммунизации (р>0,05). Наиболее активными антителопродуцентами явились доноры в возрасте от 20 до 30 лет (73,4%), наименьший иммунный ответ наблюдался в 125 группе доноров старше 50 лет. У доноров женщин наблюдали более выраженных иммунный ответ на иммунизацию, чем у мужчин 78,2% и 54,5% соответственно. Среди вакцинированных с разной активностью иммунного ответа рассчитали частоту встречаемости групп крови (АВО) и антигена D системы Резус. Произведенные расчеты не позволили установить ассоциацию активности иммунного ответа с наличием эритроцитарных АГ. Таким образом, в результате проведенного нами исследования выявлена наиболее эффективная двукратная профилактическая схема иммунизации вакциной КЭ. При изучении иммунного ответа доноров на вакцину против КЭ удалось выявить признаки (возраст и пол индивида), ассоциирующиеся с разной активностью иммунного ответа. Расчеты показали, что у женщин чаще ответная реакция на вакцину КЭ была выше, чем у мужчин (р<0,05). Доноры мужчины в возрасте 50 лет и старше дают наименьший иммунный ответ на иммунизацию вакциной КЭ. Длительность циркуляции антител ВКЭ была прямо пропорциональна величине титра. Снижение антителопродукции ранее иммунизированных, активных доноров плазмы, вызвано, как индивидуальными особенностями иммунной системы донора, так и «вымыванием» специфических АТ из организма донора в процессе частых, в среднем 11,5 донаций плазмы в год с изъятием около 6,78 литров плазмы ежегодно. Поэтому снижение специфических АТ после иммунизации у доноров происходит раньше, чем в соответствии с инструкцией по применению вакцин может проводиться ревакцинациия. В наименьшей степени это затрагивает доноров иммунизированных вакциной против КЭ, поскольку при данной вакцинации предусмотрены повторные ревакцинации, первая через 1 год после окончания цикла иммунизации, последующие отдаленные ревакцинации проводятся каждые три года, но как быть с донорами, иммунизированными АС и у которых титр АТ снизился и составил менее 5 МЕ/мл, ведь следующая ревакцинация АС у них возможна только через 5 лет, а их число значительно, через 2,5 года 60% женщин и 73% мужчин не имеют необходимого титра АТ к столбнячному анатоксину. Сре- 126 ди доноров иммунизированных вакциной против гепатита В снижение антителопродукции еще более выражено. Через год после окончания цикла вакцинации 45% иммунизированных с использованием профилактической схемы и 76,5% лиц с использованием экстренной схемы иммунизации не имели необходимого титра специфических АТ, а ревакцинации предусмотрены через 5 и 8 лет в зависимости от использованной для иммунизации вакцины. Поэтому встал вопрос иммунизации таких лиц в интервалах между ревакцинациями, проводимыми в соответствии со схемами применения вакцин, другими видами вакцин. Изучение влияния вакцинаций на специфическую антителопродукцию показало, что иммунизация АС доноров, приводила к увеличению и антителопродукции против ВКЭ у ранее вакцинированных от КЭ доноров в 3,5 раза уже через месяц после проведенной иммунизации, в течение времени титр АТ против ВКЭ, несколько снижался, но тем не менее, в течение полутора лет титр АТ против ВКЭ сохранялся на достаточно высоком уровне. В результате проведенного анализа иммунизированных АС для доноров, выявлена сильная степень линейной связи между увеличением антителопродукции к столбнячному анатоксину и ВКЭ (r=0,73). Иммунизация доноров имевших в анамнезе ревакцинации АС менее пяти лет назад, при снижении уровня АТ менее 4,0 МЕ/мл, и при отсутствии в анамнезе вакцинаций от ВГВ, проводилась с использованием вакцины против ВГВ. При иммунизации доноров против ВГВ была выявлена слабая обратная линейная связь (r=-0,5) между увеличением антителопродукции к ВГВ и увеличением титров АТ к ВКЭ у ранее иммунизированных от КЭ доноров. При иммунизации доноров вакциной КЭ линейную связь между увеличением антителопродукции к ВКЭ и увеличением титров АТ к АС и ВГВ у ранее иммунизированных доноров выявить не удалось. В результате проведенного анализа оценки иммунного ответа доноров, иммунизированных стафилококковым анатоксином и имевших в анамнезе иммунизации вакцинами, в состав которых входил столбнячный компонент (АС, АДСМ и др.) и вакциной против КЭ, стафилококковым анатоксином выявлена сильная степень линейной связи между увеличением 127 антителопродукции к стафилококковому анатоксину и столбнячному анатоксину (r=0,89, p<0,01) по критерию Стьюдента. В результате проведенных исследований, выявили изменение иммунного ответа доноров, имевших ранее в анамнезе иммунизации вакцинами, в состав которых входил столбнячный компонент (АС, АДСМ и др.), вакциной против КЭ, или вакциной против ВГВ, при последующих иммунизациях не только на вводимую вакцину, но и увеличение антителопродукции в целом, а именно: выявлены: сильные степени линейной связи между увеличением антителопродукции к столбнячному анатоксину и ВКЭ (r=0,73), между увеличением антителопродукции к стафилококковому анатоксину и анастолбнячному токсину (r=0,89, p<0,01). Слабая обратная линейная связь (r=-0,5, p<0,01) выявлена между увеличением антителопродукции к ВГВ и увеличением титров АТ к ВКЭ. Линейных связей между увеличением антителопродукции к АС и ВГВ, антителопродукции к ВКЭ и увеличением титров АТ к АС и ВГВ выявить не удалось. Данный эффект нами связан в том числе и с использованием в вакцинных препаратах гидрооксида алюминия в качестве адъюванта. Использование в качестве адъюванта гидрооксида алюминия меняет динамику развития иммунитета, ускоряя развитие и повышая уровень иммунитета, увеличивая длительность сохранения иммунного ответа, усиливая иммуногенность антигенов в несколько раз, а таких как столбнячный - до ста раз [207,223]. Вакцина, содержащая в своем составе большую концентрацию гидрооксида алюминия в качестве адъюванта - 1,1 мг/мл в составе стафилококкового и столбнячного анатоксина, против 0,5 мг/мл гидрооксида алюминия в вакцинах КЭ и против ВГВ дает не только наиболее выраженный иммунный ответ на вводимую вакцину, но и значительно увеличивает антителопродукцию в целом. Обеспечению безопасности, одному из критериев качества плазмы для фракционирования иммуноглобулинов уделяется особое внимание, так как производство препаратов на основе донорской плазмы сопряжено с высоким риском их инфицирования, ведь исходным материалом для них является жидкая часть крови – плазма, которая может содержать различные инфекци- 128 онные агенты, ведущее место среди которых занимают вирусы из которых наиболее опасными являются ВИЧ, вирусы вызывающие ВГВ и ВГС [23,33,80,209]. Обеспечение инфекционной безопасности донорской плазмы является одним из основных показателей качества плазмы для фракционирования. Материальная заинтересованность доноров, как видно из представленных нами исследований (44% доноров имели материальный интерес, 46% доноров сдавали кровь из-за сочетания как материальных, так и альтруистических мотивов) привела к участию в донорстве малообеспеченных лиц, которые пытаются утаить перенесенные заболевания и реальное состояние своего здоровья, что способствует увеличению абсолютного брака крови, и риску передачи вирусных инфекций при использовании препаратов крови человека. Инфекционная безопасность донорской плазмы обеспечивается несколькими этапами: медицинское освидетельствование претендентов на донорство, лабораторно - клиническое исследование крови, тестирование образцов крови доноров на маркеры ГТИ и сифилиса, заготовка крови и ее компонентов аппаратными методами, хранение их в специальном медицинском оборудовании в течение 180 суток и повторное обследование донора на наличие маркеров ГТИ по истечении 180 суток - процедура карантинизации донорской плазмы, все они предусмотрены нормативными документами МЗ РФ. В результате исследования были получены следующие результаты: доля выявления маркеров ВГВ (НВsAg) за период 2006-2011 гг. снизилась в 3 раза, среди доноров крови от 0,2 % в 2006 г. до 0,07% в 2009 г., среди доноров плазмы от 0,03 % в 2006 г. до 0,02% в 2009 г. Использование с 2009 г. тест системы «ДС-ИФА-НВsAg 0,01» с детекцией по НВsAg 0,01, позволило уменьшить количество ложноположительных результатов исследований в 1,7 раза. При оценке динамики выявления АТ к ВГС у доноров крови и плазмы так же как и при выявлении маркеров ВГВ, отмечено снижение выявления маркеров ВГС среди доноров крови в 2,3 раза от 0,9% в 2006 г. до 0,4% в 2011 г., среди доноров плазмы в 1,9 раза от 0,15 % в 2006 г. до 0,08% в 2011 г. С 2006 г. отмечали ежегодное уменьшение количества выявленных ВГС 129 позитивных донаций среди доноров крови и плазмы в 1,4 и 1,7 раза соответственно. Исключение составил 2010 г., в течение которого наблюдали увеличение позитивных донаций по сравнению с 2009 г., в 1,2 раза среди доноров крови и в 1,9 