отзыв оппонента Ежовой Т.А.

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА
На диссертацию
РАЗУМОВОЙ ОЛЬГИ ВЛАДИМИРОВНЫ «СРАВНИТЕЛЬНЫЙ
МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛОВЫХ ХРОМОСОМ КОНОПЛИ
ПОСЕВНОЙ (CANNABIS SATIVA L.) И РОДСТВЕННЫХ ВИДОВ РОДА HUMULUS»,
представленную на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальностям 03.02.07 − генетика
Диссертационная работа Разумовой О.В. посвящена изучению молекулярноцитогенетических особенностей организации генома конопли посевной Cannabis sativa
L., выявлению половых хромосом и их сравнительному анализу с половыми
хромосомами родственных видов рода Humulus. Актуальность этой работы следует
из того, что с точки зрения генетических механизмов полоопределения, а также с
позиций современной цитогенетики вид Cannabis sativa слабо изучен, несмотря на
его большое практическое значение. Более того, семейство Cannabaceae, к которому
относится главный объект исследования, обладают разными системами половых
хромосом, поэтому представляют собой очень интересную модель для изучения
эволюции.
Диссертационная работа Разумовой О.В. представляет собой труд, лаконично
изложенный на на 126 страницах машинописного текста и включают 42 рисунка, 6
таблиц и разделы «Введение», «Глава 1. Из истории вопроса», «Глава 2. Материалы и
методы», «Глава 3. Результаты», «Глава 4. Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и
«Список литературы». Список литературы включает 224 источника, из них 197
иностранных.
Нельзя не отметить качество и информативность обзора литературы. В первой
части этого раздела диссертации автор рассматривает немногочисленную
информацию о типах определения пола у растений, половых хромосомах у растений и
вопросах их эволюции. Вторая часть обзора посвящена рассмотрению вопросов
организация растительных геномов и повторяющимся элементам ДНК в геномах и
половых хромосомах растений, в частности. В заключительной части представлены
ботаническое описание, таксономическое положение, хозяйственное значение, а также
имеющаяся информация о генетических особенностях и определении пола у конопли
посевной и родственных видов рода Humulus.
Анализ обзора литературы,
написанного интересно и с привлечением работ 2015 г, еще раз убеждает в том, что
диссертационная работа посвящена чрезвычайно актуальной теме и ее
результаты принципиально значимы как для генетики и цитогенетики растений,
так и для эволюционной биологии.
Материалы и методы описаны четко и ясно, и говорят о том, что представленная
работа выполнена на самом высоком методическом уровне. Впечатляет широта
спектра методов, используемых автором, включающих биоинформатические и
молекулярно-биологические методы (клонирование и секвенирование ДНК,
1
генетический анализ с использованием ДНК-маркеров), а также методы классической
и молекулярной цитогенетики (GISH и FISH in situ гибридизация). Круг объектов
также достаточно представительный – 12 форм посевной конопли, а также два вида
хмеля.
Раздел «Результаты» написан подробно и также хорошо иллюстрирован
оригинальными фотографиями с результатами GISH и FISH in situ гибридизации. На
основе биоинформатического анализа диссертант выявил тандемный повтор Cs-1 (Cs375), который по данным in situ гибридизации показал себя как надежный
молекулярно-цитогенетический маркер Y-хромосомы мужских растений и четвертой
пары аутосом C. sativa. Кроме того, диссертант выявил тандемный повтор Cs-237 и
показал,
что
повтор
является
видоспецифичным,
прицентромерным
цитогенетическим маркером на хромосому 9 (несущую 45S рДНК) и хромосому 3
Cannabis sativa. Причем, в кариотипе Cannabis sativa имеется по 1 сайту гибридизации
45S рДНК (хромосома 9) и 5S рДНК (хромосома 8). Показано, что теломерный повтор
Cannabis sativa – Arabidopsis-типа и локализуется на всех хромосомах конопли.