раз среди доноров плазмы. Наблюдали ежегодное снижение числа ложноположительных результатов при определении маркеров ВГС в 1,1 раза. Наибольшее количество ложноположительных результатов среди доноров крови, наблюдали в 2010 г., что составило 0,38%. Среди доноров плазмы ситуация более стабильна, в среднем количество ложноположительных результатов за период 2006-2010 гг. составило 0,11%, и только в 2011 г., так же как и среди доноров крови, наблюдали самое низкое количество ложноположительных результатов, всего 0,02%, в 2,5 раза ниже, чем за период 2006-2010 гг. Количество выявления маркеров ВИЧ среди доноров крови увеличилось в 1,1 раза с 0,37 % в 2006 г. до 0,42% в 2009 г. С 2010 г. количество маркеров ВИЧ среди доноров крови снизилось в 1,9 раза и достигло 0,2% от числа обследованных доноров. Наблюдали уменьшение выявления маркеров ВИЧ среди доноров плазмы в 2 раза, от 0,06 % в 2006 г. до 0,03% в 2011 г. Анализ ложноположительных результатов при проведении скрининга на определение маркеров ВИЧ показал, что число полученных ложноположительных результатов исследований, при определении маркеров ВИЧ, среди доноров крови с 2006 по 2009 гг. в среднем составило 0,28%. Наименьшее число ложноположительных результатов при определении маркеров ВИЧ среди доноров крови наблюдали в 2010 г. и составило всего 0,01%. Среди доноров плазмы количество ложноположительных результатов с 2006 по 2010 гг. составило 0,06%. Самое низкое количество ложноположительных результатов, 0,01% отмечали в 2011 г. При исследовании 14901 образцов доноров крови методом ПЦР в 135 случаях было зарегистрировано нарастание флуоресцентного сигнала, свидетельствовавшего о наличие в образце крови вирусной НК. Дискриминаторное исследование этих образцов выявило в 97 образцах РНК HCV, в 21образце ДНК HBV и в 17 образцах РНК HIV. Практически во всех случаях, положительные результаты, полученные в ПЦР сов- 130 падали с положительными результатами полученными в ИФА. Только при исследовании трех серонегативных в ИФА образцов донорской крови был получен положительный результат при исследовании, проведенном методом ПЦР. В двух образцах выявлена РНК ВГС. В одном образце выявлена РНК ВИЧ. К сожалению, в дальнейшем проследить изменения в ИФА и ПЦР у данных доноров не представилось возможным, поскольку на повторные исследования доноры не явились. Сравнительный анализ частоты выявления маркеров ГТИ у доноров крови и плазмы показал, что среди активных доноров плазмы маркеры ВГВ выявляются в 7, ВГС в 5,5, а ВИЧ в 8,4 раза реже, чем среди доноров крови, что связанно, как мы считаем, с тем что активные доноры плазмы, а их 80% имеют большую частоту донаций (до 20 донаций плазмы в год), практически дважды в месяц они могут сдавать плазму крови и при каждой донации они обследуются на наличие у них маркеров ГТИ. Среди доноров крови 76% -активные доноры крови, мужчины могут иметь не более 5, женщины не более 4 х донаций крови в год и при каждой донации они обследуются на наличие у них маркеров ГТИ, т. е. в 4 и 5 раз реже, чем активные доноры плазмы и 24% среди доноров крови составляют доноры резерва, имеющие эпизодические, однократные донации, а следовательно, и обследуются на маркеры ГТИ реже (при наличии донации). При исследовании крови доноров на наличие маркеров ГТИ существует риск получения ложноположительных результатов как при первичной постановке и сомнительных или неопределенных результатов при проведении подтверждающих тестов. Поэтому нами, в 2006 г., был разработан и успешно внедрен в практику работы донорского пункта «Алгоритм действий по выбраковке донорской крови и плазмы при заготовке и в процессе карантинизации. Использование данного алгоритма позволило предотвратить попадания в производство даже подозрительной плазмы, (в случае получения положительного результата первичной постановки и перестановки и при отрицательном результате подтверждающего теста, донацию браковали), но донора не снимали с донорского учета а отводили до получения отрицательных результатов скри- 131 нинга (в исследовании, проводимом через шесть месяцев), после чего донор вновь мог быть допущен к крово-/плазмодаче. В случае получения неопределенного результата подтверждающего теста - донор отводился от донорства на 6 месяцев и вся плазма этого донора находящаяся на карантинизации, браковалась, изымалась и уничтожалась. По истечении 6 месяцев донор, после получения отрицательного результата скрининга допускался к донации. При повторном положительном результате донор отводился от донорства уже на 12 месяцев, только при получении повторного положительного результата через 12 месяцев донор снимался с донорского учета. В тоже время, разработанный нами алгоритм направлен на сохранение донорских кадров (отстранение донора от крово-/плазмадачи на 6-12 месяцев и только после получения повторных положительных или сомнительных результатов донор снимался с донорского учета). Таким образом, тщательное соблюдение всех этапов предварительного обследования доноров, использование современных методов апробации донорской крови с применением современных тест систем, обладающих высокой степенью чувствительности и специфичности позволяет произвести отбор тщательный отбор доноров и заготовить донорскую кровь и плазму с высокой степенью вирусной безопасности; снизить затраты по заготовке и отбраковке сырья ненадлежащего качества и обеспечить высокое качество и безопасность сырья для производства препаратов крови человека. Определение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа имеет значение в комплексной диагностике как первичных, так и вторичных иммунодефицитных состояний [122,149,150,158]. Проведенное исследование фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови активных доноров плазмы для фракционирования, каковыми являются здоровые мужчины и женщины в возрасте от 18-60 лет, показало, что изменения, после проведения иммунизаций, носили транзиторный характер и не являлись статистически значимыми. 132 Одним из показателей качества плазмы для фракционирования является содержание общего белка крови, и белковых фракций поэтому представляло интерес исследовать уровень плазменных белков у первичных и активных доноров плазмы для фракционирования, в зависимости от таких факторов как: пол, возраст, частота донаций, объем плазмодач, социальный статус. Были обследованы 2990 доноров плазмы для фракционирования в возрасте от 18 до 60 лет, из них 1404 первичных донора и 1586 активных доноров, том числе 1677 мужчин и 1313 женщин. При исследовании белкового состава сывороток крови установлено, что содержание общего белка и белковых фракций у первичных доноров обоего пола соответствовало нормальным показателям. Обнаружены статистически достоверные отличия уровня альбумина и суммы глобулинов у мужчин и женщин как среди первичных, так и активных доноров плазмы-60,73±0,37 г/л, 59,64±0,36 г/л, и 39,27±0,37 г/л, 40,36±0,36 г/л, и 60,60±0,38 г/л, 39,40±0,38 г/л и 58,88±0,43 г/л, 41,12±0,43 г/л соответственно, за счет более высокого значения у женщин α2 и β-глобулина. У первичных доноров плазмы обнаружены достоверные отличия уровня α1 и β-глобулина от возраста 18-30, 31-40 и 41-60 лет, 2,83±0,04%, 3,08±0,08% и 10,99±0,12%, 11,83±0,26%, 12,43±0,25% соответственно. У активных доноров плазмы такие выводы сделаны в отношении уровня альбумина, уменьшение уровня альбумина - 60,95±0,45 г/л, 59,77±0,97 г/л и 59,08±0,44 г/л, глобулинов - увеличение уровня глобулинов - 39,04±0,45 г/л, 39,04±0,45 г/л и 40,92±0,44 г/л, и соответственно уменьшение коэффициента (А/Г) с возрастом доноров 1,57±0,03, 1,50±0,06 и 1,46±0,03. Также возростзависимым является увеличение показателей β-глобулина у активных доноров более старшего возраста 11,62±0,19%, 12,23±0,55% и 12,34±0,18% соответственно. Обнаружены корреляции ряда показателей от социального статуса, у доноров студентов отмечался самый низкий уровень β-глобулина 10,83±0,17%, и самый высокий уровень γ -глобулина 17,5%. Установлено, что уровень общего белка у женщин-служащих и мужчин студентов выше, чем в других группах, а особенно в сравнении с безработными. Наибольшее 133 значение альбумина и наименьшее суммы глобулинов, в том числе α 2глобулинов, отмечено у студентов (мужчин и женщин) и α2-глобулинов у мужчин служащих. Содержание ß-глобулинов оказалось выше у служащих и самым низким у студентов, наибольший уровень γ-глобулинов отмечен у служащих и наименьший у безработных мужчин. По результатам корреляционного и регрессионного анализа изучения взаимосвязи исследуемых показателей среди доноров плазмы установлено, что такие характеристики как, содержание общего белка у активных доноров плазмы, имеющих более 11 донаций плазмы в год, ниже, чем у первичных доноров, а уровень ß-глобулина выше, чем у первичных доноров. Установлено что с возрастом доноров, такие характеристики как содержание альбумина, суммы глобулинов, в частности α2-глобулин и γ- глобулин, у женщин являются возраст зависимыми. У мужчин такой вывод сделан в отношении большинства показателей, за исключением - γ глобулина. Наиболее выраженная связь отмечена для уровня ß-глобулина, с возрастом этот показатель увеличивался. По результатам исследования установлено, что частота и объем донаций плазмы хотя и оказывали влияние на показатели белкового состава сыворотки крови у активных и первичных доноров плазмы в отношении уменьшения уровня общего белка 73,14±0,37 г/л и 75,10±0,42 г/л и повышения уровня ß-глобулина 12,07±0,13% и 11,37±0,11% соответственно, но не выходили за границы установленных возрастных норм по данным показателям. Таким образом, в результате проведенного анализа можно сделать заключение о том, что частота и объем заготовки плазмы на показатели белкового состава сыворотки крови доноров не оказывали существенного влияния. Для решения вопроса эффективной реализации имеющегося донорского потенциала, важно знать социальную характеристику доноров [76,161] для изучения структуры, оценки состояния здоровья донорского контингента и составления психологического портрета, проведение анализа причин медицинских отводов, мотиваций доноров к активному, безвозмездному донорству, оценку удовлетворенности донора процессом 134 донации [75,76,77,161,212]. В связи с чем, нами был проведен комплексный анализ социального портрета доноров, с применением традиционного инструмента управления донорским потенциалом, анкетирование доноров. В ходе анкетирования было опрошено 3700 доноров и проведен анализ карт доноров, участвующих в крово и плазмодачах. Общее количество доноров, а также виды и объемы брака были проанализированы на основании годовых отчетов предприятия, доверительная вероятность составляла 95%, а доверительный интервал составлял 5% от полученного значения. Анализ показал, что за шесть лет с 2006 по 2011 гг. общее количество доноров составило 30122 человек. С 2006 по 2009 гг. отмечалось увеличение и количества доноров плазмы на 3053 человека, 2007 г. на 2%, 2008 г. на 26% по сравнению с предыдущим периодом, но с 2009 г. отмечено уменьшение числа доноров плазмы, в 2009 г. оно составило 2%, в 2010 г. количество доноров плазмы снизилось на 34% за год. С 2007 г. по 2010 гг. регистрировалось увеличение количества доноров крови на 4874 человек, но с 2011 г. количество доноров крови уменьшилось на, на 13%, по сравнению с 2010 г., что составило 2758 человек и что соответствовало показателю 2008 г. Среди доноров крови большинство составляли женщины - 53%, 63% среди доноров крови-лица в возрасте от 31 года до 50 лет, причем от 18 до 30 лет это чаще мужчины, а от 31 года и старше женщины. Среди доноров плазмы больше мужчин -72% в возрасте от 21 до 50 лет. Среди доноров, как мужчин, так и женщин в каждой возрастной группе большинство - лица рабочих специальностей, за исключением мужчин в возрасте от 18 до 20 лет, здесь большая часть представлена безработными - 1,08% против 0,81 % рабочих и студентов. Полученные нами результаты показали что лишь 10% доноров имели альтруистические соображения, не смотря на то, что 61% доноров имел удовлетворительное материальное состояние, 44% имели материальный интерес, 46% доноров сдавали кровь из-за сочетания как материальных, так и альтруистических мотивов, причем 46 % доноров отмечали важ- 135 ность льгот и социального статуса нагрудного знака «Почетный донор России». В связи с преобладанием материальной заинтересованности доноров, начиная с 2008 г., количество безвозмездных донаций, как крови, так и плазмы уменьшилось в среднем в 2 раза. Среди доноров крови и плазмы соотношение безвозмездных и платных донаций составило 1:42 и 1:29 соответственно. Поскольку наиболее рациональными и безопасным при производстве препаратов из крови человека считается привлечение активных (постоянных) доноров [187,224,235], нами проведена оценка продолжительности донорского стажа и количества донаций. Среди доноров крови самая многочисленная группа (62%) имеет донорский стаж менее 5 лет подряд с числом донаций 3 раза в год и более. Доноры плазмы имеют более длительный донорский стаж, 84% доноров плазмы являются таковыми в течение более 5 лет, из них 76% это активные доноры, имеющие более 4-х донаций плазмы ежегодно. Количество первичных доноров, как среди доноров крови, так и среди доноров плазмы не превышает 10%, что является плохим прогностическим признаком и свидетельствует о старении донорского контингента. Одним из критериев оценки здоровья донорского потенциала является полноценность питания и наличие вредных привычек у доноров, на полноценное питание указало 99% доноров, 55,7% отметили, что не имеют вредных привычек, курят - 40,8% , употребляют алкоголь - 3,5% доноров. Проведенные исследования кадрового потенциала доноров показали, что чаще всего, активным донором крови является работающая женщина в возрасте от 31 года до 50 лет, имеющая удовлетворительное материальное состояние, хорошо питающаяся, не имеющая вредных привычек, являющаяся активным донором, но сдающая кровь менее 5 лет. Ею движет сочетание материального и альтруистического стимулов. Активным же донором плазмы является работающий мужчина в возрасте от 31 года, с удовлетворительным материальным состоянием, хорошо питающийся, но курящий, являющийся активным донором и сдающий плазму более 5 раз в год, в течение белее 5 лет, им движет материальный стимул. Отмечаемые большинством доноров, хорошее самочувствие в процессе и после 136 донации, комфорт во время донации, устойчиво взаимосвязаны и положительно коррелируют с намерением продолжать и в дальнейшем донорскую практику, анализ полученных результатов показал, что у доноров сформирована высокая приверженность к донорству - 80 % из числа опрошенных доноров плазмы и 76% доноров крови практикуют донации не реже 4-5 раз в год, но в тоже время, 27% сообщили о нехватки времени для регулярных донаций, 5 % доноров отметили, что их работодатели высказывают негативное отношение к донорству, а 7% высказывали опасения за свое здоровье в связи с крово и плазмодачами, что свидетельствует о низкой информированности доноров о безопасности регулярных донаций на организм человека. Таким образом, отрицательную роль в развитии донорства играет незаинтересованность работодателей в участии их сотрудников в донорском движении, низкая информированности доноров о безопасности регулярных донаций на организм человека, и конечно же, следует отметить и слабую пропаганду донорства в средствах массовой информации, лишь 13% доноров узнали о донорстве из средств массовой информации, для 29% источником информации стала медицинская агитация. Положительное общественное отношение, наличие обязательных социальных и государственных программ, стоящих на страже здоровья доноров, комфорт во время донациии может привлечь к активному участию в донорском движении новых групп населения. Что не только соответствуют целям государства в области безопасности и социальной политики — формирование здорового поколения, физически и духовно крепкого общества, но и позволит обеспечить отечественное здравоохранение так необходимыми ему лекарственными препаратами крови человека. 137 ВЫВОДЫ 1. Установлено, что длительность антителопродукции у вакциниро- ванных доноров зависит от используемых схем иммунизации; наиболее выраженный и длительный иммунный ответ достигается при использовании профилактических схем иммунизации. Выявлен половой диморфизм иммунного ответа на столбнячный анатоксин и вакцину клещевого энцефалита и гепатита В, проявляющийся в более выраженном и длительном повышении уровня антител у женщин в сравнении с мужчинами. 2. Показано что при иммунизации доноров иммунный ответ разви- вается не только на антигенные детерминанты вводимой вакцины, но и увеличивается уровень антител к другим антигенам. Выявлена положительная линейная корреляция между увеличением антителопродукции к столбнячному анатоксину и вирусу клещевого энцефалита (r=0,73), между увеличением антителопродукции к стафилококковому токсину и столбнячному анатоксину (r=0,89) у ранее иммунизированных доноров. 3. Для обеспечения качества и безопасности донорской плазмы, используемой для производства препаратов крови человека, необходим единый алгоритм действий по решению вопроса о допуске доноров к донации, включающий апробацию крови, эпидемиологическое наблюдение за донорами в процессе карантинизации и отбраковке плазмы ненадлежащего качества. Изменения показателей концентрации белковых фракций плазмы крови и фагоцитарной активности лейкоцитов венозной крови у активных доноров иммунной плазмы носят транзиторный характер и не могут быть использованы в качестве критериев качества плазмы для получения специфических иммуноглобулинов. Исследование кадрового потенциала доноров с использованием анкетирования, позволяет вовлечь в активное донорство социально значимые категории потенциальных доноров, плазма которых более безопасна в инфекционном отношении. 