Важный результат по локализации псевдоаутосомного региона в терминальной
области короткого плеча Y-хромосомы C.sativa был получен с помощью анализа
бивалентов XY в метафазе I мейоза у мужских растений и данных по распределению
сигнала self-GISH на Y хромосоме.
Проведенные FISH и выявленные с их помощью цитогенетические маркеры
позволили диссертанту составить и проанализировать кариотип мужских и женских
растений конопли посевной. Показано, что гаплоидный набор хромосом конопли
посевной состоит из 9 аутосом (в том числе 1 хромосома с ядрышко-организующим
регионом) и 1 пары половых хромосом – XX у женских растений и XY – у мужских.
Причем, Y-хромосома самая большая в кариотипе и отличается не только отсутствием
сигнала субтеломерного повтора на длинном плече, но и ярким, гетерохроматиновым
дапи-положительным окрашиванием.
Особый интерес представляет изучение хромосомного состава однодомных форм
конопли, которые наиболее востребованы в промышленности. Эти исследования были
проведены на хромосомах конопли восьми однодомных сортов отечественной
селекции с помощью флуоресцентной FISH in situ гибридизации субтеломерного
повтора Cs-1. Было установлено, что однодомные сорта не имеют Y хромосомы,
которая характерна только для мужских растений. По некоторым аутосомам
диссертант выявил вариабельность по наличию/отсутствию и положению сигнала
субтеломерного повтора. В общей сложности, было выделено 10 цитотипов, при этом
внутри однодомных сортов Кубанка, Ригс, Диана и Ингреда было выделено 3
цитотипа, а у двудомного сорта Игоркин – 4 (2 у мужских растений, 2 у женских).
Кроме того, растения всех сортов были проверены молекулярными маркерами
определения пола MADC2 и SCAR 323. После проверки все однодомные сорта показали
амплификацию по женскому типу. Это послужило поводом предположить
возможность использования маркеров пола для анализа партий однодомных семян на
засорение мужскими генотипами. При сравнении результатов анализа партий семян
однодомных сортов, с известным соотношением полов, с результатами, полученными
молекулярным маркированием, была показана эффективность использования
2
молекулярных маркеров для выявления мужских образцов, и высказано
предположение о возможности замены грунтового контроля ДНК-маркированием.
При этом наиболее удобным оказалось использование маркера MADC2 в следствие его
кодоминантности, что позволило автору дать обоснованный рекомендации по
использованию молекулярного маркера пола MADC2 в семеноводстве при оценке
засорения двудомными формами партий семян однодомной конопли.
В заключительном разделе «Результатов» для выявления накопления
повторяющихся элементов на Y-хромосомах автор путем геномной гибридизации GISH
с собственной ДНК (Self-GISH) на митотические хромосомы растений трех
родственных видов семейства Cannabaceae (H. lupulus,H. japonicus, C. sativa) показал
эффективность данного метода для дифференциации Y-хромосом у всех трех видов.
Причем, у хмеля японского Y-хромосомы визуализировались с помощью этого
оригинального подхода self-GISH не только на метафазных пластинках, но и в
интерфазном ядре.
Раздел «Обсуждение» очень краток и посвящен в основном эволюционным
аспектам, вытекающим из полученных диссертантам данным. Автор подчеркивает,
что выявленное им разнообразие расположения сигналов субтеломерных повторов на
половых хромосомах у трех исследованных видов семейства, а также полиморфизм по
данному признаку, свойственный сортам однодомной конопли и 5 хромосоме хмеля
японского подтверждает эволюционную пластичность данной области, показанную и
на других объектах. Автор резонно предполагает, что подобный хромосомный
полиморфизм может служить проявлением динамичности кариотипа, что может
объяснить высокую пластичность вида Cannabis sativa. Основываясь на данных
экспериментов по перекрестной гибридизации, автор делает вывод о достаточно
длительном периоде независимой эволюции половых хромосом в трех родственных
видах. Более того, учитывая возраст расхождения родов Humulus и Cannabis, автор
считает, что половая система Cannabaceae, возможно, является одной из старейших
среди изученных половых систем покрытосеменных, что делает семейство
Cannabaceae привлекательным модельным объектом для изучения эволюции половых
хромосом растений.