138 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Вакцинация доноров для получения иммунной донорской плазмы используемой при производстве специфических иммуноглобулинов должна проводиться с использованием профилактических схем иммунизаций, дающих наиболее выраженный и длительный эффект, в отличие от экстренных схем иммунизаций. 2. Целесообразно у доноров с низким уровнем антителопродукции проведение новых иммунизаций в интервалах между ревакцинациями, проводимыми в соответствии со схемами применения вакцин, другими видами вакцин. Поскольку выраженный иммунный ответ возникает не только на вводимую вакцину, но и в целом усиливается антителопродукция, а именно: выявлены: сильные степени линейной связи между увеличением антителопродукции к столбнячному анотоксину и вирусу клещевого энцефалита (r=0,73), между увеличением антителопродукции к стафилококковому токсину и столбнячному анотоксину (r=0,89). 3. Целесообразно использовать при исследовании на маркеры гемотрансмиссивных инфекций современные тест системы, обладающие высокой степенью чувствительности и специфичности, так тест системы с детекцией по НВsAg 0,01, позволили снизить количество ложноположительных результатов в 1,7 раза. Использование «Алгоритма действий по выбраковке донорской крови и плазмы при заготовке и в процессе карантинизации» позволяет предотвратить попадание в производство плазмы ненадлежащего качества, и в то же время, сохранить донорские кадры. 4. Рекомендуется проводить мониторинг донорских кадров с использованием такого традиционного инструмента как опрос и анкетирование, для выявления факторов влияющих на донорскую активность с целью привлечения наиболее социально значимых групп населения в активное донорство. 139 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Аверченков В.М., Палагин И.С. Внутривенные иммуноглобулины: механизмы действия и возможности клинического применения // Клиническая антимикробная химиотерапия. - 2004.- Т 6. № 3 - С. 273-281. 2. Агаджанян М.Г., Меграбян Т.Б., Сидорова Е.В. Наростание числа клеток, секретирующих антитела, и клеток, секретирующих неспецифические иммуноглобулины, при иммунизации мышей Т-зависиммыми и Т-независимыми антигенами // Бюлл. эксп. биол. мед. 1981. - № 8.- С. 66-68. 3. Алсынбаев М.М., Медведев Ю.А., Туйгунов М.М. Биопрепараты и ведущие направления их лечебно-профилактического применения // Уфа, 2006.110 с. 4. Алсынбаев М.М., Медведев, Ю.А., Корженевский А.А. и др. Применение препаратов лейкоцитарного интерферона и иммуноглобулинов в качестве иммуномодуляторов при комплексном лечении больных гнойно-септической хирургической инфекцией // Медицинская иммунология. - 2002.- Т. 4. № 2 . С. 345-346. 5. Алсынбаев М.М., Хаитов P.M., Исрафилов А.Г. Современные тенденции технологий получения внутривенных иммуноглобулинов рН 4,5 7: за и против // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 2001. № 2. - С. 6-12. 6. Аммосов А.Д. Гепатит В. - Новосибирск, 2000. – 132 с. 7. Анастасиев В.В. Применение иммуноглобулинов: Обзор. - Н. Новгород: НГМИ, 1993. - 27 с. 8. Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Воробьев А.А. и др. Интерферонотерапия инфекционных заболеваний - состояние проблемы и перспективы // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005. - № 6. - С. 94-99. 9. Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Феклистова Л.В. и др. Интерфероновые иммунобиологические препараты. Перспективы их применения в лечении инфекционных больных // Вестник РАМН. - 2003.- № 1.- С. 44-48. 140 10. Афанасьев С.С., Онищенко Г.Г., Алешкин В.А., и др. Интерфероновый статус, препараты интерферона в лечении и профилактики инфекционных заболеваний и реабилитации больных. - М.: «Триада-Х», 2005.- 767с. 11. Афонин Н. И. Донорство в Российской Федерации // Вестник службы крови России . – 2002. - № 3. – С. 3–13. 12. Афонин Н. И. Донорство крови: трудности и решения // Вестник службы крови России . – 2004. - № 2. – С. 7–9. 13. Бахметьев Б.А., Ширшева С.В., Кеворков Н.Н. Основные показатели иммунограммы детей и взрослых Пермской области: справочно- методическое пособие. - Пермь, 2002.- 32 с. 14. Безусова Н.A. О результатах электрокардиографического обследования доноров // Тез. докл. III Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов. - С.-Петербург, 1996. — С. 70. 15. Белобородов В.Б. Современная концепция применения иммуноглобулинов для внутривенного введения при сепсисе и септическом шоке // Инфекции и антибактериальная терапия.- 2001.- Т.З. № 1. - С.-14-17. 16. Беркос М.В., Матвеева Т.А., Красняков В.К., Бубнова Л.Н. Выявление маркеров гепатита В у доноров крови, медицинских работников и больных гемофилией // ВИЧ/СПИД и родственные проблемы: материалы 12-й Междунар. конф. «СПИД, рак и родственные проблемы». – 2004. – Т.8. № 2. – С. 9-10. 17. Вергопуло A.A. Критерии эффективности трансфузиологического обеспечения хирургической службы многопрофильного стационара // Дис. ... канд. мед. наук. - М. - 2009. - 200 с. 18. Волкова Л.В. Природный α-интерферон и антибактериальный пептидный комплекс: технология получения, новые лекарственные формы, оценка эффективности: Дис. ... д-ра мед. наук. – Пермь. - 2004.- 305 с. 19. Волкова Л.В., Кузнецов В.П. Современные лекарственные формы интерферона и их клинические свойства // Антибиотики и химиотерапия. - 2002. Т.47. № 11.- С. 30-37. 141 20. Воробьев А.И. Очерки о производственной и клинической трансфузиологии. - М.: Ньюдиамед, 2006. – 632 с. 21. Воробьева Н.Н., Казьянин А.В., Борисова В.Н., Мышкина О.К., Рысинская Т.К., Николаева А.М., Дедова О.К. Эффективность специфического иммуноглобулина (Антигеп) при остром вирусном гепатите В //Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2004. - № 2 (15). - С. 13-16. 22. Голосова Т.В., Бондаренко И.А. Трансфузионные инфекции: эпидемиология, диагностика в службе крови // Вестник службы крови России. 2007. - № 1. - С. 16-21. 23. Голосова Т.В., Никитин И.К. Гемотрансмиссивные инфекции. - М.: МИА, 2003. – 192 с. 24. Голосова Т.В. И вновь о диагностике и профилактике вирусных агентов для безопасности гемотрансфузии // Новое в трансфузиологии. - 1994. - № 9. - С. 32-35. 25. ГОСТ 53420-2009 от 28.10.2009 г. «Кровь донорская и ее компоненты. Общие требования к обеспечению качества при заготовке, переработке, хранении и использовании донорской крови и ее компонентов». 26. ГОСТ Р 52938-2008 от 14.07.2008 г. «Кровь донорская и ее компоненты. Контейнеры с консервированной кровью или ее компонентами. Маркировка». 27. Грачев В.П. Разработка и практическое применение вакцин для профилактики актуальных вирусных инфекций // Вопросы вирусологии. - 2005. - № 3.С. 32 -35. 28. Губанова М.Н., Копченко Т.Г., Жибурт Е.Б. Централизация и совершенствование качества работы службы крови Ставропольского края // Трансфузиология.- 2008.- Т.9. № 4.- С. 33-41. 29. Данильченко В. В., Сидоркевич C.B., Шикин А.Ю., и др. Влияние массивного плазмафереза на функциональное состояние организма доноров // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: Тез. докл. - С.Петербург, 1995. - С. 39-40. 142 Дейл М.М., Формен Дж. К. Руководство по иммунофармакологии: пер. с 30. англ. - М.: Медицина, 1998. - 332 с. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. - М.: ООО «Ин- 31. формационное агенство», 2003. - 604 с. Железникова Г.Ф. Резистентность к возбудителю инфекции и иммунный 32. ответ // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005. № 2. - С. 104–112. Жибурт Е. Б., Губанова М. Н., Филина Н. Г. Новое в профилактике пере- 33. дачи инфекций с компонентами донорской крови // Вопр. гематол., онкол. ииммунопатол. в педиатрии. - 2006. - № 4 (5). - С. 11. Жибурт Е.Б. Бенчмаркинг заготовки и переливания крови. Руководство 34. для врачей: Издание Российской академии естественных наук. - М., 2009. - 84 с. 35. Жибурт Е.Б., Вергопуло А.А., Губанова М.Н., Копченко Т.Г. Централизация и повышение эффективности работы службы крови субъекта Российской Федерации (на примере Ставропольского края) (окончание) // Здравоохранение.- 2008.- № 6.- С. 44-46. 36. Жибурт Е.Б., Вергопуло А.А., Копченко Т.Г., Губанова М.Н., Шестаков Е.А. Плазма для фракционирования. Отказаться от балласта // Вестник службы крови России.- 2008.- № 4.- С. 17-21. 37. Жибурт Е.Б., Вергопуло А.А., Шестаков Е.А., и др., Новые инфекционные вызовы службе крови // Здравоохранение Таджикистана.- 2008.- № 2.- С. 143145. 38. Жибурт Е.Б., Губанова М.Н., Вергопуло А.А., и др. Мировая трансфузиология сегодня и завтра // Производственная, клиническая и транспортная трансфузиология: этапы реформирования, инфекционная и иммунологическая безопасность, критерии качества. – Воронеж, 2008. - С. 191-243. 39. Жибурт Е.Б., Губанова М.Н., Клюева Е.А., Коденев А.Т., и др. Особенности национального скрининга маркеров инфекций в донорской крови // Вестник Росздравнадзора. - 2010.- № 1.- С. 75-79. 143 40. Жибурт Е.Б., Клюева Е.А., Губанова М.Н., и др. Особенности национального обеспечения инфекционной безопасности препаратов крови // Вестник Росздравнадзорв.- 2010. -№ 2.- С. 64-66. 41. Жибурт Е.Б., Коденев А.Т., Филина Н.Г. и др. Особенности национальной заготовки плазмы // Трансфузиология.- 2009.- Т.10. № 3-4.- С. 43-58. 42. Жибурт Е.Б., Копченко Т.Г., Вергопуло А.А., и др. Эволюция законодательства о донорстве крови и ее компонентов // Трансфузиология.- 2008.- Т.9. №3.- С. 34-41. 43. Жибурт Е.Б., Максимов В.А., Вергопуло А.А., и др. Динамика развития службы крови России // Здравоохранение.- 2009.- № 3.- С. 32-40. 44. Жибурт Е.Б., Мамадалиев Д.М., Шестаков Е.А., Фархутдинов Ф.Ф. Геммотрансмиссивный вирусный вирусинактивированной плазмы // гепатит Вестник Е у реципиентов Национального медико- хирургического Центра им. Н.И. Пирогова 2014. Т. 9, № 2 . - С. 53-54 45. Зайцева Г.А. Иммуногенетические маркеры крови и состояние противоинфекционного иммунитета: Дис. ... д-ра мед. наук. - Киров, 1990. - 327 с. 46. Зайцева Г.А., Вершинина О.А., Карпова М.В. Уровень ИЛ-6 и ИЛ-8 в сыворотке крови доноров // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения): Всерос. совещ. 27-28 мая 2008 г. – Киров, 2008. – С. 31-32. 47. Зайцева Г.А., Вершинина О.А., Матрохина О.И., и др. Цитокиновый статус доноров крови и еѐ компонентов // Фундаментальные исследования 2011. - № 3.– С. 61-65. 48. Зайцева Г.А., Исаева Н.В., Карпова М.В. и др. Иммунологические показатели у доноров со снижением уровня гемоглобина // Трансфузиология. – 2011. - № 2. – С. 65-66. 49. Зайцева Г.А., Разоренов Г.И., Поддубский Г.А. Способ повышения титра специфических антител путем иммунизации доноров, содержащих HLAантиген В27 при отсутствии антигенов А1, В14 и бланк антигенов локуса С 144 системы HLA (Методические рекомендации). – Киров. - 1990 г. (SU 1504596 А1, 30.08.1989). Зайцева Г.А., Исаева И.В. О некоторых изменениях иммунитета у доноров 50. крови и ее компонентов. // Новое в трансфузиологии - 1996. - № 14. - С. 2428. 51. Заплатников А.Л. Иммунопрофилактика и иммунотерапия острых расператорных инфекций у детей // Лечащий врач. - 2006.- № 9.- С. 50-56. 52. Зверева В.В., Бойченко М.Н. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Том 1. учебник. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 447 с. 53. Злобин В.И., Современные проблемы эпидемиологии и профилактики клещевого энцефалита в Российской Федерации // Биопрепараты. -2004. - №2 (14). - С. 2–6. 54. Змушко Е.И., Белозеров Е.С., Митин Ю.А. Клиническая иммунология руководство для врачей. - СПб.: Питер, 2001. — 576 с. 55. Зубкова Н.В., Лаптева Л.К., Волкова Р.А., и др. Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров // Методические рекомендации. Утверждены ФГБУ «ГИСК им. Л.А.Тарасевича» Минздравсоцразвития России № 59 - ОД от 21.07. 2011. 56. Игнатьев Г.М., Отрашевская Е.В., Воробьева М.С. Активность цитокинов при иммунизации вакциной против клещевого энцефалита в эксперименте // Вопр. вирусологии. - 2003. - № 3. - С. 22-25. 57. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. - Новосибирск, 2001. - 360 с. 58. Имельбаева Э.А., Хайруллина P.M., Медведев Ю.А и др. Методические указания к занятиям по иммунологии и серологии: учебно-методическое пособие для специалистов по клинической и лабораторной диагностике. – Уфа, 2006. - 87 с. 59. Инструкция по иммунизации доноров стафилококковым анатоксином и проведению плазмофереза для получения анти-стафилококковой плазмы, Минздрав СССР, от 02.08.1977 г. 145 Инструкция по применению столбнячного анатоксина АС для доноров № 60. 01-11/59-06 от 14.04.2006 г. Инструкция по применению вакцины «Энцевир», № 01-11/216-08 61. от 30.12.2008 г. Инструкция по применению вакцины гепатитв В, № 01-11/175-09, от 62. 19.11.209 г. Инструкция по противоэпидемическому режиму в лабораториях диагно- 63. стики СПИД от 05.06.1990 г. Ионова А.И. Влияние аппаратного плазмацитафереза на состояние им- 64. мунной системы и некоторые другие показатели гомеостаза доноров: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Л., 1991. - 19 с. Исаева Н. В. Статус активных доноров крови и ее компонентов по имму- 65. нологическим критериям // Дис. ... канд. биол. наук. - Киров, 2000. - 179 с. Исаева Н.В., Вершинина O.A,. Зайцева Г.А. и др. Характеристика иммун- 66. ного статуса первичных доноров крови и ее компонентов // Трансфузиология. 2007. - № 1-2. - С. 45-46. Исрафилов А.Г., Алсынбаев М.М., Трофимов В.А., и др. Иммуноглобулин 67. человека нормальный для внутримышечного и подкожного введения. - Уфа: РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, 2008. 130 с. Карпова М. В. Характеристика функциональных нарушений у доноров с 68. временным отводом в связи со снижением уровня гемоглобина. - СПб., 2012. - 179 с. Карпова М.В., Зайцева Г.А., Куликова М.М. и др. Показатели обмена 69. железа у доноров со снижением уровня гемоглобина в крови // Трансфузиология. – 2009.- № 1-2.- С. 38-39. Карякин A.B., Скоцеляс Е.Д., Терентьева JI.A. Мониторинг безопасности 70. донорского контингента России // Трансфузиология. - 2007. - № 1-2. - С. 2122. 146 71. Кеворков Н.Н., Шилов Ю.С., Ширшев С.В., Черешнев В.А. Гормоны репродукции в регуляции процессов иммунитета. - Екатеринбург: УИФ Наука, 1993.- 173 с. 72. Климова К.Н., Рыжков С.В., Ионова А.И., и др. Изменения показателей функциональных систем организма доноров, подвергавшихся аппаратному плазмоцитаферезу // Гематол. и трансфузиол. - 1992. - №3. - С. 27-28. 73. Клюева Е.А., Гриднев В.В., Жибурт Е.Б. Списание эритроцитов с истекшим сроком хранения в клиниках Ивановской области // Трансфузиология. 2010.- Т. 11. №1. - С. 29-35 74. Клюева Е.А., Соловьева А.Е. Отечественные иммуноглобулины для внутривенного введения // Проблемы управления здравоохранением. - 2010. - № 6.- С. 84-86. 75. Клюева Е.А., Спирина Е.В., Губанова М.Н., Жибурт Е.Б. Социология и мотивация доноров Ивановской области. Часть III. Деньги или щедрость // Вестник службы крови России. - 2010.- № 3.- С. 10-13. 76. Клюева Е.А., Спирина Е.В., Жибурт Е.Б. Социология и мотивация доноров Ивановской области. Часть I. Общая характеристика // Вестник службы крови России. - 2010.-№ 3.- С. 5-7. 77. Клюева Е.А., Спирина Е.В., Жибурт Е.Б. Социология и мотивация доноров Ивановской области. Часть II. Гендерные особенности // Вестник службы крови России . -2010. - № 3. - С. 7-10. 78. Ковтунова М.Е., Кашин К.П., Поздеев Н.М. Белковый состав сыворотки крови у доноров плазмы для фракционирования // Вестник службы крови России.- 2012. - № 3.- С. 37-40. 79. Ковтунова, M.E. Этико-деонтологические проблемы донорства // Актуальные вопросы трансфузиологии: материалы науч.-практ. конф. - Ижевск, 2009. - С. 62-66. 80. Коденев А.Т., Губанова М.Н., Жибурт Е.Б. Скрининг маркеров инфекций у доноров крови // Вестник службы крови России . – 2010. - № 2. – С. 13-16. 147 81. Козлов А.А., Качалова Н.Д., Простакова Т.М. О медицинском обследовании системы гемостаза у доноров // Новое в трансфузиологии. - 2005. – Вып. 41. - С. 58-70. 82. Копченко Т.Г., Аксененко С.В. Анализ скрининга донорской крови на маркеры инфекционных заболеваний. Проблема безопасности гемотрансфузий и пути ее решения // Неделя медицины Ставрополья. Материалы 8-й ежегодной науч.-практ. конф. врачей. – Ставрополь, 2004. – С. 32-39 83. Копченко Т.Г., Коваленко В.Н., Таркомян О.М. и др. Методические указания «О порядке выбраковки донорской крови, ее компонентов по результатам исследований на маркеры инфекционных заболеваний в учреждениях службы крови и лечебно - профилактических учреждениях Ставропольского края». – Ставрополь, 2003.- 30 с. 84. Кострова О.М. Иммуноглобулиновая терапия вирусных инфекций // Рос. мед. журн. - 1995. -№ 1. - С. 52 – 54. 85. Красняков В.К. Гемотрансмиссивные инфекции у доноров СанктПетербурга // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: материалы Рос. науч.-практ. конф. – СПб., 2004. – С.129. 86. Красняков В.К. Эпидемическая безопасность в организации службы переливания крови // Информационный бюллетень Комитета по здравоохранению Прав. СПб. – СПб., 2005. – 12с. 87. Кузнецов В.П. Интерфероны, как средство иммуномодуляции // Иммунология. - 1987. № 4.- С. 30-34. 88. Кузнецов В.П. Иммунокоррекция лейкинфероном - применения при инфекционных и онкологических заболеваниях // Сибирский медицинский журнал.- 2000.- № 1.- С. 5-10. 89. Куликова М.М., Крюкова М.