Основываясь на рассмотрении данной диссертационной работы можно
выделить ряд наиболее существенных положений определяющих ее научную
новизну:
•
впервые цитогенетически идентифицирована Y-хромосома у мужских растений
C.sativa и показано отсутствие Y-хромосомы у однодомных форм;
•
идентифицирован псевдоаутосомный регион Y-хромосомах;
•
установлена локализация 5S рДНК, 45S рДНК и теломерного повтора
арабидопсис-типа на хромосомах C.sativa;
•
выявлен, клонирован и секвенирован хромосом-специфичный прицентромерный
повтор Cs-237;
•
идентифицированы 5 из 10 хромосом гаплоидного набора C. sativa.
3
Цель работы соответствует заявленной теме диссертации, а поставленные задачи
позволяют раскрыть ее суть. Достаточный объем фактического материала,
использование
современных
методов
исследования
подтверждают
достоверность
и
обоснованность
научных
положений
и
выводов,
представленных в диссертационной работе. Содержание автореферата отражает
содержание диссертации. Результаты работы апробированы на научных
конференциях и отражены в 16 научных публикациях, в том числе 4 статьях в
журналах из перечня ВАК, включая 3 статьи в высокорейтивновых зарубежных
журналах (PLoS ONE, Comparative Cytogenetics, Protoplasma), которые уже хорошо
цитируются зарубежными коллегами.
Однако к диссертации имеется ряд замечаний:
1.
На стр. 13 и на стр 37 обзора диссертант отмечает, что существует мнение о том,
что пол Cannabis sativa зависит от соотношения количества Х хромосом к общему числу
аутосом. На стр. 37 имеется ссылка на работу Ainsworth, 2000 с теми же выводами о
полоопределении у конопли.
Однако этот вывод противоречит данным О.В.
Разумовой о роли Y хромосомы в определении мужского пола, поэтому хотелось бы
понимать, какие данные иностранных авторов свидетельствовали в пользу
балансового механизма полоопределения. К сожалению, найти в диссертационной
работе описания этих данных оппоненту не удалось.
На стр. 27 обзора автор сообщает, что «Хромосомы Х и Y папайи различаются
2.
небольшим участком, ответственным за формирование пола, получившими название
male-specific region of the Y … и hermaphrodite-specific region of Yh …», что создает
впечатление о наличии одной Y хромосомы с 2-мя участками. Но папайя - трехдомный
вид с мужскими, женскими и гермафродитными растениями, и трехдомность
поддерживается наличием двух разных Y-хромосом – Y и Yh. Женские растения папайя
имеют набор хромосом XX, тогда как мужские XY, а гермафродитные XYh. Причем,
различие между Y и Yh хромосомами связано с небольшим локусом запрета
рекомбинации. По-видимому, автору следовало более детально изложить эту
информацию, тем более, что работы с информацией по этому поводу значатся в списке
цитированной литературы (например, Ming, 2011, Na et.al 2014).
3.
Замечание к форме представления «Выводов». Они скорее являются ее
краткими результатами, а не итогом, вытекающим из результатов. По-видимому,
диссертация выиграла бы, если бы вместо 11 мелких выводов автор представил 3-4
«итога» («Вывод – это итог, получающийся как следствие рассуждений»- словарь
Ушакова). Положения, выносимые на защиту, также излишне измельчены.
4.
Фамилии цитированных зарубежных авторов приводятся в тексте диссертации
то в русской, то в английской транскрипции. Следовало бы соблюдать единообразие.
В заключение хочу отметить, что поставленная диссертантом цель и проделанная
работа, несомненно, актуальны, результаты обладают высокой
степенью
новизны.
Приведенные замечания не влияют на общую положительную оценку диссертационной
работы и не снижают ее научную и практическую ценность. Диссертационная работа
«СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ
4
5