Г., Зайцева Г.А. и др. Содержание эритропоэтина в сыворотке крови доноров // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: Всерос. науч.-практ. конф. 6-7 октября 2010 г.- Киров, 2010. – С. 84-85. 148 90. Куприна Н. П., Кокорева С. П., Семенченко JI. В., Середина Е. Ю. Применение внутривенного иммуноглобулина «Пентаглобин» в терапии тяжелых бактериальных инфекций у детей // Детские инфекции. - 2005. - Т. 4. № 3.1. C. 47-49. 91. Левина Л.А., Мигунов В.Н., Темпер P.M. Перспективы создания иммуноглобулинов для профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний // Вестник РАМН. - 1996. - № 8. - С. 26-31. 92. Макарова О.А., Алешкина В.А. Инфекции в акушерстве и гинекологии. М., 2007. - 54 с. 93. Максимов В.А, Лаптев В.В. Служба крови России на пути возрождения // Вестник службы крови России. - 2006. - № 3.1. C. 29-31. 94. Маянский А.Н. Лекции по иммунологии. — Нижний Новгород: Изд-во Нижегород. государственной мед. академии, 2005. — 272 с. 95. Меграбян Т.Б. Образование антигензависимых иммуноглобулинов при иммунизации мышей клетками сингенной опухоли // Материалы науч. конф. ИЭБ АН АрмССР. - Ереван.- 1983. – С. 35. 96. Меграбян Т.Б., Агаджанян М.Г., Зарицкая Л.С. и др. Образование клеток, секретирующих антигеннезависимые неспецифические иммуноглобулины, при иммунизации мышей двумя Т-независимыми антигенами // Бюлл. эксп. биол. мед. - 1985. - № 10. – С. 451-454. 97. Медведев Ю.А., Пахомов Д.В., Сперанский В.В. Строение, состав и общие принципы функционирования иммунной системы человека: учебное пособие по общей иммунологии. - Уфа: БГМУ. - 1999.- 20 с. 98. Медведев Ю.А., Алсынбаев М.М. Основы иммунных и иммуннонаправленных методов терапии и профилактики. - Уфа. - 2000.- 160 с. 99. Медуницин Н.В. Вакцинология. - М.- 2006.- 448 с. 100. Мелкозерова О.А. Характер системных изменений гемостаза при естественном и преждевременном старении организма // Тромбоз, гемостаз и реалогия.- 2002. - № 1.- С. 83-87. 149 101. Микава Е. И. Иммунный ответ у подростков при вакцинации против гепатита В отечественной вакциной "Комбиотех" // Дис. ... канд. мед. наук. М., 2006. - 179 с. 102. Национальный стандарт РФ ГОСТ 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств». 103. Никитин И.К. Голосова Т.В. Карантинизация - дополнительная гарантия вирусной безопасности плазмы и ее препаратов // Вестник службы крови России. - № 1. январь 2002. - С. 10-12. 104. Николаенко В.Н. Сдвиги в системе иммунокомпетентных клеток у людей, иммунизированных различными вакцинными препаратами // Дис. ... канд. мед. наук. - М., 1990. - 179 с. 105. Никулин, Б.А. Оценка и коррекция иммунного статуса - М.: ГЕОТАР Медиа, 2007. – 376 с. 106. Оприщенко С.А., Захаров В.В., Русанов В.М. Международные регулирующие документы и стандарты службы крови и производства препаратов плазмы. - М.:ИД «Медпрактика-М», 2008.- 464 с. 107. Патент 2295135 Способ прогнозирования иммунного ответа доноров на вакцину клещевого энцефалита 2005101543/15, 24.01.2005. 108. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. и др. Мониторинг популяции вируса клещевого энцефалита в европейских и азиатских регионах России. Практические аспекты проблемы // Биопрепараты. 2004 - № 2 (14). - С. 7 – 13. 109. Попкова Н. Г. Проблемы оптимизации деятельности службы крови // Здравоохранение Российской Федерации. – 2007. - № 2. - С. 22-24. 110. Попкова Н. Г., Соловьев А. Ф., Смирнова Н. И., Болотов В. В. Причины брака карантинизированной плазмы // Материалы научно –практической конференции. – СПб., 2005. – С. 45. 111. Постановление Правительства РФ N 1230 от 31.12.2010 г. «Правила и методы исследований и правила отбора образцов донорской крови, необходимых для применения и исполнения технического регламента о требованиях 150 безопасности крови, ее продуктов, кровозамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии». 112. Постановление Правительства РФ N 29 от 26.01.2010 г. «Технический регламент о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионноинфузионной терапии». 113. Приказ МЗ и СР РФ№ 91н от 22.02.2008 г. «О порядке осуществления контроля за качеством донорской крови и ее компонентов». 114. Приказ МЗ РФ № 137 от 04.04.2003 г. «Порядок осуществления государственного контроля качества лекарственных средств на территории Российской Федерации». 115. Приказ МЗ РФ № 193 от 07.05.2003 г. «О внедрении в практику работы службы крови в РФ метода карантинизации свежезамороженной плазмы» и изменения к нему: Приказ № 170 от 19.03.2010 г. 116. Приказ МЗ РФ № 292 от 30.07.2001 г. «Об использовании иммуноферментных тест-систем для выявления антител в ВИЧ в сыворотке крови человека». 117. Приказ МЗ РФ № 322 от 21.10.2002 г. «О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (антиВГС) в сыворотке крови человека иммуноферментных тест-систем для выявления антител в ВИЧ в сыворотке крови человека». 118. Приказ МЗ РФ № 364 от 14.09.2001г. "Об утверждении порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов" (в ред. Приказов МЗСР РФ № 175н от 16.04.2008г. и № 261 н от 06.06.2008г.). 119. Приказ Минпромторга России №916 Правил организации от 14.06.2013 «Об утверждении производства и контроля качества лекарственных средств». 120. Приказ УФС по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Пермскому краю № 160 от 24.07.2006г. «О мерах по обеспе- 151 чению инфекционной безопасности донорской крови и ее компонентов в учреждениях службы крови Пермского края». 121. Рагимов А.А., Дашкова Н.Г. Основы трансфузионной иммунологии. – М., 2004. – 280 с. 122. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. пер. с англ. – М.: Мир, 2000. – 592 с. 123. Рос К. В., Вебер М., Петерсен Д. и др., НВV NAT и анти-НВc- тестирование повышают безопасность крови. Научно-методический сборник. - 2004. - С. 38-55. 124. Русанов В. М. Качество исходной плазмы – основа эффективности производства препаратов донорской крови // Вестник службы крови России.2007.- № 2.- С. 42-47. 125. Русанов В.М. Качество и безопасность основа эффективности производства препаратов крови. Мон. - М., 2010.- 255 с. 126. Русанов В.М. Эффективность использования донорской плазмы в службе крови России // Вестник службы крови России. - 2009. - №2, июнь.- С. 3-6. 127. Русанов В.М., Левин И. Лечебные препараты крови. - Москва: ИД Медпрактика, 2004. - 284 с. 128. Селиванов Е.А., Данилова Т.Н. Настоящее и будущее службы крови России // Проблемы гематологии и переливания крови.- 2005.- № 3.- С. 55-59. 129. Селиванов Е.А., Данилова Т.Н., Дегтерева И.Н., Григорьян М.Ш. Служба крови России современное состояние и тенденции развития // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: Всерос. науч.- практ. конф. 6-7 октября 2010 г. - Киров, 2010. - С. 21-23. 130. Скрининг донорской крови на гемотрансмиссивные инфекции / Рекомендации Всемирной организации здравоохранения. - Женева, 2010. - 85 с. 131. Смолиголовец Ё.О., Федоров Н.А., Морозова В.Т. Люминолзависи- мая хемилюминесценция нейтрофилов периферической крови у доноров // Тез. докл. Ш Всесоюз. съезда гематологов и трансфузиологов. - М., 1991. - С. 39-39. 152 132. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты А,В,С,D,E, ни-А-Е в клинической практике.- Санкт-Петербург: ТЕЗА, 1996. - 306 с. 133. Состояние производства препаратов крови // http://www.minzdravsoc.ru/health/donors/22. Сайт Минздравсоцразвития России, 20.04.2009. 134. СП 3.1.1.2341-08 от 28.02.2008г. «Профилактика вирусного гепатита В». 135. СП 3.1.5.2826-10 от 11.01.2011г. «Профилактика ВИЧ инфекции». 136. СП 3.3.2342-08 от 03.03.2008 г. «Обеспечение безопасной иммунизации». 137. Суханов Ю.С., Бадокина Г.И., Бродская А.П. и др. Здоровье доноров общая забота работников службы крови. - // Тез. докл. III Всерос. съезда гематологов и трансфузиологов. - С.-Петербург, 1996. - С. 70. 138. Тарасенко О.А., Гукасян И.А., Соболевская Л.В. и др. Опыт использования метода ПЦР для выявления РНК (ДНК) возбудителей вирусных гепатитов В и С у серонегативных доноров // Трансфузиология. – 2010.- Т. 11, № 2. - С. 17-21. 139. Техническое руководство американской ассоциации банков крови. Пер. с англ. - Милан: Европейская школа трансфузионной медицины, 2000. – 1056 с. 140. Тхай С.В., Захаров В.В., Русанов В.М. Пути решения проблемы обеспечения Российского производства препаратов крови плазмой для фракционирования // Вестник службы крови России. - 2012. - № 3.- С. 44-48. 141. Тхай С.В., Захаров В.В., Русанов В.М. Альбумин – наиболее востребованный препарат крови в трансфузиологической практике // Вестник службы крови России. - 2012. - № 3.- С. 40-42. 142. Фадеева Т.В., Ищенкова И.В., Бинеева Э.Я. Частота выявления маркеров гемотрансмиссивных инфекций у доноров Ростовской области // Вестник службы крови России. - 2006. - № 4. - С. 34-36. 143. Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» № 52 от 30.03.1999 г. (В редакции Федеральных законов № 196 от 30.12.2001, № 86 от 30.06.2003). 153 144. Федеральный закон № 125 от 20 июля 2012 г. "О донорстве крови и ее компонентов" 145. Федоров Е.Н., Блохина Н.П., Елов А.А. и др. Длительность бессимптомного носительства вирусов гепатитов В и С среди доноров крови и лиц группы риска // Вестник службы крови России. - 2000. - № 1. - С. 7 - 9. 146. Филина Н.Г., Иванчин В.А. О карантинизации плазмы на Красноярской краевой станции переливания крови // Актуальные вопросы организации первичной медико-социальной помощи населению: Материалы краевой науч.-практ. конф. – Красноярск, 2005. - С. 14-16. 147. Филина Н.Г., Кузьменкова И.Д. Контроль качества компонентов крови на Красноярской краевой станции переливания крови // Первая краевая. Красноярский медицинский журнал. – 2003. - № 17. - С. 15 -18. 148. ФС 42-0091-02 «Плазма для фракционирования» 149. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. - М.: Медицина, 2000.- 432 с. 150. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы. руководство для врачей. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 352 с. 151. Цинкернагель Р. Основы иммунологии. - М., 2008. - 135с. 152. Черешнев В.А., Шилов Ю.И., Черешнева М.В. и др. Экспериментальные модели в патологии //Перм. гос. ун-т. - Пермь, 2011.- 267 с. 153. Шарыгин С.Л. Иммуноглобулины направленного действия для внутривенного введения // Вестник службы крови России . –2003. - №2. – С. 53–55. 154. Шарыгин С.Л., Зайцева Г.А., Ковтунова М.Е. Состояние и перспективы развития донорства крови в Кировской области // Вестник службы крови России . –2004. - № 2. – С. 3–7. 155. Шевченко Ю.Л. и др. Руководство по общей и клинической трансфузиологии. - СПб., 2003. - 608 с. 156. Шигина Ю.В. Иммунология: учебное пособие. - М.: Изд-во РИОР, 2007.183 с. 154 157. Шилов Ю.И., Владыкина B.П., Атнагузина А.Т. Некоторые методические подходы к оценке показателей общего и дифференцированного фагоцитоза лейкоцитов периферической крови. Характеристика различий у здоровых людей // Пермск. мед. журнал. - 1998. - Т. 15. № 2. - C. 3-9. 158. Ярилин А.А. Основы иммунологии. - М.: Медицина, 1999.- 608 с. 159. Agadjanian M., Ntsterenko V., Megrabian T. et al. Inhibition of cells producling antigen-dependent non-specific immunoglobulins by isologous anti- erythrocyte mmunoglobulins // Immunology Letters. - 1985. - Vol. 9. - P. 307-311. 160. Allan J.P. Occult hepatitis B virus infection: infection in transfusion // Vox Sang. - 2004. - Vol. 86. N.2. – P. 83-91. 161. Amor B., Krichene C., Rekik H. et al. Motivation and sociology of blood donors in Tunisia: Reality and perspectives // Transfusion Clinique et Biologique. 2012 - Vol. 19. Issues 4–5. Novem. - P. 469-475. 162. Auroy Y., Andreu G., Aullen J.P. et al. Patient safety and root cause analysis update // Transfusion Clinique et Biologique. - 2010 - Vol. 17. Issue 5-6. Dec. - P. 386–389. 163. Behring E.A., Kitazato S. Concerning Development of Diphteria Immunity and Tetanus Immunity in Animals. From the hygienic institute of Htrn Geheinerath Kochin Berlin. 4 Decemb. - 1890. - 40 p. 164. Benhamou D. Plasma transfusion: Products and indications. 2012 guidelines update // Transfusion Clinique et Biologique. - 2012. - Vol. 19. Issues 4– 5. Novem. - P. 253-262. 165. Benjamin R.J., Bianco C., Goldman M. et al. Deferral of males who had sex with other males // Vox Sang. - 2011.- Vol.101. № 4. - P. 339-367. 166. Brand A., Rebulla P., Engelfriet C. P., et al. Cord blood banking // Vox Sanguinis.- 2008.- Vol. 95, № 4.- P. 335–348. 167. Bryant I., Wylie B., Yuan F. Effect of donation on the establishment of normal ranges of lymphocyte subsets // Transfusion. 1996. -Vol. 36. N. 6. - P. 559-566. 168. Burke D. S., Brandt В. L, Redfield R. R. et al. Diagnosis of human immunodeficiency virus infection by immimoassay using a molecularly cloned and expressed 155 virus envelope polypeptide. Comparison to Western blot on 2707 consecutive serum samples // Ann. Intern. Med. - 1987. - Vol. 106. N 5. - P. 671-676. 169. Busch M.P., Glynn S.A., Strainer S.L. et al. A new strategy for estimating risk of transfusion-transmitted viral infection based on rates of detection of recently infected donors // Transfusion. - 2004. - Vol. 45. - P. 254-264. 170. Busch M.P., Lee L.L., Satten G.A. et al. Time course of detection of viral and serologic markers preceding human immunodeficiency virus type 1 seroconversion: implications for screening of blood and tissue donors // Transfusion. - 1995. V. 35. - P. 91-97. 171. Bush M. P., Kleinman S. H,, Williams A. E. Frequency of human immunodeficiency virus (HIV) infection among contemporary Anti-HIV-l and anti-HIV-1/2 supplemental test-indeterminate blood donors // Transfusion. - 1996. - Vol. 36. - P. 37-44. 172. Carlson J. R., Bryant M. Д., Hinrichs S. H. et. al. AIDS serology testing in lowand high-risk groups // J. A. M. A. - 1985. - Vol. 259. - P. 2574-2579. 173. Chernyshov V.P., Radysh T.V., Gura I.V. et al. Immune disorders in Women with premature ovarian failure in initial period // Am. J. Reprod. Immunology. 2001. - 46. - Р. 220-225. 174. Cruse J.M., Levis R.E. Atlas of immunology. - Tailor and Fransis Group. LLC, 2010. - 940 pp. 175. Deborah J., Anderson, Rogerso A. Lobo, Jennifer Kelsey et al. Immunologic aspects of menopause // Menopause. Biology and Pathology / Ed by Rogerso A. Lobo, Jennifer Kelsey, Robert Marcus, 2000. - Р. 353-356. 176. Dego S.F., Benhamon J.P. Histoire naturelle et traitement des hepatitis virales chroniques: Une vue d’ensemble. Eurobiologiste. - 1995. 29.- № 216.- Р. 63–65. 177. Derek T., O'Hagan MF59 is a safe and potent vaccine adjuvant that enhances protection against influenza virus infection // Expert Review of Vaccines. - 2007. Vol. 6. No. 5. - P. 699-710. 156 178. Diekamp U., Kamutzky K., Windel C.D. Anti-hepatitis C prevalence and incidence in 2,8 million blood donors in Lower Saxony residual transfusion-associated HCV risk // Beitr. Infusionsther. Transfusionsmed. - 1997. - № 34. - P. 5-10. 179. Dimitrov J.D., Vassilev T.L., Andre S. et al. Functional variability of antibodies upon oxidative processes // Autoimmun Rev. - 2008. - Vol. 7. № 7. - P. 574-578. 180. Dobec M., Naegeli A., Furrer K., Kaeppeli F. Is Western blot alone sufficient to confirm a reactive result of a fourth-generaion HIV screening assay? // Swiss. Med. Wkly. — 2006. — Vol. 136. - P. 672-673. 181. Donald P, McDonnell. Molecular pharmacology of estrogen and progesterone receptors // Menopause Biology and Pathology / Ed by Rogerio A. Lobo. - San Diego-Tokyo, 2000. - P. 459-480. 182. Druckmann R. Review: Female sex hormones, autoimmune diseases and immune response // Gynecol. Endocrinol. - 2001. - Vol. 15. N6. - Р. 69-76. 183. Elluru S.,Van Huyen J.P., Prost F. et al. Comparative study of the antiinflammatory effect of two intravenous immunoglobulin preparations manufactured by different processes // Immunol Lett. - 2006. - Vol. 107. № 1. - P. 58-62. 184. Grossman C.J., Cruden A.B.M., Stimson W.H. Bilateral communication between the endocrine and immune systems. Berlin: Springer-Verlag. - 1994.- P. 3643. 185. Grossman C.J., Roselle G.A., Mendenhall C.L. Sex steroid regulation of autoimmunity // J. Steroid Biochem Mol. Biol. - 1991. - Vol. 40. N 46 - P. 649-659. 186. Gutierrez C., Devesa V., Loureiro C.L. et al. Molecular and serological evaluation of surface antigen negative hepatitis B virus infection in blood from Venezuela // J. Med. Virol. - 2004. Vol. 3. N 2. - P. 200-207. 187. Halperin D., Baetens J., Newman B. The effect of short-term, temporary deferral on blood donation // Transfusion. - 1998. - Vol. 38. № 2. - P. 181-183. 188. Herman S., Ohhashi Y., Kyger E. et al. Performance characteristics of a new multiplex NAT screening test for HBV, HCV, and HIV. The Cobas TagScreen MRX Test COBAS S 201 system // Vox Sang., - 2007. - Vol. 91. – Suppl. 3:81. 157 189. Jackson J.B., Hanson M.R., Johnson G.M. Long-term follow up of blood donors with Indeterminate Human Immunodeficiency virus type 1 results on Western blot // Transfusion. - 1995. - Vol. 35. - P. 98-102. 190. Jenner E. An Inquiry into the Causes and Effects of the Variolae Vaccinae a Discovered I Some Western Counties of England. - London: Sampson Low, 1798. - 35 p. 191. Karacan E., Aktan Z., Seval G.C. et al. P-16 Blood donors and factors impactin the blood donation decision: motivation, beliefs and attitudes // Тransfusion and Apheresis Science, Vol. 47. Sup. 1. Sept. - 2012. - P. 29. 192. Kathy D. Antibodies. Methods. - M.: Mir, 1991. - 287 рp. 193. Ke-Qin Nu Occult hepatitis B virus infection and its clinical implication // Journal of Viral Hepatitis. - 2002. - Vol. 9. - P. 243-257. 194. Kleinman S.H., Strong D.M., Tegtmeier G.E. et al. Hepatitis B virus (DBV) DNA screening of blood donation in minipools with the Cobas AmpliScreen HBV test // Transfusion. - 2005. - Vol. 45. - P. 1247-1257. 195. Kline R. L., McNairn D., Holodilniy M. Evaluation of chiron HIV-l/HIV-2 recombinant immunoblot assay // J. Clin. Micro-bio. — 1996. - Vol. 34. - P. 26502653. 196. Kofiadi I., Trofimov D., Gudima G., Alexeev L. Genetic succeptibility to HIV1 infection in 4 populations from Russia // Proc. XVI Eur. Congr. Immunol. –2006. – Paris. – P. 129. 197. Kofiadi I.A., Trofimov D.Yu., Rebrikov D.V. Genetic susceptibility to HIV-1 infection in Russian populations // 21st EFI Conference. Barcelona. - 2007. 198. Korobova S., Chevalier A., Nikolaeva I., et al. Phase I clinical trials of a candidate vaccine based on fusion recombinant gag-gp41 protein in healthy HIV negative volunteers // AIDS Research and Human Retroviruses. – 2008. – V. 24. – S.1. – Р. 237. 199. Lange S., Riggert J., Humpe A., Dittmann J. et al. Immunologic effects of blood donation // Beitr Infusions ther Transfusions med. -1996. - № 33. - P. 9397. 158 200. Lee J. H. Follow-up investigation of indeterminate Western blot results for antibody to human immunodeficiency virus type // J. Formos. Med. Assoc. - 1994. - Vol. 93. - P. 283-288. 201. Lee W. M. Hepatitis B Virus Infection // The New England Journal of Medicine. - 1997. - Vol. 341. № 9. - P. 643-665. 202. Letowska M., Brojer T., Mirulska M. et al Hepatitic C cor. аntigen in Polish blood donors // Transfusion. - 2004. 44(7). - Р. 1067-1071. 203. Levicnic-Stezinar S. Hepatitis B surface antigen escape mutant in first blood donor potentially missed by a routine screening assay // Clin. Lab. - 2004. - Vol. 50. N 1-2.- P. 49-51. 204. Levicnik-Stezinar S. Hepatitis B surface antigen escape mutant in blood donors potentially missed by a routine screening assay // Clin. Lab. – 2004. - Vol. 50. N. 1-2. - P. 49-51. 205. Lewis S., Kutvirt S., Simon T. Investigation of the effect of long-term whole blood donation on immunologic parameters // Transfusion. - 1992. -Vol.32. N l. P. 51-56. 206. Mas A., Soriano V., Gutierrez, M. et al. Reliability of a new recombinant immunoblot assay (RIBA HIV-l/HIV-2 SIA) as a supplemental (confirmatory) test for HIV-1 and HIV-2 infections // Transfus. Sci. - 1997. - Vol. 18. N 1. - P. 63-69. 207. Medunitsyn N. V., Pokrovsky V. I. Basics of immunization and immunotherapy of infectious diseases // M: GEOTAR-Media. - 2005. — 512 pp. 208. Meles H., Wolday D., Fontanet A. et al. Indeterminate human immunodeficiency virus Western blot profiles in Ethiopians with discordant screening assay results // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2002. - Vol. 9. - P. 160-163. 209. Minegishi K., Yoshikawa A., Kishimoto S. et al. Superiority of minipool nucleic acid amplification technology for hepatitis B virus over chemiluminescence immimoassay for hepatitis B surface antigen screening // Vox Sang., - 2003. - Vol. 84. –P. 287-291. 210. Mori A, Oleszycka E, Sharp Fiona A., et al. The vaccine adjuvant alum inhibits IL-12 by promoting PI3 kinase signaling while chitosan does not inhibit IL-12 and 159 enhances Th1 and Th17 responses // European Journal of Immunology. - 2012. Vol. 42. № 10. - P. 2709 - 2719. 211. Nguyen D.D., De Vita D.A., Hirschler N.V., et al. Blood donor satisfaction and intention of future donation // Transfusion. - 2008. - Vol. 48. N 4. - P. 742-748. 212. Nubling C.M., Willkommen H., Jover J. Hepatitis C transmission associated with intravenous immunoglobulins // The Lancet. – May 6. 1995. - V. 345. – P. 1173-1174. 213. Pasteus L. Sammary Report of the experiments conducted at Pouilly-le Fort, Near Melum, on the anthrax Vaccination. Acad. Sci. 92. June. 1881. - Р. 13781383. 214. Pasteus L., Method for Preventing Rabies After a Bite. 27.C.R. Acad. Sci.. 26 octobre. 1885. CI. Р. 765-773. 215. Pat. 2432173 Russian Federation, MPKA61K39/095. Vaccines containing aluminum adjuvants and histidine / Contorno M., M. Maffei : the applicant and patentee Chiron SRL. - № 2007139924/15; appl. 29.10.2007, publ. 10.05.2009. 216. Peng Lee Yap, McOmish F., Webster F. et al. Hepatitis C virus transmission by intravenous immunoglobulin // Journal of Hepatology. -1994. - Vol. 21 (3). - P. 455-460. 217. Quinn, M.T., Gauss K.A Structure and regulation of the neutrophil respiratory burst oxidase: comparison with nonphagocyte oxidases // J. Leukoc. Biol. - 2004. Vol. 76, № 4. - P. 760-781. 218. Ravanshad M., Sabahi F., Mahboudi F. et al. An accurate confirmation of human immunodeficiency vims type 1 (HIV-1) and 2 (HIV-2) infections with a dot blot assay using recombinant p24, gp41, gp120 and gp36 antigens // Int. J. Med. Sci. - 2004. -Vol. 1. - P. 193-200. 219. Reesink H.W., Panzer S., Wendel S et al. The use of malaria antibody tests in the prevention of transfusion-transmitted malaria // Vox Sang. - 2010.- Vol. 98. № 3.- P. 468-478. 220. Roth W.K., Weber M., Petersen D., et al. NAT for HBV and HBc testing increase blood safety // Transfusion. - 2002. - Vol. 42. - P. 869-875. 160 221. Sanchez A. M., Ameti D. I., Schreiber G. B., Thomson R. A. et al. The potential impact of incentives on future blood donation behavior // Transfusion. -2001.Vol. 41.- P. 172-178. 222. Sandid I. European regulation on blood and blood components // Transfusion and Apheresis Science. Volume 17. Issues 5–6. Dec. 2010.- P. 310-314. 223. Sayers S., Ulysse G., Xiang Z. et al. Vaxjo: A Web-based vaccine adjuvant database and its application for analysis of vaccine adjuvants and their uses in vaccine development // Journal of Biomedicine and Biotechnology. - 2012. - Vol. 10. Article ID 831486. - P. 13. 224. Schreiber G. B., Glynn S. A., Busch M. P., Sharma U. K. et al. Incidence rates of viral infections among repeat donors: are frequent donors safer? // Transfusion. 2001. - Vol. 41. - P. 730-735. 225. Schwarts R., Amer J. Overview of the biochemistry and safety jf a new native intravenous gammaglobulin, IGIV, pH 4,25 // Med.- 1987.- 83.-№ 4А.- P. 46-52. 226. Screеning donated blood for transfusion-transmissibl infection. Recommendations.-Geneva: WHO. - 2009. – 66 p. 227. Silversten A. A History of Immunology (Second Edition). - Acad. Press (Elsevier Inc.), 2009. - 530 pp. (ISBN: 978-0-12-370586-0). 228. Spickett G.P. Immune deficiency disorders involving neutrophils //J. Clin. Pathol.-2008. - Vol. 61. № 9. - P. 1001-1005. 229. Stramer S.L., Glynn S.A., Kleinman S.H. et al. Detection of HIV-1 and HCV infections among antibody-negative blood donors by nucleic acid-amplification testing // N. Engl. J. Med. - 2004. - Vol. 351(8). - P. 760-768. 230. Strauss R. G. Blood donation, safety, and incentives // Transfusion. - 2001. Vol. 41. - P. 165-167. 231. Tabor E., Epstein J.C. NAT screening of blood and plasma donations: evolution of technology and regulatory policy // Transfusion. - 2002. – P. 1230-1236. 232. Tanno H., Bienn В. et al. Спонтанная реактивация хронического гепатита Sci. Meet. and Postgrad. Course, Brighton, June 3–6. - 1992: Int. Assoc. Study Liver. Brighton. - 1992. - 177 pp. 161 233. Thon J. N., Schubert P., Devine D. V. Plateletstorage lesion: A new understanding from a proteomic perspective// Transfus. Med. Rev. – 2008. – V. 22. –№ 4. – P. 268–279 234. Tsuboi N., Asano K., Lauterbach M., Mayadas T.N. Human neutrophil Fcgamma receptors initiate and play specialized non-redundant roles in antibodymediated inflammatory diseases. // Immunity. - 2008. - Vol. 28. № 6. - P. 833-846. 235. Watanabe K. K., Williams A. E., Schreiber G. B., Ownby H. E. Infections disease markers in young blood donors // Transfusion. - 2000. - Vol. 40. - P. 954960. 236. Wu Y., Glynn S. A., Schreiber G. B., Wright D. J. et al. First-time blood donors: demographic trends // Transfusion. - 2001. - Vol. 4. - P. 360-364. 237. Yoshikawa A., Gotanda Y., Itabashi M. Hepatitis B NAT virus-positive blood donors in the early and late stages of HBV infection: analyses of the window period and kinetics of HBV DNA // Vox Sang. - 2005. - Vol. 88. – P. 77-86. 238. Zaaijer H. L., van Rixel Т., Kromosoeto J. N. R. et al. Validation of immunoblot assay (LiaTec HIV 3) for confirmaition of human immunodeficiency virus infection // Transfusion. - 1998. - Vol. 38. - P. 776-781. 239. Zolfaghari A.S., Reza B.M., Sarmadi M. et al. The role of hospital blood: equipment and procedures for blood safety improvement // Vox Sang.- 2009.Vol.96. Suppl. 1. - P. 55. 240. Zuckerman A. J., Thomas H. C. Viral Hepatitis // The New England Journal of Medicine. - 1999. - Vol. 341. № 14 - P. 1631-1633. 162 ПРИЛОЖЕНИЯ 163 АКТЫ ВНЕДРЕНИЯ НАХОДЯТСЯ В ЛИЧНОМ ДЕЛЕ СОИСКАТЕЛЯ
